JP5000638B2 - 対象の眼球に対して治療用生成物を送達するための改良型方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は一般に、生物活性作用物質、特に治療用又は予防用核酸を対象の眼球に送達する改良型方法において、前記作用物質を毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に投与するステップを含む方法に関する。より詳細には、本発明は、治療用生成物を特異的毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に投与し、かくして治療すべき眼組織内にそれを移入することにより眼球の病理を治療するための装置、特に遺伝子療法におけるそれらの使用及びその方法に関する。本発明は同様に、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞投与に適した形をした生成物を含む医薬組成物、それらの調製及び使用にも関する。

眼の生体構造
眼は体の中で最も複雑な器官の１つである。眼の一部分は発生学的には中枢神経系の延長である。眼は、複数の部分で構成され、眼の最適な視力又は健康及び疾患は、さまざまな部分がいかに連携するかに左右される。

眼は、解剖学上及び機能上、小前房と大後房に分けることができる。両方の房は、透明な両凸面体である水晶体によって分離されている。水晶体は線維で毛様筋に連結されており、この毛様筋は、収縮又は弛緩によりその形状及び焦点合せ能力を改変させる。毛様筋は非骨格筋である。

後房は、ヒアルロン酸を含有する液体中に浮遊したコラーゲン線維網から成る透明で粘性の流体又はゲル様構造である硝子体で満たされている。

眼の球体は３層で作り上げられている。最も外側の層は、強膜と前極にある角膜という２つの部分から成る。強膜の下側には、脈絡膜がある。最後に、最も内側にあって感光性を有する層は、網膜と呼ばれる。強膜は、白眼としても知られている保護シートである。これは、眼球の表面のほぼ８０％を網羅する膠原線維の厚み０．３〜１ｍｍの層である。眼の前面には、ドーム形の「眼の窓」として強膜から外に透明の角膜が膨れ出ている。人間の角膜は、５層すなわち上皮、ボーマン膜、間質、デスメ膜及び内皮で構成されている。これらの層は、適切な体液平衡により角膜の透明度を維持するため、及び有害な作用物質が眼の中に入るのを防ぐために重要である。角膜の５層のうち上皮と間質というわずか２層だけが、眼の中へ薬物を通過させる上での主要な障壁である。内皮は、ボーマン及びデスメの膜と同様、薬物通過に対して大きな影響を全く及ぼさない。角膜上皮はそれ自体、薬物に対する親油性障壁を形成する合計厚み５０〜１００μｍの５〜６層の細胞層から成る。それは、眼の中への有害な作用物質の進入を妨げることによる保護機能を有し、同様に、間質水和作用ひいては角膜の透明性を維持する上で内皮を助ける流体分泌組織でもある。上皮の細胞は再生性がきわめて大きく、傷害後３日以内の自己交換能力を有する。角膜厚みの９０％を占める間質は、コラーゲン線維が散在する７５〜８０％の水を含有し、従って、きわめて親水性の高い区画となっている。

強膜の下には、眼に対して血液を供給しそれを排出させる血管及び神経を収納する脈絡膜がある。脈絡膜は眼の前面で肥厚して毛様体を形成し、これが房水と呼ばれる水様性液体を分泌する。

毛様体には、瞳孔と呼ばれる中央空隙をとり囲む眼の着色部分である虹彩が付着している。虹彩の本源的機能は、瞳孔のサイズひいては眼に進入する光の量を制御することにある。これは、以上で説明されている通り、括約筋の収縮及び散大筋の狭窄を介して達成される。虹彩にその色を与えている色素性メラニンは、強い又は明るい光の吸収を助ける。

感光性細胞を含む眼の最も内側の層は、網膜と呼ばれる。網膜は、色覚を担当する錐体及び暗所視のための棹状体を含む光受容体層１層を含めた複数の層で構成されている。錐体の大部分は、斑と呼ばれる小さな限局性部域内に局在化されている。

房水は、特に、角膜、水晶体及び硝子体といったような眼の無血管構造のための栄養機能を有する。房水は、約２．５μＬ／分の速度で毛様体の非色素性上皮の毛様体突起により連続的に産生される。

外眼筋が眼球運動を担当する。これらの筋肉は、眼窩尖に由来し、眼球上で終結する。その途中で、外眼筋は同様に、眼窩に対し線維性中隔によっても付着されている。前方では、筋膜平面が腱鞘と融合して強膜を取り囲む。人間の眼の中では、本発明の意味合いでの「外眼筋」は、４本の直筋と２本の斜紋筋により構成されている。直筋は、縁の後約７ｍｍのところで前方に挿入する。その他の外眼筋は、眼瞼の開閉を担当する輪筋及び上直筋との連結を有するミュラー線維である。

眼に薬物を送達する上での問題点
眼疾患及び眼障害の治療における主要な問題点は、治療上又は予防上有効な濃度で眼内に生物学的に活性な作用物質を送達する上でのむずかしさにある。眼科薬物の経口投与は、血液−網膜障壁に起因して網膜組織をターゲティングするのにほとんど不適切である。有効量の治療薬を、眼球部域に到達させるためには、高濃度の薬物を頻繁に投与しなければならない。この結果、全身毒性がもたらされ得る。例えば、眼内で高いコルチコステロイドレベルに達するためにパルス療法を使用することができるかもしれない。眼科用薬物の局所投与の現在実践中の方法に付随する問題も同様に存在する。局所投与は一般に、眼の表在表面すなわち角膜及び前眼部が関与する病理においてのみ有効である。局所的薬物投与の現在実践中の方法は、実際、一部の眼球組織、特に虹彩及び毛様体といったような眼球内組織内で適切な薬物濃度を達成する上で有効ではない。眼の網膜、視神経又は硝子体に到達することはさらに一層困難である。さらに、薬物がタンパク質又はペプチドである場合には、角膜を横断する能力が標準的に欠如し眼球内疾患の治療はなおさら困難になり、局所投与の有効性はさらに低くなる。その結果、眼球内疾患の最も一般的な治療は、往々にして眼球内針注入又は眼球内外科手術（例えば低放出系又はカプセル化修飾細胞の外科的植込み）を必要とすることから侵襲的である。

外眼球インサートにも同様に欠点がある。数時間で治療用化合物が溶解するため、頻繁に再適用する必要がある。ここでも又これらのインサートは、角膜及び前房にしか薬物を送達しない。

かくして、有効な治療を提供するための上述の試みにも関わらず、眼疾患特に眼内疾患を治療するための新しいアプローチに対する長年にわたる切実で深刻なニーズがなおも存在している。

治療用生成物特にタンパク質又は核酸を眼内に導入して前記疾患を制御するための適切な方法を規定することが特に有利であると思われる。特に、遺伝子療法は、さまざまな疾患の管理及び治療のための有効なアプローチとして浮上している。有効な遺伝子療法計画の例は、日常的に文献中に現われている（例えば非特許文献１を参照のこと。治療的遺伝子導入は、インビボでの所望のトランス遺伝子の連続的及び／又はターゲティングされた産生といったような潜在的利点を提供する。しかしながら、現在、高い有効性で哺乳動物眼細胞内で核酸形質導入を実施することは困難である。特に、炎症性応答を誘発することなく眼の中にこれらの核酸を導入できるかは疑わしい。その上、眼の内部で最終分化した又は増殖中のヒト細胞を形質導入する手段が欠如している。本発明は、当該技術分野における上述の積年のニーズ及び要望に応えるものである。
ロス（Ｒｏｔｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、９８５〜９９１頁（１９９６年）、又はハーミストン（Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ）及びカーン（Ｋｉｒｎ）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１１巻、４９６〜５０８頁（２００５年）。

本発明者らは実際、対象の毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内に作用物質を投与するステップを含む、薬理学的に活性な作用物質、特に治療用又は予防用核酸を眼球部域に送達するための方法を開発した。

本発明は、ここに、動物の対象、好ましくは哺乳動物の対象、特にヒトの対象の眼疾患の安全かつ効果的な予防又は治療のための組成物及び方法を提供する。本発明は、（毛様筋組織及び毛様上皮を含む）毛様体、好ましくは毛様筋及び／又は外眼筋が、眼球特に眼の内部及び後部のための薬学生成物供給タンクとして使用可能であるという本願に基づくものである。

本発明は、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞内への作用物質の投与を含む、対象の眼球内に生物学的に又は薬学的に活性な作用物質、特に核酸を選択的に移入するための特に効果的な方法について記述している。

本発明はさらに、炎症性眼疾患、虚血性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患及び緑内障を含む（ただしこれに制限されない）さまざまな眼疾患を予防又は治療するためのかかる方法の、単独での又は付加的な治療と組合わせた形での使用に関する。

本発明の第２の態様は、治療すべき対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与することにより眼疾患を治療するための組成物を調製するための治療用核酸の使用に関する。

本発明は同様に、対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対して作用物質又は組成物を投与するための電気穿孔装置であって、
（ｉ） 前記組織又は細胞内に組成物を注入するための少なくとも１つの手段であって、それが注入針、注入針電極、少なくとも１つの注入針又は１つの注入針電極を含む極微針アレイ又はそれらの組合せである手段、
（ｉｉ） 任意には、組成物の注入を開始するのに充分な深さまで針が挿入された時点でそれを検知するための手段であって、前記深さが好ましくは０．１〜１０ｍｍの間、さらに一層好ましくは０．１〜０．９ｍｍの間に含まれている手段、
（ｉｉｉ） 任意には、強膜又は眼結膜の表面上に前記注入手段を位置決めするための手段、及び
（ｉｖ） 任意には、予め定められた電気信号を生成するための手段
を含む電気穿孔装置にも関する。

本発明のさらなる態様は、本発明に従った電気穿孔装置の遺伝子療法における使用に関する。

本発明の上述された及びその他の数多くの特長及び付随する利点は、以下に詳述される。本発明のその他の特長及び利点は、その好ましい実施形態についての以下の記述から明らかになる。
（図面の説明）
図１：ラットの眼におけるインビボエレクトロトランスファ。
Ａ：辺縁周囲気泡の形成を導く毛様筋内の角膜トンネルを通した注入。
Ｂ：エレクトロトランスファ手順中の眼球内電極及び辺縁周囲外眼電極。
Ｃ：電流印加直後のエレクトロトランスファを受けた部位の外見。
Ｄ：環状眼周囲の戻り電極の写真。
図２：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドの注入及びエレクトロトランスファ後の毛様領域の横方向切片上のＧＦＰ発現。
Ａ：毛様筋（差込み図）を示すヘマトキシリン−エオシン組織像。
ａ：縦走線維（矢印）及び輪状線維（矢印の頭）を示すより高倍率の拡大図。
Ｂ：毛様筋内に局在化したＧＦＰの組織化学。矢印は複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わしている。核はＤＡＰＩで染色されている（複数の例が円で示されている）。
Ｃ：毛様筋の平滑線維を示すアルファ平滑筋アクチンの免疫組織化学。矢印は、複数のアクチン発現度の高い組織領域を表わしている。核はＤＡＰＩで染色されている（複数の例が円で示されている）。
図３：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１の注入及びエレクトロトランスファの後の毛様領域の前額切片上のＧＦＰ発現の局在化。
Ａ：毛様筋の輪状線維を示すヘマラン−エオシン組織学染色。
Ｂ：毛様筋の輪状線維内のＧＦＰの発現。ＧＦＰ発現度の高い組織領域は囲まれている。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。
Ｃ：毛様筋の縦方向線維内のＧＦＰの発現。ＧＦＰ発現度の高い組織領域は囲まれている。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。
Ｄ：毛様筋の平滑輪状線維を示すアルファ平滑筋アクチンの免疫組織化学。アクチン発現度の高い組織領域は囲まれている。
Ｅ：ＧＦＰの発現が毛様筋線維内にあることを実証するアルファ平滑筋アクチン及びＧＦＰの同時局在化。赤色及び緑色蛍光の付加の結果としてもたらされた黄色蛍光によって実証された同時局在化された発現領域が囲まれている。核は、ＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。
図４：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１の注入後の前額切片上のＧＦＰ発現の局在化。
Ａ：毛様体のわずかな疎細胞上のＧＦＰの発現。矢印は、複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わす。
ａ：より高倍率の拡大図。矢印は、複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わす。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で示されている）。
図５：毛様領域内でのＬＵＣ発現の反応速度。
両眼の毛様筋の中に３μｇのプラスミドｐＶＡＸ２ｌｕｃを注入した。注入の後、ラットの左眼内でのエレクトロトランスファを行なった。６日目、１２日目、２２日目及び３０日目に６匹のラットを屠殺した。
図６：眼構造の無欠性を示すエレクトロトランスファから５日後の毛様領域の組織学。特に電気穿孔の部位にはいかなる細胞浸潤もいかなる肉芽種も観察されなかった。エレクトロトランスファから５日後に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は全く観察されず、この時点でのアポトーシス細胞の不在を示していた。
図７：ＥＩＵの臨床的スコア。
Ａ：ＥＩＵの臨床的スコア。
ＥＩＵに罹患しているもののいかなる治療も受けていない眼（Ｂ）（スコア５）又は３μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１ＧＦＰプラスミドのエレクトロトランスファ後の眼（Ｃ）（スコア０）の細隙灯写真。
＊：Ｐ＜０．０００１対対照又は生理食塩水＋ＥＴ又はｐＶＡＸ２＋ＥＴ。
図８：ＥＩＵの組織学スコア。
Ａ：異なる治療計画後のＥＩＵに罹患した眼の前眼部及び後眼部内の浸潤細胞の平均数。
＊＊：Ｐ＜０．００５対対照；†：Ｐ＜０．０００２対ｐＶＡＸ２＋ＥＴ；＃＃：Ｐ＜０．０００１対ｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１−ＥＴ；＊：Ｐ＜０．００５対対照；＃：Ｐ＜０．００５対ｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１−ＥＴ。
Ｂ：対照ラット（ａ：角膜）（ｈ：虹彩／毛様体）、（ｃ：視神経）から及び３μｇのｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１．ＥＴで治療されたラット（ｄ：角膜）、（ｅ：虹彩／毛様体）、（ｆ：視神経）からの眼切片の顕微鏡写真。
図９：眼の生体構造。
図１０：毛様体及び角膜内へのｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）の注入及びエレクトロトランスファから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）分泌速度。分泌速度は、［１秒あたりの計数（ｃｐｓ）で表現された］蛍光を測定する分光器を用いて測定されている。
図１１：毛様筋内へのｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）のさまざまな電気的条件（電圧、パルス持続時間、パルス数及び周波数）での注入及びエレクトロトランスファから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）分泌速度。分泌速度は、［１秒あたりの計数（ｃｐｓ）で表現された］蛍光を測定する分光器を用いて測定されている。
図１２：ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１及びＧｌｕｃタンパク質を発現するプラスミド及びｐＶＡＸ２ｍＥｐｏプラスミド（１０μｇ）の毛様筋内への注入及びエレクトロトランスファから７日後の房水及び硝子体内でのガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１及びｍＥＰＯタンパク質の分泌。
図１３：ラットの毛様体内での注入（エレクトロトランスファ無し）の後のエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の臨床スコアに対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミド（３０μｇ）の効能。毛様体内のＴＮＦＲ−Ｉｓエンコーディングプラスミド３０μｇの注入は、房水内の２７４±７７ｐｇ／ｍｌのＴＮＦＲ−Ｉｓの分泌を可能にする。
図１４：それぞれ眼の前眼部及び後眼部内の浸潤細胞の平均数で表現されたラット毛様体内の注入（エレクトロトランスファ無し）後のエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の組織学スコアに対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１のプラスミド（３０μｇ）の効能。毛様体内の３０μｇのＴＮＦＲ−Ｉｓの注入は、房水内で２７４±７７ｐｇ／ｍｌのＴＮＦＲ−Ｉｓの分泌速度を可能にする。
図１５：環状手段及び針手段又は環状手段及びワイヤ手段を含むさまざまな電極装置を用いて毛様筋内にｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）を注入及びエレクトロトランスファしてから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）の分泌。印加された電界は、その電界強度が２００Ｖ／ｃｍである８つの電気パルスで構成されている。電界の印加の合計持続時間は各パルスについて２０ｍｓである。周波数は５Ｈｚである。電極間の転極は、遺伝子送達の効能を修正しない。
図１６：２つの電極を含む環状装置の例。注入のため及び／又は電極として、櫛形の第１の手段（灰色）の各先端部を使用することができる。第２の手段（黒色）は、第１の手段から分離されていてもよいし、又は２つの手段の間に一定の距離（２〜５ｍｍの間）を得るようにそれと固く結びつけられていてもよい電極である。

本発明は、生物活性のある作用物質又は生成物、特に核酸を眼細胞、特に眼の内部又は後方部分の細胞内に選択的に移入するための特に効率の良い方法について記述している。本発明は、（毛様筋、特に毛様平滑筋及び毛様上皮を含む）毛様体組織又は細胞内及び／又は（輪筋を含む）外眼筋組織又は細胞に投与することによって標的眼細胞内に核酸を特定的に移入することができるということを実証している。出願人らは本書において、治療用又は予防用生成物、特に治療用又は予防用核酸が、有利には毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞のレベルで投与され、罹患した眼細胞に分配されるということを記述している。治療的又は予防的生成物を発現する核酸の毛様体組織又は細胞内及び外眼筋組織又は細胞内の注入は、眼球に対して活性作用物質を送達するのに特に魅力的な投与様式を提供する。本発明は実際、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に投与された核酸が前記筋細胞に形質導入し、かくして前記細胞によるコードされた生成物の発現及び／又は分泌を可能にすることになる、ということを示している。分泌は、硝子体内及び／又は、眼の所望の眼球内組織、好ましくは例えば眼の虹彩、毛様体、網膜、視神経又は硝子体自体といったような眼の特定的部分の治療を可能にすることになる房水（眼球内媒質）内への発現生成物の連続的放出を可能にする。治療的又は予防用核酸の毛様体内及び／又は外眼筋内の投与は、眼の内部の治療的又は予防的生成物の大規模生産及び分配を導き、罹患した眼の部域の強力な治療を可能にする。

治療用核酸の毛様体（毛様体組織又は細胞及び／又は上皮又は上皮細胞）内及び／又は外眼筋内への投与が、眼の細胞を治療するための新しく非常に効率の高い方法を構成する。本発明によると、外傷及び／又は変性の場所に応じて、作用が所望されている眼球内組織をターゲティングすることが可能となる。特に、本発明は、有利にも、例えば医薬組成物にターゲティング配列を添加することにより異なる眼組織の細胞をターゲティングできるようにする。本発明は、より広汎性で眼球に制限されない前額部内（任意には眼球レベルまで）への定位的な注入に比べて外傷性が低くかつより特定的であるということが本願されてきた。本発明は同様に、例えば硝子体内の前記生成物の直接的投与に比べてインビボでの所望の治療用生成物の連続的かつ／又はターゲッティングされた生産を可能にするためはるかに効率が良いものでもある。

かくして本発明の目的は、治療すべき対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与することによって眼疾患を治療又は予防するための組成物を調製することを目的とする生物学的又は薬学的に活性な作用物質、好ましくは治療又は予防用核酸の使用に関する。毛様上皮は特異的にトランスフェクションを受けた時点で、特に高眼圧の治療のため、房水の生産を調節できる翻訳タンパク質又はペプチドを生産するために使用される。毛様上皮内でのトランスフェクションの場合、ペプチド又は翻訳タンパク質は、房水の生産を局所的に調節するように設計されており、従ってこのような場合には局所的投与が必要とされる。

投与
前述のように、長年にわたり多大な知識が蓄積されてきたが、従来の方法により真核細胞内に生成物、特にペプチド、タンパク質及び核酸をインビボ投与することには数多くの問題が往々にして付随している。標準的には、治療的効果を得るために、アプタマー又はアンチセンスオリゴヌクレオチドといったような小型核酸を、侵襲針を用いて頻繁に注入しなくてはならない。同様にして、トランスフェクションのためにＤＮＡを送達する場合、異種核酸でのトランスフェクションを受けるべき標的細胞のうちの僅かな割合のみが実際に、トランスフェクションを受けたトランス遺伝子から転写及び翻訳された問題の生成物特に問題のｍＲＮＡ又はタンパク質を満足のいくレベルで発現する。さらに、合成オリゴヌクレオチドを含むものといったような一部の治療用組成物は、非常に高価で、毒性をもち、分解可能であり、従って非常に局所化された施用、標的細胞内への効率の良い内在化及び頻繁な投与を必要とする。最後に、望ましくない全体的毒性のリスクをもつタンパク質例えばサイトカイン、抗体、抗サイトカイン例えば抗ＴＮＦα可溶性レセプタ又は現行の技術からのその他のタンパク質は局所的に送達することが有利である可能性がある。例えば、体系的に投与される抗ＴＮＦα可溶性レセプタが結核のリスクを増大させることが示されてきている。本発明に従った方法及び使用は、任意の生物活性をもつ生成物又は作用物質の長期にわたる局所的発現を誘発するように設計されている。出願人らはここで、生物活性をもつ作用物質、特に治療用又は予防用核酸又はかかる作用物質を含む組成物を毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内に投与することにより毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞は、生理学的及び／又は治療的又は予防的用量で作用物質を生産又は分泌することになる、ということを記述している。筋肉発現生成物は例えば、硝子体及び房水内の連続的放出により、罹患した眼細胞に分配され得る。

かくして、本発明の目的は、生物活性をもつ作用物質、特に治療用又は予防用核酸又はかかる作用物質を含む本発明に従った組成物の、治療すべき対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞への投与に関する。

本発明に従った生物活性をもつ作用物質、特に核酸又は組成物は例えば、経結膜、経強膜、経角膜、眼球内（好ましくは外科手術中）又は内視鏡経路によって投与可能である。注入は外科的気体輸注と組合せてか又はこれを伴わずに、硝子体茎切除術の間に実施され得る。投与は、唯一の注入部位により、又は多数の注入部位で実施可能である。

本発明の好ましい実施形態においては、投与は、毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内に直接実施され、好ましくは、前記筋肉内への生物活性をもつ作用物質の注入ステップを含む。かかる直接注入は、経結膜、経強膜又は経角膜経路で実施可能である。

毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内への直接的投与又は移入は、「遺伝子銃」で用いられる金粒子といった薬学的に送達された生物活性をもつ作用物質でコーティングされた粒子を使用することによって、数多くの技術例えば電気穿孔、外科的処置、熱処置、イオン導入、超音波導入による技術を用いて実施可能である。粒子衝突装置又は「遺伝子銃」では、コーティングされた高密度粒子（例えば金又はタングステン）を、眼組織又は細胞への貫入を可能にする高速まで加速するように推進力が生成される。

本発明の好ましい実施形態においては、ここでは「エレクトロトランスファ」という用語でも無差別的に呼称されている電気穿孔法によって投与が実施されるか、又は、注入ステップに加えて電気穿孔ステップが含まれる。電気穿孔には、該出願の中で後により詳細に記述されているように、電界の印加が含まれる。

発明者らは、毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内への生物活性をもつ核酸の機械的又は物理的注入が、トランスフェクションを受け持続的マーカー発現を有する細胞を高い百分率で生成することを本願した。

上述の方法のいずれかの代りに又はそれらに加えて直接的でない投与も実施することができる。非直接的投与は通常、血流といったような体液内への医薬品の注入を含み、該医薬品は有利には、毛様体組織又は細胞又は外眼筋組織又は細胞に対するアドレッシングシグナル配列を含む。細胞レセプタベースのエンドサイトーシス方法又は化学物質媒介型摂取を用いて、非直接的投与を実施することができる。

レセプタベースのエンドサイトーシス方法においては、（細胞表面レセプタに特異的な）リガンドが、問題の医薬品好ましくは核酸と複合体を形成させられる。該複合体はこのとき、対象の血流といった体液の中に注入される。細胞表面レセプタを有する標的細胞はリガンドを特異的に結合させ、リガンド−生成物複合体を細胞内に輸送する。

化学物質媒介型摂取は、リン酸カルシウムトランスフェクションであり得、そうでなければ、融合性脂質小胞例えばリポソーム又はその他の膜融合用小胞の使用が関与し得る。問題の医薬品好ましくは問題の核酸を抱く担体は、体液中に適切に導入され得、その後毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に部位特異的に導かれ得る。例えば毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞特異的な治療用又は予防用生成物を担持するリポソームを開発することができ、該リポソームが担持する生成物をこれらの特異的細胞に吸収させることができる。毛様体組織又は細胞上及び／又は外眼筋組織又は細胞上の特異的レセプタに対しターゲティングされた免疫リポソームの注入を、そのレセプタを担持する眼球筋細胞内に治療用又は予防用生成物を挿入する適切な方法として使用することができる。

毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対する機械的、物理的又は化学的送達のいずれか、又はこれらの異なる方法の組合せには、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞内での薬物の拡散を増強し場合によって細胞摂取を増強させることになるヒアルロニダーゼ、ジスパーゼ、アルファキモトリプシンなどといった酵素の予備的使用が関与し得る。

ひとたび細胞内に入ると、細胞又は核（ｎｕｃｌｅａｒ、ｎｕｃｌｅｕｓ）環境内においてヌクレオチド配列に治療用物質を生産させることができる（エピソーム性か又は染色体への組込み後）。核取込みされたヌクレオチド配列は、以上で説明された通り、永久的を含め長期間にわたり治療用生成物を生産することができる。

所望の治療用又は予防用生成物は、例えば生成物が核酸である場合、レシピエントである毛様体組織又は細胞及び外眼筋組織又は細胞内で突然変異が発生することなく核酸レベルを維持するように、生成物レベルを維持するべく周期的に再投与されてもよい。

電気穿孔
標的細胞内への核酸のインビボ移入を可能にするか増強する方法の中でも、特に電気穿孔を挙げることができる。電気穿孔手段は、核酸といったような生物活性をもつ作用物質に対する細胞膜及び／又はターゲティングされた組織の少なくとも一部分の透過性を担当し、つまりこれを増加させる。さらに、電気泳動効果により組織を通して又は細胞膜を横断して細胞内に作用物質を輸送するか又は移動させることができるようにするため、一定の与えられた電界強度をもつ短かい電気インパルスが使用される。電気穿孔技術は、当業者にとって周知である。

この方法は、細胞が、一般に電流を通過させることのできない電気コンデンサとして作用するという原理に基づいて機能する。細胞を電界に付すことにより、細胞膜の中に過渡的な透過性構造又は微細孔が作り出される。細孔は、調合薬及び／又は核酸が細胞に出入りできるように充分なほどに大きいものである。細胞膜内に簡単に形成された「細孔」の結果として、生物活性をもつ分子は最初、細胞質又は核の中に入り、この中でこれらの分子は必要な場合には研究対象とすべきそれらの機能をすでに発揮することができる。経時的に、細胞膜内の細孔は閉じ、細胞は再び不透過性となる。細孔効果に加えて、ポリアニオン荷電ヌクレオチドは同様に、印加された電気パルスの電気泳動効果により、組織及び細胞内へと駆動される。

本願では、出願人らは、毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋組織又は細胞内への生物活性をもつ作用物質の移入が、約１〜６００ボルト／ｃｍ、好ましくは１〜４００ボルト／ｃｍの間、さらに一層好ましくは約５０〜２００ボルト／ｃｍの間、有利には約５０〜１５０ボルト／ｃｍ、７５〜１５０ボルト／ｃｍ又は５０〜１００ボルト／ｃｍの間の電界強度をもつ１つ以上の電気パルスから成る電界を所望の眼組織に印加することによって可能となる又は増加し得るということを実証している。本発明において使用可能である特に好ましい電界強度は、２００ボルト／ｃｍの強度である。

電界の合計印加時間は、０．０１ミリ秒〜１秒の間、好ましくは０．０１〜５００ミリ秒の間、より好ましくは１〜５００ミリ秒の間、さらに一層好ましくは１又は１０ミリ秒超であり得る。好ましい実施形態においては、電界の合計印加時間は１０ミリ秒〜１００ミリ秒の間であり、好ましくは２０ミリ秒である。

印加される電気パルスは、例えば１〜１００，０００個の間であり得る。その周波数は０．１〜１０００ヘルツの間に含まれていてよい。これは好ましくは一定の周波数である。電気パルスは、同様に、互いに不規則に送達されてもよく、１つのパルスに関する時間の関数として電界の強度を表す関数は、好ましくは可変的である。送達される電界は、例えば、少なくとも１ミリ秒未満の４００ボルト／ｃｍ超の第１の電界と４００ボルト／ｃｍ未満で約１ミリ秒の１つ以上の電気パルスとの組合せであり得る。送達される電界は、さらに、例えば少なくとも１ミリ秒未満の２００ボルト／ｃｍ超の第１の電界と、２００ボルト／ｃｍ未満で約１ミリ秒の１つ以上の電気パルスとの組合せであり得る。

時間に伴う電界の変動を表す関数の積分は好ましくは１ｋＶ×ミリ秒／ｃｍ超、さらに一層好ましくは５ｋＶ×ミリ秒／ｃｍ以上である。

好ましい実施形態においては、組織又は細胞に印加される電界は、周波数が１〜１０Ｈｚの間、好ましくは５Ｈｚである１〜１０個のパルスの間、好ましくは８個のパルスである。

電気パルスは単極又は双極波パルスであり得る。これらは、例えば方形波パルス、指数関数的逓減波パルス、制限された持続時間の単極振動波パルス、制限された持続時間の双極振動波パルス又はその他の波形の中から選択され得る。優先的に、電気パルスは、方形波パルス又は双極振動波パルスを含む。

本発明の特定の実施形態においては、投与は、１パルスあたり２０ｍｓの電界の合計印加時間について各パルスの強度が２００ボルト／ｃｍである、５Ｈｚの周波数の８単極方形波パルスを含む電界を組織に対して印加することを伴う電気穿孔ステップを含む。

電気穿孔は、標準的には組織表面に印加される電極対の間に電圧パルスを印加することによって実施される。電圧は、電極間の距離に比例して印加されなくてはならない。電極間の距離が過度に大きい場合、生成される電界は、組織内に奥深く侵入し、そこでこれは不快な神経及び筋肉反応をひき起こす。

本発明においては、電圧パルスは好ましくは、１センチメートル未満だけ互いに離隔した少なくとも２つの電極を用いて印加されるようになっており、前記電極のうちの少なくとも１つが毛様体組織又は細胞内又は外眼筋組織又は細胞の中に導入される。好ましくは、前記電極のうちの少なくとも１つが強膜又は眼結膜、好ましくは辺縁結膜上に適用される。

電極は、好ましくは、互いに１０ミリメートル未満、より好ましくは９、８、７、６、５、４、又は３ミリメートル未満、さらに一層好ましくは２ミリメートル又は１ミリメートル未満だけ離隔されている。

本発明に従った上述の使用においては、電気穿孔ステップの前後、その間に、好ましくはこのステップの前に、イオン導入ステップを実施することができる。イオン導入は、（例えば０．５〜２ｍＡ／ｃｍ^２の間である密度といったような）小さい電流密度が関与する電界を用いて組織を通して体内に生成物を投与することを特徴とする。１つの電極を治療すべき部位に配置し、一方電気回路を閉じるよう意図された第２の電極を体のもう１つの部位に設置する。これらのイオン導入電圧は０．００１〜４０Ｖ／ｃｍの範囲内にあり、数秒から最長数時間（経眼瞼イオン導入について）、好ましくは最長１０分、より一層好ましくは最長７分又は最長５分間（イオン導入が直接眼に適用される場合）持続する。

イオン導入を通した治療薬の経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ、ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達用の装置が皮ふ又は眼疾患を治療するために一般に用いられており、かくしてすでに開示されてきた。従って当業者であれば、標的細胞を含む眼組織に適したイオン導入装置及びその使用条件、特に電流密度、電流印加時間及び電極形態及び場所などを容易に選択し決定することができると思われる。本発明に従った方法における上述の通りの生物活性をもつ作用物質、好ましくは核酸の眼内送達のために使用することのできるイオン導入装置のうち、米国特許第６，５１４，６７１号明細書において開示されているイオン導入システムが好ましい。

装置
本発明は同様に、本発明に従った送達方法の中で使用可能な装置にも関する。特定の実施形態においては、前記方法は電気穿孔ステップで構成されているか又はこれを含んでいる。しかしながらかかる電気穿孔ステップは、療法に適した条件で、毛様体組織又は細胞内又は外眼筋組織内で本発明に従った組成物の注入を達成するのに義務的なものではない。

かくして本発明の目的は、対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対して組成物を投与するための電気穿孔装置であって、
（ｉ） 前記組織又は細胞内に組成物を注入するための少なくとも１つの手段であって、それが注入針、注入針電極、少なくとも１つの注入針又は１つの注入針電極を含む極微針アレイ又はそれらの組合せである手段、
（ｉｉ） 任意には、組成物の注入を開始するのに充分な深さまで針が挿入された時点でそれを検知するための手段であって、前記深さが０．１〜１０ｍｍの間、好ましくは０．２〜０．９ｍｍの間に含まれている（有利には、この深さは約０．５ｍｍ又は厳密に０．５ｍｍである）手段、
（ｉｉｉ） 任意には、強膜又は眼結膜の表面上に前記注入手段を位置決めするための手段、及び
（ｉｖ） 任意には、予め定められた電気信号を生成するための手段
を含む電気穿孔装置に関する。

組成物を注入するための手段は、注入針、注入針電極、少なくとも１つの注入針又は１つの注入針電極を含む極微針アレイ又はその組合せであり得る。注入針及び／又は注入針電極の長さに沿ってならびにその端部に、注入された物質の分配を改善させるための穴を設けることができる。さらに、注入針及び／又は注入針電極のうちの１つ以上のものは中空であり得、毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋又は細胞内に治療用又は予防用作用物質を注入できるようにする開口部を内含し得る。代替的には、組成物を注入するための手段は、遺伝子銃装置、カテーテルなどといった当該技術分野に熟練した実験者が熟知している任意の手段であり得る。

注入針又は注入針電極の長さは、０．１ｍｍ〜４ｃｍの間に含まれるものであり得る（例えば３、２又は１．５ｃｍ）。標的組織（毛様体組織又は外眼筋組織）に侵入する注入針又は注入針電極部分の長さは、有利には０．１ｍｍ〜２ｃｍの間、好ましくは０．１ｍｍ〜１０ｍｍの間、さらに一層好ましくは０．２〜０．９ｍｍの間に含まれる（例えば３、４、５、６、７又は８ｍｍ）。注入針又は注入針電極の長さは好ましくは、約０．１〜０．９ｍｍの間に含まれ（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７又は０．８ｍｍ）、好ましくは約０．５ｍｍ又は厳密に０．５ｍｍである。

該装置はさらに、組成物の注入を開始させるのに充分な深さまで針が挿入された時点でそれを検知するための手段を含むことができ、ここで前記深さは０．１〜１０ｍｍの間、好ましくは２〜９ｍｍの間に含まれている。例えばこの深さはおよそ又は厳密に０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４又は５ｍｍである。本発明に従った組成物の注入をいつ開始するかを選択することができる。理想的には、針の先端部が問題の毛様体組織（筋肉又は上皮）又は外眼筋組織に達した時点で、注入が開始され、装置は好ましくは、組成物の注入を開始するのに充分な深さまで針が挿入された時点でそれを検知するための手段を含んでいる。このことはすなわち、針が（通常は筋肉組織が開始する深さとなる）所望の深さに達した時点で自動的に組成物の注入を開始するよう促すことができる、ということを意味している。筋肉組織が開始する深さは、例えば０．１〜１０ｍｍ、好ましくは２〜９ｍｍの間に含まれる予め設定された針挿入深さとなるように取ることができる。例えば、この深さは、針が強膜又は眼結膜にたどりつくのに充分であるとみなされるおよそ又は厳密に０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４又は５ｍｍであり得る。

１つの好ましい実施形態においては、検知手段は超音波プローブを含む。

代替的な好ましい実施形態においては、該検知手段は、インピーダンス又は抵抗の変化を検知するための手段を含む。この場合、該手段は、かくして体内組織の中の針の深さを記録するのではなく、むしろ針がさまざまなタイプの体内組織から眼の中へと移動するにつれてインピーダンス又は抵抗の変化を検知するように適合されている。

望まれる場合にはさらに針の挿入深さを記録することができ、これを用いて、注入すべき組成物の量が針挿入深さの記録につれて決定されるような形で組成物の注入を制御することができる。

上述の装置はあらゆるタイプの注入のために使用することができる。ただしこれは、電気穿孔の分野で特に有用であるものと想定されており、従って好ましくはこれは、特に予め定められた電気信号を生成するため針に電圧を印加するための手段をさらに含んでいる。こうして、該針は注入のためだけでなく電気穿孔中に電極としても使用することができる。このことは、電界が注入された組成物と同じ部域に印加されることを意味することから、きわめて有利である。

好ましい実施形態においては、注入装置には、互いに１センチメートル未満だけ離隔している少なくとも２つの電極が含まれており、前記電極のうち少なくとも１つはその他の電極のものと異なる極性を有する。有利には、前記少なくとも２つの電極のうちの少なくとも１つは先に定義された通りの注入手段である。

電極は好ましくはワイヤタイプの電極及び平板コンタクトタイプの電極から選択され、各タイプの電極は、強膜又は眼結膜、好ましくは辺縁結膜の表面上に反転可能な形で適用されるように任意に適合されている（例えばそれらが少なくとも部分的に環状である場合）。

第１の実施形態においては、ワイヤタイプの電極は、例えば、好ましくは辺縁から数ミリメートル、好ましくは１．５〜４ｍｍ（さらに一層好ましくは成人の眼の中の辺縁から２．５ｍｍ）の距離のところで組成物を注入する一方で作られた唯一のトンネル又は複数のトンネルのうちの１本の中で、眼の中に経結膜及び経強膜的に導入され得る。ワイヤは例えば辺縁に平行に導入される。ワイヤはこのとき約２〜１０ｍｍの間に含まれる距離で毛様体内に進入可能である。かかるワイヤ電極は、少なくとも１つの平板コンタクトタイプの電極、又は少なくとももう１本のワイヤ電極（例えば環状）又はこれらの組合せと共に使用することができる。環状電極は、例えば、戻り電極として使用可能であり、例えば眼球内ワイヤ電極から１〜９ミリメートルの間に含まれる距離のところで、辺縁のまわりを角膜を通して導入され得る。好ましくは２つ以上の電極が同時に使用される。

２つの電極のみが使用され、例えば両方が環状電極である場合、１つの電極は、不利な効果を全く誘発することなくもう一方の電極を被覆することができる。

上述の要領で使用されるワイヤタイプの電極は、その他の電極タイプに比べ侵襲性が低くさらに使用が容易であることから有利である。ワイヤ電極は同様に電極の電気的表面積の増大を可能にし、かくしてより優れたトランス遺伝子発現を導く。

第２の実施形態においては、ワイヤタイプの電極の形状は、環又はその一部分の形である。かかるワイヤは有利にも、強膜又は眼結膜、好ましくは辺縁結膜の表面上に反転可能な形で適用されるように適合されている。

ワイヤ電極の長さは、１ミリメートルから３センチメートルの間、好ましくは１〜１０ミリメートルの間に含まれ得る。ワイヤ電極は、環状をしている場合、さらに長いもの（５、３センチメートル又はそれ以下）となる。当然のことながら、経強膜的に導入されるように適合された場合、それはより短かいものとなる（例えば１、２、３、４又は４ミリメートル）。

平板コンタクトタイプの電極は、湾曲していてもいなくてもよい。これは同様に、少なくとも２個の先端部（好ましくは３〜２０個、例えば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９個の先端部）を含む櫛の様に設計されていても、又そうでなくてもよく、前記先端部のうちの少なくとも１つは、該装置の注入手段を含む。ワイヤ電極の幅は好ましくは約１センチメートル未満、好ましくは０．５ミリメートル未満である。

特定の実施形態においては、平板コンタクト電極は、好ましくは剛性材料でできており、強膜又は眼結膜の表面の幾何形状に適合し湾曲した形状を有する。

さらなる実施形態においては、平板コンタクト電極は好ましくは、強膜又は眼結膜の表面の幾何形状に適合した可とう性材料で作られている。

少なくとも２つの電極は好ましくは１．５又は１センチメートル未満、さらに一層好ましくは１５又は１０ミリメートル未満、好ましくは１４、１３、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ミリメートル未満だけ離隔している。各電極間の距離は有利には１ミリメートルさらにはそれ以下である。

装置が少なくとも２つの電極を含む場合、前記電極は独立したものであっても、互いに連結されていてもよい。

電極は有利には、例えばイリジウム又は白金から選択される導電性の非酸化金属で作られている。本発明に従った装置は有利には、注入の前及びその間に強膜又は眼結膜の表面上に前述の注入手段を位置決めする、及び／又は維持するための手段を含み得る。位置決め手段は、有利には、強膜又は眼結膜、好ましくは辺縁結膜の表面上に反転可能な形で適用されるように適合されている。

位置決め手段は、注入手段に対し反転可能な形で連結され得る。それは、少なくとも１つの電極及び／又は針が眼内の充分な深さまで挿入された時点でそれを検知するための手段にさらに連結され得る。

位置決め手段は環状手段又はその一部であり得る。それは、剛性材料製であり得、強膜又は眼結膜の表面の幾何形状に適合された湾曲した形状を有していてよく、そうでなければ、強膜又は眼結膜炎の表面の幾何形状に適合した可とう性材料でこれを作ることもできる。

１つの特定の実施形態においては、本発明に従った装置の位置決め手段は、少なくとも２つの先端部を含む、湾曲していてよい櫛様に設計されており、前記少なくとも２つの先端部のうちの少なくとも１つは、前述の通り注入手段を含む。

環状位置決め手段の内径は、好ましくは１０〜２０ｍｍの間、さらに一層好ましくは１３〜１４ミリメートルの間に含まれ、環状位置決め手段の外径は、好ましくは１５〜２５ミリメートルの間、さらに一層好ましくは１５〜１６ミリメートルの間に含まれる。

先端部の長さは好ましくは０．１ｍｍ〜３ｍｍ又は１ｍｍの間、好ましくは０．４ｍｍ〜０．８ｍｍの間に含まれ、さらに一層好ましくは０．５ｍｍである。

環状手段又はその一部分と先端部との間の角度は、所要注入深さによって変動し、１°〜９０°の間、例えば５°、１０°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°及び８０°であり得る。

特定の一実施形態においては、本発明に従った装置の位置決め手段は、複数の注入針及び／又は針電極が中を通って延びる複数の中ぐりを有することもでき、針電極に対応する中ぐりは、使用中に１つの電源に対し各々の電極を接続できるような形で導線に別々に接続されている。針の絶縁部分に隣接する生体組織を使用中に電極が生成する電界から絶縁するように、各電極の中央部分に沿って絶縁部分を具備することができる。

もう１つの特定の実施形態においては、本発明に従った装置の位置決め手段は環状をしていてよく、環の両側に挿入された電極を有し得る。このとき第１の電極セットを注入手段として、かつ同時に正又は負の電極としても使用することができ、一方残りの電極（第２の電極セット）は、第１の電極セットと異なる極性を有する。両方の電極セット共、毛様体（特に毛様筋）の中に挿入することができる。電極間の距離は、好ましくは１０〜２０ミリメートルの間、さらに好ましくは１２〜１７ミリメートルの間に含まれる。この特定のケースにおいては、平板−コンタクト−戻り電極をさらに使用する必要はない。

本発明に従った特定の装置は、以下のものを含んでいる。
（ｉ） 前記組織又は細胞内に組成物を注入するための少なくとも１つの手段であって、それが少なくとも２つの注入針電極を含む極微針アレイである手段、
（ｉｉ） 任意には、組成物の注入を開始するのに充分な深さまで針が挿入された時点でそれを検知するための手段であって、前記深さが０．１〜１０ｍｍの間、好ましくは２〜９ｍｍの間に含まれている（有利にはこの深さはおよそ又は厳密に０．７又は０．５ｍｍである）手段、
（ｉｉｉ） 強膜又は眼結膜の表面上に前記注入針電極又は極微針アレイを位置決めするための手段であって、環状でかつ少なくとも２つの先端部を含む櫛の様に設計され、前記先端部の各々が少なくとも２つの注入針電極のうちの少なくとも１つを含んでいる手段、及び
（ｉｖ） 予め定められた電気信号を生成するための手段。

上述のもののような装置においては、使用される電極の唯一のアレイは、注入手段であり、それぞれに櫛の各先端部内に含まれている１つの電極と次の電極の間で交互の極性を付与する電源（電気信号を生成するための手段）を用いて電気パルスが送達され得る。

装置はさらに組成物の輸液のためのパイプシステムを含み得る。

投与される組成物には、本出願内で記述されている通りの本発明に従った組成物、又は生物活性をもつ作用物質、好ましくは治療用又は予防用の核酸が含まれる。

投与はインビボで実施されることから、外部の非侵襲的電極との電気的連続性を確保することのできる中間生成物を使用することが時として有用であり得る。例えば、それは、上述の本発明に従った組成物を調製するのに用いられるものといったような電解質であり得る。

本発明は少なくともその好ましい実施形態において、インビボで特に遺伝子療法において使用することのできる装置を提供しようとしている。

薬理活性をもつ作用物質
本発明は、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞での投与が眼組織又は細胞に対して薬理活性をもつ作用物質を送達するための手段を提供するという本願に関係する。

かかる作用物質は、天然に又は非天然に発生するものであり得る。非天然発生分子は例えば、人工的、合成、キメラ又はトランケートされた分子であり得る。

本書で使用されているように、天然発生分子は、所望であれば「実質的に精製され」得、そのため、その分子を含有する天然発生調製物の中に存在するか又は存在し得る１つ以上の分子は除去されてしまっているか、又はそれが通常本願されるはずの濃度よりも低い濃度で存在することになる。

本書で使用される通りの治療用生成物又は薬理活性をもつ作用物質は、例えば核酸分子、タンパク質及びそのあらゆる誘導体又は一部分から選択される、生物活性をもつ有機分子を含む。これらの作用物質は、人工的又は合成（とりわけ生合成）由来のものであり得、そうでなければ、ウイルス（例えばＡＡＶ又はＡＤＶ）から、又は単細胞又は多細胞真核又は原核性物から抽出可能である。これらは例えば、ヒト由来、その他の哺乳動物、植物、細菌又はウイルス由来のものであり得、そうでなければ、所望の生物学的効果を保持するその誘導体であり得る。

本発明の作用物質は事実、好ましくは、構造的属性、例えばもう１つの核酸分子に対しハイブリッド形成する１つの核酸の能力又は抗体によって結合される（又はかかる結合のためもう１つの分子と競合する）タンパク質の能力のいずれかに関して「生物活性を有する」ことになる。代替的には、かかる属性は触媒属性であり得、かくして、これには、予防的又は治療的生物学又は化学反応を調節、媒介又は誘発する作用物質の能力が関与し得る。

本書で使用する「誘導体」という用語は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の化学的修飾体を意味する。

ポリヌクレオチド配列の化学的修飾には、例えばアルキル、アシル又はアミノ基による水素の交換が含まれる可能性がある。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、例えばグリコシル化又はその他の任意のプロセスによって修飾され、その誘導のもととなったポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を保持しているものである。

本書で使用される「遺伝子」又は「組換え遺伝子」という用語は、エクソン及び（任意には）イントロン配列を含む生物活性をもつ作用物質をコードする読取り枠を含む核酸を意味する。

本発明に従った特に好ましい薬理活性をもつ作用物質すなわち治療用又は予防用作用物質は核酸である。

本発明で使用されるべき核酸は、問題の任意の核酸、すなわち以上で説明されている通り生物学的特性を示す任意の核酸であり得る。より詳細には、該核酸は、上述の通り、生物活性を示す天然の、トランケートされた、人工の、キメラ又は組換え型の生成物［例えば問題のポリペプチド（タンパク質又はペプチドを含む）、ＲＮＡなど］をコードするあらゆる核酸であり得る。核酸は、好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、人工ＤＮＡ、組換えＤＮＡなど）又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｓｉ、触媒ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなど）である。該核酸は、１本鎖又は多重鎖核酸、好ましくは２本鎖核酸であり得、そうでなければ複合体形成されていてもよい。該核酸は、ハイブリッド配列又は合成又は半合成配列を含み得る。それは当業者にとって既知のあらゆる技術によって得られ、特にライブラリスクリーニング、化学合成又は代替的にはライブラリスクリーニングによって得られた配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合型方法によって得ることができる。

特定の実施形態においては、治療用核酸は、合成又は生化学由来のものであるか又はウイルスから又は単細胞又は多細胞真核又は原核生物から抽出される。

本発明で使用される治療用核酸は、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋又は細胞に投与される場合、裸の核酸であっても、又任意の化学的、生化学的又は生物学的作用物質に複合されても、又ベクターなどの中に挿入されてもよい。

本書で使用されている通り、「裸のＤＮＡ」という用語は、前記ＤＮＡの送達又は移入を改善するか又は細胞内へのその進入を促進する合成、生合成、化学、生化学又は生物学的作用物質に組合わされていないあらゆる核酸分子を意味する。

本書で使用される「ベクター」という用語は、自らが連結されているもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。この用語は同様に、本出願においては、その細胞送達を増大させるため治療用又は予防用核酸に結びつけられる組成物といったようなあらゆる送達担体をも意味している。

好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の自己複製及び／又は発現能力をもつベクターである。自らが操作可能な形で連結されている遺伝子の発現を導く能力をもつベクターは、本書では「発現ベクター」と呼ばれている。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、往々にして、そのベクター形態では染色体に結合されない環状２本鎖ＤＮＡループを意味する「プラスミド」の形をしている。本発明においては、プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用されている形態である。プラスミドは、本発明に従った裸のＤＮＡの好ましい形態である。

ベクターは同様に、エピソームＤＮＡ、酵母人工染色体、ミニ染色体又はウイルスベクターでもあり得、ここで該ウイルスベクターはレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びウイルス様ベクターからなる群から選択される。

ベクターは同様に、リポソームといったような脂質小胞でもあり得る。リポソームではない脂質ベースの化合物をさらに使用することができる。例えば、リポフェクチン及びサイトフェクチンは、負に帯電した核酸に結合しかつ細胞膜を横断してＤＮＡを運ぶことのできる複合体を形成する脂質ベースの正のイオンである。本発明は、同等の機能を果たし、その後で当該技術において知られるようになったその他の形態の発現ベクターを含み入れるように意図されている。

さらに、本発明に従った核酸は同様に、例えば、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋又は細胞の中での発現を可能にしかつ／又はそれを促進する配列、転写終結シグナル、分泌配列、複製起点及び／又は細胞核に対するポリヌクレオチド移入をさらに増強する核局在化シグナル（ｎｌｓ）配列などのプロモータ領域（構成的、調節される、誘発可能、組織特異的領域など）といった当業者が利用できる小型又は大型の調節要素などの１つ以上の付加的な領域を含有し得る。このようなｎｌｓ配列は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原配列を含め、文献中で記述されてきている（ディングウォール（Ｄｉｎｇｗａｌｌ）及びラスキー（Ｌａｓｋｅｙ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．第１６号（１９９１年）４７８頁；カルデロン（Ｋａｌｄｅｒｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ第３１１号（１９８４年）３３頁）。

加えて、核酸はさらに、核酸移入の結果（どの組織への移入か、発現持続時間など）を選択、測定及び監視する上で有用である選択可能なマーカーを含み得る。使用可能な又は使用に適合させることのできる発現系及びレポータ遺伝子のタイプは、当該技術分野において周知である。例えば、ルシフェラーゼ活性、アルカリホスファターゼ活性又は緑色蛍光タンパク質活性についてコードする遺伝子が一般的に使用されている。アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）、及び１９９９年５月までの追補］を参照のこと。

本発明に従った核酸はあらゆるサイズのあらゆるヌクレオチド配列を含有し得る。かくして核酸は、単純なオリゴヌクレオチドからより大きな分子、例えばエクソン及び／又はイントロン及び／又はあらゆるサイズ（大または小）の調節要素を含むヌクレオチド配列、あらゆるサイズ、例えば大きなサイズの遺伝子又は例えば染色体に至るまで、サイズが変動していてよく、プラスミド、エピソーム、ウイルスゲノム、ファージ、酵母人工染色体、ミニ染色体、アンチセンス分子などであり得る。

特に好ましい実施形態においては、ポリヌクレオチドは、生物活性を有する生成物をコードするプラスミドといったような２本鎖環状ＤＮＡである。

核酸は、増幅、原核又は真核宿主細胞内での培養、精製などといった従来の組合せＤＮＡ技術に従って調製及び生産可能である。組換えＤＮＡ技術の技法は、当業者にとっては既知のものである。組換え分子のクローニング及び発現のための一般的方法は、本明細書に参照により援用されているマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８２年）中、及びアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９８７年）の中で記述されている。

好ましい生物活性をもつ物質は、眼科用活性物質、すなわち、眼細胞に対し有益な効果を及ぼす能力をもつ物質である。それは過剰な内因性物質の低減における、又はその欠如を代償する能力を有する物質であり得る。代替的には、それは細胞に対し新しい特性を付与する物質であり得る。これは例えば、眼細胞の機能、形態、活性及び／又は代謝に影響を及ぼし得るポリペプチド又はアンチセンス配列であり得る。

アンチセンス核酸を用いた遺伝子発現のダウンレギュレーションは、翻訳又は転写レベルで達成可能である。本発明のアンチセンス核酸は好ましくは、内因性眼活性物質をコードする核酸と特異的にハイブリッド形成する能力をもつ核酸フラグメント又は対応するメッセンジャＲＮＡである。これらのアンチセンス核酸は、任意にはその安定性及び選択性を改善するべく修飾される合成オリゴヌクレオチドであり得る。これらは同様に、細胞内でのその発現が、内因性眼科用活性物質をコードするｍＲＮＡの全て又は一部分に相補的なＲＮＡを生産させるＤＮＡ配列でもあり得る。アンチセンス核酸は、反対の向きでの内因性眼科用活性物質をコードする核酸の全部又は一部分の発現により調製され得る。それが内因性眼科用活性物質の発現をダウンレギュレートするか又は遮断する能力を有するかぎり、アンチセンス配列のあらゆる長さが本発明の実践に適している。好ましくは、アンチセンス配列の長さは、少なくとも２０ヌクレオチドである。アンチセンス核酸の調製及び使用、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ及びオリゴ及び遺伝的アンチセンスの使用については、その内容が本明細書に参照により援用されている国際公開第９２／１５６８０号パンフレットの中で開示されている。

以上で記述されている通りの核酸により任意に発現されるか又は生物活性をもつ作用物質として使用可能でありかつ本発明の実践に適している生物活性をもつポリペプチド又はタンパク質としては、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症性因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼ阻害物質、アポトーシス調節因子、凝固因子、そのレセプタ、特に可溶性レセプタ、レセプタ又は接着タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストであるペプチド、抗原、抗体、そのフラグメント又は誘導体及び細胞のその他の必須成分がある。

さまざまな網膜由来の神経栄養因子が変性光受容細胞を救助する潜在力を有しており（リー（Ｌｉ）及びターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）、１９８８年ａ，ｂ；リー（Ｌｉ）ら、１９９１年；アンチャン（Ａｎｃｈａｎ）ら、１９９１年；シードロ（Ｓｈｅｅｄｌｏ）ら、１９８９年、１９９３年；ギュモ（Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ）及びセプコ（Ｃｅｐｋｏ）、１９９２年；スティール（Ｓｔｅｅｌｅ）ら、１９９３年）、本発明に従った方法を通して送達可能である。

好ましい生物活性をもつ作用物質は、ＶＥＧＦ、アンギオジェニン、アンギオポイエチン−１、Ｄｅｌ−１、酸性又は塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、散乱因子（ＳＦ）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−ａｌｐｈａ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管透過因子（ＶＰＦ）、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＰＥＤＦ、ＮＴ３、ＢＦＧＦ、アンギオポイエチン、エフリン、ＥＰＯ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ＮＴ５、Ｇａｘ、成長ホルモン、α−１−アンチトリプシン、カルシトニン、レプチン、アポリポタンパク質、ビタミン生合成酵素、ホルモン又はニューロメディエータ、ケモカイン、サイトカイン例えばＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、それらのレセプタ、前記レセプタのいずれかを遮断する抗体、ＴＩＭＰ、例えばＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、ＴＩＭＰ−４、アンギオアレスチン、エンドスタチン、例えばエンドスタチンＸＶＩＩＩ及びエンドスタチンＸＶ、ＡＴＦ、アンギオスタチン、エンドスタチン及びアンギオスタチンの融合タンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２のＣ−末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノゲンのクリングル５ドメイン、エンドスタチン及びヒトプラスミノゲンのクリングル５ドメインの融合タンパク質、胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質、プラスミノゲン活性剤阻害因子、血小板因子−４（ＰＦ４）、プロラクチンフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、軟骨由来阻害物質（ＣＤＩ）、ＣＤ５９補体フラグメント、バスキュロスタチン、バソスタチン（カルレチキュリンフラグメント）、トロンボスポンジン、フィブロネクチン、特にフィブロネクチンフラグメントグロ−ベータ、ヘパリナーゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ、インターフェロン誘発性タンパク質（ＩＰ−１０）、インターフェロン−ガンマ誘発型モノキン（Ｍｉｇ）、インターフェロン−アルファ誘発性タンパク質１０（ＩＰ１０）、Ｍｉｇ及びＩＰ１０の融合タンパク質、可溶性Ｆｍｓ−様チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ−１）レセプタ、キナーゼ挿入ドメインレセプタ（ＫＤＲ）、アポトーシスの調節因子、例えばＢｃｌ−２、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｉｋ、Ｂｃｌ−Ｘ短イソ型及びＧａｘ、それらのフラグメント又は誘導体などから選択され得る。

特に好ましい実施形態においては、核酸は、ＴＮＦαレセプタ、ＴＧＦβ２レセプタ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＣＣＲ２又はＭＩＰ１の可溶性フラグメントをコードする。

核酸は同様に、もう１つの好ましい実施形態において、抗体、１本鎖抗体の可変フラグメント（ＳｃＦｖ）又は免疫療法を目的として認識能力をもつその他のあらゆる抗体フラグメントをコードし得る。

本発明の特定の実施形態においては、生物活性をもつ核酸は、以上で記述したもののような本発明の中で使用可能である治療用タンパク質の前駆体をコードする。

その上、本発明のもう１つの実施形態においては、生物活性をもつ全く異なる生成物をコードする核酸の混合物を使用することができる。この変形形態によると、眼細胞中の異なる生成物の同時発現が可能となる。

核酸を送達する基本的方法としては、インビボ遺伝子移入及びエクスビボ遺伝子移入がある。インビボ遺伝子移入には、上述の通りの裸の核酸、複合核酸、核酸ベクターなどを用いて患者の毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋又は細胞内に特異的に核酸を導入することが関与する。上述の広範囲にわたるカテゴリのうちの２つの全てを用いて、本発明の状況下で遺伝子移入を達成することが可能である。本発明に従ったエクスビボ遺伝子移入においては、任意の細胞特に筋肉細胞、好ましくは平滑筋細胞、さらに一層好ましくは毛様体組織から及び／又は外眼筋からの細胞が患者から採取され、細胞培養内で成長させられる。核酸は、前記細胞内にトランスフェクションされ、トランスフェクションを受けた細胞は好ましくはその数を増加させ、その後患者の体内、好ましくは毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋又は細胞内に再移植される。本発明に従ったエクスビボ遺伝子移入において使用可能である特定の細胞は、例えば線維芽細胞であり得る。本発明に従ったもう１つの生物活性ある生成物は、かくして、上述の通りの問題の核酸でのトランスフェクションを受けた細胞又はかかる核酸を発現する細胞である。

医薬組成物
一実施形態においては、本発明は、治療すべき対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋又は細胞に対し投与することにより眼疾患を治療又は予防するための組成物を調製することを目的とした、治療用又は予防用核酸といった生物活性をもつ作用物質の使用において、さらに薬学的に受容可能な賦形剤又は希釈剤を含有する組成物の中に生物活性をもつ作用物質が存在している使用に関する。

本発明のもう１つの目的は、眼疾患を予防又は治療するための医薬組成物において、毛様体組織又は細胞内及び／又は外眼筋又は細胞内への投与用に意図され、上述の通りの生物活性をもつ作用物質及び好ましくは薬学的に受容可能な賦形剤又は希釈剤を含んでいる医薬組成物に関する。

本発明に従った薬学調製物又は組成物は、基本的に、受容可能な担体、賦形剤又は希釈剤の中の生物活性をもつ作用物質、好ましくは裸の核酸、複合核酸、核酸ベクター又は送達系などで構成され得、そうでなければ、作用物質が中に包埋される徐放性マトリクスを含み得る。代替的には、例えばプラスミドベクターなど、組換え細胞から無傷の状態で完全な核酸送達系を生産することができる場合、薬学調製物は、分泌された治療用タンパク質を生産する好ましくは毛様体細胞及び／又は外眼筋細胞といった１つ以上の細胞を含み得る。

薬学的に相容性があるか又は生理学的に受容可能な担体、賦形剤又は希釈剤としては、投与方法にとって薬学的に受容であり、無菌であり、かつ中性乃至弱酸性である等張緩衝食塩水（リン酸塩、塩化物などを含む）、水性又は油性溶液又は懸濁液の中から、及びより好ましくはスクロース、トレハロース、界面活性剤、タンパク質及びアミノ酸の中から選択され得る希釈剤及び充てん剤が含まれる。薬学的に相容性があるか又は生理学的に受容可能な担体、賦形剤又は希釈剤は、好ましくは、適切な分散剤、湿潤剤、懸濁剤、緩和剤、等張剤又は粘度上昇剤、安定化剤、防腐剤及び等張溶液を形成するための適切な緩衝液を用いて処方される。特別な薬学的に受容可能な担体及び活性化合物対担体比は、組成物の溶解度及び化学的特性、特定の投与様式及び標準的な薬学的実践方法により決定される。当業者であれば、既知の技術によりかかるビヒクルをいかにして処方するかを理解することと思われる。

安定剤の例としては、エデト酸２ナトリウムなどがある。等張剤の例としては、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール及びマンニトールなどがある。緩衝液の例としては、クエン酸、リン酸水素、氷酢酸及びトロメタモールなどがある。ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素塩などがある。緩和剤の例としては、ベンジルアルコールなどがある。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウム及びクロロブタノールなどがある。

活性化合物の眼吸収を増大させるため、製剤を送り出す上での可変性を逓減させるため、処方懸濁液又はエマルジョンの構成要素の物理的分離を低減させるため及び／又はその他の形で眼科用処方を改良するためには、単純な水溶液の粘度に比べて高い粘度が必要となる可能性がある。このような粘度上昇剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又は当業者にとって既知のその他の作用物質が含まれる。かかる作用物質は標準的には約０．０１〜約２重量％のレベルで利用される。

本発明の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋又は細胞に対する投与向けに意図された医薬組成物の調製物形態は、好ましくは液体調製物である。液体調製物は、例えばＢＳＳ（平衡塩類溶液）、グリセリン溶液、ヒアルロン酸溶液などの中に生物活性をもつ作用物質を溶解させることによって調製可能である。特定の組成物には、例えばＢＢＳ（６０％）及びヒアルロン酸（４０％）が含まれる。安定剤、等張剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、緩和剤、防腐剤、電解質例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び／又は塩化物などを、任意には、液体調製物に適切な量で添加することができる。

本書にその内容が参照により援用されている米国特許第５，５８０，８５９号明細書及び同第５，５８９，４６６号明細書の中で、哺乳動物の筋肉組織に対して裸のＤＮＡを処方し投与するための方法が開示されている。

医薬組成物は、任意の付加的な活性成分又はアジュバントを含むことができ、又、生物活性をもつ作用物質を任意の付加的な活性成分又はアジュバントと組合せることもできる（本発明に従った使用の中で）。アジュバントは、前記作用物質の送達又は移入を改善させる任意の生物学的、合成又は生合成作用物質といったような予防用又は治療用作用物質の生物活性を促進又は増大させるあらゆる物質、混合物、溶質又は組成物から選択され得、本発明に従った（送達担体としての）ベクターに同化され得る。アジュバントは、組成物を含有する予防用又は治療用作用物質とは個別に又は逐次的に、かつ／又は全く異なる注入部位においてコンディショニングされ投与され得る。本発明に従った多数の作用物質及び／又はアジュバントでの治療は、作用物質及び／又はアジュバントの混合物を用いて行なわれる必要はなく、別々の薬学調製物を用いて行なうことができる。調製物は、正確に同時刻に送達される必要はないが、同じ治療期間中に、すなわち互いから１週間又は１カ月以内に患者に対し送達されるべく調整され得る。

本発明の組成物と任意の適切な治療薬を調和させることが可能である。本発明に従った方法を通して上述の生物活性をもつ（予防用又は治療用）作用物質に加えて投与され得る治療薬の制限的意味のない例には同様に、透過性上昇作用物質、例えばウイルス、脂質小胞、ヒアルロン酸、脂質ベースの正イオン、ポリカチオン性エマルジョン、カチオン性ペプチド、ポリプレックスなど；抗生物質及び抗菌剤、例えば塩酸テトラサイクリン、ロイコマイシン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、エリスロマイシン、スルファチアゾール及びニトロフラゾン；局所麻酔薬、例えばベンゾカイン；血管収縮剤、例えば塩酸フェニレフリン、塩酸テトラヒドロゾリン、硝酸ナファゾリン、塩酸オキシメタゾリン及び塩酸トラマゾリン；強心剤、例えばジギタリス及びジゴキシン；血管拡張剤、例えばニトログリセリン及び塩酸パラベリン；消毒剤、例えば塩酸クロルヘキシジン、ヘキシルレゾルシノール、デカリニウムクロリド及びエタクリジン；酵素、例えば塩化リゾザイムおよびデキストラナーゼ；降圧剤；鎮静剤；抗腫瘍剤；ステロイド系抗炎症剤、例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン、フルチカゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アセトニド、デキサメタゾン、ベータメタゾン、ベクロメタゾン及びジプロピオン酸ベクロメタゾン；、非ステロイド系抗炎症剤、例えばアセトアミノフェン、アスピリン、アミノピリン、フェニルブタゾン、メファナム酸、イブプロフェン、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、コルチシン、及びプロベノシド；酵素系抗炎症剤、例えばキモトリプシン及びブロメランセラチオペプチダーゼ；抗ヒスタミン剤、例えば塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロロフェニラミン及びクレマスチン；抗アレルギー剤；及び鎮痛性化合物が含まれる。

本発明の組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、所望の生物活性を得るのに有効である活性成分の量を得るように適合可能である。しかしながら、任意の特別な患者のための特定の用量レベルは、体重、全身的な健康状態、性別、食生活、時間、吸収及び排泄速度、その他の薬物との組合せ、及び治療対象の特定の疾患の重症度を含めたさまざまな因子によって左右されることになることは理解されるべきである。

医薬組成物は、単位剤形の体裁をとることが適切であり得、薬学の分野で周知の方法のいずれによっても調製可能である。全ての方法は、１つ以上の副成分を構成する上述の通りの担体と活性作用物質を会合状態にするステップを含んでいる。一般に、組成物は、活性作用物質を担体好ましくは液体担体と均質かつ密に会合した状態にすることによって調製される。

その他の送達系は、時間放出、遅延放出又は持続放出送達系を内含し得る。かかる系は、必要な場合、活性作用物質の反復的投与を回避して、対象及び医師にとっての利便性を増大させることができる。数多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者にとっては既知である。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物といったようなポリマーベース系が含まれる。送達系は同様に、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸といったようなコレステロール又はモノ及びトリグリセリドといったような中性脂肪を含む脂質、ヒドロゲル放出系、シラスティック系、ペプチドベース系、ワックスコーティングなどをも含み得る。

本発明のもう１つの実施形態は、治療すべき対象の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対して投与することによって対象の体内の眼疾患を予防又は治療するための上述の医薬組成物を調製するための、上述のような生物活性をもつ作用物質、好ましくは治療用核酸の使用に関する。

治療
本発明は、対象の眼球、特に眼の内部又は後方部分に対して前述の生物活性又は薬理活性をもつ作用物質、特に治療用又は予防用核酸又は本発明に従った組成物を送達するためのインビボ方法において、前記作用物質又は組成物を毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞内に投与することが含まれる方法を提供している。

本発明のさらなる目的は、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞の中にタンパク質をコードする核酸を投与するステップを含む、対象の眼組織又は細胞内で治療用又は予防用タンパク質を生産させる方法において、前記核酸が以上で説明された通りに前記眼組織又は細胞まで送達される方法にある。

本発明の目的は同様に、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対して、上述の生物活性又は薬理活性をもつ作用物質、好ましくは核酸又は本発明に従った組成物を投与するステップを含む、眼疾患又は眼の機能障害から対象を保護する方法において、前記作用物質又は組成物が眼組織又は細胞に送達され眼疾患から保護する方法にも関する。

本発明のさらにもう１つの態様は、対象の毛様体（筋肉又は上皮）及び／又は外眼筋に対し、上述の通りの生物活性又は薬理活性をもつ作用物質、好ましくは治療用物質をコードする核酸又は本発明に従った組成物を投与するステップを含む、対象が罹患している眼疾患又は眼の機能障害を治療する方法において、前記作用物質又は組成物が機能障害のある眼組織又は細胞に対し送達される方法、にある。

本発明のもう１つの態様は、遺伝子療法に関する。この種の療法は、インビボ又はエクスビボのいずれかでの細胞又は組織内への核酸の導入から成る。一部のケースでは、核酸は、機能性に欠いた内因性遺伝子と交換する（又はその代りに作用する）或いはそれを補正し、治療用ポリペプチドを生産する能力を宿主に付与し、望ましくない遺伝子産物の退行をひき起こし、或いは又免疫応答を刺激するように意図されている。

特定の態様においては、本発明は、治療を必要としている対象宿主において、その遺伝子発現がその疾病に結びつけられている標的細胞の標的遺伝子の中で突然変異を復元する又は誘発させる能力をもつ核酸、好ましくは以上で定義された通りのキメラオリゴヌクレオチドを投与することを含む、疾病を治療する方法において、前記標的細胞内に前記核酸をインビボで送達するために用いられる方法が本発明に従ったインビボ核酸の送達方法である方法に関する。

特定の実施形態においては、本発明に従った眼細胞に核酸をインビボで送達するための方法は、その発現が眼疾患の原因である突然変異遺伝子である眼細胞遺伝子の中の少なくとも１つの突然変異の存在に起因する眼の遺伝病を治療又は予防するために使用される。この方法においては、前記核酸は、前記標的突然変異遺伝子の中で復元することが望まれる突然変異を除いて、前記細胞の標的突然変異遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメント配列と相補的である。

もう１つの好ましい実施形態においては、本発明に従った眼細胞内にインビボで核酸を送達するための方法は、眼疾患を研究するため又はこの眼疾患を治療できる化合物をスクリーニングするためのモデルとして役立ち得る動物又はヒトの組織又は生体を得ることを目的として、その発現が該眼疾患の原因である突然変異遺伝子である、動物の前記眼細胞の遺伝子の中に、突然変異を自発的に誘発するのに使用される。

上述の治療用又は予防用方法の利益を享受し得る対象は、任意の眼科用薬物、タンパク質又はペプチドでの治療を必要とする任意の眼疾患及び眼の条件に罹患している又は罹患する可能性のある動物、特にあらゆる哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。

かくして、本発明は、単独で又は付加的な治療と組合せた形での、眼の炎症性疾患、虚血性疾患、増殖性疾患（例えば血管新生又はグリア病）、神経変性病及び緑内障を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）さまざまな眼疾患又は眼の機能障害を予防又は治療することを目的とした、かかる方法の使用に関する。

本発明を用いて治療可能な眼疾患の例
本発明のさまざまな実施形態により治療可能な眼疾患及び障害の制限的な意味のない例としては、増殖性眼疾患、神経変性眼疾患、緑内障、感染性眼疾患、炎症性眼疾患（例えば、結膜炎、角膜炎、内皮炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎及び炎症性視神経症）、網膜変性（特に網膜色素変性症、周辺部網膜変性症、黄斑変性症、例えば乾燥加齢性黄斑変性症）、虚血性網膜症（特に、未熟児網膜症及び糖尿病性網膜症）、網膜血管疾患、眼虚血性症候群及びその他の血管異常、脈絡膜障害及び腫瘍、硝子体障害、グリア細胞増殖、例えば増殖性硝子体網膜症及び糖尿病性前網膜血管形成に付随するグリア細胞増殖などが含まれる。

本発明により予防又は治療可能な主要な疾病について以下で記述する。

眼内炎は、眼内組織、主としてブドウ膜及び網膜の全てのタイプの炎症を統合している。眼内炎症は、免疫学的原因、感染性原因、医原性原因又は未知の病因によるものであり得る。これらは、急性、再発性又は慢性であり得る。眼内炎症は、治癒可能な失明の最も多い原因に入るものである。後眼部眼内炎症は、脈管炎、視神経炎、硝子体炎、舞踏病性網膜炎に関連づけされ得る。

遺伝性網膜ジストロフィ又は網膜色素変性症は、視覚サイクルに関与する遺伝子内の突然変異又は欠失に起因する遺伝性失明病である。これらの疾病は、幼齢で始まり、ゆっくりと進行して完全に失明する。光受容体の喪失が網膜色素細胞の喪失及びより後期での脈管及び視神経萎縮と関連づけされる。これらの遺伝性変性の一部は、ミトコンドリアＤＮＡ内の突然変異に起因する。

緑内障には主として２つのタイプ、すなわち慢性緑内障又は原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）及び急性閉塞隅角緑内障が存在する。その他の変形形態としては、先天性緑内障、色素性緑内症、血管新生緑内症及び続発性緑内症が含まれる。緑内症は、高眼圧症に類似しているが、視神経損傷及び視力喪失が伴う。緑内障は通常、点眼薬、レーザー又は従来の眼科手術で治療される。治療を行わない場合、緑内障は失明をひき起こすことになる。

血管形成は、新血管形成に導く新たな毛細血管の形成である。血管形成は、血管基底膜及び間質マトリクスの内皮細胞媒介型分解、内皮細胞の移動、内皮細胞の増殖及び内皮細胞によるループ状毛細血管の形成を含めた一連の逐次的ステップを含む複雑なプロセスである。血管形成は、脈管構造の発達又は維持のための正常なプロセスであるが、血管成長が実際に有害である場合に、病的状態（すなわち血管形成依存性疾患）が発生する。血管形成は、特に、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障及び角膜瘢痕化を含めた眼組織の重要な疾病と関連づけされる。眼内の血管のどんな異常成長でも、網膜に達する前に入射光を散乱させ遮断する可能性がある。新血管形成は、眼の中のほぼあらゆる部位で発生し得、眼組織の機能を著しく改変させる。最も恐ろしい眼の血管新生疾患は、網膜が関与するものである。例えば、数多くの糖尿病患者が、網膜の後表面上及び硝子体内に漏れやすい新しい血管を形成して増殖性の硝子体網膜症をひき起こすことを特徴とする網膜症を発生させる。加齢性黄斑変性症患者の一部の集団は、場合によって失明に至る網膜下血管新生を発生させる。

糖尿病性網膜症は、眼の内部の網膜血管が血液及び流体を周囲の組織内に漏出させる場合に起こる。糖尿病患者の約８０％が糖尿病性網膜症を発生させる。この病気は一般にレーザーを用いて治療される。しかしながら、レーザー療法には、網膜静脈の閉塞、視力の喪失、硝子体出血を含めた合併症が関与し、時として失敗する。治療を行わなければ、糖尿病性網膜症は失明をひき起こし得る。

未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、未熟児がかかるものである。それは、網膜及び硝子体内の血管の異常成長から成る。ＲＯＰが後期まで進行すると、網膜上に瘢痕組織が形成され、硝子体が出血し、網膜剥離が起こる。治療は通常レーザー又は凍結療法（フリージング）のいずれかによって実施される。

虚血性網膜症は、神経網膜のいたみ、細胞死及び新生血管形成を導く血管閉塞（毛細血管又は大血管）に関連づけされる網膜症である。

黄斑変性症は、中心視を侵し、視力喪失に導く病気である。若年者を襲う黄斑変性症形態も存在するが、該身体条件は６０才を超えた人に発生するのが最も一般的である。この障害は従って、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）と呼ばれる。人の視覚の中心のみが通常侵されることから、該疾病から失明が起こることは稀である。しかしながら、網膜の中心の斑点に対する傷害は真直ぐ前方をはっきりと見る能力を破壊し得る。乾燥型には、神経網膜、ＲＰＥ細胞及び脈絡膜の変性が付随する。湿潤型には、先に記述した現象及び脈絡毛細管板及び／又は網膜血管からの新血管の成長、網膜下剥離及び出血、上皮下出血及び涙液などが付随する。黄斑変性症は通常、６０才以降に発生する。中心視が逓減する一方で、ほとんどの患者は一部の視覚を保持し、完全失明には決して至らない。

角膜炎は、角膜の炎症である。角膜炎は、細菌、ウイルス、又は真菌感染、眼瞼の障害又は涙液形成能力の減退の結果としてのドライアイ、非常に明るい光に対する露出、眼を傷つけるか又は眼の中に引っかかった異物、アイメーキャップ、ダスト、花粉、公害又はその他の刺激物に対する感受性又はアレルギー反応、及びビタミンＡ欠乏症によってひき起こされる可能性がある。

黄斑パッカー（網膜上膜、網膜しわ、黄斑前線維症及びセロファン黄斑症とも呼ばれる）は、網膜から剥離して網膜に瘢痕又はシワを形成させることになる硝子体の加齢性収縮に起因することが最も多い。黄斑パッカーのその他の原因には、（外科手術又は眼の傷害由来の）外傷、網膜剥離、炎症、及び網膜血管の問題が含まれる。唯一の治療は、瘢痕組織の剥ぎ取りと組合わされた硝子体切除（硝子体の除去）から成る外科手術である。硝子体切除の最も一般的な合併症は、白内障発生速度を速めるということにある。

治療される眼疾患は、強膜炎、結膜炎、角膜炎、内皮炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎、前部ブドウ膜炎、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、遺伝性網膜ジストロフィ、加齢性黄斑変性症、開放隅角緑内障、血管新生緑内症、虚血性網膜症などの中から選択され得る。

本発明の好ましい態様は、ＴＮＦアルファのための可溶性レセプタをコードする核酸を、慢性ブドウ膜炎に罹患している哺乳動物の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与するステップを含む、慢性ブドウ膜炎の治療方法にある。

本発明のもう１つの好ましい態様は、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦレセプタ又は抗ＰＬＧＦをコードする核酸を、眼内新血管又は黄斑浮腫に罹患した哺乳動物の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与するステップを含む、当該疾病の治療方法にある。

本発明のさらに好ましい態様は、上述の通りの神経栄養因子をコードする核酸を、網膜色素変性症に罹患した哺乳動物の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与するステップを含む、当該疾病の治療又は遅延方法にある。

本発明のもう１つの好ましい態様は、抗ＩＲＳ−１又はＩＧＦ−１をコードする核酸を、糖尿性網膜症に罹患した哺乳動物の毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞に対し投与するステップを含む、当該疾病の治療方法にある。

本発明に従った方法及び使用においては、毛様体組織又は細胞及び／又は外眼筋組織又は細胞を、核酸移入の前後、又はその間に当該移入を改善させるための処置に付すことができる。この処置は、薬理学的なものであり、局所的又は全身的施用の形をとり得るが、そうでなければ、先に記述したように酵素的、透過化、外科的、機械的、熱又は物理的処置でもあり得る。

キット
本発明の方法に従うと、眼疾患の予防又は治療用のキットが想定されている。

本発明に従った装置及び組成物は、まとめてキットの形で供給され得る。該キットの中で、構成要素は別々に包装されていても又格納されていてもよい。賦形剤、担体、その他の薬物又はアジュバント、活性物質又は組成物の投与のための使用説明書及び投与又は注入装置などの他の構成要素もこのキットの中に入って供給され得る。使用説明書は、書面、ビデオ又はオーディオ形態をとり得、紙、電子媒体に格納されていてもよく、さらには、ウェブサイト又は参考マニュアルといったような別の出典への参照指示として含まれていてもよい。

特に、本発明は、乾燥され凍結乾燥されたプラスミド、このプラスミド用の希釈媒質及び上述の通りの使い捨て電極装置を格納するキットを含んでいる。

本発明のその他の態様及び利点は、以下の実施例の中で記述されるが、これらの実施例は、例示目的のものであって本出願の範囲を制限していないとみなされるべきである。

本発明において、発明者らは、特に眼の毛様体筋肉を特異的にトランスフェクトするための新規のエレクトロトランスファ技法を設計した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はルシフェラーゼ（ｌｕｃ）のいずれかをコードするプラスミドが、トランスフェクション後の遺伝子発現を追跡し秤量するために使用されてきた。この技法の療法としての潜在的可能性は、ヒトＴＮＦ−α可溶性レセプタＩ（ｈＴＮＥＲ−Ｉｓ）をコードする遺伝子を用いてエンドトキシン誘発型ブドウ膜炎（ＥＩＵ）に罹患したラットにおいて評価される。

材料と方法
動物：
生後６〜７週で体重１５０〜２００ｇの雌のルイスラット（フランスＬｙｏｎのＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ）を使用した。視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言（ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って実験を実施した。研究に含み入れる前１週間ラットを保持した。実験のために、腹腔内ペントバルビタール注入液（４０ｍｇ／ｋｇ）でラットを麻酔した。実験の終了時点で、過量のペントバルビタールによりラットを屠殺した。

プラスミド：
ｐＶＡＸ２は、プロモータをｐＣＭＶβプラスミドプロモータで交換したｐＶＡＸ１プラスミド（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））から成る。ｐＣＭＶβ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））をＥｃｏＲＩで消化し、次にクレノウフラグメントで平滑末端化し、最後にＢａｍＨＩで消化した。結果として得た６２９ｂｐのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動の後、精製した。このプロモータをＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩｐＶＡＸ１フラグメント内にライゲートしてｐＶＡＸ２を得た。ｐＶＡＸ２−ｌｕｃは、ＣＭＶプロモータの制御下で細胞質性ホタルルシフェラーゼプラスタンパク質をコードする４．６ｋｂのプラスミドベクターである。

プラスミドｐＥＧＥＰ−Ｃ１は、ＣＭＶプロモータ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏのクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））の制御下で緑色蛍光タンパク質遺伝子を担持する４．７ｋｂのプラスミドである。プラスミドｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１は、ｐＶＡＸ２主鎖にクローニングされた免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結されたヒトＴＮＦ−α可溶性レセプタＩ型（ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ）のキメラタンパク質をコードする４．３ｋｂのプラスミドである。このキメラタンパク質は、天然の単量体ｈＴＮＦＲ−Ｉｓに比べてより長い半減期を有している。

ラット毛様筋へのエレクトロトランスファ
エレクトロトランスファの実験を行うために、眼を露出させ、外科用シートを用いて所定の位置に保持する。毛様筋内への筋内注入を１００μｌ入りのマイクロファインシリンジ（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、スペイン）上で３０Ｇの針を用いて、側頭部上象眼内で実施した。辺縁の後ろの強膜の下にある毛様筋に到達するために、トンネル角膜切除を通して、毛頭筋内注入を実施した。針が辺縁を横断した時点で、これを１ｍｍの距離にわたりやや深く挿入し、（１倍生理食塩水１０μｌの中に希釈させた）プラスミドを注入した。注入後、小さい強膜下気泡が形成する（図１Ａ）。エレクトロトランスファのためには、２ｍｍにわたり裸であり次にその長さの残りの部分ではシリコーンで被覆されている特殊設計の鋭利なイリジウム／白金電極（直径５００μｍ）を角膜トンネル内に挿入し、陰極に接続した。陽極戻り電極は、毛様体の上にあるラットの強膜表面にぴったりはまるように設計された厚み０．３ｍｍ、長さ５ｍｍ及び幅２．５ｍｍの白金シートで構成されていた（図１Ｂ及び１ｂ）。

２００ボルト／ｃｍの電界強度を送達するようにエレクトロトランスファ発電機を設定した。上述のシステムを用いて、各々１０ボルト及び長さ２０ｍｓの８回の連続的パルス（パルス間１８０ｍｓ）を送達した。この電界強度は、臨床的に検出可能な構造損傷又は組織熱傷を全くひき起こさなかった（図１Ｃ）。

実験の設計：
毛様筋内のレポータ遺伝子の発現についてのコンセプト証明の場所を設定し用量を決定するために、ｐＶＡＸ２−ｌｕｃ又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを使用した。すなわち、
１． １２個の眼（１２匹のラット）の毛様筋の中に、１０μｌの生理食塩水中の３μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを注入した。４個の眼（４匹のラット）では、付加的な処置を全く行なわなかった。８個の眼（８匹のラット）では、先に記述した通り、注入直後にエレクトロトランスファを実施した。対照として４匹の付加的なラット（４個の眼）を用い、右眼の毛様筋内に１０μｌの生理食塩水を与えた。これらのラットのうち２匹（２個の眼）において、生理食塩水注入の後にエレクトロトランスファを行なった。全ての動物を１日目及び８日目に検査し、８日目に過量のペントパルビトールで屠殺した。処置済みの眼を摘出し、スナップ凍結させた。冷凍切片（厚み８μｍ）を、組織学及び免疫組織化学における日常的染色向けに調製した。

２． １０μｌの生理食塩水中３μｇのｐＶＡＸ２−ｌｕｃを２４匹のラットの両方の眼の毛様筋内に注入した。プラスミドの注入後、これら２４匹のラットの左眼の中でエレクトロトランスファを行なった。処置から６、１２、２２及び３０日後に６匹のラットを屠殺した。各時点で、眼を切開し、毛様筋全体を取り出し、−８０℃でスナップ凍結させ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）活性の評価のためにこれを使用した。２匹の付加的な未処置ラットの４個の眼をｌｕｃ発現のための負の対照として使用した。

ＧＦＰ組織化学及びアルファ平滑筋アクチン免疫組織化学
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のエレクトロトランスファから８日目に、眼を摘出し、１時間４％のパラホルムアルデヒド中で定着させ、１×ＰＢＳ内で洗い流し、ＯＣＴ化合物中に包埋し、冷凍切片化した（８μｍ）。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のエレクトロトランスファで処置した３個の眼及び単にｐＥＧＦＰ−Ｃ１を注入しただけの２個の眼について、毛様筋の円形筋原線維の横方向切片を得るべく眼の横方向８μｍ切断を行なった。その他の眼については、矢状８μｍ切断を行なった（光学軸に対し平行）。細胞核を視覚化するために、１／３０００に希釈した４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）溶液（フランス、Ｓｔ−Ｑｕｅｎｉｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒのシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で５分間切片を染色し、ＰＢＳ中で再び洗い流し、グリセロール／ＰＢＳ（１／１）中で取り付けた。蛍光顕微鏡（スイスのライカ（Ｌｅｉｃａ））下で切片を検査し、全ての切片について一定の露光時間でデジタル顕微鏡写真を撮影した。横方向及び前額切片上で毛様筋を位置特定するために、マウス抗ヒトアルファ平滑筋アクチン（ａｎｔｉ−α−ｓｍ−１）モノクローナル抗体（カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａのケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））での免疫蛍光染色を実施した。−２０℃でアセトン中で５分間、組織切片を固定し、空気乾燥させた。上清の希釈を、３ｍＭのＥＧＴＡを含むＰＢＳ中で行なった。５μｇ／ｍｌの濃度でａｎｔｉ−α−ｓｍ−１を使用した。第２の抗体として、発明者らは、１：５０で希釈したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）染料共役型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウスＩｇＧ（ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅのジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））を使用した。１／３０００で希釈された４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共に５分間インキュベートすることにより、核を染色した（フランス、Ｓｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒのシグマアルドリッチ）。切片を再度ＰＢＳ中で洗浄し、グリセロール／ＰＢＳ（１／１）中で取付けた。一次抗体の代りにラット免疫前血清を負の対照として使用した。

ルシフェラーゼ活性のインビトロ測定
右眼内に３μｇのｐＶＡＸ２−ｌｕｃの毛様体注入及び左眼内に注入とそれに続くエレクトロトランスファを受けたラットを、処置後６、１２、２２及び３０日目に屠殺した。眼を摘出し、動作中の顕微鏡下で切開し、毛様体と筋肉及び虹彩複合体を除去し、液体窒素中で冷凍させ、テストされるまで−８０℃に保った。各々の試料を次に、プロテアーゼ阻害物質カクテル（ドイツＭａｎｎｈｅｉｍのベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））（５０ｍｌにつき１錠）で補足された０．３ｍｌの細胞培養溶菌試薬（フランスＣｈａｒｂｏｎｉｅｒｅのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中で均質化した。１５０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、ルシフェラーゼ活性を、白色９６ウェル平板内に置かれた１０μｌの上清上で査定した。検出器はＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ照度計（フランスＥｖｒｙのＥＧ＆Ｇワラック（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ））であり、試料に５０μｌのルシフェラーゼ検定基質（プロメガ）を試料に添加して、試料により生成された光を１０秒間集積させた。結果は、１秒あたりの計数（ｃｐｓ）の単位で、全試料について示されている。

ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミドエレクトロトランスファの効果
房水中及び血清中のｈＴＮＦＲ−Ｉｓの生産を、付加的なエレクトロトランスファを伴う（又は伴わない）毛様筋に対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１注入から７日後に評価した。房水中での試料採取用の実験条件を最適化するために、１６匹のラットの右眼の中に３０μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１（１０μｌの生理食塩水中）を注入し、その後これら１６匹のラットの８個の右眼の中でエレクトロトランスファを行なった。処置後６日目にラットを屠殺した。これら１６匹のラットの血清の試料を採取した。右及び左眼からの房水を得、各眼について別々に評価した。１６個の左眼（未処置、対側性）からの房水を、ｈ−ＴＮＦＲ−Ｉｓレベルの対照として使用した。（付加的なエレクトロトランスファを伴う又は伴わない）毛様筋内のｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の注入後に眼の内部で生産されたｈＴＮＦＲ−Ｉｓの生物学的効果を、急性ヒト眼内炎症のモデルであるエンドトキシン誘発型ブドウ膜炎（ＥＩＵ）に罹患したラットの体内で評価した（２−５）。２４匹のラットが両眼に３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の注入を受けた。プラスミド注入の後、これら２４匹のラットのうちの１２匹においてエレクトロトランスファを行なった。１２匹の対照は、両眼の毛様筋内に１０μｌの生理食塩水の注入とその後のエレクトロトランスファを受けた。さらに８匹のラットが、毛様筋中に「空の」プラスミドｐＶＡＸ２（ｈＴＮＦＲ−Ｉｓをコードする遺伝子無し）の注入を受けた。空のプラスミド注入の後、これら８匹のラットの右眼の中にエレクトロトランスファを行なった。上述の処置から７日後に、右後足蹠内にネズミチフス菌ＬＰＳ（シグマアルドリッチ）１５０μｇを注入することで、４４匹全てのラットの体内でＥＩＵを誘発した。ＥＩＵの臨床スコアを、ＬＰＳ抗原投与から２４時間後に記録し、ラットを屠殺した。各ラット群の中で、８個の眼から得た房水を用いて、分泌されたラットＴＮＦ−αのレベルを評価した。正確な評価を可能にするために、同じ処置を受けＥＩＵの類似の臨床スコアを示した２つの眼からの２つの房水をプールした。各群（空のプラスミドで処置したラット群を除く）の４個の眼を冷凍切断し、浸潤炎症性細胞の組織学評定のために処理した。

ＥＩＵの程度に対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１エレクトロトランスファの評価
以前に公表された通りの（５）臨床的等級付けシステムを、わずかに適合させて使用した。簡単に言うと、等級（０）は炎症が無いことを表わす。等級（１）は、前房（ＡＣ）内に発赤又は気泡の無い、虹彩及び結膜血管のわずかな拡張を表わす。等級（２）は、ＡＣ内に明らかな発赤又は気泡の無い、虹彩及び結膜の中度の血管拡張の存在を表わす。等級（３）は、ＡＣ内に１細隙灯フィールドあたり１０個未満の気泡及び発赤を伴う強い虹彩血管の拡張の存在を表わす。等級（４）は、前房蓄膿（ｈｙｐｏｐｉｏｎ）又はフィブリンを形成するＡＣ内の数多くの気泡を伴う等級３と類似した臨床的兆候の存在を表わす。等級（５）は、完全瞳孔閉鎖を伴うＡＣ内の強い炎症性反応の存在を表わす。ＥＩＵの程度の組織学評価のためには、各群の４個の眼を摘出し、１時間４％のパラホルムアルデヒド内で固定し、ＰＢＳ中で洗い流し、ＯＣＴ中で取付け、全眼球を冷凍切断した。評価すべき各眼の視神経を通した眼球切片をヘマトキシリン−エオシンで染色した。前眼部及び後眼部内に存在する１切片あたり浸潤細胞の平均数は、同じ眼について検査したスライド数で細胞の合計数を除することによって得られた。湿潤細胞の数は、処置について知らされていない治験担当医師により記録された。

ＥＩＵに罹患した又は罹患していないラットの房水中の可溶性ｈＴＮＦＲ−Ｉｓレベル
ヒトレセプタＩ型特異キット（デュオセット、英国ＡｂｉｎｇｄｏｎのＲ＆Ｄシステムズ（Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を用いメーカーの使用説明書に従ったＥＬＩＳＡにより、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓレセプタのレベルを測定した。前眼部内で生産されるｈＴＮＦＲ−Ｉｓの全身的通過を評価するために、同じ方法によりｈＴＮＦＲ−Ｉｓの血清濃度を決定した。

ＥＩＵに罹患した又は罹患していないラットの房水中のＴＮＦ−αレベル
得られた房水を直ちに遠心分離し、無細胞画分を収集し、分析前に−２０℃で凍結させた。ラットＴＮＦ−αについて特異的なＥＬＩＳＡ（デュオセット、英国ＡｂｉｎｇｄｏｎのＲ＆Ｄシステムズ）を用いてラットＴＮＦ−αレベルを測定した。ＴＮＦ−αレセプタレベルの評価の場合と同じ手順を、４μｇ／ｍｌの捕捉抗体、１００ｎｇ／ｍｌの検出抗体及び４００ｐｇ／ｍｌから６２．５ｐｇ／ｍｌまでの組換え型ラットＴＮＦ−αの２倍の系列希釈で使用した。

統計的分析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表現されている。データを、ボンフェローニ／ダン方法によるペアワイズ比較を伴うＡＮＯＶＡを用いて比較した。

結果
（電気穿孔とも呼ばれる）エレクトロトランスファの安全性
ＧＦＰ又は生理食塩水エレクトロトランスファ後１日目及び８日目における細隙灯による処置済みの眼の臨床検査は、眼内炎症又は大きな構造的損傷の臨床的症候を全く開示しなかった。ラットを屠殺した後、処置済みの眼の組織学的切片を得、検査した。毛様筋内注入及びエレクトロトランスファの部位についての針の挿入を通した切片の組織学的研究は、少数のケースにおいて、角膜トンネル内に軽度の細胞浸潤物が存在するものの毛様筋内には存在しないことを実証した。眼の構造は、正常な生体構造が保存された状態で、影響を受けなかった。同様に、生理食塩水溶液の注入後にエレクトロトランスファを受けるＥＩＵに罹患したラットの眼の中の房水ＴＮＦ−αは、対象のＥＩＵラット（ｐ＝０．１０）における房水ＴＮＦ−αに比べ増加しなかった。かくして、エレクトロトランスファ自体は、ＥＩＵに罹患したラットの眼の中でＴＮＦ−αの生産を増強させない。

毛様筋内のＧＦＰについてコードするプラスミドのエレクトロトランスファ
ＧＦＰエンコーディングプラスミドのエレクトロトランスファから８日後に、縦方向切片が、毛様筋内に局在化された特異的蛍光信号をはっきりと示している。細長い蛍光細胞は、アルファ平滑筋アクチン（α−ｓｍ−１）の免疫学的局在決定により実証される通り（図２Ｃ）、毛様筋の横方向筋原線維に対応する（図２Ａ、ａ及びＢ）。前部前額切片上では、強膜のすぐ下で毛様体をとり囲む円形筋原線維が同定される（図３Ａ）。両方の前部切片上でＧＦＰが高度に発現され、輪状線維を示し（図３Ｂ）、より後部の切片では、半径方向及び縦走線維に対応する丸い管内のＧＦＰ染色を示している（図３Ｃ）。前部前額切片上では、毛様筋の輪状線維が、α−ｓｍ−１免疫染色により充分同定されている（図３Ｄ）。ＧＦＰ及びα−ｓｍ−１の同時局在化により、ＧＦＰがエレクトロトランスファ後筋線維内で発現されることが確認された（図３Ｅ）。

ＧＦＰプラスミド注入がエレクトロトランスファ無しで実施された場合、毛様体の根元にはわずかに丸い蛍光ドットが観察されたが、円形筋原線維は、いかなる蛍光シグナルも示さなかった（図４Ａ、ａ）。

ルシフェラーゼ発現の反応速度
エレクトロトランスファ無しで３μｇのｐＶＡＸ２−ｌｕｃの注入を受けたラットの毛様筋内では、有意なルシフェラーゼ活性は全く測定されなかった。ただし、安定した値に到達したと思われた時点で、少なくとも３０日まで３μｇのｐＶＡＸ２−ｌｕｃの注入後にエレクトロトランスファを受けたラットの毛様筋内で高く持続的なルシフェラーゼ活性が測定された（図５）。

房水中の可溶性レセプタｈＴＮＦＲ−Ｉｓの生産
ＥＩＵを患っていないラットの眼の房水の中で、３０μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の注入（エレクトロトランスファ無し）から７日後、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓの平均レベルは２７４±３９ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝４）であった。エレクトロトランスファの組合せで処置された眼の中では、平均レベルは６９１±１２１ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝４）（ｐ＜０．０１）であった。エレクトロトランスファを伴う又は伴わない他眼内にプラスミド注入を受けたラットの対側眼においては、検出可能なレベルのｈＴＮＦＲ−Ｉｓは全く見られなかった。全ての群からのラットの血清においては、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓは検出レベル未満であり、かくして局所的遺伝子導入タンパク質の生産及び送達を可能にするための本発明の利点を実証している。ＥＩＵに罹患したラットにおいては、平均ｈＴＮＦＲ−Ｉｓレベルは、３０μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１のみの毛様体注入後のラット群において、１８１±１０８ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝８）であった。エレクトロトランスファと注入の組合せを受けた眼の房水中では、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓのレベルは、ｐ＜０．００５で著しく高い１０７０±２１８ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝８）であった。エレクトロトランスファを伴う又は伴わない毛様体内プラスミド注入を受けていないＥＩＵに罹患したラット（対照群）においては、検出可能なレベルのｈＴＮＦＲ−Ｉｓは全く本願されず、ＥＬＩＳＡ試験がヒトＴＮＦＲ−Ｉｓについて特異的でありラットの可溶性ＴＮＦレセプタと干渉しないということを実証していた。ＥＩＵに罹患しているラットの血清中では、眼の処置がプラスミド単独で実施されたか又はエレクトロトランスファとの組合せの形で実施されたかに関わらず、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓレベルは検出未満であり、眼内ｈＴＮＦＲ−Ｉｓの全身的拡散が無視できるほどのものであることを示していた。

臨床的ＥＩＵに対する効果
毛様筋注入のために３μｇの低いｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミド用量が使用された場合、平均ＥＩＵスコアは、ＥＩＵの非プラスミド注入ラット群及び生理食塩水のエレクトロトランスファを伴う注入を受けたラット群についての３．８±０．２及び３．９±０．１（それぞれｐ＝０．８１及びｐ＝０．６２）のＥＩＵスコアと類似した３．７±０．２であった（図７Ａ）。３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１でのエレクトロトランスファを受けたラット群においては（１．２±０．２、ｐ＜０．０００１）、平均臨床ＥＩＵスコアは著しく減少し、単にプラスミド注入のみ（ｐ＜０．０００１）又は処置無し（ｐ＜０．０００１）に比べた場合にエレクトロトランスファとの組合せが臨床的ブドウ膜炎を著しく低減させることを実証していた。エレクトロトランスファと組合わされた３μｇの空のプラスミドの毛様体内注入での処置を受けたラット群においては、ＥＩＵスコアは３．８±０．２であった。このラット群におけるＥＩＵスコアは、プラスミド注入を受けたＥＩＵ対照群（ｐ＝０．９１）又は生理食塩水のエレクトロトランスファを受けたＥＩＵラット（ｐ＝０．８５）において得られたものと著しく異なってはいなかった。

細胞浸潤物に対する効果
ＥＩＵに罹患したラットの対照群においては、前眼部内の浸潤細胞の平均数は、３１６±１４（ｎ＝４）であり、後眼部では２７２±６６であった。前眼部（３６９±６５、ｐ＝０．７７）又は後眼部（２６１±３２、ｐ＝０．９９）における浸潤細胞の数の有意な差異は、３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の注入のみの処置を受けたラット群においては全く見られなかった。エレクトロトランスファと組合わされた空のプラスミドの毛様体内注入は、対照の非プラスミド注入ＥＩＵ群と比べた場合、前眼部（３２２±２６、ｐ＝０．９９）内又は後眼部（２５５±１３、ｐ＝０．９８）内の浸潤細胞の数に対しいかなる効果ももたらさなかった。エレクトロトランスファと組合わされた３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の毛様筋内注入で処置されたラットにおいては、これらのラットの眼の中の前眼部（４９±１、対照及びＮａＣｌに対してｐ＜０．００２）内及び後眼部（８８±３、対照に対してｐ＜０．０５）内の両方において、浸潤細胞数の著しい減少が見られた（図８Ａ及びＢ）。

房水中のＴＮＦ−αレベル
ＥＩＵに罹患したルイスラットの房水中のＴＮＦ−αの平均レベル（５１０±４４ｐｇ／ｍｌ）は、生理食塩水及びエレクトロトランスファを受けたラット群の場合（３７４±６５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．１０）と著しく異なるものではなかった。ＴＮＦ−αの平均レベルは、生理食塩水のエレクトロトランスファを受けたラット（ｐ＜０．００２）又はＥＩＵ対照ラット（ｐ＜０．０００５）と比べた場合、３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１（１２６±１６ｐｇ／ｍｌ）のエレクトロトランスファで処置されたラット群において有意に低下した。電界送達無しで毛様筋内へ３μｇのｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１の注入を受けたラット群においては、ＴＮＦ−αの平均レベルは２５０±４５ｐｇ／ｍｌ、すなわち生理食塩水のエレクトロトランスファを伴うＥＩＵラットにおけるＴＮＦ−αレベル（ｐ＝０．０７）と有意に異なるものではなかった。

空のプラスミドのエレクトロトランスファは、対照の生理食塩水で処理された群（４７８±３３ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．１４）に比べて、房水中のＴＮＦ−αレベルに対しいかなる効果ももたらさなかった。実験未使用のラットでは、いかなるＴＮＦ−αも検出不能であった。

論述
骨格筋に対するプラスミドＤＮＡのエレクトロトランスファは、高レベルの循環タンパク質の発現に譲ることのできる安全かつ効率の良い遺伝子移入技術である（１；６−１１）。選択的電気パラメータが導入されてきた（１０、１２、１３、１４）。眼の中では、毛様筋は特殊な平滑筋である。前記筋肉の一部の線維は円形に配向されており、一方その他の線維は、強膜棘に対し付着するよう縦走又は放射方向に向けられている。前眼部と後眼部の間の交差点で強膜の下というその表面的位置設定に起因して、毛様筋は、潜在的に治療用のタンパク質をコードする遺伝子のエレクトロトランスファのための理想的候補として発明者らがみなしてきたものである。毛様筋内部で考えられるこれらの遺伝子のトランスフェクション及び房水内又は硝子体内でのコードされたタンパク質の分泌は、最も魅力的であり、それらの調査の最初のねらいであった。今までのところ、遺伝子のエレクトロトランスファのための標的として毛様筋を使用する試みは全くなされてきていない。ラットの眼の中のプラスミドの毛様筋内注入を制御するため、トンネル経路が作り上げられた。トンネルは、角膜内で始まり、辺縁部域に向かって、さらには強膜下を後ろ向きに毛様筋内へと延びていた。次に、筋肉内に挿入された部分を除きその全長が絶縁材料で被覆されている活性電極は、作り上げられたトンネル内に導入された。電気熱傷の危険性を削減する制御された形でエレクトロトランスファが実施された。この技術を用いると、生理食塩水の毛様体内注入後のエレクトロトランスファがＥＩＵの臨床スコアに影響を及ぼすことはなく、又、房水中のＴＮＦ−αのレベルを増大させることもなく、このことは、エレクトロトランスファがこれらの特定的条件下で眼内炎症を誘発しないということを示唆していた。誘発されたＥＩＵに罹患したラットにおいてそうであるように眼内炎症がすでに存在していた場合、反応は増強されず、エレクトロトランスファ後に疾病プロセスは悪化した。発明者の実験は同様に、プラスミドＤＮＡがラットの眼の毛様筋内に導入され得、エレクトロトランスファを適用することで筋肉細胞線維を効率良くかつ特異的にトランスフェクトできることを示している。この目的のため新たに考案された電極プローブを用いて、発明者らは、ＧＦＰレポータ遺伝子導入タンパク質が毛様筋内部に特異的に局在化され得ることを示した。同様に、発明者らは、エレクトロトランスファ後少なくとも３０日間、処理済みの眼の内部でのルシフェラーゼ活性の発現を実証した。さらに、ヒトＴＮＦ−α可溶性レセプタについてコードする遺伝子を伴うプラスミドの毛様筋注入及びエレクトロトランスファの適用の後、処置済みラットの房水内で、高レベルの可溶性レセプタタンパク質が測定された。興味深いことに、これらのラットは、その血清中又は他眼の中に検出可能なヒトＴＮＦ−αレセプタを全く有していなかった。これらの本願事実は、潜在的な治療的利用分野をもつタンパク質の局所的生産が達成可能であることそして、局所的に生産されたタンパク質の大部分が処置対象の眼に限定された状態にとどまっていることを実証している。

エレクトロトランスファの成功及び再現性は、標的組織内の充分量のプラスミドＤＮＡの効率の良い投与、うまく選択された電界強度及び２つの電極間の制御された距離（この距離が電界値（Ｖ／ｃｍ単位）を決定するため）によって左右される（１１、１２）。ＧＦＰ発現実験は、高用量のプラスミド（３０μｇ）の注入後に電気パルス送達が全く適用されない場合、ＧＦＰを発現する細胞は、毛様体領域内でわずかに位置特定されるということを示した。一方で、エレクトロトランスファがプラスミドＤＮＡ注入に後続していた場合、筋細胞線維内に高いＧＦＰ発現が検出され、エレクトロトランスファから最長１カ月後までのルシフェラーゼ活性により示されるように、持続的タンパク質生産が可能となった。

外眼骨格筋は、毛様筋と類似の治療目的に使用可能である。実際、発明者らは、外眼筋内への高能力プラスミドエレクトロトランスファを本願した。

いかなる治療用タンパク質の生産にも譲らなかった対照エレクトロトランスファ（生理食塩水及び空のプラスミド）と共に又は単独で注入されたプラスミドの場合、いかなる効果も見られなかったことから、ＥＩＵに対するｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミドエレクトロトランスファの有益な効果は、眼の媒質内のｈＴＮＦＲ−Ｉｓの生産の結果もたらされた。このことは、エレクトロトランスファと組合わされた低プラスミド用量（３μｇ）で処置されたラットの房水中のＴＮＦ−αレベルが、対照群又は単にプラスミド注入だけの処置を受けたラット群におけるＴＮＦ−αのレベルと比べた場合、有意に減少していたという事実により裏付けされた。治療用プラスミドのエレクトロトランスファによる治療を受けたラット群においては、眼の前眼部及び後眼部の両方において浸潤炎症性細胞の数が有意に減少し、このことは、網膜疾患の治療のために有利であるＴＮＦＲ−Ｉｓが、治療対象動物の硝子体の中でも同様に生産されてきた可能性があるということを示唆している。

ＴＮＦ−αは、眼内炎症の病因に関与する主要な炎症誘発性サイトカインである（１５、１６）。その正確な作用機序は今だに不完全にしか理解されていない（１７）。しかしながら、進行する眼内炎症性疾患のプロセスに対する明らかに有益な効果が、実験的（１８、１９）及び臨床的（２０、２１、２２）な眼の炎症性疾患の間のＴＮＦ−α遮断薬の使用によって得られている。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦＲ−Ｉ（ｐ５５、５５ｋｄ）又はＴＮＦＲ−ＩＩ（ｐ７５、７５ｋｄ）という膜結合レセプタに結合する。これら２つのレセプタの天然発生可溶性形態は、ＴＮＦ−αの炎症誘発活性を中和するが、きわめて不安定である。従って、臨床では、抗ＴＮＦ戦略は、免疫グロブリンフラグメント、ＴＮＦＲ−ＩＩｓ／Ｆｃ（エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））又はＴＮＦＲ−Ｉｓ／Ｆｃ（レネルセプト（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ））により安定させられたＴＮＦ（インフリキシマブ及びアダリムマブ）又はＴＮＦ−α可溶性レセプタに対するモノクローナル抗体のいずれかを使用する。エタネルセプトでの全身的処置は、ＥＩＵ及び眼細胞浸潤の臨床スコアを低減させる。全身的に投与されるＴＮＦＲ−Ｉｓ／Ｉｇ（ｐ５５）で処置されている後部眼内炎症患者は、ＩＬ−１０を発現する末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞数の増加という本願事実と共に、明白な臨床的改善を示した（２３）。しかしながら抗ＴＮＦ−αの全身的投与には重大な副作用が付随する（２２）。発明者の実験は、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミドのエレクトロトランスファ後の毛様筋線維によるＴＮＦＲ−Ｉｓの局所的眼内生産がＥＩＵにおける臨床的及び組織学的疾病パラメータの強度を有意に削減することを示している。これらの治療対象ＥＩＵラットにおいては、血清中に検出可能なレベルのＴＮＦＲ−Ｉｓが全く本願されなかった。かくして、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミドの毛様筋エレクトロトランスファは、その他の医療では効果がない重症の眼内炎症に罹患している患者における抗ＴＮＦ−αの全身的投与に対する代替案となり得る。

結論として、これは、ラットの眼の毛様筋又は外眼筋がプラスミドエレクトロトランスファのためにターゲティングされ得、房水中のコードされたタンパク質の長時間にわたる発現、高いレベル及び効率の良いトランスフェクション速度を生み出すということの初めての実証である。コンセプトの証明として、この技術は、ＥＩＵに罹患しているラットの治療のために適用され成功をおさめた。ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１エンコーディングプラスミドのエレクトロトランスファは、臨床的に及び組織学的に査定された眼疾患の強度を著しく低減させた。このタイプの療法は、眼疾患の治療に対し新たな興味深い道をきり開くものである。

ラットの眼におけるインビボエレクトロトランスファＡ：辺縁周囲気泡の形成を導く毛様筋内の角膜トンネルを通した注入Ｂ：エレクトロトランスファ手順中の眼球内電極及び辺縁周囲外眼電極Ｃ：電流印加直後のエレクトロトランスファを受けた部位の外見Ｄ：環状眼周囲の戻り電極の写真 ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドの注入及びエレクトロトランスファ後の毛様領域の横方向切片上のＧＦＰ発現Ａ：毛様筋（差込み図）を示すヘマトキシリン−エオシン組織像ａ：縦走線維（矢印）及び輪状線維（矢印の頭）を示すより高倍率の拡大図Ｂ：毛様筋内に局在化したＧＦＰの組織化学。矢印は複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わしている。核はＤＡＰＩで染色されている（複数の例が円で示されている）。Ｃ：毛様筋の平滑線維を示すアルファ平滑筋アクチンの免疫組織化学。矢印は、複数のアクチン発現度の高い組織領域を表わしている。核はＤＡＰＩで染色されている（複数の例が円で示されている）。 ｐＥＧＦＰ−Ｃ１の注入及びエレクトロトランスファの後の毛様領域の前額切片上のＧＦＰ発現の局在化Ａ：毛様筋の輪状線維を示すヘマラン−エオシン組織学染色。Ｂ：毛様筋の輪状線維内のＧＦＰの発現。ＧＦＰ発現度の高い組織領域は囲まれている。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。Ｃ：毛様筋の縦方向線維内のＧＦＰの発現。ＧＦＰ発現度の高い組織領域は囲まれている。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。Ｄ：毛様筋の平滑輪状線維を示すアルファ平滑筋アクチンの免疫組織化学。アクチン発現度の高い組織領域は囲まれている。Ｅ：ＧＦＰの発現が毛様筋線維内にあることを実証するアルファ平滑筋アクチン及びＧＦＰの同時局在化。赤色及び緑色蛍光の付加の結果としてもたらされた黄色蛍光によって実証された同時局在化された発現領域が囲まれている。核は、ＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で表わされている）。 ｐＥＧＦＰ−Ｃ１の注入後の前額切片上のＧＦＰ発現の局在化。Ａ：毛様体のわずかな疎細胞上のＧＦＰの発現。矢印は、複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わす。ａ：より高倍率の拡大図。矢印は、複数のＧＦＰ発現度の高い組織領域を表わす。核はＤＡＰＩで染色される（複数の例が円で示されている）。 毛様領域内でのＬＵＣ発現の反応速度。 両眼の毛様筋の中に３μｇのプラスミドｐＶＡＸ２ｌｕｃを注入した。注入の後、ラットの左眼内でのエレクトロトランスファを行なった。６日目、１２日目、２２日目及び３０日目に６匹のラットを屠殺した。 眼構造の無欠性を示すエレクトロトランスファから５日後の毛様領域の組織学。特に電気穿孔の部位にはいかなる細胞浸潤もいかなる肉芽種も観察されなかった。エレクトロトランスファから５日後に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は全く観察されず、この時点でのアポトーシス細胞の不在を示していた。 ＥＩＵの臨床的スコアＡ：ＥＩＵの臨床的スコア ＥＩＵに罹患しているもののいかなる治療も受けていない眼（Ｂ）（スコア５）又は３μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１ＧＦＰプラスミドのエレクトロトランスファ後の眼（Ｃ）（スコア０）の細隙灯写真。＊：Ｐ＜０．０００１対対照又は生理食塩水＋ＥＴ又はｐＶＡＸ２＋ＥＴ。 ＥＩＵの組織学スコア。異なる治療計画後のＥＩＵに罹患した眼の前眼部及び後眼部内の浸潤細胞の平均数を示す。＊＊：Ｐ＜０．００５対対照；†：Ｐ＜０．０００２対ｐＶＡＸ２＋ＥＴ；＃＃：Ｐ＜０．０００１対ｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１−ＥＴ；＊：Ｐ＜０．００５対対照；＃：Ｐ＜０．００５対ｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１−ＥＴ。 対照ラット（ａ：角膜）（ｈ：虹彩／毛様体）、（ｃ：視神経）から及び３μｇのｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１．ＥＴで治療されたラット（ｄ：角膜）、（ｅ：虹彩／毛様体）、（ｆ：視神経）からの眼切片の顕微鏡写真。 眼の生体構造 毛様体及び角膜内へのｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）の注入及びエレクトロトランスファから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）分泌速度。分泌速度は、［１秒あたりの計数（ｃｐｓ）で表現された］蛍光を測定する分光器を用いて測定されている。 毛様筋内へのｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）のさまざまな電気的条件（電圧、パルス持続時間、パルス数及び周波数）での注入及びエレクトロトランスファから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）分泌速度。分泌速度は、［１秒あたりの計数（ｃｐｓ）で表現された］蛍光を測定する分光器を用いて測定されている。 ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１及びＧｌｕｃタンパク質を発現するプラスミド及びｐＶＡＸ２ｍＥｐｏプラスミド（１０μｇ）の毛様筋内への注入及びエレクトロトランスファから７日後の房水及び硝子体内でのガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）、ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１及びｍＥＰＯタンパク質の分泌。 ラットの毛様体内での注入（エレクトロトランスファ無し）の後のエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の臨床スコアに対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１プラスミド（３０μｇ）の効能。毛様体内のＴＮＦＲ−Ｉｓエンコーディングプラスミド３０μｇの注入は、房水内の２７４±７７ｐｇ／ｍｌのＴＮＦＲ−Ｉｓの分泌を可能にする。 それぞれ眼の前眼部及び後眼部内の浸潤細胞の平均数で表現されたラット毛様体内の注入（エレクトロトランスファ無し）後のエンドトキシン誘発性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の組織学スコアに対するｐＶＡＸ２ｈＴＮＦＲ−Ｉｓ／ｍＩｇＧ１のプラスミド（３０μｇ）の効能。毛様体内の３０μｇのＴＮＦＲ−Ｉｓの注入は、房水内で２７４±７７ｐｇ／ｍｌのＴＮＦＲ−Ｉｓの分泌速度を可能にする。 環状手段及び針手段又は環状手段及びワイヤ手段を含むさまざまな電極装置を用いて毛様筋内にｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃプラスミド（１５μｇ）を注入及びエレクトロトランスファしてから７日後のガウシア・ルシフェラーゼ（Ｇ−ルシフェラーゼ又はＧｌｕｃ）の分泌。印加された電界は、その電界強度が２００Ｖ／ｃｍである８つの電気パルスで構成されている。電界の印加の合計持続時間は各パルスについて２０ｍｓである。周波数は５Ｈｚである。電極間の転極は、遺伝子送達の効能を修正しない。 ２つの電極を含む環状装置の例。注入のため及び／又は電極として、櫛形の第１の手段（灰色）の各先端部を使用することができる。第２の手段（黒色）は、第１の手段から分離されていてもよいし、又は２つの手段の間に一定の距離（２〜５ｍｍの間）を得るようにそれと固く結びつけられていてもよい電極である。

Claims (34)

1. 治療すべき対象の毛様筋組織又は細胞に対し投与することにより眼疾患を治療するための組成物を調製するための治療用デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の使用であって、前記投与には、電界の印加を伴う電気穿孔ステップが含まれる、使用。
2. 前記組成物が前記組織又は細胞内に直接投与される、請求項１に記載の使用。
3. 前記組成物が前記組織又は細胞内に注入により投与される、請求項２に記載の使用。
4. 前記デオキシリボ核酸が経強膜、経角膜、眼球内又は内視鏡的経路で投与されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記電界の強度が１〜４００ボルト／ｃｍにある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 前記電界の強度が５０〜２００ボルト／ｃｍにある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記電界強度が２００ボルト／ｃｍである、請求項６に記載の使用。
8. 前記電界の合計印加持続時間が、０．０１〜５００ミリ秒である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記電界の合計印加持続時間が、１ミリ秒超である、請求項８に記載の使用。
10. 前記電界の合計印加持続時間が、１０ミリ秒〜１００ミリ秒の間である、請求項８に記載の使用。
11. 前記組織に対する前記電界の印加が、定格周波数の１つ以上のパルスを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記組織に対する前記電界の印加が、０．１〜１０００ヘルツの周波数の１〜１００，０００個のパルスを含む、請求項１１に記載の使用。
13. 前記組織に対する前記電界の印加が、１〜１０Ｈｚの周波数の１〜１０個のパルスを含む、請求項１２に記載の使用。
14. 前記電気パルスが互いに不規則な形で送達され、１つのパルスに関する時間の関数として前記電界の強度を表す関数が可変的である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. 経時的な前記電界の前記変動を表す関数の積分が１ｋＶ×ミリ秒／ｃｍよりも大きい、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
16. この積分が５ｋＶ×ミリ秒／ｃｍ以上である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記電気パルスが単極又は双極波パルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 前記電気パルスが、指数関数的逓減波、制限された持続時間の単極振動波又はその他の波形の中から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
19. 前記電気パルスが方形波パルスを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
20. 前記電気パルスが双極振動波パルスを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
21. 前記投与には、５Ｈｚの周波数の８個の単極方形波パルスを含む電界を組織に対し印加することを伴う電気穿孔ステップが含まれ、各パルスの前記強度は１パルスあたり２０ｍｓの前記電界の合計印加持続時間について２００ボルト／ｃｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
22. 前記電気パルスは、１センチメートル未満だけ互いに離隔した少なくとも２つの電極を用いて印加されるようになっており、前記電極のうち少なくとも１つは、前記毛様筋組織又は細胞内に導入される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
23. 前記電極が互いに１０ミリメートル未満だけ互いから離隔されている、請求項２２に記載の使用。
24. 前記電極が互いに２ミリメートル未満だけ互いから離隔されている、請求項２２に記載の使用。
25. １つの電極が強膜又は眼結膜、好ましくは辺縁結膜の表面上に反転可能な形で適用される、請求項２２、２３又は２４に記載の使用。
26. 前記電気穿孔ステップの前後又はその間にイオン導入ステップが実施される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用。
27. 前記治療用デオキシリボ核酸が２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ又は複合体ＤＮＡである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用。
28. 前記治療用デオキシリボ核酸がプラスミドである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用。
29. 前記治療用デオキシリボ核酸が、前記毛様筋組織又は細胞の中での発現を可能にしかつ／又は促進する配列を含有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
30. 前記組成物が多数の部位で投与される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の使用。
31. 前記デオキシリボ核酸が、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼ阻害物質、アポトーシス調節因子、凝固因子、そのレセプタ、レセプタ又は接着タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストであるペプチド、抗原、抗体およびそのフラグメントの中から選択されたタンパク質をコードする、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
32. 前記治療対象の眼疾患が、炎症性疾患、虚血性疾患、増殖性疾患、神経変性疾患及び緑内障の中から選択される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の使用。
33. 前記増殖性疾患が新生血管又はグリア疾患である、請求項３２に記載の使用。
34. 前記治療対象眼疾患が、強膜炎、結膜炎、角膜炎、内皮炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症、遺伝性網膜ジストロフィ、加齢性黄斑変性症、開放隅角緑内障、血管新生緑内障及び虚血性網膜症の中から選択される、請求項３２に記載の使用。

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