JP5149346B2 - ペットのヘリコバクター種治療用ペットフード組成物 - Google Patents

Description

本発明はペットのヘリコバクター様細菌による感染に関係する疾患の予防または治療に意図されたペットフード組成物を製造するために乳酸菌の単離菌株を使用することに関する。本発明はまたそれから調製したペットフード組成物に関する。

［発明の背景］
ヒトでは、病原菌のヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に感染されると、胃炎の原因になったり、また潰瘍性疾病や胃癌になることは公知である。この治療方法は無数にある。乳酸菌がインビトロやインビボでヘリコバクター・ピロリを阻害し得ることはＥＰ５７７９０３号明細書（ネスレ）に開示した。

犬やネコのような飼いならされた肉食動物は胃内のヘリコバクターの他の種により事実上すべて感染されている。そのほとんどはインビトロで培養できないが、形態的にはＨ．ヘイルマニに似ている。Ｈ．フェリスもネコの胃粘膜から単離されたが、最近２つの新しいヘリコバクター種、即ちＨ．ビゾゼロニとＨ．サロモニスが犬から単離された。しかし、これらのヘリコバクター種は形態的分析だけでは識別できないので、胃内ヘリコバクター様生物（“Ｇａｓｔｒｉｃ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”、ＧＨＬＯ）として分類されている。

ＧＨＬＯはペットの洞部（ａｎｔｒｕｍ）および／またはコーパス（ｃｏｒｐｕｓ）にコロニーを形成するが、Ｈ．ピロリのコロニーは主にコーパスで形成される。コロニーを形成するＧＨＬＯ生物は胃基底腺に深く住み、非侵襲性細菌として知られるＨ．ピロリと比較して、時に、胃壁細胞小管内に、および小窩や胃粘膜で見られる（ダン等、１９９７、「Ｈｐは表面上皮細胞に接着性の粘膜に見られ、陰窩内にしばしば深く発見される」）。

ネコや犬の胃がヘリコバクター種により汚染されることは、胃炎が軽度から中程度に発展する重大な危険因子と考えられる。観察される炎症は、Ｈ．ピロリに感染されたヒトに起きるものより通常は酷くない。胃潰瘍、リンパ腫および癌のようなさらに酷い病変が観察され得るが、ＧＨＬＯの病原性は少しも明かにされていない。

それにもかかわらず、ネコや犬のＧＨＬＯによる感染を低レベルにコントロールすることは多くの獣医により有益なものと認識されている。このものは医薬の治療を必要とする病気とは十分には認識されていないので、ネコや犬のＧＨＬＯ感染を最小にしうる活性成分を含有するペットフード製品が一般には必要とされる。

したがって、本発明は乳酸菌の少なくとも１つの株および／またはその代謝産物またはインビトロで強力な抗ヘリコバクター細菌活性を示す能力について単離され選択された少なくとも１つの乳酸菌により発酵された培地を、ペットのＧＨＬＯ感染に関連する疾患の予防治療用に意図された組成物の製造のために使用することに関する。

望ましい態様において、単離された株により産生された代謝産物または該乳酸菌により発酵された培地、あるいは乳酸菌の単離された株により発酵された培養培地のサブフラクションが使用される。

乳酸菌株はラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバチルス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒａｈｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）からなる群から選択される。

望ましい態様において、乳酸菌株はラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ） ＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＮＣＣ２５８１（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４８）、ラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２５９２（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５０）、ラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２６１３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５２）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ） ＮＣＣ２４６１（ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６）、ラクトバチルス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ） ＮＣＣ２６０３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５１）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒａｈｍｎｏｓｕｓ） ＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４９）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ） ＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５３）、ビフィドバクテリウム種 ＮＣＣ２６２７、ビフィドバクテリウム種 ＮＣＣ２６５７、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）（ＡＴＣＣ２７５３６）からなる群から選択される。

別の目的は、ペットのＧＨＬＯ感染に関係する疾患の治療または予防方法に関し、乳酸菌の少なくとも１つの株および／またはその代謝産物あるいはインビトロで強力な抗ヘリコバクター細菌活性を示す能力について単離され選択された少なくとも１つの乳酸菌により発酵された培地を含有する組成物をペットに投与することを含む。

別の目的は、乳酸菌の少なくとも１つの単離株および／またはその代謝産物あるいは上記特徴を有する少なくとも１つの乳酸菌により発酵させた培地を、摂取可能な支持体または医薬用マトリックスとともに含有するペットフード組成物を供することである。

このペットフード組成物はネコや犬のＧＨＬＯ感染を減少させることができ、ＧＨＬＯロードとウレアーゼ活性は基底部で少なくとも０．５評点および洞部で少なくとも０．５評点減少する。

慢性胃炎におよぼす当該組成物の効果は、薄い部位のバイオプシの細胞検査により評価した。これは胃の炎症の評点で少なくとも０．５（０から３までの評点）の平均的後退で、慢性の基底部胃炎の後退を誘導しうる。

他の態様では、このペットフード組成物はＧＨＬＯによる感染レベルと相関関係にある呼吸臭を有意に減少することができる。

［発明の詳細な記載］
次の記載において、「ＧＨＬＯ」とは「胃内ヘリコバクター様生物」を意味する。ペットの胃粘膜にコロニーを形成することが分かっているヘリコバクター・フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ）、Ｈ．ヘイルマニ（Ｈ． ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ）、Ｈ．ビゾゼロニ（Ｈ． ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉ）、およびＨ．サロモニス（Ｈ． ｓａｌｏｍｏｎｉｓ）のようなヘリコバクター種はこの規定に分類される。

さらに、ペットの胃腸管に直接影響するすべての疾患や、例えば、悪い口臭症状のような２次的疾患も、「ＧＨＬＯ疾患」に含める。

また、「ＮＣＣ」はネスレのカルチャーコレクション（ネスレ・リサーチ・センター、スイス、ローザンヌ）を意味する。

本発明の最初の目的について、少なくとも１つの乳酸菌株および／またはその代謝産物あるいはインビトロで強力なヘリコバクター細菌活性を示しうる乳酸菌の少なくとも１つの株により発酵された培地を、ペットのＧＨＬＯ感染に関係する疾患の予防や治療を意図した組成物の製造に使うことに関する。

これらの菌株はその技術的および生理学的パラメータ、特にその良好な生育特性、少なくとも５×１０^８菌／ｍｌ、望ましくは１０^６から１０^１０菌／ｍｌ、更に望ましくは１０^９から１０^１０菌／ｍｌおよびインビトロで強力な抗ヘリコバクター細菌活性を示す能力について、多くの乳酸菌株から選択された。

望ましい態様において、当該乳酸菌株はラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・アニマリス、ラクトバチルス・ルミニス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ビフィドバクテリウム種、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・アニマリスからなる群から選択することができる。

該乳酸菌株はラクトバチルス・ジョンソニ ＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭ Ｉ− １２２５）、ラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２５８１（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４８）、ラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２５９２（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５０），ラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２６１３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５２），ラクトバチルス・パラカゼイ ＮＣＣ２４６１（ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６）、ラクトバチルス・アニマリス ＮＣＣ２６０３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５１），ラクトバチルス・ラムノサス ＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４９），ラクトバチルス・アシドフィルス ＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５３）、ビフィドバクテリウム種 ＮＣＣ２６２７、ビフィドバクテリウム種 ＮＣＣ２６５７、ビフィドバクテリウム・ラクティス（ＡＴＣＣ２７５３６）からなる群から選択するのがよい。

本発明により選択した各種菌株のうち、つぎの株はブダペスト条約により、国立微生物カルチャーコレクション（フランス、パリ、パスツール研）（ＣＮＣＭ）に、ラクトバチルス・ジョンソニ（ＮＣＣ５３３）については９２年６月３０日にＣＮＣＭ Ｉ−１２２５として、ラクトバチルス・パラカゼイ（ＮＣＣ２４６１）については９９年１月１２日にＣＮＣＭ Ｉ−２１１６としておよびラクトバチルス・ファーメンタム ＮＣＣ２５８１，ＮＣＣ２５９２，ＮＣＣ２６１３、ラクトバチルス・アニマリス ＮＣＣ２６０３，ラクトバチルス・ラムノサス ＮＣＣ２５８３、ラクトバチルス・アシドフィルス ＮＣＣ２６２８については００年４月１９日にそれぞれ（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４８）、（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５０）、（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５２）、（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５１）、（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４９）、（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５３）として寄託された。ビフィドバクテリウム・ラクティス（ＡＴＣＣ２７５３６）の菌株はハンセンより受けた（ハンセンＡ／Ｓ、デンマーク、ＤＫ−２９７０ホースホルム）。

＜選択菌株の生化学的特性＞
［ラクトバチルス・ジョンソニ ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５］
・グラム陽性菌、非運動性、胞子なし・かなり短く、太いカン菌・ホモ発酵代謝をもつ微好気性菌、Ｌ（＋）およびＤ（−）乳酸を産生・カタラーゼ（−）、ＣＯ_２の産生（−）、アルギニンの加水分解（−）
・糖類の発酵：アミグダリン（＋）、アラビノース（−）、セロビオース（＋）、エスクリン（＋）、フラクトース（＋）、ガラクトース（−）、グルコース（＋）、ラクトース（＋）、マルトース（＋／−）、マンニトール（−）、マンノース（＋）、メリビオース（−）、ラフィノース（＋）、リボース（−）、サリシン（＋）、シュクロース（＋）、トレハロース（＋）。

［ラクトバチルス・パラカゼイ ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６］
・グラム陽性・カタラーゼ陰性・アルギニン由来ＮＨ_３形成陰性・ＣＯ_２産生陰性・Ｌ（＋）乳酸産生・約０．４％までの濃度で胆汁塩の存在下で生育

乳酸菌の単離株および／またはその発酵された培養培地はペットの健康を改善するため、特にペットのＧＨＬＯ感染に関連する疾患の予防または治療のために意図された組成物の製造に使用することができる。

これらのものは悪い呼吸臭のようなＧＨＬＯ感染に関連する他の疾患にも使用できる。事実、ネコや犬の胃内にＧＨＬＯが存在すると、尿素から多量のアンモニアが生成されるので呼吸臭に明らかに影響を及ぼす。このアンモニアはゲップをした後に呼吸に現れる。悪臭は、スルフィド揮発性化合物の産生により胃内のＧＨＬＯの存在にも関係する。該単離株により産生された代謝産物は悪い呼吸臭を減じかつペットの呼吸を新鮮にすることが望ましい。

乳酸菌の単離株により発酵された培養培地のサブフラクションも使用できる。本発明の乳酸菌株は生存可能な形または不活化された形で使用できる。

望ましい態様において、乳酸菌菌株はその発酵生育培地の存在下で使用される。この培地は単独でまたは食品と一緒に例えば滅菌し、押出しまたは噴霧乾燥、冷蔵または貯蔵安定にすることができる。

乳酸菌またはその対応する発酵培地を、ペットに利用できる量が約１０^３−１０^１４ｃｆｕ／日に相当するように使用できる。この量は動物の体重に左右され、犬では約１０^９−１０^１２ｃｆｕ／日、ネコでは１０^７−１０^１１ｃｆｕ／日が望ましい。

他の態様では、本発明はペットのＧＨＬＯ感染に関係する疾患の治療または予防方法であって、乳酸菌の少なくとも１つの株および／または上記特徴を有する少なくとも１つの乳酸菌により発酵される培地を含有する組成物をペットに投与するものである。ペットに利用可能な量は約１０^３−１０^１４ｃｆｕ／日に相当し、犬では約１０^９−１０^１２ｃｆｕ／日、ネコでは１０^７−１０^１１ｃｆｕ／日が望ましい。

本発明の第２の主目的は乳酸菌の少なくとも単離された株および／またはその代謝産物あるいは発酵生育培地を含有するペットフード組成物に関し、該乳酸菌は上記の特徴を有し、組成物は摂取可能な支持体または医薬用マトリックスをともに含む。

当該株および／またはその発酵培地はインビトロで強力な抗ヘリコバクター細菌活性を示す能力について動物の消費に適する１つ以上の乳酸菌から選択することができる。

上記の特徴を有する少なくとも１つの菌株および／またはその発酵培地はペットの通常の食事の補給として、あるいは栄養的に完全なペットフードの成分としてペットに投与することができる。

本発明にかかる栄養的に完全なペットフード組成物は粉末でも、乾燥状またはウェット状、冷蔵または貯蔵安定なペットフード製品でもよい。
ペット用の食事補給でもあるいは医薬組成物でもよい。

栄養的に完全なペットフードは任意の適当な形でよく、例えば乾燥形、半ウェット形およびウェット形でよい。これらのペットフードは常法通り製造することができる。菌株および／またはその発酵培地の他に、これらのペットフードは１種以上の澱粉源、タンパク質源および脂質源を含有してもよい。

適当な澱粉源は例えば、コーン、コメ、小麦、大麦、オート、大豆およびそれらの混合物のような穀類やマメ科植物である。
適当なタンパク質源は肉、肉粉、家禽粉、魚粉、濃縮大豆タンパク質、乳タンパク質、グルテンなどの適当な動物又は植物タンパク質源から選択できる。老齢の動物には、高品質のタンパク質を含むタンパク質源が望ましい。
適当な脂質源には肉、動物脂肪および植物脂肪がある。

澱粉、タンパク質及び脂質源の選択は、動物の栄養要求度、食性の問題、および製造製品の種類により主に決定される。老齢のペット用には、ペットフードは、若令のペット用のペットフードよりも比例的に脂肪含量が少ないのがよい。さらに、澱粉源は１種以上のコメ、大麦、小麦およびコーンを含んでもよい。

さらには、各種他の成分、例えば糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン、フレーバ付与剤、脂肪などを必要に応じてペットフードに加えることもできる。

乾燥ペットフードでは、押出し加熱方法が適しているが、焙焼その他の適当な方法も使用できる。押出し加熱する場合は、乾燥ペットフードは粗挽き粉（ｋｉｂｂｌｅ）の形で通常供される。プレビオティックを使用する場合には、加工する前に、プレビオティックを乾燥ペットフードの他の成分と混和してもよい。適当な方法はＥＰ０８５０５６９号明細書に記載される。プロビオティック微生物を使用する場合には、該微生物を乾燥ペットフードに被覆するかまたは一緒に加えるのがベストである。適当な方法はＥＰ０８６２８６３号明細書に記載される。

ウェットなペットフードでは、米国特許第４，７８１，９３９号明細書および５，１３２，１３７号明細書に記載の方法を使用して、肉に似た製品を得ることができる。チャンク型の製品を製造する他の方法、例えば、スチームオーブン加熱も使用可能である。別法としては、適当な肉材料を乳化して肉すり身を調製し、適当なゲル化剤を加え、そして缶やその他の容器に充填する前に該すり身を加熱してローフ型の製品を製造することもできる。

ペットフード中のプレビオティックの量は約２０重量％、特に約１０重量％がよい。例えば、プレビオティックはペットフードの約０．１％から約５重量％を含む。プレビオティックとしてチコリを使用するペットフードでは、チコリは飼料混合物の約０．５％から約１０重量％、望ましくは約１％から約５重量％を含むのがよい。

プロビオティック微生物を使用する場合には、ペットフードはプロビオティック微生物をペットフードのｇあたり約１０^４〜約１０^１０細胞含有するのがよく、より好ましくはペットフードのｇあたり約１０^６〜約１０^８細胞を含有する。ペットフードは約０．５％〜約２０重量％のプロビオティック微生物の混合物を含み、好ましくは約１％〜約６重量％、例えば約３％〜約６重量％を含む。

ペットフードには他の活性成分例えば、長鎖脂肪酸を含んでもよい。適当な長鎖脂肪酸にはα−リノール酸、γ−リノール酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサン酸がある。魚油はエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサン酸の適当なソースである。ルリチシャ油、黒スグリ種油およびマツヨイグサ油はγ−リノール酸の適当なソースである。サフラワー油、ヒマワリ油、コーン油および大豆油はリノール酸の適当なソースである。

必要なら、ペットフードにミネラルやビタミンを補給して、栄養的に完全にすることができる。
さらに、必要なら、菌株を例えば糖マトリックス、脂肪マトリックスあるいは多糖類マトリックス中にカプセル化できる。

有益な効果を得るためにペットに消費されるペットフードの量はペットの大きさ、ペットの種類およびペットの年齢により異なる。しかしながら、約１０^３〜１０^１４ｃｆｕの少なくとも１つの乳酸菌株および／またはその対応する発酵培地の日常量を供するペットフードの量が通常適している。犬では約１０^９〜１０^１２ｃｆｕ／日、ネコでは１０^７〜１０^１１ｃｆｕ／日を投与するのが好ましい。

本発明の組成物は特にペットのＧＨＬＯに関連する感染の予防又は治療を意図するもので、特に、例えば、ペットの胃腸管あるいは下部腸の感染の予防又は治療を意図するものである。これは例えば、ペットの健康な消化機能を維持しかつ例えば、ＧＨＬＯのような病原株による再感染を予防することも意図している。したがって、この組成物はＧＨＬＯの侵入に対する抗生物学的治療のアジュバントとしても使用できる。

本発明組成物のＧＨＬＯに及ぼす影響はバイオプシ部位（例２参照）の組織検査により評価した。部位あたりＧＨＬＯの数が細菌ゼロの場合、評点は「０」で、細菌が５未満の場合は、評点「１」、５から２０の場合、評点は「２」、２０以上の場合は、評点は「３」である。このペットフード組成物は犬ネコのＧＨＬＯ感染を減少させることができ、基底部中のＧＨＬＯロード（ｌｏａｄ）とウレアーゼ活性は少なくとも０．５の評点減ぜられ、かつ洞部では少なくとも０．５の評点減ぜられた。

慢性胃炎の本組成物の効果はまたバイオプシ薄層部位の細胞検査により評価した。慢性胃炎の組織学的分類はつぎの通りである。
・評点０：表面繊維形成、０好中球、０−１０リンパ球およびプラズマ細胞、凝集体なし、正常上皮細胞、
・軽度の慢性胃炎−評点１：慢性表面胃炎、１０−１５表面間隙性組織を含むリンパ球またはプラズマ細胞、凝集体＜２、正常な上皮細胞、
・中度の慢性胃炎−評点２：慢性間隙性胃炎、１０−５０またはそれ以上の粘膜が全体に厚いリンパ球またはプラズマ細胞、凝集体＞３、正常上皮細胞、
・重篤な慢性胃炎−評点３：萎縮性胃炎、１０−５０またはそれ以上リンパ球またはプラズマ細胞、凝集体＞３、腺性上皮細胞変化

この組成物は胃の炎症の評点で少なくとも０．５の平均的後退で、慢性基底部胃炎の後退を導くことができる。

この組成物は呼吸臭を有意に減少させることもわかった。したがって、ペットの悪い呼吸臭のようなＧＨＬＯ感染に関係する２次的疾患を治療または予防するものである。
さらに、本発明の組成物は犬の寿命を改善することもできる。

次の例は説明を目的とするものであり、本願の主題を限定するものではない。すべての百分率は特に断らない限り、重量により表す。

＜例１ 菌株の選択＞
本発明の菌株を選択するために、増殖可能なＧＨＬＯ（１０^７菌）はＤＭＥＭ中該菌株の生育上澄（ＢＳ）の連続希釈物の存在下で５％ＣＯ_２のもと３７℃で１−２時間培養することができる。培養後、ＧＨＬＯ−ＢＳ混合物を１２，０００ｇで３分間遠心分離し、ついでペレットを１ｍｌの０．９％ＮａＣｌで洗い、急速ウレアーゼテスト（Ｊａｔｒｏｘ^登録商標−Ｈ．ｐ．テスト、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，ドイツ）５００μｌに再懸濁させる。ウレアーゼ活性に比例する比色変化は、５５０ｎｍの光学密度の比色分析によって測定される。
菌の生存可能性は、１０％の馬の血清（イノテック）、および１％のＩｓｏｖｉｔａｌｅ Ｘ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ）を補給した血清プレート（ＧＣ寒天、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ペイズリー、スコットランド）上にＧＨＬＯの連続希釈物を平板培養してＬＳによる培養前後に評価し、そしてコロニ−形成単位（ＣＦＵ）をカウントする。

＜例２＞
犬のヘリコバクター種感染に及ぼすラクトバチルスの発酵培地による補給効果を実験する。

［材料と方法］
＜動物＞
フランス、リヨンの獣医学校の倫理委員会はこの研究を認証した。ＧＨＬＯを自然に胃内感染させた９匹の雄のビーグル犬をこの研究に使った。動物は体重１０−１４ｋｇ、年齢３−４歳の範囲である。犬を各犬舎に収容し、衛生と飼育条件を同一にした（リヨンの獣医学校）。犬舎は毎日清掃し、消毒した。
犬は規則的に午前８時に給餌し、実験中飲料水にはコンスタントに接近させた。全実験中、特定の飼料（ＶＩＴＡＬＩＴＹ^登録商標、フリスキー社、フランス）を与えた。

＜実験デザイン＞
処理前の、ＧＨＬＯの胃内感染は、ＧＨＬＯの同定（組織細菌学）、胃内ウレアーゼ活性（Ｊａｔｒｏｘ^登録商標試験）および胃の基底部および／または洞部バイオプシの慢性胃炎（組織病理学）の存在を評価して９匹のビーグル犬で確認した。ＧＨＬＯ感染のすべての犬は１３日間処理に供した。これらの試験プラス^１３Ｃ−尿素呼吸試験によるＧＨＬＯの胃内感染の検出は３度（処理前〔Ｄ_０〕、処理終了時〔Ｄ_１３〕および処理終了後３０日〔Ｄ_４３〕）繰返した。

＜処理＞
処理は、１３日の期間中Ｌ．ジョンソニ ＮＣＣ５３３により発酵させた酸性乳標品を毎日消費させるものである。この酸性乳標品は特定の飼料（２４０ｇ「ＶＩＴＡＬＩＴＹ／犬」）を与える前に完全に食べさせる必要があった。

＜評価試験＞
・［臨床試験］：全実験中、犬は該獣医学校の二人の獣医師により観察した。臨床知見は報告書の形で記録した。

・［胃のバイオプシ］：麻酔下（ケタミン、ＩＭＡＬＧＥＮＥ^登録商標、５ｍｇ／ｋｇ−ＩＭ（静注））、胃の内視鏡検査を行った。犬は２４時間断食させた。内視鏡はビデオガストロスコープ、オリンパス^登録商標ＧＩＦＫ／ＸＶ１０で行った。各評価の日に、１２個のバイオプシを胃の基底部と洞部から取った。ＧＨＬＯのウレアーゼ活性を測定するために、２つの基底部および洞部バイオプシを直ぐに使用した。４つの基底部と洞部バイオプシは組織細菌学および組織病理学のために使用する前に「ブーイン（ｂｏｕｉｎ）」溶液に保持させた。

・［ＧＨＬＯの同定（組織細菌学）］：ＧＨＬＯの同定は、バイオプシ部位の組織検査により行った。組織部位はギームサ型染色液で染色し、顕微鏡（×１０００）で評価した。ＧＨＬＯの半定量的評価は胃内の局在と細胞外のコンタミの深さを考慮して行う。部位当たりのＧＨＬＯの数が無菌の場合、評点「０」、５未満の場合、評点「１」、５〜２０の場合、評点「２」、および２０を越える場合、評点「３」である。各基底部および洞部バイオプシについては、２つの部位を試験し、評価し、結果は２つの評価の平均値であった（エム・ディー・ウィラード、１６頭のドイツシェパード犬の天然に増殖する小腸のバクテリア過剰繁殖の特徴、Ｊ．Ａ．ｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９４，２０４，１２０１−１２０６）。

・［胃内ウレアーゼ活性］（Ｊａｔｒｏｘ^登録商標−Ｈ．Ｐ．テスト、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ、ドイツ）：本試験の原理は、試験媒体の尿素をＧＨＬＯに存在するウレアーゼにより分解させる。尿素の分解に関係するｐＨ値の上昇は、指示薬（フェノールレッド）が黄色からピンク／赤に変色することにより分かる。バイオプシは試料採取後直ぐに試験した。指示薬にバイオプシを加えた後、Ｊａｔｒｏｘ^登録商標試験はＵＶ検出器で比色計により１８０分間で読んだ。比色計は対照６５０ｎｍで５５０ｎｍにセットした。基底部および洞部バイオプシのウレアーゼ活性は２つの光学的測定の平均であった。

・［^１３Ｃ−尿素呼吸試験］：ＵＢＴ試験は内視鏡検査のため麻酔した後、２時間で行った。したがって、麻酔はＵＢＴの結果に影響を及ぼさなかった。ＵＢＴは麻酔せずに断食犬に行った。最初に、犬には試験食を食べさせ、それは、毎日の摂取量の半分、即ち１２０ｇＶＩＴＡＬＩＴＹ^登録商標／犬である。２回目で、犬に７．５ｍｇの^１３Ｃ−尿素／犬（マス・トレース、ウォバーン、米国）を経口投与した。試験食の前（ＴＢ）ついで^１３Ｃ−尿素の投与から４０分後（Ｔ４０）に、^１３ＣＯ_２尿素ブリ−ズアウト試料を得た。その後、犬に毎日の食事量の半分を与えた。^１３ＣＯ_２尿素ブリーズアウト試料をガスアイソトープ比質量分析計（フィニガンＭＡＴ、ドイツ、ブレーメン）で分析した。研究室間の結果を標準化するために、^１３Ｃ‐対照の国際標準（ビエナ・ピー・ディー・ベルムナイト即ちＶＰＤＳ）のアナログを使用した。^１３ＣＯ_２の原子比過剰はベースラインの試料（試験食および^１３Ｃ投与前〔ＴＢ〕の試料）と４０分後〔Ｔ４０〕に得た試料×１０００（４４，４５）間の原子率^１３ＣＯ_２の差（デルタ値、δ）として規定した。結果は過剰δ^１３ＣＯ_２（δ‰）として表した。

・［組織病理学（細胞学）］：ｃｙｔｒｏＢＴ試験により行った組織病理学はバイオプシ薄層部位を細胞検査して行った。インプレッション部位をヘマトキシリン−フォロキシン−サフロン（ＨＰＳ）で染色し、顕微鏡で観察した。胃バイオプシの組織的診断の基準は、４００倍で見た３つの領域の平均および２００倍の試料中の数であるリンパ球集合体の量である各細胞型の数に依存する。慢性胃炎の組織学的分類はつぎの通りである。
・評点０：表面繊維形成、０好中球、０−１０リンパ球とプラズマ細胞、集合体なし、正常上皮細胞
・軽度の慢性胃炎−評点１：表面慢性胃炎、１０−１５表面間隙性組織を含むリンパ球またはプラズマ細胞、集合体＜２、正常上皮細胞
・中度な慢性胃炎−評点２：間隙性慢性胃炎、１０−５０リンパ球または粘膜の全厚さを含むプラズマ細胞、集合体＞３、正常上皮細胞
・重篤な慢性胃炎−評点３：萎縮性胃炎、１０−５０それ以上のリンパ球またはプラズマ細胞、集合体＞３、腺性上皮細胞変化（萎縮）
（Ｒｅｆ．（参照）：ピー・レコインダー、エム・シュバリエ、アール・ジラードおよびエフ・ダウリン、犬の小腸のバクテリアの異常発育および炎症性腸病。スピラマイシン−メトロニダゾール併用の医療効果の評価、Ｒｅｖｕｅ Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．１９９８，１４９，８４３−８５２）。

＜統計的分析＞
診断試験の各結果は、別々のバイオプシから２つの測定値の平均である。結果分布の正常性または異常性はウィルク−シャピロ法により試験した。
処理および処理後の効果は、ウィルコキソンのランク付け試験（ＷＳＲＴ）および／または対ｔ−試験を使って評価した。すべての統計的計算はソフトウェアプログラム（Ｓｔａｔｉｓｔｉｘ^登録商標、エクセル マイクロソフト^登録商標）で行った。Ｐ‐値＜０．０５は有意とみなされた。

＜結果＞
胃内ＧＨＬＯロードの運動性：結果は表１および２に示す。

処理（〔Ｄ_０〕から〔Ｄ_１４〕）段階の終わりに、ＧＨＬＯの中央値細菌ロードは有意に基底部（Ｐ＝０．０１４３）で「３」から「１」の評点に、かつ洞部（Ｐ＝０．０３６０）では「２」から「１」に低下した。
処理開始と研究（〔Ｄ_０〕から〔Ｄ_４３〕）の終了の間で、ＧＨＬＯによる中央値細菌ロードは基底部バイオプシ（Ｐ＜０．０３６０）で「３」から「２」の評点に有意に減少した。洞部バイオプシでは、有意な差はなかった。

＜胃内ウレアーゼ活性（Ｊａｔｒｏｘ^登録商標試験）＞：結果は表３および４に示す。

処理（〔Ｄ_０〕から〔Ｄ_１４〕）段階の終わりで、ウレアーゼ活性の平均は基底部（Ｐ＝０．０１５５）で３５％、および洞部（Ｐ＝０．０１９７）で９３％有意に減少した。

処理（〔Ｄ_１４〕から〔Ｄ_４３〕）の終了２９日後に、平均ウレアーゼ活性は基底部バイオプシ（Ｐ＝０．０３８１）で３５％有意に減少したが、処理の開始時より依然として低かった。洞部のウレアーゼ活性は修正されず、ゼロのままだった。

＜全般のウレアーゼ活性（^１３Ｃ−尿素呼吸試験））＞：
結果は表５に示す。

処理（〔Ｄ_０〕から〔Ｄ_１４〕）の開始と終了の間で、３５％の^１３ＣＯ_２−ブリーズアウトの中央値^１３Ｃ−エンリッチメントは有意に減少した（Ｐ＝０．０４９）。
処理終了後の２９日間（〔Ｄ_１４〕から〔Ｄ_４３〕）終了時に、^１３ＣＯ_２−ブリーズアウトの^１３Ｃ−エンリッチメントは有意には変わらなかった。

＜慢性胃炎（^１３Ｃ−尿素呼吸試験）＞：
結果は表６および７に示す。

処理（〔インクルージョン〕から〔Ｄ_１４〕）の段階の終わりに、慢性胃炎の中央値は基底部（Ｐ＝０．０１４３）で「１」から「０」の評点に有意に低下した。この減少は、研究の終了まで維持された。中央値評点の有意な修正は洞部バイオプシに示されなかった。

＜結論＞

慢性胃炎の胃内ＧＨＬＯ感染の犬では、Ｌ．ジョンソニ ＮＣＣ５３３により発酵させた酸性乳標品を消費することにより、つぎの結果を得ることができた。
即ち、
・基底部および洞部で、処理中、ＧＨＬＯロードおよびウレアーゼ活性の有意な減少ならびに慢性胃炎の後退、
・基底部では、処理終了後に維持された慢性胃炎の有意な後退、
・副作用なし。

＜例３：各種ラクトバチルス菌株の培養上澄に存在する抗ヘリコバクター性＞
単離株：ＮＣＣ ５３３、ＮＣＣ ２５８３およびＮＣＣ ２６２８のラクトバチルス菌の生育培養上澄のインビトロ抗−ＧＨＬＯ性をウレアーゼ活性の阻害により評価した。

Ｈ．ビゾゼロニおよびＨ．サロモニスはコロンビア寒天−５％ヒツジ血液で生育した。Ｈ．フェリスは３ｇ／Ｌ酵母エキスと１０％ヒツジ血液を含有するブレーンハートインフュージョン（ＢＨＩ）で生育した。すべてのヘリコバクター種は微好気性雰囲気（８５％Ｎ_２／１０％ＣＯ_２／５％Ｏ_２）にて３７℃４８時間維持された。２．５ｇ／Ｌ酵母エキスを補給したＢＨＩブロスに集菌した。菌数は６００ｎｍの光学密度（１ＯＤ６００＝１０^８菌／ｍｌ）を測定して評価した。

適当な培地中の純粋のまたは予備希釈した培養上澄は、最終的にＤＭＥＭ培地に１：２に希釈した。ｐＨを４．２に調整した後、試料を０．２μＭで濾過して滅菌した。１×１０^７Ｈ．ピロリの均等物を、異なる試料５００μｌを含有する試験管に加え、さらに該管を細胞培養器（５％ＣＯ_２）にて３７℃で１時間維持させた。遠心分離により集菌した。菌ペレットを０．９％ＮａＣｌで一度洗いそして２５０μｌのウレアーゼ試験試薬（Ｊａｔｒｏｘ^登録商標−Ｈ．ｐ．テスト、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）に再懸濁させた。更に３７℃で１時間培養した後、ウレアーゼ活性に比例する、比色定量変化を５５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）の比色計で測定した。

＜発酵上澄標品＞
ＮＣＣ ２５８３およびＮＣＣ２６２８のネスレ・カルチャー・コレクションから得たラクトバチルスをＭＲＳ−パスツール培地で生育させた。Ｅ．フェシウム ＳＦ６８およびＳ．ブーラジ ＳＢ２０はそれぞれＨＪＬ培地とＹＰＦ培地に生育させた。３７℃で４８時間後、菌をペレット化し、発酵上澄を回収し、そして更に使うまで−２０℃で凍結保存した。

＜結果＞
Ｅ．フェシウム ＳＦ６８（Ｂｉｏｆｅｒｍｅｎｔ）とＳ．ブーラジＳＢ２０（Ｌｅｖｕｃｅｌｌ）のラクトバチルス株、ＮＣＣ ２５８３およびＮＣＣ ２６２８のストックを適当な培地にて平行して生育させた。各種発酵上澄を、ウレアーゼ試験を使って、Ｈ．ベゾゼロニ、Ｈ．サロミニスおよびＨ．フェリスに対する阻害能力について試験した。アッセイではＮＣＣ ５３３生育培養上澄をポジティブコントロールとして使用し、培地単独をネガティブコントロールとして使用した。

表８は２つの別々の実験結果を示す。＜Ｌ．アシドフィルスＮＣＣ ２６２８＞の発酵上澄は、Ｈ．ビゾゼロニ、Ｈ．サロミニスおよびＨ．フェリスのウレアーゼ活性を全体的に阻害した。＜Ｌ．ラムノサス ＮＣＣ ２５８３＞の発酵上澄はＨ．ビゾゼロニとＨ．サロモニスのウレアーゼ活性を部分的に阻害したが、Ｈ．フェリスのウレアーゼ活性は阻害しなかった。

任意のヘリコバクター種は＜Ｌ．ジョンソニ ＮＣＣ ５３３＞培養上澄との培養により、それらのウレアーゼ活性は完全に阻害された。３つのヘリコバクター種とＥ．フェシウムＳＦ ６８の生育培養上澄、Ｓ．ブーラジ ＳＢ２０の生育培養上澄とを培養した場合、ウレアーゼ活性の阻害は観察されなかった。

３つのラクトバチルス、Ｅ．フェシウム、Ｓ．ブーラジはそれらの適当な培地で４８時間培養した。発酵培養上澄の１／２希釈を２×１０７菌／ｍｌとともに培養した。１時間培養後、Ｈ．ビゾゼロニ、Ｈ．フェリスおよびＨ．サロモニスのウレアーゼ活性を比色計により評価した。完全阻害 ＯＤ_{５５０ｎｍ}＝０； 阻害なし ＯＤ_{５５０ｎｍ}≧０．５。

＜例４ 乾燥ドッグフード＞
飼料混合物は約５８重量％のコーン、約５．５重量％のコーングルテン、約２２重量％のチキンミール、２．５重量％の乾燥チコリ、ラクトバチルス・ジョンソニ ＮＣＣ ５３３（ＣＮＣＭ−Ｉ １２２５）およびラクトバチルス・パラカゼイ（ＣＮＣＭ−Ｉ ２１１６）の株による、犬用の対応する量が約１０^９−１０^１２ｃｆｕ／日となっている発酵乳、および残りは塩、ビタミンおよびミネラルから構成される。

飼料混合物を予備コンディショナーに入れ、加湿する。ついでこの加湿飼料をエクストルーダ加熱機に供給し、ゼラチン化する。エクストルーダにのこるゼラチン化マトリックスをダイに通し、押出す。押出し物を犬に供するのに適当な断片に切断し、約１１０℃で約２０分間乾燥し、冷却してペレットを得る。

この乾燥ドッグフードはペットの健康を改善し、特にペットのＧＨＬＯ感染に関連する疾患を予防することができる。

＜例５＞
２０匹の雄のビーグル犬を使って試験を行った。この犬はＧＨＬＯで自然に胃内感染させた。最初に、すべての犬に、ＧＨＬＯの撲滅に古典的な治療として、２つの異なる抗生物質（スピラマイシン（Ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎｅ）とメトロニダゾール（Ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ））とオメプラゾール（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）のような抗分泌剤とを含む抗生物質を、１週間与えた。

処理７日後、半分の犬はＧＨＬＯ陰性であり、即ち、ヘリコバクター菌は組織細菌学的にも検出されず、胃内ウレアーゼ活性もなく、^１３Ｃ−尿素呼吸試験値は４０分でベースラインより５‰未満の増加率であった。

処理後、半分の犬には対照飼料として、市販の乾燥ドッグフードである、フリスキー（Ｆｒｉｓｋｉｅｓ）のメニューエネルギー製品（Ｍｅｎｕ Ｅｎｅｒｇｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）を与えた。１０匹の残りの犬には、犬用の量が約１０^９−１０^１２ｃｆｕ／日となる、ラクトバチルス・ジョンソニ ＮＣＣ ５３３（ＣＮＣＭ−Ｉ １２２５）およびラクトバチルス・パラカゼイ（ＣＮＣＭ−Ｉ ２１１６）株による乾燥発酵乳のペレットを含有すること以外は、フリスキーのメニューエネルギー製品に想到する試験飼料を与えた。

^１３Ｃ−尿素呼吸試験と組織細菌学によるヘリコバクターの検出を、これらの２つの異なる飼料を与えた６週間後に再度行った。結果によれば、通常のフリスキーメニューエネルギ製品を与えた犬の２０％は６週間で陽性になった。試験飼料を与えたすべての犬は６週間後に陰性になった。
この組成物はＧＨＬＯの再侵入防止用の抗生物学的治療のアジュバントとして有効である。

＜例６ 缶詰ペットフード＞
７３％の家禽屠体、豚の肺および牛の肝臓（粉砕）、１６％の小麦粉、２％の色素および９％のラクトバチルス・ジョンソニ ＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭ−Ｉ １２２５）およびビフィドバクテリウム・ラクティス（ＡＴＣＣ ２７５３６）株による発酵乳、ビタミンおよび無機塩からなる混合物を調製する。この混合物を１２℃で乳化し、プリンの形に押出し、ついでこれを９０℃の温度で加熱する。３０℃に冷却し、塊に切断する。この塊４５％を、ソース５５％（９８％の水、１％の色素および１％のグアーガムから調製した）と混合する。スズめっきの缶に充填し、１２５℃で４０分滅菌した。
このウェットな組成物はペットのＧＨＬＯ感染に関係する疾患を予防または治療するのに使われる。

＜例７ 悪い呼吸臭への影響＞
胃にＧＨＬＯを有する１０匹の犬を例２と同じ飼料で２週間飼育した。呼吸臭はハリトメータによって治療の開始と終わりに各犬で測定した。
この実験では、Ｌ．ジョンソニ ＮＣＣ ５３３で発酵させた酸性乳調製物を含有する組成物で犬を飼育すると、呼吸臭は有意に減少した。
さらに、ヘリコバクターによる感染レベルと呼吸臭の間に明かな相関関係があった。

Claims (2)

1. 犬用の胃内ヘリコバクター様細菌（ＧＨＬＯ）感染疾患治療剤であって、
   ラクトバチルス・ジョンソニを、１日あたりの量で１０ ^９ から１０ ^１２ ｃｆｕ含む、治療剤。
2. 前記ラクトバチルス・ジョンソニはラクトバチルス・ジョンソニＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭ Ｉ−１２２５）である、請求項１に記載の治療剤。