JP5157246B2

JP5157246B2 - 小径細胞体捕捉チップ及びその製造方法

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Publication number: JP5157246B2
Application number: JP2007130285A
Authority: JP
Inventors: 大輔内田; 康浩遠藤; 伸一若菜
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: JP2008283885A

Description

本発明は小径細胞体捕捉チップ及びその製造方法に関するものであり、特に、直径が数μｍ程度の幹細胞等の小径細胞体へ遺伝子、薬剤を注入するマイクロインジェクションシステムにおいて、小径細胞体にダメージを与えることなく確実に配列・固定化するための構成に特徴のある小径細胞体捕捉チップ及びその製造方法に関するものである。

近年、細胞内に遺伝子などを注入することで細胞の性質改変を行うことは遺伝的な原因による病気を治療する方法として注目され、その研究が進んでいる。
この研究の成果としては、遺伝子の役目を解明することや、個人の遺伝子特性に合わせた投薬や治療を行うテーラーメード医療が可能になることなどが挙げられる。

細胞内に遺伝子を注入する方法としては、高圧パルスを利用する電気的な方法（エレクトロポレーション法）、エンドサイトーシスや膜融合を利用する化学的な方法（リポフェクション法）、ウイルスを利用する生物的な方法（ウイルスベクター法）、微細針を使用する機械的な方法（以下、マイクロインジェクション法）、レーザー光を利用する光学的な方法（レーザーインジェクション法）などが一般的に良く知られている。

しかしながら、電気的な方法は細胞に与えるダメージが大きく、また化学的な方法では遺伝子の注入効率が悪く、更に生物的な方法では全ての注入材料が導入できない（ウイルスの制限）などの欠点がある。
一方、現時点では機械的な方法、即ち、マイクロインジェクション法が、最も安全で注入効率が高い方法として注目されている。

このマイクロインジェクション法を用いるためには、細胞を捕捉・固定する必要があり、そのために、細胞を捕捉させるための細胞径と同等もしくは細胞径より小さな口径の凹部構造を有する細胞固定板（一般にはシリコンチップ）を備え、細胞を入れた培養液（液体培地）を凹部構造の下部に設けた捕捉孔から吸引することによって、細胞固定板上の孔の表面部分に細胞を吸着し固定することが提案されている（例えば、特許文献１乃至特許文献５参照）。

或いは、マイクロポーラスガラス等の多孔質プレートに受精卵の形状に沿った凹部を設け、多孔質プレートに含まれている微細孔を介して吸引することによって、凹部に数１００μｍ径の受精卵を捕捉することも提案されている（例えば、特許文献６参照）。

また、細胞を固定させるその他の手段としては、電極間に高周波を印加し、細胞に働く電場の力を利用して細胞固定板上の微小電極に細胞を固定させるものや、細胞に親和性の無い細胞固定板上に細胞親和性物質を配置し、その細胞親和性物質上に細胞を固定させるものなどが挙げられる。

この様ないずれかの手段によって細胞を捕捉・固定し、固定された細胞に微細注入針（キャピラリー）を差し込んで物質を順次注入（注入処理）することにより、大量の細胞への注入を可能としている（例えば、特許文献３参照）。
特開昭６３−１２９９８０号公報特開平０１−１１２９７６号公報特開２００２−０２７９６９号公報特開２０００−０２３６５７号公報特開平０１−１４４９７０号公報特開平１０−１６５１６６号公報

しかしながら、上述の従来のマイクロインジェクション法がターゲットとしていた細胞は数１００μｍ径の卵細胞といった比較的、径の大きな細胞であったのに対し、最近では５〜１０μｍ径の幹細胞を用いた再生医学・再生医療の研究・治療が盛んになり、幹細胞へのマイクロインジェクションに対する要求が高くなっている。

この幹細胞は卵細胞などと比べるとサイズが非常に小さく、これら小径細胞を固定基板上に確実に整列・固定化させるためには、従来のプロセス技術を用いた上述の構造では、細胞が吸引孔内を通り抜けるといった不具合が発生しており、マイクロインジェクションが困難であるという問題がある。

また、上述の特許文献３の場合には、細胞を吸引孔内に一部引き込んで吸引トラップするために、細胞に与えるダメージが問題になる。

さらに、シリコン基板との基板にエッチングによる微細な吸引孔を形成する方法では、５〜１０μｍ径の幹細胞のような小径細胞を吸引固定するための微細な吸引孔を現実的に作製することができないという問題がある。

仮に、このような幹細胞をはじめとする小径細胞に適した微細な吸引孔形状を現行のプロセスを用いて実現しようとすると、高価なプロセス装置が必要であり、また吸引孔と細胞を保持する凹部構造とのアライメントが難しく歩留まりも低下してしまうため、結果として製造コストが上昇するという問題がある。

したがって、本発明は、微細な吸引孔をリソグラフィーを用いることなく形成し、微小な小径細胞体にダメージを与えることなく、確実に捕捉・固定化することを目的とする。

図１は本発明の原理的構成図であり、ここで図１を参照して、本発明における課題を解決するための手段を説明する。
図１参照
上記の課題を解決するために、本発明は、細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体８を捕捉固定するための凹部構造層６と、一方向に貫通した吸引孔５を有する吸引孔層４と、前記凹部構造層６と吸引孔層４を支持する支持基板１を有するとともに、前記凹部構造層６内に吸引孔５が少なくとも二つ以上配置され、且つ、前記吸引孔５の径が前記小径細胞体８の平均直径の１／１００〜１／１０である小径細胞体捕捉チップであって、前記吸引孔層４がアルマイトポア膜からなり、前記吸引孔５が陽極酸化により自己組織化されたポアからなることを特徴とする。

このように、小径細胞体捕捉構造を、凹部構造層６と一方向に貫通した吸引孔５を有する吸引孔層４とに分離して形成することによって、吸引孔５の径が小径細胞体８の平均直径の１／１００〜１／１０となる吸引孔層４を形成することが容易になるとともに、凹部構造層７内に吸引孔５を少なくとも二つ以上配置することが容易になり、また、吸引孔５の径を小径細胞体８の平均直径の１／１００〜１／１０としているので、幹細胞等の細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体８をダメージを与えることなく、且つ、吸引孔５内に引き込むことなく確実に捕捉することが可能になる。

この場合、吸引孔層４をアルマイトポア膜とし、吸引孔５を陽極酸化により自己組織化されたポアとすることによって、エッチング工程を用いることなく、小径細胞体８の平均直径の１／１００〜１／１０となる吸引孔層４を簡単な工程により且つ確実に形成することが可能になる。

また、凹部構造層６及び吸引孔層４は、小径細胞体８の顕微鏡観察が可能な程度に光学的に透明であることが望ましく、それによって、小径細胞体８への薬液やウイルスの注入を顕微鏡観察しながら行うことが可能になる。

また、小径細胞体捕捉チップを製造する場合には、アルミニウム板を陽極酸化処理することによって、アルマイトポア膜を形成する工程、アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を開口部２を有する支持基板１に貼り合わせる工程、アルミニウム板を薄層化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層４を形成する工程、及び、吸引孔層４上に吸引孔層４に設けられたポアを複数個含むように凹部７を形成した凹部構造層６を設ける工程とを有するように構成すれば良く、吸引孔５は吸引孔層４の一面に配置されているため、凹部構造層６とのアライメント精度が必要ではなく、歩留まりの低下を防ぐことが可能となる。

この場合、凹部構造層６を設ける工程の前に、アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を開口部２を有する支持基板１に貼り合わせる工程に用いた接着層の露出部を除去する工程を有することが必要になる。

或いは、支持基板１上にアルミニウム層を形成する工程、アルミニウム層を陽極酸化してアルマイトポア膜を形成して吸引孔層４とする工程、支持基板１に開口部２を形成する工程、及び、吸引孔層４上に吸引孔層４に設けられたポアを複数個含むように凹部７を形成した凹部構造層６を設ける工程とを有するように構成しても良く、それによって、半導体プロセスを用いて小径細胞体捕捉チップを製造することが可能になり、小径細胞体捕捉チップの低コスト化が可能になる。

この場合、アルミニウム層を形成する工程において、アルミニウム層を支持基板１に形成した介在層３を介して支持基板１上にアルミニウム層を成膜することが望ましく、それによって、ポアを貫通させる際に支持基板１がダメージを受けることがなく、また、支持基板１に開口部２を形成する際に、アルマイトポア膜がダメージを受けることがない。

この場合の介在層３は、支持基板１を熱酸化することによって形成することが望ましく、介在層３の形成工程が簡素化される。

また、アルマイトポア膜を形成する工程において、パターンドメディアの製造分野において確立しているナノインプリント法を用いても良く、それによって、ポアを任意のピッチで且つ５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲において任意の径に形成することができる。

本発明によれば、従来の構造では不可能とされていた幹細胞のような細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体への大量かつ高速なインジェクションが可能になるともに、細胞変形によるダメージストレスが軽減されることで、細胞反応の正確な評価観察が可能になる。

また、製造プロセスにおいても陽極酸化により形成したアルマイトポア膜を吸引孔層としているので、高価なプロセス装置を使わないだけではなく、チップ歩留まりの向上が見込まれ、幹細胞等の小径細胞に好適な小径細胞体捕捉チップを容易に提供することが可能となる。

本発明は、幹細胞やマイクロカプセル等の直径が１０μｍ以下の小径細胞体を捕捉固定するために、一方向に貫通した吸引孔を有する吸引孔層、特に、陽極酸化により小径細胞体の平均直径の１／１００〜１／１０のサイズの吸引孔を有するアルマイトポア膜と、凹部構造内に吸引孔が少なくとも二つ以上配置されるように形成した凹部構造層とを積層して、支持基板上に支持したものである。

このような小径細胞体捕捉チップを製造する場合には、アルミニウム板を陽極酸化処理することによって、アルマイトポア膜を形成し、アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を負圧吸引口となる開口部を有するシリコン基板等の支持基板に接着剤やＳｉＯ_２膜を用いた基板貼り合わせ技術によって貼り合わせ、アルミニウム板を薄層化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層を形成したのち、吸引孔層上に吸引孔層に設けられたポアを複数個含むように凹部を形成した凹部構造層を設ければ良い。

或いは、シリコン基板等の支持基板上に熱酸化で形成したＳｉＯ₂膜等のバリア膜を介してアルミニウム層を形成したのち、このアルミニウム層を陽極酸化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層を形成し、次いで、支持基板に開口部を形成したのち、バリア層の露出部除去し、次いで、吸引孔層上に吸引孔層に設けられたポアを複数個含むように凹部を形成した凹部構造層を設ければ良い。

また、アルマイトポア膜を形成する工程においては、陽極酸化に伴う通常の自己組織化によってポアを規則正しく形成しても良いし、或いは、ナノインプリント法を用いてポアを任意のピッチで且つ５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲において任意の径に形成するようにしても良い。

ここで、図２乃至図４を参照して、本発明の実施例１の細胞捕捉チップの製造工程を説明する。
図２参照
まず、純度が９９．９９％以上で、鏡面処理を施した厚さが、例えば、１００μｍのＡｌ板１１を用意し、例えば、０．３Ｍ／リットルの希硫酸浴からなる陽極酸化液を用いて陽極酸化処理を行うことによって多孔質アルミナ膜、即ち、アルマイトポア膜１２を形成する。

なお、ここでは図示を省略しているが、Ａｌ板１１の一方の面に保護膜を設けているので、陽極酸化は他方の面から進行して、保護膜側には未酸化のＡｌ層１３が残存する。
この時、アルマイトポア膜１２にはポア１４は自己組織化により六方最密構造状に規則正しく配列して形成されるが、そのピッチは、
ポアピッチ〔ｎｍ〕＝陽極酸化時の直流電圧〔Ｖ〕×２．５
で規定されるので、直流電圧によってポアピッチ、したがって、ポア密度を制御することができる。

この場合、細胞径が大きい場合は陽極酸化のみでは所望の径を実現できないため、必要に応じて４％のリン酸を用いたポアワイドニングを施すことによって、径を拡大することも可能である。

一方、支持基板となるシリコン基板２１の表面に熱酸化によりＳｉＯ₂膜２２，２３を形成したのち、フッ酸を用いて一方のＳｉＯ₂膜２３に一辺が例えば、１．７ｍｍの開口部２４を形成する。

次いで、例えば、ＫＯＨ等のエッチング液を用いてシリコン基板２１の露出部をエッチングすることによって負圧吸引用の開口部２５を形成し、次いで、フッ酸を用いてＳｉＯ₂膜２２，２３をエッチング除去する。

図３参照
次いで、接着剤（図示は省略）を用いてアルマイトポア膜１２を形成したＡｌ板１１をアルマイトポア膜１２とシリコン基板２１とが対向するようにシリコン基板２１に貼り合わせる。

次いで、Ａｌ層１３側から研磨してＡｌ層１３を完全に除去するとともに、アルマイトポア膜１２の厚さが例えば５μｍ（或いは１０μｍ）になるまで研磨してポア１４を貫通させることによって吸引孔１６を備えた吸引孔層１５としたのち、開口部２５に露出する接着剤（図示は省略）を除去する。

次いで、凹部層１７となるレジストを塗布したのち、露光・現像することによって直径が５μｍ〜２０μｍの細胞捕捉部１８となる凹部を形成し、レジストをそのまま残存させることによって、厚さが、例えば、５μｍの凹部層１７とすることによって、本発明の実施例１の細胞捕捉チップの基本構造が完成する。

図４参照
図４は、本発明の実施例１の細胞捕捉チップの構成説明図であり、図においては細胞２０を捕捉するための細胞捕捉部１８は４×４の１６個であるが、実際には、チップサイズが３．５ｍｍ□である場合、例えば、約１０００個程度形成する。

また、図４の下図に示すように、細胞捕捉部１８には複数の吸引孔１６が露出しており、陽極酸化における直流電圧によって規定されるポアピッチによるが、例えば、８０個程度露出することになり、この吸引孔１６から開口部２５を介して負圧吸引することによって、流れてくる細胞２０を細胞捕捉部１８に吸引捕捉する。

このように、本発明においては、細胞捕捉構造部を細胞捕捉部１８を設けた凹部層１７と吸引孔１６を設けた吸引孔層１５とに分割しているので、それぞれの特性に応じたサイズの開口部を形成することができる。

また、吸引孔１６を備えた吸引孔層１５は、パターンドメディア分野において確立している陽極酸化による自己組織化を利用して形成しているので、高度なエッチング技術を要することなく微細な吸引孔１６を任意のピッチで形成することができ、また、それによって、吸引孔１６が吸引孔層１５の表面に均一に露出しているので、細胞捕捉部１８を設けた凹部層１７を形成する際にアライメントが不要になる。

また、この場合の吸引孔１６のサイズは、捕捉対象となる細胞２０のサイズに応じて適宜決定するものであり、細胞２０の平均直径の１／１００〜１／１０とすることができるので、細胞２０を吸引捕捉する際に、細胞２０が吸引孔１７内に引き込まれることがなく、細胞２０にダメージを与えることなく安定した捕捉が可能になる。

また、アルミナは可視光に対して透明であるので、微細な吸引孔によって乱反射が生じても、捕捉した細胞に薬液をインジェクションする際に、光学顕微鏡を用いて観察しながら薬液をインジェクションできる程度に透明である。

次に、図５及び図６を参照して、本発明の実施例２の細胞捕捉チップの製造工程を説明する。
図５参照
まず、支持基板となる厚さが、例えば、５２５μｍのシリコン基板３１の表面に熱酸化によりＳｉＯ₂膜３２，３３形成したのち、例えば、スパッタリング法を用いて厚さが、例えば、５μｍのＡｌ膜３４を形成する。

次いで、例えば、０．３Ｍ／リットルの希硫酸浴からなる陽極酸化液を用いて陽極酸化処理を行うことによってＡｌ層３４をアルマイトポア膜３５に変換する。
なお、陽極酸化後にはＳｉＯ₂膜３２側にアルミナバリア膜３７が形成される。

次いで、シリコン基板３１の裏面に形成したＳｉＯ₂膜３３にフッ酸を用いて一辺が例えば、１．７ｍｍの開口部３８を形成したのち、例えば、ＫＯＨ等のエッチング液を用いてシリコン基板３１の露出部をエッチングすることによって負圧吸引用の開口部３９を形成する。

図６参照
次いで、ＢＨＦ溶液によりＳｉＯ₂膜３３と開口部３９に露出するＳｉＯ₂膜３２をエッチング除去したのち、イオンミリング法等を用いてアルミナバリア膜３７を除去してポア３６を貫通させることによって吸引孔４１を備えた吸引孔層４０とする。

次いで、凹部層４２となるレジストを塗布したのち、露光・現像することによって直径が５μｍ〜２０μｍの細胞捕捉部４３となる凹部を形成し、レジストをそのまま残存させることによって、厚さが、例えば、５μｍの凹部層４２とすることによって、本発明の実施例２の細胞捕捉チップの基本構造が完成する。

なお、この実施例２においても、チップサイズが３．５ｍｍ□である場合、例えば、約１０００個程度の細胞捕捉部４３を形成するものであり、また、細胞捕捉部４３には８０個程度の吸引孔４１が含まれることになる。

このように、本発明においては、半導体テクノロジーと陽極酸化を組み合わせて細胞捕捉構造部を形成しているので、高度のエッチング技術を要することなく微細な吸引孔４１を任意のピッチで形成することができ、また、それによって、吸引孔４１が吸引孔層４０の表面に均一に露出しているので、細胞捕捉部４３を設けた凹部層４２を形成する際にアライメントが不要になる。

次に、図７を参照して、本発明の実施例３の細胞捕捉チップの製造工程を説明するが、基本的な工程は上記の実施例２と同様であるので、陽極酸化工程のみを図示する。
図７参照
まず、上記の実施例２と同様に、支持基板となる厚さが、例えば、５２５μｍのシリコン基板３１の表面に熱酸化によりＳｉＯ₂膜３２，３３形成したのち、例えば、スパッタ法を用いて厚さが、例えば、５μｍのＡｌ膜３４を形成する。

次いで、規則正しく配列した突起部５１を有するＳｉＣスタンパー５０をＡｌ膜３４に押しつけて窪み４４を形成したのち、例えばシュウ酸浴からなる陽極酸化液を用いて陽極酸化処理を行うことによってＡｌ層３４をアルマイトポア膜３５に変換する。
この時、窪み４４が深くエッチングされてポア３６が形成される。

この場合も、細胞径が大きい場合は陽極酸化のみでは所望の径を実現できないため、必要に応じて４％のリン酸を用いたポアワイドニングを施すことによって、径を拡大することも可能である。

次いで、シリコン基板３１に負圧吸引用の開口部３９を形成したのち、ＳｉＯ₂膜３３と開口部３９に露出するＳｉＯ₂膜３２をエッチング除去し、次いで、イオンミリング法等を用いてアルミナバリア膜３７を除去してポア３６を貫通させることによって吸引孔４１を備えた吸引孔層４０とする。

次いで、凹部層４２となるレジストを塗布したのち、露光・現像することによって直径が５μｍ〜２０μｍの細胞捕捉部４３となる凹部を形成し、レジストをそのまま残存させることによって、厚さが、例えば、５μｍの凹部層４２とすることによって、本発明の実施例３の細胞捕捉チップの基本構造が完成する。

この実施例３においては、ポア３６を形成する際に、ナノインプリント法を用いているので、ポアのピッチを印加電圧とは無関係に任意に且つより規則正しく配列させることができる。

次に、図８を参照して、本発明の実施例４の細胞捕捉チップの製造工程を説明するが、基本的工程は上記の実施例１と同様であるので、貼り合わせ工程のみ図示する。
図８参照
上記の実施例１と同様に、まず、純度が９９．９９％以上で、鏡面処理を施した厚さが、例えば、１００μｍのＡｌ板１１を用意し、例えば、０．３Ｍ／リットルの希硫酸浴からなる陽極酸化液を用いて陽極酸化処理を行うことによって多孔質アルミナ膜、即ち、アルマイトポア膜１２を形成する。

一方、支持基板となるシリコン基板２１の表面に熱酸化によりＳｉＯ₂膜２２，２３を形成したのち、フッ酸を用いて一方のＳｉＯ₂膜２３に一辺が例えば、１．７ｍｍの開口部２４を形成し、次いで、例えば、ＫＯＨ等のエッチング液を用いてシリコン基板２１の露出部をエッチングすることによって負圧吸引用の開口部２５を形成する。

次いで、アルマイトポア膜１２の表面にＣＶＤ法を用いてＳｉＯ₂膜１９を形成したのち、シリコン基板の基板貼り合わせ技術と同様に、ＳｉＯ₂膜２２とＳｉＯ₂膜１９とを対向させ、加圧した状態で加熱することによって、Ａｌ板１１とシリコン基板２１に貼り合わせる。

次いで、Ａｌ層１３側から研磨してＡｌ層１３を完全に除去するとともに、アルマイトポア膜１２の厚さが例えば５μｍになるまで研磨してポア１４を貫通させることによって吸引孔１６を備えた吸引孔層１５とする。

次いで、ドライ・エッチングによって、ＳｉＯ₂膜２３と開口部２４に露出するＳｉＯ₂膜２２及びＳｉＯ₂膜１９を除去したのち、凹部層１７となるレジストを塗布し、露光・現像することによって直径が５μｍ〜２０μｍの細胞捕捉部１８となる凹部を形成し、レジストをそのまま残存させることによって、厚さが、例えば、５μｍの凹部層１７とすることによって、本発明の実施例４の細胞捕捉チップの基本構造が完成する。

このように、本発明の実施例４においては、基板貼り合わせ技術を用いて化学反応性の低いＳｉＯ₂により細胞捕捉構造部を支持基板に貼り合わせているので、接着剤を用いた場合に比べて、インジェクション工程に用いる薬液や培養液等の接着剤に与える影響や、逆に、接着剤の成分が細胞や薬液に与える影響を配慮する必要がなくなる。

以上、本発明の各実施例を説明したが、本発明は各実施例に示した構成、条件、数値に限られるものではなく、各種の変更が可能であり、例えば、上記の各実施例において示した、チップサイズ、細胞捕捉部の数等は全く任意であり、必要に応じて適宜変更されるものである。

また、上記の各実施例においては、凹部層をレジストによって形成しているが、レジストの成分が細胞や薬液等に与える虞がある場合や、表面の親水性や疏水性が問題になる場合には、ＳｉＯ₂やＳｉＮ等の化学反応性の低い他の無機物に置き換えても良いものである。

また、上記の各実施例においては、支持基板を微細加工技術が確率されたシリコン基板により形成しているが、シリコン基板に限られるものではなく、ガラス基板やサファイア基板等の他の基板を用いても良いものである。

また、上記の実施例３においては、ＳｉＣマスター基板を用いたナノインプリント技術でポアの位置を制御しているが、電子線描画法或いはＸ線リソグラフィー法による開口レジスト部のエッチング技術によりアルミニウム表面に窪みを形成し、その後、酸性電解液、例えばシュウ酸等の溶液中で電圧印加をする陽極酸化ことにより、窪みに対応したポアを有するアルマイトポア膜を形成しても良いものである。

ここで、再び図１を参照して、改めて、本発明の詳細な特徴を説明する。
再び、図１参照
（付記１）細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体８を捕捉固定するための凹部構造層６と、一方向に貫通した吸引孔５を有する吸引孔層４と、前記凹部構造層６と吸引孔層４を支持する支持基板１を有するとともに、前記凹部構造層６内に吸引孔５が少なくとも二つ以上配置され、且つ、前記吸引孔５の径が前記小径細胞体８の平均直径の１／１００〜１／１０である小径細胞体捕捉チップであって、前記吸引孔層４がアルマイトポア膜からなり、前記吸引孔５が陽極酸化により自己組織化されたポアからなることを特徴とする小径細胞体捕捉チップ。
（付記２）前記凹部構造層６及び吸引孔層４が、前記小径細胞体８の顕微鏡観察が可能な程度に光学的に透明であることを特徴とする付記１に記載の小胞体捕捉チップ。
（付記３）アルミニウム板を陽極酸化処理することによって、アルマイトポア膜を形成する工程、前記アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を開口部２を有する支持基板１に貼り合わせる工程、前記アルミニウム板を薄層化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層４を形成する工程、及び、前記吸引孔層４上に前記吸引孔層４に設けられたポアを複数個含むように凹部７を形成した細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体を捕捉固定するための凹部構造層６を設ける工程とを有することを特徴とする小径細胞体捕捉チップの製造方法。
（付記４）前記凹部構造層６を設ける工程の前に、前記アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を開口部２を有する支持基板１に貼り合わせる工程に用いた接着層の露出部を除去する工程を有することを特徴とする付記３に記載の小径細胞体捕捉チップの製造方法。
（付記５）支持基板１上にアルミニウム層を形成する工程、前記アルミニウム層を陽極酸化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層４を形成する工程、前記支持基板１に開口部２を形成する工程、及び、前記吸引孔層４上に前記吸引孔層４に設けられたポアを複数個含むように凹部７を形成した細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体を捕捉固定するための凹部構造層６を設ける工程とを有することを特徴とする小径細胞体捕捉チップの製造方法。
（付記６）支持基板１上にアルミニウム層を形成する工程において、前記アルミニウム層を前記支持基板１に形成した介在層３を介して支持基板１上にアルミニウム層を成膜するとともに、前記凹部構造層６を設ける工程の前に前記介在層３の露出部を除去することを特徴とする付記５に記載の小径細胞体捕捉チップの製造方法。
（付記７）前記介在層３を、前記支持基板１を熱酸化することによって形成することを特徴とする付記６に記載の小径細胞体捕捉チップの製造方法。
（付記８）前記アルマイトポア膜を形成する工程において、前記アルミニウム層の表面にレジスト膜を形成し、前記レジスト膜にナノインプリント法によって規則正しく配置された直径が５０ｎｍ〜１０００ｎｍの開口部２を形成し、前記開口部２に露出したアルミニウム層を陽極酸化する工程を有することを特徴とする付記３乃至付記７のいずれか１に記載の小径細胞体捕捉チップの製造方法。

本発明の活用例としては、幹細胞にインジェクションを行う場合の細胞捕捉チップが典型的なものであるが、捕捉対象は幹細胞に限られるものではなく、幹細胞より大きな他の細胞でも良いものであり、さらには、捕捉対象は生体の細胞に限られるものではなく、各種の医薬反応や化学反応を実験するためのマイクロカプセルの捕捉にも適用されるものである。

本発明の原理的構成の説明図である。本発明の実施例１の細胞捕捉チップの途中までの製造工程の説明図である。本発明の実施例１の細胞捕捉チップの図２以降の製造工程の説明図である。本発明の実施例１の細胞捕捉チップの構成説明図である。本発明の実施例２の細胞捕捉チップの途中までの製造工程の説明図である。本発明の実施例２の細胞捕捉チップの図５以降の製造工程の説明図である。本発明の実施例３の細胞捕捉チップの製造工程の説明図である。本発明の実施例４の細胞捕捉チップの製造工程の説明図である。

符号の説明

１支持基板
２開口部
３介在層
４吸引孔層
５吸引孔
６凹部構造層
７凹部
８小径細胞体
１１Ａｌ板
１２アルマイトポア膜
１３Ａｌ層
１４ポア
１５吸引孔層
１６吸引孔
１７凹部層
１８細胞捕捉部
１９ＳｉＯ_２膜
２０細胞
２１シリコン基板
２２，２３ＳｉＯ_２膜
２４開口部
２５開口部
３１シリコン基板
３２，３３ＳｉＯ_２膜
３４Ａｌ膜
３５アルマイトポア膜
３６ポア
３７アルミナバリア膜
３８開口部
３９開口部
４０吸引孔層
４１吸引孔
４２凹部層
４３細胞捕捉部
４４窪み
５０ＳｉＣスタンパー
５１突起部

Claims

細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体を捕捉固定するための凹部構造層と、一方向に貫通した吸引孔を有する吸引孔層と、前記凹部構造層と吸引孔層を支持する支持基板を有するとともに、前記凹部構造層内に吸引孔が少なくとも二つ以上配置され、且つ、前記吸引孔の径が前記小径細胞体の平均直径の１／１００〜１／１０である小径細胞体捕捉チップであって、前記吸引孔層がアルマイトポア膜からなり、前記吸引孔が陽極酸化により自己組織化されたポアからなることを特徴とする小径細胞体捕捉チップ。
前記凹部構造層及び吸引孔層が、前記小径細胞体の顕微鏡観察が可能な程度に光学的に透明であることを特徴とする請求項１に記載の小径細胞体捕捉チップ。
アルミニウム板を陽極酸化処理することによって、アルマイトポア膜を形成する工程、前記アルミニウム板のアルマイトポア膜を形成した面を開口部を有する支持基板に貼り合わせる工程、前記アルミニウム板を薄層化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層を形成する工程、及び、前記吸引孔層上に細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体を捕捉固定するための凹部構造層を設ける工程とを有することを特徴とする小径細胞体捕捉チップの製造方法。
支持基板上にアルミニウム層を形成する工程、前記アルミニウム層を陽極酸化してアルマイトポア膜からなる吸引孔層を形成する工程、前記支持基板に開口部を形成する工程、及び、前記吸引孔層上に細胞またはマイクロカプセルのいずれかからなる小径細胞体を捕捉固定するための凹部構造層を設ける工程とを有することを特徴とする小径細胞体捕捉チップの製造方法。