JPH10165166A - 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法 - Google Patents
細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法Info
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- JPH10165166A JPH10165166A JP34672896A JP34672896A JPH10165166A JP H10165166 A JPH10165166 A JP H10165166A JP 34672896 A JP34672896 A JP 34672896A JP 34672896 A JP34672896 A JP 34672896A JP H10165166 A JPH10165166 A JP H10165166A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞固定用プレ−トの所定位置に複数の細胞
を安定した状態で固定すること。 【解決手段】 微細孔２１を有する多孔質プレ−ト２０
の表面側に、受精卵１１の下部側と適合する形状の凹部
３を複数形成し、当該プレ−ト２０の表面の凹部３以外
の領域に非透液性膜３１を形成する。このような細胞固
定用プレ−ト２の表面側に卵浮遊液を供給し、裏面側か
ら所定の圧力で吸引すると、非透液性膜３１が形成され
た領域では卵浮遊液の液体成分が弾かれて、当該液体成
分が凹部３に流れ込むような液流が発生する。受精卵１
１はこの液流により凹部３に引き込まれ、凹部３の内面
全面に吸引されて、安定した状態で固定される。
を安定した状態で固定すること。 【解決手段】 微細孔２１を有する多孔質プレ−ト２０
の表面側に、受精卵１１の下部側と適合する形状の凹部
３を複数形成し、当該プレ−ト２０の表面の凹部３以外
の領域に非透液性膜３１を形成する。このような細胞固
定用プレ−ト２の表面側に卵浮遊液を供給し、裏面側か
ら所定の圧力で吸引すると、非透液性膜３１が形成され
た領域では卵浮遊液の液体成分が弾かれて、当該液体成
分が凹部３に流れ込むような液流が発生する。受精卵１
１はこの液流により凹部３に引き込まれ、凹部３の内面
全面に吸引されて、安定した状態で固定される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えばマイクロイ
ンジェクション等に用いられる細胞固定用プレ−ト及び
この細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法に関する。
ンジェクション等に用いられる細胞固定用プレ−ト及び
この細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】マイクロインジェクション法では特定の
細胞に物質を注入することができ、受精卵への遺伝子の
注入もこの方法により行われている。従来この方法によ
り例えばミニブタ等の受精卵へ遺伝子を注入する場合
は、受精卵は直径が１５０μｍ程度と極めて小さいた
め、例えば図１０に示すように、作業者が双眼顕微鏡に
より受精卵１１を観察しながら、平坦な非透液性のプレ
−ト上で受精卵１１の卵核１２の一部をマイクロピペッ
ト１３の先端で吸引固定した状態で、マイクロ針１４を
受精卵１１に刺入し、遺伝子を注入することにより行わ
れている。
細胞に物質を注入することができ、受精卵への遺伝子の
注入もこの方法により行われている。従来この方法によ
り例えばミニブタ等の受精卵へ遺伝子を注入する場合
は、受精卵は直径が１５０μｍ程度と極めて小さいた
め、例えば図１０に示すように、作業者が双眼顕微鏡に
より受精卵１１を観察しながら、平坦な非透液性のプレ
−ト上で受精卵１１の卵核１２の一部をマイクロピペッ
ト１３の先端で吸引固定した状態で、マイクロ針１４を
受精卵１１に刺入し、遺伝子を注入することにより行わ
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら上述の方
法では、受精卵１１はその一部がマイクロピペット１２
により吸引固定されているだけなので、固定されている
といっても不安定な状態である。従ってこの状態でマイ
クロ針１４を刺入しようとすると、刺入時に卵核が変形
してしまい、刺入操作が困難になってしまったり、刺入
の際に受精卵１１に損傷を与えてしまう場合がある。ま
た双眼顕微鏡では平面しかみえないため、受精卵１１に
マイクロ針１４を刺入したと思っても、実際は受精卵１
１と離れたところにマイクロ針１４が位置し、受精卵１
１へ遺伝子が注入されないという場合もある。
法では、受精卵１１はその一部がマイクロピペット１２
により吸引固定されているだけなので、固定されている
といっても不安定な状態である。従ってこの状態でマイ
クロ針１４を刺入しようとすると、刺入時に卵核が変形
してしまい、刺入操作が困難になってしまったり、刺入
の際に受精卵１１に損傷を与えてしまう場合がある。ま
た双眼顕微鏡では平面しかみえないため、受精卵１１に
マイクロ針１４を刺入したと思っても、実際は受精卵１
１と離れたところにマイクロ針１４が位置し、受精卵１
１へ遺伝子が注入されないという場合もある。
【０００４】従ってこの方法による受精卵への遺伝子の
注入作業は、作業者の熟練と経験が必要とされ、一般的
に作業効率が悪い。また作業者は双眼顕微鏡を用いて操
作を行うので、両目を拘束されて疲労が大きくなり、作
業者の負担が大きいという問題もある。
注入作業は、作業者の熟練と経験が必要とされ、一般的
に作業効率が悪い。また作業者は双眼顕微鏡を用いて操
作を行うので、両目を拘束されて疲労が大きくなり、作
業者の負担が大きいという問題もある。
【０００５】本発明はこのような事情の下になされたも
のであり、その目的は複数の細胞を細胞固定用プレ−ト
の所定位置に固定することができる細胞固定用プレ−ト
及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法を提供する
ことにあり、また他の目的は複数の細胞を細胞固定用プ
レ−トへの所定位置に安定した状態で固定することがで
きる細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細
胞の固定方法を提供することにある。
のであり、その目的は複数の細胞を細胞固定用プレ−ト
の所定位置に固定することができる細胞固定用プレ−ト
及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法を提供する
ことにあり、また他の目的は複数の細胞を細胞固定用プ
レ−トへの所定位置に安定した状態で固定することがで
きる細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細
胞の固定方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】このため本発明の細胞固
定用プレ−トは、例えばマイクロポ−ラスガラスよりな
る透液性材料により構成されたプレ−トの一面側に細胞
を収納する複数の凹部を形成したことを特徴とする。こ
こで凹部は細胞の一部分が嵌合する形状に形成されてい
ることが好ましく、前記プレ−トの一面側の凹部以外の
領域には非透液性膜を形成することが好ましい。
定用プレ−トは、例えばマイクロポ−ラスガラスよりな
る透液性材料により構成されたプレ−トの一面側に細胞
を収納する複数の凹部を形成したことを特徴とする。こ
こで凹部は細胞の一部分が嵌合する形状に形成されてい
ることが好ましく、前記プレ−トの一面側の凹部以外の
領域には非透液性膜を形成することが好ましい。
【０００７】また本発明の細胞固定用プレ−トへの細胞
の固定方法は、透液性材料により構成されたプレ−トの
一面側に細胞を収納する複数の凹部が形成された細胞固
定用プレ−トを収納室内に収納し、一面側に細胞を含む
液を供給し、他面側から吸引することにより、前記凹部
に細胞を固定する方法において、前記収納室内の圧力を
検出し、この検出値に基づいて前記凹部に細胞が固定さ
れたか否かを判断することを特徴とする。
の固定方法は、透液性材料により構成されたプレ−トの
一面側に細胞を収納する複数の凹部が形成された細胞固
定用プレ−トを収納室内に収納し、一面側に細胞を含む
液を供給し、他面側から吸引することにより、前記凹部
に細胞を固定する方法において、前記収納室内の圧力を
検出し、この検出値に基づいて前記凹部に細胞が固定さ
れたか否かを判断することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明は、透液性材料例えば微細
孔を有する多孔質材料により構成されたプレ−トの裏面
側から吸引すると、当該プレ−トの表面側に供給された
液体が、多孔質プレ−トの微細孔を介して裏面側に向け
て透過していくことに着目してなされたものであり、例
えばマイクロインジェクションに用いられる細胞固定用
プレ−ト及びこの細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方
法として好適な例を示すものである。
孔を有する多孔質材料により構成されたプレ−トの裏面
側から吸引すると、当該プレ−トの表面側に供給された
液体が、多孔質プレ−トの微細孔を介して裏面側に向け
て透過していくことに着目してなされたものであり、例
えばマイクロインジェクションに用いられる細胞固定用
プレ−ト及びこの細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方
法として好適な例を示すものである。
【０００９】先ず本発明の細胞固定用プレ−トの実施の
形態の一例について説明する。図１（ａ）は細胞固定用
プレ−ト２の平面図、図１（ｂ）はそのＡ−Ａ位置にお
ける断面図であり、図２は要部の拡大断面図である。図
１中２０は、直径８ｍｍ、厚さ０．７７ｍｍの円板状に
形成された、例えば透液性材料例えば多孔質ガラスによ
りなる多孔質プレ−トである。ここで透液性材料とは、
表面側に供給された液体が裏面側に向けて透過していく
性質を有する材料をいい、裏面側から吸引したときに表
面側に供給された液体が裏面側に向けて透過していく材
料も含むものとする。
形態の一例について説明する。図１（ａ）は細胞固定用
プレ−ト２の平面図、図１（ｂ）はそのＡ−Ａ位置にお
ける断面図であり、図２は要部の拡大断面図である。図
１中２０は、直径８ｍｍ、厚さ０．７７ｍｍの円板状に
形成された、例えば透液性材料例えば多孔質ガラスによ
りなる多孔質プレ−トである。ここで透液性材料とは、
表面側に供給された液体が裏面側に向けて透過していく
性質を有する材料をいい、裏面側から吸引したときに表
面側に供給された液体が裏面側に向けて透過していく材
料も含むものとする。
【００１０】前記多孔質プレ−トは例えば直径２μｍ程
度の多数の微細孔２１を有し、微細孔２１の容積が０．
２５ｃｃ／ｇ程度の多孔構造体であり、例えばマイクロ
ポ−ラスガラスにより構成されている。このような多孔
質プレ−ト２０では裏面側から吸引すると、表面側に供
給された液体が裏面側に向けて透過していく。
度の多数の微細孔２１を有し、微細孔２１の容積が０．
２５ｃｃ／ｇ程度の多孔構造体であり、例えばマイクロ
ポ−ラスガラスにより構成されている。このような多孔
質プレ−ト２０では裏面側から吸引すると、表面側に供
給された液体が裏面側に向けて透過していく。
【００１１】ここで前記マイクロポ−ラスガラスとは、
ガラスの分相現象を利用した多孔質ガラスであり、例え
ば高ケイ酸ガラスを製造する過程で製造される。熱処理
によって発生する分相により超微細孔径の大きさが決定
されるので、熱処理温度、熱処理時間を変化させること
によって所望の大きさの微細孔を有するマイクロポ−ラ
スガラスを製造することができる。
ガラスの分相現象を利用した多孔質ガラスであり、例え
ば高ケイ酸ガラスを製造する過程で製造される。熱処理
によって発生する分相により超微細孔径の大きさが決定
されるので、熱処理温度、熱処理時間を変化させること
によって所望の大きさの微細孔を有するマイクロポ−ラ
スガラスを製造することができる。
【００１２】このような多孔質プレ−ト２０の表面には
例えば２５個の凹部３が形成されている。この凹部３は
例えば図２に示すように、例えば固定しようとする細胞
例えばミニブタの受精卵１１の一部と適合するように形
成され、この例では例えば直径が１５０〜１８０μｍ程
度の球状の受精卵１１の下部側が嵌まり込むように、開
口直径が１４０μｍ程度であって深さが７０μｍ程度の
ほぼ半球状に形成されている。このような凹部３に受精
卵１１は下部側の全面が凹部３の内面に嵌合し、多孔質
プレ−ト２０の上面から受精卵１１の上部側が突出する
ように固定される。
例えば２５個の凹部３が形成されている。この凹部３は
例えば図２に示すように、例えば固定しようとする細胞
例えばミニブタの受精卵１１の一部と適合するように形
成され、この例では例えば直径が１５０〜１８０μｍ程
度の球状の受精卵１１の下部側が嵌まり込むように、開
口直径が１４０μｍ程度であって深さが７０μｍ程度の
ほぼ半球状に形成されている。このような凹部３に受精
卵１１は下部側の全面が凹部３の内面に嵌合し、多孔質
プレ−ト２０の上面から受精卵１１の上部側が突出する
ように固定される。
【００１３】前記凹部３は多孔質プレ−ト２０のほぼ中
央に例えば５列×５列に配列されており、上下方向及び
左右方向に隣接する凹部３との間隔は共に、２５０μｍ
程度に設定されている。前記多孔質プレ−ト２０の表面
の凹部３以外の領域には、例えばガラス等の非透液性材
料よりなる非透液性膜３１が形成されている。この非透
液性膜３１は例えば卵浮遊液の液体成分の透過を妨げる
ものであり、この非透液性膜３１が形成されている領域
では、多孔質プレ−ト２０内への液体の浸透が抑えられ
る。
央に例えば５列×５列に配列されており、上下方向及び
左右方向に隣接する凹部３との間隔は共に、２５０μｍ
程度に設定されている。前記多孔質プレ−ト２０の表面
の凹部３以外の領域には、例えばガラス等の非透液性材
料よりなる非透液性膜３１が形成されている。この非透
液性膜３１は例えば卵浮遊液の液体成分の透過を妨げる
ものであり、この非透液性膜３１が形成されている領域
では、多孔質プレ−ト２０内への液体の浸透が抑えられ
る。
【００１４】このような細胞固定用プレ−ト２は、例え
ば所望の大きさの微細孔２１を有する多孔質プレ−ト２
を製造した後、多孔質プレ−ト２０の表面全体に例えば
非透液性材料をコ−ティングすることにより非透液性膜
３１を形成し、次いで例えばサンドブラストにより凹部
３を形成することにより製造される。
ば所望の大きさの微細孔２１を有する多孔質プレ−ト２
を製造した後、多孔質プレ−ト２０の表面全体に例えば
非透液性材料をコ−ティングすることにより非透液性膜
３１を形成し、次いで例えばサンドブラストにより凹部
３を形成することにより製造される。
【００１５】続いて上述の細胞固定用プレ−ト２への細
胞の固定方法について説明する。先ずこの固定方法を実
施するための装置の一例について図３により説明する
と、図３中４は細胞固定用プレ−ト２を収納するための
収納室である。この収納室４は、有底筒状体４Ａとこの
有底筒状体４Ａの内面に適合する形状のロッド体４Ｂよ
りなり、有底筒状体４Ａにロッド体４Ｂを螺合すること
により構成されている。
胞の固定方法について説明する。先ずこの固定方法を実
施するための装置の一例について図３により説明する
と、図３中４は細胞固定用プレ−ト２を収納するための
収納室である。この収納室４は、有底筒状体４Ａとこの
有底筒状体４Ａの内面に適合する形状のロッド体４Ｂよ
りなり、有底筒状体４Ａにロッド体４Ｂを螺合すること
により構成されている。
【００１６】前記有底筒状体４Ａの底面とロッド体４Ｂ
の上面との間には、例えばシリコン製のリング体４１
ａ，４１ｂにより上下の周縁領域を挟まれた細胞固定用
プレ−ト２が設けられており、このようにして細胞固定
用プレ−ト２が収納室４内に収納されることになる。前
記リング体４１ａ，４１ｂは、例えば外径が８ｍｍ、幅
２ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの大きさに形成されており、細
胞固定用プレ−ト２の凹部３が形成されている領域より
も外側の周縁領域を覆うように設けられ、液体成分が細
胞固定用プレ−ト２の外周縁と収納室４内面との間から
漏れないようにシ−ルの作用をしている。そして収納室
４内の例えば細胞固定用プレ−ト２の直ぐ下方側には、
収納室４内の圧力を検出するための例えば水銀圧力計よ
りなる圧力検出手段４２が設けられている。
の上面との間には、例えばシリコン製のリング体４１
ａ，４１ｂにより上下の周縁領域を挟まれた細胞固定用
プレ−ト２が設けられており、このようにして細胞固定
用プレ−ト２が収納室４内に収納されることになる。前
記リング体４１ａ，４１ｂは、例えば外径が８ｍｍ、幅
２ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの大きさに形成されており、細
胞固定用プレ−ト２の凹部３が形成されている領域より
も外側の周縁領域を覆うように設けられ、液体成分が細
胞固定用プレ−ト２の外周縁と収納室４内面との間から
漏れないようにシ−ルの作用をしている。そして収納室
４内の例えば細胞固定用プレ−ト２の直ぐ下方側には、
収納室４内の圧力を検出するための例えば水銀圧力計よ
りなる圧力検出手段４２が設けられている。
【００１７】前記有底筒状体４Ａの内径ａは例えば９ｍ
ｍであり、この有底筒状体４Ａの上面のほぼ中央には、
細胞固定用プレ−ト２に卵浮遊液を供給するために例え
ば内径ｂが３ｍｍの卵浮遊液供給口４３が形成されてお
り、前記ロッド体４Ｂには、細胞固定用プレ−ト２の裏
面側を吸引するために例えば内径ｃが３ｍｍの吸引路４
４が形成されている。
ｍであり、この有底筒状体４Ａの上面のほぼ中央には、
細胞固定用プレ−ト２に卵浮遊液を供給するために例え
ば内径ｂが３ｍｍの卵浮遊液供給口４３が形成されてお
り、前記ロッド体４Ｂには、細胞固定用プレ−ト２の裏
面側を吸引するために例えば内径ｃが３ｍｍの吸引路４
４が形成されている。
【００１８】前記収納室４１の吸引路４４の下端側には
排気管５１を介して排気手段例えば真空ポンプ５が設け
られており、この真空ポンプ５の下流側には卵浮遊液貯
槽６１が設けられている。一方収納室４の上流側には卵
浮遊液供給槽６２が設けられていて、この槽内の卵浮遊
液が卵浮遊液供給管６３により、前記収納室４の供給口
４３を介して細胞固定用プレ−ト２の表面に供給される
ように構成されている。前記卵浮遊液貯槽６１と卵浮遊
液供給槽６２とは循環供給管６４により接続されてい
る。また図中Ｖ１，Ｖ２はバルブ、Ｐはポンプを夫々示
している。
排気管５１を介して排気手段例えば真空ポンプ５が設け
られており、この真空ポンプ５の下流側には卵浮遊液貯
槽６１が設けられている。一方収納室４の上流側には卵
浮遊液供給槽６２が設けられていて、この槽内の卵浮遊
液が卵浮遊液供給管６３により、前記収納室４の供給口
４３を介して細胞固定用プレ−ト２の表面に供給される
ように構成されている。前記卵浮遊液貯槽６１と卵浮遊
液供給槽６２とは循環供給管６４により接続されてい
る。また図中Ｖ１，Ｖ２はバルブ、Ｐはポンプを夫々示
している。
【００１９】そしてこのような装置において、細胞固定
用プレ−ト２に細胞例えば受精卵１１を固定するときに
は、先ず細胞固定用プレ−ト２を収納室４内に収納し、
真空ポンプ５により収納室４の吸引路４４を介して細胞
固定用プレ−ト２を裏面側から例えば７５０ｍｍＨｇの
引圧で吸引しながら、細胞固定用プレ−ト２の表面に卵
浮遊液供給槽６２から卵浮遊液を例えば０．１ｍｌ／ｈ
ｒの流量で供給する。この卵浮遊液は例えば培養液等か
らなる液体成分１０ミリリットル中に１０個程度の受精
卵１１を含むものである。
用プレ−ト２に細胞例えば受精卵１１を固定するときに
は、先ず細胞固定用プレ−ト２を収納室４内に収納し、
真空ポンプ５により収納室４の吸引路４４を介して細胞
固定用プレ−ト２を裏面側から例えば７５０ｍｍＨｇの
引圧で吸引しながら、細胞固定用プレ−ト２の表面に卵
浮遊液供給槽６２から卵浮遊液を例えば０．１ｍｌ／ｈ
ｒの流量で供給する。この卵浮遊液は例えば培養液等か
らなる液体成分１０ミリリットル中に１０個程度の受精
卵１１を含むものである。
【００２０】このようにすると細胞固定用プレ−ト２の
表面の卵浮遊液の液体成分は吸引路４４側へ流れて行こ
うとするが、リング体４１ａ，４１ｂによりプレ−ト２
の周縁領域への流れが妨げられるので、前記液体成分は
プレ−ト２の中央部分の微細孔２１を介して裏面側に透
過して行く。この際当該プレ−ト２の凹部３以外の領域
には非透液性膜３１が形成されているので、前記液体成
分は非透液性膜３１を透過できずにプレ−ト２の表面で
弾かれてしまう。従ってプレ−ト２の表面では凹部３に
のみ液体成分が流れ込んでいくので、このようにして液
流が発生する。そしてこの液流に乗って卵浮遊液に含ま
れる受精卵１１は凹部３に引き込まれる。
表面の卵浮遊液の液体成分は吸引路４４側へ流れて行こ
うとするが、リング体４１ａ，４１ｂによりプレ−ト２
の周縁領域への流れが妨げられるので、前記液体成分は
プレ−ト２の中央部分の微細孔２１を介して裏面側に透
過して行く。この際当該プレ−ト２の凹部３以外の領域
には非透液性膜３１が形成されているので、前記液体成
分は非透液性膜３１を透過できずにプレ−ト２の表面で
弾かれてしまう。従ってプレ−ト２の表面では凹部３に
のみ液体成分が流れ込んでいくので、このようにして液
流が発生する。そしてこの液流に乗って卵浮遊液に含ま
れる受精卵１１は凹部３に引き込まれる。
【００２１】凹部３に受精卵１１が引き込まれると、凹
部３は受精卵１１の下面側と適合するように形成されて
いるため、この凹部３の内面全面により受精卵１１が吸
引収納される。このようにして受精卵１１が収納された
凹部３が多くなってくると、凹部３の表面は受精卵１１
により塞がれ、凹部３以外の領域の表面は非透液性膜３
１により塞がれているので、通気領域が少なくなり、当
初は２０ｍｍＨｇ程度であった収納室４内の圧力が徐々
に低くなってくる。そして２５個の略全数に受精卵１１
が収納されると、収納室４内の圧力が例えば０〜５ｍｍ
Ｈｇ程度と急激に低くなる。
部３は受精卵１１の下面側と適合するように形成されて
いるため、この凹部３の内面全面により受精卵１１が吸
引収納される。このようにして受精卵１１が収納された
凹部３が多くなってくると、凹部３の表面は受精卵１１
により塞がれ、凹部３以外の領域の表面は非透液性膜３
１により塞がれているので、通気領域が少なくなり、当
初は２０ｍｍＨｇ程度であった収納室４内の圧力が徐々
に低くなってくる。そして２５個の略全数に受精卵１１
が収納されると、収納室４内の圧力が例えば０〜５ｍｍ
Ｈｇ程度と急激に低くなる。
【００２２】従ってこの圧変化により細胞固定用プレ−
ト２に形成された略全数の凹部３に受精卵１１が収納さ
れたことが検知できるので、この圧変化に基づいて真空
ポンプ５の引圧を例えば７４０ｍｍＨｇ程度として、収
納室４内の圧力を１０ｍｍＨｇ程度に維持し、この引圧
で受精卵１１を細胞固定用プレ−トに固定する。ここで
このように引圧を小さくするのは受精卵１１の変形を抑
えるためである。
ト２に形成された略全数の凹部３に受精卵１１が収納さ
れたことが検知できるので、この圧変化に基づいて真空
ポンプ５の引圧を例えば７４０ｍｍＨｇ程度として、収
納室４内の圧力を１０ｍｍＨｇ程度に維持し、この引圧
で受精卵１１を細胞固定用プレ−トに固定する。ここで
このように引圧を小さくするのは受精卵１１の変形を抑
えるためである。
【００２３】そしてこの状態で例えばマイクロインジェ
クション法により受精卵１１に遺伝子を注入する。一方
真空ポンプ５により吸引された卵浮遊液の液体成分は一
旦卵浮遊液貯槽５１に貯留され、循環供給管６４を介し
て卵浮遊液供給槽６２に循環供給される。
クション法により受精卵１１に遺伝子を注入する。一方
真空ポンプ５により吸引された卵浮遊液の液体成分は一
旦卵浮遊液貯槽５１に貯留され、循環供給管６４を介し
て卵浮遊液供給槽６２に循環供給される。
【００２４】ここで卵浮遊液の液体成分の細胞固定用プ
レ−ト２の透過速度は、後述の実験例により真空ポンプ
５の引圧に比例して大きくなるが、液体成分の透過速度
は例えば０．５〜５ｍｌ／ｈｒ程度が好ましく、このた
めには真空ポンプ５の引圧は例えば６５０〜７６０ｍｍ
Ｈｇであることが好ましい。また細胞固定用プレ−ト２
の微細孔２１の大きさは例えば２〜２０μｍ程度である
ことが好ましく、微細孔２１の容積は０．２５〜２．５
ｃｃ／ｇ程度であることが好ましく、プレ−ト２０の厚
さは０．５〜２ｍｍ程度であることが好ましい。
レ−ト２の透過速度は、後述の実験例により真空ポンプ
５の引圧に比例して大きくなるが、液体成分の透過速度
は例えば０．５〜５ｍｌ／ｈｒ程度が好ましく、このた
めには真空ポンプ５の引圧は例えば６５０〜７６０ｍｍ
Ｈｇであることが好ましい。また細胞固定用プレ−ト２
の微細孔２１の大きさは例えば２〜２０μｍ程度である
ことが好ましく、微細孔２１の容積は０．２５〜２．５
ｃｃ／ｇ程度であることが好ましく、プレ−ト２０の厚
さは０．５〜２ｍｍ程度であることが好ましい。
【００２５】このように細胞固定用プレ−ト２に上述の
方法により受精卵１１を固定すると、多数の受精卵１１
を細胞固定用プレ−ト２の所定位置に、変形を抑えなが
ら安定した状態で固定することができる。つまり凹部３
が受精卵１１の下部側と適合するように形成されている
と共に、多孔質プレ−ト２０の微細孔２１を介して卵浮
遊液の液体成分が吸引されるので、図４（ａ）に示すよ
うに、凹部３の内面の全面に吸引力が分散し、この内面
全面で受精卵１１を吸引することができる。このため吸
引の際に受精卵１１の一部に大きな吸引力が加わること
がないので変形が抑えられる。
方法により受精卵１１を固定すると、多数の受精卵１１
を細胞固定用プレ−ト２の所定位置に、変形を抑えなが
ら安定した状態で固定することができる。つまり凹部３
が受精卵１１の下部側と適合するように形成されている
と共に、多孔質プレ−ト２０の微細孔２１を介して卵浮
遊液の液体成分が吸引されるので、図４（ａ）に示すよ
うに、凹部３の内面の全面に吸引力が分散し、この内面
全面で受精卵１１を吸引することができる。このため吸
引の際に受精卵１１の一部に大きな吸引力が加わること
がないので変形が抑えられる。
【００２６】また受精卵１１の下部側の外面全体が凹部
３に吸引固定されるので、受精卵１１は凹部３に広い面
積で固定されることになり、これにより固定された受精
卵１１が安定する。従って例えば既に凹部３に固定され
ている受精卵１１に、卵浮遊液が流れてきて浮遊してい
る受精卵１１や液体成分が当該固定されている受精卵１
１に衝突しても、その衝撃力により凹部３から固定され
ている受精卵１１が凹部３から飛び出してしまうおそれ
はない。さらに細胞固定用プレ−トに別個に液体を通流
させるための吸引孔を形成する必要がないので、吸引孔
を形成する場合に比べて細胞固定用プレ−トの製造する
際の工程数が少なくなり、当該プレ−トの製造が容易に
なる。
３に吸引固定されるので、受精卵１１は凹部３に広い面
積で固定されることになり、これにより固定された受精
卵１１が安定する。従って例えば既に凹部３に固定され
ている受精卵１１に、卵浮遊液が流れてきて浮遊してい
る受精卵１１や液体成分が当該固定されている受精卵１
１に衝突しても、その衝撃力により凹部３から固定され
ている受精卵１１が凹部３から飛び出してしまうおそれ
はない。さらに細胞固定用プレ−トに別個に液体を通流
させるための吸引孔を形成する必要がないので、吸引孔
を形成する場合に比べて細胞固定用プレ−トの製造する
際の工程数が少なくなり、当該プレ−トの製造が容易に
なる。
【００２７】ここで例えば図４（ｂ）に示すようにプレ
−ト２２の一面側に凹部３２を形成し、この凹部３２の
底部に液体を通流させるための吸引孔３２ａを設けた細
胞固定用プレ−トに細胞を固定する場合を想定すると、
卵浮遊液は吸引孔３２ａを通じて吸引されるため、凹部
３２に受精卵１１が引き込まれると、受精卵１１の一部
に吸引力が集中することになり、この部分が吸引孔３２
ａに吸い込まれて受精卵１１が、図中２点鎖線で示すよ
うに変形されて損傷するおそれがあるし、吸引により固
定される面積が小さいので受精卵１１の安定性が悪くな
る。
−ト２２の一面側に凹部３２を形成し、この凹部３２の
底部に液体を通流させるための吸引孔３２ａを設けた細
胞固定用プレ−トに細胞を固定する場合を想定すると、
卵浮遊液は吸引孔３２ａを通じて吸引されるため、凹部
３２に受精卵１１が引き込まれると、受精卵１１の一部
に吸引力が集中することになり、この部分が吸引孔３２
ａに吸い込まれて受精卵１１が、図中２点鎖線で示すよ
うに変形されて損傷するおそれがあるし、吸引により固
定される面積が小さいので受精卵１１の安定性が悪くな
る。
【００２８】さらに上述の細胞の固定方法によれば、収
納室４の圧力を検出することによって全ての凹部３に受
精卵１１が固定されたか否かを判断することができるた
め、細胞の固定工程の終了時の判断を適確かつ容易に行
うことができ、作業効率を向上させることができる。
納室４の圧力を検出することによって全ての凹部３に受
精卵１１が固定されたか否かを判断することができるた
め、細胞の固定工程の終了時の判断を適確かつ容易に行
うことができ、作業効率を向上させることができる。
【００２９】このように本実施の形態によれば細胞固定
用プレ−ト２に受精卵１１を安定して固定することがで
きるので、マイクロインジェクション法により受精卵１
１にマイクロ針を刺入する際にも、マイクロ針を刺入し
やすく、刺入の際に受精卵１１に損傷を与えるおそれも
減少する。また受精卵１１は細胞固定用プレ−ト２の所
定位置に規則正しく固定されており、受精卵１１の上部
側は細胞固定用プレ−ト２から突出しているのでマイク
ロ針の刺入操作が容易になり、受精卵１１への遺伝子の
注入が確実かつ容易に行える。従って作業者の経験と熟
練に頼る面が少なくなり、作業効率が向上すると共に、
マイクロ針の刺入操作が容易になるので、作業時間が短
縮され、作業者への負担を軽減させることができる。
用プレ−ト２に受精卵１１を安定して固定することがで
きるので、マイクロインジェクション法により受精卵１
１にマイクロ針を刺入する際にも、マイクロ針を刺入し
やすく、刺入の際に受精卵１１に損傷を与えるおそれも
減少する。また受精卵１１は細胞固定用プレ−ト２の所
定位置に規則正しく固定されており、受精卵１１の上部
側は細胞固定用プレ−ト２から突出しているのでマイク
ロ針の刺入操作が容易になり、受精卵１１への遺伝子の
注入が確実かつ容易に行える。従って作業者の経験と熟
練に頼る面が少なくなり、作業効率が向上すると共に、
マイクロ針の刺入操作が容易になるので、作業時間が短
縮され、作業者への負担を軽減させることができる。
【００３０】尚、本発明の請求項１による細胞固定用プ
レ−ト２では凹部を例えば図５に示すような形状に形成
したものも含む。図５（ａ）に示す凹部３３は、底部が
受精卵１１の下面側と適合する形状であって、受精卵１
１が細胞固定用プレ−ト２の表面から突出しない程度の
深さに形成されている。このような凹部３３では上述の
細胞固定用プレ−ト２と同様の効果が得られる。また図
５（ｂ）、（ｃ）に示す例は、凹部３４、３５を四角柱
状あるいは円柱状に形成したものであり、図５（ｄ）に
示す例は凹部３６を円錐状に形成したものであるが、こ
のような凹部であっても細胞固定用プレ−ト２の所定位
置に規則正しく固定することができる。
レ−ト２では凹部を例えば図５に示すような形状に形成
したものも含む。図５（ａ）に示す凹部３３は、底部が
受精卵１１の下面側と適合する形状であって、受精卵１
１が細胞固定用プレ−ト２の表面から突出しない程度の
深さに形成されている。このような凹部３３では上述の
細胞固定用プレ−ト２と同様の効果が得られる。また図
５（ｂ）、（ｃ）に示す例は、凹部３４、３５を四角柱
状あるいは円柱状に形成したものであり、図５（ｄ）に
示す例は凹部３６を円錐状に形成したものであるが、こ
のような凹部であっても細胞固定用プレ−ト２の所定位
置に規則正しく固定することができる。
【００３１】また細胞固定用プレ−トへ受精卵の固定す
る際に用いられる装置においては、収納室４を本実施の
形態の図３で示す構成に限らず、例えば図６に示す構成
としてもよい。図６に示す収納室４は、有底筒状体４Ａ
と細胞固定用プレ−ト２の上面側周縁部との間と、ロッ
ド体４Ｂと細胞固定用プレ−ト２の下面側周縁部との間
とに、夫々Ｏリング４５を設けるように構成されてい
る。このような収納室４ではＯリング４５により細胞固
定用プレ−ト２と有底筒状体４Ａ、ロッド体４Ｂとの間
の気密性が高められて、卵浮遊液の液体成分が細胞固定
用プレ−トの周縁側へ流れ込むことが抑えられる。
る際に用いられる装置においては、収納室４を本実施の
形態の図３で示す構成に限らず、例えば図６に示す構成
としてもよい。図６に示す収納室４は、有底筒状体４Ａ
と細胞固定用プレ−ト２の上面側周縁部との間と、ロッ
ド体４Ｂと細胞固定用プレ−ト２の下面側周縁部との間
とに、夫々Ｏリング４５を設けるように構成されてい
る。このような収納室４ではＯリング４５により細胞固
定用プレ−ト２と有底筒状体４Ａ、ロッド体４Ｂとの間
の気密性が高められて、卵浮遊液の液体成分が細胞固定
用プレ−トの周縁側へ流れ込むことが抑えられる。
【００３２】続いて本発明者らが本発明の効果を確認す
るために行った実験例について説明する。実験装置とし
ては図７に示す装置を用いたが、図中４は例えば図３に
示す収納室４と同様に構成された細胞固定用プレ−ト２
の収納室であり、この収納室４の上流側にはロ−ラ−ポ
ンプ７３が介装された供給管７２により模擬卵浮遊液貯
槽７１が接続されていて、この模擬卵浮遊液貯槽７１と
ロ−ラ−ポンプ７３とは恒温槽内に配置されている。ま
た収納室４の吸引路４４には細胞固定用プレ−ト２の裏
面側を吸引するための真空ポンプ７５が排気管７４を介
して接続されており、この排気管７４の他端側にはトラ
ップ７６が設けられている。また収納室４の上方側に
は、卵浮遊液供給口４３を介して細胞固定用プレ−ト２
を観察するためにカメラ７７が設けられている。
るために行った実験例について説明する。実験装置とし
ては図７に示す装置を用いたが、図中４は例えば図３に
示す収納室４と同様に構成された細胞固定用プレ−ト２
の収納室であり、この収納室４の上流側にはロ−ラ−ポ
ンプ７３が介装された供給管７２により模擬卵浮遊液貯
槽７１が接続されていて、この模擬卵浮遊液貯槽７１と
ロ−ラ−ポンプ７３とは恒温槽内に配置されている。ま
た収納室４の吸引路４４には細胞固定用プレ−ト２の裏
面側を吸引するための真空ポンプ７５が排気管７４を介
して接続されており、この排気管７４の他端側にはトラ
ップ７６が設けられている。また収納室４の上方側に
は、卵浮遊液供給口４３を介して細胞固定用プレ−ト２
を観察するためにカメラ７７が設けられている。
【００３３】ここで細胞固定用プレ−ト２は、直径８ｍ
ｍ、厚さ２ｍｍの大きさとし、微細孔２１の直径は２μ
ｍ、微細孔２１容積は０．２５ｃｃ／ｇとした。凹部３
は直径１４０μｍ、深さ７０μｍとした。また模擬卵
は、１％塩化カルシウム水溶液に、０．１％アルギン酸
水溶液と４％エリトロシン水溶液との混合液を噴霧する
ことにより作成して、粒径１５５〜１８０μｍのものを
選別し、この模擬卵約２５個を純水２０ミリリットルに
浮遊させることにより模擬卵浮遊液を製造した。
ｍ、厚さ２ｍｍの大きさとし、微細孔２１の直径は２μ
ｍ、微細孔２１容積は０．２５ｃｃ／ｇとした。凹部３
は直径１４０μｍ、深さ７０μｍとした。また模擬卵
は、１％塩化カルシウム水溶液に、０．１％アルギン酸
水溶液と４％エリトロシン水溶液との混合液を噴霧する
ことにより作成して、粒径１５５〜１８０μｍのものを
選別し、この模擬卵約２５個を純水２０ミリリットルに
浮遊させることにより模擬卵浮遊液を製造した。
【００３４】温度３７℃の下で、模擬卵浮遊液貯槽７１
から細胞固定用プレ−ト２の表面側に０．１ｍｌ／ｈｒ
の流量で模擬卵浮遊液を供給し、真空ポンプ７５により
細胞固定用プレ−ト２の裏面側を引圧を変えながら吸引
して、模擬卵浮遊液の液体成分の細胞固定用プレ−ト２
の透過速度と真空ポンプ７５との関係を測定すると共
に、凹部３に模擬卵が固定される様子をカメラ７７によ
り観察した。前記透過速度は、単位時間当りの模擬卵浮
遊液の液体成分の透過量を、トラップ７６に溜まった水
蒸気を液体窒素によって凝固させ、重量を測定すること
により求めた。また真空ポンプ７５の引圧は、収納室４
内の圧力を水銀圧力計及び水柱を用いることにより求め
た。この結果を図８に示す。
から細胞固定用プレ−ト２の表面側に０．１ｍｌ／ｈｒ
の流量で模擬卵浮遊液を供給し、真空ポンプ７５により
細胞固定用プレ−ト２の裏面側を引圧を変えながら吸引
して、模擬卵浮遊液の液体成分の細胞固定用プレ−ト２
の透過速度と真空ポンプ７５との関係を測定すると共
に、凹部３に模擬卵が固定される様子をカメラ７７によ
り観察した。前記透過速度は、単位時間当りの模擬卵浮
遊液の液体成分の透過量を、トラップ７６に溜まった水
蒸気を液体窒素によって凝固させ、重量を測定すること
により求めた。また真空ポンプ７５の引圧は、収納室４
内の圧力を水銀圧力計及び水柱を用いることにより求め
た。この結果を図８に示す。
【００３５】この実験により、細胞固定用プレ−ト２の
裏面側から所定の圧力で吸引すると模擬卵浮遊液の液体
成分は細胞固定用プレ−トを裏面側に透過していくこと
が確認された。また引圧と透過速度とは比例関係にあ
り、引圧が大きくなると透過速度も大きくなることが認
められ、凹部３に模擬卵が固定される様子が確認され
た。
裏面側から所定の圧力で吸引すると模擬卵浮遊液の液体
成分は細胞固定用プレ−トを裏面側に透過していくこと
が確認された。また引圧と透過速度とは比例関係にあ
り、引圧が大きくなると透過速度も大きくなることが認
められ、凹部３に模擬卵が固定される様子が確認され
た。
【００３６】続いて細胞固定用プレ−ト２の厚さを０．
７７ｍｍにして同様の実験を行ったところ図９に示す結
果が得られ、厚さが２ｍｍの場合に比べて透過速度が大
きくなり、模擬卵が凹部３に固定される様子が確認でき
た。特に引圧が７００ｍｍＨｇ程度であれば、細胞固定
用プレ−ト２の表面に適度な液流が発生し、模擬卵が凹
部３に速やかに固定されることが確認された。
７７ｍｍにして同様の実験を行ったところ図９に示す結
果が得られ、厚さが２ｍｍの場合に比べて透過速度が大
きくなり、模擬卵が凹部３に固定される様子が確認でき
た。特に引圧が７００ｍｍＨｇ程度であれば、細胞固定
用プレ−ト２の表面に適度な液流が発生し、模擬卵が凹
部３に速やかに固定されることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】本発明の請求項１の発明によれば、細胞
固定用プレ−トの所定位置に複数の細胞を固定すること
ができる。請求項２〜５の発明によれば、細胞固定用プ
レ−トの所定位置に複数の細胞を安定した状態で固定す
ることができる。請求項６の発明によれば、細胞固定用
プレ−トへの細胞の固定工程の終了時の判断が容易にな
る。
固定用プレ−トの所定位置に複数の細胞を固定すること
ができる。請求項２〜５の発明によれば、細胞固定用プ
レ−トの所定位置に複数の細胞を安定した状態で固定す
ることができる。請求項６の発明によれば、細胞固定用
プレ−トへの細胞の固定工程の終了時の判断が容易にな
る。
【図１】本発明の実施の形態に係る細胞固定用プレ−ト
の一例を示す平面図と断面図である。
の一例を示す平面図と断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る細胞固定用プレ−ト
の要部を示す断面図である。
の要部を示す断面図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る細胞の固定方法を実
施するための装置の一例を示す構成図である。
施するための装置の一例を示す構成図である。
【図４】細胞固定用プレ−トの作用を説明するための断
面図である。
面図である。
【図５】細胞固定用プレ−トの他の例を示す断面図であ
る。
る。
【図６】収納室の他の例を示す断面図である。
【図７】本発明の効果を確認するための実験に用いた実
験装置を示す構成図である。
験装置を示す構成図である。
【図８】実験結果を示す透過速度と引圧との特性図であ
る。
る。
【図９】実験結果を示す透過速度と引圧との特性図であ
る。
る。
【図１０】従来の細胞の固定方法を示す平面図である。
２ 細胞固定用プレ−ト ２０ 多孔質プレ−ト ２１ 微細孔 ３、３３、３４、３５、３６ 凹部 ３１ 非透液性膜 ４ 収納室 ４３ 卵浮遊液供給口 ４４ 吸引路 ５ 真空ポンプ
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年２月１３日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
フロントページの続き (72)発明者 辻 隆之 大阪府吹田市藤白台５丁目７番地 国立循 環器病センタ−内 (72)発明者 藤里 俊哉 大阪府吹田市藤白台５丁目７番地 国立循 環器病センタ−内 (72)発明者 西 武郎 神奈川県横須賀市神明町１番地 株式会社 日平トヤマ技術センタ−内 (72)発明者 温井 満 富山県東砺波郡福野町100番地 株式会社 日平トヤマ富山工場内 (72)発明者 山田 文正 富山県東砺波郡福野町100番地 株式会社 日平トヤマ富山工場内
Claims (6)
- 【請求項１】 透液性材料により構成されたプレ−トの
一面側に細胞を収納する複数の凹部を形成したことを特
徴とする細胞固定用プレ−ト。 - 【請求項２】 凹部は細胞の一部分が嵌合する形状に形
成されていることを特徴とする請求項１記載の細胞固定
用プレ−ト。 - 【請求項３】 透液性材料により構成されたプレ−トの
一面側の凹部以外の領域に非透液性膜を形成したことを
特徴とする請求項１又は２記載の細胞固定用プレ−ト。 - 【請求項４】 透液性材料は多孔質材料であることを特
徴とする請求項１、２又は３記載の細胞固定用プレ−
ト。 - 【請求項５】 透液性材料はマイクロポ−ラスガラスで
あることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の細
胞固定用プレ−ト。 - 【請求項６】 透液性材料により構成されたプレ−トの
一面側に細胞を収納する複数の凹部が形成された細胞固
定用プレ−トを収納室内に収納し、一面側に細胞を含む
液を供給し、他面側から吸引することにより、前記凹部
に細胞を固定する方法において、 前記収納室内の圧力を検出し、この検出値に基づいて前
記凹部に細胞が固定されたか否かを判断することを特徴
とする細胞の固定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34672896A JPH10165166A (ja) | 1996-12-10 | 1996-12-10 | 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34672896A JPH10165166A (ja) | 1996-12-10 | 1996-12-10 | 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10165166A true JPH10165166A (ja) | 1998-06-23 |
Family
ID=18385423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34672896A Pending JPH10165166A (ja) | 1996-12-10 | 1996-12-10 | 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10165166A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008283885A (ja) * | 2007-05-16 | 2008-11-27 | Fujitsu Ltd | 小胞体捕捉チップ及びその製造方法 |
| US7479388B2 (en) | 2004-04-28 | 2009-01-20 | Fujitsu Limited | Apparatus for injecting solution into cell |
| WO2015115448A1 (ja) * | 2014-01-30 | 2015-08-06 | 並木精密宝石株式会社 | 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 |
| US9127245B2 (en) | 2007-11-30 | 2015-09-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Living body holding method, living body test method, living body growing method, living body holding sheet, and living body processing device |
| JP2017167475A (ja) * | 2016-03-18 | 2017-09-21 | 憲隆 福永 | 模擬卵 |
-
1996
- 1996-12-10 JP JP34672896A patent/JPH10165166A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7479388B2 (en) | 2004-04-28 | 2009-01-20 | Fujitsu Limited | Apparatus for injecting solution into cell |
| JP2008283885A (ja) * | 2007-05-16 | 2008-11-27 | Fujitsu Ltd | 小胞体捕捉チップ及びその製造方法 |
| US9127245B2 (en) | 2007-11-30 | 2015-09-08 | Canon Kabushiki Kaisha | Living body holding method, living body test method, living body growing method, living body holding sheet, and living body processing device |
| WO2015115448A1 (ja) * | 2014-01-30 | 2015-08-06 | 並木精密宝石株式会社 | 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 |
| JPWO2015115448A1 (ja) * | 2014-01-30 | 2017-03-23 | 並木精密宝石株式会社 | 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 |
| JP2017167475A (ja) * | 2016-03-18 | 2017-09-21 | 憲隆 福永 | 模擬卵 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20040106 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |