JP5164971B2 - 三次元的相互作用を用いてマルチマー形成ポリペプチドのモノマーからマルチマーを分別検出する方法 - Google Patents

Description

本発明は、三次元的相互作用を用いてマルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出する方法及びそのためのキットに関する。

タンパク質の機能は、タンパク質を構成するポリペプチドのマルチマー化が必要であるということは、一般によく知られている。しかしながら、あるタンパク質においてマルチマーの形成は、よく疾患または疾病を引き起こす。特に、タンパク質は、正常的な状態ではモノマーとして存在し、非正常的な状態では、マルチマー(または凝集)に変換される(例えば、ミスフォールディング形成)。

ミスフォールディングまたは機能的に形成されなかった凝集(蓄積)が形成されたタンパク質は、正常的な生物学的活性を有しないことが既によく知られている。タンパク質が正確にフォールディングされなかったり、正確なフォールディングを維持できない場合は、多様な生物学的機能不全(malfunction)を誘発し、その結果、多様な疾患を誘発する(Massimo Stefani, et al., J. Mol. Med. 81:678-699(2003); and Radford SE, et al., Cell. 97:291-298(1999))。数々の疾病は、生体内で不正確な構造、即ち、正常的に機能を果たすものとは異なる構造を有するタンパク質分子により引き起こされる。

例えば、タンパク質の非正常的な凝集またはミスフォールディングに係わる疾患または疾病には、アルツハイマー疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症 (Spongiform encephalopathies)、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、セルピン欠乏症(Serpin deficiency)、肺気腫(emphysema)、硬変症(cirrhosis)、第II型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、フロント一時的痴呆(Fronto-temporal dementias)、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイドポリニューロパチー(familial amyloid polyneuropathy)、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチー(hereditary cerebral amyloid angiopathy)、及び血透析関連アミロイド症がある。

凝集関連疾患の初期診断は、集中的に研究されてきた。しかしながら、モノマー形(正常)からマルチマー形(凝集)を分別的に検出するための方法及び研究は、まだ提示されていない状態である。

人間において、散発性、変種、医原性、及び家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、クル(kuru)、家族性致命的不眠症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、羊及びヤギのスクレイピー、猫の海綿状脳症、ミンク海綿状脳症、シカ、エルク及びムースの慢性消耗性疾患、及び家畜の狂牛病は、致命的な神経退行性疾患であり、このような疾病は、伝達性海綿状脳症(Transmissible spongiform encephalopathies：TSE)によるものである(Prusiner S.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 568-57(2000))。プリオンタンパク質の非正常的なイソフォームまたはスクレイピー形(PrP^Sc)は、ＴＳＥの主要因として強力に提案されている(Caughey B. Trends Biochem. Sci. 26:235-42(2001))。

プリオンタンパク質の正常形(PrP^C)は、α−鎖と流動的な無秩序な部位を含み、モノマー形として存在して(Zahn, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:145-150(2000))、スクレイピー形(PrP^Sc)は、高度のβ−シート構造を有して、マルチマー形または少なくとも二量体形以上として存在する(Caughey, B., et al., J. Biol. Chem. 273:32230-35(1998))。α−鎖構造からβ−シート構造への変化は、神経系疾患を発生させる疾病において主要原因である。

ＰｒＰ^Cは、タンパク質加水分解酵素に敏感性(PrP^sen)を有する反面、ＰｒＰ^Scは、タンパク質加水分解に対する部分的な抵抗性(PrP^res)を有し、高分子凝集体を形成する傾向がある(Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001))。このような凝集体の形成は、ＰｒＰ^resの形成を誘導する構造的変化に対する分析や特性の記述を難しくする。

プロテアーゼＫ(PK)の切断方法は、細胞形を切断して、スクレイピー形のみを残しておき、これはＥＬＩＳＡで検出されるが、ＰｒＰ(スクレイピー形)の多様な形態の抵抗性を区別するに利用される。しかしながら、ＰＫ切断方法に対しては問題点が提起されている。なぜなら、ＰｒＰ構造、濃度、組織抗体、切断時間及び緩衝液は、ＰＫ敏感度に影響を与え、これは、ＰＫ切断方法に対する信頼度を大きく低下させるからである。

したがって、モノマー形(例えば、PrP^C、PrPの細胞形)からマルチマー形(例えば、PrP^Sc、PrPのスクレイピー形)を、より信頼度高く便利に分別検出できるような新しい方法の開発が切実である。

本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用は、表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

本発明の目的は、マルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、マルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出するためのキットを提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

本発明の一様態によると、本発明は、以下のステップを含む、生試料内のマルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出する方法を提供する：(ａ)固相のキャリアー(solid phase carrier)の表面に捕獲抗体を３次元的に結合させて、キャリアー−捕獲抗体複合体を用意するステップであって、前記捕獲抗体は、前記マルチマー形成ポリペプチドの一つの特定エピトープに結合して、(ｂ)検出抗体を用意するステップであって、前記検出抗体が認識するエピトープは、検出抗体がエピトープに結合した場合、前記捕獲抗体のエピトープに結合された捕獲抗体により立体的妨害(Steric hindrance)を起す位置にあることを特徴とし、(ｃ)生試料に前記キャリアー−捕獲抗体複合体及び検出抗体を同時に反応させるステップと、(ｄ)キャリアー−捕獲抗体−マルチマー形検出抗体複合体を検出するステップ。

本発明のまた他の様態によると、本発明は、以下を含む、生試料内のマルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出するためのキットを提供する：(ａ)固相のキャリアー(solid phase carrier)の表面に３次元的に結合されており、前記マルチマー形成ポリペプチドの一つの特定エピトープに結合する捕獲抗体と、(ｂ)前記捕獲抗体のエピトープに結合された捕獲抗体により立体的妨害(Steric hindrance)を起す位置にあるエピトープを認識する検出抗体。

本発明は、抗原−抗体反応である免疫分析を用いて、生試料においてマルチマー形成ポリペプチドのマルチマー形をモノマー形から分別的に検出する方法を提供する。また、本発明は、マルチマー形成ポリペプチドとの結合において競争的な関係である２種の抗体、即ち、捕獲抗体及び検出抗体を利用する。競争的な抗体は、立体的な妨害を起す。特に、マルチマー形成ポリペプチドのエピトープに結合された捕獲抗体は、マルチマー形成ポリペプチドのエピトープへの結合において、検出抗体と競争的であるため、検出抗体がマルチマー形成ポリペプチドのエピトープに結合することを抑制する。本発明の特徴の一つは、三次元的結合に対する免疫分析を利用する。本発明において、捕獲及び検出抗体は、生試料において抗原と三次元的結合をする。

本発明者らは、マルチマー形成ポリペプチドのマルチマー形をモノマー形から分別的に検出する方法を既に開発し、これをマルチマー検出システム(Multimer Detection System：MDS)と命名して、ＰＣＴ出願した(PCT/KR2005/004001)。本発明は、実施例１５で述べたように、検出度及び分別力において、ＭＤＳを向上させた。本発明の最も大きい特徴は、捕獲抗体と検出抗体が三次元的に分析対象の試料と接触することであるため、本発明で提示される方法を‘ＭＤＳ−３Ｄ(threedimensional)システム’と命名する。

本明細書において、用語“マルチマー形成ポリペプチド”は、凝集形(aggregation form)、特に構造の変化により凝集形を形成できるポリペプチドを意味する。このような凝集形ポリペプチドは、多様な疾患、例えば、アルツハイマー疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症 (Spongiform encephalopathies)、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、セルピン欠乏症(Serpin deficiency)、肺気腫(emphysema)、硬変症(cirrhosis)、第II型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、フロント一時的痴呆(Fronto-temporal dementias)、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイドポリニューロパチー(familial amyloid polyneuropathy)、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチー(hereditary cerebral amyloid angiopathy)、及び血透析関連アミロイド症を誘発する。したがって、用語“マルチマー形成ポリペプチド”は、用語“凝集体形成ポリペプチド”と相互交換的に使用される。

本発明は、二種の抗体、即ち、捕獲抗体及び検出抗体を利用する。本明細書において、用語“捕獲抗体”は、生試料内のターゲットとするマルチマー形成ポリペプチドに結合能を有する抗体を意味する。用語“検出抗体”は、捕獲抗体により捕獲されたマルチマー形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。本明細書において用語“抗体”は、抗原に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。抗体は、全体抗体(entire antibody)だけではなく、エピトープ、抗原または抗原性断片に結合能を有する抗体断片(例えば、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ)も含む。

本発明によると、検出抗体と捕獲抗体に特異的に認識されるエピトープは、これらに結合する抗体間に立体的妨害(steric hindrance)を起す個所に位置する。好ましくは、捕獲抗体のエピトープと検出抗体のエピトープのアミノ酸配列は、同一であるか、オーバーラップまたは隣接したアミノ酸配列を有する。捕獲抗体のエピトープと検出抗体のエピトープのアミノ酸配列が同一であるか、オーバーラップされた場合は、これに結合された捕獲抗体と検出抗体が互いに立体的妨害、即ち、競争的結合をすることは容易に理解できる。また、前記２種のエピトープが互いに隣接したアミノ酸配列であるというのは、上述の立体的妨害、即ち、競争的結合を誘発できる程度の距離にあるアミノ酸配列であるという意味を有する。

本発明において、用語‘オーバーラップ’は、エピトープと捕獲抗体及び検出抗体のアミノ酸配列が同一または部分的に一致することを意味する。例えば、Ｔ２及び３Ｅ７抗体に対するエピトープは、それぞれ牛プリオンタンパク質アミノ酸配列の１４７−１５２及び１４０−１６０であって、完全にオーバーラップする。さらに、ＩＣＳＭ３５と１Ｅ４抗体に対するエピトープは、牛プリオンタンパク質アミノ酸配列の１０４−１１３及び１０８−１１９であって、部分的にオーバーラップする。

エピトープが隣接する場合は、二つの抗体の立体的妨害を起すため、マルチマー形ポリペプチドにおいて、一つの特定エピトープ(捕獲抗体が認識するエピトープ)は、他の特定エピトープ(検出抗体が認識するエピトープ)と隣接しない個所に位置する。

本発明の特徴の一つは、固相のキャリアーの表面に捕獲抗体を三次元的に結合させて、キャリアー−捕獲抗体複合体を用意することである。例えば、立体的ビーズ表面に捕獲抗体を結合させることがこれに該当する。しかしながら、プレート表面上に捕獲抗体を結合させることは、二次元的な結合であるため、本発明から除かれる。このように立体的にキャリアーに結合された捕獲抗体は、三次元方式で生試料と接触し、これにより、生試料と接触する機会をさらに多く有するようになる。

捕獲抗体が結合される固相のキャリアーは、立体的構造を有するいかなる物質でも可能であり、好ましくは、重量(gravity)、電荷または磁気によって容易に分離または回収できる物質である。最も好ましくは、固相のキャリアーは、磁性ビーズである。

本発明の好ましい具現例によると、検出抗体には、検出可能な信号を発生させる標識が結合されているか、親和性物質が結合されている。前記標識は、酵素(例えば、アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ及びサイトクロムP₄₅₀)、放射能物質(例えば、C¹⁴及びI¹²⁵)、蛍光物質(例えば、フルオレセイン)、発光物質、化学発光物質(chemiluminescent)、及びＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー伝達; fluorescence resonance energy transfer)を含むが、これらに限定されるものではない。検出を容易にするために、検出抗体に結合できる親和性物質は、バイオチンを含む。多様な標識及び標識方法は、Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y(1988)に記載されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。

検出抗体に結合する標識として放射能同位元素が利用される場合は、本発明の最終過程で形成された抗原−抗体複合体を、放射能を測定することにより検出できる。検出抗体に結合する標識として、発色反応を触媒する酵素が利用される場合は、酵素反応に利用される基質を本発明の測定システムに添加して反応生成物を測定し、抗原−抗体複合体を検出することができる。例えば、標識としてアルカリンフォスファターゼが利用される場合は、基質としてブロモクロロインドリルフォスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−フォスフェート(naphthol-ASB1-phosphate)及びＥＣＦ(enhanced chemifluorescence)のような発色反応基質が利用できて、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合は、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン(ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート)、レソルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬(１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン)、ＴＭＢ(３，３，５，５−テトラメチルベンジジン)及びＡＢＴＳ(２，２−アジン−ジ[３−エチルベンズチアゾリンスルホネート])のような基質が利用できる。

検出抗体に親和性物質が結合される場合は、この親和性物質に結合するパートナーに検出可能な信号を発生させる標識(例えば、発色反応−触媒酵素)が結合された物質を利用して、抗原−抗体複合体を検出することができる。例えば、バイオチンが結合された検出抗体を利用する場合は、ストレブトアビジンが結合された発色反応−触媒酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ)を抗原−抗体複合体に処理した後、発色反応基質を反応させて出る信号を検出することにより、抗原−抗体複合体を検出する。

このような標識は、前記ステップ(ｄ)において、マルチマー形抗原−抗体複合体の検出を容易にするだけではなく、定量的分析も可能にする。検出抗体に標識が結合された場合、ステップ(ｄ)は、ポリペプチドのマルチマー形に結合された検出抗体の標識から出る信号を測定して行われる。

捕獲抗体と検出抗体とから構成された好ましい抗体セットは、牛プリオンアミノ酸配列１４０−１６０のエピトープを認識する捕獲抗体と、牛プリオンアミノ酸配列１４７−１５２のエピトープを認識する検出抗体を含む。他の好ましい抗体セットは、牛プリオンアミノ酸配列１０４−１１３のエピトープを認識する捕獲抗体と、牛プリオンアミノ酸配列１０８−１１９のエピトープを認識する検出抗体を含む。

本発明の特徴の一つは、キャリアー−捕獲抗体と検出抗体とを試料に同時に処理することである。仮に、二つの抗体を同時に処理せず、捕獲抗体を先に処理してから検出抗体を処理すると、遊離状態(free form)のキャリアー−捕獲抗体は、プレートの表面に固定されている抗体とは違って、マルチマー形に存在する多数のエピトープに結合することにより、後で検出抗体がエピトープ(前記捕獲抗体に対するエピトープと同一、オーバーラップ、または隣接したエピトープ)に結合することを立体的に妨害する問題点がある。したがって、別々に処理を施すと、検出抗体による信号が非常に微弱に出る。しかし、二つの抗体を同時に処理すると、捕獲抗体と検出抗体とがエピトープに対して互いに競争的な状態となり、二つの抗体が濃度依存的にエピトープに結合するようになる。

本明細書において、キャリアー−捕獲抗体と検出抗体を言及する際に使用される用語‘同時処理’は、(ｉ)キャリアー捕獲抗体と検出抗体のそれぞれを試料に同時に処理すること、または(ｉｉ)キャリアー−捕獲抗体と検出抗体との混合カクテルを試料に処理することを意味する。

本発明の好ましい具現例によると、ステップ(ｃ)において、捕獲抗体と検出抗体は、モル比５：１〜１：５で同時に添加されて、より好ましいモル比は、３：１〜１：３であり、さらに好ましいモル比は、２：１〜１：２であって、最も好ましいモル比は、１：１である。

本発明の方法によりＭＤＳ−３ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを行う場合、好ましくは、ステップ(ｃ)において、キャリアー−捕獲抗体とキャリアー−検出抗体のモル比５：１〜１：５で同時に添加されて、より好ましいモル比は、３：１〜１：３であり、最も好ましいモル比は、２：１である。

本発明は、いかなるマルチマー形成ポリペプチドでも、マルチマー形をモノマー形から分別的に検出することができる。好ましくは、本発明の方法により検出できるマルチマー形成ポリペプチドは、アルツハイマー疾患に関与するＡβペプチドとｔａｕタンパク質、海綿状脳症及びクロイツフェルト・ヤコブ病に関与するプリオン、パーキンソン疾患に関与するα−シヌクレイン、一次全身性アミロイド症に関与するＩｇ軽鎖、二次全身性アミロイド症に関与する血清アミロイドＡ、フロント一時的痴呆に関与するｔａｕタンパク質、老人全身性アミロイド症に関与するトランスチレチン、家族性アミロイドポリニューロパチーに関与するトランスチレチン、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチーに関与するシスタチンＣ、血透析関連アミロイド症に関与するβ₂−マイクログロブリン、ハンチントン疾患に関与するハンチンチン、筋萎縮性側索硬化症に関与するスーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)、セルピン欠乏症に関与するセルピン(Serpin)、肺気腫、肝硬変及び第II型糖尿病に関与するアミリン(amyline)である。

本発明の最も好ましい具現例によると、検出対象のマルチマー形成ポリペプチドは、クロイツフェルト・ヤコブ病及び海綿状脳症を誘発するプリオンタンパク質である。

本発明の方法は、このようなプリオンタンパク質の構造的変化によるマルチマー形プリオン、即ち、ＰｒＰ^Scで形成されたマルチマーの検出に非常に有用である。

本発明の方法がＰｒＰ^Scにより形成されるマルチマーの検出に利用される場合、前記ポリペプチドのモノマー形は、ＰｒＰ^c(cellular form of prion)であり、マルチマー形は、ＰｒＰ^Scで形成されたマルチマーである。

本発明の最も大きい特徴の一つは、反復されない配列(non-repeated sequence)をエピトープとして有する抗体を利用することである。もし、抗体が認識するエピトープが反復配列である場合は、本発明の方法は、モノマー形からマルチマー形を効果的に分別して検出することができない。

本発明の好ましい具現例によると、捕獲抗体及び/または検出抗体が認識するポリペプチドのエピトープは、ポリペプチドにおいて反復されない配列である。

本発明に利用される抗体は、当業界で通常的に行われる方法、例えば、融合方法(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976))、組み換えＤＮＡ方法(米国特許第4,816,56号)、またはファージ抗体ライブラリー(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991);及びMarks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))により製造できる。抗体製造に対する一般的な過程は、Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;及びColigan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。例えば、単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞の製造は、不死滅化細胞株(immortal cell line)を、抗体を生産するリンパ球と融合させてなされ、この過程に必要な技術は、当業界によく知られており、容易に実施できる。多クローン抗体は、酵素抗原を適合した動物に注入して、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性(affinity)技術を利用して、抗血清から抗体を分離して得ることができる。

また、本発明で使用する捕獲抗体または検出抗体カクテルは、捕獲抗体カクテルが、検出抗体と同一またはオーバーラップされたエピトープと反応する場合、及び、検出抗体カクテルが、捕獲抗体と同一またはオーバーラップされたエピトープと反応する場合に限って有用に使用できる。実施例１３及び１４から分かるように、本発明で使用する捕獲抗体または検出抗体カクテルは、ＰｒＰ^cからＰｒＰ^Scを分別的に検出する。

本明細書において、用語‘生試料(biosample)’は、検査対象の有機体由来の試料を意味する。生試料は、細胞、組織、生体液、本発明を実施するに好ましい他の媒介物(medium)、人間または動物からの試料または人間または動物の排泄物を含む。好ましくは、生試料は、血液、血清、血漿、リンパ液、牛乳、小便、糞便、涙液、唾液、精液、脳抽出物(例えば、脳均質液)、脊髄液(SCF)、虫垂液、脾臓液、及び扁桃組織抽出物を含む生体液である。より好ましくは、前記生試料は、脳均質液または血漿であり、最も好ましくは、血漿である。

生試料が脳均質液である場合、本発明の方法は、生試料をプロテアーゼＫまたはトリプシンで前処理する過程をさらに含むことが好ましい。

しかしながら、生試料が血液または血漿である場合は、生試料にプロテアーゼＫで前処理しない方が好ましい。これは、プロテアーゼ前処理をすると、マルチマー形、特に本発明の方法によりＰｒＰ^Scを検出するにおいて、検出度及び分別力を非常に減少させる結果を示すからである。実施例１０に述べたように、本発明の方法により血液または血漿試料からＰｒＰ^Scを検出する際、プロテアーゼ切断が不要であることを確認することができる。

一方、生試料が血液または血漿である場合、サルコシル(sarkosyl)またはトリトン系(例えば、Triton X-100)デタージェント、より好ましくはトリトン系列、最も好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で生試料を前処理する過程をさらに含むことが好ましい。生試料(好ましくは血液、最も好ましくは血漿)を準備するために、好ましい緩衝液は、ＴＢＳＴ(Tris-buffered saline with Tween 20)とトリシン(tricine)である。好ましくは、ステップ(ｃ)において生試料(好ましくは血液、最も好ましくは血漿)の濃度は、１０ｖ/ｖ％〜７０ｖ/ｖ％であり、より好ましくは、２０ｖ/ｖ％〜４０ｖ/ｖ％であって、最も好ましくは、２３ｖ/ｖ％〜３０ｖ/ｖ％である。

本発明の他の様態によると、本発明は、以下のステップを含む、マルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出する方法を提供する：(ａ)磁性ビーズの表面に捕獲抗体を３次元的に結合させて、磁性ビーズ−捕獲抗体複合体を用意するステップであって、前記捕獲抗体は、前記マルチマー形成ポリペプチドの一つの特定エピトープに結合して、(ｂ)検出抗体を用意するステップであって、前記検出抗体が認識するエピトープは、検出抗体がエピトープに結合した場合、前記捕獲抗体のエピトープに結合された捕獲抗体により立体的妨害(steric hindrance)を起す位置にあることを特徴とし、(ｃ)生試料に前記磁性ビーズ−捕獲抗体複合体及び検出抗体を同時に反応させるステップと、(ｄ)前記ステップ(ｃ)の結果物に磁場を適用するステップと、(ｅ)前記ステップ(ｃ)で形成された磁性ビーズ−捕獲抗体−マルチマー形ポリペプチド−検出抗体複合体を検出するステップ。

好ましくは、本発明の方法は、ステップ(ｄ)とステップ(ｅ)との間に、分離された捕獲抗体−マルチマー形−検出抗体複合体を洗浄するステップをさらに含む。洗浄ステップでは、ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)、ＰＢＳＴ(phosphate-buffered saline with Tween 20)、ＰＢＳＸ(phosphate-buffered saline with Triton X-100)、ＴＢＳＸ(tris-buffered saline with triton-100)及びＴＢＳＴ(tris-buffered saline with Tween 20)のような多様な洗浄緩衝液を利用することができる。最も好ましくは、洗浄ステップでは、ＴＢＳＴ洗浄緩衝液を利用する。

キャリアーとして磁性ビーズを利用する本発明の方法の一実施例は、図１ａに示されている。図１ａを参照し、本発明の方法をより詳細に説明すると、以下のようである：仮に、検体にＰｒＰの多様な形態、即ち、ＰｒＰ^c及びＰｒＰ^Scがある場合、この検体を、捕獲抗体がコーティングされた磁性ビーズと検出抗体に同時に適用させると、ＨＲＰ−検出抗体は、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^cには結合できず、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^Scにのみ結合するようになる。また、利用された捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において反復されない配列をエピトープとして認識するものである。また、捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において、同一、オーバーラップまたは隣接したエピトープを認識する。図１ａにおいて、エピトープは三角形で示されている。検出抗体により認識されるエピトープは、捕獲抗体と既に結合されているため、このようなエピトープを一つのみ有しているＰｒＰ^cには、検出抗体が結合しない。しかしながら、ＰｒＰ^Scにより形成されたマルチマー形には同一エピトープが多数存在するため、検出抗体が結合するようになる。抗原−抗体反応後、磁場を付与して、磁性ビーズを収集し、洗浄をした後、ＨＲＰの基質で発色、蛍光または発光反応を誘導する。最終的に、前記発色、蛍光または発光反応を測定して、ＰｒＰ^Scで構成されたマルチマー−抗体複合体の存在または量を分析する。

本発明のキットの好ましい具現例によると、キャリアー−捕獲抗体及び検出抗体は、モル比５：１〜１：５、より好ましくは、モル比３：１〜１：３、さらに好ましくは、２：１〜１：２、最も好ましくは、モル比約１：１のカクテル形態として含まれる。本発明のキットは、磁場プレート、緩衝溶液、発色酵素、発色基質などを含むことができる。

本発明のＭＤＳ−３Ｄシステムは、ＭＤＳ−３Ｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステム及びＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを含む。

ＭＤＳ−３Ｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステム(参照：図１ａ)は、上述のように、ビーズに結合された捕獲抗体を利用するもので、ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステム(図１ｂ及び図１ｃ)は、捕獲抗体と検出抗体ともビーズに結合されたものを利用するものである。

ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによると、前記検出抗体は、固相のキャリアーの表面に三次元的(即ち、立体的)に結合されている。このように立体的にキャリアーに結合された検出抗体は、三次元方式で、そしてより集中された方式(concentrated manner)でマルチ形ポリペプチドと接触するようになる。

検出抗体が結合される固相のキャリアーは、立体的構造を有するいかなる物質でも可能であって、好ましくは、重量、電荷または磁気によって容易に分離または回収できる物質である。最も好ましくは、固相のキャリアーは、ラテックスビーズである。検出抗体が結合されるキャリアーには標識物質が結合できる。このようにキャリアーに標識物質が結合された場合、例えば、蛍光物質のあるラテックスビーズを利用する場合、検出抗体に標識(例えば、HRP)を結合させなくても、キャリアーから出る安定した最終検出信号(マルチマー形の存在を意味する信号)を得ることができる。

ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムは、シングルラベルを使用する ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステム(参照：図１ｂ)及びダブルラベルを使用する ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステム(参照：図１ｃ)をさらに含む。

シングルラベルを使用する ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによると、検出抗体またはキャリアーに、検出可能な信号を生成させる標識が結合されている。ダブルラベルを使用する ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによると、キャリアーと検出抗体ともに、検出可能な信号を生成させる標識が結合されている。このような二重的なラベリングは、キャリアーから出る信号及び検出抗体から出る信号を、相互チェック可能であるという利点がある。

図１ｂを参照して、シングルラベルを使用する ＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを説明すると、以下のようである。仮に、検体にＰｒＰの多様な形態、即ち、ＰｒＰ^c及びＰｒＰ^Scがある場合、この検体を、捕獲抗体がコーティングされた磁性ビーズと検出抗体に同時に適用させると、Fluor−検出抗体(蛍光物質が結合されているラテックスビーズに結合された検出抗体)は、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^cには結合できず、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^Scにのみ結合するようになる。利用された捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において反復されない配列をエピトープとして認識するものである。また、捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において、同一、オーバーラップまたは隣接したエピトープを認識する。図１ｂにおいて、エピトープは三角形で示されている。検出抗体により認識されるエピトープは、捕獲抗体と既に結合されているため、このようなエピトープを一つのみ有しているＰｒＰ^cには、検出抗体が結合しない。しかし、ＰｒＰ^Scにより形成されたマルチマー形にはエピトープが多数存在するため、検出抗体が結合するようになる。抗原−抗体反応後、磁場を付与して、磁性ビーズを収集し、洗浄をした後、蛍光を測定して、ＰｒＰ^Scで構成されたマルチマー−抗体複合体の存在または量を分析する。

図１ｃを参照して、ダブルラベルを使用するＭＤＳ−３Ｄ Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを説明すると、以下のようである。仮に、検体にＰｒＰの多様な形態、即ち、ＰｒＰ^c及びＰｒＰ^Scがある場合、この検体を、捕獲抗体がコーティングされた磁性ビーズと検出抗体に同時に適用させると、Fluor−HRP−検出抗体(蛍光物質が結合されているラテックスビーズに結合された検出抗体であって、検出抗体にはHRPが結合されている)は、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^cには結合できず、磁性ビーズ−捕獲抗体に結合されたＰｒＰ^Scにのみ結合するようになる。利用された捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において反復されない配列をエピトープとして認識するものである。また、捕獲抗体及び検出抗体は、プリオンタンパク質において、同一、オーバーラップまたは隣接したエピトープを認識する。図１ｃにおいて、エピトープは三角形で示されている。検出抗体により認識されるエピトープは、捕獲抗体と既に結合されているため、このようなエピトープを一つのみ有しているＰｒＰ^cには、検出抗体が結合しない。しかし、ＰｒＰ^Scにより形成されたマルチマー形にはエピトープが多数存在するため、検出抗体が結合するようになる。抗原−抗体反応後、磁場を付与して、磁性ビーズを収集し、洗浄をした後、ＨＲＰによる反応産物及び/または蛍光を測定して、ＰｒＰ^Scで構成されたマルチマー−抗体複合体の存在または量を分析する。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例]
実施例I：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰ検出
２７０５μｌの羊血漿、２２．５μｌの組み換えマルチマー形羊ＰｒＰ(ゲノタイプＡＲＱ、１２０倍希釈されたもの)及び３６０５μｌの２．５×デタージェント(detergent)(３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．２５％サルコシル)を含む試料を製造した。また、前記試料において組み換えマルチマー形羊ＰｒＰの代わりに２２．５μｌのＰＢＳを含む陰性対照群を製造した。一方、磁性ビーズに捕獲抗体を結合させるが、磁性ビーズ２．５μｌに捕獲抗体１μｇが結合されるように結合させた。磁性ビーズに結合させた捕獲抗体は、３Ｅ７またはＭＡ１−７５０単クローン抗体である。３Ｅ７単クローン抗体は、ＰｒＰ^cのアミノ酸１４０−１６０(牛プリオン基準)または１３２−１５２(羊プリオン基準)をエピトープとして認識するもので、前記エピトープ配列は、ＰｒＰ^cにおいて反復されない。ＭＡ１−７５０単クローン抗体は、ＰｒＰ^cのSer-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Argエピトープを認識するもので、前記エピトープ配列は、ＰｒＰ^cにおいて反復されない。

次いで、前記試料に磁性ビーズ−捕獲抗体複合体及び検出抗体を同時に血漿試料と反応して、マルチマー形羊ＰｒＰを検出できるかどうかを調べた。検出抗体として利用したものは、３Ｂ８/Ｄ５−ＨＲＰまたはＴ２−ＨＲＰである。Ｔ２単クローン抗体は、Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med. Sci., 66(6):515(2004)に開示されており、ＰｒＰ^cのアミノ酸配列１４７−１５２(牛プリオン基準)、１４０−１４５(羊プリオン基準)エピトープに特異的に反応する抗体である。３Ｂ８/Ｄ５単クローン抗体のエピトープは、ＰｒＰ^cのアミノ酸１３２−１５２(羊プリオン基準)、１４０−１６０(牛プリオン基準)である。

前記試料に磁性ビーズ−捕獲抗体複合体及び検出抗体を、表１に記載の量で同時に添加し、３７℃で１時間反応した。次いで、磁場を反応混合物に付与して磁性ビーズを分離し、磁性ビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ(enhanced chemiluminescence)検出を行った。

一方、比較実施例として、磁性ビーズ−捕獲抗体複合体を試料と優先的に反応した後、検出抗体を反応させるプロトコールで行った。

試料を上述と同様に用意した。次いで、磁性ビーズ−捕獲抗体複合体を試料に添加して、３７℃で１時間反応した。次いで、磁場を反応混合物に付与して磁性ビーズを分離し、磁性ビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、分離された磁性ビーズに検出抗体を処理して、３７℃で１時間反応した。その後、磁場を反応混合物に付与して磁性ビーズを分離し、磁性ビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した。最終的にＥＣＬ(enhanced chemiluminescence)検出を行った。

図２から分かるように、本発明により磁性ビーズ−捕獲抗体(３Ｅ７抗体)及び検出抗体(Ｔ２−ＨＲＰ)を試料に同時に処理した場合は、分離処理した場合に比べ、検出信号が非常に高く得られ、プリオン検出敏感度が大きく増加した。また、本発明により磁性ビーズ−捕獲抗体及び検出抗体を試料に同時に処理した場合は、分離処理(step by step)した場合に比べ、正常形プリオンの信号強度に対するマルチマー形プリオンの信号強度の比率が著しく増加して、マルチマー形プリオンに対する分別力が非常に大きく向上されることが分かる。

実施例II： ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに適合した緩衝液の分析
ＭＤＳ−３Ｄ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに適合した緩衝液を選別するために、磁性ビーズに結合された捕獲抗体３Ｅ７、３Ｅ７−ｂｅａｄ及び検出抗体Ｔ２−ＨＲＰを１：１比率(０．８μｇ：０．８μｇ)で利用し、Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。試料は、次のように用意した：１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｉｎ ｄ−Ｈ₂Ｏ １２０μｌ、緩衝液(ＴＡＰＳ、ＴＢＳＴまたはＴｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０)５８０μｌ、及び羊の血漿３００μｌを混合して、１．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び３０％血漿を含む総容量１ｍｌの試料を準備した。捕獲抗体としての３Ｅ７−結合磁性ビーズ２μｌ(０．８μｇ)及び検出抗体としてのＴ２−ＨＲＰ(４μｇ/ｍｌ ｉｎ ＴＢＳＴ)２００μｌ(０．８μｇ)を混合して、混合抗体を準備した。試料１ｍｌに前記混合抗体２００μｌを添加して混合し、３７℃で１時間反応した。次いで、磁場を反応混合物に付与して磁性ビーズを分離し、磁性ビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ検出を行った(図３ａ及び３ｂ)。図３ａ及び３ｂにおいて、‘Ｎ’は、正常血漿、‘Ｓｃ’は、ＰｒＰ^Scを有する血漿を示す。図３ａ及び図３ｂから分かるように、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液が、ＰｒＰ^Sc血漿に対して最も高い信号を示しながらも、正常血漿に対しては最も低い信号を示し、結晶試料からＰｒＰ^Scを検出するにおいて、最も優れた分別力を有することが分かる。

実施例III：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰの検出
１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １２０μｌ、ＴＢＳＴ緩衝液(ｐＨ８．０)７３０μｌ及び羊血漿１５０μｌを混合して、１．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ及び１５％羊血漿を含む試料溶液１ｍｌを製造した。

捕獲抗体としての３Ｅ７−結合磁性ビーズ４μｌ、検出抗体としてのＭＡ１ ７５０−結合蛍光ラテックスビーズ２μｌ及びＴＢＳＴ緩衝液２００μｌを混合して、混合抗体を準備した(３Ｅ７−ビーズ/ＭＡ１ ７５０−蛍光ビーズ、２：１比率)。試料１ｍｌに前記混合抗体２００μｌを添加して混合し、３７℃で１時間反応した。次いで、磁場を反応混合物に付与して磁性ビーズを分離し、磁性ビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した後、蛍光を測定した。図４から分かるように、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムは、血漿内のＰｒＰ^Scを分別的に検出していることが分かる。

実施例IV： ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムに適合した緩衝液の分析
捕獲抗体としての３Ｅ７−結合磁性ビーズ４μｌ及び検出抗体としてのＭＡ１ ７５０−結合蛍光ラテックスビーズ１μｌを混合して、混合抗体を準備した(３Ｅ７−ビーズ/ＭＡ１ ７５０−蛍光ビーズ、４：１比率)。１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｉｎ ｄ−Ｈ₂Ｏ １２０μｌ、緩衝液(ＴＢＳＴまたはＴｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．０)７３０μｌ及び羊の血漿１５０μｌを混合して、試料溶液を準備した。その他の過程は、前記実施例３と同様である。図５から確認できるように、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを利用して血漿試料からＰｒＰ^Scを検出するにおいて、ＴＢＳＴがＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液より優れた信号強度及び分別力を示す。

一方、Ｔ２及びＭＡ１抗体をそれぞれ捕獲抗体及び検出抗体として利用する他のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを構築し、上記の過程を行った。図５から分かるように、この抗体組み合わせにおいても、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムは、血漿試料からＰｒＰ^Scを検出した。

実施例V：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムにおける適合した血漿試料濃度の分析
捕獲抗体としての３Ｅ７−結合磁性ビーズ２μｌ及び検出抗体としてのＭＡ１ ７５０−結合蛍光ラテックスビーズ１μｌ(３Ｅ７−ビーズ/ＭＡ１ ７５０−蛍光ビーズ、２：１比率)の混合抗体を利用し、血漿試料をそれぞれ３０％、１５％及び７．５％として、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムの適合した血漿試料濃度を分析した。緩衝液としては、Ｔｒｉｃｉｎｅ(ｐＨ８．０)を利用して、その他の実験方法は、前記実施例３と同様である。

図６から分かるように、血漿試料３０％、１５％及び７．５％に存在するそれぞれのＰｒＰ^Scは、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムにより分別的に検出された。Ｓｃ/Ｎ比率は、血漿濃度が減少するほど減少したが、信号の強度は、低い血漿濃度で最も高かった。したがって、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムに適合した血漿濃度は、約１５％であることが分かる。

実施例VI：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムにおける適合した血漿試料濃度の分析
ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに適合した血漿試料濃度を分析するために、磁性ビーズに結合された捕獲抗体３Ｅ７、３Ｅ７−ｂｅａｄ及び検出抗体Ｔ２−ＨＲＰを１：１比率(０．８μｇ：０．８μｇ)で利用し、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。血漿試料は、それぞれ３０％、１５％及び７．５％とした。緩衝液としては、Ｔｒｉｃｉｎｅ(ｐＨ８．０)を利用して、その他の実験方法は、前記実施例２と同様である。

図７から分かるように、血漿試料３０％、１５％及び７．５％に存在するそれぞれのＰｒＰ^Scは、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムにより分別的に検出された。Ｓｃ/Ｎ比率と正常血漿及びＰｒＰ^Sc血漿に対する信号の強度は、血漿濃度が減少するほど減少した。したがって、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに適合した血漿濃度は、約３０％であることが分かる。

また、３Ｅ７−ビーズ抗体及びＴ２−ＨＲＰ抗体を１：２の比率として、３０％及び１００％濃度の血漿とＴｒｉｃｉｎｅ(ｐＨ０．８)緩衝液を利用して、その他の実験方法は、前記実施例２と同様にして行った。図１１から分かるように、１００％濃度の血漿は、３０％濃度の血漿に比べ、さらに低い信号強度と分別力を示した。

また、３Ｅ７−ビーズ抗体及びＴ２−ＨＲＰ抗体を１：１の比率として、２０％及び２５％濃度の血漿とＴｒｉｃｉｎｅ(ｐＨ０．８)緩衝液を利用して、２０％及び２５％濃度の血漿の量は、それぞれ３００μｌ及び４００μｌである。その他の実験方法は、前記実施例２と同様にして行った。図１２から分かるように、２５％濃度の血漿は、２０％濃度の血漿に比べ、さらに高い信号強度と分別力を示した。

実施例VII：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰの検出
捕獲抗体としてＴ２−結合磁性ビーズ、検出抗体としてＭＡ１ ７５０−結合蛍光ラテックスビーズを利用し、二つの抗体の比率を２：１または４：１として本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを実施した。緩衝液としてはＴＢＳＴ(ｐＨ８．０)を利用して、血漿の濃度は、１５％であった。その他の過程は、前記実施例３と同様である。図８から分かるように、Ｔ２−ビーズ/ＭＡ１ ７５０−ビーズの比率が４：１の場合が、２：１の場合に比べ、Ｓｃ/Ｎ比率が大きくて、信号の強度も高かった。

実施例VIII：多様なデタージェント(detergent)の濃度及びタイプにおいて、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰの検出
デタージェントの濃度とタイプを多様にしながら、実施例２と同様な方法(デタージェントの条件を除いた)により、ＰｒＰ^Scが存在するとの臨床的所見を示す羊血漿試料に対してＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによりマルチマー形ＰｒＰを検出した。図９から分かるように、多様なトリトンＸ−１００の濃度(１％、１．５％及び２％)は、マルチマーＰｒＰに対してほぼ等しい検出度及び分別力を示した。また、結果の偏差が相対的に高いが、Ｎｐ−４０(ＵＳＢ社、米国)も相当な検出及び分別力を示した。Ｎｐ−４０は、非イオン性デタージェントの一つで、[オクチルフェノキシ]ポリエトキシエタノール([Octylphenoxy]polyethoxyethanol)を示す。

実施例IX：多様な洗浄緩衝液において、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰの検出
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、抗体重量比(３Ｅ７−ビーズ：Ｔ２−ＨＲＰ、１：２)と洗浄条件を除いては、実施例２と同様な方法により、洗浄緩衝液のタイプを多様にしてＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。図１０から分かるように、マルチマー形ＰｒＰは、ＰＢＳＴ(phosphate-buffered saline with Tween 20)、ＰＢＳＸ(phosphate-buffered saline with Triton X-100)及びＴＢＳＸ(tris-buffered saline with Triton X-100)と比較し、ＴＢＳＴ(tris-buffered saline with Tween 20)洗浄緩衝液において最も優れた検出度及び分別力を示した。

実施例X：ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形プリオンタンパク質の検出において、ＰＫ切断の影響
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、抗体比率(３Ｅ７−ビーズ：Ｔ２−ＨＲＰ、１：２)除いては、実施例２と同様な方法により、プロテアーゼＫ(ＰＫ)の切断有無と共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。図１３から分かるように、ＰＫ分解は、血漿試料においてＰｒＰ^Scに対する信号の強度を減少させる。これにより、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを利用して血液または血清試料からＰｒＰ^Scを検出するにおいて、プロテアーゼＫの切断過程は不要であることが分かった

実施例XI：多様な比率の抗体において、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内マルチマー形ＰｒＰの検出
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、実施例２と同様な方法により、抗体比率を多様にしてＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。３Ｅ７−ビーズ捕獲抗体とＴ２−ＨＲＰ検出抗体の質量比率を４：１、２：１、１．３３：１及び１：１として添加した。図１４ａから分かるように、二つの抗体を同じ量で添加した場合、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内ＰｒＰ^Sc検出において、最も優れた検出度及び分別力を示した。

実施例XII：多様な比率の抗体において、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによる血漿内ＰｒＰの検出
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、実施例３と同様な方法により、抗体比率を多様にしてＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを実施した。３Ｅ７−ビーズ捕獲抗体とＭＡＩ−７５０蛍光ビーズ検出抗体を４：１と２：１の質量比率で添加した。図１４ｂから分かるように、捕獲抗体及び検出抗体の量を２：１の比率で添加した場合、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによる血漿内ＰｒＰ^Sc検出において、最も優れた検出度及び分別力を示した。

実施例XIII：捕獲抗体カクテルと、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内ＰｒＰの検出
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、実施例２と同様な方法により、捕獲抗体カクテルと共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。捕獲抗体として、３Ｅ７−ビーズとＴ２−ビーズ抗体(図１５ａ)または３Ｅ７−ビーズとＭＡＩ−ビーズ(図１５ｂ)から構成された捕獲抗体カクテルが使用された。捕獲抗体カクテルと検出抗体、即ちＴ２−ＨＲＰの比率は、１：１とした。図１５ａと１５ｂから分かるように、捕獲抗体カクテルは、血漿内ＰｒＰ^Scに対して、優れた検出度及び分別力を示した。

実施例XIV：検出抗体カクテルと、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムによる血漿内ＰｒＰの検出
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、実施例２と同様な方法により、検出抗体カクテルを添加してＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。添加した抗体セットは、(ｉ)捕獲抗体として３Ｅ７−ｂｅａｄ及び検出抗体カクテルとしてＴ２−バイオチンとＭＡＩ−バイオチン、及び(ｉｉ)捕獲抗体としてＭＡＩ−ｂｅａｄ及び検出抗体カクテルとしてＴ２−バイオチンと３Ｅ７−バイオチンである。図１５ｃから分かるように、検出抗体カクテルは、血漿内ＰｒＰ^Scに対して、優れた検出度及び分別力を示した

実施例XV：同一な条件下でＭＤＳ及びＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムの検出力の比較
本発明者らは、マルチマーを形成するポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別的に検出する方法を既に開発し、これをマルチマー検出システム(Multimer Detection System：MDS)と命名して、ＰＣＴ出願した(PCT/KR2005/004001)。

信頼できる実験方法でＭＤＳとＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ ＢｅａｄシステムのＰｒＰ^Sc検出度及び分別力を比較するために、羊血漿内のマルチマー形ＰｒＰ^Scは、同一な実験条件下でそれぞれ検出された。３Ｅ７及びＴ７抗体が、捕獲抗体及び検出抗体としてそれぞれ利用された。

図１６から分かるように、本発明のＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムが、ＭＤＳに比べ、羊血漿内のＰｒＰ^Scに対してさらに高い敏感度及び分別力を示した。

実施例XVI：他の抗体セットの利用するＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに対する最適血漿濃度の決定
羊血漿試料に存在するマルチマー形ＰｒＰ^Scを検出するために、抗体セットタイプと血清濃度を除いては、実施例２と同様な方法によりＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施した。捕獲抗体としては、ＩＣＳＭ３５−バイオチンストレプトアビジンビーズ、検出抗体としては、１Ｅ４−ＨＲＰを利用して、羊血漿の濃度は２５％にした。ＩＣＳＭ３５抗体(Ｄ−Ｇｅｎ、英国)は、アミノ酸配列９６−１０５(羊プリオン基準)またはアミノ酸配列１０４−１１３(牛プリオン基準)に対応するエピトープを認識して、１Ｅ４抗体(Sanquin Reagents、オランダ)は、アミノ酸配列１００―１１１(羊プリオン基準)またはアミノ酸配列１０８−１１９(牛プリオン基準)に対応するエピトープを認識する。

図１７から分かるように、部分的にオーバーラップするエピトープを認識する抗体セットは、血漿内ＰｒＰ^Scに対して非常に優れた検出度及び分別力を示した。

以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

本発明の方法の具体的な一具現例であるＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄ(Multimer Detection System-3 Dimensional-Single Bead)システムの作動原理を示す概念図である。 本発明の方法の具体的な他の具現例であるＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムの作動原理を示す概念図である。 本発明の方法の具体的な他の具現例である、二重にラベリングされたＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムの作動原理を示す概念図である。 本発明により磁性ビーズ−捕獲抗体及び検出抗体を試料に同時に処理した場合(simultaneous)と別途に処理した場合(step-by-step)、マルチマー形プリオンタンパク質を検出した実験結果を示したグラフである。‘Ｎ’及び‘Ｓｃ’は、正常血漿及びＰｒＰ^Scが含有された血漿をそれぞれ意味し、‘ＲＬＵ’は、相対的光単位を意味する。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムに適した緩衝液を選別するための実験結果を示すグラフである。 図３ａの結果を、ＰｒＰ^Sc血漿試料の信号に対する正常血漿試料の信号の比で示したグラフである。 ３Ｅ７抗体及びＭＡ１７５０抗体を利用するＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムによる、血漿内マルチマー形プリオンタンパク質の検出結果を示したグラフである。‘ＲＬＵ’は、相対的蛍光単位を意味する。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムに適した緩衝液を選別するための実験結果を示したグラフである。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムにおいて、適した血漿試料濃度を選別するための実験結果を示したグラフである。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムにおいて、適した血漿試料濃度を選別するための実験結果を示したグラフである。 Ｔ２抗体及びＭＡ１ ７５０抗体を利用するＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出した結果を示したグラフである。 血漿試料の準備のために、デタージェント(detergent)の濃度及びタイプを多様にしながら、ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施して、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出した結果を示したグラフである。 血漿試料及び抗体と共に培養されたビーズを洗浄するために、多様な洗浄緩衝液と共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出した結果を示したグラフである。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、３０％及び１００％の血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出した結果を示したグラフである。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、２０％及び２５％の血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出した結果を示したグラフである。 ＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質を検出するにおいて、プロテアーゼＫの分解に対する結果を示すグラフである。 抗体の比率を多様にしながらＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内マルチマー形プリオンタンパク質の検出に対する分析結果を示すグラフである。 抗体の比率を多様にしながらＭＤＳ−３Ｄ−Ｄｕａｌ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内マルチマー形プリオンタンパク質の検出に対する分析結果を示すグラフである。 捕獲抗体カクテルと共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質の検出に対する分析結果を示すグラフである。 捕獲抗体カクテルと共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質の検出に対する分析結果を示すグラフである。 検出抗体カクテルと共にＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムを実施し、血漿内でマルチマー形プリオンタンパク質の検出に対する分析結果を示すグラフである。左側及び右側のバーは、(ｉ)捕獲抗体として３Ｅ７−ｂｅａｄ及び検出抗体カクテルとしてＴ２−バイオチン及びＭＡＩ−バイオチン(ｉｉ)捕獲抗体としてＭＡＩ−ｂｅａｄ及び検出抗体カクテルとしてＴ２−バイオチン及び３Ｅ７−バイオチンをそれぞれ示す。 ＭＤＳ及びＭＤＳ−３Ｄ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｅａｄシステムの検出力に対する比較結果を示すグラフである。

Claims (22)

1. (ａ)立体構造を有する固相のキャリアーの表面に捕獲抗体を３次元的に結合させて、キャリアー−捕獲抗体複合体を用意するステップであって、前記捕獲抗体は、前記マルチマー形成ポリペプチドの一つの特定エピトープに結合するステップと、
   (ｂ)検出抗体を用意するステップであって、前記検出抗体が認識するエピトープは、検出抗体がエピトープに結合した場合、前記捕獲抗体のエピトープに結合された捕獲抗体により立体的妨害を起す位置にあり、前記捕獲抗体のエピトープと検出抗体のエピトープのアミノ酸配列は、同一ではなくオーバーラップされるアミノ酸配列を有して、前記捕獲抗体が認識するポリペプチドのエピトープは、ポリペプチドにおいて反復しない配列であり、前記検出抗体が認識するポリペプチドのエピトープは、ポリペプチドにおいて反復しない配列であることを特徴とするステップと、
   (ｃ)生試料に前記キャリアー−捕獲抗体複合体及び検出抗体を同時に反応させるステップと、
   (ｄ)キャリアー−捕獲抗体−マルチマー形検出抗体複合体を検出するステップと、
   を含む、生試料内のマルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出する方法。
2. 前記検出抗体は、立体構造を有する固相のキャリアーの表面に３次元的に結合されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記マルチマー形成ポリペプチドは、Ａβペプチド、β−アミロイド(β−amyloid)、ｔａｕタンパク質、プリオン、α−シヌクレイン、Ｉｇ軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスチレチン、シスタチンＣ、β₂−マイクログロブリン、ハンチンチン(huntingtin)、抗酸化酵素(Superoxide dismutase)、セルピン(serpin)、またはアミリン(amylin)から構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記検出対象のマルチマー形成ポリペプチドは、プリオンタンパク質であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記モノマー形は、ＰｒＰ^Cであり、マルチマー形は、ＰｒＰ^Scであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記捕獲抗体が結合された固相のキャリアーは、磁性ビーズであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 前記検出抗体が結合された固相のキャリアーは、ラテックスビーズであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
8. 前記検出抗体には、検出可能な信号を生成させる標識が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 前記検出抗体及び/または検出抗体が結合された固相のキャリアーには、検出可能な信号を生成させる標識が結合されていることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
10. 前記ステップ(ｄ)は、前記ポリペプチドのマルチマー形に結合された検出抗体の標識から出る信号を測定して行われることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 前記ステップ(ｄ)は、前記ポリペプチドのマルチマー形に結合された検出抗体−キャリアーの標識から出る信号を測定して行われることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
12. 前記検出抗体に結合された標識は、化学物質、酵素、放射能物質、蛍光物質、発光物質、化学発光物質、またはＦＲＥＴ標識であることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
13. 前記生試料は、脳均質液または血液であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
14. 前記生試料は、血液であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記血液試料は、血漿であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記生試料が脳均質液である場合、前記方法は、生試料をプロテアーゼＫまたはトリプシンで前処理するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ステップ(ｃ)において、捕獲抗体と検出抗体は、モル比２：１〜１：２で添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
18. (ａ)立体構造を有する固相のキャリアーの表面に３次元的に結合されており、前記マルチマー形成ポリペプチドの一つの特定エピトープに結合する捕獲抗体と、
    (ｂ)前記捕獲抗体のエピトープに結合された捕獲抗体により立体的妨害を起す位置にあるエピトープを認識する検出抗体とを含み、
    前記捕獲抗体のエピトープと検出抗体のエピトープのアミノ酸配列は、同一ではなくオーバーラップされるアミノ酸配列を有し、
    前記捕獲抗体が認識するポリペプチドのエピトープは、ポリペプチドにおいて反復しない配列であり、
    前記検出抗体が認識するポリペプチドのエピトープは、ポリペプチドにおいて反復しない配列であることを特徴とする、生試料内のマルチマー形成ポリペプチドのモノマー形からマルチマー形を分別検出するためのキット。
19. 前記検出抗体は、立体構造を有する固相のキャリアーの表面に３次元的に結合されたことを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
20. 前記マルチマー形成ポリペプチドは、Ａβペプチド、β−アミロイド(β−amyloid)、ｔａｕタンパク質、プリオン、α−シヌクレイン、Ｉｇ軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスチレチン、シスタチンＣ、β₂−マイクログロブリン、ハンチンチン(huntingtin)、抗酸化酵素(Superoxide dismutase)、セルピン(serpin)、またはアミリン(amylin)から構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
21. 前記検出対象のマルチマー形成ポリペプチドは、プリオンタンパク質であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
22. 前記モノマー形は、ＰｒＰ^Cであり、マルチマー形は、ＰｒＰ^Scであることを特徴とする、請求項２１に記載のキット。

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