JPS6034997A - 生物学的活性ポリペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的活性ポリペプチド類及びそれらの天
然或いは合成の源が５の製造、該ポリペプチド類から誘
導されるオリゴペプチド類、及び該ポリペプチド類及び
それらから誘導されるオリゴペプチド類に伴う生物学的
活性を健康科学分野に有用に適用するだめの組成物及び
方法に関する。

より詳細には、本発明は、細胞成長促進活性を有する蛋
白質を規定する一般的ポリベグチドＶ４造、及び形質転
換された表現型を１ｎ　ｖＨｒｏで正割細胞に可逆的に
与える性質な有し、従って悪性表現型（プエノタイプフ
の近接エフェクター（ρｒｏＸ１ｍａｔｅｅｆｆｅｃｔ
ｏｒｓ）であると思われる新規種類の形質転換成長因子
（ＴＧＦ）ポリペプチド類に向けられたものである。も
う一つの特別な側面において１本発明は、このＴＣＦ　
ｒ］＝リペプチド類から誘導された抗原性オリゴペプチ
ド類、及びこの抗原性オリゴペプチド類及び関連（ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｄ　）　ＴＧＦポリペプチド類に対して
産生され、かつ悪性の検出及び治療において有用な抗体
に向けられたものである。更に特別な側面において、本
発明瞥工、細胞成長因子リセゾターに結合する能力な有
し、従って潜在的にある種の細胞系統の癌状態への形質
転換を妨害する能力な有するある種のオリゴペプチド類
に向けられたものである。更に特別の側面において、本
発明は、形質転換されたヒト及びネズミ（ｍｕｒｉｎｅ
）の細胞系統及び体液の両者から均質な形態においテＴ
ＧＦ　ｓｅソリペプチド類単離する方法、並びにその様
にして得られた均質ＴＧＦポリペプチド類に向けられた
ものである。本発明のその他の特別の側面は、癌その他
の増殖性の病気の検出及び治療、並びにａ胞成長関連治
療、例えば鰻の治療及び潰瘍の治療など、のための組成
物及び方法に向けろれたものである。

数多くのポリペプチドホルモン及びホルモン球成長因子
が組織流体中に見出されており、それらの正常な細胞成
長或いは有糸分裂の制御における関係が確立されている
。これらの有糸分裂促進ポリペプチド成長因子としては
、インシュリン、インシュリン様成長因子、血小板由来
成長因子、神経成長因子、繊維芽細胞成長因子及び表皮
成長因子（ＥＧＦ）などが挙げられる。少なくともこれ
らの公知の成長因子の幾つかは形質転換細胞の成長に影
響を及ぼすが、しかし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験に基づけ
ば、形質転換細胞は正常細胞よりも最適成長及び増殖の
ためにこれらの公知の成長因子の要求がより少なめよう
にみしれる。特に、細胞培養における実験においては、
インシュリン及びＥＧＦ１７）、Ｊ：うな外因性成長因
子の添加は正常細胞に形質転換と類似の細胞特性におけ
るある種の変化な模倣せしめることが可能であることが
示されてＶ）る。しかしながら、それらは形質転換され
た表現型に伴うあらゆる変化をもたらすこと＆１不可能
である。

例えばスポーン等（５ｐｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８１）　ＴｈｅＮｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ
、　Ｎｏ、　１５、ｐｐ−８７８−８８０）参照。

最近、明らかに表現型形質転換に本質的である特性のよ
り大きな補体な有し、かつ形質転換成長因子、即ちＴＧ
Ｆと呼ばれる新種のポリペプチド成長因子があるｆｉｌ
ｌのヒト及び動物の癌及び内陣細胞内に見出されている
［　Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）Ｐｒ
ＯＣ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、ＳＣｉ、１ＪＳＡ、　７７
、ｐｐ、　３４９４−３４９８及びＴｏｄａｒｏ　ｅｔ
　ａｌ、　（１９ｇ　Ｑ　）　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、ｐｐ、　５２５８
−５２６２　］。これらのＴＧＦポリペプチド類は、一
つのクラスとして、それらが培養液中で成長する非−形
質転換、非−新生物指示細胞に適用された際に起こす変
化により％機付けられている。これらの変化としては。

ａ）単層培′Ｉｔにおける細胞成長の密度−依存性阻止
の喪失、ｂ）単層培養における細胞の過剰成長。

り指示細胞が新生物表現型をとる結果な伴う細胞形状に
おける変化、及びｄ）軟質寒天内での成長能力が得られ
る固定−非依存性の獲得、などがバまれる。培養液内で
の細胞の固定−非依存性成長のこの性質は１ｎｖｉｖｏ
！７Ｃおゆる新生物成長と特に高い関連性な有する。少
なくともある稲のＴＧＦポリペプチド類は、それらのＥ
ＧＦとの関連性を、それらが共に還元剤及びプロテアー
ゼ類に対して敏感な熱安定性、酸安定性ペプチド類であ
ること、及びそれらが細胞膜ＥＧＦ　リセプターと特異
的に、ｌ［万作用し、生物学的効果を生成するようであ
り、ＴＧＦは細胞ＥＧＦリセプターとの結合に対しＥＧ
Ｆと競合する点において幾つか示している。しかし、な
がう、ＴＧＦは幾つかの重要な点にｆ、ｉいてＥＧＦと
区別することができる。特に、ＥＧＦは培養液中におい
て細胞の固定−非依存性成長を誘発せず、又ＥＧＦに対
する抗体はラジオイム／アッセイ或いは免疫沈降試験の
いずれにおいてもＴＧＦを検出しない。丈に、ＥＧＦは
培養細胞の表現型に対して僅かな影響？及ぼすのに過ぎ
ないのに対し、　ＴＧＦは培養細胞内により、顎著な表
現型変化？もたらし、それらに形質転換細胞として挙動
する能力を伺与する。興味深いことに、ＴＧＦによりも
たらされる形質転換は、永久的なものではなく、ＴＧＦ
の不存在下において可逆的であり、　ＴＧＦが完全な発
癌物質そのものであるとして作用するとの証拠は存在し
ていなりｓ　［７ｏｄａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
１〕Ｊ、　ｏｆ　Ｓｕｐｒａｍ−ｏｌｅｃｕｌａｒ　５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　１５　ｐｐ、　２８７−３０１］。

この様に、ＴＧＦポリペプチド類は生物学的性質及び化
学構造の両者の見地からＥＧＦなどのその他の成長因子
とは区別可能な独特の蛋白質の種類である。これらのＴ
ＧＦ類は又強力であるがしかし可逆的な細胞成長な合む
健康科学分野におＶ）で価値のある、或いは潜在的価値
のある各種の性質、或いは例えば傷の治ｆＭ、或いは潰
瘍の治療などなよむ細胞修復に用途を見い出す有糸分裂
促進特性な有する。更に、ＴＧＦポリペゾチド類の製造
、或Ｖ１は高められた水準の製造は、ヒト及びネズミの
組織及び／又は体液の両者における成る種の細胞系統の
形態学的形質転換に本質的なものではないにせよ、特徴
的なものである。従って、ＴＧＦポリペプチド類あるい
はその抗原性フラグメントは正常細胞な＠蛎細胞かう区
別−イーる際に有用であり、それらに対して産生された
抗体は悪性の診断及び治療の両者において有用である。

更に、ある（■のＴＧＦポリペプチド類が細胞膜ＥＧＦ
リセゾターと４’ａ異的に相互作用し、それな介してそ
れらの生物学的効果なもたらすことが実現されれば、一
度基本的ＴＧＦポリペプチド構造が決定されるならば、
その構造’ｋ　ＥＧＦの構造と関連付は細胞の表９６型
形賀転換を行うことなく、ＩＧＦリセブターへの結合を
５」能にする化学的特性を有するオリザペグチドの開発
が可能となる。この特性的ＥＧＦ　Ｉ７セゾター結合能
力を有するオリゴペゾテド類は、オリゴペプチドが、利
用可能なりセプタ一部位に関してＴＧＦを妨害或いは、
−れと競合することによりに（■胞の形質転換された性
質の発現を妨害するので、悪性の治療において用途を有
するものである。

本発明によれば、ＴＧＦポリペゾチド類な十分な量及び
純度で得、完全な構造決定を可能にする方法が開発され
、この決定及びその他の観察、例えばヒト及びネズミＴ
ＧＦ間の実質的類似性の発見１工どを含む観察、の結果
、細胞有糸分裂及び細胞成長関連分野の用途に広範な用
途な有する基本ペプチド構造が見出された。更に、細胞
成長分野及び癌及びその他り増殖性病気の検出及び治療
における用途？有する均質なＴＧＦポリペプチド類が得
られる。更に、抗原性オリゴペプチド類及び細胞成長因
子リセゾターに結合する能力を有するオリゴペプチド類
がこの基本ペプチド構造及び決定されたＴＧＦポリペプ
チド構造から得られる。最後に、このＴＧＦポリペゾチ
ド類及びそれから得られた抗原性オリゴペプチド類に対
して産生された抗体をａむ組成物及び方法が健康科学分
野用に提供されろ。

マルカルト及びトダａ　［Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　ａｎｄ
　Ｔｏｄａｒｏ。

Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ−（１９８２）　Ｖｏ
ｌ、　２５７、Ｎｏ、　９　、　ｐｐ。

５２２０−５２２５　（１９８２年５月１０日発行）〕
は、ヒト転移黒色腫腫瘍系統により条件付けられた無血
清培地からの低分子慕ヒ）　ＴＧＦの単離な一連の工程
、即ち１Ｍ酢酸中での抽出及びこれに引続く先ずアセト
ニトリル溶媒で溶出した後１−プロパツールで溶出な行
う逆相高圧液体クロマトグラフでの精製により特徴的Ｔ
ＧＦ’ｌＥ物学的活性例えば固定−非依存性細胞成長の
訴発を有する精製したＴＧＦを得る方法を記載している
。トワルチツク等［Ｔｗａｒｄｚｉｋ　ｅｔ　ａｌ、　
５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８２）　Ｖｏｌ、　２１６、ｐ
ｐ。

８９４−８９７（１９８２年５月２１日発行）〕はウィ
ルス形質転換されたラット細胞からＴＧＦ　を精製する
同一の精製方法の使用を報告している。この精製物質の
細胞培養液における生物学的活性も又示されている。／
ｅイク等［Ｐｉｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ−ｏｆ　Ｂｉｏ
、　Ｃｈｅｍ。

（１９８２）Ｖｏｌ、２５７、ＮＯ，２４、ｒ）ｐ、　
１４６２８−１４６３１（１９８２年１２月５日発行）
〕は部分的に精製されたラット及びヒトのＴＧＦはいず
れもヒト凍傷細胞膜における蛋白質キナーゼを活性化す
る能力な有し、従って合成チロノン浮有ペプチドのホス
ホリル化を刺戟する能力な有することを開示している。

これまでにこの活性？有することが記載されている唯一
のその他の分子はＥＧＦ、イン／ニリン及び血小板由来
成長因子であり、それらの全てはヒト及び動物における
重要な生理学的機能な有するものと思われている。その
他の参考文献は上記文献に挙げられている。

新規種類の生物学的活性分子を規定する基本的蛋白質構
造が今や見出された。生物学的活性ｔ。

特に細胞成長促進分野において与えるこの基本禍“造ポ
リペゾチドの知見は、複数のジスルフィド結合な含有す
るＴＧＦ　ｋ含むある種のポリペプチド類の三次元構造
と、該ポリペプチド類に帰することのできる生物学的活
性の間には特定の相関関係があるとの発見に基づくもの
である。従って、その最も広い側面の一つにおいて本発
明は、下記一般式Ｉで表わされる少なくとも１イ固のペ
プチド配列な溶存する生物学的活性ポリペプチドに向け
られたものであるニ ーＣｙｓ−（ＡＡ）、−ＣｙＳ−（ＡＡ）ｂ−ＣｙＳ−
（ＡＡＪ。−ＣｙＳ−ＡＡ−ＣｙＳ−（ＡＡ）ｄ−Ｌ：
ｙＳ−１（式中、ＡＡはＶａｔ％Ｓｅｒ、ｌ１ｉｓ、　
Ｐｈｅ、　Ａｓｏ、Ｌｙｓ、　Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ
、　Ａｒｇ、　Ｌｅｕ％Ｇｌｕ、　ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇ
ｌｙ、　ＴｒｐＡびＴｙｒ、より追（丁れたアミノ酸残
基であり％ａは７％ｂは４又は５であり、Ｃは１０であ
り、及びｄは８である）。又、式Ｉに従った化合物には
記載されたアミノ酸残基の他にｂが４であり、ＡＡが工
１ｅｆＲ，ｖｓはＭｅｔである化合（グも含まれる。

本発明のもう一つの側面は、下記一般式■で表わされる
化合物或いはそのオリゴマー′ｊＡｔ含む形質転換成長
因子特性す封１−る特別の種類のポリペプチド類に向け
られたものである： Ｖａ　Ｉ　−ｖａ　１−８ｅ　ｒ−Ｈｉ　ｓ−ｐｈｅ−
Ａｓｎ−Ｒ−Ｃｙ　５−Ｐｈｃ−ＩＩｉ　５−Ｇｌ　ｙ
−Ｔｂ　ｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｒ’　−Ｌｅｕ−ｖａｌ
−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−ＧｌｕＪＩｉ　５−Ａｌａ−ＡＳｐ
−Ｌｌ！ｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ （式中、ＲはＡＳｐ又はＬｙＳ％Ｒ’はＰｈｅ又はＴ　
Ｙ’ｓｕ’＋５ｓｅｒ又はＰｈｅ　、及びＲ１１ｌはＰ
ｂｅ又はＴｙｒであるへ又１本発明の範囲内には一般式
Ｈのボリベツチド類から得られた抗原性オリゴペプチド
類もバまれる。

更に１本発明の側面は下記ベゾテドフラグメント類の１
以上を含有するポリペプチド成長因子に関するものであ
る： Ａ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−ｐｈｅ−４ｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｈｉ　５
−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉ５
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＢ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−
Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ−Ｑｌｎ−Ｐｈｅ−
Ｃｙｓ−Ｐｂｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｖ−Ｔｂｒ−ＣｙｓＣ，
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅ
ｒ−Ｇｌｙ、及びＤ＋Ｃｖｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−
Ｇｂ＋−Ｈｉ　ｓ−、Ａｌ　ａ−ＡＳｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ 本発明の更に又別の側面は細胞成長因子リセプターに結
合する能力を有し、従って悪性の治療における潜在的有
用性？有するクラスのオリゴペプチド類に向けられたも
のである。このクラスのオリゴペプチド類は、適当な三
次元第１４造における有意義なアミノ酸配列の相同？示
し、かつ細胞成長リセゾタ一部位に結合する能力を有す
るより大きなポリペプチド分子における鍵配列の発見に
基づくものである。従って、本発明のこの側面は下記一
般式■な有するオリゴペプチド類を提供するものである
： （ＡＡＪｘ−ＣｙＳ−（ＡＡ）、−Ｇｌｙ−Ｒ−（ＡＡ
）２−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−（ＡＡＪ２＋　ｕｉ （式中Ｒはｐｈｅ又はＴｙｒであり、及びＡＡはＶａｌ
。

Ａｓｎ１ｌＨｉｓ、　Ｓｅｒ、　ＶａｌｌｌｌｅＩＩＧ
ｌｙｌＩＬｅｕ、　Ａｓｐ。

Ａｓｎ％Ｃｙｓ、　’ｒｂｒ％Ａｌａ、　Ｔｙ’１１ｐ
ｒｏ％Ｇｌｕ、　Ｇｌｕ及びＡｒｇより選ばれたアミノ
酸残基であり、Ｘは０又は１〜５の整数、ｙは２．２は
３及びＺ′は０又は１〜６の整数である〕。

又、本発明により上記ポリペプチド及びオリゴペプチド
構造な使用して一般式■のポリペプチド類及びそれらか
ら得られる抗原性オリゴペプチドに対する抗体を含む生
物学的活性組成物及び方法が提供され、該抗体は、診断
方法に使用するための検知ｔ＋Ｊ能１．ｃ信号を与える
ことのできるラベル或いは癌或いは増殖性病気の治療に
使用するための細胞毒物質で任意に標識化することがで
きる。本発明のポリペプチド類の細胞成長促進特性を利
用するその他の組成物及び方法も本発明の一部な形成す
るものである。

本発明の最後の側面は、均質な形質転換成長因子ポリペ
プチド類を単離するに当り、該ポリペプチド類？誹有す
るより純度の低い水性溶液例えば体液及び形質転換成長
因子生成細胞系統で条件付けられた水性培地などから単
離する方法並びにそれにより製造された均質な形質転換
成長因子ポリペプチド類及び該均質ポリペプチド類に対
して産生された抗体をａむものである。その最も広い側
面において、本発明の方法は、均質な形質転換成長因子
ポリペプチドな不純な彫りで該形質転換成長因子ポリペ
プチドを含有する水性培地から単離する方法であって、
下記工程を含んでなることな特徴とする方法である： （１）形質転換成長因子を不純な形傳で含有する水性培
地を、酢酸水溶液に対して透析を行Ｖ）、ノ杉質転換成
長因子ポリペプチドなぎ有する溶媒相な与え、この相を
濃縮し、及び任意に清田二化させる工程、 （２）工程＋１１の譲縮溶謀相を酢酸水ｆ６液で１１＋
ｉ＋１）成（復元）し、酢酸水溶液で調整したゲル透過
クロマトグラフィーカラムに復元浴液を適ＪＩシ、酢酸
水溶液で射出することにより復元ｄ液のゲル透過クロマ
トグラフィーを行って、形質転換成長因子ポリペプチド
を冒められた純度の状部で含有する選択された溶出液自
分を得、該選１く画分を合一し、濃縮して部分的に１１
′Ｊ製された形質転換成長因子ボ”リペブテドａ有生成
物を弓える工程、及び （３）工程（２）の部分的にｖ４ｖされた形′Ｒ転換成
長因子ポリペプチドき有生成物を、該生成物乞トリフル
オロ酢！没水溶液中で復元後にトリフルオロ酢酸水浴液
で平衡化させである１以上の炭化水素結合ノリカマトリ
ックスカラムに通して高圧液体クロマトグラフィー条件
下において逐次逆相高圧クロマトグラフィーに付するに
除し、最初のカラム浴出をトリフルオロ酢酸水ｔｄ液中
で１１録形アセトニトリル勾配？用いて行い、及び矢の
最初の高圧クロマトグラフィ一工程で得られた合一され
た形質転換成長因子ポリペプチド度有画分について行わ
れるカラム浴出をトリフルオロ酢酸水溶液中でω形１−
ゾロパノール勾配を用いて行い、該ｌ−グロ・ξノール
勾配は十分に小さいｌ−プロノミノール濃度増加分にて
増大せしめ、形質転換成長因子ポリペプチドを均質ポリ
ペプチド状態の単一の明確なピークとして与えるように
して行う工程。

本発明による基本蛋白質構造なＩ侍機付けるペプチド配
列はポリペプチド構造における１行別の位置に位置する
６個の７ステイン残苓をきむものである。ノステイン残
基の配置は、対の７ステイン間のジスルフィド架橋の結
果ポリペプチドｋｌ）＋別の様態で折りたたむことを可
能にし、従って得られた蛋白質の生物学的活性に寄与す
る三次元構造を示すものと思われる。ある特別のジスル
フィド架橋配列を示唆する証拠があり、この配列におい
ては（上記式ＩにおけるＣｙＳ残基の番号１〜６は左か
ら右に向うものである）ジスルフィド結合により基本蛋
白質構造の生物学的活性形聾においてＣｙｓ−１はＣｙ
ｓ−３に結合され、Ｃｙｓ−２はｃｙｓ−４に結合され
、及びＣｙｓ−５はＣｙｓ−６に結合されている。式■
におけるＣｙｓ残基間に存在するアミノ酸配列に記載さ
れるアミノ酸残基の正確な化学的性質は、式Ｉについて
記載された群から選ばれた少なくとも１０個の異ったア
ミノ酸が使用され、任意の配列において如何なるアミノ
酸も連続して３回よりも多く繰り返されない限り、特別
に重要であるものとは思われない。式ｌについて挙げた
アミノ酸残基のうちＶａｌ、Ｓｅｒ、　Ｈｉｓ、　Ｐｈ
ｅ、　Ｌｙｓ、Ａｓｐ、　Ｔｈｒ、　Ｇｌｎ％Ｌｅｕ、
　ＧｌｕｌｌｐｒｏｌＩＡｌａ及びＧｌｙが好ましい。

少なくとも１個の一般式Ｉのペプチド配列を有する生物
学的活性ポリペプチドの好ましい群は下記一般式■で表
わされるポリペプチド類及びそのオリゴマー類である： （ＡＡ）、１−Ｃｙｓ−（ＡＡ）、ｎ−Ｃｙｓ−（ＡＡ
）。−Ｃｙｓ−（ＡＡ）、−ＣｙＳ−ＡＡ−ＣｙＳ−（
ＡＡ）ｑ−ＣｙＳ−（ＡＡ）ｒＩＶ（式中、ＡＡはＶａ
１％Ｓｅｒ、　Ｈｉｓ％Ｐｈｅ、　Ａｓｎ。

Ｌｙｓ％Ａｓｐ％Ｔｈｒ、　Ｇｉｎ、　Ａｒｇ、　Ｌｅ
ｕ、　Ｇｌｕ、　ｐｒｏ。

Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｔｒｐ及びＴｙｒより選ばれたア
ミノ酸残基であり、ｎは４〜１０の整数、ｍは７．０は
４又は５、ｐは１０、ｑは８及びｒは６〜１２の整数で
あるン。この好ましい群におＶｌては更に０が４であり
、ｎ及びｒが７である。７リペゾチド類或いはそのオリ
ゴマー類が好ましい。この好ましい群において、一般式
ＩＶについて上記したアミノ酸残基の他にＡＡにより示
されたアミノ酸残基は又ｌｉｅ及び／又はＭｅｔであり
得る。最も好ましＶｌものは、Ｃｙｓ残基間に存在する
配列におけるアミノ酸残基がＭａｌ、ＢｅｒｌＩＨｉｓ
、　Ｐｈｅ、　Ｌｙｓ％Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｉｎ、　Ｌ
ｅｕ、　Ｇｌｕ、　Ｐｒｏ、Ａｌａ及びＧｌｙから選ば
れたポリペプチド類である。典型的には、式■及び■で
表わされるポリペプチド類は約５．０００〜約３５　、
０００の分子量を有する。この点において、好ましいポ
リペプチド類は５，０００〜ｓ　、　ｏｏｏの範囲の分
子量を有する。

上記の如く１本発明は又下記一般式（上記一般式■）に
表わされる新規クラスのＴＧＦポリペゾテド類及びその
オリゴマー類を包含するものである：Ｖａｌ−Ｖａｌ−
８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｌｉｅ−Ａｓｎ−Ｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｈｉ　５−Ｇｌｙ−Ｔｈ　ｒ−ＣｙＳ−Ａｒｇ−Ｒ
’　−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−４
（ｉ　５−Ａｌ　ａ−ＡＳｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ （式中、ＲはＡｓｐ又はＬｙＳ、　Ｉｔ’はＰｈｅ又は
Ｔ　Ｖ　’　ｓＲ′はＳｅｒ又はｐｈｅ　、及びＲ＃′
はＰｈｅ又はＴｙｒである）。この新規クラスのぼりペ
プチド類は、各種哺乳動物種（ネズミ及びヒトの両者）
から得られたある種のＴＧＦはペプチド配列のアミノ酸
構成において実質的な相同（配列の９０％を越える部分
が同−）並びに実質的に同一な生物学的性質を有すると
いう知見から得られたものである。特に、上式に従った
ＴＧＦポリペプチド類は、培勅液中で生育される未形質
転換、非−新生物指示細胞に適用された揚台に単層培養
中において細胞成長の密度−依存阻止の喪失、単層培養
における過剰成長、細胞形態における特性的変化、及び
固定−非依存性成長の獲得を引き起こす。細胞形質転換
の強力な１１４１１胞成長プロモーター及びエフェクタ
ーであることに加えて、上式に従ったＴＧＦポリペゾチ
ド類は、細胞ＥＧＦリセプターに結合するに対してＥＧ
Ｆと競合し、ヒト腫瘍細胞膜内において酵先即ち蛋白質
キナーゼを活性化する能力も有する。上記式■の好まし
いＴＧＦポリペゾチド類はＲがＡｓｐ、　Ｒ’がＰｈｅ
、　Ｒ’がＳｅｒ、及びＲ“′がｐｂ６であるもの、或
いはＲがＬｙＳ、　Ｒ’はＴＹ’ｂ　Ｒ’はｐｈｅ、及
びＲ″′はＴｙｒであるものを含む。印、下により詳細
に説明する如く、これらのＴＧＦポリペゾテド類は、本
発明の単離方法を用いて或いは通常のポリペプチドを合
成するための合成或いは組換え手段により適宜各種の形
質転換されたヒト及びネズミ細胞系統、ある種の胚細胞
系統及び１厘瘍−保有動物の体液から得ることができる
。式■のＴＧＦポリペグテド類及びそのオリゴマー類の
分子量は典型的には約５．０００〜約３５　、０００の
範囲にある。これに関して、好ましいＴＧＦポリペプチ
ド類は約５　、０００〜８　、０００の分子量を有する
。

上記式■の新規クラスのＴＧＦポリペツチド類の実質的
ペグチド配列の相同及びそれらに伺随する生物学的性質
の共通性の認識は、本発明の範囲に詮まれる更に別のポ
リペプチド成長因子の定義を可能にする。これらのポリ
ペプチド成長因子は下記ペプチドフラグメントの１以上
を含有するものと定義される： Ａ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｌｉｅ−Ａｓ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−８ｅｔ−１（ｉ
　５−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＢ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８
ｅｒ−１（ｉｓ−Ｐｌｉｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−
ＰｒＯ−ＡＳｐ−Ｓｅ　ｒ−Ｈｉ　ｓ−’ｒｈｒ−Ｇｌ
　ｏ−Ｐｌｉｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈ４５−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−ＣｙｓＣ，Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙ
ｓ−Ｈｒｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ、およびり、Ｃｙｓ−Ｈｉ
ｓ−８ｅｒ−ＧＪｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＧＪｙ−Ｖａｌ
−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈ４５−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ この点に関して、好ましいポリペプチド類は、ペプチド
フラグメン）Ａ及びＣの組合せをき有するポリペプチド
類及びペプチドフラグメン）Ｂ及びＣの組合せを滑有す
るポリペプチド類を３−むものである。ノｄも好ましい
ものは、７ラグメントＢ、Ｃ及びＤをぎ有するポリペプ
チド類である。ここテモ又、１１３上のペプチドフラグ
メン）Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをき有するポリペプチド成長因
子は通常約１．０００〜約３５，０００の範囲の分子量
を有するものであケ、好ましくは１，０００〜ｓ、ｏｏ
ｏの分子量を有するものである。この分子呈範囲の下限
は、特性的な成長因子生物学的活性を有する完全ポリペ
プチド類としての上記の！時定なペプチドフラグメント
そのものをよむものである。

先に述べた如く１本発明のＴＧＦポリペプチド類は、Ｔ
ＧＦポリヘゾチド類の生成及び／又は高められた水準の
生成はある種のヒト及びネズミ細胞系統の形態的形質転
換に特徴的なものであるので、哺乳動物における悪性の
検出に価値のあるものである＝これに関して、ＴＧＦポ
リペプチド類に関する抗体はそれらが呻瘍細胞或いは体
液内に存在する極めて少量のＴＧＦポリペプチドを検出
することに使用することができるので悪性の診断に有用
である。全ＴＧＦポリペプチド分子を使用して抗体（ポ
リクローナル及びモノクローナルの両者〕を発生するこ
とが可能であるが、又、コスト及び技術的努力の見地か
らＴＧＦ、ｉεリペゾチド配列内に決定部位と思われる
各種領域を決定し、少なくとも約８個のアミノ酸、典型
的には約１０〜約２０以下のアミノ酸を有するこれらの
オリゴペプチド類を使用して抗体形成を誘発することに
使用し得るハプテン（ｈａｐｔｅｎ　）を規定すること
が１ｌｉＪ能であり、又、有用である。更にμ下に述べ
る如く、このオリゴペプチドは適当な免疫原に結合され
、を椎動物中に導入されて所望の抗体を産生ずる。従っ
て、本発明は、ＴＧＦポリペゾテド類における抗原領域
に対応する一連のオリゴペプチド類を提供するものでも
ある。本発明に従って抗体を生成するために有用な抗原
性オリゴペプチド類の具体例を以下に示す。

Ａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｂｅ−Ａｓｎ
−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｈｉ　５−Ｔｈｒ Ｂ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−ｐｈｅ−Ａｓｎ
−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｈｌ　５−Ｔｈｒ Ｃ−Ａｒｇ−Ｐｉｒｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−４１ａ Ｄ＋Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
−ＧＩｕ−Ｌｙｓ−ＰｒＯ＝ＡＩａ Ｅ、Ｃｙｓ−Ｈ＋ｓ−８ｅｒ−Ｇｌ５−８ｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒ　ｕ−Ｈｉｓ
−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ Ｆ、ＣｙＳ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｈｉ　
５−ＡＩ　Ｘ＋−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ 本発明のもう一つの組成物的側面は、悪性の治療におい
て治療的価値を有するオリ！ペゾテド知のクラスに向け
られたものである。これらのオリゴペプチド類は、細胞
の表現型的形質転換を生ずることなく細胞成長因子リセ
プターに結合する能力を有するので、それらは細胞上の
利用可能なリセプター部位に対して有効にＴＧＦポリペ
プチド類と競合し、細胞リセプターに結合するＴＧＦに
特徴的な細胞形質転換を妨害或いは最少にすることかで
きる。細胞リセゾターに結合する能力を有する本発明の
オリゴペプチド類は下記一般式（上記一般式■）で表わ
される： （ＡＩ）　−ｃｙｓ−（ｈｈ）　−ｃｌｙ−ｒｔ−（Ａ
Ａ）　−Ｘ　ｙ　２ Ａｒｇ−ＣｙＳ−（ＡＡ）Ｚｒ （式中、ＲはＰｈｅ又はＴｙｒ及びＡＡはＶａｔ、　Ａ
ｓｎ、）１ｆｓｌＩＳｅｒ、　Ｌｙｅ、　ｌｌｅｌｌＱ
ｌｙ％Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ａｓｎ。

ＣｙｓＩＩＴｈｒ、　Ａｌａ、　Ｔｙｒ、　Ｐｒｏ、Ｇ
ｌｕ、　Ｇｌｎ、及びＡｒｇより選ばれたアミノ酸残基
であり、ＸはＯ又は１〜６の１震笈、ｙは２．２は３及
び２′は０又は１〜６の整数である）。

上記式による好ましｈオリゴペプチド類はＸ及び２′が
０であり、ＡＡがＶａｌ、　）ｆｉｓ、　Ｓｅｒ％Ｉｌ
ｅ、Ｇｌｙ及びＡＳｐから選ばれたアミノ酸残基である
ものが挙げられる。式■の化合物に関連する生物学的活
性オリゴペプチド類の好ましい群は、更に２つのグリノ
ン残基を詮有するものであり、下記の一般式の配列を与
えるものである： （ＡＡ）Ｘ−ＣｙＳ−（ＡＡＪ２−ＧＬＹ−（ＡＡ）２
−Ｇｌｙ−（ＡＡ）２−ＣｙＳ−（ＡＡ）２Ｉ （式中、ＡＡにより表わされるアミノ酸残基は弐１１１
１Ｃついて述べたものと同一であるが、ＰｈｅをＪむも
のであり、伶字Ｘ及び２′は上記式■に！６けると同義
である）。これらのオリゴにゾチド−１は、２個の７ス
テイン間を架橋するジスルフィドに・１・；ｉすること
のできる共通の三次元構造をとイ）と思われる。このジ
スルフィド架橋がこれらのオリゴペプチド類の生物学的
活性形聾を′ｒンυノ付けるものである。これに関して
、特に好ましいオリゴペプチド類は次のクラスより選ば
れる： １、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ及び ２、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ 上記構造式（式Ｉ−ＩＶ）及びペプチド配列により規定
される本発明によるポリペプチド類及びオリゴペプチド
類は合成技術、ペプチドが自然発生源即ち細胞系統及び
体液から単離される技術、及び・・イブリッドＤＮＡ技
術を用いる技術により調製することができる。約５０個
までのアミノ酸残基なき有する本発明のポリペプチド類
及びオリゴペプチド類については、通常の同相ペプチド
合成を使用するのが適当である。例えば、米国特許第４
．３４１，７６１号明細摺に記載されているこの一般的
ペプチド合成方法において（ｉ、公知の！Ｍ鎖保護基及
び通？孔のポリスチレンＩｉ（１ｌｉｒ支持１本−例え
ばクロ０メチル化１ｆｆ（ｌ１ｉｉ、ヒドロキシメチル
＋６．ＪハＩ７或いはベンズヒドリルアミン樹脂−など
が用いられてアミノ酸カップリングを行っている。約５
０飼のアミノ酸残基を越えるポリペプチド類については
、以下に詳説される自然源から均質ＴＧＦを単離する本
発明による方法を用いて目的ペプチドの純粋な形態を得
るのが適当である。これに関して、本発明によるＴＧＦ
ポリペプチド類の特に適当な詠は、レトロライ／Ｌ／　
（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　）−形質転換ｐｉｓｃｂｅｒ
ラット胚繊維芽細胞で、特に５ｎｙｄｅｒ−Ｔｈｅｉｌ
ｅｎネコ肉腫ウィルスで形質転換された繊維芽細胞、Ｍ
ｏ１ｏｎｅｙネズミ肉腫ウィルス−形質転換マウス３Ｔ
３細胞及びヒト転移黒色腫細胞系統Ａ２０５Ｂ及びＡ３
７５により条件付けられた無血清培地が挙げられる。適
白なネズミ剖胞系統についての源及び方法は、デラルコ
等［ＤｅＬａｒｃｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）　
Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ−２５５、Ｉ）［）−３６８５−３６９０：］
及びオゾンネ等［０ｚａｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　（１
９８０）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉａｌ　１０５、
ｐｐ、　１６３−１８０　］に記載されている。同様に
、ヒト細胞系統に対する源及び方法は、トダロ等［Ｔｏ
ｄａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７７、ｐｐ、　５２５ｇ　−５２６２）及びジ
アール等［Ｇｉａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７３）　
Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、。

５工、ｐｐ、　１４１７−１４２３　］に記載されてい
る。以下に説明する本発明のＭｐ−船方法は、悪性を保
有するヒト或いはネズミの各種体液、例えば尿、血清、
血漿、全面或いは脳を髄液、或いはＴＧＦ　、Ｉ？！Ｊ
ペゾチド類を産生ずる形質転換細胞から本発明のＴＧＦ
ポリペゾチド類を得るのに用いることもできる。

これに関して、本発明によるＴＧＦポリペプチド類の適
当な源は、ＴＧＦポリペゾテド類を産生することが知ら
れたｌＩ￥１瘍細胞（ヒト黒色腫或いは形質転換ラット
〕で接種されであるマウスの尿或いはその他の体液であ
る。全ての場合におＶ）で、ＴＧＦポリペゾチドの同定
及び純度は、ＥＧＦとのりセプター交差−反応性に基づ
いたラジオリセプターアッセイにより追跡することかで
きる（下記実験◇（ｊ参照）。組換え或いはハイブリッ
）″ＤＮＡ技術な使用する技術においては、例えば２ｏ
個までのアミノ酸を含む本発明によるオリゴペプチド類
或いは本発明によるポリペプチド類のセグメントを使用
して一本鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ）プローブに対するコ
ドン配列を演綽することができる。これらのヌクレオチ
ドプローブを次Ｖ１で公知の合成技術を用いて合成し、
正常及び形質転換細胞の両者における成長因子型ポリペ
プチド類或いは該ペプチド類を詮有する体液を暗号化す
るメツセンジャーＲＮＡを得るためのプローブとして使
用することができる。

−［、メツセンジャーＲＮＡが得られると、ｍＲＮＡを
ＣＤＮＡに逆転写するのに運営の技術を使用し、引き続
きｃＤＮＡを適当なベクター内にクローニングして、目
的ポリペプチドの発現を得ることかできる。

本発明による方法は、より純度の低い形態のＴＧＦポリ
ペプチド類を含有″１−る各種水性ペース流体、例えば
ＴＧＦポリペプチド類を産生する形質転換された細胞系
統により条件イ」けられた無血清堵地或いは体液例えば
悪性を保有する哨乳ＩＩＩＩ物からの尿或いはＴＧＦポ
リペプチド類を産生ずる形質転換細胞などから均質な形
態でＴＧＦポリペゾテド類を得るための独特に有効な手
段を提供するものである。この独特、な単離或いは精製
方法の重要な側面は、先ず、酢酸水溶液を用いる抽出或
いは透析工程、引き続く酸可溶性ＴＧＦ富有活性のゲル
透過クロマトグラフィー及び最後にトリフルオロ酢酸水
溶液の存在下における逐次アセトニ）　ＩＪル及び１−
プロパツールを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー
をよむものである。広義においてこの方法は、均質な形
質転換成長因子ポリペプチドを不純な形態で該形質転換
成長因子ポリペプチドを含有する水性培地から単離する
方法であって、下記工程をａんでなることを特徴とする
方法である＝（１）形質転換成長因子を不純な形態でき
有する水性培地を、酢酸水溶液に対して透析を行い、形
質転換成長因子ポリペプチドを含有する溶媒相を与え、
この相を濃縮し−及び必゛決に応じて清澄化させる工程
、 （２）工程（１１の鎖線溶媒相を酢酸水溶液で復元し。

酢酸水溶液で調整したゲル透過クロマトグラフィーカラ
ムに復元ｉｄｇを適用し、酢酸水溶液で溶出することに
より復元溶液のゲル透過クロマトゲラフイーを行−）て
、形質転換成長因子ポリペプチドを高められた純度の状
■で含有する選択された溶出液画分を得、該選択画分を
合一し、Ｇ縮して部分的に精製された形質転換成長因子
ポリペプチド陰性生成物を与える工程、及び（３）　工
程（２）の部分的に精製された形質転換成長因子ポリペ
プチド含有生成物を、該生成物をトリフルオロ酢酸水溶
液中で復元後にトリフルオロ酊辰水隘液で平衡化させて
おいた１以上の炭化水素結合／リカマトリックスカラム
に通して高圧液体クロマトグラフィー条件下において逐
次逆相高圧クロマトグラフィーに付１−るに際し、最初
のカラム溶出をトリフルオロ酢酸水溶液中で線形アセト
ニトリル勾配を用いて行Ｖ）、及び次の、最初の高圧ク
ロマトグラフィ一工程で得られた合一された形質転換成
長因子ポリペプチドさ有画分について行われるカラムυ
出をトリフルオロ酢酸水溶液中で線形１−プロ・ξノー
ル勾配を用いて行い、該ｌ−ゾロノξノール勾配は十分
に小さいｌ−プロパツール濃度増加分にて増大せしめ、
形質転換成長因子ポリペプチドを均質ポリペプチド状使
の単一の明確なピークとして与えるようにして行う工程
。

好ましい応用において、本発明による方法は、形質転換
されたＴＧＦ−産生細胞系統により条件付けられた無血
清培地から均質ＴＧＦを単離するために使用される。こ
の好ましい応用において、条件付は培地は、透析前に例
えば遠ＩＬ？分離により？１１澄化され、濃縮されるの
が適当であり、透析から・ｆｎられたＴＧＦ　Ｂ有溶媒
相は、ゲル透過クロマトグラフィーに先立ち、例えば遠
心分離により清澄化され並びにＩＩｋ縮されるのが適当
である。いずれの場合においても、透析は０．０１〜１
モルの酢酸濃度を有する水性酢酸浴媒を用いて行うのが
適当であり、０・１モルの酢酸が好ましい。ゲル透過ク
ロマドグシフイーは、分子径に基づいて蛋白１↓或Ｖ）
はポリペプチド類を分離するために通常使用されろ各＋
ｍゲルを用いて行うことができる。適当なゲルとしては
、デキストランゲル、アガロースゲル及びポリアクリル
アミドゲルなどが挙げられる。これに関してポリアクリ
ルアミドゲル沖過樹脂（＋３ｉｏ−Ｇｅｌ’）例えばＢ
ｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ　−１０、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ　−３
０及びＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−６０などが好ましく中でも
特に、Ｂｊｏ−Ｇｅｌ　Ｐ　−１０が好ましい。カラム
な調整し、ＴＧＦ−含有画分を適当に溶出するために使
用される水性酢酸は、０．２〜２．０モルの酢酸濃度を
有するのが適当であり、ＬＯモルの酢酸が好ましい。

カラムから溶出されるＴＧＦ含有画分はそれらのＥＧＦ
−競合活性及び軟寒天中における成長促進活性をめるこ
とにより同定することができる（下記実験例参照）。ゲ
ル透過クロマトグラフィーの後、ＴＧＦポリペゾチド類
を高められた純度の状暢で含有する画分を一緒にプール
し、例えば凍結乾隊によりａ縮して更に逆相高圧液本ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製のための準備
工程とする。

本発明の精製方法の最終段階は水性トリフルオロ酢酸の
存在下におけるアセトニトリル及び１−プロ・ぞノール
による逐次ＨＰＬＣをきむ。この逐次ＨＰＬＣは１本μ
上の）（ＰＬＣカラムを用いて行うことができるが、逐
次ＨＰＬＣ工程は噴−のＨＰＬＣカラムを用いて行うの
が好ましｌ／１゜１史用さハ、るカンム充填削は、長鎖
炭化水素例えば１６〜２２の炭素数を有する炭化水素が
結合された多孔性／リカマトリックスが適当である。好
ましい光填削は、／４Ｂｏｎｄａｐａｋ炭化水素カラム
特にμＢｏｎｄａｐａｋ　ｃｍ、カラム（１０μｍ粒径
、０．３９　Ｘ　３０ｃａｌＩＷａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏ
ｃｉａ−ｔｅｓ　）である。典壓的には、操作は約５０
〜約５．ｔ）００ｐｓｉ（約３．５〜３５０にす凍２）
の範囲の加圧下に行われる。カラムにかけるに先立ち、
藺縮されたＴＧＦ含有画分を１〜１０％のトリフルオロ
酢咽浴液中で復元し、２〜５の範囲のｐＨ、好ましくは
３，５のｐＨにトリフルオロ酢酸をｄ−ｉ加して調整す
る。カラムは試料注入前に帆０１〜０．１％トリフルオ
ロ酊酸水溶液、好ましくは、０．０５％トリフルオロｆ
ｋｅ酸水溶液により平衡化されるのが適当である。最初
の溶出は、０．０１＼帆１％、好ましくは帆０５％トリ
フルオロ酢酸中のアセトニトリルにおいて線形アセトニ
トリル勾配（アセトニトリル濃度が線形的に約し１％／
分〜約１％／分の範囲の勾配で増太されるンを用Ｖ）て
行われる。この溶出は、約０．２〜２１７分の流速で１
０〜５０℃の温度好ましくは約４０℃の温度で帆２〜３
時間に亘って行われる。

ＥＧＦ競合及び軟寒天アッセイによりめられたＴＧＦ活
性をよ有するプールされた両分を例えば凍結乾燥により
濃縮してから第２工程の１−プロパツール溶媒を用いる
ＨＰＬＣを行う。逐医１（ＰＬＯの第２工程については
、第１ＨＰＬＣ俗出から得られたプールされ濃縮された
両分を０．Ｏ１〜０．１％トリフルオロ酢酸中で復元し
、第１カラムについて用いたと同一の方法でトリフルオ
ロ酔眼により平衡化された同一カラム或いは第２番目の
カラム上で再クロマトグラフを行う。この第２の溶出は
ｌ−ゾロパノールを用いて０．０１〜０．１％、好まし
くは０−０３５％トリフルオロ酢酸中で線形１−プロパ
ツール勾配を用いて行う。この工程においては。

最適の結果を得るためには、浅い線形１−プロパツール
勾配を用いることが重要である。特に、１−プロパツー
ル勾配は０．１％／分を越えない勾配で線形的に増大す
べきであり、好ましくは線形１−プロパツール勾配は溶
出の間口０１％／分及び０．０５％／分の間に保つべき
である。この第２のｒ８出は、約０．５〜５彪／分の流
速で、１０〜６０℃の偏度、好ましくは約４０℃で１〜
５時間に亘って行うのが適当で競る。線形ｌ−プ・パノ
ール体皮勾配を上記浅しｌ水準にコントロールすること
によりＴＧＦポリペプチド類を均質ポリペプチド形態に
おけるＴＧＦ活性の明確なピークとして溶出することが
可能である。

本発明の単離方法に従うと、不純出発物１！を中の最初
のＴＧＦ活性の約７０％までを回収することが可能であ
るのに対し、達成される純度の程度は２００．０００倍
を越えるものである。本発明の単離方法により得られる
均質なＴＧＦポリペゾチド類は。

典型的に約５　、０００〜約３５　、０００の範囲の分
子九支を有し、ペプチド配列決定をｎ」能にするに十分
な純度のものである。本発明の方法に従って得られる好
ましい均質ＴＧＦポリペプチドぢ（は、見かけ分子値７
，４００．２０　、０００及び３０，０００〜３５，０
００を有するＴＧＦが含まれる。これらの均ｔ）Ｉ　Ｔ
ＧＦポリペプチド゛４１は、培養液中で成長する未形質
転換、非−新生物指示細胞に適用された場合にＴＧＦポ
リペプチド類の特性的生物学的性質例えば固定−非依存
性の獲得などを示し、軟寒天中で生育する能力を有する
に至る。更に、これらの均質ＴＧＦポリペゾチド類を使
用することにより本発明に従った癌及びその他の増殖性
病気の検出及び治療に価値を有する抗体（下記参照）を
産生することができる。

これに関して、　ＴＧＦの形態の各々は、異ったＴＧＦ
ペプチド類に対する抗体を産生する目的で均質になるま
で精製することは必須ではない。これらのＴＧＦポリペ
プチド類に対する＠種形態の抗体も又本発明にきまれる
ものである。

本発明に従った抗体は上記式ＨのＴＧＦポリペプチド類
、式ＨのＴＧＦポリペプチド類から得られた抗原性オリ
ゴペズテド類及び各商形質転換細胞系統及び急性或いは
形質転換細胞を保有する咄乳動物の体液から本発明の単
離方法を用いて得られた均質ＴＧＦポリペプチド類に対
して産生さねたモノクローナル及びポリクローナル抗体
の両名がきまれる。本発明による抗体は、モノクローナ
ル或いはポリクローナル抗体のいずれが所望されるかに
従って各種公知技術に従って調装置−ることが可能であ
る。ポリクローナル抗体に対しては、を椎動物、典型的
には家畜を抗原により病度免疫化し、血液を繰返し免疫
化後間もなくで集め、ガンマグロブリンを単離する。ポ
リクローナル抗体の調製に適した方法は、「実験免疫学
便覧」Ｌ″Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第３版Ｗｅｌｒｉ、
Ｂ　Ｉａｃｋｗｅｌ　Ｉ　５ｃｉｅｎｔｉｆ　ｉｃ　ｐ
ｕｂ、Ｉ　１ｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｌｏ
ｎｄｔ）ｎ１９７８１に記載されている。モノクローナ
ル抗体に対しては、小動物、典型的にはマウス或いはラ
ットを抗原で高度免疫化し、胛繊を取り出し、適当な融
合促進剤の存在下においてリン・ξ球をミエローマ細胞
と融合する。得られたノ・イブリッド雅胞即ちハイシリ
ドーマをスクリーニングして、その各々が抗原に対する
唯−抗困種を分泌する個々のクローンを単離する。この
様にして得られた個々の抗体種は、各々、免疫諒物質上
に認識された特異性抗原部位に応答して生成した免疫動
物からの単−Ｂ伸ｊ胞の生成物である。本発明によるも
のナカめてモノクローナル抗体乞得る一般的方法はコー
ラ−及びミルスタイｙ　［Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６、ｐ
ｐ、　４９５−４９７　］に説明されている。本発明の
ポリペプチド類及び抗原性オリ！　ペプチド類は免疫化
操作に直接使用してもよく、或いは公知の方法例えば米
国特許第４．３４１，７６１号明−ｔｉｌｌ書に記載の
方法を用し１て適当なキャリヤー−蛋白質に結合するこ
ともできる。免疫化が本発明の抗原性オリザペゾチド類
を使用して行われる場合にはキャリヤー蛋白質な使用す
ることが特に好ましい。

本発明による抗体は、各種方法で使用することができる
。１つの好ましい応用において、それらは悪性及びその
他の増殖性病気の診断に使用することができる。抗原が
生理学的流体中に存在する場合或いは悪性或いはその他
の増殖的病気が存在する場合のみの濃度差におｌ八で存
在する場合には、その生理学的流体例えば血清、血漿、
全血或いは脳髄液などを測定することができる。測定に
使用される抗体は、標識化されても標識化されなくても
より。未標識化抗体は、凝集反応において使用すること
ができる。標識化抗体は広範囲のラベル例えば放射核種
、酵素、螢光物質、酵素基質或いは補因子などｔ用し為
る広範囲の測定に使用することができる。これ等の技術
は、文献に十分に記載されており、具体的な測定法は例
えば米国特許第３．８１７．８３４号、３，９３５，０
７４号、４，２３３，４０２号及び４．３１８，９８０
号などの各明細書に記載されている。

ある技術においては、抗体よりもむしろ抗原或いはその
フラグメントな標識化した方が有用で、抗体に対して試
料中の標識化抗原および抗原間の競合をもたせる方が有
用である。この状況においては、最適の感度及び精度乞
与える量におめて。

標識化抗原或いは標識化フラグメントと抗体の組合せな
有するキラトラ提供するのが普通である。

その他の状況においては、抗原或いは抗体のいずれかが
結合される固体支持体を有することが望ましい。ポリエ
ビトーゾ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉり抗原は、支持体に
結合された抗体とアッセイ培地中の標識化抗体間の橋と
しての役割を果たし得る。或いは又、限られた量の抗体
に対しては、標識化抗原と試料中の任意の抗原間の競合
もあり得る。

抗原が生理学的流体にはプよい場合或いはあっても悪性
或いは目標の増殖性病気の診断がなされない場合は、ａ
胞が単離され、細胞について抗原の存在につＶλてアッ
セイが行われなければなうなＶ）。

抗原の検出のためには、組織試料を常法に従って、例え
ば塩基、洗剤などを用いて溶解し、、１１１１胞破片な
ヂ過或いは遠心分離により分離し、Ｐ液酸いは上澄液ン
ｊ＃離して分析する。

治療目的のためには、治療の性質に応じて及び外部抗体
が免疫応答を誘発するか否かに応じて異種間或りは異形
的抗体のいずれかを使用することができる。文献には、
マウスその他の哺乳動物の抗体では十分でない場合のヒ
ト抗体の作り方が数多く記載されている。これらの抗体
は各種方法により使用することが可能である。適当なＩ
ｇＧ（ＩｇＧ１以外）を使用するごとにより自然郭ｊ体
プロセスにより沼解を誘発することができる。或いは又
毒素の溶解部分を抗体特にＦａｂフラグメントに連結す
ることができる。す、１？ソームを悪性細胞に向けて膜
の合一により細胞により摂取されるように抗体をリポソ
ームに結合してもよい。その他の２ベル例えば放射性核
種、螢光性物質、酵素などを抗体に結合することなども
できる。抗体Ｌｉｎｖｉｖｏに導入することにより、抗
体はラベルを悪性細胞に向け、そこにおいて悪性の存在
を診断或いは治療することもできる。

抗体の組成はラベルの性質、抗体の目的、抗体が向けら
れる箇所などに応じて広範に変わり得る。

通常抗体は、生理学的に許容可能なキャリヤー例えば塩
水或匹はホスフェート緩衝化塩水などのキャリヤー中に
配合され　ｏＪ能である場合には所望の箇所において或
いはこれが可能でない場合には血液のような循環系中で
宿主に注入される。

本発明に従って得られた抗体は又、ＴＧＦポリペゾチド
な発現する細胞を単離し、及びＴＧＦポリペプチドを発
現する細胞を含有する不均一細胞集団から細胞をｉｎ　
ｖｉｔｒｏで除去することもできる。分離は螢光活性化
細胞ソーター（ＦＡＣ８）　を用Ｖ１て達成することが
できる。この同一技術を用いてＴＧＦボリペゾチドを発
現する細胞を同定し、単離することかできる。ＴＧＦポ
リペプチドを発現する細胞な細胞の混合物から除去する
ためには、目的抗体を′補体と結合し、毒素の俗解フラ
グメント（Ａフラグメント）に連結しくＥ、Ｐ、Ｏ，出
願１７５０７号、及びＵ、に、特許用１ｉＡ　２．０３
４，３２４号参照ン、或いは細胞をＮＵ集して物理的手
段で分離することができる。

本発明の生物学活性ポリペプチド類及びオリゴペプチド
類を使用する方法及び組成物は、癌及びその他の増殖性
病気の治療及び細胞成長促進が有利である治療にも用い
ることができる。％に上記式■のオリゴペプチド類を用
いる組成物が悪性の治療に提供される。史に又、癌及び
その他の増殖性病気の治療用の及び傷の治療及びｌ１ｍ
　１％の治療などの細胞成長促進用途のための式■及υ
■の生物活性ポリペプチド類を含有する組成物も提供さ
れる。これらの治療組成物は示されたオリゴペプチド類
及びポリペプチド類の有効験と薬学的に許容可能なキャ
リヤーとの混合物よりなる。特に、本発明のオリゴペプ
チド類及び／叉はポリペプチド類を活性成分としてよ有
する薬学組成物は通常、使用される特別な投与態様に応
じて適当な固体又は液体のキャリヤーと配合される。例
えば、非経口配合物は、洛学的且つ生理学的に許容可能
な液体例えば生理学的塩水、′＋衡化塩水溶液などを稀
釈削として使用する注射可能な流体である。他方、経口
配合物は、固体例えば錠剤或いはカプセル、或いは液本
溶液酸いは（“静濁液である。

本発明の治療方法におし１て、オリゴペプチド類及び／
又はポリペプチド類はヒトに各種方法により例えば経口
的、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮膚内或いは皮
下投与により投与を行うことができる。投与の特別な態
様及び投与液処方は担当医師により患者の詳細、必要と
される試料の性質及び／又は病気、柄幅を考慮して８択
さｈる。

例えば傷による損傷した組織は、毎日或いは毎日２回の
投与により数日間或いは数週間に亘ってｌ市常治療され
るのに対し、肺膓或いは尚の治療は毎日或いは毎日数回
の投与を数ケ月或いは数年に亘って行われる。本発明の
オリゴペプチド及び／又はポリヘブテド治療はその他の
治療と組み合わせることが可能であり、増殖性病気、新
生物或いはそれらが有効であるその他の病態に対して治
療を与えるために、そ６他の化学療法或いは化学予防剤
と組合わせるか或いは一緒に使用することが可能である
。

以下具体例により本発明を説明するが、これらは本発明
を限定するものではない。

男−」 Ａ、実験操作 ｈＴＧ−Ｆ源 ｈＴＧＦは４３才の男の脳転移より得られたヒト転移黒
色肺系統Ａ２０５８　（Ｔｏｄａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、
　（１９８０）Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃ
ｉ　、　ＵＳＡ　７７　ｐｐ５２５８　＼５２６２３に
より条件付けられた無血清培地から精製された。

細胞は１０％のつ７血清（Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕ
ｍ　Ｃｏ、　）　ン補給したダルベツコ−（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ　）の変性イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地（Ｇｒａ
ｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ、、
　４３０−２１００　）な含有するローラーボトル中で
９０％果密度まで生育させた。シ４０胞ヲ５０１の血清
のないウエイマウｘ　（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）の培、ｔｉ
！！（Ｇｒａｎｄ　ＩｓｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｃｏ、、　ＭＤ　７０５／ｌ）で１時間洗浄した。

これ及び冴時間後の２番目の上澄液を集めたものを廃棄
した。引き続いた採集を隔日或いは３日目毎に２週間続
けて行った。

培地はデカンチー７ヨンにより集め、阻害剤フェニルメ
タンスルホニルフルオライＦ’（１μｇ　／ｒｎｔ　）
の存在下に４℃で冴時間迄貯蔵し、連続流動遠心分離に
より４℃で３２．０００ｒｐｍにおいて溝面化させた。

Ｌ５−５０型超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　）におけ
るＣＦ−３２連続流動ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　
Ｋ　オｖｈ　テ５１／時間の流速を使用した。高速遠心
分離後の上澄液をＡ２０５８−条件付は培地と称する。

このＡ２０５８−条件付は培地を直ちに中空ｆ７Ａ維透
析機／濃軸機（ＤＣＩＱ型、タイプ）（１０９５−２０
カートリッノ、Ａｍ１ｃｒｏｎ　Ｃｏｒｐ、　）内にお
いて、１０℃において直ちに濃縮した。濃縮液を容態な
１５０倍に減少した後に抜き出した。カートリッジＹ１
０００ｍＡのウェイマウスの培地で洗浄した。限外濾過
液は廃棄した。

ｈＴＧＦ（７）ｒｉＮ 透析及び遠心分離 限外濾過後のＡ２０５８−条件付は培地の合一した保持
分及びカートリッジ洗浄液をＢｐｅｃｔｒａｐｏｒ　３
透析管（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉｅｓ）中において０．１Ｍ酢酸に対してω時間
透析ビ行った。この保持分を４℃において１時間１００
，０００　ｘ　＆にて遠心分離乞行った。ペレットは廃
棄した。上澄液を凍結乾燥により濃縮し、　ｏ、５ｍｂ
のＩＭ酊酸／始めのＡ　２０５８−条件付は培地ｔで元
にもどした。

Ｂｊｏ−Ｇｅｌ　Ｐ　−１０上でのりＯマドグラフィー
濃縮、透析及び遠心分離に続き、ｈＴＧＦ活性な含有す
る上澄液を更にＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ　−１０（２００−
４００メツシユ、Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ　、［、ａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　）のカラム（２，５ｘｓ５ｍ）（４２０
ｍ４床容積〕上でゲル透過クロマトグラフィーにより４
’＋’ｔ　Ｈした。このカラムを２２℃において１Ｍ酢
酸により平衡化さ・ビた。１Ｍ酢酸Ｃ３ｒｎｔ）中の蛋
白質の試Ｉｓ）　（６５〜１１Ｆｌｌ＆　）　Ｙカラム
にかけた。一定流速を確実にするためにカラム流出液樋
需動ポンプにより１２ｍＡ／ｈに制御した。４．８幅の
一分を集めた。アリコート音引き続く軟寒天中でのＥＧ
Ｆ−競争活性及び発育−促進活性の測定のために凍結乾
燥させた。あるピークの主な部分を表わす一分をプール
し、凍結乾燥により濃縮した。

逆相高圧散体クロマトグラフィー ｈＴＧＦの最終苗製はマルクアルト等（：Ｍａｒｑｕａ
ｒ−ｄｔ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｊ、ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２５６、ｐｐ６８５９−６８６５　
］に記載される一般的方法乞用いて逆相Ｉ（ＰＬＯによ
り達成した。全ての分離は４０℃において１ｍ６７分の
泥速においてμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ：□８カラム（１
０−μｍ粒径、０．３９Ｘ３Ｑｃｍ、Ｗａｔｅｒｓ　Ａ
ＳＳ−ｏｃｉａｔｅｓ　）上で行った。凍結乾燥した試
料は水中０．０５％（ｖ／リドリフルオロ酢酸中で元に
もどし、１０％（ｖ／ｖ）　）リフルオロ酢酸で１）Ｈ
２に調整し、０．０５％トリプルオロ酔酸で平衡化され
たカラムに試料注入器２通して供給した。カラムを次い
で０．０４５％トリフルオロ酢酸中の線形アセトニトリ
ル勾配で溶出を行った。カラム流出液＊　ｔ、５Ｔｎｔ
画分で集めた。アリコートは引きＷｌ　＜　ＥＧＦ競合
及び成長刺戟検定のために凍結乾燥させた。主たるｈＴ
ＧＦ活性を３む画分のプール分は凍結乾燥により濃縮し
た。

１１ＴＧＦ　ｉＩｌ有プール分＊　０．０５％トリフル
オロｆｌｌｈｌ中で元にもどし、予め水中０．０５％の
トリフルオロ酢酸で平衡化されてＬ／）７こ同一カラム
上で再クロマトグラフを行った。カラムを次いで０．０
３５％トリフルオロ酢酸中の線形１−プロＡノール勾配
で浴出した。カラム洗浄液ｗ１．５ｍｔ画分で集めた。

アリコート乞ＥＧＦ競合及び成長刺戟検定のために凍結
乾燥した。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル眠気法１！ｌＪはラエンムリ［Ｌａ
ｅｍｍｌｉ　（１９８０）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）
　２２７、ｐｐ、　６８０−６８５　）に記載される方
法吟よりイｊつだ。

１５〜３０％アクリルアミド勾配スラブ（１４０Ｘ　１
２０Ｘ０．７５朋）を４％積層ゲルを用いて調製した。

ゲルを３０１ＣおいてＴｒｉｓ　（０，０５Ｍ　）、グ
リ７ン（０−３８Ｍ）、及び５ＤＳ（０，１％、ｗ／ｖ
　）をき有する電極緩衝液を用いて追跡染料（ブロムフ
ェノールブルー）がゲルの末端な流出させてしまう迄流
動させた。電気泳動後、ゲルヲ関％メタノール、１０％
酢酸中で２時間固定し、５％メタノール、７％酢酸中で
一晩洗浄し、銀で染色した［　０ａｋｌｅｙ　ｅｔａｌ
、　（１９８０）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
０５、ｐｌ）、　３６１−３６３１蛋白質決定 全蛋白質はウノ血清アルブミン乞標準に用いて決定した
。蛋白質決定に先立ち、出発物質乞呈色反応を妨害する
遍地の成分を除去するためにリン酸緩衝塩水に対して透
析を行うか或りは試料が揮発性酸中に溶解している場合
には凍結乾燥し１こ。

蛋白質は又アミノ酸分析により決定された。凍結乾燥さ
れた試料は０．１％の液体フェノール’ｘａ有する６Ｎ
　ＨＣＩ　Ｏ，ｌＡで真空パイレックス管内において１
１０℃において冴時間加水分解を行い、−級アミンの螢
光兄生イｆ出のためにＯ−フタルアルデヒドを用いてＰ
ＤＰ８／Ａ債ｐ：泪を備えたｌ）ｕｒｒｕｍＤ−５００
７ナライザーで分析した［　Ｂｅｎ５ｅｎ　ｅｔ　ａｔ
。

（１９７５）　Ｐｒｎｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７２、ｐｐ、６１９−６２２１゜ ラジオリセゾターアツセイ Ｙ＋’Ｊ　製されたＥＧＦ　Ｙデラル：ｒ・”Ｊ　［Ｄ
ｅＬａｒｃｏ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７５、ｐｐ。

４００１−４００５１に説明されているクロラミン−Ｔ
法の修正方法によりＮａ　ＩでＧ脆化した。　Ｉ−ＥＧ
Ｆ結合アッセイをホルマリン固定Ａ４３１ヒト癌細胞の
下部集密的細胞単層について前述の方法で行った［Ｄｃ
Ｌａｒｃｏ　ｃｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｊ、　ｏｆ
　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５５、Ｉ）ｌ）、　３６８５−３６９０
１゜固定細胞を２回０．５ｍｂの結合緩衝液［１ｍ９／
ｍＬのウシ血清アルブミン及ヒ５０ｍＭ　２−　［ビス
〔２−ヒドロキシエチルンアミノ〕エタンスルホン酸な
き有するダルベツコ−の修正イーグル培地、ｌ］８６．
８］で６℃浄した。競合の開始は潜在的阻害剤を用いて
、或いは用いずに帆４ｎｇの１２５Ｉ　−ＥＧＦ’に含
有すル０−２ｍ１．（１）結合緩衝液を添加することに
より行った。２２℃で１１埒間インキュベーション後ｓ
　’ｌ’Ｆ異的に結合し１こ１２５Ｉ−ＥＧＦ７測定し
た。ＴＧＦ−言置は、１２５Ｉ−ＥＧＦのＥＧＦ　リセ
ゾターへの結合の阻害の度合いにより表わした。ｘＥａ
Ｆ−ｍ合活性単位は１２５ニーＥＧＦのそのリセゾター
への結合２５０％阻害する蛋白質の量と可義する。

軟寒天成長アッセイ 正常なラットの腎臓繊維芽細胞、クローン・１９Ｆを用
いたコロニー成長のアツセイントダロ等［ＴｏｄａｒＯ
ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、　５ｃｉ−男囚７７、ｐｐ５２５８−５２６２
）に報告される方法に従って行った。凍結乾燥された被
試験試料は、１０％ウノ血清を補給されたＱ　、　５　
ｒｒＬｔのダルベツコ−の修正イーグル培地中で元にも
どした。１．５ｆｆＬＡの補給培地中の帆５％（ｗ／ｖ
　）寒天（Ｄｉｆｃり及び帆５ｍＡの２．３Ｘ１０’個
の細胞を含有する補給培地をｉ％加した。２．３ｍｂの
得られた混合物υ■ｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）に入れ
た２１基底層（補給培地９帆５％寒天）にピペットで重
加した。細胞？３７℃において加湿した５％Ｃｏ　２　
／　９５％空気雰囲気内においてインキュベートした。

アッセイは５日目及びｌｏ〜１４日目に未固定、未染色
の状態で読み取られた。

Ｂ、結果 ｈＴＧＦの源、濃度及び初期分別 ｈＴＧＦは高度に形質転換されたヒト転移黒色腫細胞系
統Ａ２０５８の無血清条件培地から単離された。ｈＴＧ
Ｆの定量はその２つの特性に基づいてＶ）る。即ち、軟
寒天中に固定−非依存性の正常なラットの腎臓繊維芽細
胞の成長を誘発する能力、及びＡ４３１ヒト層細胞上の
ＥＧＦリセプタ一部位に対して１２５Ｉ−ＥＧＦと競合
する能力である。ｈＴＧＦの単離及びその回収に導く工
程ン表Ｉにまとめて示す。

マウスの培地で十分に洗浄した。上澄液は２週間の間隔
日採果した。培斐条注は培養期間の終りに９０％の細胞
が尚成長可能であり単層として刺着しているようなもの
であった。１．０２．９の全蛋白質及び４５２５単位の
ＥＧＦ　−取合活性を有する１３６　ｔの初期の透明化
Ａ２０５８−条件付は培地Ｙ　５０００分画分子酸分子
−トリッジを有する中空糸濃縮機を用いて約９００ＩＲ
１Ｋ濃縮した。全ＥＧＦ−競合活性が保持され、９５％
を越える回収率が得られた。

濃縮されたＡ２０５８−条件付は培地の酢酸に対する透
析及びそれに引ぎ統く遠Ｉし分離の結果、初期の全ＥＧ
Ｆ−競合活性の９５％の回収率が得られた。

蛋白質の１８％は酸不溶性であり、廃棄された。酸可溶
性の一部分的に精製されたｈＴＧＦ　７ａｌ″Ｂ１ｏ−
Ｇｅ１−　Ｐ−１０上のゲルパーミエークヨンクロマト
グラフイーにかけた。カラムはＩＭ〜）９で溶出した。

汚染蛋白質の大部分はカラムの排除体積内に溶出され、
ＥＧＦ−競合活性分及び成長−利賦活性分とは互によく
分度された。活性分の２つのピークは互によく分離され
ていた。ＥＧＦ　−％合及び成長−刺戟活性分の両者を
有する両分（Ｐ−１０−Ａ及びｐ−１Ｏ−Ｂ）はそれぞ
れ１０，５００及び６．８００の見かけ分子量を有した
。これらの２つの活性分の一方のみを有する両分は観察
されなかった。ｂＴＧＦ−含有画分を示されたようにプ
ールし、凍結乾燥し、更に精製した。カラムからより広
いピークで浴出されたより大きな分子量ＴＧＦ　（Ｐ−
１０−Ａ　）は異った大きさのポリペプチドと会合して
いるようであった。Ｐ−１０−Ａは初期ＥＧＦ　−ｆｉ
合活性分の４６％を含有した。鋭いピークでカラムから
溶出されたより小さな分子′ＩＬＴＧＦ　（Ｐ−１０−
Ｂ）は初期全ＥＧＦ競合活性分の４５％乞表わした。工
程ｌからのゲルノξ−ミニー７ヨンクロマトグラフイー
エ程にヨル全入力ＥＧＦ−競合活性分の累積的収率は９
１％であった（表Ｉ）。ｈＴＧＦは標本毎に定値的に変
化した２つの明確な主たるピークとして溶出された。

幾つかのＡ２０５８−灸件付は培地の標本におＶｌては
実質的に全ての成長促進活性がｈＴＧＦ領域に存在した
。

ｈＴＧＦの精製 ｈＴＧＦは更に逆相ＰＨＬＣにより精製された。プール
Ｐ−１０−Ｂは濃縮Ａ２０６８−条件付は培地の酸可溶
性ＥＧＦ−競合活性のＢ　ｉｏ　−Ｇｅｌ　Ｐ　−１０
上テノケルパーミエ−７ヨンクロマトグラフイーの＆、
水中０．０５％のトリフルオロ酢酸中で元にもどされた
後、μＢＯｎｄａｐａｋ　ｃ、８カラム上でクロマトグ
ラフを行った。個々の一分の軟寒天中でのＥＧＦ　−競
合及び成長−刺戟活性ン求めた。ｈＴＧＦは有機溶媒の
より高い濃度で溶出した大部分の汚染蛋白質からよく分
離された。ｈ’ｒＧＦ’　ｆ　＠有する一分乞プールし
、凍結乾燥し、再クロマドグ２フイー用に採取した。

ゲルパーミエーノヨンクロマトグラフイーの後に５７倍
に精製されたｈＴＧＦの精製品が得られた。ゾールＰ−
１０−Ｈにおける初期ＥＧＦ−競合活性の８０％が回収
された（表Ｉ）。

最終精製工程にはμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ，Ｂ支持体上
でのｈＴＧＦ含有画分の再クロマトグラフィーが選ばれ
た。これらは、これらのカラム上で僅かに相対的に少縫
のＥＧＦ−競合活性の損失が見られたに過ぎなかったか
らである。不純物からｌ＋ＴＧＦの明確な分離を得るた
めには帆０３５％トリフルオロ酢酸中において浅い線形
ｌ−ゾロノξノール勾配を使用する必要があった。汚染
ペプチド物質の代替画分は明確な活性のピークかう分離
された。ＥＧＦ　−競合及ヒ成長−刺戟活性は１３％１
−グロノ９ノールにおける明確な吸収ピークなもって共
に精製された。

ｈＴＧＦ　’ｉ　＊有する画分ｔプールし、更に分析し
た。

ｈＴＧＦのＦｒ１１１度はゲルパーミニ−７ヨンクロマ
トグラフイー後はぼ７０００倍であり、収率はＷ勘合Ｅ
ＧＦ−競合活性のお％であった。最終逆相ＨＰＬＣ工程
による工程３からのｈＴＧＦの総合回収率は７３％であ
り、工程当りの回収率は８０〜１００％であった（表口
。

ｈＴＧＦの特徴付は 最終ｂＴＧＦ標本の純度は５ｒ）Ｓ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析法によりめた。ゲルは銀で染色した
。一つの見かけＭ、　＝　７４００の主ポリベゾテド帯
が見られた。試料馨非還元条件下において電気泳動した
場合にも同一・ぐターンが得られ、ＴＧＦが単一鎖分子
であることを示した。

ｈＴＧＦのりセッター反応性乞うジオリセゾターアツセ
イにおいてＥＧＦと対比した。ｈＴＧＦの定量はコンパ
ニオンアリコートのアミノ酸分析に基づいた。ｈＴＧＦ
及びＥＧＦの両者は３Ａ図に示したようにＡ４３１ヒ＋
ｔｉ細胞のＥＧＦリセゾタ一部位に対して　Ｉ−ＥＧＦ
と競合した。ｈＴＧＦの特異的ＥＧＦ−競合活性は１〜
１．５ＸＩ０６単位／ｌψであった。

ＥＧＦ結合？５０％阻害するためには１．ｌｎｇのｈＴ
Ｇｌｉ’或いはＥＧＦが必要であった。

ｈＴＧＦは正常な固定依存性ラット腎臓１γ川胞、クロ
ーン／Ｉ９　Ｆ　、の軟寒天中での成長ゲ可能にした。

ｈＴＧＦの軟餠天中での半一最大応答はＩ　ＥＧＦ　−
競合単位即ちｉｌ−１ｎのｈＴＧＦ’で到達したのに対
し、ＥＧＦはｌＯμｇまで試験された場合にも軟寒天中
におけるこれらの細胞の成長′ｌａ：ｌｐＨ伐しない。

例■ ヒト（ｈＴＧＦ　）、ラット（ｒＴＧＦ）、及びマウス
Ａ、実験操作 ＴＧＦ源 ｒＴＧＦ％ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦはそれぞれＦｉｓｈｅ
ｒラット胚繊維芽細胞、ＦＲＥＣＩＩＯｌＦＲＥ　３Ａ
のサブクｅ＋　−ｙ　［５ａｃｋｓ　ｅｔ　ａｌ、　（
１９７９）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９７、ｐｐ。

２３１−２４０　］であって、］５ｎｙｄｅｒ−Ｔｂｅ
ｉｌｅｎネコ肉１隙ウィルはより非生産的に形質転換さ
れたもの［５ｎｙｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９６９）
　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌａｎｄ）　２２１．　ｐＤ１０７
４−１０７５　］、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ肉１１４ウィ
ルＸ　−形質転換３Ｔ３＃Ｉ胞系統、３Ｂ１１−ＩＣ［
Ｂａ５ｓｉｎｅｔ　ａｌ−（１９７０）　ＩｎＬＪ、Ｃ
ａｎｃｅｒ　６、ｐｐ、　９５−１０７　ＴＩ、及び２
つのヒト転移黒色嘘系統、Ａ２０５８　（例Ｉ参照）、
及びＡ３７５　［Ｇｉｒａｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７
３）　Ｊ、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎ−ｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　
５１、ｐｐ、　１４１７−１４２３　］により条件付け
られた無血清培地から精製した。細胞は１０％つ／血清
を補給されたダルベツコ−の修正イーグル培地Ｆａ有す
る２ｔのプラスチックローラーボトル中で生育し、次い
でデラルコ等［ＤｅＬａｒｃｏ　ｅｔ　ａｌ。

（１９７８ン　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、Ｓｅｔ
、ＵＳＡ　７５、ｐｐ。

４００１−４００５　）に記載される無血清ウェイマウ
ス培地中［＃ｔＬ持した。無血前条作付は培地？冴時間
毎に３日間採集し、連続流動遠心分離で清澄化し上澄液
を濃縮した［Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ−（１９
８０）Ｊ−ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５、Ｉ
］ｐ、９１７７−９１８１］。この条件付は培地の濃縮
液がＴＧＦの精製の出発材料であった。

ＴＧＦの精製 これらのＴＧＦは、先に例Ｉにおいて黒色独−由来ｈＴ
ｃＦの精ａについて説明された方法に実質的に従って調
製された。条件付は培地の限外済過後の保持分？帆ＩＭ
酢酸に対して透析を行い、遠心分離後の上澄液？凍結乾
燥により濃縮し、１Ｍ酢酸中で元にもどして引き続き１
３ｉｏ−Ｇｅｌ　Ｆ　−１０（２００−４００メツ７ユ
、１３ｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のカ
ラム（２，５Ｘ８５ｍ）上でのゲル透過クロマドグ、ラ
フイーな行った。この力２ムは１Ｍ酢酸により平衡化さ
れた。見かけ分子社約７．０００の主ＥＧＦ−競合活性
分を計む・画分をプールし、速結乾燥した。

ｒＴＧＦ、　ｍＴＧＦ、及びｈＴＧＦの最終精製は例Ｉ
で説明したクロマトグラフィー系を用し）た逆相、　Ｈ
ＰＬＣにより達成した。分離はμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ
１Ｈカラム（１０，１１ｍ粒径、０．３９Ｘ３０ｆｆｉ
、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ−ｉａｔｅｓ）上で行った
。可動相は０，０５％トリフルオロ酢酸であり、町勧相
変性剤は（ＬＯ４５％トリフルオロ酢酸を含有するアセ
トニトリルであった。アセトニトリルの濃度はペプチド
の溶出のために４℃において１１／分の流速において２
時間の量線形的に増大させた（（１，０８３％／分）。

ＴＧＦ含有ゾール分を凍結乾燥し、ＬＯ５％トリフルオ
ロ酢酸中で元にもどし、同一カラム上で帆０３５％のト
リフルオロ酢酸を言句するｌ−ゾロノぞノールを司動相
変性削として使用して再クロマトグラフを行った。１−
プロ、ｅノール濃度は４０℃において１ｒＬｔ、７分の
鑞速で２時間の量線形的に増大させた（０．０５％／分
）。

主ＥＧＦ−ｊｌＡ合活性を含む両分のプールを直結乾燥
した。

ＴＧＦアッセイ ＴＧＦは！ウスの顎下線表皮成長因子（ｍＥＧＦ）との
りセプターの交差反応性に基づくラジオリセプターアッ
セイにおいて定置した。精製ｍＥＧＦは例Ｉで説明した
クロラミン−Ｔ法の修正方法によりＮａ１２５工でンぺ
／Ｌ”２付した。この１２５Ｉ　−ＥＧＦ結合アッセイ
はマイクロテスト■シレー）　（Ｆａｌｃｏｎ　）中に
おいてＢｘｌＯｅのホルマリン−固定Ａ４３１ヒト癌細
胞について行った。ＴＧＦの濃度はｍＥＧＦ　ｎ？当量
数／ｌで表わし、公知敬の未標識ｍＥＧＦとしてのＡ４
３１細胞に結合する”’Ｉ−ＥＧＦの同等な阻害乞生成
するに必要とするＴＧＦ　ｇ）ｋ　ｉｃ基づくものであ
った。

ＴＧＦのアミノ酸配列決定 アミノ酸配列分析には、ｒＴＧＦ　（３μｇ）ングアニ
ノｙ　−ＭＣＩ　（６Ｍ）及びＮ　ａ　２−　Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ　（０−１％）をき有するトリＸ−ＨｃＩ緩衝液
Ｃ０，４Ｍ）、ＰＨ８，５゜０Ｚｏｏ　を中において、
ジチオトレイトール（２０ｍＭ）で５０’Ｃにおいて２
時間減少させ、次いでρ℃におＶ）て（資）分間ヨード
アセタミド（４５ｍＭ）でＳ−カルボキサミトメチル化
した。Ｓ−カルホキ丈ミ　トメチルｆヒｒＴＧＦをμＢ
ｏｎｄａｐａｋ　Ｃ□８カラム上で脱塩した。ペゾテ下
乞帆０４５％トリフルオロＩＮ’Ｆｌｆｆを含有する水
性アセトニトリルの勾配で溶出した。

アセトニトリルの濃度は４０℃において１１／分の流速
で１時間内に、線形的に増大させた（１％／分）。

Ｓ−カルボキサミトメチル化ｒＴＧＦ及び未変性ｍＴＧ
Ｆ及びｈＴＧＦの自ｒＪＪＪ配列分析１：　Ｅｄｍａｎ
　ｅｔ　ｅｌ　。

（１９６７Ｊ　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉ、ｐ
ｐ、　８０−９１　）は気−液固相マイクロノークエネ
イタ−（ｍ１ｃｒｏｓｅｑｕ−ｅｎａｔｏｒ）　［Ｈｅ
ｗｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｊ−ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５６、ｐｐ、　７９９０−７９９７　）を用いて行っ
た。ノークエネイター画分は逆相Ｉ（ＰＬＣにより分析
した１：Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ−（１９
８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１９、ｐｐ。

６５０−６５９　］。

Ｂ、結果 ＴＲＧＦｏ）精製 小分子＋ｆｃｒＴＧＦ、　ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦの′ｍ
製された標本がそれぞれレトロウィルス−形質転換ラッ
ト及びマウスの鷹維芽細胞及び２つのヒト黒色腫細胞系
統の条件付は培地から得られた。精製は酸−可溶性ＥＧ
Ｆ−競合活性の１Ｍ酢酸中のｌ１ｉｏ−ＧｅｌＰ−１０
上でのゲル透過クロマドグ２フイーを行った後、順次水
性アセトニトリルの線形勾配を用り引き続き０．０３５
％のトリフルオロ酢酸ヲ含有する１−プロパツールを用
いたμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８支持体上の逆相ＨＰＬ
ＣＫより達成された。ｒＴＧＦ。

ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦの最終精製工程の溶出パターンは
ＥＧＦ−競合活性が明確な吸収ビークを以って共精製さ
れ、汚染ＵＶ−吸収物質から有効に分離された。ｒＴＧ
Ｆ、　ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦＫおける主たる蛋白％、５
−りは標準条件下におＶｌて４８〜５５分の間にμＢｏ
ｎｄａｐａｋ　Ｃ１，カラムからｂ出した。

Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ−１０上でのゲル透過クロマドグ２
フイーは、より大きな分子量のＴＧＦからの小分子量Ｔ
ＧＦの分離？与え、久の精製工程におけるμＢｏｎｄａ
ｐａｌ＜　Ｃ１Ｂカラムにかけられる蛋白質の負荷を減
少させた。小分子ｉ　ＴＧＦはＷ期の全ＥＧＦ　−ｍＡ
合活性の４５−８０％を表わした。次の２つの私製工程
におけるμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８支持体上でのＴＧ
Ｆの逆相ＨＰＬＣは極めて効率がよく各々典型的標本に
おいて各工程当り８０〜１００％の範囲の回収率を与え
た。小分子値ＴＧＦの最終回収率は、精製の隙に検出さ
れた最大音ＥＧＦ−競合活性に基づＶ）てはｈｔ　７（
１％であった。半均収率は条件Ｕげ培地当り、精製ｒＴ
ＧＦば９０ｎｇ／４．　ｍＴＧＦｔま５０ｎｇ／を及び
ｈＴＧＦは１０ｎｇ／ｌであった。この計算は、単離さ
れたＴＧＦ　Ｉｃついてめられた特異活性、並びに２ノ
メーリセプターアツセイにおＶ）て測定されたＥＧＦ　
−Ｏｘ合活性は大小の分子量のＴＧＦの全敗のみを文映
するとの仮定に基づ（ものである。条件付は培地中には
免疫反応性ｍ　Ｅ　Ｇ　Ｆは検出されなかった。

ＴＧＦの純度 クロマトグラフ溶出プロフィールから示唆されるｒＴＧ
Ｆ、　ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦの純度は、ＥＧＦラジオリ
セプターアツセイにおし）てアミノ酸配列分析により評
価された。ｒＴＧＦ、　ｍＴＧＦ及びｈＴＧＦ＆ｊ。

Ａ４３１ヒト瘤細胞上のＥＧＦす七シタ一部位に対して
１２５Ｉ−ＥＧＦ’と競合し、定性的且つ定量的に船逢
を了ｍＥＧＦとは区別不能であった。従って、最終ＴＧ
Ｆ標本は高度に精製され、実質的に均質なものと思われ
る。単一アミノ末端配列がｒＴＧＦ、　ｍＴＧＦ及びｈ
ＴＧＦｌｃついて自切化Ｅｄｍ；１０劣化によりめられ
た。使用された方法によれば、５％より大で存在する任
意の少量のブロックされてないペゾチド配列も検出され
たはずである。ｂＴＧＦの均質性は更にドブノル硫酸ナ
トリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により
確認された。精製標本は１つの主ポリペプチド帯を与え
た。

ＴＧＦのアミノ酸配列決定 ｒＴＧＦ、　ｍＴＧＦ及びｂＴＧＦの完全な配列決定が
達成され、こり、もの３つの＋ｌ？リペプテドのアミノ
欧配列２以下に示１−０この配列よりｒＴＧＦ及びｍＴ
ＧＦは化学的構成において同一であり、更にネズミのＴ
ＧＦとｂＴＧＦ間に実質的な類似性が存在し、異ったア
ミノ酸残基は配列中の７．１５，２３及び：３８の位置
にのみ生じていることが判る。

ｆｉｌ　工１９旦 Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−ＰＩ＋ｅ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−＋２１　ｍＴＧＦ Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−ＩＩｉｓ−ｐｈｅ−Ａｓｎ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ（３１１１ＴＧＦ Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−０ Ｇｌｙ−Ｐｂｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃ
ｖｓ−ＯＧｌｕ−）１ｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ａｌ　ａ例■ ｉｎ　ｖｉｖｏでのＴＧＦの製造及びその単賠ＴＧＦ　
（ヒト黒色腫及び形質転換ラット）乞産生することの知
られているＭ４に４　ａ　ｌ１ｍ系統（ＩＸＩＯ）’ｖ
ｓ胸ｍの「ヌード」マウスに接種して開動を発′Ｈさせ
た。１傾動保有マウスからの尿を集め、上記例■で示し
て午離操作及び分析技術ケ用いて、ＴＧＦの存在の分析
を行った。独膓保有マウスの尿にはＴＧＦが検出され、
それは上記例１及び■で説明した細胞培養物由来のＴＧ
Ｆと同一の大きさ及びＨＰＬＣ上の溶出ｌ時性を有した
。更に、上記例Ｉで説明した操作？用いて、マウスの尿
に存在するＴＧＦはそれが細胞の固定源−非依存性成畏
を刺戟し、ＥＧＦリセプターに結合する点において特徴
的なＴＧＦの生物学的性實を有することが判明した。

引き続き呻郷保有マウスから忰〃、ｒ！乞敗り除き、腫
瘍除去後のマウスの尿について上記操作を用いてＴＧＦ
の存在の試験乞行った。この場合において、ＨＰＬＣに
おける溶出特性或いはＴＧＦ様生物学的活性を有するＴ
ＧＦは見出されなかった。これらの結果は、１躍蛎細胞
は細胞培養液と同様に全動物においてＴＧＦ　７ａｌ−
産生し、ＴＧＦは本発明の方法ビ用いて体液内に検出さ
れ、それより単離することができること乞示している。

同様な実験を化学的発癌物質誘発１′Ｐｌｉ　’％　乞
有するラットについても行ったところ、それらは上記生
物学的及び生化学的・時性ＶＣ基づきＴＧＦｔＫ中に有
することが判明したのに対し、未処理のラットはそれら
ケ有しなかった。

例■ 胞生育の阻害 下記アミノ酸配列（ラットＴＧＦのアミノ酸配列調−力
に対応する）馨有するオリゴペゾテド乞オーガツク等［
Ｏｈｇａｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３〕Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈ、　５７．　ｐｐ、　
１７１−１８４）の固相技術を用いて合成した： Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａ１　ａ−Ａ
ｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ４Ｊａこのオリゴペプチドを次い
で・々ロン等［Ｂａｒｏｎカッシリングさせ、ウサギＬ
　Ｂａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）９旦２８．
９ｐ、　３９５−４０４１及びヒツジ［：　Ｌｅｒｎｅ
ｒ（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９９、ｐｐ−５９２
−５９６〕娶免疫化するために使用した。抗血清はペプ
チドに対してパーオキシダーゼ結合イムノアッセイ（Ｋ
ｉｒｋｅｇａ−ａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉ　ｔｂｅｒｓｂｅｒｇ、　
ＭＤ　）及び均質２ツ）　ＴＧＦ　（上記例■に従って
イ青製）に対し免疫沈降（Ｂｉｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ　
（１９８０）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６、’ｐｐ−６
１７−６２１〕、及びウェスタン（ｗｅｓｔｅｒｎ　）
　’ｆｊ：［Ｂｕｒｎｅｔｔ（１９８１）　Ａｎａｌｙ
ｔ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　１１２、ｐｐ。

１９５−２０３］により行った。Ｉ？５Ｉ−操識イしラ
ットＴＧＦ及びマウスＥＧＦ　（Ｂｅｔｂｃｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｌｔ　Ｌａｂｓ。

Ｂｅｔｂｅｓｄａ、　ＭＤ　）の９６−ウェル／マイク
ロタイタープレート内で生育されたＡ　４３１　＃ｆｌ
胞への結合は、マウス等［Ｐｒｕｓｓ　ｅｔ　ａｌ、　
（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　５ｃｉ−ＵＳＡ　７４　、ｐｐ−３９１８
−３９２１）において説明されている通りである。

１匹のウサギ及び２匹のヒツジにおいて調製された抗血
）ｎはパーオキシダーゼー結合イムノアッセイにおいて
対応するペプチドと少なくとも１０’の力価で反応した
。ウサギ抗血清とラツ）　ＴＧＦとの反応は免疫沈降法
により記鎌？取りウェスタン法により確１ｇシた。本仙
究においては、抗ペプチド抗血清はヨード化マウスＥＧ
Ｆ　ン免疫沈降させなかった。

ヒトエビテルモイドＡ４３１翁１１胞は治口胞当り］ｉ
Ｊ６を越えるＥＧＦリセブタ−ｖｉする［　Ｆａｂｒｉ
ｃａｎｔ　ｅｔａｌ、　（１９７７Ｊ　Ｐｒｏｃ−Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｒｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４、ｐｐ
−５６５−５６９］。ＴＧＦはこれらのりセプクーへの
結合に対してＥＧＦと競合する。１２５■−ｔ、＞識化
シットＴＧＦのこれらの細胞への結合（膚、過剰の未標
識化ＥＧＦ及びペプチドに対する抗血清により遮断され
た。抗血清のＴＧＦ結合に対する遮断効果は、仮に抗体
−ＴＧＦ複合体がＳ、マウレウス蛋白質Ａにより容易に
された免疫沈降によってＡ４３１細胞を囲む培地から除
去されない場合にも観察された。抗血清は免疫沈降アッ
セイにおいて精製ヨード化ＥＧＦ　リセプターとは反応
しなかったので、抗体による遮断はりセプターよりもＣ
しろＴＧＦ分子との相互作用の結果であった。免疫沈降
データから予想された如く、ペプチドに対する抗血清は
ネズミＥＧＦのＡ４３１細胞に対する結合乞妨害しなか
った。

ＴＧＦの細胞結合？遮断するが、ＥＧＦはしない抗血清
の利用可能性により、オートクライン（ａｕｔｏ−ｃｒ
ｉｎｅ）機構によるＴＧＦ機能が悪性細胞の成長乞刺戟
するかどうか及び抗体がこのようにしてその様なｉｎ　
ｖｉｔｒｏの成長を阻害１−るかどうかを試験すること
が可能であった。その結果、未形質転換正常ラット腎臓
細胞（ＮＲＫ）及び各種レトロウィルス細胞系統は血清
富有培地中において低密度で平板培養され（皿当り５０
０〜２，０００羽１１胞〕、短時間の付着の後無血清Ｊ
台地にスイッチさｈ　Ｔこ。培地にＴＧＦペプチド或い
は各種未Ｂ’ｌ連の非又差反応ペプチドに対するヒツジ
或いはウサギ抗体を０メ加し、ｉＩ聞胞成成長敵視的及
び巨視的コロニー形成及びコロニーの形山に及ぼづ一影
響馨観察した。全ての抗体はペプチドカラム上でアフイ
ニテイーイ′１１製を行い、十分に透析し、０縮し、且
つ１０〜１０　の抗ペプチドカ価に再措゛成した。結果
乞下記表１１ＶＣ示す。

上記表■に見られる如く、ウサギ或いはヒツノ抗−ＴＧ
ＦオリゴペゾチドのいずれもＮＲＫ細胞によるコロニー
形成を阻害し７よかったが、・４８時間以内にＫｉｒｓ
ｔｅｎ−形質転ｆｉＮＲＫ細胞、ネコー肉軸−ウイルス
ー形質転換うット胚繊維＃−細胞（ＣＬＩＯ細胞〕及び
Ｒｏｕｓ−肉穐−ウィルスー形負転Ｊ英３Ｔ３細胞の成
長馨阻害した。ＣＬＩＯ細胞はＴＧＦの多韮生産本であ
ることか公知であった［Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　ｅＬ　ａ
ｌ。

（１９８３）　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ　８０、ｐｐ−４６８４−４６８８）。

抗−ＴＧＦ抗体−処理細胞における少数の住き残ったコ
ロニーは大きさが小さい傾向を示し、正常コロニーの遥
しい外観に欠けていた。培地中には非付７Ｂ性未鹸）弄
細胞が遊離して浮んでいた。この阻害はＴＧＦペプチド
、但し非父走反応未関連性ではないペプチドがＴＧＦに
対する抗体と共に麟加された場合にはｂ公的に逆転され
た。

４種の異った非又差反応性ペプチドに対するウサギ及び
ヒツジ抗体はＮＲＫ　＃：いはレトロウィルス形質転換
細胞系統のコロニーの成佼には伺寺の影響も及ぼさなか
った。７２時間後に抗１４き有培ｉ１１！！馨耕たな無
抗体培地で置挨したところ、コロニー形成の阻害は逆転
せず、生き残ったコロニーが激しく成長した。

例■ ラツ）　ＴＧＦの合成及び特徴付け Ｗす■に示した化学式ケ有するラットＴＧＦ（ｒＴＧＦ
）の化学合成馨メリフィールド［Ｍｅｒｒｉｆｉ−ｅｌ
ｄ　（１９６３）　Ｊ、Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ−５ｏｃ
−８５、ｌ］Ｉ）−２１４９−２１５６１により説明さ
れる一般原則に従って段階的固相手法により手作業で行
つ１こ。この合成には異った噛−不安定性保議基手法を
採用し、Ｎ−アミノ末端に対するｔｅｒｔ−ブチルオキ
７カルボニル及び側鎖に対するベンノルアルコール誘導
体の通常の組み合わせ？用いた。保、ｉ勺アミノ酸？重
合体支持体に固足した、より酸安定性のベンノルエステ
ル結合を使用して繰返し行われる酸処理の間のペプチド
の損失を最少にし７ｊ　［Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　ｅｔ　ａ
ｌ。

（１９７６）　Ｊ、　Ａｍｅｒ、、Ｃｂｅｍ、　ＳＯＣ
，９２、ｌ）［）、　７３５７−７３６２　）。ペプチ
ドの樹脂からの完全な脱保禮及び除去は、り五等［Ｔａ
ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　’ｆｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎＬｅｔｌ　２３．１）ｐ−４４３５−４４３８〕
の低−高ＨＰ法により行われた。この方法は１通常のＨ
ＦＩＩＱ保鷹法と異り、ベンジル保ｄ基を稲ＨＦｉ液中
においてＳＮ２機構により除去し１通常の５ＮＩＩ医祿
方法において生成したカルボカチオンによる激しい副反
応２最少にした。史に、それは又多くのノスルフイド結
合ケ合有１−る蛋白質の合成ケしばしば妨害する多くの
７スデイニル副反応ン減少させることを意図′ｆるもの
である。

ＨＦ処理後如ＰＩなるｆ＃脱も行う罰に、粗製の還元さ
れた合成ｒＴＧＦｋ還元及び酸化グルタチオンの組み合
せの存在下において混合フスルフィド法により酸化及び
再生乞行う［Ａｈｍｅｄ　ｅｔ　ａｌ−（１９７５）Ｊ
、　Ｂ１１１．　Ｃｈｅ＋ｎ、　２５０．　ｐｐ、８４
７７−８４８２　：］。これは、精製中ＶＣおける重合
体物質の形成を回縫した。再往された粗製ｒＴＧＦ−１
は天然ｒＴＧＦ−１に比較して、４０〜５０％のＥＧＦ
　−ｔジオリセプター及びテロノン−〇異性蛋白質キナ
ーゼ活性をき有した。１１１製合成ｒＴＧＦ−Ｉは３段
階、即ち ＋１１　８ｉｏ−Ｇｅｌ　Ｆ　−１０カラム上でのゲル
濾過、（２１ＣＭ−５ｅｐｂａｄｅｘカラム上テノイオ
ン父換りｏ−ｑトゲラフイー、及び １３１　Ｃ−１８逆相カラム上での調錬高圧′ｏ、体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） ｅこおいて均一になるまで精製された。総括収率はＡＩ
ａｏ）樹ｉＩｄへの出発負荷材に基づいて３１％であっ
た。

還元或いは非還元条件下において、精製された合成ｒＴ
ＧＦ−ＩはＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　゛龜気泳動上見がけ分
子址７０００の単−帯を与え１こ。６ＮＨＣ＋によるア
ミノ酸分析及び酵素加水分解は、提束された配列の予想
された理論的モル比乞与えた。合成ｒＴＧＦについての
エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）法のスルヒドリル決定により
遊離チオールは検出されなかったが、チオール分路還元
時には６個の７ステインの予想された理論値が得られた
。これらの知見は、合、−ｒＴＧＦは、ジスルフィド結
合内に６個の７ステインを含有する羊−鎖ポリペプチド
であるという結論？支持し、それは、天然ｒＴＧ　Ｆの
予想される化学的性゛―と合致している。更に１合成ｒ
ＴｃＦ’はＣ−１８逆相ＨＰＬＣＩＣおいて天然ｒＴＧ
Ｆと共に単一対称ピークとして共浴出した。

本例に従って調製された合成ｒ’ｒＧＦＹ、推定的形質
転換成長因子の生物学的性質について３種のアッセイに
おいて対比した。分裂促進１’＋１１アツセイにおいて
は、血清除去された正常なラット腎１減細胞のｒＴＧＦ
　ＶＣよる成長のψり戟は　■−ヨードデオキシウリジ
ンン導入１−ることにより測足された。

胎児ウノ血清及び第２ＴＧＦ、ＴＧＦ−ベータの存在下
における軟寒天アッセイにおいてはｒＴＧＦによる形伸
学的及び表現型変化は軟寒天中のコロニー形成により定
ち１：１−ることかできた。後者の形質転換アッセイは
呻瘍形成性とよく関連することが示されてｖｒ７．ｘ　
［５ｔｏｋｅｒｅｔ　ａｌ、（１９６８）　Ｉｎ１−Ｊ
、Ｃａｎ−ｃｅｒ　３、ｐｐ、　６８３−６９３　］。

胎児ウノ血清或いはＴＧＦ−ベータ単独では、培養液中
のＮＲＫ翁ＩＩ　ｄ’ｔｑの形質転換を誘発しない。同
様に、天然或いは合成のＴＧＦ　モＴＧＦ−ベータの不
存在下に：ｔｎ　ｌ／１てその様な効果乞生成しない。

合成及び天然ｒＴＧＦの両者はこれらの２つのアッセイ
において同様の投与猷応答曲線及び半−最大活性乞示し
た。

ｒＴＧＦは、ＥＧＦ　リセグターの細胞膜上べの結合に
対してｍＥＧＦと競合するので、合成ｒＴ９ＦＹＡ４３
１ヒト癌細胞への結合について天然ｒＴＧＦと対比した
。ここでも又、天然及び合成ｒＴＧＦの応答及び活性は
相互に区別不可能であった。　Ｉ−ＥＧＦ結合の犯％阻
害に必要とされた濃度は天然及び合成−士ＧＦにつ―て
谷々の３．５及び４．１ｎＭであった。ＥＧＦ膜リセす
ターＩ／ｃ結合するＴＧＦ或いはＥＧＦの結果は合成ペ
ゾチド或いは内因性基質のチロノン残基のホスホリル化
の刺戟である［Ｐｉｋｅｅｔａｌ、（１９８２〕　Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７、ｐｐ、１４６２８−１４
６３１　）。合成ｒＴＧＦはレイノルド等［ｌｅ３’ｎ
０−１ｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ
　２９２、ｐｐ、　２５９−２６１　］により報告され
た天然ｒＴＧＦに対する値に匹敵する活性である０、３
ｎＭの半最大活性？以って合成アンゼオテン／ニルペプ
チド基質のホスホリル化ケ刺戟することが判明した。

出願人代理人　猪　股　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともｌ　ＩＩＭＩの下記一般式で表わされる
   ペプチド配列をよんでなることを１１ｆ徴とする生物学
   的活性ポリペプチド…ニ ーＣＹＳ−（ＡＡ）　ａ−ＣＹＳ−（ＡＡ）　１）−Ｃ
   ｙＳ−（ＡＡＪ。−Ｃｙｓ−ＡＡ−ＣｙＳ−（ＡＡ）ｄ
   −ＣｙＳ−（式中、ＡＡはＶａｌ、　Ｓｅｒ、　Ｈｉｓ
   、　ＰｋｌｅｌＡｓｎ。 Ｌｙｓ、　ＡｓｐｌＩＴｈｒ％Ｇｉｎ、　Ａｒｇ％Ｌｅ
   ｕｌＩＧｌｕ。 Ｐｒｏ、　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｔｒｐ及びＴｙｒ、よ
   り選ばれたアミノ酸残基であり％　ａは７であり、ｂは
   ４又は５であり、Ｃは１０であり、及びｄは８である）
   。 ２　ｂが４である特許請求の範囲第１ｙ＝記載の生物学
   的活性、＋ｊ’リペプチド。 ３、下記一般式で表わされる生物学的活性ポリペプチド
   類或いはそのオリゴマー類： （ＡＡＪｎ−Ｃｙｓ−（ＡＡ）１ｎ−Ｃ）’５−（ＡＡ
   Ｊｏ−Ｃｙｓ−（ＡＡ）ｐ−ＣｙＳ−ＡＡ−ＣｙＳ−（
   ＡＡ）、−Ｃｙｓ−（ＡＡ）　ｒ（式中、ＡＡはＶａｌ
   、　Ｓｅｒ、　Ｈｉｓ、　Ｐｈｅ％Ａｓｎ。 Ｌｙ　”　ｓ　Ａ　’　ｐ　−、Ｔ　ｈ　ｒ　１Ｇ　ｌ
   　ｎ　ｓ　Ａ　ｒ　ｇ　ｓ　Ｌ　ｅ　ｕ　ｓ　ＧＩ　ｕ
   　。 Ｐｒｏ、Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　’ｒｒｐ及びＴＹ”　ｓ
   より選ばれたアミノ酸残基であり、ｎは４〜１０の整数
   であり、ｍは７であり、Ｏは４又は５であり、ｐは１０
   であり、ｑは８であり、及びｒは６〜１２の整数である
   ）。 ４．０が４であり、ｎ及びｒが７である特許請求の範囲
   第３項記載の生物学的活性ポリペプチド。 ５、下記一般式で表わされる少なくとも１個のペプチド
   配列な含んでなることな特徴とする生物学的活性ポリペ
   プチド類ニ ーＣｙｓ−（ＡＡ）ａ−Ｃ）’５−（ＡＡ）６−Ｃ）’
   ５−（ＡＡ）ｃ−Ｃｙｓ−ＡＡ−Ｃｙｓ（ＡＡ）ｄ−Ｃ
   ｙｓ−（式中、ＡＡはＶａｌ、Ｓｅｒ、　Ｈｊｓ、　Ｐ
   ｈｅ、　■Ｉｅ。 Ｍｅｔ、　Ａｓｎ、　ＬｙＳ、ＡＳＩ）、　Ｔｈｒ、　
   Ｇｌｎ、　Ａｒｇ。 Ｌｅｕ、　Ｇｌｕ、　Ｐｒｏ、Ａｌａ、　ＧｌｙＩＩＴ
   ｒｐ及び’ｌ’ｙｒ、より選ばれたアミノ酸残基であり
   、ａは７であリ、ｂは４であり、Ｃは１０であり、及び
   ｄは８である）。 ６、下記一般式で表わされる生物学的ポリペプチド類或
   いはそのオリゴマー類： （ＡＡ）ｎ−ＣｙＳ−（ＡＡ）ｍ−Ｃｙｓ−（ＡＡ）。 −Ｃｙｓ−（ＡＡ）　−ＣｙＳ−ＡＡ−Ｃｙｓ−（ＡＡ
   ）　−ＣｙＳ−（ＡＡＪｒｐ　ｑ （式中、ＡＡはＶａｔ、　Ｓｅｒ、　Ｉｌｅ、　Ｍｅｔ
   、　Ｈｉｓ。 ＰｈｅＩＩＡｓｎ、　Ｌｙｓ％Ａｓｐ％ＴｈｒｌｌＧＩ
   ｎＩＩＡｒｇ。 Ｌｅｕ、　Ｇｌｕ、　Ｐｒｏ、Ａｌａ、　ＧｌｙｌＩＴ
   ｒｐ及びＴｙｒより選ばれたアミノ酸残基であり、ｎは
   ４〜１０の整数であり、ｍは７であり、０は４であり、
   ｐは１０であり、ｑは８であり、及びｒは６〜１２の整
   数である）。 ７、下記一般式で表わされるポリペプチド形質転換成長
   因子或いはそのオリゴマー類： Ｖａｌ−Ｖａｔ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｒ
   −Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＨｉＳ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−
   Ａｒｇ−Ｒ’−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃ）’５−Ｇ
   ｌｕ−Ｈｉｓ−Ａ１ａ−Ａｓｐ−ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
   ａ （式中、ＲはＡｓｐ又はＬｙｓであり、Ｒ′はｐｈｅ又
   ８、　ＲがＡｓｐであり、Ｒ′がｐｈｅであり、Ｒ′が
   Ｓｅｔであり及びＲ“′がＰｈｅである特許請求の範囲
   第７項記載のポリペプチド。 ９、　ＲがＬｙｓであり、Ｒ′がＴｙｒであり、Ｒ′が
   Ｐｈｅであり、及びＲ′がＴｙ「である特許請求の範囲
   第７項記載のポリペプチド。 １０、１以上の下記ペプチドフラグメントをよんでなる
   ことを特徴とするポリペプチド成長因子：Ａ、Ｖａｌ−
   Ｖａｌ−８ｅｒ−）１ｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−
   Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇ
   ｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
   ｒ−ＣｙｓＢ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈ
   ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−８ｅｒ
   −）Ｉｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｂｅ
   −Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＣ，Ｌｅｕ−Ｖａｌ
   −Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
   Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｉ（ｉｓ−８ｅｒ−Ｃ１ｙ、
   及びり、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉ
   ｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１ａ １１、ポリペプチドがペプチドフラグメントＡ及びＣを
   きむ特許請求の範囲第１０項記載のポリペプチド成長因
   子。 １２、ポリペプチドがペプチドフラグメントＢ及びＣを
   含む特許７．請求の範囲第１０項記載のポリペプチド成
   長因子。 １３、ポリペプチドがペプチドフラグメントＢ、Ｃ及び
   ＤＩ含む特許請求の範囲第１Ｏ項記載のポリペプチド成
   長因子。 １４、下記群より選ばれる抗原性オリゴペプチド：Ａ、
   Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｌ＋ｃ−Ａｓｎ−
   Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｈ４５−Ｔｈｒ Ｂ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ
   −Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＨｉＳ−Ｔｈｒ Ｃ，Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｄ、Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ Ｅ、Ｃｙｓ−）１ｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｌｘｅ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−）１
   ｉｓ−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌ、ｅｕ−Ａｌａ Ｆ、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
   −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−
   Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｌａ １５、イ（Ｕ胞成長因子すセプターに結合する能力を有
   し、下記一般式で表わされるオリゴペプチド：（ＡＡ　
   ）　−ＣＹ　Ｓ−（ＡＡ）　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｒ−（Ａ
   Ａ）　ｚ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｃ’／Ｓ−（ＡＡＪ　ｉ （式中、ＲはＰｈｅ又はＴｙｒであり、　ＡＡはＶａｌ
   。 ＡＳｎ、　Ｈｉｓ、　Ｓｅｒ、　Ｖａｌ、　ｌ１ｅｌＩ
   Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ。 Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｃｙｓ％Ｔｈｒ、　Ａｌａ、　Ｔ
   ｙｒ、　Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、　Ｇｉｎ、及びＡ　ｒｇ　ｓ
   　より選ばれにアミノ酸残基、Ｘは０又は１−６の整数
   であり、ｙは２．２は３及び２′はＯ又は１〜６の整数
   である）。 １６、ｘ及び２が０であり、ＡＡが■ａ１％Ｈｉｓ１Ｓ
   ｅｒ。 ｊｌｅ、　Ｑｌｙ及びＡＳｐより選ばれたアミノ酸残基
   である特許請求の範囲第１５項記載のオリゴペプチ　ド
   。 １７下記一般式で表わされる生物学的活性オリゴペプチ
   ド： （ＡＡＪ　ｘ−ＣｙＳ−（ＡＡ）　２−Ｇｌｙ−（ＡＡ
   ）　２−Ｇ　’Ｙ−（ＡＡ　）　２−　Ｃｙ　Ｓ　−（
   ＡＡ　）　２１（式中、ＡＡはＰｈｅ、　Ｖａｌ、Ａｓ
   ｎ、　Ｈｊｓ、　Ｓｅｒ。 Ｖａｔ、　Ｉｌｅ、　Ｇｌｙ、ＬｅｕＩＩＡｓｐ％Ａｓ
   ｎ、　Ｃｙｓ。 Ｔｈｒ、　Ａｌａ、　Ｔｙｒ、　Ｐｒｏ、Ｇｌｕ％ＧＩ
   ｎ、及びＡｒｇ。 より選ばれたアミノ酸残基であり、ＸはＯ又は１〜６の
   整数であり、及び２′は０又は工＼６の整数である）。 １８、下記群より選ばれた特許請求の範囲第１６項記載
   のオリゴペプチド： ｆｉｌ　Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ及び ｆ２１　Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｂｅ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ １９、特許請求の範囲第７項及び第１Ｏ項のポリペプチ
   ド成長因子或Ｌ／）は特許請求の範囲第１４項の抗原性
   オリゴペプチド類に対して産生された抗体。 ２０、検出可能な信号を与えることのできる２ペルで標
   識化された特許請求の範囲第１９項記載の抗体。 ２１、細胞毒性物質で標識化された特許請求の範囲第１
   ９項記・款の抗体。 ２２、形質転換成長因子生産性、腫瘍−保有咄乳動物の
   体液から得られた形質転換成長因子ポリペプチド類に対
   して産生された抗体。 ２３、均質な形質転換成長因子ポリペプチドを不純な形
   態で該形質転換成長因子ポリペプチドを含有する水性培
   地から単離する方法であって、下記工程を３んでなるこ
   とを特徴とする方法＝ｆｌ）　形質転換成長因子な不純
   な形態で含有する水性培地な、酢酸水溶液に対して透析
   を行い、形質転換成長因子ポリペプチドな含有する溶媒
   相を与え、この相を濃縮し、及び必要に応じて清澄化さ
   せる工程、 （２）工程ｆｉ＋の濃縮溶媒相を酢酸水溶液で復元し、
   酢酸水溶液で調整したゲル透過クロマトグラフィーカラ
   ムに復元溶液な適用し、酢酸水溶液で溶出することによ
   り復元溶液のゲル透過クロマトグラフィーを行って、形
   質転換成長因子ポリペプチド？高められ１こ純度の状態
   で含有する選択された溶出液画分を得、該選択画分な合
   一し、濃縮して部分的に精製された形質転換成長因子ポ
   リペプチドき有生成物？与える工程、及び （３）工程（２）の部分的に精製された形質転換成長因
   子ポリペゾチド庁有生成物を、該生成物をトリフルオロ
   酢酸水溶液中で街元後にトリフルオロ酢酸水溶液で平衡
   化しておいた１μ上の炭化水素結合７リカマトリツクス
   カラムに通して高圧液体クロマトグラフィー条件下にお
   いて逐次逆相高圧クロマトグラフィーに付するに際し、
   最初のカラム醒出をトリフルオロ酢酸水溶液中で線形ア
   セトニトリル勾配を用いて行い、及び次の、最初の高圧
   クロマトグラフィ一工程で得られた合一された形質転換
   成長因子ポリペプチドさ有画分（７Ｉ：ついて行われる
   カラム溶出なトリフルオロ酢酸水溶液中で線形ｌ−プロ
   、４１ノール勾配を用いて行い、該１−プロノ々ノール
   勾配は十分に小さいｌ−ゾロノξノール濃度増加分にて
   増大せしめ、形質転換成長因子ポリペプチドを均質ポリ
   ペプチド状態の単一の明確なピークとして与えるように
   して行う工程。 ２４、該形質転換成長因子、Ｉ？リペゾチドを不純ブよ
   形態で１有する水性培地が、形質転換成長因子を１有す
   る体液或いは形質転換成長因子産生細胞系統により条件
   付けられた水性培地である特許請求の範囲第６項の方法
   。 ２、特許請求の範囲第お項記載の均質形質転換成長因子
   ポリペプチド類に対して産生された抗体。 ２６、検出可能な信号？与えることのできるラベルで標
   識化された特許請求の範囲第ｎ項又は第５項記載の抗体
   。 ２７、細胞毒性物質で標識化された特許請求の範囲第２
   ２項又は第５項記載の抗体。 部、生育ａ」能な形質転換成長因子産生細胞系統により
   条件句けられた無血清培地であって、且つ清澄化及び画
   線された無血清培地から均質形質転換成長因子ポリペプ
   チドを単離する方法であって、−ト記工程？含んでなる
   ことをｑｆ徴とする方法： （１）この条件イリは培地な酢酸水溶液に対して透析し
   、形質転換成長因子ポリペプチド？き有する溶媒相を与
   え、この相な清澄化及びａ縮する工程。 （２）工程（１）の清澄化及び濃縮溶媒相を酢酸水溶液
   で復元し、酢酸水溶液で調整したゲル透過クロマトグラ
   フィーカラムに復元溶液な適用し、酢酸水溶液で溶出す
   ることにより復元溶液のゲル透過クロマトグラフィーを
   行って、形質転換成長因子ポリペプチドを高められた純
   度の状態で含有する選択された溶出液画分な得、該選択
   画分を合一し、濃縮して部分的に精製された形質転換成
   長因子ポリペプチド陰有生成物を与える工程、及び （３）工程（２）の部分的に精製された形質転換成長因
   子ポリペゾチドａ有生成物を、該生成物をトリフルオロ
   酢酸水溶液中で復元後にトリフルオロ酢酸水溶液で平衡
   化しておいた１以上の炭化水素結合ノリ力マトリックス
   力ラムに通して高圧液体クロマトグラフィー条件下にオ
   イテ逐欠逆相茜圧クロマトグラフ（−ｉｃ付するに際し
   、最初のカラム溶出をトリフルオロ酢酸水浴液中で線形
   アセトニトリル勾配を用いて行い、及び次の、最すの高
   圧クロマトグラフィ一工程で得られた合一された形質転
   換成長因子ポリペプチド自存画分について行われるカラ
   ム溶出？トリフルオロ酢酸水溶液中で線形ｌ−プロパツ
   ール勾配な用いて行い、該ｌ−グロパノール勾配は十分
   に小さいｌ−ノロノξノール濃度増加分にて増大せしめ
   、形質転換成長因子ポリペプチドな均質ポリペプチド状
   態の単一の明確なピークとして与えるようにして行う工
   程。 ２９、ヒト宿主における悪性？検出するｉｎ　ｖｉｔｒ
   ｏ方法において、該ヒト宿主からの細胞或いは体液を特
   許請求の範囲第１９項、槙２２項或いは第５項記載の抗
   体と接触させ、該抗体の該細胞或いは該体液内の細胞生
   成物への結合の程度な宿主保有悪性の徴候として測定す
   ることを特徴とする°方法。 ３０抗体が検出可能な信号な与えることのできるラベル
   で標識化されてＶするｌ特許請求の範囲第２９項記載の
   方法。 ３１、治療量の特許請求の範囲第７項又は第１０項記載
   のポリペプチド、或いは特許請求の範囲第１５項或いは
   第１７項記載のオリゴペプチドと薬学的に許容可能なキ
   ャリヤーと共によんでなることｔ％徴とする癌或いはそ
   の他の増殖性病気の治療用組成物。 ３２、有効量の特許請求の範囲第１項、第３項、第５項
   又は第６項記載のポリペプチドと薬学的に許容可能なキ
   ャリヤーと共にきんでなることｔ特徴とする細胞或いは
   組織損傷の治療及び／又は修復用組成物。 ３３、特許請求の範囲第１項、第３項、第５項、第６項
   、第７項又は第１０項のいずれかに記載のポリペプチド
   及び特許請求の範囲第１４項、第１５項及び第１７項の
   いずれかに記載のオリゴペプチドの製造方法において、
   該、ｆリペゾチド或いはオリゴペプチドは約犯までのア
   ミノ酸残基な含有し、適当な支持体上にポＩＪ−（プチ
   ド或いはオリゴペプチド式により与えられる順番で逐次
   アミノ酸をカップリングすること￥特徴とする方法。 ３４、支持体がポリスチレン樹脂支持体よりなる特許請
   求の範囲第お項記載の方法。 ３５、ポリスチレン樹脂支持体がクロロメチル化樹脂、
   ヒドロキシメチル樹脂、及びベンズヒドリルアミン嗣脂
   より選ばれる特許請求の範囲第あ項記載の方法。 ３６、特許請求の範囲第１項、第３項、第５項、第６項
   、第７項又は第１０項のいずれかに記載の７Ｊｅリペプ
   チドの製造方法において、該ポリペプチドは少なくとも
   約５０個のアミノ酸す訃有し、そのポリペプチド構造の
   アミノ酸配列な暗号化する二本鎖ＤＮＡを合成し、その
   二本＠ｉ　ＤＮＡをクローニングビヒクル或いはベクタ
   ーの適当な部位に挿入し、組換えＤＮＡ分子な形成し、
   該組換えＤＮＡ分子で適当な宿主を形質転換してそのポ
   リペプチドの発現ケ得ることな特徴とする方法。 ３７、細胞又は組織損傷を治療及び／又は修復するため
   の特許請求の範囲第１項、第３項、机５項又は第６項の
   いずれかに記載の生物学的活性ペゾチド。 謔、細胞又は組織損傷を治療及び／又は修復するための
   特許請求の範囲第７項ｔＬ載のポリペプチド。 ３９、ヒト宿王中の悪性を検出するための特許ＮＷＡ＜
   の範囲第１９項、飢座項或いはｉ７！５項σル）′１゛
   れかに記載の抗体。