JP5261494B2

JP5261494B2 - 損傷しまたは傷害を受けた組織または臓器の内皮／上皮再生用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞（ｍｖ）の使用ならびにインビトロおよびインビボでの関連した方法

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Publication number: JP5261494B2
Application number: JP2010531647A
Authority: JP
Inventors: ヴィンセンツォ・カンタルッピ; マリア・キアラ・アミルデ・デレジブス; ジョヴァンニ・カムッシ
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Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2007-10-29
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Description

本発明は一般に、組織再生の分野に属し、特に内皮および上皮再生に関する。

複雑な臓器において、内皮区画と上皮区画間のクロストークは分化、機能および修復に関連している。傷害後の形態学的修復および機能回復は、内皮細胞および上皮細胞の両方の再生、したがって細胞間相互作用の回復に基づいている。

内皮細胞は外胚葉の胚層に由来し、血液と血管壁間の第１インターフェースを務める。それらは全体重の１％を占め、約２８ｍ^２の動脈表面、２８０ｍ^２の毛細血管表面に存在する。血管内皮は、分泌メディエーター、機械的ストレスの感知、血圧調節、神経−体液制御ならびに炎症性細胞接着および管外遊出の制御のような広範な生物学的活性を有することが知られている。

上皮細胞は内胚葉の胚層に由来し、主として多くの臓器に存在し、ここでそれらは特定の機能を獲得している。腎臓では、上皮細胞は特異的な構造に分化している（前尿素の再吸収および分泌に特化した機能を有する近位および遠位尿細管細胞ならびに選択的浸透性の制御に特化した機能を有する糸球体上皮細胞）。肝臓では、上皮細胞は主として、肝小葉の解剖学的機能単位を構成する。この構造は、ビリルビンおよび胆汁塩の生産に特化しており、これらは特に、固有の新合成生成物である。膵臓では、多様なタイプの上皮細胞が別のホルモンの分泌および取り扱いに特化している（すなわち、インスリン分泌についてのベータ細胞）。

上皮細胞および内皮細胞は、急性または慢性臓器機能不全を導き得る多様な損傷メカニズムの標的である。臓器レベルでの修復プロセスは、内皮細胞および上皮細胞の脱分化、増殖および最終的な損傷部位への移動、ついには再分化して完全な形態学的および機能的回復を保証する能力に依存している。例えば、虚血事象または毒性事象へとつながる臨床的に重大な事象である急性尿細管壊死の後、両細胞タイプの増殖および成熟細胞への最終的分化が修復事象には必要である（１，２）。腎糸球体疾患において、損傷からの回復は、糸球体の構造の血管リモデリングに本質的に関連している。より詳しくは、糸球体疾患の再生期の間に生じる血管新生が、糸球体の選択的浸透性をもたらす高度に分化した上皮細胞である有足細胞の機能的回復にも影響することが示されている（３）。多くの急性血管損傷モデルにおいて、内皮細胞の再生が組織および臓器機能の回復に有益であり、これはまた、臓器の上皮機能的要素の修復にも関連している。骨髄由来間葉系幹細胞および内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は接着分子シグナルを通じて、血管虚血部位に優先的に採用される（４，５）。

内皮／上皮損傷または傷害を処置するためのこれまでの既存のアプローチは、１）２種の細胞タイプの両方または一方に作用する増殖因子；２）間葉系幹細胞またはＥＰＣを用いた細胞療法の使用を基礎としていた。しかし、既存のアプローチは多くの欠点を有する。

増殖因子の使用は、高い生産コストおよび別の増殖因子の適切な組合せの生物学的効果を得る必要があることといった欠点を有する。幹細胞療法の使用は、一旦患者に移植すると、潜在的な腫瘍原性リスクまたは不適切な分化を伴って、投与した細胞の制御が失われる内因的リスクを有する。例えば、糸球体腎炎の実験モデルにおける損傷糸球体での脂肪生成分化が報告されている（６）。

本発明者らは、幹細胞由来の微小胞（ＭＶ）が内皮／上皮損傷または傷害の処置のための既存のアプローチを超える有利な代替手段であり、すなわちそれらの使用が上記欠点を有さないことを見出した。さらにまた、幹細胞由来の微小胞が内皮および上皮両組織の損傷または傷害を再生する能力を有することは、全く予想外である。実際に、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する微小胞が内皮細胞からの血管新生および毛細血管様構造の形成を促進し得ることは、先行技術文献において知られていた（７）。また例えばWO2005121369から、ドナー細胞由来の微小胞または合成微小胞を用いて微小胞と接触させた細胞を修飾し得ることは知られていた。典型的には、修飾は少なくとも一部は微小胞のＲＮＡによって影響されるが、微小胞の脂質成分、微小胞の膜関連ペプチドまたは微小胞の細胞質性ペプチドによっても影響され得る。

しかし、ＥＰＣを含む多数のタイプの幹細胞に由来する微小胞の、内皮および上皮両組織の再生を促進する複合能力は、開示も示唆もされていない。

それらの再生能力のために、本発明に使用する幹細胞由来ＭＶは、組織損傷または傷害後の組織修復、特に内皮／上皮再生に使用することができる。本発明で使用するＭＶは、インビトロおよびインビボの両方の適用のために使用することができる。

インビボでの使用に関して、幹細胞由来ＭＶは、ヒトに適用する腎臓および肝臓修復用、特に急性腎不全（ＡＲＦ）および急性肝不全（ＡＨＦ）の処置用医薬として使用するために特に好適な、多くの共通した生物学的効果を有することが示された。実際に、本発明で使用するＭＶは、急性尿細管損傷からの回復、急性糸球体腎炎からの回復ならびに糸球体毛細血管再生および肝細胞増殖の促進に有効であり、それによって、ＡＲＦおよびＡＨＦの処置に大きな利点を有することが示された。

急性傷害エピソード後の腎臓の回復能力は、入院患者の罹患率および死亡率に大いに影響する（８，９）。腎尿細管細胞は特に、敗血症のような内因性サイトカイン、ミオグロビンもしくはアミノグリコシドおよび放射線造影剤のような内因性もしくは外因性毒素または腎虚血エピソードに曝されたとき、傷害を受けやすい（１０）。急性腎臓損傷からの回復は、腎尿細管の正常機能の再生および回復能力に依存する（２）。患者の年齢および損傷の重症度が回復を条件付け得る。重度または反復腎損傷エピソードの後、回復は弱まるかあるいは機能しないことさえあり得て、長期間の透析が必要となり、患者の死亡率が上昇する（１１）。尿細管上皮細胞の壊死および喪失は、急性腎不全（ＡＲＦ）で最も一般的な事象であり、急性腎不全後の腎機能回復は機能的尿細管上皮による壊死尿細管細胞の置換に依存する（２）。上皮および内皮再生の非存在または低下は、管状間質瘢痕化および慢性腎疾患に罹患しやすくなり得る。腎損傷への生理的応答に関する研究によって、損傷が生じた後、尿細管細胞が脱分化し、間葉性表現型を獲得することが示されている。次いで、脱分化した細胞は、尿細管細胞が壊死、アポトーシスまたは尿細管基底膜の露出による脱離が生じる領域へと移動する。このプロセスは、細胞増殖、最終的には続くそれらの組織完全性の回復を伴った機能的上皮細胞への分化と続く（２）。また、腎臓の間質は、腎臓修復に寄与できる成熟腎幹細胞を含むことが示唆されている（１２）。糸球体損傷はしばしば、糸球体細胞が細管に関して限定された再生能を有するため、硬化性病変への進行が続く。毛細血管の減少は、腎不全の最終段階へと進行する多様な異なる糸球体疾患における共通の事象である（１３）。

（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）（原文に記載なし）

したがって、本発明の一つの局面は、内皮／上皮再生用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞の使用である。
好ましい態様において、医薬は急性腎不全（ＡＲＦ）のような腎損傷の処置に関する。
別の好ましい態様において、医薬は急性肝不全（ＡＨＦ）のような肝損傷の処置に関する。

アポトーシスを阻害し、細胞増殖を促進する幹細胞由来微小胞（ＭＶ）の能力に鑑みて、かかるＭＶはまた、細胞増殖抑制剤によって誘導されるアポトーシスの阻害における使用に特に好適であり、それによってがんの化学療法の副作用を低減する。

したがって、本発明の別の局面は、細胞増殖抑制剤によって誘導されるアポトーシスの阻害用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞の使用である。

細胞増殖抑制剤は、例えばパクリタキセル、レナリドマイド、ポマリドマイド、エピルビシン、５ＦＵ、スニチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、レナリドマイド／デキサメタゾン、ポマリドマイド／デキサメタゾン、カルボプラチン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、ドセタキセル、ビノレルビンである。

本発明の医薬は、好適には、静脈内輸液によって投与され、そしてそれは、約３０〜１２０μｇ／ｋｇ患者体重を含む微小胞の投与量に好適な投与形態で製造することができる。患者は、例えばＡＲＦまたはＡＨＦに罹患しているヒトのような、内皮／上皮再生をもたらし得る処置を必要としている何れかの患者である。

「幹細胞由来微小胞（ＭＶ）」なる表現は、本明細書において使用するとき、少なくとも部分的に幹細胞に由来する膜粒子を意味する。次に「幹細胞」なる用語は、増殖し（自己再生）、分化する（可塑性(palsticity)）ことができ、それによってライフサイクルの終わりに到達した分化細胞系統の成熟細胞を置換することができる、あらゆる未分化または部分的に未分化の細胞を含む。「幹細胞」なる用語は、本明細書において使用するとき、無制限の自己再生能と多能的可塑性を有する幹細胞と、多能的または分化単能的可塑性およびいくつかの例では、限定された自己再生能を有する前駆細胞の両方を含む。

本発明の好ましい態様において、本発明で使用する幹細胞由来ＭＶは、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、腎前駆細胞ＣＤ１３３＋、成人肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）から成る群から選択される幹細胞に由来する。

本発明で使用する幹細胞由来微小胞は、一般に、球状であり、１００ｎｍ〜５μｍ、より典型的には０．２〜１μｍの直径を有する。粒子が球状でないとき、上記の値は粒子の最大径を意味する。

本発明で使用する微小胞が得られる幹細胞は、本明細書の実験の項に記載のとおりに単離することができる。次いで、微小胞（ＭＶ）は単離した幹細胞の上清から、本明細書の実験の項に記載のとおりに超遠心分離して、得ることができる。

単離ＭＶは、使用するまで、超低温、典型的には−８０℃で、１種以上の凍結防止剤を含む懸濁液中で凍結させて、保存することができる。好適な凍結防止剤は、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびグリセロールである。細胞懸濁液体積の濃度１％でのＤＭＳＯの使用は、細胞の良好な保存および再注入する患者に対する限定された毒性効果を保証する。言及し得る他の物質は、細胞表面で作用して細胞内脱水を低下させる緊密な障壁を形成する高分子物質である、細胞外凍結保護剤である。ヒドロキシエチルデンプンを例として記載することができる。単離ＭＶは医薬の製造のために使用することができる。

単離した幹細胞由来ＭＶは、本発明者らによって、インビトロおよびインビボの両方で試験された。インビボで実施した試験は、マウス毒性ＡＲＦモデルおよび抗Ｔｈｙ−１抗体の静注によって誘導したラット糸球体腎炎の試験モデルを含む。

下記実施例の項は、説明のみを目的として提供する。

材料および方法
細胞調製物
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＣＤ１３３腎前駆細胞の単離および特徴付け
ＥＰＣは、健常ドナー由来の末梢血単核細胞から密度遠心分離によって単離して、フィブロネクチン被覆培養フラスコ中の５％のＦＢＳ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦおよびインスリン様増殖因子−１を補った内皮細胞基礎培地−２（Clonetics, Biowhittaker, Walkersville, MD）に播種した。内皮の同一性は、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、遺伝子マイクロアレイ分析およびマトリゲル被覆プレート上での血管形成特性の機能的評価によって、既報の通りに試験した（５）。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は既報の通りに単離し、培養した（４）。８週齢マウスの大腿骨および脛骨由来マウスＭＳＣ（ｍＭＳＣ）は、既報の通りに得た（１４）。１０％のＦＣＳ、１０％のウマ血清（いずれもEuroclone, Westenby, UKから）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン（全てSigma, St Louis, MO, USAから）を補ったα−ＭＥＭ（Invitrogen, Paisley, Scotland）に細胞を密度２０〜４０×１０^６細胞／９．５ｃｍ^２で播種した。７２時間後に非接着細胞集団を除去し、接着層を新鮮な培地で１回洗浄した。細胞は典型的な紡錘型外見を有し、ＭＳＣ表現型が間葉系幹細胞マーカーの発現ならびに骨細胞および脂肪細胞への分化能によって、既報の通り確認された（１４）。腎前駆細胞は、外科的に採取した腎臓から得た皮質の正常部分から得た。切除および連続等級メッシュによるふるい分けの後、ＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotec, Auburn, California）を用いた磁気的細胞選別によって、ＣＤ１３３^＋細胞を尿細管分画から単離した。６０％のＤＭＥＭＬＧ（Invitrogen, Paisly, United Kingdom）、４０％のＭＣＤＢ−２０１の存在下で、１×インスリン−トランスフェリン−セレニウム、１×リノール酸２−リン酸、１０^−９Ｍのデキサメタゾン、１０^−４のアスコルビン酸２−リン酸、１００Ｕのペニシリン、１０００Ｕのストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（全てSigma-Aldrich, St.Louis, Missouryから）および２％のＦＣＳ（EuroClone, Wetherby, United Kingdomから）を補ったフィブロネクチン上にＣＤ１３３^＋細胞を播種した（１２）。選択した細胞は造血マーカーの発現を欠いており、胚腎マーカーであるＰＡＸ−２を発現していた。これはそれらが腎臓起源であることを示唆している。腎組織由来ＣＤ１３３^＋細胞および個々の細胞のクローンは、増殖および限定的な自己再生が可能であり、インビトロで上皮または内皮細胞に分化することができた。インビトロでの上皮分化は、ＦＧＦ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma）の存在下で得られた。内皮分化は、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma）および内皮細胞接着因子（Sigma）上１０％ＦＣＳを補ったＥＢＭ培地（Cambrex Bio Science, Baltimore, Maryland）中で培養して得られた（１２）。ＳＣＩＤマウスに皮下移植すると、未分化細胞は腎上皮マーカーを発現する尿細管構造を形成した。

幹細胞由来ＭＶの単離および特徴付け
ＭＶは、ＦＣＳを除いた培地中で培養した別の前駆細胞の上清から得た（７）。２０００ｇで２０分間遠心分離してゴミを除いた後、細胞を含まない上清を１０００００ｇで１時間、４℃で遠心分離し（Beckman Coulter Optima L-90K ultracentrifuge）、無血清培地で洗浄し、同じ条件での２回目の超遠心分離に供した。製造業者の指示書（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に従ったLimulusテストによって、内毒素汚染を除いた。得られたＭＶは次のとおりに分析した：

ＦＡＣＳ分析：ＭＶのサイズをＦＡＣＳ（Becton Dickinson）で測定した。異なるサイズのビーズ（１、２、３、４、６、１０および１５μｍ、Molecular Probes, Invitrogen）をサイズマーカーとして用いて、ＦＳＣおよびＳＳＣパラメーターの対数目盛を用いて分析を実施した。

走査型および透過型電子顕微鏡：ＭＶをKarnowski固定剤で固定し、アルコールで脱水し、ガラス表面上で乾燥させ、スパッタコーティングにより金でコーティングした。試料をJeol T300走査型電子顕微鏡で試験した。作動距離１５〜２５ｍｍ、加速電圧２０〜２５ｋＶで、二次電子を介して画像を得た。Karnovsky固定、オスミウムテトラオキシド固定後組織を標準的な方法でエポキシ樹脂に包埋して、透過型電子顕微鏡観察を実施した。極薄切片を酢酸アラニルおよびクエン酸鉛で染色し、Jeol JEM 1010電子顕微鏡で試験した。

遺伝子アレイ分析：アポトーシスの試験のためのヒトＧＥアレイキット（GEArray Q series Human Apoptosis, SuperArray Inc., Bethesda, MD）を用いて、ＭＶで処理した尿細管細胞の遺伝子発現を特徴付けた。異なる実験からプールしたＲＮＡをビオチニル化プローブ合成のためのテンプレートとして用いた。アルカリホスファターゼ基質、CDP-Starおよび製造業者の指示に従って直接必要とされるものを用いて、化学発光シグナルによって遺伝子発現を検出した。Quantity one プログラム（Life Science）を用いて濃度測定分析を行い、生データはＧＥアレイ分析機プログラム分析によって分析した。

インビボモデル
マウス毒性ＡＲＦモデル
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの急性毒性尿細管損傷は、５０％グリセロール溶液（Sigma, St. Louis, MO）の７．５ｍｌ／ｋｇ体重の筋注によって、既報の通り誘導した（１４）。血清クレアチニンレベルおよび尿素濃度を測定して（Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA）、腎機能を評価した。尿細管損傷のピークはグリセロール注射後３日で生じた（１４）。ＡＲＦ誘導から３、６、１０および１５日後にマウスを屠殺し、最大損傷および尿細管再生の段階を評価した。組織学的および免疫組織化学的分析のために腎臓をホルマリン固定してパラフィン包埋した。

Ｔｈｙ−１糸球体腎炎の実験モデル
６週齢メスLewisラットに２５０μｇ／１００ｇ体重の抗Ｔｈｙ１−１抗体（Ａｂ）を０日目に大腿静脈に静脈内投与して、糸球体腎炎（ＧＮ）を誘導した。対照動物には抗Ｔｈｙ１．１Ａｂの代わりに同量の生理食塩水を注射で投与した。既にタンパク尿が検出できた２日目に、３０μｇのＥＰＣ由来ＭＶを反対側の大腿静脈に注射した。対照動物には同量のビークル（Ｈｅｐｅｓ修飾Ｍ１９９培地と１％のＤＭＳＯ）のみを注射で投与した。タンパク尿、血清および尿クレアチニン／尿素（２４時間尿採取）を毎日評価した。マウスを４日目、７日目、１４日目に屠殺した。各実験グループは９匹のラットを含む。

インビトロ実験
ヒト尿細管細胞の単離および培養
ヒトＴＥＣの初代培養（ＰＴＥＣ）は、腎臓癌に罹患している患者から外科的手法によって採取した腎臓から得た（１５）。ハイブリッドAdeno5/SV40ウイルスに感染させて得たＰＴＥＣの不死化細胞系を用いて、初代尿細管細胞で行った実験を確認し、敷衍した。１０％のＦＣＳ（Hyclone, Logan, Utah）および２ｍＭのグルタミン（GIBCO）を含むＲＰＭＩ１６４０（GIBCO, Grand Island, NY）で細胞を増殖させた。

細胞増殖アッセイ
９６ウェルプレート中の１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に、８０００細胞／ウェルで細胞を播種して、接着させた。ＤＮＡ合成は、細胞ＤＮＡへの５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みとして、ＥＬＩＳＡキット（Roche Applied Science）を用いて検出した。簡潔には、細胞に１０μＭのＢｒｄＵを加え、１０％のＦＣＳの存在下または非存在下でＤＭＥＭ中で１８時間インキュベートした。次いで細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてＤＮＡを消化した。ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵは、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ結合ｍＡｂを用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。

アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、ＴＵＮＥＬアッセイ分析（ApopTag Oncor, Gaithersburg, MD）を用いて評価した。多様な前アポトーシス性刺激の後、細胞をＰＢＳに懸濁し、ＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒド、ｐＨ７．４で１５分間、４℃で固定し、ＰＢＳで２回洗浄した後、予め冷却した２：１のエタノール−酢酸で５分間、−２０℃で固定した。サンプルをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素で処理した。次いで細胞を、フルオレセインと結合した抗ジゴキシゲニンで加温下で処理し、室温で３０分間インキュベートした。１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む培地にサンプルを乗せ、免疫蛍光法で細胞を分析した。結果は赤色蛍光放出細胞（全細胞）に対する緑色蛍光放出細胞（アポトーシス細胞）の百分率として表現する。

カスパーゼ３−８−９活性の検出
カスパーゼ３−８−９の活性は、カスパーゼによって認識される標識化基質ＤＥＶＤ−ｐＮＡを切断した後、発色団ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の分光光度的検出に基づくＥＬＩＳＡ（Chemicon, Temecula, CA）によって評価した。尿細管溶解物を適切な反応バッファーで希釈し、ＤＥＶＤ−ｐＮＡを最終濃度５０Ｍで加えた。次いでサンプルを波長４０５ｎｍで自動ＥＬＩＳＡリーダーで分析した。各実験は、３連で行った。

ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析のため、細胞を組織培養プレートからＥＤＴＡで剥離し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、別の分子に関する一次抗体または無関係な対照抗体で、４℃で１時間染色した。細胞をAlexa Fluor結合二次抗体と共に４５分間、４℃でインキュベートした。細胞を１％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ分析に供した（Becton Dickinson, Mountain View, CA）。

ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析のために、細胞をＥＤＴＡで剥離し、１％のTriton-X-100、１０μＭ／ｍｌのロイペプチン、１０μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１００Ｕ／ｍｌアプロチニンを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶解バッファーで溶解させた。尿細管溶解物を１５０００×ｇで遠心分離した後、上清のタンパク質含量をBradford法で測定した。３０μｇ／レーンのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供し、ニトロセルロースメンブランフィルターにエレクトロブロットした。次いで２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１％のTweenを含む５％の無脂肪ミルクでブロットをブロックした。濃度５００ｎｇ／ｍｌのＡｋｔ、Ｐ−Ａｋｔ、Ｂｃｌ−ｘＬに対する抗体（全てSanta Cruz Biotechnologyから）またはＰａｘ−２に対する抗体と共に、膜を４℃で一夜インキュベートした。０．１％のTweenで入念に洗浄した後、ＨＲＰ結合タンパク質Ａ（２００ｎｇ／ｍｌ、Amersham, Buckingamshire, UK）で１時間、ＲＴでブロットを染色し、０．１％のTweenで再度洗浄し、ＥＣＬ検出試薬（Amersham）で現像して、X-Omatフィルム（Eastman Kodak, Rochester, NY）に曝した。

経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の評価
経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を上皮極性の指標として用いた。細胞をTranswell中コラーゲン被覆ポリカーボネート膜（Corning Costar Corp., Cambridge, MA）に播種し、コンフルエンスに到達させた後、多様な刺激を加えた。上皮ボルト−オームメーター（ＥＶＯＭ；World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL）を用いてＴＥＲ値を既報の通りに測定した（１２）。全測定は３連で実施し、膜の面積について正規化した。

ＦＩＴＣ結合アルブミン取り込みの検出
尿細管細胞を５０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ヒトアルブミンと共に３７℃で２時間インキュベートした後、タンパク質取り込みを試験した。ＦＩＴＣ−アルブミン負荷の後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回念入りに洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。

移動および形態発生アッセイ
機械的ストレス条件を模倣するために、コンフルエントな単層に生じさせた外傷へと尿細管細胞が移動する速度として、移動を評価した。細胞運動性はNikonの倒立顕微鏡下で、密封したインキュベーター内で３７℃で観察した。Micro-Image分析システム（Casti Imaging srl, Venezia, Italy）を用いて３０分間隔で異なる画像をデジタル保存した後、移動を分析した。細胞移動は、視野当たり３０個以上の細胞の核の位置に印を付けて評価した。観察物の始点から終点までの直線距離を観察時間で割った比として、平均速度を計算した。選択実験および形態発生アッセイにおいて、タイプＩＶコラーゲンであるフィブロネクチン２０μｇ／ｍｌまたはMatrigelで予めコーティングしたプレートに散在している尿細管細胞を播種した。

ＳＣＩＤマウスへのＰＴＥＣの皮下マトリゲル埋め込み
マトリゲルプラグ中ＰＴＥＣの皮下移植を行って、インビボで幹細胞由来ＭＶの管形成効果を評価した。簡潔には、増殖因子欠乏マトリゲル（Becton Dickinson）を使用するまで−２０℃で維持し、移植の直前に４℃で一夜解凍した。ＦＣＳを含まない新鮮な培地２５０μｌに５０００個の細胞を再懸濁し、多様な刺激の存在下で冷却ピペットチップを用いて氷上でマトリゲル５００μｌと混合した。全サンプルをＳＣＩＤマウスの後肢に皮下移植した。１週間後、マウスを屠殺し、試験のためにマトリゲルプラグを回収した。

内皮−尿細管サンドイッチ共培養
多様な刺激と共にインキュベートしたＨＭＥＣの尿細管生存率に対する効果を試験するために、共培養モデルを適用した。ＨＭＥＣを２４ウェルプレートで２４時間、標準培養条件で播種した。次いでＨＭＥＣを２４時間または４８時間、１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来ＭＶの存在下または非存在下で、血清欠乏に付した。上記条件下でインキュベーションした後、培地を吸引し、接着細胞を１×ＰＢＳで念入りに洗浄し、ＲＰＭＩで１：１に希釈した増殖因子減少マトリゲル；（ＢＤ）２００μｌを上覆いとして用い、３７℃で３０分間ゲル状にさせた。その後、１×１０^４個の尿細管細胞を核ウェルに加えてサンドイッチ共培養物を完成させた。共培養物をさらに２４または４８時間、血清欠乏条件でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、尿細管細胞をＸＴＴ利用アッセイ（Sigma）に供した。データは３つの異なる実験の平均±ＳＤとして与えられる。

免疫蛍光および免疫組織化学
以下の抗体を用いて細胞蛍光分析を実施した：全てＦＩＴＣまたはＰＥ結合の、抗ＣＤ１３３−１モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）（Miltenyi Biotec）、抗ＣＤ４４および抗ヒトＨＬＡクラスＩｍＡｂ（Sigma）、抗ＣＤ３１および抗ＣＤ１０５ｍＡｂ（Serotec Inc, Oxford, United Kingdom）、抗ＫＤＲｍＡｂ（R&D System, Minneapolis, Minnesota）；抗Ｍｕｃ−１８ｍＡｂ（Chemicon International, Temecula, California）、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３４、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１１７ｍＡｂ（Becton Dickinson, San Jose, California）。抗ＶＥカドヘリンｍＡｂはGuido Tarone（University of Torino）から提供を受けた。ＦＩＴＣまたはＰＥマウス非免疫アイソタイプＩｇＧ（Dako, Copenhagen, Denmark）を対照として用いた。チャンバースライドで培養し、２％ショ糖を含む４％パラホルムアルデヒドで固定し、所望によりHepes-Triton-X 100バッファーで透過処理した細胞で、間接免疫蛍光法を実施した。液体窒素で急速凍結し、３μｍ切片に切断し、２％ショ糖を含む３．５％パラホルムアルデヒドで固定したヒトまたはマウス組織でも免疫蛍光法を実施した。次の抗体を用いた：抗Ｎａ−Ｃｌコトランスポーター、抗アミノペプチダーゼＡおよび抗アルカリホスファターゼポリクローナルヤギＡｂ（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California）、ウサギ抗閉鎖帯（ＺＯ）−１ポリクローナルＡｂ（Santa Cruz Biotechnology）、ヤギ抗−ＶＷＦおよびウサギ抗Pan-Cytokeratin Ａｂ（Sigma）、抗ビメンチンおよび抗ＥカドヘリンｍＡｂ（Dako）、抗ＥＭＡｍＡｂ（Chemicon International）、ポリクローナルウサギ抗ＰＡＸ２Ａｂ（Covance, Princeton, New Jersey）、ＰＥ結合抗ＣＤ１３３（Miltenyi Biotec）および抗増殖細胞核抗原（PCNA）、ＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡＩおよび抗カルビンジンＤ−２８ＫｍＡｂｓ（Sigma）。対照マウス、ウサギまたはヤギ非免疫免疫グロブリンを対照として用いた。ＦＩＴＣ結合抗マウス、ウサギまたはヤギＩｇＧ（Sigma）を、所望により、二次抗体として使用した。１０％緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織で、既報のとおり免疫組織化学を実施した（７）。Leika TCS SP2モデルの共焦点顕微鏡（Heidelberg, Germany）を用いて共焦点顕微鏡観察を実施した。核を染色するためにHoechst 33258染色剤（Sigma）を加えた。

統計的分析
異なる実験方法の全てのデータは、平均±ＳＤとして与えられる。統計的分析は、適切であるとき、多重比較試験によるＡＮＯＶＡで実施した。

結果
ＭＶの特徴
ＥＰＣ、ＭＳＣおよびＣＤ１３３腎前駆細胞由来のＭＶについて、１、２、４および６μｍビーズをサイズの内部標準としたＦＡＣＳ分析を用いて、サイズを測定したところ、幹／前駆体細胞の別集団由来のＭＶが同様のサイズを有することが示された。観察したＭＶの大多数は１μｍビーズに対応するＦＳＣシグナル未満であった（図１Ａ）。走査型および透過型電子顕微鏡観察によってＭＶが球状の形態を有することが示され、サイズが０．２〜１μｍであることが確認された（図１Ｂ）。画像は作動距離１５〜２５ｍｍ、加速電圧２０〜３０ｋＶで二次電子を介して得られた。ＦＡＣＳ分析によって、対応する幹／前駆体細胞の細胞膜によって発現されることが知られている接着分子の発現をＭＶが示した（図１Ｃ）。ＥＰＣ、ＭＳＣ由来ＭＶおよび常在腎臓ＣＤ１３３^＋前駆体は、ＣＤ４４、ＣＤ２９の発現について共通しているが、ＩＣＡＭ−１、α４インテグリンおよびα５インテグリンの発現については異なっていた。これらの結果は、ＭＶが表面で、それらの起源である細胞の細胞膜の多様な決定因子を発現することを示している。接着分子の発現は標的細胞中のＭＶの取り込みに役立つことが既に示されている。

ＭＶの腎細胞に対するインビトロ生物学的効果
尿細管損傷は虚血性または毒性急性腎不全（ＡＲＦ）の特徴である。さらに、傍尿細管毛細血管の内皮細胞の損傷は、虚血後の腎臓損傷の拡大に寄与することが示されている（１６）。したがって、我々は幹細胞から放出されたＭＶの近位尿細管上皮細胞系（ＰＴＥＣ）に対する効果を調べた。

マウス間葉系幹細胞（ｍＭＳＣ）由来ＭＶがシスプラチンによって誘導されるＰＴＥＣのアポトーシスを阻害する
我々は、漸増用量のマウス間葉系細胞（ｍＭＳＣ）由来ＭＶと共にＰＴＥＣをインキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して、シスプラチンによって誘導されるアポトーシスが顕著に減少することを見出した。ＲＮａｓｅと共にＭＶをインキュベートすると、アポトーシスに対する耐性が破壊された。得られた結果を図２に示す。アポトーシスは、０．５μｍ／ｍｌのシスプラチンと共に２４時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合として、ＴＵＮＥＬアッセイによって評価した（黒棒）。ＰＴＥＣをビークルのみと、または多様な用量のＭＶと共にインキュベートした。斜線付の棒はシスプラチンで処理しない対照を示す。結果は３回の実験の平均±１ＳＤとして表す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った：＊ｐ＜０．０５ＭＶ対ビークルのみ。

ＭＶで処理したＰＴＥＣによるＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の発現が細胞増殖の誘導を示す
ｍＭＳＣ由来ＭＶはＰＴＥＣによるＰＣＮＡの発現を誘導する。５×１０^４細胞／ウェルの尿細管細胞を１０μｇ／ｍｌのＭＶまたはビークルと共に、ＤＭＥＭ＋５％のＢＳＡ中で２４時間インキュベートして、ＰＣＮＡの発現を共焦点顕微鏡で評価した。得られた結果は、無血清培地で培養したＰＴＥＣ中のＰＣＮＡについて染色された核が存在せず、ｍＭＳＣ由来ＭＶと共にインキュベートした後、ＰＴＥＣによって核がＰＣＮＡを発現することが示された。３回実験を実施し、同様の結果が得られた。

成人腎前駆細胞ＣＤ１３３＋由来ＭＶはシスプラチンによって誘導されるアポトーシスを阻害でき、尿細管上皮細胞の増殖を補助する
多様な用量（１、５および１０μｇ／ｍｌ）の成人腎前駆細胞ＣＤ１３３^＋由来ＭＶと共にＰＴＥＣをインキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して、シスプラチンによって誘導されるアポトーシスが顕著に阻害された（図３）。アポトーシスは、０．５μｍ／ｍｌのシスプラチンと共に２４時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合として、ＴＵＮＥＬアッセイによって評価した（黒棒）。斜線付の棒はシスプラチンで処理しない対照を示す。結果は３回の実験の平均±１ＳＤとして表す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った：＊ｐ＜０．０５ＭＶ対ビークルのみ。

ヒト腎前駆細胞ＣＤ１３３ ^＋由来ＭＶはＰＴＥＣの細胞増殖を誘導し得る
２種の異なる用量（１５および３０μｍ／ｍｌ）のヒト腎臓前駆細胞ＣＤ１３３^＋由来ＭＶと共にＰＴＥＣを４８時間インキュベートすると、対照と比較して尿細管上皮細胞の細胞増殖が顕著に促進された。９６ウェルプレート中８０００細胞／ウェルに１０μＭのＢｒｄＵを加え、ビークルのみまたは多様な用量のＭＶと共にＤＭＥＭ中でインキュベートした。次いで細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてＤＮＡを消化した。抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ結合ｍＡｂを用いてＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。結果は３回の実験の平均±１ＳＤとして表す。結果を図４に示す。

ＭＶとインキュベートすることで、インキュベーションの４８時間後にＰＴＥＣによるＰＡＸ２およびビメンチン発現が誘導された。これは未成熟表現型を獲得したＰＴＥＣの脱分化を示している
ヒト腎臓前駆細胞ＣＤ１３３由来ＭＶはＰＴＥＣの脱分化を誘導する。５×１０^４細胞／ウェルのＰＴＥＣをビークルのみまたは１０μｍ／ｍｌのヒト腎臓前駆細胞ＣＤ１３３由来ＭＶと共にＤＭＥＭ＋５％ＢＳＡ中で２４時間インキュベートして、ＰＡＸ２およびビメンチンの発現を共焦点顕微鏡で評価した。

ＭＳＣまたはＨＬＳＣ由来ＭＶで処理したヒト肝細胞の細胞増殖およびアポトーシスアッセイ
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または成人肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）由来ＭＶはヒト肝細胞の増殖を補助できる；
多様な用量（１０、２５および５０μｍ／ｍｌ）のＭＳＣまたはＨＬＳＣ由来ＭＶと共に肝細胞を７２時間インキュベートすると、ビークルのみと共にインキュベートした対照と比較して細胞増殖が促進された。９６ウェルプレート中５０００細胞／ウェルに１０μＭのＢｒｄＵを加え、ビークルのみまたは多様な用量のＭＶと共にＤＭＥＭ中でインキュベートした。次いで細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてＤＮＡを消化した。抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ結合ｍＡｂを用いてＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。結果は３回の実験の平均±１ＳＤとして表す。結果を図４に示す。Dunnetの多重比較試験による分散の分析を行った：＊ｐ＜０．０５ＭＶ対ビークルのみ。結果は、ＭＳＣまたはＨＬＳＣ由来ＭＶが成熟ヒト肝細胞の増殖をインビトロで刺激することができることを明確に示しており、これは肝臓再生における潜在的な効果を示唆している。

ＨＬＳＣ由来ＭＶで処理したヒト尿細管細胞のアポトーシスアッセイ
既報の通りＴＵＮＥＬアッセイを用いて、ヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスを評価した。簡潔には、アポトーシスの誘導のためのポジティブコントロールとしてシスプラチン（２μｇ／ｍｌ）を用いて、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）介在ニック末標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ分析に細胞を供した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドｐＨ７．４で固定し、ＴｄＴ酵素、ジゴキシゲニン−ｄＮＴＰと共にインキュベートし、抗ジゴキシゲニン−ＦＩＴＣ抗体およびＰＢＳ中ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）で対比染色した。アポトーシス細胞のＦＩＴＣ標識化ＤＮＡフラグメントを倒置ＵＶ顕微鏡で可視化した。ビデオカメラを用いて得られた画像のデジタル分析によって細胞数を計測し、アポトーシス陽性細胞を１０倍の倒置顕微鏡視野で計測した合計細胞数の割合として表した。このアッセイで用いたＭＶの濃度は、４８時間で、１０、１５、３０μｇ／ｍｌであった。
図６は１０、１５および３０μｇ／ｍｌのＨＬＣＳ由来ＭＶで刺激したヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスのパーセンテージを示す。ＨＬＳＣ由来ＭＶは用量依存的に、初代細胞培養物であるヒト尿細管上皮細胞の増殖を刺激し、これはわずか数代に限られていた。増殖を刺激したＭＶ濃度は１０、１５、３０μｇ／ｍｌであった。シスプラチンによってアポトーシスを誘導した場合、ＨＬＣＳ由来ＭＶは、増殖の刺激と同じ濃度でヒト尿細管上皮細胞のアポトーシスを阻害する。

ＥＰＣ由来ＭＶはＰＴＥＣに対して増殖性および抗アポトーシス性効果を示した
ＰＴＥＣを漸増用量のＭＶ（１〜５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ＭＶはＰＴＥＣにおいて、インキュベーションの１２時間後に増殖性効果を誘導し、２４〜４８時間後にさらに上昇した（図７）。ＭＶ誘導性増殖は１μｇ／ｍｌの用量で顕著に上昇し、用量５０μｇ／ｍｌでピークに達した（図７）。図７はＰＴＥＣに対するＭＶ誘導性増殖効果を示す。ＰＴＥＣの時間経過増殖のＸＴＴ利用アッセイからのデータ。ＭＶは、検討した全ての時点で、増殖の顕著な用量依存的上昇を誘導した（１２、２４、４８時間）。データは３回の異なる実験の平均±ＳＤとして表す。Newman-Keuls多重比較試験によるＡＮＯＶＡを実施した。

我々は、多様な有害条件で培養したＰＴＥＣに対するＭＶの抗アポトーシス効果を試験した。ＴＵＮＥＬアッセイで示されるとおり（図８）、ＭＶは血清欠乏条件で、５μｇ／ｍｌのシスプラチン、１μｇ／ｍｌのＦＫ５０６または炎症性サイトカイン（２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−ガンマ）と共に培養したＰＴＥＣのアポトーシスを顕著に低下させた。図８は実施したＴＵＮＥＬアッセイの結果を示し、血清欠乏（ビークル／ＦＣＳ−）、シスプラチン（ＣＩＳ５μｇ／ｍｌ）、ＦＫ５０６（１μｇ／ｍｌ）または炎症性サイトカイン（敗血性：２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−ガンマ）に曝露したＰＴＥＣに対する１０μｇ／ｍｌのＭＶの抗アポトーシス効果を示す。データは３回の異なる実験の平均±ＳＤとして表す。Newman-Keuls多重比較試験によるＡＮＯＶＡを実施した。

遺伝子アレイ分析によって、ＭＶがミトコンドリア分子をコードする遺伝子およびデスレセプターアポトーシス経路の発現を調節することが示された。特に、ＭＶは抗アポトーシスＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２およびＦＬＩＰの上方制御およびＦａｓ、Ｆａｓ−リガンド（Ｆａｓ−Ｌ）、Ｂａｘ、ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬのような多様な前アポトーシス遺伝子の下方制御を誘導した。さらに、炎症性損傷において腎尿細管上皮細胞で過剰発現されるＣＤ４０遺伝子が下方制御されたが、これはＰＴＥＣに対するＭＶの抗炎症性作用を示唆している。ＣＤ４０の下方制御はＦＡＣＳ分析によって確認した。図９は、１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下または非存在下での、シスプラチン（５μｇ／ｍｌ）で刺激したＰＴＥＣの遺伝子アレイ分析の結果を示す。ＰＴＥＣのアポトーシスに関与する遺伝子の発現の変化率。結果は、シスプラチンのみに対するシスプラチン＋ＭＶに曝露したＰＴＥの遺伝子発現の濃度測定分析間の比として示される。ハウスキーピング遺伝子（ベータアクチン、ＧＡＰＤＨ）を濃度測定分析のためのレファレンスとして用いた。３回実験を行ったが、同様の結果が得られた。

１０ｎｇ／ｍｌのＭＶとインキュベートすると、シスプラチン処理ｉＴＥＣにおいてカスパーゼ−３−８および９活性の顕著な低下が誘導された。これらの結果は、ミトコンドリア経路および受容体介在性アポトーシス経路の同時的阻害を示した。図１０は、２４時間シスプラチンで処理したＰＴＥＣに対する、１０μｇ／ｍｌのＭＶによって誘導されるカスパーゼ−３−８および９活性の顕著な低下を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示している。データは３回の異なる実験の平均±ＳＤとして表す。Newman-Keuls多重比較試験によるＡＮＯＶＡを実施した。

我々は、ＰＴＥＣの上層からマトリゲルによって分離された内皮細胞層によって特徴付けられる共培養モデルにおける、ＰＴＥＣ生存に対する内皮生産因子のパラクリン作用を評価した。１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下または非存在下で、２４時間または４８時間の血清欠乏によって内皮損傷を誘導し、次いで増殖因子を減少させたマトリゲルを層状にして、これにＰＴＥＣを播種した。ＭＶの非存在下では、ＰＴＥＣの生命力は２４および４８時間後に顕著に低下した。逆に、ＭＶでの内皮刺激によって、生命力の低下が防止された。これらの結果は、ＰＴＥＣ生存を促進する内皮細胞のパラクリン作用をＭＶが刺激したことを示している。内皮−ＰＴＥＣ共培養モデルにおけるＰＴＥＣの生命力の評価に関する得られた結果は図１１に示す。内皮損傷は１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下または非存在下で、２４時間または４８時間の血清欠乏によって誘導し、次いで増殖因子を減少させたマトリゲルを層状にして、これにＰＴＥＣを播種した。データは３回の異なる実験の平均±ＳＤとして表す。Newman-Keuls多重比較試験によるＡＮＯＶＡを実施した。

１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下、ＦＣＳの非存在下で２４時間培養したヒトＰＴＥＣにおける、間葉系マーカーであるビメンチンおよび胚腎臓に存在するタンパク質であるＰａｘ−２の発現に対するＭＶの効果を試験した。ＭＶはＰＴＥＣにおいてビメンチンおよびＰａｘ−２の発現を誘導した。５×１０^４細胞／ウェルのＰＴＥＣを２４時間、１０μｇ／ｍｌのＥＰＣ由来ＭＶと共にＤＭＥＭ＋５％ＢＳＡ中でインキュベートし、ＰＡＸ２とビメンチンの発現を共焦点顕微鏡で評価した。

ＭＶ誘導性ＰＴＥＣ移動
フィブロネクチン、タイプＩＶコラーゲンまたはマトリゲル被覆プレート上に播種した散在ＰＴＥＣの運動性を評価した。条件は、ＰＴＥＣが移動して尿細管完全性を回復するであろう微小環境を模倣した。散在ＰＴＥＣの低速度顕微鏡観察によって細胞移動に対するＭＶの効果を試験した。ＰＴＥＣの自発的運動性に対応するベースライン移動速度は観察の全期間（１２時間）にわたって静置して得られ、３〜４μｍ／時間を超えることはなかった。ＭＶは自発的移動の顕著な上昇を誘導し、これは２時間でピークとなり、全細胞外マトリックスにおいて、全観察期間を通じて顕著に高いままであった。図１２は細胞外マトリックスで培養したＰＴＥＣの移動に対するＭＶの効果を示す。１０μｇ／ｍｌのＭＳＰとのインキュベーションによって、予め２０μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン、タイプＩＶコラーゲンまたはマトリゲルで被覆したプレート上で培養したＰＴＥＣの移動が上昇した。データは３回の異なる実験の平均速度（μｍ／時間）±ＳＤとして与えられる。

ＭＶはシスプラチン処理したＰＴＥＣの上皮単層の機能的完全性を維持する
経上皮耐性分析で評価したように、シスプラチン処理ＰＴＥＣにＭＶを加えると細胞極性が回復した。図１３は経上皮耐性（ＴＥＲ）のシスプラチン誘導性変化に対するＭＶの効果を示す。細胞極性のマーカーであるＰＴＥＣＴＥＲの異なる実験条件での分析。シスプラチン（ＣＩＳ５μｇ／ｍｌ）はＴＥＲ値を有意に低下させるが（＊ｐ＜０．０５ＣＩＳ対ビークル）、ＭＶ（１０または５０μｇ／ｍｌ）は正常ＴＥＲ値を回復した。データは３回の異なる実験の平均ＴＥＲ値±ＳＤとして与えられる。ＴＥＲ値は実験に使用した膜面積について正規化した。Newman-Keuls多重比較試験によるＡＮＯＶＡを実施した。

さらに、ＭＶの存在下で、シスプラチン処理ＰＴＥＣは、アルカリホスファターゼおよびアミノペプチダーゼＡのような十分に分化した細管に典型的な分子の発現を保存しており、このことは、これらの細胞のＦＩＴＣ標識化アルブミンを取り込む維持された能力の原因と思われる現象である。ＭＶ処理ＰＴＥＣによる細胞内受容体メガリンの発現は、５μｇ／ｍｌのシスプラチンまたは５μｇ／ｍｌのシスプラチン＋１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下でのメガリン発現を比較して、免疫蛍光法で試験した。倍率１００倍。核を０．５ｍｇ／ｍｌのHoechstで対比染色した。３回実験を実施したが、同様の結果が得られた。

図１４はＰＴＥＣによるＦＩＴＣ−アルブミンの取り込みに対するＭＶの効果を示す。タンパク質取り込みは、ＰＴＥＣ単層を５０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−結合ヒトアルブミンと共に、３７℃で２時間インキュベートした後に試験した。ＦＩＴＣ−アルブミン負荷の後、ＰＴＥＣを氷冷ＰＢＳで念入りに洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。黒塗りの曲線は対照（白抜きの曲線）に対するアルブミンの取り込みを示す。Ａは５μｇ／ｍｌのシスプラチン処理ＰＴＥＣによるＦＩＴＣ−アルブミンの取り込みを示し；Ｂは１０μｇ／ｍｌのＭＶで刺激した５μｇ／ｍｌのシスプラチン処理ＰＴＥＣによるＦＩＴＣ−アルブミン取り込みを示す。Kolomogorov Smirnov統計分析を実施した。３回の異なる実験を実施したが、同様の結果が得られた。

ＭＶはマトリゲル被覆プレート上で培養したＰＴＥＣの分岐形態形成およびインビボでの尿細管形成を誘導する
ＰＴＥＣをＦＣＳの非存在下、マトリゲル被覆プレート上で２４時間培養すると、嚢胞様構造が形成された。１０μｇ／ｍｌのＭＶを加えると、ＰＴＥＣの分岐形態形成がもたらされた。マトリゲルプラグ中ＰＴＥＣをＳＣＩＤマウスに皮下注射した。これらの細胞は自発的に少数の尿細管様構造を形成し、これは１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下で顕著に増加した。対照的に、シスプラチンはアポトーシスを惹起する分岐形態形成を完全に阻害し、これはＭＶ刺激によって回復された。１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下または非存在下でのマトリゲル被覆プレート上で培養したＰＴＥＣの形態形成を評価した。２４時間後、非刺激ＰＴＥＣは嚢胞様構造を形成したが、ＭＶは散乱および分岐形態形成を誘導した。ＳＣＩＤマウスにマトリゲル中で皮下注射したＰＴＥＣのインビボでの尿細管形成も評価した。非刺激細胞はごく少数の尿細管様構造を形成し、これは１０μｇ／ｍｌの存在下では顕著に増加した。

インビボでのＭＶの尿細管形成効果は用量依存的であった。図１５はＭＶ誘導性インビボ尿細管形成の定量化を示す。尿細管様構造の計測を、多様な用量のＭＶで処理し、ＳＣＩＤマウスに皮下注射したＰＴＥＣの１０個の非連続マトリゲル切片（倍率１００倍）で実施した。マウスを７日後に屠殺し、マトリゲルプラグを蛍光顕微鏡で観察した。データは、３回の異なる実験で計測した尿細管様構造数／視野（倍率１００倍）の平均として表す。ＰＴＥＣの栄養因子であるマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ１０ｎｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。

ＰＴＥＣ単層へのリンパ球の接着の低下
サイトカイン処理ＰＴＥＣは、インビボでＡＲＦ中に生じる炎症性応答を模倣したリンパ球接着を促進した。サイトカインで刺激したＰＴＥＣにＭＶを加えると、ＰＴＥＣへのリンパ球接着を顕著に阻害したが、これはＭＶの抗炎症性作用を示唆している。

図１６：ＰＴＥＣ単層をビークルのみまたは炎症性サイトカイン（２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−ガンマ）と共に、１０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下または非存在下で６時間インキュベートした。ＰＴＥＣ単層を念入りに洗浄した後、１×１０^４個のＰＫＨ２標識化ヒトリンパ球を加え、わずかに振盪しながら１時間、３７℃でインキュベートした。非接着細胞をＰＢＳで３回洗浄して除去し、接着細胞数を倍率１００倍で蛍光顕微鏡で計測して、細胞数／視野として表した。データは３回の異なる実験の平均±ＳＤである。

ＥＰＣ由来ＭＶは細胞増殖およびインビトロでの糸球体内皮細胞（ＧＥＣ）の血管新生を誘導できる
ＥＰＣ由来ＭＶは細胞増殖およびインビトロでの糸球体内皮細胞（ＧＥＣ）の血管新生を誘導できた。ＧＥＣを多様な用量のＥＰＣ由来ＭＶ（１０、１５および３０μｇ／ｍｌ）と共に４８時間インキュベートすると、対照と比較して、ＧＥＣの細胞増殖を顕著に促進した。図１７に示すとおり、ＧＥＣ（９６ウェルプレート中８０００細胞／ウェル）に１０μＭのＢｒｄＵを加え、ビークルのみまたは多様な用量のＭＶと共にＤＭＥＭ中でインキュベートした。次いで細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートしてＤＮＡを消化した。抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ結合ｍＡｂを用いてＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを検出し、可溶性発色基質で可視化した。吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。結果は３回の実験の平均±１ＳＤとして表す。
さらに、多様な用量のＭＶ（１０、１５および３０μｇ／ｍｌ）はインビトロで、マトリゲル上で６時間インキュベートしたＧＥＣの血管新生を誘導した。

腎臓修復に対するＭＶのインビボ生物学的効果
ＭＶは実験的に誘導した急性尿細管損傷の再生を促進する
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの成体骨髄由来のＭＳＣ由来ＭＶが急性腎損傷からの回復を促進できるか決定するため、メスＣ５７／ＢＬ６マウスに高張グリセロールを筋肉内注射して、ＡＲＦを誘導した。グリセロールは組織、特に腎臓に曝露することによって、筋融解、そしてそれによる溶血を多くのミオグロビンおよびヘモグロビンに誘導した。このマウスモデルにおいて、血清クレアチニンおよびＢＵＮによって測定されるように、腎臓機能がグリセロールの投与後１〜４日で損なわれる。今回の条件では、７．５ｍｌ／ｋｇのグリセロールの筋内注射によって、血清クレアチニンおよびＢＵＮの顕著な上昇が誘導され、これは３日目でピークに達し、１０日目に低下し、２１日目に正常化した。グリセロール投与の３日後、ＭＳＣ由来ＭＶまたは１×１０^６個のＭＳＣの静脈内注射によって、生理食塩水を与えたグリセロール処置マウスと比較して、５日目で血清クレアチニンおよびＢＵＮが顕著に低下した（図１８および１９）。

図１８はＭＶがグリセロール処置マウスを腎機能破壊から保護したことを示す。処置なし（黒棒）または３日目に６μｇのＭＶ（白抜き棒）もしくは１×１０^６個のＭＳＣ（斜線付の棒）で処置したグリセロール誘導性ＡＲＦを有するマウスの血中尿素窒素（ＢＵＮ）の評価。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表し、ＡＮＯＶＡを実施した：＊ｐ＜０．０５。

図１９は、処置なし（黒棒）または３日目に６μｇのＭＶ（白抜き棒）もしくは１×１０^６個のＭＳＣ（斜線付の棒）で処置したグリセロール誘導性ＡＲＦを有するマウスにおける、クレアチニンの評価に関する。データは３回の独立した実験の平均±ＳＤとして表し、ＡＮＯＶＡを実施した：＊ｐ＜０．０５。

グリセロール誘導性ＡＲＦを有するマウスにおいて、５日目で顕著な尿細管上皮損傷が明らかであった。グリセロール誘導性ＡＲＦを有するマウスにおいて観察された形態的変化は、刷子縁の喪失および尿細管上皮細胞の広範な壊死および尿細管硝子様円柱の形成を含む。グリセロール処置マウスにＭＶを注射したとき、尿細管再生の局面に関して尿細管病変は重症度が低く、管が刷子縁を再発現した。

ＭＶは実験的に誘導した糸球体損傷の再生を促進する
ヒトＥＰＣ由来ＭＶが糸球体再生を誘導し得るかを決定するために、急性抗体介在性糸球体損傷によって特徴付けられる糸球体腎炎のＴｈｙ−１モデルを用いた：このモデルにおいて、抗Ｔｈｙ−１抗体は糸球体毛細血管の減少を伴ったメサンギウム融解および炎症性細胞の蓄積を誘導する。糸球体損傷はタンパク尿に関連している。糸球体腎炎（ＧＮ）は、６週齢のメスＬｅｗｉｓラットの大腿静脈に２５０μｇ／１００ｇ体重の抗Ｔｈｙ−１抗体（Ａｂ）を０日目に静脈内投与して誘導した。対照動物には抗Ｔｈｙ１．１Ａｂの代わりに同量の生理食塩水を注射した。既にタンパク尿が検出できた２日目に、３０μｇのＥＰＣ由来ＭＶを反対側の大腿静脈に注射した。対照動物には同量のビークル（Ｈｅｐｅｓ修飾Ｍ１９９培地と１％のＤＭＳＯ）のみを注射で投与した。タンパク尿、血清および尿クレアチニン／尿素（２４時間尿採取）を毎日評価した。マウスを４日目、７日目、１４日目に屠殺した。各実験グループは９匹のラットを含む。

図２０に示すとおり、ＭＶの投与によってＴｈｙ−１ＧＮを有するラットのタンパク尿が顕著に減少した。組織学的分析は、Ｔｈｙ−１ＧＮを有するラットにおける微小動脈瘤（microaneurismatic）形成および炎症性細胞の存在を伴った、毛細血管壁の広範囲にわたる損傷の存在が示された。糸球体毛細血管の減少はまた、内皮マーカーであるＲＥＣＡ抗原についての染色の減少によっても示された。さらに、尿細管腔におけるタンパク質構造物による近位および遠位尿細管の広範な損傷が観察された。ＭＶで処理したラットの腎臓の組織学的試験は、４日目での糸球体および尿細管の損傷の減少ならびに７日目でＲＥＣＡ抗原および尿細管細胞刷子縁の正常な分布が検出されるように、糸球体毛細血管の再生が示された。ＭＶ処置による毛細血管損傷の阻害は、ＭＶ処置ラットにおける無傷の内皮細胞層の存在および糸球体上皮細胞足突起の正常な分布を示した電子顕微鏡観察によって確認された。対照的に、ＭＶで処置しなかったラットにおいて、炎症性細胞による損傷内皮の食作用に関連した内皮細胞の膨潤および脱離が観察された。さらに、足突起の展退が存在した。
結論として、ＭＶによるＴｈｙ−１ＧＮの処置は、タンパク尿、糸球体炎症性病変を阻害し、糸球体毛細血管再生および回復を促進した。

結論
得られた実験結果は、内皮前駆体、間葉系、肝および腎幹細胞のような異なる起源の幹細胞に由来するＭＶは、腎成熟細胞に生物学的シグナルを伝達することができ、これによってアポトーシス刺激に対する耐性ならびに移動能および増殖能と共に、未成熟表現型を獲得する標的細胞の脱分化が生じることを示唆している。常在細胞の脱分化、それらの移動および増殖は、腎尿細管および糸球体損傷後の修復に必須である。したがって、幹細胞由来ＭＶは、多様な腎尿細管および糸球体病的状態における再生両方に提唱され得る。幹細胞よりもＭＶを用いる利点は、幹細胞の潜在的な腫瘍原性効果の回避、免疫抑制の必要の回避および限定されないインビトロでの生産の可能性である。

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Claims

腎損傷の処置用かつ上皮再生用医薬の製造のための、幹細胞由来微小胞（ＭＶ）の使用であって、微小胞の起源である幹細胞が、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、腎前駆細胞ＣＤ１３３ ^＋、成人肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）およびそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、使用。
医薬が急性腎不全（ＡＲＦ）の処置用である、請求項１の使用。
医薬が、静脈内輸液による投与に適した投与形態である、請求項１または２の使用。
医薬が、３０〜１２０μｇ／ｋｇ体重の微小胞の投与に適した投与形態である、請求項１〜３の何れかの使用。
薬学的に許容されるビークルまたは希釈剤中に有効量の１種以上の幹細胞由来微小胞（ＭＶ）を含む腎損傷の処置用医薬組成物であって、微小胞の起源である幹細胞が、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、腎前駆細胞ＣＤ１３３ ^＋、成人肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）およびそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、医薬組成物。
静脈内輸液による投与に適した投与形態である、請求項５の医薬組成物。
３０〜１２０μｇ／ｋｇ体重の微小胞の投与に適した投与形態である、請求項５または６の医薬組成物。
インビトロで、腎損傷において上皮を再生する方法であって、有効量の幹細胞由来微小胞（ＭＶ）で腎損傷を処置することを含み、微小胞の起源である幹細胞が、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、腎前駆細胞ＣＤ１３３ ^＋、成人肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）およびそれらの何れかの組合せから成る群から選択される、方法。