JP5400768B2

JP5400768B2 - Ｐｃｒ及び他のデータセットにおけるクロストーク係数を決定するシステム及び方法

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Publication number: JP5400768B2
Application number: JP2010513758A
Authority: JP
Inventors: ティー．クルニク，ロナルド; サネ，アディテャ; エルキン，クリス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
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Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2014-01-29
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Description

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）曲線などのＳ字型曲線又は成長曲線を示すデータを処理するシステム及び方法に関する。より詳細には、ＰＣＲ検出システムにおいてクロストーク特性を決定するシステム及び方法に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、酵素的に合成するインビトロの（in vitro）方法である。すなわちポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、規定された核酸配列を増幅するインビトロの方法である。一般的には、反応は、逆ストランドをハイブリダイズし、増幅するべき標的ＤＮＡ、又は鋳型ＤＮＡに隣接する（flank）２つのオリゴヌクレオチドプリマを使用する。プリマのエロンゲーションは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが触媒作用を及ぼす。テンプレートの変性（template denaturation）と、プリマアニーリング（primer annealing）と、ポリメラーゼによってアニールされるプリマの伸展とを含む反復的な一連のサイクルは、特定のＤＮＡ断片の指数的な蓄積をもたらす。一般的には、蛍光プローブを処理で使用して、増幅処理の検出及び定量化を容易にする。

図１ａにおいて、一般的なリアルタイムＰＣＲ曲線の組を示す。ここで、蛍光強度の値は、一般的なＰＣＲ処理におけるサイクル数に対してプロットされる。この場合、ＰＣＲ生成物の構造は、ＰＣＲ処理のそれぞれのサイクルにおいて監視される。増幅は、増幅反応の間蛍光信号を測定する構成素子及び装置を含むサーモサイクラ（thermocycler）内で通常測定される。このようなサーモサイクラの例は、Roche DiagnosticsのLightCycler（Cat. No. 20110468）である。例えば、増幅産物は、標的の核酸に結合するときに蛍光信号を放射し且つ蛍光ラベルされるハイブリダイゼーション・プローブ（hybridization probes）の手段によって検出される。ある場合には、増幅産物は、二重鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素の手段によっても検出される。図１ａから分かるように、ＰＣＲ曲線は、ベースライン領域５とプラト領域６とを有する。ベースライン領域５とプラト領域６との間の領域は、成長領域と一般的に称される。

ＰＣＲ実験からの放射線放出を分析する一般的なＰＣＲ検出システムは、さらなる分析のために波長帯を分離する操作が可能な２つ又は３つ以上のフィルタを有する。例えば、それぞれの光学フィルタは、規定された波長帯の実質的に全ての放射線を通すことが可能である。しかしながら、一般的にはプローブ又はマーカは、波長帯域が部分的にオーバラップして放出され、フィルタの通過帯域は、他のプローブから放出された信号をそれぞれの検出チャネル受信するように、このオーバラップの領域を有する。このクロストーク信号は、対象の実際の信号に作用する傾向がある。したがって、それぞれの検出チャネルにおいて、このようなクロストーク信号を補正することが望ましい。これを行う従来の方法の１つは、定量的なクロストーク係数を決定し、これを使用してそれぞれの検出チャネルにおいてクロストーク信号を補正することである。

現在のクロストーク手順において、一般的にクロストーク係数は、基準信号及びクロストーク信号のプラトの平均値の割合を使用して計算される。従来の方法は、データの１０％未満を包含するプラト領域にもっぱら頼っている。またＰＣＲの間、プラト領域の信号は、化学的構造が不安定な状態にあるときに生成される。このために、一般的にはベースライン信号のしきい値は、標的の識別に使用される。したがって、従来の方法は、ノイズがある信号を使用して、曲線における真の信号捕捉領域からのデータを含まない限定された情報によってクロストーク係数を決定する。さらに従来のクロストークモデルにおいて使用する不正確な仮定がデータ捕捉曲線に応じてエラーを誘発することも分かっている。したがって、クロストーク係数を計算する従来の方法は、（１）プラトが存在する、（２）プラトが平坦である（３）プラトのノイズが最小限である、との条件で十分なものになる可能性がある。しかし、そうでない場合である多くのデータの組がある。

したがって、Ｓ字型曲線又は成長曲線、及び特にＰＣＲ曲線などの曲線において、クロストーク係数を決定するシステム及び方法を提供して、上述の問題及び他の問題を克服することが望ましい。

本発明は、Ｓ字型曲線又は成長曲線、及び特にＰＣＲ曲線などの曲線において、クロストーク係数を決定するシステム及び方法を提供する。また、本発明は、線形減法モデル（linear subtractive model）を使用してデータの組を補正したクロストークを生成するためにクロストーク係数を適用するシステム及び方法を提供する。

様々な実施形態に従うと、クロストーク信号の係数は、基準信号（ゲイン毎に、随意的には線形項を加える）と、クロストーク信号との間の差の二乗和を最小化することによって決定される。この技術は、基準信号及びクロストーク信号のプラトの平均値の割合を使用する従来技術よりも優れていることが示されている。さらに、この技術は、全体的な信号獲得範囲に亘るデータを分析して、クロストーク係数を決定する。例えば、獲得範囲に亘る全てのデータを使用でき、又は全体的な獲得範囲に亘る一部のデータを使用できる。信号曲線データの全てに亘って解析することにより、全体的なデータ獲得範囲に亘り且つロバスト性に優れたクロストーク補正を提供する。さらに、従来の方法は、全てのソースから測定する信号は、線形加法モデル（linear additive model）であり、全ての信号は、検出器の間で分析されると仮定するが、これは、事実とは異なり、過剰な補正、及び不足する補正の双方を結果として生じる信号にもたらす。代わりに本発明の技術は、この問題を克服する線形減法モデルを使用し、実際の検出システムを良好にモデル化する。これらの新しい技術は、クロストーク係数が２％又はそれよりも大きい範囲における実施例において、最大の有用性を手に入れることになるであろう。

本発明の１つの態様に従うと、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）光学検出システムのクロストーク係数を決定する方法が提供される。本方法は、ＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘りＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得するステップを含み、獲得範囲に亘るクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するステップを含む。さらに本方法は、ＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するステップを含む。ある態様では、獲得範囲は、ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含む。ある態様では、獲得範囲に亘るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含む。ある態様では、クロストーク係数は、ＰＣＲデータの組に適用されて、補正したＰＣＲデータの組のクロストークを生成する。ある態様では、線形減法モデルを使用して、クロストーク係数を適用する。

本発明の他の態様に従うと、プロセッサを制御するコードを有し、又は記憶して、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）光学検出システムのクロストーク係数を決定するコンピュータが読み取り可能な媒体が提供される。コードは、ＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘り獲得するＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために受信する命令を含み、獲得範囲に亘り獲得するそれぞれのフィルタのクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に受信する命令を含む。また、コードは、ＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定する命令を含む。ある態様では、獲得範囲は、ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含む。ある態様では、クロストーク係数を決定するコードは、獲得範囲に亘るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定するコードを含む。

本発明のさらに他の態様に従うと、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する光学検出モジュールを有するキネティック・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムが提供される。ここで、光学検出モジュールは、ＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘るＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得するように構成され、獲得範囲に亘るクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するように構成される。また本システムは、獲得したＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを処理して、クロストーク係数を決定するように構成されるインテリジェントモジュールを含む。ある態様では、獲得範囲は、ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含む。ある態様では、インテリジェントモジュールは、獲得範囲に渡るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定する。

本発明のまたさらなる態様に従うと、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する光学検出モジュールを有する核酸融解（nucleic acid melting）分析システムが提供される。光学検出モジュールは、温度獲得範囲に亘る融解データの組をそれぞれの光学素子のために獲得するように構成され、温度獲得範囲に亘るクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するように構成される。光学検出モジュールは、温度獲得範囲に亘るそれぞれの融解データの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定する。

本発明のまたさらなる態様に従うと、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する光学検出システムのためにクロストーク係数を決定する方法が提供される。本方法は、成長処理の獲得範囲に亘る第１のデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得するステップと、獲得範囲に亘るクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するステップと、獲得範囲に亘る第１のデータの組とクロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するステップとを含む。ある態様では、成長処理は、ＰＣＲ処理、細菌処理、酵素処理、又は結合処理の１つである。

図面及び特許請求の範囲を含む、本明細書の他の部分を参照することにより、本発明の他の特徴及び有利な点を理解することになるであろう。本発明に係るさらなる特徴及び有利な点は、本発明に係る様々な実施形態の構成及び操作と同様に、添付図面に対して以下に詳細に説明される。図面における同種の符号番号は、同一の要素、又は機能的に類似する要素を示す。

一般的なＰＣＲ処理におけるサイクル数に対する蛍光強度の値をプロットした一般的なリアルタイムＰＣＲ曲線の組を示す図である。２つ又は３つ以上の検出チャネルを使用してＰＣＲ増幅処理を分析する検出システムのためにクロストーク係数を決定する処理を示す図である。２チャネル検出システムのための、ＦＡＭ信号と、ＨＥＸ内のＦＡＭ信号のクロストークである特定の２チャネルの場合を示す図である。２チャネル検出システムのための、ＦＡＭ信号と、ＨＥＸ内のＦＡＭ信号のクロストークである特定の２チャネルの場合を示す図である。２つのフィルタの範囲における２つの色素スペクトルのオーバラップを示す図である。従来の方法でＦＡＭチャネルに標的を置き、ＨＥＸチャネルに標的を置かずにＦＡＭチャネル及びＨＥＸチャネルをテストしたときの２４個のそれぞれの残差プロットを示す図である。図４の端から端までの２４個のプロットを示す図である。図４の２４個の全てのプロットの重ね合わせを示す図である。本発明の実施形態に従って処理されたデータの組の端から端までの残差プロットを示す図である。本発明の実施形態に従って処理されたデータの組の端から端までの残差プロットを示す図である。本発明の実施形態に従って処理されたデータの組の端から端までの残差プロットを示す図である。図７に示すプロットに対応する重ね合わせた残差プロットを示す図である。図８に示すプロットに対応する重ね合わせた残差プロットを示す図である。図９に示すプロットに対応する重ね合わせた残差プロットを示す図である。ＦＡＭチャネルに標的を置き、ＨＥＸチャネルに標的を置ないＨＩＶ試験法のＰＣＲ実験のためのデータの組を示す図である。図１３のＨＩＶ試験法に対応するＨＥＸチャネルのためのクロストークデータの組を示す図である。従来の方法を使用してＨＥＸチャネルの補正したクロストーク信号を示す図である。本発明に係る実施形態を使用してＨＥＸチャネルの補正したクロストーク信号を示す図である。本発明に係る実施形態を使用してＨＥＸチャネルの補正したクロストーク信号を示す図である。ソフトウェア資源とハードウェア資源との間の関係を示すブロックを概略的に示す図である。

本発明は、クロストーク係数を決定するシステム及び方法、並びにクロストーク係数を使用して補正したクロストークデータを生成するシステム及び方法を提供する。詳細にはＰＣＲ検出システム、並びにＰＣＲデータの組、及び核酸融解データの組のシステム及び方法を提供する。また、本発明は、線形減法モデルを使用して補正したクロストークデータの組を生成するためにクロストーク係数を適用するシステム及び方法を提供する。

本明細書の他の部分では、ＰＣＲデータの適用性の観点から本発明に係る実施形態及び態様を説明することになるが、本発明は、他の処理に関連するデータに適用できることは明らかであろう。Ｓ字型曲線又は成長曲線を提供する他の処理、又は本発明の技術に従って処理できる他の処理の例示は、細菌処理、融解処理、微生物成長処理（microbial growth processes）,（酵素キネティック反応（enzymatic kinetic reactions）などの）酵素処理、及び結合処理を含む。また、本発明の技術は、核酸融解処理及び類似する処理などからのデータを分析することに適用可能である。

図１ａに示すように、ＰＣＲサイクル数をＸ軸に規定し、堆積したポリヌクレオチド成長の指標をＹ軸に規定するなどして、一般的なＰＣＲ成長曲線のデータを２次元座標のシステムに示すことができる。図１ａに示すように、一般的には、蛍光マーカを使用することがおそらく最も広く使用されるラベリングスキーマであり、堆積した成長の指標は、蛍光強度の値である。しかしながら、特定のラベリング及び／又は検出スキーマを使用するときには、他の指標を使用できることが理解されるはずである。堆積した信号成長（accumulated signal growth）の他の有用な指標の例示は、発光強度、化学発光強度、生物発光強度、リン光強度、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギ、温度、粘度、光散乱、放射線強度、反射率、透過率、及び吸収率を含む。またサイクルの定義は、時間、処理サイクル、単位操作サイクル（unit operation cycle）、及び生殖サイクルを含む。

〔処理の概略的な概説〕
図１ｂを参照することによって、２つ又は３つ以上の検出チャネルを使用するＰＣＲ増幅処理を分析する検出システムのためにクロストーク係数を決定する、本発明に係る１つの実施形態である処理１００を簡単に説明できる。ある態様では、ＰＣＲ検出システムは、ＰＣＲ実験からの放射線放出を分析するための検出器を含む。検出システムは、さらなる分析のために波長帯を分離する操作がそれぞれ可能な光学素子を含む。これらの光学素子は、特定の色素の発光帯域内の放射を分離するなど、ＰＣＲ増幅処理において使用される蛍光プローブ又はマーカの発光特性に整合するように通常選択される。例えばある態様において、発光素子は、規定した波長帯の全ての放射が通過できる１つ又は２つ以上の光学フィルタを含む。他の光学素子は、回折格子を含むことができる。それぞれの光学素子は、検出素子が受信した波長帯などの検出チャネルを規定する。

本発明の典型的な実施形態において、本方法は、キーボード、マウスなどのようなデータの組を入力する入力装置、モニタなどのような曲線の領域における対象の特定点を示す表示装置、ＣＰＵなどのような本方法におけるそれぞれのステップを実施するために必要な処理装置、モデムなどのようなネットワークインタフェース、及びデータの組とプロセッサにおいて実行するコンピュータコードなどとを記憶するデータ記憶装置を含む従来のパーソナルコンピュータシステムを使用して実施できるがこれに限定されるものではない。さらにまた、本方法は、ＰＣＲ装置において実施できる。

ステップ１１０において、それぞれの検出チャネルでは、１つ又は２つ以上のＰＣＲ曲線を示す実験データの組が受信あるいは獲得される。ある態様において、ベースライン領域、移行領域、プラト領域などの、検出システムの全ての獲得範囲に亘ってデータが獲得される。図２Ａにおいて、プロットされたＰＣＲデータの組（１つ又は２つ以上のＰＣＲデータ曲線の組）を示す。ここでは、Ｙ軸とＸ軸とは、ＰＣＲ曲線の蛍光強度とサイクル数とをそれぞれ示す。ある態様では、データの組は、軸に沿って等間隔のデータを含むはずである。しかしながら、１つ又は２つ以上のデータの欠落点がある可能性がある。ステップ１２０において、ステップ１１０と同時に、それぞれ他のチャネルにおける獲得範囲に亘るクロストークデータの組が獲得される。図２Ｂにおいて、クロストークデータの組の例示が示される。ステップ１３０において、以下に詳細に説明されるように、データの組を処理してクロストーク係数が決定される。ある態様において、以下に詳細に説明されるように、それぞれのＰＣＲデータの組とクロスデータの組との間の二乗和が最小化される。他の態様において、ＰＣＲデータの組とクロスデータの組との間の差の絶対値の和が最小化される。

サーモサイクラなどのようなＰＣＲデータ獲得装置に内在する（命令を実行するプロセッサなどの）インテリジェンスモジュールにおいてプロセス１００が実施される場合、データの組は、データが収集されるとリアルタイムでインテリジェンスモジュールに提供でき、又はメモリ部又はバッファに記憶して実験が終了した後にインテリジェンスモジュールに提供できる。同様に、データの組は、デスクトップコンピュータシステム、又は他のコンピュータシステムなどの別のシステムに（ＬＡＮ、ＶＰＮ、イントラネット、インタネットなどの）ネットワーク接続、又は（ＵＳＢ若しくは他の有線又は無線の直接接続などの）獲得装置への直接接続を介して提供でき、若しくはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピディスクなどのような携帯型媒体に提供できる。

図１８は、ソフトウェア資源とハードウェア資源との間の関係を概略的に説明するブロックである。このシステムは、サーモサイクラ装置に配置できるキネティックＰＣＲ分析モジュールと、コンピュータシステムの一部であるインテリジェンスモジュールとを有する。データの組（ＰＣＲデータの組）は、分析モジュールからインテリジェンスモジュールに、又はインテリジェンスモジュールから分析モジュールにネットワーク接続又は直接接続を介して転送される。プロセッサで実行され、インテリジェンスモジュールの記憶装置に記憶され、処理の後に分析モジュールの記憶装置の返送されるコンピュータコードによって、図１ｂに表示される方法に従ってデータの組が処理される。ここで、修正されたデータは、表示装置に表示できる。

ある態様では、データの組は、一対の座標値（又は２次元ベクトル）を有するデータ点を含む。ＰＣＲデータでは、一対の座標値は、サイクル数及び蛍光強度の値を示す。

ステップ１３０において、クロストーク係数が決定された後に、ステップ１４０において、決定された元のＰＣＲデータ又は新しいＰＣＲデータにクロストーク係数を適用して補正したクロストークデータの組を生成できる。ステップ１５０において、クロストーク係数及び／又は補正したクロストークＰＣＲデータの組、又は他のデータは、メモリ部に記憶でき、ネットワーク接続又は携帯型記憶媒体を介して種々のシステムに提供でき、モニタ又はプリンタなどのような表示装置に表示できる。

〔クロストーク係数の決定〕
従来のクロストークモデルにおいて、クロストーク係数は、概して以下のように計算される。

固有であるがスペクトルがオーバラップする２つの可視色素を包含する単一のサンプルを仮定する。検出システムは、一方の色素スペクトルの約９５％を通し、他方の色素スペクトルの約５％を通すそれぞれの２つの固有の光スペクトルフィルタからなる。それぞれのフィルタは、ただ１つの色素からの光を通すように最適化される。フィルタのそれぞれを通る光は、それぞれチャネル１、チャネル２と考えられる。
（１）チャネル１及び２のプラト信号領域における５つのデータ点の平均を取る
PLAvg1 = 平均（プラトチャネル１の５つの点）
PLAvg2 = 平均（プラトチャネル２の５つの点）
（２）サンプルのクロストーク係数を計算する
XT-dye2-channel1 = PLAvg2/ PLAvg1
（３）ここでサンプルの大きさを９６マルチウェルプレートに増加し、チャネル１->チャネル２のXTを計算する
XT(1->2) = 平均（XT1,XT2,.....,XT96）

従来のこのクロストーク計算方法は、（１）プラトが存在する、（２）プラトが平坦である（３）プラトのノイズが最小限である、との条件で十分なものになる可能性がある。しかし、そうでない場合の多くのデータの組がある。

本発明の様々な実施形態に従うと、クロストーク係数の計算の正確性を向上する方法が提供される。ある態様に従って、クロストーク係数は、線形回帰に類似する最適化技術を使用することによって決定される。基準信号として「Signal」を規定し、クロストーク信号として「ＸＴSignal」を規定し、サイクル数として添字ｉを規定し、乗法ゲイン（multiplicative gain）としてｑを規定し、オフセット及び傾きとしてｒ及びｓを規定すると、３つの典型的な実施形態が以下の式によって説明できる。
（１）式（１）に示すように、単純なゲイン「ｑ」を使用して、それぞれの蛍光信号とクロストーク信号との間の二乗和を最小化する。

（２）式（２）に示すように、共通のオフセット「ｒ」及び傾き「ｓ」と、それぞれの単純なゲイン「ｑ」とを使用して、それぞれの蛍光信号とクロストーク信号との間の二乗和を最小化する。これは、それぞれのチャネルのクロストーク係数と、全てのチャネルに共通する線形項とをもたらすことになる。

（３）式（３）に示すように、オフセット「ｒ」と、傾き「ｓ」と、単純なゲイン「ｑ」とを使用する、それぞれの蛍光信号とクロストーク信号との間の二乗和を最小化する。これは、それぞれのチャネルのクロストーク係数と、線形項とをもたらすことになる。

他の態様において、ＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の差の絶対値の和が最小化される。レーベンバーグ・マルカート法、線形計画法、Nelder-Mead法、勾配降下法、部分勾配手法、シンプレックス法、楕円体法、バンドル法、ニュートン法、準ニュートン法、内点法、及び当業者に理解されると思われる他の方法などを使用できる。

これらの様々な実施形態の１つの有利な点は、全ての信号獲得範囲に亘るデータを使用してクロストーク係数を決定することである。例えば、獲得範囲に渡る全てのデータを使用でき、又は全ての獲得範囲に亘るデータの一部を使用できる。これは、系統的なデータ獲得エラーを平均するクロストーク係数を提供する。反対に、従来の方法は、データの１０％未満を包含するプラト領域にもっぱら頼っている。また、本発明の実施形態は、ＰＣＲなどの分析にさらなる有利な点を提供する。ＰＣＲの間、プラト領域の信号は、プローブの大部分が消費されたときに生成される。このため、基準信号のしきい値は、概して標的の識別に使用される。したがって、従来の方法は、ノイズを有する信号を使用して、曲線における真の獲得点からのデータを含まない、限定された情報によってクロストーク係数を決定する。また、従来のクロストークモデルで使用する不正確な仮定は、不正確な仮定がデータ獲得曲線に応じてエラーを誘発することも分かっている。クロストークの計算に全ての曲線を使用することにより、誤っている仮定の一部を取り除く。また、正確なモデルのさらなる使用によって、クロストーク補正のエラーを事実上排除する。

ある実施形態に従って、クロストーク係数を決定するのに先立ち、バックグラウンド除去及び／又はベースライン除去が全ての信号（基準信号及びクロストーク信号）を示すデータの組において実行される。バックグラウンド除去は、それぞれの信号に固有のバッファ信号を除去することにより行われる。ベースライン除去は、ベースライン（傾き及び断片など）を規定し、全ての信号（基準信号及びクロストーク信号）からこのベースラインを除去することによって行われる。ベースラインは、ベースラインのスタート値及びストップ値を特定し、これらの端点の間に直線回帰を実行することによって規定でき、又は（ダブルシグモイド関数（double sigmoid function））などの関数を曲線適合（curve fitting）し、この関数から傾き及び切片のパラメータをベースラインとして使用することによって規定できる。

ある態様では、ベースラインの決定は、規定したベースラインのスタート位置とストップポイント位置との間のデータの組に直線回帰を実行することを含む。他の態様では、ベースラインの決定は、ダブルシグモイド関数を曲線適合して、傾き値及び切片値を識別することを含む。

特定の態様では、本方法は、クロストーク係数を決定するのに先立ち、ＰＣＲデータの組（信号）とクロストークデータの組とから異常点（outlier points）、すなわち「スパイク」を取り除くことを含む。名称を「レーベンバーグ・マルカート異常点スパイク除去法（Levenberg Marquardt Outlier Spike Removal Method）」という米国特許出願第１１／３１６３１５号と、名称を「レーベンバーグ・マルカートアルゴリズムと正規化とによるダブルシグモイド関数曲線適合を使用することによるＰＣＲエルボの決定（PCR Elbow Determination By Use of a Double Sigmoid Function Curve Fit With the Levenberg-Marquardt Algorithm and Normalization）」という米国特許出願第１１／３４９５５０号とは、ダブルシグモイド関数を適合してＰＣＲ曲線の傾き及び切片をとりわけ決定する技術と、ＰＣＲデータの組の異常点、すなわち「スパイク」を識別し、取り除く技術とを開示する。

本方法のある態様において、光学素子は、１つ又は２つ以上のフィルタを有し、それぞれのフィルタは、特定の異なる波長帯の光を通すことができる。特定の実施形態では、システムは、少なくとも４つのフィルタを有する。

他の態様において、本方法は、補正したクロストークデータの組を生成するときに後に使用するために、決定したクロストーク係数を表示し、又は出力し及び／又は決定したクロストーク係数をメモリモジュールに記憶する。

さらに本発明は、プロセッサを制御するコードを有するコンピュータが読み取り可能な媒体と関連して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）光学検出システムのクロスオーバ係数を決定する。光学検出システムは、それぞれ電磁的な種々の特定の波長帯を分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する。コードは、それぞれ他の光学素子のために、ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを有するＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘って獲得するＰＣＲデータの組を受信するための命令と、獲得範囲に亘って獲得するそれぞれのフィルタのクロストークデータの組を同時に受信する命令と、獲得範囲に亘るＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定する命令とを有する。ある態様では、光学素子は、１つ又は２つ以上の光学フィルタを有し、それぞれのフィルタは、特定の異なる波長帯の光を通すことができる。

コンピュータが読み取り可能な媒体の他の態様において、データ獲得範囲は、複数のＰＣＲサイクルを表す。ここでは、クロストーク係数を決定することは、獲得範囲に亘るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストーク係数の組との間の二乗和を最小化することを含む。

特定の実施形態では、二乗和の最小化は、以下の式を使用することを含む。

ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signaliは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignaliは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｑは、乗法ゲイン因子である。

他の実施形態では、二乗和の最小化は、以下の式を使用することを含む。

ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signaliは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignaliは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｒは、共通のオフセットであり、ｓは、共通の傾きであり、ｑ１、ｑ２、及びｑ３は、乗法ゲイン因子である。

さらに他の実施形態では、二乗和の最小化は、以下の式を使用することを含む。

ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signaliは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignaliは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｒは、オフセットであり、ｓは、傾きであり、ｑは、乗法ゲイン因子である。

ある態様では、コードは、それぞれのＰＣＲデータの組とそれぞれのクロストークデータの組とのベースラインを決定する命令と、クロストーク係数を決定するのに先立ち、それぞれのデータの組からそれぞれのベースラインを除去する命令とをさらに有する。これを考慮すると、ベースラインを決定する命令は、ベースラインのスタート位置とストップ位置との間のデータの組に直線回帰を実行する命令を有することができる。他の態様では、ベースラインを決定する命令は、ダブルシグモイド関数を曲線適合して、傾き値及び切片値を識別する命令を有することができる。

他の態様では、コードは、クロストーク係数を決定するのに先立ち、ＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とから異常点を除去する命令をさらに有する。コードは、決定したクロストーク係数を表示し又は出力する命令をさらに有することができる。他の実施形態では、コードは、補正したクロスデータの組を生成するときに後に使用するために、決定したクロストーク係数をメモリモジュールに記憶する命令をさらに有することができる。

また、コードは、線形減法モデルを使用して、決定したクロストーク係数をＰＣＲデータの組に適用して、補正したクロストークデータの組を生成する命令をさらに有することができる。これを考慮すると、線形減法モデルは、以下の式を含むことができる。

ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_ijは、チャネル（ｊ）からチャネル（ｉ）へのクロストーク係数を示す。

他の態様において、線形減法モデルは、以下の式を含むことができる。

ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_ijは、チャネル（ｊ）からチャネル（ｉ）へのクロストーク係数を示し、ｒとｓとは、それぞれ全てのチャネル（ｉ）に共通のゲインと線形項とである。

さらに他の態様において、線形減法モデルは、以下の式を含むことができる。

ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_ijは、チャネル（ｊ）からチャネル（ｉ）へのクロストーク係数を示し、ｒ_iとｓ_iとはそれぞれ、それぞれのチャネル（ｉ）の異なるゲインと線形項とである。

また、本発明は、少なくとも２つの光学素子を有する光学検出モジュールを有するキネティック・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムに関する。それぞれの光学素子は、特定の異なる電磁的波長帯を分離する操作が可能であり、光学検出モジュールは、ベースライン領域、成長領域、及びプラト領域を含む、ＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘りそれぞれの光学素子のためにＰＣＲデータの組を獲得するように構成され、獲得範囲に亘りそれぞれ他の光学素子のためにクロストークデータの組を同時に獲得するように構成される。そして、インテリジェンスモジュールは、獲得したＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを処理して、獲得範囲に亘るＰＣＲデータの組とクロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するように構成される。本システムのある態様において、データ獲得範囲は、複数のＰＣＲサイクルを示し、インテリジェンスモジュールは、獲得範囲に渡るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定する。二乗和の最小化は、以下の式を使用することを含む。

ここで、ｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signal_iは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignal_iは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｑは、乗法ゲイン因子である。

ここで、ｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signal_iは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignal_iは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｒは、共通のオフセットであり、ｓは、共通の傾きであり、ｑ１、ｑ２、及びｑ３は、乗法ゲイン因子である。

ここで、ｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signal_iは、光学素子のＰＣＲデータの組であり、XTSignal_iは、光学素子のクロストークデータの組であり、ｒは、オフセットであり、ｓは、傾きであり、ｑは、乗法ゲイン因子である。

さらに本システムにおいて、インテリジェンスモジュールは、それぞれのＰＣＲデータの組、及びクロストークデータの組のベースラインを決定するように構成でき、クロストーク係数を決定するのに先立ち、それぞれのデータの組からベースラインを除去するように構成できる。特定の実施形態において、インテリジェンスモジュールは、規定したベースラインのスタート位置とストップ位置との間のデータの組に線形回帰を実行することによって、ベースラインを決定する。他の特定の実施形態では、インテリジェンスモジュールは、ダブルシグモイド関数を曲線適合することによってベースラインを決定して、傾き値及び切片値を識別する。

さらに本システムのある実施形態では、インテリジェンスモジュールは、クロストーク係数を決定するのに先立ち、ＰＣＲデータの組、及びクロストークデータの組の１つ又は２つ以上から異常点を除去するように構成できる。本システムの他の実施形態では、光学素子は、１つ又は２つ以上のフィルタを含み、それぞれのフィルタは、特定の異なる波長帯の光を通すことができる。

さらに本システムにおいて、インテリジェンスモジュールは、線形減法モデルを使用して、決定したクロストーク係数をＰＣＲデータの組に適用して、補正したクロストークデータの組を生成できる。ある実施形態では、線形減法モデルは、以下の式を含む。

ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_ijは、チャネル（ｊ）からチャネル（ｉ）へのクロストーク係数を示す。他の実施形態では、線形減法モデルは、以下の式を含む。

ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_ijは、チャネル（ｊ）からチャネル（ｉ）へのクロストーク係数を示し、ｒとｓとは、それぞれ全てのチャネル（ｉ）に共通のゲインと線形項とである。他の実施形態では、線形減法モデルは、以下の式を含む。

ある態様における本システムは、表示モジュールをさらに有することができる。ここで、インテリジェントモジュールは、決定したクロストーク係数の１つを表示し、又は補正したクロストーク係数の組を表示する表示モジュールにデータを提供するようにさらに構成できる。特定の実施形態では、本システムは、メモリモジュールをさらに有する。ここで、インテリジェントモジュールは、補正したクロストーク係数の組を生成するときに後に使用するために、決定したクロストーク係数を記憶するようにさらに構成できる。

〔ＨＰＶ較正検定（HPV Calibration Assay）を使用する実施例〕
特定の２チャネルの場合を考える。図２Ａ及び２Ｂに示すように、ＨＰＶ較正検定におけるＦＡＭ信号と、ＨＥＸチャネル内のＦＡＭ信号のクロストークである。ＦＡＭとＨＥＸとは、異なる励起特性及び発光特性を有する周知の蛍光色素である。ノイズが少なくプラトが明確であるので、図２Ａ及び２Ｂの信号は、ほぼ理想的である。したがって、従来の方法で計算したときと、式（１）〜（３）の方法で計算したときとでクロストーク係数がほぼ等しくなることが期待されるであろう。

〔クロストーク係数を決定する従来の方法を使用する分析〕
クロストークデータからプラト領域の５つの点のデータの平均を取り、全体の信号（pure signal）からプラト領域の５つの点の平均によって分割する。そして、クロストーク係数は、サーマルサイクラー（商標）の全てのウェル（wells）にクロストーク係数の平均として規定される。結果は、（Mathematica（登録商標）によって示される）。

このように、この例では、ＦＡＭとＨＥＸとのクロストーク係数は、0.01549であると決定される。式（１）〜（３）の方法によるＦＡＭとＨＥＸのクロストーク係数の概要を以下の表１に示す。

従来の方法に最も類似するであろう式１は、ほぼ同一のクロストーク係数を生成する一方、線形項を有するために式２及び３は相違する。

〔従来の方法と式（１）とのクロストークのマトリックスの比較〕
特定の４チャネルの場合を考える。ＨＰＶ較正検定におけるＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、及びＣＹ５．５のクロストーク係数の全てを比較することは有益である。以下の表２には、従来の方法をしようして計算されたクロストーク係数が示される。一方、表３は、式（１）を使用して計算された係数を示す。式（１）は、対角要素（a₁₁、a₂₂、a₃₃、a₄₄）を使用しない。そこでこれらのセルは「−」が付される。このＨＰＶ較正の組について既に説明したように、ノイズが最小限でありプラトが明確であるときは、クロストーク係数の２つの組は、ほぼ同一になるように期待される。

このように、この具体的な実施例における従来の方法と式（１）〜（３）とを適用するときの差は、クロストーク係数の数学的なアプリケーションによるものであり、係数そのものによるものではないであろう。なお、しかしながら、現在の方法と式（１）〜（３）とを比較したときにクロストーク係数が大きく異なる多くの実施例がある。

〔補正したクロストークデータを生成するクロストーク係数のアプリケーション〕
クロストーク係数を適用する従来の方法は、以下の式（４）に示す付加的な線形モデルを仮定する。
ｆ₁ = a₁₁c₁ + a₁₂c₂ + a₁₃c₃ + a₁₄c₄
ｆ₂ = a₂₁c₁ + a₂₂c₂ + a₂₃c₃ + a₂₄c₄
ｆ₃ = a₃₁c₁ + a₃₂c₂ + a₃₃c₃ + a₃₄c₄
ｆ₄ = a₄₁c₁ + a₄₂c₂ + a₄₃c₃ + a₄₄c₄ （４）
ここでf_iは、測定された信号であり、c_iは、蛍光色素信号であり、係数a_IJは、チャネルＪからチャネルＩへのクロストーク係数である。

また、これらのクロストーク係数は、以下の特性を有する。

式（４）の組を逆行列によって解いて、補正したクロストーク信号として規定される色素信号c_iを得ることができる。このアプローチの１つの問題は、チャネルＪからの全ての信号がチャネル（１、２、３、４）の間で解析されると仮定することである。一般に、これは真実ではない。

１つの実施形態に従って、減法線形モデル（subtractive linear model）を使用してクロストーク係数を適用して、補正したクロストークデータの組を生成する。式（１）の線形減法モデルは、以下の式（６）で示される。
ｆ_1c =ｆ₁ -(a₁₂f₂ + a₁₃f₃ + a₁₄f₄)
ｆ_2c =ｆ₂ -(a₂₁f₁ + a₂₃f₃ + a₂₄f₄)
ｆ_3c =ｆ₃ -(a₃₁f₁ + a₃₂f₂ + a₃₄f₄) （６）
ｆ_4c =ｆ₄ -(a₄₁f₁ + a₄₂f₂ + a₄₃f₃)
ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された蛍光色素信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号であり、係数a_IJは、チャネル（Ｊ）からチャネル（Ｉ）へのクロストーク係数を示す。このモデルは、異なるチャネルの中の基準信号の分析において何も仮定しない。

式（２）の線形減法モデルは、以下の式（７）で示される。
ｆ_1c =ｆ₁ -(a₁₂f₂ + a₁₃f₃ + a₁₄f₄) - (r + S*i)
ｆ_2c =ｆ₂ -(a₂₁f₁ + a₂₃f₃ + a₂₄f₄) - (r + S*i)
ｆ_3c =ｆ₃ -(a₃₁f₁ + a₃₂f₂ + a₃₄f₄) - (r + S*i) （７）
ｆ_4c =ｆ₄ -(a₄₁f₁ + a₄₂f₂ + a₄₃f₃) - (r + S*i)
ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された蛍光色素信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号である。係数a_IJは、チャネル（Ｊ）からチャネル（Ｉ）へのクロストーク係数を示す。式（７）は、全てのチャネルに共通するゲイン及び線形項、ｒ及びｓを使用する。

式（３）の線形減法モデルは、以下の式（８）で示される。
ｆ_1c =ｆ₁ -(a₁₂f₂ + a₁₃f₃ + a₁₄f₄) - (r₁ + S₁*i)
ｆ_2c =ｆ₂ -(a₂₁f₁ + a₂₃f₃ + a₂₄f₄) - (r₂ + S₂*i)
ｆ_3c =ｆ₃ -(a₃₁f₁ + a₃₂f₂ + a₃₄f₄) - (r₃ + S₃*i) （８）
ｆ_4c =ｆ₄ -(a₄₁f₁ + a₄₂f₂ + a₄₃f₃) - (r₄ + S₄*i)
ここでf_iは、チャネル（ｉ）の測定された蛍光色素信号であり、f_icは、チャネル（ｉ）の補正したクロストーク信号である。係数a_IJは、チャネル（Ｊ）からチャネル（Ｉ）へのクロストーク係数を示す。式（８）は、それぞれのチャネルで異なるゲイン及び線形項、ｒ及びｓを使用する。

なお有利には、これらの補正したクロストーク信号の計算もまた、逆行列を必要としない。また、ある態様では、式（６）〜（８）は、最初に基準信号とクロストーク信号との双方からバックグラウンド又はベースラインを除去することによって、修正できる。

〔２つの色素状態におけるクロストークアプリケーションの比較〕
図３に示される色素スペクトルを考える。ここで、スペクトル１０は、色素１（ＦＡＭ）を示し、スペクトル２０は、色素２（ＨＥＸ）を示す。ＦＡＭ色素とＨＥＸ色素とがオーバラップする領域によって示されるクロストークを除去することが要求される。

従来の方法では、上述の式（４）及び（５）を解くことにより、フィルタ１の内部で観察されるＦＡＭの補正されたクロストーク信号、及びフィルタ２の内部で観察されるＨＥＸの補正されたクロストーク信号として、以下の式（９）及び（１０）に示す結果が得られる。

このシステムにおいて式（１）を使用して補正したクロストーク信号は、以下の式（１１）及び（１２）として与えられる。
ｆ_1c =ｆ₁ - a₁₂f₂ （１１）
ｆ_2c =ｆ₂ - a₂₁f₁ （１２）

式（１１）は、式（９）に関連する２つの問題を克服する。すなわち、クロストークを過大に補償する原因であるf₁の乗数(1-a₁₂)は、もはや存在せず、不正確な分母ももはや存在しない。

〔ＨＰＶデータの組における従来の方法と新たな方法との比較〕
ＦＡＭチャネル及びＨＥＸチャネルのみを有するＨＰＶを現在の方法と式（１）〜（３）とを使用してテストする。このデータは、ＦＡＭチャネルに標的を包含し、ＨＥＸチャネルには標的を包含しない。これらの方法は、ＨＥＸチャネルのクロストーク信号に適用され、結果として生じる残差プロットを調べる。理想的には、残差は、傾きがゼロであるゼロ切片の周囲に集中するであろう。

〔ａ）従来の方法を使用する残差プロット〕
図４は、２４個のそれぞれの残差プロットを示す。一方、図５は、端から端までの２４個のプロットを示し、図６は、全ての２４個のプロットの重ね合わせを示す。最適な補正では、残差は、傾き及び切片がセロでありＸ軸の周りに集中することが期待されるであろう。しかしながら、図４では、サイクル１からサイクル６０に残差が実質的に減少し、最適なクロストークが実施されていないことを多くのグラフが示す。

図６（図４の２４個の全てのグラフの重ね合わせ）を観察すると、従来のクロストーク方法を使用するときにサイクル１からサイクル６０にかなり下降する傾向があることが明らかである。

〔ｂ）式（１）〜（３）を使用する残差プロット〕
図７〜９は、式（１）〜（３）のそれぞれの端から端までの残差プロットを示す。同様に図１０〜１２は、式（１）〜（３）の重ね合わせた残差プロットを示す。図６と図１０〜１２とを比較すると、有利には、本発明に係る技術を使用する残差の範囲が従来の方法よりも狭いことは、明らかである。さらに、本発明に係る技術を使用すると、重ね合わせたプロットの傾向線は、目標のゼロにより近い傾き及び切片を有する。この例において、ＦＡＸクロストークとＨＥＭクロストークとは、約２％だった。このため、これらのプロットは、本発明に係る技術のロバスト性を表す、より最適な補正を示す。本発明に係る技術の優位性は、より多くの色素があり且つクロストークが２〜２０％の範囲にある実施例において、より明らかになるであろう。

〔ＨＩＶのデータの組における従来の方法と新たな方法との比較〕
ＦＡＭチャネルに標的を有し、ＨＥＸチャネルには標的を有しないＨＩＶ試験のＰＣＲ実験を、ＦＡＭフィルタについて図１３に示し、ＨＥＸフィルタについて図１４に示す。図１３及び１４のデータを使用すると、ＦＡＭ−＞ＨＥＸクロストーク（a₂₁）のクロストーク係数は、従来の方法と式（１）との双方でa₂₁=0.051と計算される。

図１５、１６、及び１７は、従来の方法、式（１）、及び式（３）をそれぞれ使用するＨＥＸチャネルにおける補正したクロストーク信号を示す。式（１）、及び式（３）のいずれかを使用すると、信号の過剰補正が大幅に減少することが分かる。

本明細書で説明されるクロストーク補正処理を含むクロストーク係数決定処理は、コンピュータシステムのプロセッサで実行されるコンピュータコードで実施できることは、明らかであるはずである。コードは、コンピュータを制御して様々な態様を実施する命令と、その処理のステップとを含む。コードは、ハードディスク、ＲＡＭ、又はＣＤ、ＤＶＤなどのような携帯可能な媒体に記憶される。同様に、処理は、プロセッサに接続されるメモリ部に記憶される命令を実行するプロセッサを有するサーモサイクラなどのＰＣＲ装置において実行できる。このような命令を有するコードは、周知のネットワーク接続又はコードソースへの直接接続、若しくは携帯可能な媒体を使用することによって、ＰＣＲ装置のメモリ部にダウンロードできる。

本発明に係るクロストーク係数の決定処理及びクロストーク補正処理は、Ｃ、Ｃ＋＋、フォートラン、ビジュアルベーシックなどの様々なプログラム言語と同様にMathematica（登録商標）のように、データの視覚化及び分析に有益なプリパッケージ化されたルーティーン、機能、及び手順を提供するアプリケーションを使用してコード化できることは、当業者には明らかなはずである。後者の他の例は、ＭＡＴＬＡＢ（商標）である。

本発明は、特定の実施形態に関して実施例の手段で説明されているが、本発明は、開示された実施形態に限定されないと解すべきである。反対に、当業者には明らかであろうが、様々な変更及び相似の配置の範囲に亘ることが意図される。したがって、添付されたクレームの範囲は、このような変更及び相似の配置を包含するように、最も広範な解釈が認められるべきである。

Claims

特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）光学検出システムのクロストーク係数の決定方法であって、
ＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘りＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得するステップと、
少なくとも２つのフィルタの範囲における少なくとも２つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するステップであって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘って獲得されるステップと、
前記獲得範囲に亘る前記ＰＣＲデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するステップと、
を含み、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘る前記ＰＣＲデータの組と前記クロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含むことを特徴とする決定方法。
前記データ獲得範囲は、複数のＰＣＲサイクルを示し、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含む請求項１に記載の決定方法。
二乗和を最小化するステップは、

の式を使用するステップを含み、ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signal_iは、光学素子の前記ＰＣＲデータの組であり、XTSignal_iは、光学素子の前記クロストークデータの組であり、ｑは、乗法ゲイン因子である請求項１、又は請求項２に記載の決定方法。
二乗和を最小化するステップは、

の式を使用するステップを含み、ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signaliは、光学素子の前記ＰＣＲデータの組であり、XTSignaliは、光学素子の前記クロストークデータの組であり、ｒは、共通のオフセットであり、ｓは、共通の傾きであり、ｑ１、ｑ２、及びｑ３は、乗法ゲイン因子である請求項１、又は請求項２に記載の決定方法。
二乗和を最小化するステップは、

の式を使用するステップを含み、ここでｉは、ＰＣＲサイクル数であり、Signaliは、光学素子の前記ＰＣＲデータの組であり、XTSignaliは、光学素子の前記クロストークデータの組であり、ｒは、オフセットであり、ｓは、傾きであり、ｑは、乗法ゲイン因子である請求項１、又は請求項２に記載の決定方法。
それぞれのＰＣＲデータの組と、それぞれのクロストークデータの組とのベースラインを決定するステップと、
クロストーク係数を決定するステップに先立ち、それぞれのデータの組から前記それぞれのベースラインを除去するステップと、
をさらに含む請求項１に記載の決定方法。
線形除法モデルを使用して前記決定したクロストーク係数をＰＣＲデータの組に適用して、補正したクロストークデータの組を生成するステップをさらに含む請求項１に記載の決定方法。
プロセッサを制御するコードを有して、特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）光学検出システムのクロストーク係数を決定するコンピュータが読み取り可能な媒体であって、前記コードは、
ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含むＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘り獲得するＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために受信手段により受信する命令と、
少なくとも２つのフィルタの範囲における少なくとも２つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるそれぞれのフィルタのクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために受信手段により同時に受信する命令であって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘り獲得される命令と、
前記獲得範囲に亘る前記ＰＣＲデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定手段により決定する命令と、
を含み、クロストーク係数を決定するステップは、前記獲得範囲に亘る前記ＰＣＲデータの組と前記クロストークデータの組との間の二乗和を最小化するステップを含むことを特徴とするコンピュータが読み取り可能な媒体。
キネティック・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システムであって、
特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する光学検出モジュールであって、
ベースライン領域と、成長領域と、プラト領域とを含むＰＣＲ成長処理の獲得範囲に亘るＰＣＲデータの組をそれぞれの光学素子のために獲得し、
少なくとも２つのフィルタの範囲における少なくとも２つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得するように構成される光学検出モジュールであって、前記クロストークデータの組は、前記獲得範囲に亘って獲得される光学検出モジュールと、
前記獲得したＰＣＲデータの組と前記獲得したクロストークデータの組とを処理して、前記獲得範囲に亘る前記ＰＣＲデータの組と前記クロストークデータの組とを使用してクロストーク係数を決定するように構成されるインテリジェンスモジュールと、
を含み、前記インテリジェンスモジュールは、前記獲得範囲に亘るそれぞれのＰＣＲデータの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによって前記クロストーク係数を決定することを特徴とするシステム。
核酸融解分析システムであって、
特定の異なる電磁的な波長帯をそれぞれが分離する操作が可能である少なくとも２つの光学素子を有する光学検出モジュールであって、
温度獲得範囲に亘る融解データの組をそれぞれの光学素子のために獲得し、少なくとも２つのフィルタの範囲における少なくとも２つの色素スペクトルのオーバーラップによって生成され且つ前記温度獲得範囲に亘って獲得されるクロストークデータの組をそれぞれ他の光学素子のために同時に獲得し、
前記獲得範囲に亘るそれぞれの融解データの組とクロストークデータの組との間の二乗和を最小化することによってクロストーク係数を決定する、
ように構成される光学検出モジュールを含むことを特徴とするシステム。