JP5498657B2 - 臨床サンプルからの無傷の生体全体の磁性粒子による捕捉 - Google Patents

Description

本願は、２００４年８月出願の米国特許出願第１０／９０２，８７１号明細書に対する優先権を主張するものである。

本発明は、無傷の小片全体または生体全体をサンプルから抽出し、凝縮し、かつ／または単離するための組成物および方法を対象とする。より詳細には、本発明は、無傷の小片全体または生体全体を、磁気反応性粒子と可逆的に結合させることによってサンプルから抽出し、凝縮し、かつ／または単離するための組成物および方法を対象とする。

以下の議論において、背景提示および導入目的で、いくつかの物質および方法が記載される。本明細書に含有されるものは、従来技術の「認められたもの」として解されるものではない。該当する場合、出願人は、適用可能な法による規定のもとで、本明細書で言及する物質および方法が従来技術を構成するものでないことを表明する権利を明白に留保する。

サンプルからの生物学的成分の単離および／または分離は、多くの診断上および生化学上の手順において必須のタスクである。この目的を実現するための周知の技術には、生物学的材料を溶解して、それに含有される核酸を放出させ、その後、核酸の少なくとも一部を分離することが含まれる。核酸は、いくつかの異なる技術によって分離し、かつ／または取り出すことができる。このような技術の１つは、核酸を可逆的に磁性粒子に結合させることを含む。このような技術は、特許文献１および特許文献２に記載されており、それらの内容全体を参照により本明細書に組み込むものである。しかし、サンプルからの無傷の小片全体または生体全体を、凝縮し、単離し、または取り出すことが望まれる。

米国特許第５，９７３，１３８号明細書 米国特許第６，４３３，１６０号明細書 米国特許第６，６７２，４５８号明細書

本発明は、磁性粒子の表面電荷特性、および／または、小片もしくは生体それ自体の表面電荷特性を改変することによって、無傷の小片全体または生体全体を、磁性粒子に非特異的に結合させる組成物および技術を対象とする。したがって、無傷の小片全体または生体全体は、溶液からこれら小片または生体が沈殿することなく、磁性粒子と非特異的に結合する。

一態様によれば、本発明は、少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体を含有するサンプルを提供すること、そのサンプル、少なくとも１種の磁気反応性粒子、および残部を含む混合物を生成すること、ならびに混合物に約７．０未満のｐＨをもたらすことを含む方法を提供する。混合物に約７．０未満のｐＨをもたらすことによって、少なくとも１種の磁気反応性粒子の表面電荷特性の変化が生じ、それによって少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体が少なくとも１種の磁気反応性粒子と非特異的に結合して、複合体を形成する。

本発明の前述の特徴および他の特徴、態様、ならびに利点は、以下の説明、添付の請求項の範囲、および以下に簡潔に記載される図に示された例示的な実施形態から明らかとなろう。別段の指定がない限り、同様の要素には同一の参照番号が付されることに留意されたい。

ここで本発明の原理を、本発明のいくつかの例示的な実施形態を以下に議論し、前記の図を参照することによってさらに説明する。

本明細書で使用する「無傷の小片全体または生体全体」は、溶解していないまたはその他の形で構成成分に分解されていない小片全体または生体全体の、天然に存在するまたは合成の任意の修飾物を意味する。無傷の小片全体または生体全体には、それらには限定されないが、細胞全体、細菌、ウィルス、寄生生物、および前記の組合せが含まれる。

本明細書で使用する「サンプル」は、それらには限定されないが、血液、血漿、血清、尿、骨髄穿刺液、脳脊髄液、組織、細胞、食物、糞便、唾液、口内分泌物、鼻分泌物、気管支洗浄液、頸部液、およびリンパ液を含めた、任意の生物学的粒子または生体を含有する物質を意味する。場合によっては、サンプルは滅菌したものでもよい。

本明細書で使用する「磁気反応性粒子」は、それに付与される磁気モーメントを有することが可能であり、またはそうでなければ磁場の作用のもとで移動可能な粒子を意味する。

本明細書で使用する「非特異的結合」は、特定の薬剤と選択的に結合するはずの受容体、捕捉剤、またはその他を介しては生ずることのない結合機構を意味する。

本出願人は、磁気反応性粒子が酸性環境にあるとき、それが無傷の小片全体または生体全体と可逆的に結合することを見出した。特定の理論に拘泥するものではないが、本出願人は、酸性環境によって粒子の電気陽性の性質が高められ、それによってその粒子と電気陰性の無傷の小片全体または生体全体との結合が強まると考える。

本発明の好ましい一実施形態によれば、磁気反応性粒子は、好ましくは被覆されず、またはそうでなければ処理されない。したがってこの粒子は、無傷の小片全体または生体全体と非特異的に結合する。本発明で有用な粒子には鉄粒子が含まれ、その鉄は、水性環境への溶解度が低い水酸化第二鉄および四酸化三鉄などの形態の酸化鉄でよい。硫化鉄および塩化鉄などの他の鉄粒子も、本明細書に記載の条件を用いて、核酸を結合し抽出するのに適したものであってもよい。

磁気反応性粒子の形状は、本発明にとって重要ではない。磁気反応性粒子は、例えば、球体、立方体、長円体、カプセル型、錠剤型、特徴のない任意の形状等を含めた様々な形状のものでよく、均一形状でも不均一形状でもよい。粒子の形状を問わず、その最大点での径は、一般に約０．１μｍから約２０μｍの範囲である。一実施形態によれば、磁気反応性粒子は直径約１．０μｍである。

磁気反応性粒子が、無傷の小片または生体全体と効果的かつ可逆的に結合する酸性環境は、様々な手段によって提供することができる。例えば、磁気反応性粒子を酸性溶液に添加することができ、または酸性溶液をその粒子に添加してもよい。あるいは、塩酸、硫酸、酢酸、またはクエン酸などの酸性化剤を添加することによって磁気反応性粒子が存在する溶液または環境を酸性化することもできる。ただし、磁気反応性粒子が存在する環境がｐＨ約７．０未満のものならば、その粒子は無傷の小片全体または生体全体と可逆的に結合する。好ましい一実施形態によれば、結合を促進するために、約４．５〜５．５のｐＨが定められる。

場合によっては、１種または複数の洗浄ステップをこの段階で実施して、望ましくない物質をさらになくすことができる。適切な洗浄剤ならばいずれも使用することができる。例えば、非イオン性洗浄剤または非イオン性洗浄剤／低濃度の酸性溶液を使用することができる。

結合した無傷の小片全体または生体全体は、さらなる操作のために、適切な緩衝液に溶離させることができる。結合した無傷の小片全体または生体全体を有する粒子の環境を加熱し、かつ／またはこのような環境のｐＨを上げることによって、このような溶離を実現することができる。無傷の小片全体または生体全体の磁性反応からの溶離の助けとするために使用できる薬剤には、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、あるいは電気陰性の無傷の小片全体または生体全体が磁気反応性粒子から移動するのに十分な程度までその環境のｐＨを増大する任意の化合物などの塩基性溶液が含まれる。好ましい一実施形態によれば、結合した小片または生体の放出を促進するために、約８．３〜８．４のｐＨが定められる。

次いで、無傷の小片全体または生体全体を抽出し、凝縮し、かつ／または単離することができる。その結果、無傷の小片全体または生体全体を、以下の、培養、ポリメラーゼ連鎖増幅、連鎖置換増幅、逆転写酵素連鎖置換増幅、およびリガーゼ連鎖増幅の１種または複数などのさらなるプロセスにかけることができる。

ここで、本発明の原理に従って実施される例示的プロセスを、図１を参照することによって説明する。

ステップＡでは、サンプル１０を容器１５に配置する。サンプル１０は、無傷の小片全体または生体全体２０を含有する。

次いでステップＢで、サンプル１０、無傷の小片全体または生体全体２０、および磁気反応性粒子３０を含む混合物２５を形成する。この混合物のｐＨは、適切なレベル、好ましくは約７．０未満、より好ましくは約４．５〜５．５にされる。この混合物は、任意の適切な手段によって形成することができる。例えば、磁気反応性粒子３０を酸性溶液に添加することができ、または酸性溶液を粒子３０に添加してもよい。あるいは、塩酸、硫酸、酢酸、またはクエン酸などの酸性化剤を添加することによって、磁気反応性粒子３０が存在する溶液または環境を酸性化することもできる。

前述のように、ｐＨの変化は、少なくとも磁気反応性粒子３０の表面電荷特性の改変を引き起こして、無傷の小片全体または生体全体２０が磁気反応性粒子３０と結合し、それによって複合体を形成する。次いで、磁場が加えられる。ステップＣに示すように、このことは、互いに逆の永久磁石４０または電磁石（図示せず）を、容器１５の外側に接近させることによって実現することができる。磁場の影響下で、結合した無傷の小片全体または生体全体と磁気反応性粒子の複合体は、磁石に向かって引き付けられる。次いで、混合物２５の上清または残部を、容器１５から除去することができる（ステップＤ）。

場合によっては、１種または複数の洗浄ステップ（図示せず）をこの段階で実施して、望ましくない物質をさらになくすことができる。適切な洗浄剤ならばいずれも使用することができる。例えば、非イオン性洗浄剤または非イオン性洗浄剤／低濃度の酸性溶液を使用することができる。

ステップＥは、複合体を溶離して、無傷の小片全体または生体全体２０を、磁気反応性粒子３０から開放することを示すものである。この溶離は、化学薬品、熱エネルギー、またはその２つの組合せなどによる任意の適切な手段によって達成することができる。例えば、ｐＨを適切なレベルに上昇させるために、緩衝液４５を添加することができる。一実施形態によれば、ｐＨは約８．３〜８．４に上げられる。緩衝液は、ＫＯＨを含んでよい。

次いでステップＦでは、磁石４０を再び容器１５の近くに接近させ、今度は磁気反応性粒子３０だけを容器１５の側壁に引き付ける。次いで、無傷の小片全体または生体全体２０を、容器１５から取り出す（ステップＧ）。

ステップＧに続いて、無傷の小片全体または生体全体２０を、以下の、培養、ポリメラーゼ連鎖増幅、連鎖置換増幅、逆転写酵素連鎖置換増幅、およびリガーゼ連鎖増幅の１種または複数などのさらなるプロセスにかけることができる。

例示的プロセスの上記ステップは、手作業で、自動方式で、または手作業および自動ステップの組合せによって実施することができる。自動ステップは、場合によっては自動化されたピペット機能、混合機能、および磁石配置機能を含む自動ロボット装置で実施することができる。自動ロボット装置は、コンピュータ制御することができる。

本発明は、いくつかの異なる状況で使用することができる。例えば、本発明は、その内容全体が参照により本明細書に取り込まれる特許文献３に記載のシステムおよび方法と共に使用することができる。

ここで、本発明の原理を、以下の例示的な非限定的な実施例に則して説明する。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、酸性緩衝液の環境から抽出できたかどうかを判定するために、ある実験を実施した。微生物の緩衝液からの回収は、以下に記載のように調製された培地を検査することによって評価した。

ｐＨが４．８の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１．０ｍｌ量を、２．０ｍｌのマイクロ遠心チューブ内にピペットで入れ、各チューブに、平均粒径が約１．４ミクロンの四酸化三鉄５０ｍｇを入れた。１×１０⁶ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ ２５９２３懸濁液０．０１ｍｌ量を、第１のチューブに添加し、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１７７５懸濁液０．０１ｍｌ量を、第２のチューブに添加した。

上記混合物を入れた各チューブを、Ｎｕｔａｔｏｒミキサーで、室温で３時間回転させて、酸化鉄と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）各微生物との結合を促進した。次いで、ネオジム磁石をチューブの側面に３０秒間配置した。

次いで、上清をピペットでチューブから取り出した。取り出した上清の一部を使用して１０倍希釈液を作成した。非希釈上清および希釈上清の両方を、以下にさらに詳細に説明するように、増殖用プレートに塗布した。

次いで、マイクロチューブ内の酸化鉄／微生物の複合体を、上記の酢酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄した。次いで、その複合体を、酢酸ナトリウム緩衝液１ｍｌで再懸濁した。次いで、懸濁液の一部分を使用して、１０倍希釈液を調製した。非希釈懸濁液および希釈懸濁液の両方を、以下にさらに詳細に説明するように、増殖用プレートに塗布した。

以下の各サンプルそれぞれ０．１ｍｌ量を、３つの異なるＢＢＬＴＭ血液寒天プレート（羊血５％のＴＳＡ ＩＩ）のそれぞれの上にピペットで置き広げた。
（ｉ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）非希釈上清；
（ｉｉ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）希釈上清；
（ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）酸化鉄非希釈懸濁液；
（ｉｖ）黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）酸化鉄希釈懸濁液；
（ｖ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）非希釈上清；
（ｖｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）希釈上清；
（ｖｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酸化鉄非希釈懸濁液；および
（ｖｉｉｉ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酸化鉄希釈懸濁液。

各プレートを、３６℃、周囲空気下で２４時間インキュベートした。全回収物を測定するために、各プレート上のコロニー数を計数し、非希釈サンプルについては１０を乗じ、希釈サンプルについては１００を乗じた。算出したコロニー数を、以下の表ＩおよびＩＩに記録する。

上記の記録されたデータから、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方が、ｐＨ４．８の酢酸ナトリウム緩衝液中、酸化鉄との結合により捕捉されたことが明らかとなる。一方、上清には、ごく少数の微生物しか存在していないと思われる（すなわち、酸化鉄と未結合）。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、蓄尿サンプルから抽出できたかどうかを判定するために、ある実験を実施した。尿からの微生物の回収物を、以下に記載のように調製された培地を調査することによって評価した。

健康な男性および女性ドナーの蓄尿のｐＨを、ｐＨ４．８の０．１Ｍ酢酸緩衝液を用いて、ｐＨ４．８に調節した。ｐＨ調節された尿１．０ｍｌ量を、約１．４ミクロンの平均粒径の四酸化三鉄５０ｍｇを入れた２．０ｍｌマイクロ遠心チューブ内にピペットで入れた。１×１０６ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ ２５９２３懸濁液０．０１ｍｌ量を、チューブに添加した。

上記混合物を入れた各チューブを、Ｎｕｔａｔｏｒミキサーで、室温で２時間回転させて、酸化鉄と微生物黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との結合を促進した。次いで、ネオジム磁石をチューブの側面に３０秒間配置した。

次いで、上清をピペットでチューブから取り出した。非希釈上清を、以下にさらに詳細に説明するように、増殖用プレートに塗布した。

次いで、マイクロチューブ内の酸化鉄／微生物の複合体を、上記の酢酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄した。次いで、その複合体を、０．１５４Ｍ塩酸ナトリウム溶液１ｍｌで再懸濁した。非希釈懸濁液を、以下にさらに詳細に説明するように、増殖用プレートに塗布した。

上記の上清および懸濁液のそれぞれ０．１ｍｌ量を、３つの異なるＢＢＬＴＭ血液寒天プレート（羊血５％のＴＳＡ ＩＩ）のそれぞれの上にピペットで置き、広げた。各プレートを、３６℃、周囲空気下で２４時間インキュベートした。全回収物を測定するために、各プレート上のコロニー数を計数し、１０を乗じた。算出したコロニー数を、以下の表ＩＩＩに記録する。

上記の記録されたデータから、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が、ｐＨ４．８の酢酸ナトリウム緩衝液中、酸化鉄との結合により捕捉されたことが明らかとなる。一方、上清には、懸濁液よりも有意に少ない数の微生物が存在していると思われる（すなわち、酸化鉄と未結合）。

本発明の好ましい実施形態と共に詳細に記載するように、本発明は多くの異なる形態の実施形態によって満たされるが、本開示は本発明の例示的な原理としてみなされるべきであり、本発明を、本明細書に示し説明する特定の実施形態に制限するものではないことが理解されよう。多数の変形形態は、当分野の技術者によって、本発明の精神から逸脱することなく行われ得る。本発明の範囲は、添付の請求項の範囲およびそれらの均等物によって推測されることになる。

当分野の技術者なら誰でも本発明を行いまたは使用することができるように、先に記載の実施形態が提示される。これらの実施形態に対する様々な変更形態も可能であり、本明細書に示される一般的な原理は、他の実施形態に同様に適用することができる。要約は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。というのはその目的は、適切な当局ならびに一般社会が、本発明の一般的性質を迅速に決定することを可能にするためのものだからである。

本発明の原理に従って実施されるプロセスの一実施形態を示す略図である。

Claims (5)

1. （ｉ）少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体を含有するサンプルを容器内に提供するステップ、
   （ｉｉ）前記サンプル、少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子、および残部を含む混合物を生成するステップ、
   （ｉｉｉ）前記混合物に約７．０未満のｐＨをもたらすステップであって、
   前記少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子の表面電荷特性の変化が生じ、それによって、前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体が前記少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子と非特異的に結合し、複合体を形成するステップであって、前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体の非特異的な結合が可逆的な結合であるステップ、
   （ｉｖ）前記複合体に磁場を加えるステップ、
   （ｖ）前記複合体に磁場が加えられる間に、前記混合物の残部を前記容器から除去するステップ、
   （ｖｉ）前記複合体を洗浄するステップ、
   （ｖｉｉ）ｐＨを約８．３〜８．４に上昇させて、前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体を、前記少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子から溶離するステップ、ならびに
   （ｖｉｉｉ）溶離した前記少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子に再び磁場を加え、それによって、前記少なくとも１種の被覆されていない未処理の磁気反応性粒子を、前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体から分離するステップ、
   を含むことを特徴とする方法。
2. さらに、（ｉｘ）前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体を、前記容器から取り出すステップ、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｉｉｉ）で、前記少なくとも１種の無傷の小片全体または生体全体は、沈殿せずに前記少なくとも１種の磁性粒子と結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記粒子は、酸化鉄、水酸化第二鉄、または四酸化三鉄を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. ステップ（ｉｉｉ）は、混合物に約４．５〜５．５のｐＨをもたらすことを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

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