JP5592355B2 - 液滴アクチュエータ装置、システム、および方法 - Google Patents

液滴アクチュエータ装置、システム、および方法 Download PDF

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ジーシャン フア
アレン エクハルト
プラサンナ サワー
ヴィジェイ スリニヴァサン
ヴァムシー パミュラ
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Description

（１．関連出願）
本出願は、２００８年１０月２８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１０８，８８０号、２００８年１１月１８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１１５，６５４号、２００９年２月１８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１５３，５９８号、２００８年５月１３日に出願された「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／０５２，８８５号、２００８年９月２２日に出願された「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／０９８，８６０号、２００９年３月１６日に出願された「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１６０，６０７号、２００８年１０月７日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ ｏｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１０３，３３２号、２００８年１２月３１日に出願された「Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｏｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１４１，８２０号に対する優先権を主張し、これらの出願の各々の全開示は参照として本明細書に援用される。
（２．政府の利益）
本発明は、米国の国立衛生研究所によって与えられたＡＩ０６５１６９−０１およびＡＩ０６６５９０−０２のもとで、政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
ＡＩ０６５１６９−０１のもとの政府の支援に関する上述の声明は、２００８年１０月２８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１０８，８８０号、２００８年１１月１８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１１５，６５４号、２００９年２月１８日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１５３，５９８号に起因する本出願において記載され、特許請求される本発明のこれらの態様のみに適用し、ＡＩ０６６５９０−０２のもとの政府の支援に関する上述の声明は、２００８年１０月７日に出願された「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ ｏｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１０３，３３２号、２００８年１２月３１日に出願された「Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｏｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の米国特許出願第６１／１４１，８２０号に起因する本出願において記載され、特許請求される本発明のこれらの態様のみに適用する。
本発明は、液滴アクチュエータ装置、システム、および方法に関する。
（３．背景）
液滴アクチュエータは、多種多様の液滴操作を実施するために使用される。液滴アクチュエータは、典型的に、液滴操作間隙によって隔てられる２つの基板を備える。基板は、液滴操作を実施するための電極を備える。基板間の液滴操作間隙は、典型的に、液滴操作に供される流体と混ざらない流動性の充填流体で満たされる。液滴操作は、基板の１つまたは両方と結合する電極によって制御される。液滴の成分は、一部の場合において、充填流体中の液滴から出ていくことがある。充填流体からのそのような成分は他の液滴を汚染する場合がある。
本発明は、流動性の充填流体を介して液滴アクチュエータ上のある液滴から別の液滴への汚染の移動を減少または除去するための特定の新規のアプローチに関する。１つの適用において、液滴アクチュエータは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて遺伝子解析を実施するために使用される。標的サンプルの最適な増幅および検出を提供する液滴アクチュエータ上でＰＣＲを実施する改良された方法についての必要性が存在する。
（４ 本発明の詳細な説明）
本発明は、サンプル中の標的核酸を増幅および／または検出する方法を提供する。その方法は、核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程を含んでもよい。各液滴はサンプルの一部を含んでもよい。その方法は、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理して、増幅核酸を有する増幅液滴の対応するサブセットを得る工程を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、１つ以上の増幅反応液滴を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、標的核酸を増幅するための異なる条件下で処理されてもよい。その方法は、検出するための増幅液滴を調製する工程を含んでもよい。その方法は、増幅液滴からシグナルを検出する工程を含んでもよい。その方法はまた、増幅液滴および／またはサンプルに存在する増幅核酸の量および／または識別を決定する工程を含んでもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、サンプル液滴から核酸増幅液滴のセットを分配する工程を含んでもよい。サンプル液滴は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に提供されてもよく、分配は電極により媒介されてもよい。サンプル液滴は、液滴アクチュエータのリザーバーに提供されてもよい。液滴アクチュエータは、リザーバーから液滴操作間隙内への液体経路を備えてもよい。核酸増幅液滴のセットを分配する工程は、液体経路を通して液滴操作間隙内にサンプル液滴を流動させる工程、および液滴操作間隙中に増幅反応液滴を分配するために電極を使用する工程を含んでもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、サンプル液滴を提供する工程と、サンプル液滴を複数のサンプル小液滴に分裂する工程と、各サンプル小液滴と、増幅試薬を含み得る１つ以上の液滴とを混合して、増幅反応液滴を生じる工程とを含んでもよい。本明細書に記載される方法の任意の１つ以上の工程は、電極によって媒介される液滴操作を用いて液滴アクチュエータの液滴操作間隙中で行われてもよい。本明細書に記載される方法の任意の１つ以上の工程は、電極によって媒介される液滴操作を用いて行われてもよい。サンプル液滴、複数の小液滴および１つ以上の液滴は、増幅試薬を含んでもよい。増幅反応液滴は、液滴操作間隙に配置され、少なくとも部分的に流動性の充填流体によって囲まれてもよい。核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程は、以下の工程を含んでもよい：サンプル液滴を提供する工程；サンプル液滴と、増幅試薬を含み得る１つ以上の液滴とを混合して、増幅準備液滴を生じる工程；および増幅準備液滴を分裂して、増幅反応液滴を生じる工程。サンプル液滴、１つ以上の液滴は、増幅試薬、親増幅反応液滴を含んでもよく、増幅反応液滴は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に配置されてもよく、流動性の充填流体に少なくとも部分的に囲まれてもよい。その方法は、標的核酸がサンプル中に存在する場合、各増幅反応液滴が標的核酸を含むことを確実にするために増幅準備液滴中で十分に増幅された核酸を得るために選択される条件下で増幅準備液滴を処理する工程を含んでもよい。増幅準備液滴を処理する工程は、１〜５０サイクル、１〜４０サイクル、１〜３０サイクル、１〜２０サイクル、または１〜１０サイクル、または１〜５サイクルについて増幅準備液滴を熱サイクルすることを含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙中の複数の電極経路に沿って液滴を輸送することによって２つ以上の熱領域の間で増幅反応液滴をサイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内の共通の電極経路に沿って各サブセットにおける液滴を輸送することによって２つ以上の熱領域の間で２つ以上の増幅反応液滴のサブセットをサイクルする工程を含んでもよい。一部の場合において、１つ以上の電極経路は、２つ以上の熱領域の間に１つ以上のループ経路を規定する。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、電極経路ループの周りに複数の増幅反応液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、その所定数のサイクルが完了した場合、各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程を含んでもよい。各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程は、増幅反応液滴を液滴操作間隙の別の領域に輸送するために電極により媒介される液滴操作を含んでもよい。液滴操作間隙の領域は、まだ検出されていない増幅液滴を保存するために選択される温度を有する温度制御領域を備えてもよい。各増幅液滴を電極経路ループから除去する工程は、各増幅液滴を液滴アクチュエータの液滴操作間隙から除去する工程を含んでもよい。他の場合において、電極経路は、２つ以上の熱領域の間で曲がっている。電極経路上の１つの電極から電極経路上の隣接する電極への輸送時間は、隣接する電極の各対に関して実質的に均一であってもよく、熱領域内の滞留時間は、熱領域に存在する電極経路の各曲がり角の電極の数によって規定されてもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、並行して熱領域の間に増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを輸送する工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを熱領域内に連続して輸送する工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅反応液滴の第１のサブセットを第１の熱領域内に輸送するが、増幅反応液滴の第２のサブセットを第２の熱領域内に輸送する工程と、増幅反応試薬液滴の第１のサブセットを第２の熱領域に輸送するが、増幅反応試薬の第２のサブセットを第１の熱領域に輸送する工程を含んでもよい。連続して熱サイクルされた増幅反応液滴のサブセットは、共通の電極経路に沿って熱サイクルされてもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、並行して２つ以上のサブセットを増幅させる工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、全ての増幅反応試薬に関して熱的に同時に熱サイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、全ての増幅反応試薬に関して熱的に同時でなくてもよい熱サイクルする工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの熱サイクル領域を加熱および冷却することによって行われ得ることを含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、１回以上、熱サイクルするサイクル数で熱領域における増幅反応液滴の滞留時間を変化させる工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、増幅液滴からシグナルを検出する前に増幅反応液滴の全てのサブセットに関して完了されてもよい。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は、第２のセットの液滴について標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する前に第１のサブセットの液滴について完了されてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、２つ以上の増幅液滴のセットに対して標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する前に、液滴アクチュエータの熱サイクル範囲から離れた位置、または熱サイクル領域から離れた位置に２つ以上の増幅液滴のセットを輸送する工程を含んでもよい。増幅液滴は、増幅液滴からシグナルを検出するのに適切な温度を有する熱領域に輸送されてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、配置された増幅液滴の各々のそのようなサブセットに対して増幅液滴からシグナルを検出する前に熱サイクル領域から離れた位置に増幅液滴のサブセットを少なくとも配置する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅核酸から未結合の検出試薬を分離する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、１つの液滴アクチュエータから別の液滴アクチュエータに増幅液滴を輸送する工程を含んでもよい。増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程は、増幅反応を実質的に停止するために液滴温度を調節する工程を含んでもよい。増幅液滴における増幅を実質的に停止する工程は、増幅反応を実質的に停止するために試薬を増幅液滴に添加する工程を含んでもよい。試薬を増幅液滴に添加する工程は、増幅液滴と試薬液滴とを混合する工程を含んでもよく、試薬液滴は、増幅反応を実質的に停止するために選択される試薬を含んでもよい。増幅反応を実質的に停止するために選択される試薬は、ポリメラーゼ活性を妨げること、ポリメラーゼ補因子活性を妨げること、核酸に結合すること、および／または鉄イオンを放出することによって増幅反応を実質的に停止する試薬を含んでもよい。特定の実施形態において、増幅反応液滴は検出試薬を欠く。検出するための増幅液滴を調製する工程は、検出試薬を増幅液滴に添加する工程を含んでもよい。検出試薬を増幅液滴に添加する工程は、各々の増幅液滴と検出試薬を含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、各々の増幅液滴と１つ以上の検出試薬を含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、検出試薬によって媒介されるシグナルに基づいて増幅を検出する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、そのような液滴の検出ウィンドウへの輸送後に各々の増幅液滴からシグナルを検出する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴の１つ以上のサブセットのセットを、検出するための検出ウィンドウに輸送する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応試薬の２つ以上のサブセットを処理する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内で達成されてもよく、検出するための増幅液滴を調製する工程および／または増幅液滴からシグナルを検出する工程は、液滴操作間隙の外側で達成されてもよい。従って、検出するための増幅液滴を調製する工程は、検出するための液滴操作間隙の外側に１つ以上の増幅液滴を輸送する工程を含んでもよい。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙の外側のリザーバーで行われてもよい。検出するための増幅液滴を調製する工程は、増幅液滴のサブセットを、少ないサイクル数のサブセットで開始する検出ウィンドウに輸送する工程、および高いサイクル数のサブセットまで処理する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴のアレイを走査する工程を含んでもよい。増幅液滴からシグナルを検出する工程は、増幅液滴のアレイを画像化する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程は、複数のサブセットに関して並行して開始し、検出するための増幅液滴を調製する工程は、連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始し、増幅液滴からシグナルを検出する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始する。一部の場合において、検出するための増幅液滴を調製する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの開始後に開始する。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は連続して開始し、各サブセットは以前のサブセットの完了後に開始する。
一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は、液滴が装置の領域を通って移動する場合、その液滴を追跡し、その液滴からシグナルを測定する画像化装置を用いて達成される。一部の場合において、検出するための増幅液滴を調製する工程は並行して開始し、各サブセットはほぼ同じ時間でプロセスを開始する。一部の場合において、増幅液滴からシグナルを検出する工程は並行して開始し、各サブセットはほぼ同じ時間でプロセスを開始する。その方法は、増幅液滴のサブセットの各々についての熱サイクルエンドポイントにてシグナルの増加または減少を決定することによって増幅液滴に存在する増幅核酸の量を決定する工程を含んでもよい。増幅液滴および／またはサンプルに存在する増幅核酸の量を検出する工程は、サンプル液滴に存在する標的核酸の量を決定するために増幅液滴に存在する増幅核酸の量を使用する工程を含んでもよい。増幅液滴および／またはサンプルに存在する増幅核酸の量を決定する工程は、サンプル液滴に存在する標的核酸の量を決定するために異なる数の熱サイクルの後に増幅液滴に存在する増幅核酸の量を使用する工程を含んでもよい。標的核酸を増幅するための異なる条件は、増幅反応液滴の各サブセットについての異なる数の熱サイクルを含んでもよい。増幅反応液滴は検出試薬を含んでもよい。他の場合において、増幅反応液滴は有意な量の検出試薬を含まなくてもよい。増幅試薬を含む１つ以上の液滴はさらに、検出試薬を含んでもよい。他の場合において、増幅試薬を含む１つ以上の液滴は、有意な量の検出試薬を含まなくてもよい。検出試薬は核酸結合剤を含んでもよい。一部の場合において、核酸結合剤は核酸増幅の割合を有意に阻害できる。核酸結合剤は挿入剤を含んでもよい。挿入剤は蛍光色素を含んでもよい。標的核酸は、遺伝性疾患または感染病の指標であってもよい。標的核酸は、生物学的集団由来の個体または個体のサブグループの同定の指標であってもよい。一部の実施形態において、核酸増幅反応液滴の１つ以上は、標的核酸を増幅するための条件下で、増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを処理する工程、および増幅液滴に存在する増幅核酸の量を決定する工程の前に、初期検出工程に供されてもよく、ならびに／あるいはサンプルは、初期検出工程において検出されるシグナルと、増幅液滴から検出されるシグナルとの間の比較物を含んでもよい。サンプル中の標的核酸を検出する方法は、十分なデータが所定の範囲の統計的確実性内で開始サンプルに存在する標的核酸を定量化するために収集された場合、方法を停止する工程を含んでもよい。その方法は、選択されるサイクル数の各々についての増幅液滴および／またはサンプルに存在する増幅核酸の量を決定するための十分なデータを提供するために予想される第１のセットのサイクル数を選択する工程、１つ以上の増幅反応液滴のサブセットを増幅させる工程に供する工程、調製する工程、検出する工程、および決定する工程、ならびに十分なデータが、所定の範囲の統計的確実性内でサンプルに存在する核酸を同定または定量化するために収集されているかどうかを決定する工程を含んでもよい。十分なデータが、所定の範囲の統計的確実性内で開始サンプルに存在する標的核酸を同定または定量化するために収集されるまで、あるいは十分なデータが、標的核酸がサンプルに存在しない所定の範囲の統計的確実性内で決定するために収集されるまで、工程は新しいセットのサイクル数で繰り返されてもよい。十分なデータが収集されるかどうかを決定する工程は、十分なデータが、所定の範囲の統計的確実性内でサンプルに存在する標的核酸を同定するために収集されるかどうかを決定する工程を含んでもよい。十分なデータが収集されるかどうかを決定する工程は、十分なデータが、所定の範囲の統計的確実性内でサンプルに存在する標的核酸を定量化するために収集されるかどうかを決定する工程を含む。
本発明はサンプル中の標的核酸の増加をモニターする方法を提供する。その方法は、核酸増幅反応液滴のセットを提供する工程を含んでもよく、各液滴はサンプルの一部を含む。その方法は、増幅された二本鎖核酸を有する増幅液滴を得るために標的核酸を増幅するための条件下で増幅反応液滴の２つ以上のサブセットを熱サイクルする工程を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、１つ以上の増幅反応液滴を含んでもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、異なる数のサイクルについて熱サイクルされてもよい。増幅反応液滴の各サブセットは、各サブセットについての所定数のサイクルの完了前に検出に供されなくてもよい。その方法は、検出準備プロトコルを実行する工程を含んでもよく、その検出準備プロトコルは、増幅液滴の各々と、増幅核酸の検出用の検出試薬とを混合して、検出準備液滴を生じる工程を含んでもよい。その方法は、検出準備液滴からシグナルを検出する工程を含んでもよい。その方法は、増幅液滴および／またはサンプルに存在する増幅核酸のシグナル、存在および／または量に基づいて決定する工程を含んでもよい。
本発明は、予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジを提供する。予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、液滴操作間隙を形成する１つ以上の基板、およびその１つ以上の基板に結合され、かつ液滴操作間隙内で液滴操作を媒介するように配置される電極を含んでもよい。予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、増幅試薬を含み、検出試薬を欠く１つ以上の液滴を含む第１のリザーバー、および１つ以上の検出試薬を含む第２のリザーバーを含んでもよい。予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、液滴操作間隙を有する第１のリザーバーおよび第２のリザーバーに流動的に接続される１つ以上の流体経路を含んでもよい。例えば、予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、液滴操作間隙を有する第１のリザーバーに流動的に接続される流体経路を備えてもよい。同様に、予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、液滴操作間隙を有する第２のリザーバーに流動的に接続される流体経路を備えてもよい。予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジは、サンプルを液滴操作間隙に負荷するための手段を備えてもよい。サンプルを液滴操作間隙に負荷するための手段は、例えば、サンプル負荷リザーバーおよび液滴操作間隙を有するサンプル負荷リザーバーに流動的に接続される流体経路を含んでもよい。本発明は、予め組み込まれている液滴アクチュエータカートリッジを含むキットを提供する。キットはまた、カートリッジを用いて増幅プロトコルを実行するためのソフトウェアを含んでもよい。本発明の物理的実施形態のいずれかは、物理的実施形態を含むそのようなキットおよび物理的実施形態を制御するためのソフトウェア含んでもよい。
本発明は検体を検出する方法を提供する。その方法は、検出ウィンドウ内に液滴を提供する工程を含んでもよい。液滴は、検体の存在および／または量の指標であるシグナル生成物質を含んでもよい。液滴は、シグナル生成物質によって生成されたシグナルを妨げることができる１つ以上の磁性反応ビーズを含んでもよい。その方法は、検出ウィンドウ内の液滴を輸送および／または抑制している間、検出ウィンドウから磁性反応ビーズを磁性的に除去するため、および／または磁性反応ビーズが検出ウィンドウに侵入することを磁性的に抑制するための磁場を使用する工程を含んでもよい。その方法は、磁性反応ビーズから実質的に妨げられないシグナル生成物質によって生成されるシグナルを検出する工程を含んでもよい。同様に、本発明は、検出ウィンドウに液滴を提供する工程を含む検体を検出する方法を提供し、ここで、液滴は、検体および／または実質的に磁性反応ではなく、シグナル生成物質によって生成されたシグナルを妨げることができる１つ以上のビーズの存在および／または量の指標であるシグナル生成物質を含む。その方法は、検出ウィンドウ内に液滴を輸送および／または保有している間、ビーズが検出ウィンドウに侵入することを防ぐ物理的障壁を使用する工程を含んでもよい。その方法は、ビーズから実質的に妨げられないシグナル生成物質によって生成されたシグナルを検出する工程を含んでもよい。この物理的障壁アプローチは、ビーズが磁性反応であるか否かに関わらず、使用されてもよいことは理解されるだろう。検体を検出するこれらの方法において、液滴は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内に提供されてもよい。検出ウィンドウは、液滴アクチュエータの基板内に開口部またはウィンドウを備えてもよい。実質的に非磁性反応ビーズを利用する実施形態に関して、磁場を使用する工程は、検出ウィンドウに近接する固定磁石を提供する工程を含んでもよい。検出ウィンドウ内に液滴を輸送する工程は、磁性反応ビーズを、ビーズが検出ウィンドウから離れた位置へ引き付けられ得るか、および／またはビーズが検出ウィンドウに侵入することを抑制され得る、固定磁石に十分に近接する位置に送達できる。物理的障壁を利用する実施形態に関して、液滴を検出ウィンドウに輸送する工程は、ビーズが物理的障壁によって検出ウィンドウ内に侵入することを抑制している間に達成されてもよい。このビーズが検出ウィンドウに侵入することを抑制することは、液滴から磁性反応ビーズを除去して、または除去せずに達成されてもよい。磁場を利用する本発明のこれらおよび任意の他の実施形態において、磁場は、任意の適切な磁場源によって生成されてもよい。例えば、磁場源は、固定永久磁石、移動可能な永久磁石、および／または電磁石を備えてもよい。磁場は、液滴の端部に磁性反応ビーズを凝集させるために配置されてもよい。磁場は、検出ウィンドウの外側であり得る液滴の領域内に磁性反応ビーズを凝集させるために配置されてもよい。一部の場合において、磁場は、液滴から離れた位置に磁性反応ビーズを分裂させるために選択される。例えば、磁場は、液滴が所定の位置に保持され得る間、および／または電極により媒介される力によって移動され得る間、磁性反応ビーズを液滴から離れた位置に分裂させることができる。一部の場合において、液滴が検出ウィンドウ内に少なくとも部分的に存在し得る場合、磁場は、磁性反応ビーズを液滴の端部に引き付ける方法で磁性反応ビーズを引き付ける。一部の場合において、液滴が磁石上を通過する場合、磁場は液滴の外側に磁性反応ビーズを引き付ける。一部の場合において、液滴が磁石の近くに近づく場合、磁場は液滴の外側に磁性反応ビーズを引き付ける。一部の場合において、液滴が検出ウィンドウに近づく場合、磁場は液滴の外側に磁性反応ビーズを引き付ける。一部の場合において、液滴が検出ウィンドウ内に輸送され得る場合、磁場は、実質的に全てのビーズが検出ウィンドウに侵入するか、または再侵入することを抑制する方法で磁性反応ビーズを引き付ける。検出ウィンドウは、液滴アクチュエータ装置の表面に設けられてもよい。液滴アクチュエータは、例えば、液滴操作表面に結合される電極の複数の経路、検出ウィンドウに結合される各々の経路、ならびに検出ウィンドウ内に液滴を輸送および／または保有している間、対応する検出ウィンドウから磁性反応ビーズを磁性的に除去するように、および／または磁性反応ビーズが対応する検出ウィンドウに侵入することを磁性的に抑制するように配置される経路に近接する磁場を備える。液滴は、１つ以上の検体の存在、非存在および／または量の指標であるシグナルを放出できる。例えば、１つ以上の検体は増幅核酸を含んでもよい。検出ウィンドウは液滴アクチュエータの表面に配置されてもよく、液滴アクチュエータは、熱サイクル反応を実施するための電極の経路に沿った温度制御ゾーンを備えてもよい。そのような液滴アクチュエータを使用する方法は、増幅液滴を得るために増幅準備液滴を熱サイクルする工程、および増幅液滴を検出ウィンドウに輸送する工程を含んでもよい。その方法は、１以上の熱サイクルの後、電極の経路から少なくとも部分的に電極の経路に沿って磁性反応ビーズを含み得る液滴を、検出ウィンドウ内に輸送する工程を含んでもよい。
本発明はまた、液滴を熱サイクルする方法を提供する。その方法は、充填流体によって少なくとも部分的に囲まれた液滴を提供する工程を含んでもよい。液滴は、潜在的に標的核酸を含んでもよい。液滴は、標的核酸の存在下で増幅を生じるのに十分な試薬を含んでもよく、試薬は、熱サイクルプロトコルを実施している間、充填流体中で有意に分離しないフルオロフォアを含んでもよい。その方法は、標的核酸の存在下で増幅を誘導するために熱サイクルプロトコルに従って液滴の温度を調節する工程を含んでもよい。フルオロフォアは極性フルオロフォアを含んでもよい。フルオロフォアは細胞膜に実質的に不浸透性であってもよい。フルオロフォアは細胞膜に完全に不浸透性であってもよい。フルオロフォアはＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）フルオロフォアを含んでもよい。フルオロフォアはＴＯ−ＰＲＯ１フルオロフォアを含んでもよい。充填流体は、本質的にシリコーンオイルから構成されてもよく、必要に応じて１つ以上の添加剤でドープされてもよい。充填流体は、１０〜２０の炭素オイルから構成されてもよく、必要に応じて１つ以上の添加剤でドープされてもよい。充填流体は、１５〜２０の炭素オイルから本質的に構成されてもよく、必要に応じて１つ以上の添加剤でドープされてもよい。充填流体は、ヘキサデカンオイルから本質的に構成されてもよく、必要に応じて１つ以上の添加剤でドープされてもよい。充填流体は、実質的な脱気水から本質的に構成されてもよく、必要に応じて１つ以上の添加剤でドープされてもよい。液滴を提供する工程は、液滴を液滴アクチュエータの液滴操作間隙に提供する工程を含んでもよい。熱サイクルプロトコルに従って液滴の温度を調節する工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙の液滴を加熱および／または冷却する工程を含んでもよい。熱サイクルプロトコルに従って液滴の温度を調節する工程は、電極により媒介される液滴操作を用いて液滴操作間隙内の熱領域の間に液滴を輸送する工程を含んでもよい。
本発明は、液滴アクチュエータでプロトコルを実行する方法を含む。その方法は、不動態化剤を含み得る液滴を有する領域内で１つ以上の電極で液滴操作を実施することによって液滴アクチュエータの１つ以上の領域を処理する工程、および液滴アクチュエータの１つ以上の処理された領域を用いてプロトコルを実施する工程を含む。そのプロトコルは、標的核酸の解析における工程を含んでもよく、不動態化剤は標的核酸でなくてもよい核酸を含んでもよい。そのプロトコルは核酸増幅プロトコルを含んでもよい。そのプロトコルは熱サイクルプロトコルを含んでもよい。少し例を挙げると、不動態化剤は、核酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、界面活性剤、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）、アルブミン、血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、および／または色素を含んでもよい。不動態化剤は、液滴アクチュエータの表面上に吸着するように選択されてもよい。不動態化剤は、充填流体内に吸着するように選択されてもよい。１つ以上の液滴は、十分な不動態化剤を実質的に飽和する可能性のある不動態化部位に送達してもよい。そのプロトコルは、不動態化剤を含む液滴を用いて実施されてもよい。一例として、そのプロトコルは、核酸増幅プロトコルを含んでもよい。核酸増幅プロトコルおよび処理する工程は、核酸増幅試薬および不動態化剤を含む液滴を用いて同時に実施されてもよい。
本発明はまた、高温で液滴操作を実施するための液滴アクチュエータを提供する。液滴アクチュエータは、液滴操作基板および液滴操作表面とカバーとの間に液滴操作間隙を形成するために液滴操作表面に隣接し、液滴操作表面から離れているカバーを備えてもよく、液滴操作間隙は少なくとも２５０μｍの高さを有する。液滴アクチュエータは、液滴操作基板および／またはカバーに結合され、熱サイクルプロトコルに従って熱領域の間に液滴を輸送するように配置される電極の経路を備えてもよい。液滴アクチュエータは、液滴操作間隙内の１つ以上の熱領域を規定するように配置される温度制御素子を備えてもよい。一部の場合において、液滴操作間隙は、実質的に球状の形状の単一のサイズの液滴を与えるように選択される高さを有してもよい。例えば、特定の実施形態において、約２５０μｍ〜約５００μｍ、または約２７５μｍ〜約４５０μｍ、または約３００μｍ〜約４００μｍ、または約３２０μｍ〜約３７５μｍ、または約３２０μｍ〜約３５０μｍの範囲の高さを有してもよい。特定の実施形態において、電極はピッチを有してもよく、液滴操作間隙は、約７：１〜約２．８：１、または約６：１〜約３：１、または約４．３：１〜約３．４：１の範囲の比のピッチ：高さを規定する高さを有してもよい。特定の実施形態において、液滴操作間隙は、熱サイクルプロトコルを受ける液滴から完全な熱サイクルプロトコルについて５％未満、または完全な熱サイクルプロトコルについて１％未満、または完全な熱サイクルプロトコルについて０．０１％未満の容積減少を維持するように選択される高さを有する。特定の実施形態において、液滴操作間隙は、熱サイクルプロトコルを受ける液滴から１回の熱サイクルにつき０．１％未満、または１回の熱サイクルにつき０．０１％未満、または１回の熱サイクルにつき０．００１％未満の容積減少を維持するように選択される高さを有する。一部の場合において、液滴操作間隙は、熱サイクルプロトコルの間、実質的に容積減少を排除するように選択される高さを有する。本発明はまた、熱サイクル反応を実施する方法を提供し、その方法は、本発明のこの態様の液滴アクチュエータを提供する工程、電極の経路に沿って、磁性反応ビーズを含み得る液滴を、検出ウィンドウ内の少なくとも部分的に電極の経路に輸送する工程であって、その結果、磁石が、１つ以上のビーズが検出ウィンドウに侵入することを抑制する方法で磁性反応ビーズを引き付ける、工程、および液滴からのシグナルを検出するためにセンサーを使用する工程を含んでもよい。
本発明は、解析用のサンプルを調製する方法を提供する。その方法は、液滴操作基板、基板の液滴操作表面上で液滴操作を実施するように配置される電極、液滴操作表面に隣接し、液滴操作表面とカバーとの間に液滴操作間隙を形成するために液滴操作表面から離れているカバー、上部基板に結合され、１つ以上の標的検体および／または１つ以上の標的検体を含み得る物質に対する親和性を有するビーズを含み得るリザーバー、リザーバーから液滴操作間隙内に延びる液体経路、液滴操作基板に結合され、磁性反応ビーズを引き付けるのに十分な磁場を生じるように構成される磁場源を備える液滴アクチュエータを提供する工程を含んでもよい。その方法は、サンプルをリザーバーに供給する工程を含んでもよい。サンプルは１つ以上の標的物質を含んでもよい。その方法は、液滴経路を通して液滴操作間隙に磁性反応ビーズとともにサンプルを流動させる工程を含んでもよい。その方法は、磁石で磁性反応ビーズを凝集させる工程を含んでもよい。その方法は、磁性反応ビーズを有する液滴操作間隙内のサンプル液滴を得るために、磁場を除去する工程または磁場からビーズを除去する工程を含んでもよい。一部の場合において、液体経路は、（より湾曲した液体経路とは対照的に）基板における穴または開口部などの実質的に真っ直ぐな液体経路であってもよい。磁石は、リザーバーから液滴操作間隙内に１つ以上のビーズを引き付けるのに十分な磁場の強さを有してもよい。液滴アクチュエータは、液滴操作基板に結合され、液体経路を介して液滴操作間隙に侵入する流体を受容するように配置されるリザーバー電極を備えてもよい。磁石は液体経路に対してリザーバー電極の反対側に配置されてもよい。磁石は、電磁石または永久磁石などの適切な磁場を生成するための任意の要素または要素の組み合わせであってもよい。磁石は空間的に調節可能である。磁石は、第１の位置において液滴操作間隙内の永久磁石の磁場をブロックまたは妨げることができるか、あるいは第２の位置において液滴操作間隙内の永久磁石の磁場をブロックまたは妨げることができない可動式磁気シールドに結合されてもよい。液滴アクチュエータは、リザーバー内のサンプル流体を撹拌するように配置される撹拌器を備えてもよく、その方法は、リザーバー内のサンプルを撹拌する工程を含んでもよい。液滴アクチュエータは、音波エネルギーをリザーバー内のサンプル流体に与えるように配置される超音波処理器を備えてもよく、その方法は、リザーバー内のサンプルを超音波処理する工程を含んでもよい。液滴アクチュエータはまた、１つ以上の電極に結合される第２の磁石を備えてもよい。物質は、ビーズが親和性を有する１つ以上の標的検体を含んでもよい。一実施形態において、標的検体は細胞を含み、その方法は、細胞を溶解または分解する工程を含む。例えば、細胞を溶解する工程は、溶解試薬を、細胞を含む液滴に加えることによって達成されてもよい。一例として、溶解試薬を加える工程は、磁性反応ビーズを含む液滴操作間隙内のサンプル液滴と、細胞溶解試薬を含む溶解液滴とを混合する工程を含む。混合した液滴は超音波処理されてもよいか、あるいは混合するために攪拌または振盪されてもよい。その方法は、一部の場合、磁性反応ビーズを固定するために磁場を再印加する工程を含んでもよい。その方法は、固定された磁性反応ビーズから離れた位置に液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、磁性反応ビーズから離れた位置に液滴の一部を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、離れた位置に輸送された液滴または液滴の一部と、１つ以上の標的検体に対する親和性を有するビーズを含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。その方法は、１つ以上の標的検体に対する親和性を有するビーズを洗浄するための洗浄プロトコルを実施する工程であって、実質的に精製された標的検体を含むビーズを有する液滴を生じる工程を含んでもよい。その方法は、実質的に精製された標的検体を含むビーズを有する液滴を用いて解析プロトコルを実施する工程を含んでもよい。解析プロトコルの工程は、液滴操作間隙内または液滴操作間隙外で達成されてもよい。解析プロトコルの工程は、液滴アクチュエータ上、別の液滴アクチュエータ上、または液滴アクチュエータを使用せずに達成されてもよい。例えば、ビーズおよび実質的に精製された標的検体を含む液滴は、解析プロトコルを実施する前に液滴操作間隙から除去されてもよい。その方法は、液滴操作間隙間から実質的に精製された標的検体を有するビーズを除去する工程を含んでもよい。その方法は、ビーズから１つ以上の標的検体を溶出する工程を含んでもよい。溶出する工程は、実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む液滴と、溶出バッファーを含む液滴とを混合する工程であって、ビーズを含む液滴および溶出された１つ以上の標的検体を生じる工程を含んでもよい。その方法は、実質的に精製された標的検体を含み、かつ実質的にビーズを含まない液滴を得るために、ビーズおよび溶出された１つ以上の標的検体を含む液滴からビーズを除去する工程を含んでもよい。除去する工程は、例えば、磁場および／または物理的障壁を用いて行われてもよい。その方法は、実質的に精製された標的検体を含み、かつ実質的にビーズを含まない液滴を、液滴操作間隙から除去する工程を含んでもよい。その方法は、実質的に精製された標的検体を含み、かつ実質的にビーズを含まない液滴を用いて解析プロトコルを実施する工程を含んでもよい。そのプロトコルは、液滴操作間隙内または外において、液滴アクチュエータ上で、または液滴アクチュエータ外で行われてもよい。本明細書に記載されるアッセイプロトコルのいずれかは、解析プロトコルの結果のアウトプット指標を提供する工程を含んでもよい。その方法の工程の１つ以上は、その方法の工程の１つ以上を実行するようにプログラムされた液滴アクチュエータおよびプロセッサを含むシステムによって実行されてもよい。その方法は、解析プロトコルの結果のユーザーが判読可能なアウトプット指標をアウトプットする工程を含んでもよい。標的検体は、核酸、タンパク質またはペプチド、抗体、小有機分子などを含んでもよい。液滴操作間隙は流動性の充填流体で満たされてもよい。
本発明は液滴アクチュエータを操作する方法を提供する。本発明は、内部液滴操作間隙を形成するように構成される１つ以上の基板を備える液滴アクチュエータ装置を提供する工程を含んでもよい。その方法は、液滴操作間隙内に流動性の充填流体を提供する工程を含んでもよい。その方法は、液滴操作間隙内の充填流体中で液滴プロトコルを実行する工程を含んでもよい。その方法は、液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程を含んでもよい。一旦、充填流体が置き換えられると、その方法は、液滴操作間隙内の充填流体中で別の液滴プロトコルを実行する工程を含んでもよい。本発明は、共通の液滴アクチュエータ上で、液滴プロトコル実行の間に充填流体の交換が実施される複数の液滴プロトコルを提供する。従って、例えば、本発明は、充填−実行−再充填パターンの使用を含んでもよく、実行−再充填は、数回、例えば２、５、１０、２０、５０、１００またはそれ以上繰り返される。同様に、本発明は、充填−実行−実行−再充填パターンの使用を含んでもよく、実行−実行−再充填は、数回、例えば２、５、１０、２０、５０、１００またはそれ以上繰り返される。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙を通して充填流体をフラッシングする工程を含んでもよい。液滴操作間隙を通して充填流体をフラッシング工程は、所定量のフラッシングが達成するまで続けてもよい。液滴操作間隙を通して充填流体をフラッシングする工程は、洗浄の指標（例えば除去された充填流体中で測定される汚染）が所定のレベルに到達するまで続けてもよい。フラッシングの量は自動化されてもよい。液滴プロトコルは、例えば、標的検体の存在および／または量を測定するためのプロトコルを含んでもよい。例えば、プロトコルは診断的プロトコルであってもよい。少しの例を挙げると、液滴プロトコルは、核酸増幅プロトコル、核酸シークエンシングプロトコル、免疫学的検定プロトコル、および／または酵素アッセイプロトコルであってもよい。一部の実施形態において、流動性の充填流体は、充填流体を置き換える間、汚染について試験されてもよく、別のプロトコルの実行が、所定のレベルの汚染の減少が達成された後に行われてもよい。このプロセスは自動化されてもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙を通して、および液滴操作間隙の外側に、流動性の充填流体源から流動性の充填流体を流動させる工程を含んでもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内の充填流体を置き換える前に、液滴操作間隙を通して洗浄流体を流動させる工程を含んでもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内の充填流体を交換する前に、液滴操作間隙を通して充填流体を流動させる工程を含んでもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内の充填流体を置き換える前に、液滴操作間隙を通して加熱された洗浄液体を流動させる工程を含んでもよい。加熱された洗浄液体は、汚染物質を分解するように選択される温度を有してもよい。例えば、種々の実施形態において、温度は、約３０℃〜約１２５℃、または約６０℃〜約１１５℃、または約７５℃〜約１０５℃、または約９０℃以上、または約１００℃以上、または約１２５℃以上、または約１５０℃以上の範囲である。温度は、典型的に、液滴アクチュエータの１つ以上の構成要素が過度な損傷、すなわち、液滴アクチュエータ装置にその意図される使用に対する損傷を受ける温度未満である。充填流体などの冷却液体は、加熱された洗浄後に、適切または操作可能な温度を設定するために液滴アクチュエータ間隙を通して流されてもよい。加熱された洗浄液体は、例えば、充填流体、オイル、溶媒、および／または水性洗浄液体を含んでもよい。洗浄液体は、親油性物質が可溶性であり得る成分および親水性物質が可溶性であり得る成分を含んでもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内の充填流体を置き換える前に、液滴アクチュエータ間隙を乾燥させるために、液滴アクチュエータ間隙を通してガスを流動させる工程を含んでもよい。ガスは空気または別のガスであってもよい。ガスは、洗浄液体の温度と比較して、加熱または冷却されてもよい。ガスは、例えば、約５０℃以上、約７５℃以上、約１００℃以上、約１２５℃以上、または約１５０℃以上の温度を有してもよい。温度は、典型的に、液滴アクチュエータの１つ以上の構成要素が過度な損傷、すなわち、液滴アクチュエータ装置にその意図される使用に対する損傷を受ける温度未満である。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴アクチュエータ間隙を通してガスを流動させる工程の前に、液滴アクチュエータ間隙を通して洗浄液体を流動させる工程を含んでもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内に存在する少なくとも約５０％の充填流体、または液滴操作間隙内に存在する少なくとも約７５％の充填流体、または液滴操作間隙に存在する少なくとも約９０％の充填流体、または液滴操作間隙に存在する少なくとも約９５％の充填流体、または液滴操作間隙に存在する少なくとも約９９％の充填流体、または液滴操作間隙に存在する少なくとも約９９．９％の充填流体、または液滴操作間隙に存在する実質的に全ての充填流体を置き換える工程を含んでもよい。液滴操作間隙の１つ以上の表面はコーティングを含んでもよく、洗浄液体はコーティングの層を除去するために選択されてもよい。液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程は、液滴操作間隙内の充填流体を置き換える工程の前に所定の温度を設定するために、液滴操作間隙を通して冷却液体を流動させる工程を含んでもよい。洗浄流体は溶媒を含んでもよい。洗浄流体は水溶液を含んでもよい。洗浄流体は、新油性化合物を溶解する１つ以上の成分および親水性化合物を溶解する１つ以上の成分を含んでもよい。本発明は、本発明の充填流体を置き換える方法を実行するための命令を有するプログラムを有するコンピューターにより読取可能な媒体を提供する。本発明は、内部液滴操作間隙を形成するように構成される１つ以上の基板、流動性の充填流体源に流動的に接続される液滴操作間隙内の開口部、その開口部を通して、液滴操作間隙内に充填流体源から充填流体の流れを制御するように構成される１つ以上の弁および／またはポンプ、ならびに本発明の充填流体の交換および／または洗浄のいずれかを実行するようにプログラムされる１つ以上のポンプおよび／または弁を制御するプロセッサを備える液滴アクチュエータ装置を有するシステムを提供する。
本発明は、液滴操作間隙を形成する１つ以上の基板を備える液滴アクチュエータを提供する。液滴操作間隙は、液体経路によって流動的に結合される少なくとも２つの温度制御リザーバーを規定する熱サイクル経路および１つ以上の障壁、ならびに１つまたは両方の基板に結合され、温度制御リザーバーの間に液滴を輸送するように構成される電極を備えてもよい。液滴アクチュエータは２つ以上のこのような熱サイクル経路を備えてもよい。
本発明は、液滴アクチュエータ上での液滴間の二次汚染を阻害する方法を提供する。その方法は、液滴操作間隙を形成する１つ以上の基板、複数の実質的に平行な液滴輸送経路を規定する１つ以上の基板に結合される電極、および液滴操作間隙を実質的に充填する流動性の充填流体を有する液滴アクチュエータを提供する工程を含んでもよい。その方法は、第１のサブセットの複数の実質的に平行な液滴輸送経路上に複数のアッセイ液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、第２のサブセットの複数の実質的に平行な液滴輸送経路上に１つ以上のバッファー液滴を輸送する工程を含んでもよく、その第２のサブセットの各々の液滴輸送経路は、第１のサブセットの２つの液滴輸送経路の間に存在してもよい。アッセイ液滴を輸送する工程および液滴を洗浄する工程は同時に行われてもよい。２つ以上の洗浄液滴は、第２のサブセットの各々の液滴輸送経路上に提供／輸送されてもよい。洗浄液滴は、液滴または液滴スラグ（細長い液滴）の形態で提供されてもよい。その方法は、第１のサブセットの液滴輸送経路上に１つ以上のバッファー液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、第１のサブセットの液滴輸送経路上に１つ以上のバッファー液滴を輸送する工程を含んでもよい。その方法は、第１の洗浄液滴に対してアッセイ液滴の反対側の第１のサブセットの液滴輸送経路上に１つ以上のバッファー液滴を輸送する工程を含んでもよい。アッセイ液滴は核酸増幅液滴を含んでもよい。その方法は、増幅を行うために２つの熱領域の間にアッセイ液滴を輸送する工程を含んでもよい。
本発明はまた、液滴操作間隙を設けるように配置される１つ以上の基板、複数の実質的に平行な液滴輸送経路を規定する１つ以上の基板に結合される電極、液滴操作間隙を実質的に充填する流動性の充填流体、ならびに液滴輸送経路の各々の間にあり、１つの液滴操作経路と結合される充填流体が、他の液滴操作経路と結合される充填流体と接触することを防ぐ障壁を有する液滴アクチュエータを提供する。液滴アクチュエータは、２つ以上の液滴輸送経路上にアッセイ液滴を含んでもよい。アッセイ液滴は、核酸を増幅するための試薬およびサンプルを含んでもよい。
本発明は、液滴アクチュエータ上の液滴間の二次汚染を減少させる方法を提供する。その方法は、内部液滴操作間隙および液滴操作間隙内のオイルベースの充填流体を含み得る液滴アクチュエータを提供する工程、ならびに液滴操作間隙内に水性液滴を提供する工程を含んでもよい。液滴は、オイルベースの充填流体によって少なくとも部分的に囲まれてもよい。液滴は界面活性剤−酵素複合体を含んでもよく、その複合体は、潜在的な汚染物質を分解するように選択される酵素に結合された界面活性剤を含んでもよい。適切な酵素のいくつかの非限定的な例としては、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、および／またはプロテイナーゼが挙げられる。界面活性剤に関して、任意の適切な界面活性剤が使用されてもよい。例としては、ポリエチレン（ＰＥＧ）−アルキル界面活性剤などのポリアルカレン（ＰＡＧ）−アルキル界面活性剤が挙げられる。界面活性剤−酵素複合体は、酵素−ＰＡＧ−アルキル複合体を含んでもよい。界面活性剤は、例えば、酵素のアミノ部分に結合されてもよい。界面活性剤−酵素複合体は、液滴内で実質的に不活性であるように十分に低く、液滴から形成され得る、微小液滴、マイクロ液滴またはナノ液滴内で活性であるように十分に高い量で液滴に存在してもよい。一部の場合において、その量は、約１０μＬ未満、または約１μＬ未満、または約０．０１μＬ未満、または約０．００１μＬ未満であり得る平均容積を有する微小液滴内で活性であるように選択される。一部の場合において、平均液滴サイズ対平均微小液滴サイズの比は、約１０００対約１未満、または約１０００対約０．１未満、または約１０００対約０．０１未満、または約１０００対約０．００１未満であり得る。潜在的な汚染物質としては、例えば、タンパク質、核酸、または試薬が挙げられ得る。特定の実施形態において、界面活性剤−酵素複合体の実質的に全ては、液滴の表面に捕捉されてもよい。充填流体は、シリコンオイルなどのオイルを含んでもよい。液滴は、充填流体によって部分的に囲まれてもよい。液滴は、充填流体によって実質的に囲まれてもよい。液滴は、充填流体によって完全に囲まれてもよい。
本発明は、デジタル増幅法を提供する。その方法は、標的核酸、および必要に応じて増幅試薬を含むサンプル液滴を提供する工程を含んでもよい。その方法は、サンプル液滴から小液滴を分配する工程、および増幅試薬がサンプル液滴に存在し得ない場合、増幅準備液滴を得るために各々の小液滴と増幅試薬とを混合する工程を含んでもよい。その方法は、各々の小液滴を、標的核酸を増幅するために選択される熱サイクルプロトコルに供する工程を含んでもよい。その方法は、各々の小液滴内の増幅産物を検出する工程を含んでもよい。その方法は、サンプル部を含む小液滴の数を決定する工程を含んでもよく、そのサンプル部から上記増幅産物が形成されてもよい。典型的に、上記小液滴の少なくとも１つは、少なくとも１つの標的核酸分子を含む。増幅試薬は、増幅標的分子に対してハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に変化するか、またはハイブリダイゼーションの結果として変化する蛍光特性を有する少なくとも１つのプローブを含んでもよい。その方法は、サンプル部を含む小液滴の数を決定する工程を含んでもよく、そのサンプル部から上記増幅産物が形成される。一部の場合において、決定する工程は、上記少なくとも１つのプローブのハイブリダイゼーションに起因する蛍光変化を検出する工程を含んでもよい。上記増幅産物が形成され得るサンプル部を含む小液滴の数を決定する工程は、全ての小液滴を一緒に画像化する工程を含んでもよい。上記増幅産物が形成され得るサンプル部を含む小液滴の数を決定する工程は、検出ウィンドウを通して一つずつまたは小液滴内の液滴を輸送する工程を含んでもよい。小液滴は、約１μＬ未満、または約１μＬ以上〜約１０００μＬの範囲、または約１００μＬ以上〜約５００μＬの容積を有してもよい。この１つ以上の系統および本発明の他の方法は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内で実施されてもよい。小液滴は、液滴操作間隙内の２つの基板の間で平らまたはディスク形状の構造に圧縮されてもよい。液滴操作間隙は、約５０μｍ〜約１０００μｍ、または約１００μｍ以上〜約５００μｍの範囲の高さを有してもよい。熱サイクルは、１つの熱領域から別の熱領域へ液滴を輸送することによって行われてもよい。特定の実施形態において、液滴アクチュエータはサンプルチャンバを欠く。特定の実施形態において、液滴アクチュエータは流路チャネルを欠く。特定の実施形態において、サンプル液滴から小液滴を分配する工程は、流路チャネルからサンプルを配置する配置流体を用いずに行われてもよい。特定の実施形態において、標的核酸を含むサンプル液滴はまた、増幅試薬を含んでもよい。特定の実施形態において、増幅試薬はサンプル液滴に存在しなくてもよく、その方法は、各々の小液滴と増幅試薬とを混合して増幅準備試薬を生じる工程を含んでもよい。特定の実施形態において、各々の小液滴中の増幅産物を検出する工程は、液滴を検出に供する前に、増幅液滴と１つ以上の検出試薬を含む液滴とを混合する工程を含んでもよい。
本発明のこれらの態様および多くの他の態様は、本明細書の残りの段落および添付の特許請求の範囲から明らかになるだろう。
（５．定義）
本明細書で使用する場合、以下の用語は示される意味を有する。
１つ以上の電極に関して「活性化する」とは、液滴の存在下において、１つ以上の電極の電気状態の変化を与えることにより、液滴操作を生じさせることを意味する。
液滴アクチュエータ上のビーズに関して「ビーズ」とは、液滴アクチュエータ上で、または液滴アクチュエータと近接して、液滴と相互作用できる任意のビーズまたは粒子を意味する。ビーズは、球形、ほぼ球形、卵形、円盤形状、立方体および他の三次元形状などの様々な形状のいずれかであってもよい。ビーズは、例えば、液滴アクチュエータ上の液滴中で輸送され得るか、あるいは液滴アクチュエータ上の液滴が、液滴アクチュエータ上および／または液滴アクチュエータの外でビーズと接触できる方法で液滴アクチュエータに対して構成され得る。ビーズは、例えば、樹脂およびポリマーを含む、様々な材料を用いて製造されてもよい。ビーズは、例えば、マイクロビーズ、マイクロ粒子、ナノビーズおよびナノ粒子を含む、任意の適切なサイズであってもよい。一部の場合において、ビーズは磁性反応であり、他の場合において、ビーズは、著しく磁性反応でなくてもよい。磁性反応ビーズに関して、磁性反応材料は、ビーズの実質的に全てまたはビーズの１つの成分のみを構成してもよい。ビーズの残りは、特に、アッセイ試薬の結合を可能にするポリマー性の材料、コーティング、および部分を含んでもよい。適切な磁性反応ビーズの例は、２００５年１１月２４日に公開された「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｆｌｏｗ ａｓｓａｙｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ ｗｉｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ」という発明の名称の米国特許出願公開第２００５−０２６０６８６号に記載されており、その全開示は、磁性反応材料およびビーズに関するその教示のために本明細書に参照として援用される。流体は、１つ以上の磁性反応ビーズおよび／または非磁性反応ビーズを含んでもよい。磁性反応ビーズおよび／または非磁性反応ビーズを固定するための液滴アクチュエータ技術ならびに／あるいはビーズを用いて液滴操作プロトコルを実施するための液滴アクチュエータ技術の例は、２００６年１２月１５日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｏｒｔｉｎｇ」という発明の名称の米国特許出願公開第１１／６３９，５６６号；２００８年３月２５日に出願された「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ Ｂｅａｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｒｏｐｌｅｔ」という発明の名称の米国特許出願公開第６１／０３９，１８３号；２００８年４月２５日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂｅａｄｓ」という発明の名称の米国特許出願公開第６１／０４７，７８９号；２００８年８月５日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ」という発明の名称の米国特許出願公開第６１／０８６，１８３号；２００８年２月１１日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５３５４５号；２００８年３月２４日に出願された「Ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８０１８号；２００８年３月２３日に出願された「Ｂｅａｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｎ ａ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５８０４７号；および２００６年１２月１１日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７４８６号に記載されており、その全開示は本明細書に参照により援用される。
「液滴」とは、充填流体に少なくとも部分的に結合される液滴アクチュエータ上の液体の量を意味する。例えば、液滴は充填流体によって完全に囲まれてもよいか、または充填流体および液滴アクチュエータの１つ以上の表面に結合されてもよい。液滴は、例えば、水溶性であっても、非水溶性であってもよいか、または水溶性および非水溶性成分を含む混合物もしくはエマルションであってもよい。液滴は様々な形状をとってもよく、非限定的な例として、ほぼ円盤形状、スラグ形状、切頭球体、楕円、球形、部分的に圧縮された球形、半球形、卵形、円筒形、および液滴アクチュエータの１つ以上の表面と、そのような形状との接触の結果として融合または分裂または形成されるなどの液滴操作の間に形成された種々の形状が挙げられる。本発明のアプローチを用いて液滴操作に供され得る液滴流体の例に関しては、２００６年１２月１１日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４７４８６号を参照のこと。種々の実施形態において、液滴は、全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄液、羊水、精液、膣排出液、漿液、滑液、心膜液、腹水、胸膜液、浸出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞便試料、単細胞または多細胞を含む液体、細胞小器官を含む液体、流動組織、流動器官、多細胞生物を含む液体、生物学的スワブおよび生物学的洗浄液などの生物学的サンプルを含んでもよい。さらに、液滴は、水、脱イオン水、生理的食塩水、酸性溶液、塩基性溶液、清浄液および／または緩衝液などの試薬を含んでもよい。液滴内容物の他の例としては、核酸増幅プロトコル、親和性ベースアッセイプロトコル、酵素アッセイプロトコル、シークエンシングプロトコル、および／または生物学的流体の解析のためのプロトコルなどの生物学的プロトコルのための試薬などの試薬が挙げられる。
「液滴アクチュエータ」とは、液滴を操作するための装置を意味する。液滴アクチュエータの例に関しては、Ｐａｍｕｌａらによる２００５年６月２８日に発行された「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ−Ｂａｓｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」という発明の名称の米国特許第６，９１１，１３２号；２００６年１月３０日に出願された「Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｏｎ ａ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｂｏａｒｄ」という発明の名称の米国特許出願公開第１１／３４３，２８４号；両方、Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖらによる、２００４年８月１０日に発行された「Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」という発明の名称の米国特許第６，７７３，５６６号および２０００年１月２４日に発行された「Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｍｏｖｉｎｇ Ｐａｒｔｓ」という発明の名称の同第６，５６５，７２７号；Ｐｏｌｌａｃｋら、２００６年１２月１１日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７４８６号；ならびにＲｏｕｘら、２００５年８月１８日に公開された「Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｄｒｏｐ Ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｏｒ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」という発明の名称の米国特許出願公開第２００５０１７９７４６号を参照のこと（これらの開示は本明細書に参照として援用される）。特定の液滴アクチュエータは、基板、基板に結合された液滴操作電極、液滴操作表面を形成する基板および／または電極の上の１つ以上の誘電層および／または疎水性層、ならびに必要に応じて、液滴操作間隙によって液滴操作表面から分離された上部基板を備える。１つ以上の参照電極が、上部または底部の基板ならびに／あるいは液滴操作間隙内に設けられてもよい。種々の実施形態において、液滴アクチュエータによる液滴の操作は、電極により媒介、例えばエレクトロウェッティングにより媒介、または誘電泳動により媒介、またはクーロン力により媒介されてもよい。本発明の液滴アクチュエータに使用され得る液体の流れを制御する他の方法の例としては、機械的原理（例えば外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電／超音波ポンプおよび音響力）；電気または磁気的原理（例えば電気浸透流、動電学的ポンプ、磁性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁場を用いる引力または斥力および電磁流体力学的ポンプ）；熱力学的原理（例えば気泡生成／相変化誘発体積膨張）；他の種類の表面湿潤原理（例えばエレクトロウェッティングおよびオプトエレクトロウェッティング、ならびに化学的、熱的、構造的、および放射活性的に誘発される表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば毛細管現象）；静電気力（例えば電気浸透流）；遠心力を利用した流れ（コンパクトディスクに配置され、回転される基板）；磁場（例えば周期的に振動するイオンが流れを引き起こす）；電磁流体力学的力；ならびに真空または圧力差に基づいて操作するものなどの流体力学的流体圧力を含む装置が挙げられる。特定の実施形態において、２つ以上の上述の技術の組み合わせが、本発明の液滴アクチュエータに利用されてもよい。
「液滴アクチュエータ」とは、液滴アクチュエータ上での液滴の任意の操作を意味する。液滴操作としては、例えば、液滴アクチュエータに液滴を負荷すること、液滴源から１つ以上の液滴を分配すること、１つの液滴を２つ以上の液滴に分裂、分離、または分割すること、任意の方向において液滴を１つの位置から別の位置に輸送すること、２つ以上の液滴を単一の液滴に融合または混合すること、液滴を希釈すること、液滴を混合すること、液滴を攪拌すること、液滴を変形させること、液滴を所定の位置に保持すること、液滴をインキュベートすること、液滴を加熱すること、液滴を蒸発させること、液滴を冷却すること、液滴を配置すること、液滴アクチュエータの外部へ液滴を輸送すること、本明細書に記載される他の液滴操作、および／または上述の任意の組み合わせが挙げられ得る。用語「融合する」、「融合している」、「混合する」、「混合している」などは、２つ以上の液滴から１つの液滴を生成することを述べるのに使用される。そのような用語が、２つ以上の液滴に関して使用される場合、２つ以上の液滴の１つの液滴への混合を生じるのに十分な液滴操作の任意の組み合わせが使用されてもよいことは理解されるべきである。例えば、「液滴Ａと液滴Ｂとを融合する」ことは、液滴Ａを静止液滴Ｂと接触するように輸送すること、液滴Ｂを静止液滴Ａと接触するように輸送すること、または液滴ＡおよびＢを互いに接触するように輸送することによって達成され得る。用語「分裂している」、「分離している」、「分割している」とは、得られる液滴の容積に対する任意の特定の結果、または得られる液滴の数に対する任意の特定の結果を表すことを意図しない（すなわち得られる液滴の容積は同じであっても、異なっていてもよいか、あるいは得られる液滴の数は２、３、４、５またはそれ以上であってもよい）。用語「混合する」とは、液滴内の１つ以上の成分のより均一な分布を生じる液滴操作を指す。液滴を「負荷する」操作の例としては、微小透析負荷、圧力支援による負荷、ロボットによる負荷、不動態による負荷、およびピペットによる負荷が挙げられる。液滴操作は電極により媒介されてもよい。一部の場合において、液滴操作は、表面上の親水性および／または疎水性領域の使用によって、ならびに／あるいは物理的障壁によってさらに容易にされる。
「充填流体」とは、液滴アクチュエータの液滴操作基板に結合する液体を意味し、その液体は、液滴相が電極により媒介される液滴操作を受けるように液滴相と十分に混ざらない。充填流体は、例えば、シリコーンオイルなどの低粘度のオイルであってもよい。充填流体の他の例は、２００６年１２月１１日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４７４８６号；２００８年８月８日に出願された「Ｕｓｅ ｏｆ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔ ａｃｔｕａｔｉｏｎ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７２６０４号；および２００７年５月１７日に出願された「Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ」という発明の名称の米国特許出願公開第２００８０２８３４１４号（その全開示は本明細書に参照として援用される）に提供される。充填流体は、液滴アクチュエータの間隙全体を満たしてもよいか、または液滴アクチュエータの１つ以上の表面を覆ってもよい。充填流体は、導電性であっても、または非導電性であってもよい。「充填物質」は、凝固または硬化されたワックス、油脂またはオイルなどの凝固または硬化された充填流体である。
磁性反応ビーズに関して「固定する」とは、ビーズが、液滴アクチュエータ上の液滴または充填流体内の所定の位置に実質的に保持されることを意味する。例えば、一実施形態において、固定されるビーズは、液滴上での分裂操作の実施を可能にするために、所定の位置に実質的に保持され、実質的に全てのビーズを有する１つの液滴およびビーズを実質的に欠く１つの液滴を生じる。
「液体経路」とは、液体を誘導または流動させるのに適切な経路を意味する。液体経路は、管基板（例えば毛細管）内の内腔経路または固体基板内のチャネル、管、導管、穴、開口部、溝またはくぼみの経路など、基板内に規定されてもよい。液体経路は、開いていても（例えば液体が流れる表面内の溝またはくぼみ）、閉じていてもよい（例えば管）。多くの場合、液体経路は、液体リザーバーから、液体経路を通して、液滴アクチュエータの液滴操作間隙内、または液体リザーバーから、液滴経路を通して、第２の液体経路内などのように、１つのチャンバから別のチャンバへ液体を流すように規定される。
「磁性反応」とは、磁場に対する反応を意味する。「磁性反応ビーズ」は、磁性反応物質を含むか、または磁性反応物質から構成される。磁性反応物質の例としては、常磁性体、強磁性体、フェリ磁性体、およびメタ磁性体が挙げられる。適切な常磁性体の例としては、鉄、ニッケルおよびコバルト、ならびにＦｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、およびＣｏＭｎＰなどの金属酸化物が挙げられる。
磁性反応ビーズを洗浄することに関して、「洗浄する」とは、磁性反応ビーズと接触するか、または磁性反応ビーズと接触する液滴から磁性反応ビーズに曝露される１つ以上の物質の量および／または濃度を減少させることを意味する。物質の量および／または濃度の減少は、部分的、実質的に完全または均一に完全であってもよい。物質は、様々な物質の任意のものであってもよい。例としては、さらなる解析のための標的物質、ならびにサンプル、汚染物質、および／または過剰な試薬の成分などの不要な物質が挙げられる。一部の実施形態において、洗浄操作は磁性反応ビーズと接触する開始液滴で始まり、その液滴は物質の初期量および初期濃度を含む。洗浄操作は種々の液滴操作を用いて進行されてもよい。洗浄操作により、磁性反応ビーズを含む液滴が生じ得、その液滴は、物質の初期量および／または濃度未満の物質の全量および／または濃度を有する。適切な洗浄技術の例は、Ｐａｍｕｌａら，２００８年１０月２１日に付与された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗａｓｈｉｎｇ」という発明の名称の米国特許第７，４３９，０１４号（その全開示は本明細書に参照として援用される）に記載されている。
用語「上部」、「底部」、「上」、「下」および「上に」は、液滴アクチュエータの上部および底部基板の相対的位置などの液滴アクチュエータの構成要素の相対的位置に関して本明細書全体を通して使用される。液滴アクチュエータは空間の方向に関わらず機能的であることは理解されるだろう。
任意の形態の液体（例えば、移動しているか、または静止しているかに関わらず、液滴または連続体）が、電極、アレイ、表面のマトリクス「の上に」、「において」または「より上に」存在していると記載される場合、そのような液体は、電極／アレイ／マトリクス／表面と直接接触してもよいか、または液体と電極／アレイ／マトリクス／表面との間に入り込む１つ以上の層もしくは薄膜と接触してもよいかのいずかである。
液滴が、液滴アクチュエータ「の上に」または「の上に負荷される」と記載される場合、液滴が、液滴アクチュエータを用いて液滴上での１つ以上の液滴操作を実施することを容易にする方法で液滴アクチュエータ上に配置され、液滴は、液滴からの特性またはシグナルの検出を容易にする方法で液滴アクチュエータ上に配置され、および／または液滴は液滴アクチュエータ上で液滴操作に供されることは理解されるべきである。
（６．図面の簡単な説明）
図１は、液滴アクチュエータ基板上の熱サイクル経路を示す。 図２は、液滴アクチュエータ基板上に規定された一連の熱サイクル経路を示す。 図３は、液滴アクチュエータについての別の熱サイクルの配置を示す。 図４は、液滴間の二次汚染を減少または除去するための技術を示す。 図５は、複数の洗浄液滴がサンプル液滴間の経路に置かれることを除いて、図４に示す技術と実質的に同様の技術を示す。 図６は、洗浄液滴がサンプル液滴に対して１つの電極によってオフセットされることを除いて、図５に示す技術と実質的に同様の技術を示す。 図７は、洗浄液滴が細長いスラグ形状の洗浄液滴と置き換えられることを除いて、図４および５に示す技術と実質的に同様の技術を示す。 図８は、細長い洗浄スラグが、サンプル液滴の前後のサンプル液滴経路において洗浄液滴でさらに補われることを除いて、図７に示す技術と実質的に同様の技術を示す。 図９は、洗浄液滴が、サンプル液滴の前後に水平形状の洗浄液滴として提供されることを除いて、先行技術と実質的に同様の技術を示す。 図１０は、経路間の充填流体の交換または充填流体の構成を防止する、細長い物理的障壁が、サンプル経路間に備えられることを除いて、図２に示す実施形態と同様の実施形態を示す。 図１１は、充填流体が、保存温度で実質的に凝固し、操作に必要とされる温度で加熱器の近くで融解する物質として提供される実施形態を示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、液滴間の二次汚染を減少または除去するための別の技術を示す。 図１３は、液滴間の二次汚染を減少または除去するための別の技術を示す。 図１４は、液滴アクチュエータ上の反応を開始するために表面積対体積比の原理ならびに図１２Ａおよび１２Ｂに示す表面活性酵素複合体を使用する実施形態を示す。 図１５は、充填流体を置き換える流路を構成する液滴アクチュエータの断面図を示す。 図１６は、充填流体を置き換える流路を構成する図１５に示すものと同様の液滴アクチュエータの上面図（図１６Ａ）および断面図（図１６Ｂ）を示す。 図１７は、充填流体を置き換える流路を構成する液滴アクチュエータの断面図を示す。 図１８は、熱領域間で液滴を循環させるように配置される電極経路を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図１９は、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示し、液滴が温度制御素子から離れて滞留され得るように、特定の経路が延長されることを除いて、図１８に示す電極の構成と同様である。 図２０は、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示し、液滴を検出ウィンドウの存在下に輸送させることができるように配置される電極経路に沿って検出ウィンドウが提供されることを除いて、図１９に示す構成と同様である。 図２１は、２つ以上の熱領域を通る曲がった蛇行している電極経路を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２２は、曲がった電極経路から液滴を輸送するように構成されるさらなる電極経路を含む２つ以上の熱領域を通る曲がった蛇行している電極経路を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２３は、各々の熱領域内の曲がっている電極経路が、その領域内の液滴の滞留時間を長くするか、または短くするために、どのように延びているか、または短縮しているかを示す、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２４は、曲がっている経路を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示し、曲がっている経路の１つ以上の曲がり角はアクセス経路に結合される。 図２５は、図２５の電極の構成と同じ電極の構成を示すが、電極の活性化を必要とせずに検出前に液滴を保存するための液滴滞留領域も含む。 図２６は、熱制御領域の間に液滴を輸送するための電極経路のループを形成するように配置される電極を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２７は、複数の電極経路のループを含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２８は、電極経路のループおよび電極経路のサブループを含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図２９は、流路の熱サイクルの構成を例示する本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示し、小液滴は検出のためのより大きな液滴から分裂される。 図３０は、電極アレイおよび電極アレイに配置されるサブサンプルの液滴を含む、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図３１は、サンプル液滴が熱サイクルされ、ｎサイクルごとの後、サブサンプル液滴が分配され、検出のために離れた位置に輸送される、本発明の実施形態を示す。 図３２は、どのように小液滴が離れた位置に輸送され、配置されて、その後検出器によって操作され得るかを示す、実施形態を示す。 図３３は、電極の構成が、反応液滴を配置するために使用される、実施形態を示す。 図３４は、熱サイクル経路が半径方向に配置される、本発明の液滴アクチュエータの電極の構成を示す。 図３５は、液滴輸送経路の複数のセットを有する電極アレイによって接続される複数の温度制御素子を有する電極の構成を示す。 図３６は、先細の電極である電極の構成を示し、温度制御素子の間に液滴を輸送するために使用される。 図３７は、本発明の液滴アクチュエータカートリッジの基板底部の写真である。 図３８は、図３７に示す基板底部の配置の図である。 図３９は、カートリッジ上の増幅についての生のデータおよび正規化されたデータを示す。 図４０は、ＢｉｏＲａｄＩＱ５からの正規化されたデータと比較した本発明のカートリッジからの正規化されたデータを示す。 図４１は、１つの液滴アクチュエータ上の１２の同時増幅反応の結果を示す。 図４２は、図３７および３８に示されるカートリッジの配置を用いた別の熱サイクル実験の結果を示す。 図４３は、増幅が検出と分離される実験に使用される液滴プロトコルを示す。 図４４は、図４３に関して記載される実験の結果を示す。 図４５は、ビーズが、検出の間、検出ウィンドウに曝露されないように、磁性反応ビーズが、細長い液滴内の端側に引き付けられる本発明の実施形態を示す。 図４６Ａは、液滴アクチュエータの領域の上面図を示し、検体の検出を向上するための磁性反応ビーズを操作する方法の特定の工程を一緒に示す。 図４６Ｂは、液滴アクチュエータの領域の上面図を示し、検体の検出を向上するための磁性反応ビーズを操作する方法の特定の工程を一緒に示す。 図４６Ｃは、液滴アクチュエータの領域の上面図を示し、検体の検出を向上するための磁性反応ビーズを操作する方法の特定の工程を一緒に示す。 図４６Ｄは、熱サイクル反応から得たリアルタイムＰＣＲデータのプロットを示す。 図４７Ａ〜４７Ｉは液滴アクチュエータの領域の断面図を示し、核酸増幅および検体についてのサンプル流体からの標的核酸の濃縮および回収プロセスにおける磁性反応捕捉ビーズの使用例を提供する。 図４８Ａおよび４８Ｂは、加熱バーおよび挿入される加熱バーの側面図を示す。
（７．詳細）
本発明は、液滴アクチュエータ装置、液滴アクチュエータを製造および使用するための技術ならびにシステムを提供する。本発明の実施形態は、液滴操作を実施するのに有用である。本発明の実施形態は、核酸を増幅するための液滴の熱サイクルなどの液滴の熱サイクルを利用するアッセイを実施するのに有用である。本発明の種々の熱サイクルプロトコルは、当該技術分野に対して様々な利点を有する。一部の場合において、そのプロトコルは、加熱器または液滴アクチュエータが熱サイクルされることを必要としない。他の場合において、同時または同じ部位で発生する核酸増幅および検出を必ずしも必要としない。さらに他の場合において、熱サイクルの間の反応に存在すべき検出試薬を必ずしも必要としなくてもよい。例えば、検出試薬は、熱サイクルされた液滴と、検出試薬を含む液滴とを混合することなどによって熱サイクルの後に加えられてもよい。一部の実施形態において、熱サイクルの間に生じる検出を必ずしも必要としない。すなわち、検出は、熱サイクルの完了の際、または熱サイクル後に生じてもよい。さらに他の場合において、測定されるべき１つより多い個々の反応からのシグナルを必ずしも必要としない。さらに、任意の特定の順序で決定されるべき任意の特定の数のサイクルと関連するシグナルを必ずしも必要としなくてもよい。本発明の任意の特定の熱サイクルプロトコルは、これらおよび他の利点のうちの１つ以上を有してもよい。
本発明は、液滴アクチュエータおよび液滴アクチュエータ上でのＰＣＲなどの核酸解析を実施する改良された方法を提供する。例えば、本発明は、増幅された標的物（例えば核酸）の検出を改良するために磁性反応ビーズを操作する方法を提供する。本発明はまた、増幅された標的物の検出を改良するために、液滴アクチュエータにより駆動される増幅プロトコルにおいて極性蛍光色素分子の使用を提供する。本発明はまた、液滴操作の間の核酸標的物およびＰＣＲ試薬の損失を実質的に減少および／または除去するための方法（例えば不動態化）を提供する。本発明はまた、液滴操作の間の液滴の安定性を改良するために、増加した間隙サイズを有する液滴アクチュエータを提供する。本発明はまた、増幅反応液滴間のキャリーオーバーおよび二次汚染を減少させる方法を提供する。本発明はさらに、サンプル流体から標的核酸を濃縮および収集するための方法を提供する。
特定の実施形態において、実質的に同一の組成を含む複数の液滴が熱サイクルプロトコルに供されてもよく、異なる液滴または異なる液滴のセットが異なる数のサイクルに供される。液滴または液滴のセットが所定数のサイクルを完了すると、液滴は、その液滴に存在する増幅産物の量を決定するために検出に供されてもよい。曲線が、異なる熱サイクルのエンドポイントにおいて液滴の検出に基づいて生成され、オリジナルのサンプルに存在する標的物を定量化するために使用されてもよい。多くの代替が、本明細書に開示される本発明を考慮して本発明の範囲内で可能である。
本発明の装置、技術およびシステムは、限定されないが、液滴アクチュエータ上の液滴と、他の液滴、充填流体、および／または液滴アクチュエータ表面との間の二次汚染の減少または除去、汚染を減少または除去するために使用する液滴アクチュエータ間の清浄を含む、当該技術分野に対する多くの利点を有する。
（７．１ 二次汚染の減少）
本発明は、液滴アクチュエータ装置および液滴操作を実施するための方法を提供する。本発明は、液滴アクチュエータ上の液滴と、他の液滴、充填流体、および／または液滴アクチュエータ表面との間の二次汚染ならびにキャリーオーバーを実質的に減少または除去することができる。本発明は、汚染を減少または除去するために使用する液滴アクチュエータ間の清浄を提供することができる。本発明は概して、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を参照して記載されるが、その方法は、液滴間の二次汚染またはキャリーオーバーが問題となる任意の種類のアッセイに適切であることは理解されるだろう。
図１は、液滴アクチュエータ基板上の熱サイクル経路１００を示す。熱サイクル経路１００は液滴操作領域１０５を備える。液滴操作領域１０５は第１の基板上に規定され、第１の基板に対してほぼ平行な様式で配置され、液滴操作を実施するための液滴操作間隙をその間に生成するように第２の基板も含んでもよい。液滴操作領域１０５は、液滴操作領域１０５に侵入するか、またはそこから出ていく汚染を防止するためにガスケット１１０により囲まれる。第１および第２の基板が存在する場合、ガスケット１１０は液滴操作間隙に設けられてもよい。ガスケット１１０は、液滴操作領域１０５において充填流体を保有するためのシールとして、および／または液滴操作領域１０５の液滴操作間隙の高さを規定するためのスペーサーとして役立ってもよい。
ガスケット１１０が液滴操作領域１０５において流動性の充填流体を保有する場合、ガスケット１１０は、充填流体の汚染が液滴アクチュエータ表面上の他の液滴操作領域を汚染することを防ぐ。従って、第１および第２の基板が存在する場合、ガスケット１１０は液滴操作間隙に設けられ、液滴操作領域１０５における充填流体が、第１および第２の基板ならびにガスケットによって完全に囲まれるように配置されてもよい。種々のポートが、液滴操作領域１０５まで／から流体を負荷する／取り出す（非負荷する）ために、液滴操作間隙から液滴アクチュエータの外側、または液滴アクチュエータの別の領域まで任意の経路に沿って設けられてもよい。
図示するように、液滴操作領域１０５は、２つの温度制御領域１２０Ａおよび１２０Ｂ、ならびに遷移領域１２５を備える。温度制御領域１２０は、温度制御素子１３０Ａおよび１３０Ｂに結合される。温度制御素子１３０は、それらの近くで充填流体の温度を制御する素子である。温度制御素子１３０は、電気を温度制御素子１３０に供給するために電気接点１３１に電気的に接続されてもよい。適切な温度制御素子１３０の例としては、加熱器およびヒートシンクが挙げられる。図示するように、２つの温度制御領域１２０Ａおよび１２０Ｂが存在するが、任意の数の温度制御領域１２０が備えられてもよいことは理解されるだろう。
温度制御領域１２０は遷移領域１２５に接続される。遷移領域１２５における電極１１５は、温度制御領域間の液滴を往復させるために利用されてもよい。一部の実施形態において、遷移領域１２５は、温度制御領域１２０の間の流体の循環を最小化するために、温度制御領域１２０より狭くてもよい。図示するように、単一の遷移領域１２５は２つの温度制御領域１２０に接続するが、温度制御領域１２０が複数の遷移領域１２５の接続を有してもよいことは理解されるだろう。さらに、任意の数の温度制御領域１２０が、任意の数の遷移領域１２５によって接続されてもよい。
液滴操作領域１０５は、第１および第２の基板の１つまたは両方に結合される電極１１５を備える。電極１１５は１つ以上の液滴操作を実施するように構成される。電極１１５は、例えば矢印Ａによって示される方向で、例えば液滴１４０を温度領域１２０Ａと１２０Ｂとの間で前後に往復させるために使用されてもよい。
図２は、液滴アクチュエータ基板上に規定される連続した熱サイクル経路１００を示す。温度制御素子１３０は、連続して一緒に電気的に接続される連続したほぼディスク形状の加熱器として示される。しかしながら、温度制御素子１３０は、電源または別個の電源に並行に接続されてもよいことは理解されるだろう。さらに、温度制御素子１３０は組み合わされてもよい。例えば、素子１３０Ａは、各々の温度制御領域１２０Ａと結合される単一の温度制御素子１３０と置き換えられてもよい。同様に、素子１３０Ｂは、各々の温度制御領域１２０Ｂと結合される単一の温度制御素子１３０と置き換えられてもよい。
図３は、液滴アクチュエータのための別の熱サイクルの配置３００を示す。熱サイクルの配置３００は、図１および２における熱サイクル経路１００を規定する配置と同様である。しかしながら、熱制御素子３０５は、複数の液滴往復経路３１０Ａ−３１０Ｂにわたる温度制御領域３２０Ａおよび３２０Ｂを規定する。液滴往復経路３１０は、概して図１を参照して記載されるように、１つ以上の液滴操作を実施するように構成される液滴操作電極３１５から構成される。特に、液滴往復経路３１０は、矢印Ａによって示される方向において熱領域３２０Ａと３２０Ｂとの間で液滴３４０を往復させるために液滴操作電極３１５を利用する。熱サイクルの配置３００はまた、熱領域３２０Ａと３２０Ｂとの間で充填流体の循環を減少させるように構成される物理的障壁を備えてもよい。
図４は、液滴間の二次汚染を減少または除去するための技術を示す。液滴往復経路１０５Ａ、１０５Ｂ、１０５Ｃ、１０５Ｄおよび１０５Ｅが、液滴アクチュエータ基板上に設けられる。液滴は、矢印Ａによって示される方向において熱領域（図示せず）の間で往復する。経路１０５Ａ、１０５Ｃおよび１０５Ｅは、ＰＣＲ液滴としてここで示されるサンプル液滴を含む。洗浄液滴Ｗは、サンプル液滴を含む経路間の経路１０５Ｂおよび１０５Ｄ上に置かれる。サンプル液滴が温度領域間で往復する場合、洗浄液滴はサンプル液滴経路間で往復する。洗浄液滴ＷはＤＮＡ分解酵素などの汚染物質を分解する化合物を含んでもよい。洗浄液滴Ｗは、ＤＮＡ結合ビーズなどの汚染物質に結合する成分を含んでもよい。洗浄液滴Ｗは、サンプル液滴に対して同じ方向または反対方向において往復してもよい。それらは、サンプル液滴にすぐ隣接する位置および／またはサンプル液滴に対してオフセットする位置において往復してもよい。洗浄液滴Ｗは、必要に応じて、核酸増幅試薬を含んでもよく、それによって、それらはまた、洗浄液滴内で増幅された核酸の検出が、汚染物質が洗浄液滴内で検出可能であるという指標を与えるネガティブ反応コントロールとして機能する。
図５は、複数の洗浄液滴がサンプル液滴間の経路に置かれることを除いて、図４に示す技術と実質的に同様の技術を示す。代替の実施形態において、複数の洗浄液滴経路は、各々の洗浄液滴経路において１つ以上の洗浄液滴を有するサンプル液滴経路間に配置される。
図６は、洗浄液滴が、サンプル液滴に対して１つの電極によってオフセットすることを除いて、図５に示す技術と実質的に同様の技術を示す。
図７は、洗浄液滴が細長いスラグ形状の洗浄液滴と置き換えられることを除いて、図４および５に示す技術と実質的に同様の技術を示す。
図８は、細長い洗浄スラグがさらに、サンプル液滴の前後でサンプル液滴経路において洗浄液滴で補われることを除いて、図７に示す技術と実質的に同様の技術を示す。同様に、サンプル液滴の前後のサンプル液滴経路における洗浄液滴はまた、図１〜７のいずれかに含まれ得る。
図９は、洗浄液滴が、サンプル液滴の前後で水平形状の洗浄液滴として与えられることを除いて、先行技術と実質的に同様の技術を示す。同様の実施形態において、洗浄液滴のスラグは、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘまたはそれより大きい液滴の任意の形状と置き換えられてもよい。
図１０は、経路または領域間の充填流体の交換または充填流体の構成を防止する、細長い物理的障壁１０１０Ａ、１０１０Ｂ、１０１０Ｃおよび１０１０Ｄが、サンプル経路１００５Ａ、１００５Ｂ、１００５Ｃ、１００５Ｄおよび１００５Ｅの間に備えられることを除いて、図２に示す実施形態と同様の実施形態を示す。
図１１は、充填流体が、保存温度で実質的に凝固し、操作に必要とされる温度で加熱器の近くで融解する物質として与えられる実施形態を示す。加熱器１１３０は、所望の液滴操作経路１１０５の形状とほぼ対応する形状を有するように与えられる。４つの液滴操作経路１１０５Ａ、１１０５Ｂ、１１０５Ｃおよび１１０５Ｄをここで示すが、任意の数の経路が設けられてもよいことは理解されるだろう。実質的に凝固した充填物質を加熱する際に、一部の充填物質は融解して、実質的に固体のままである充填物質により囲まれる流体が充填した液滴操作経路１１０５を形成し、それにより、汚染物質が１つの液滴操作経路１１０５から別の経路まで流動性の充填流体を介して移動することの障壁１１２０として役立つ。一実施形態において、充填物質は、核酸増幅を実施するのに必要とされる温度以下の温度で固体のままであり、核酸増幅を実施するのに必要とされる温度で融解するように選択される。
図１２Ａおよび１２Ｂは、液滴間の二次汚染を減少または除去するための別の技術を示す。液滴操作電極１２１０の経路またはアレイは、液滴アクチュエータ基板上に設けられる。液滴操作電極１２１０は１つ以上の液滴操作を実施するように構成される。図１２Ａに示すように、例えば、液滴操作電極１２１０は、液滴１２２０を輸送するために使用されてもよい。液滴１２２０は、汚染物質を潜在的に含む任意の液体であってもよい。すなわち、物質は別の液滴を汚染する可能性がある。例えば、液滴１２２０は、免疫学的検定、シークエンシングアッセイ、核酸増幅アッセイ、および／または酵素アッセイの液滴に使用される液滴などのアッセイ液滴であってもよい。汚染物質は、例えば、核酸増幅反応における核酸などの標的物質、免疫学的検定サンプルにおける非標的タンパク質などの非標的物質、および／または酵素などの試薬であってもよい。
液滴１２２０は、多量の界面活性剤−酵素複合体１２２４を含んでもよい。一例において、複合体１２２４は、界面活性剤−ＤＮａｓｅ複合体（すなわち、ＤＮＡ分解複合体）であってもよい。界面活性剤部分のために、実質的に全ての複合体１２２４は、液滴１２２０の表面に閉じ込められる。多量の複合体１２２４は、酵素部分（例えばＤＮａｓｅ）の濃度が十分に低く、それによって、液滴１２２０中で実質的に不活性であるように選択されてもよい。
液滴操作電極１２１０に沿った液滴１２２０の移動は、図１２Ｂに示すように、特定の液滴操作電極１２１０上に残ったままになり得る微小液滴１２２６の形成を生じる場合がある。微小液滴１２２６は、ＤＮＡおよび複合体１２２４などの液滴１２２０の全ての成分を含んでもよい。結果として、微小液滴１２２６は、液滴操作電極１２１０に沿って生じ得る、後の液滴操作におけるＤＮＡ汚染の源となり得る。
例えば、微小液滴１２２６は、液滴１２２０の直径の１／１００であってもよい。より小さい直径の微小液滴１２２６は、十分により高い（例えば１００倍高い）表面積対体積比を与える。高い表面積対体積比は、微小液滴１２２６中により高い濃度（例えば１００倍高い）の複合体１２２４を与え得る。しかしながら、微小液滴１２２６中の複合体１２２４の高い濃度のために、微小液滴１２２６中でのＤＮＡの急速な分解が達成され得、微小液滴１２２６によって引き起こされる二次汚染を実質的に防止または減少する。
例として、酵素は、ＰＡＧ−アルキルポリマーのポリアルカレングリコール（ＰＡＧ）部分（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールなど）に結合されてもよい。そのような結合を達成するための種々の方法は当該分野において公知である：米国特許第４，０８８，５３８号は、ＰＥＧに共有結合された酵素の酵素的に活性なポリマー−酵素結合体を記載し、米国特許第４，４９６，６８９号は、α−１プロテアーゼ阻害剤と、ＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）などのポリマーとの共有結合した複合体を記載し、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５７８（１９７７）は、ウシ血清アルブミンのアミン基に対するｍＰＥＧの共有結合を記載し、米国特許第４，４１４，１４７号は、ポリ（エチレン無水コハク酸）などのジカルボン酸の無水物に対するインターフェロンの結合を記載し、国際特許公開第１９８７／０００５６は、インターフェロン−β、インターロイキン−２および抗毒素などのタンパク質に対するＰＥＧおよびポリ（オキシエチル化）ポリオールの結合を記載している。このような文献の各々の全開示は参照により本明細書に援用される。
酵素にＰＥＧを結合する別の様式は、ペプチド上のグリコシル残基の酸化による。酸化された糖は、ペプチドにＰＥＧ部分を結合するための部位として利用される。例えば、国際特許公開第１９９４／０５３３２号は、ＰＥＧを糖タンパク質に付加するためにヒドラジンまたはアミノ−ＰＥＧの使用を記載している。グリコシル部分は、後でアミノ−ＰＥＧに結合される、対応するアルデヒドに酸化される。国際特許公開第１９９６／４０７３１号は、免疫グロブリン上のグリカンを酵素的に酸化し、次いで、グリカンとアミノ−ＰＥＧ分子とを接触することによって免疫グロブリン分子に対するＰＥＧの結合を記載している。界面活性剤は、結合が酵素の活性を過度に阻害しない、酵素の１つ以上の分子にて結合される。
図１３は、液滴間の二次汚染を減少または除去するための別の技術を示す。この実施形態において、液滴操作経路１３１０Ａ、１３１０Ｂおよび１３１０Ｃは、液滴アクチュエータ基板上に設けられる。３つの液滴操作経路１３１０Ａ、１３１０Ｂおよび１３１０Ｃをここで示すが、任意の数の経路が設けられてもよいことは理解されるだろう。経路１３１０Ａ、１３１０Ｂおよび１３１０Ｃは、ここで、ＰＣＲ液滴として示されるサンプル液滴を含む。液滴は、例えば矢印Ａによって示される方向において熱領域間（図示せず）を往復する。液滴の往復は、充填流体１３１６中に分散され得る微小液滴１３１４の形成を生じ得る。微小液滴１３１４はＤＮＡを含んでもよく、従って、他の液滴操作経路に対する汚染の源であってもよい。
充填流体１３１６は多量の界面活性剤−酵素複合体１３２０を含む。この例において、複合体１３２０は、ＤＮＡを分解するために使用される界面活性剤−ＤＮａｓｅ複合体であってもよい。複合体１３２０は、経路１３１０Ａ、１３１０Ｂおよび１３１０Ｃ間に障壁を与え、それによって、複合体１３２０は微小液滴１３１４中でＤＮＡを分解し、その後、経路間の二次汚染を実質的に防止または減少する。
代替の実施形態において、図１２Ａ、１２Ｂおよび１３に示す実施例は、液滴アクチュエータにおける他の物質の二次汚染を減少させるために適用されてもよい。例えば、界面活性剤−プロテアーゼ複合体は、液滴操作中のタンパク質のキャリーオーバーを実質的に防止または減少させるために使用されてもよい。
図１４は、表面積対体積比ならびに液滴アクチュエータ上での反応を開始するために図１２Ａおよび１２Ｂに示す表面活性酵素複合体の原理を使用する実施形態を示す。
この例において、リザーバー電極１４１０および液滴操作電極１４１２の経路またはアレイは、液滴アクチュエータ基板上に設けられる。多量の界面活性剤−酵素複合体１４１８を含む多量のサンプル流体１４１６は、リザーバー電極１４１０に与えられる。界面活性剤部分のために、実質的に全ての複合体１４１８は、サンプル流体１４１６の表面に閉じ込められる。多量の複合体１４１８は、酵素部分の濃度が十分に低く、それによって、サンプル流体１４１６中で実質的に不活性であるように選択されてもよい。
リザーバー電極１４１０は、液滴操作電極１４１２上に単一のサイズの液滴１４２０を分配するように構成される。液滴操作電極１４１２は、単一のサイズの液滴１４２０を処理するために１つ以上の液滴操作を実施するように構成される。
リザーバー電極１４１０上のサンプル流体１４１６の体積は、単一のサイズの液滴１４２０の体積より実質的に大きい。例えば、サンプル流体１４１６の体積は、単一のサイズの液滴１４２０の体積より約１０倍〜約１，０００倍大きくてもよい。サンプル流体１４１６と比べて、単一のサイズの液滴１４２０のより小さい体積は、実質的により高い表面積対体積比を与える。高い表面積対体積比は、単一のサイズの液滴１４２０中により高い濃度の複合体１４１８を与えることができる。単一のサイズの液滴１４２０中の高い濃度の複合体１４１８は、反応を開始するのに十分である。
代替の実施形態において、リザーバー電極１４１０は他の液滴操作電極１４１２と置き換えられる。この例において、多量の界面活性剤−酵素複合体を含むサンプル液滴は、液滴操作を用いて分裂されて、その表面積対体積比を変化させて反応を開始してもよい。
一部の実施形態において、液滴アクチュエータは、充填流体を置き換えるように構成される。一部の適用において、液滴アクチュエータの反復された使用を与えることは有用である。充填流体の汚染が問題となる場合、アッセイが作動している間に液滴アクチュエータにおける充填流体の一部または全てを置き換えることは有用であり得る。この技術は、例えば、増幅、シークエンシング、免疫学的検定、酵素アッセイなどのためのプロトコルを含む、広範な液滴プロトコルで有用であり得る。一実施形態において、充填流体は実質的に完全に置き換えられる。置き換えは自動化されてもよい。充填流体は各々の作動後に試験されてもよく、所定レベルの汚染が検出される場合、充填流体は置き換えられてもよい。置き換えは自動化されてもよい。一部の場合において、置き換えは、周期的、例えば１、２、３、４、５またはそれ以上の作動ごとの後に発生してもよい。
図１５は、充填流体を置き換える流路が構成される液滴アクチュエータ１５００の断面図を示す。液滴アクチュエータ１５００は、１つ以上の液滴操作を実施するように構成される電極１５１０を含む基礎基板１５０５を備える。液滴アクチュエータ１５００はまた、液滴操作間隙１５２０を生じるように基礎基板１５０５から分離した上部基板１５１５を備える。液滴アクチュエータ１５００は、液滴操作間隙１５２０を通して充填流体を流動するための側方開口部１５２５を備える。側方開口部１５２５は、外部の充填流体源または充填流体の送達位置上の１つ以上の対応する調整具１５３５と適合するように構成される調整具１５３０を備えてもよい。調整具１５３５は、外部の充填流体源（図示せず）から、導管１５４０を通り、調整具１５３０および１５３５を通り、液滴操作間隙１５２０への液体経路を規定する導管１５４０と結合されてもよい。調整具１５３５は、液滴操作間隙１５２０から、調整具１５３０および１５３５を通り、導管１５４０を通り、外部の充填流体の送達位置（図示せず）への液体経路を規定する導管と結合されてもよい。
図１６は、充填流体を置き換える流路が構成される同様の液滴アクチュエータ１６００の上面図（図１６Ａ）および断面図（図１６Ｂ）を示す。液滴アクチュエータ１６００は、１つ以上の液滴操作を実施するように構成される電極１６１０を含む基礎基板１６０５を備える。液滴アクチュエータ１６００はまた、液滴操作間隙１６２０を生じるように基礎基板１６０５から分離される上部基板１６１５を備える。液滴アクチュエータ１６００は、液滴操作間隙を通して充填流体を流動するための側方開口部１６２５を備える。側方開口部１６２５は、導管１６４０から液滴操作間隙に、および／または液滴操作間隙から導管１６４０に液体を流動するように構成されるマニホルド１６６０に結合されてもよい。マニホルド１６６０は、外部の充填流体源から、導管１６４０を通り、マニホルド１６６０を通り、液滴操作間隙へと液体経路を規定するように、導管１６４０および流動性の充填流体源（図示せず）を備えて構成されてもよい。マニホルド１６６０は、液滴操作間隙から、マニホルド１６６０を通り、導管１６４０を通り、流動性の充填流体の送達位置へと液体経路を規定するように、導管１６４０および流動性の充填流体の送達位置（図示せず）を備えて構成されてもよい。マニホルド１６６０は、直接または間接的に導管１６４０に結合するのに適切な開口部１６６２を備えてもよい。マニホルド１６６０は、直接または間接的に液滴アクチュエータに結合するのに適切な開口部１６６４を備えてもよい。理想的には、開口部１６６４および開口部１６２５は、液滴操作間隙１６２０における充填流体を完全に置き換えることを容易にするために液滴操作間隙１６２０の断面と実質的に同様の形状を有する。１つ以上の通気口は、再充填の間に液滴操作間隙１６２０内に導入され得る気泡が放出できるように、液滴アクチュエータ１６００の基板に、および／または基板間（例えばガスケット中）に存在してもよい。矢印ｘは、導管１６４０、マニホルド１６６０を通り、液滴操作間隙１６２０へ流れる流れの方向を示す。
図１７は、充填流体を置き換える流路が構成される液滴アクチュエータ１７００の断面図を示す。液滴アクチュエータ１７００は、液滴アクチュエータを通して流体を流動するための開口部が、液滴アクチュエータの底部に配置されることを除いて、液滴アクチュエータ１５００と同様である。この配置構成は、液滴操作間隙を通して液体を流動するための構成要素を備えるシステムにおいて液滴アクチュエータの取り付けを容易にするために有用である。液滴アクチュエータ１７００は、１つ以上の液滴操作を実施するのに構成される電極１７１０を含む基礎基板１７０５を備える。液滴アクチュエータ１７００はまた、液滴操作間隙１７２０を生じるために基礎基板１７０５から分離された上部基板１７１５を備える。ガスケット１７０７は液滴操作間隙を密閉する。液滴アクチュエータ１７００は、液滴操作間隙１７２０を通って充填流体を流動するための底開口部１７２５を備える。底開口部１７２５は、外部の充填流体源および／または充填流体の送達位置のための液体経路と結合する１つ以上の対応する調整具１７３５と適合するように構成される調整具１７３０を備えてもよい。一例として、適切なチップ−管の接続としては、ＮＡＮＯＰＯＲＴ（商標）アセンブリ（ＩＤＥＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）が挙げられる。１つ以上の調整具１７３５は、外部の充填流体源（図示せず）から、導管１７４０を通り、調整具１７３０および１７３５を通り、液滴操作間隙１７２０への液体経路を規定する導管１７４０と結合されてもよい。１つ以上の調整具１７３５は、液滴操作間隙１７２０から、調整具１７３０および１７３５を通り、導管１７４０を通り、外部の充填流体の送達位置（図示せず）への液体経路を規定する導管と結合されてもよい。
本発明の種々の態様において、このように充填流体は、充填流体源から、液体経路を通り、液滴操作間隙を通って流動し、かつ、第２の液体経路中の液滴操作間隙から流動性の充填流体の送達位置まで出ていく。このように、充填流体は、少なくとも部分的に置き換えられてもよい。液滴操作間隙を通る充填流体の流れは、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体と実質的に置き換えられてもよい。一部の場合において、充填流体は、液滴操作間隙中の充填流体を置き換えるのに十分な量で液滴操作間隙に流れてもよい。他の場合において、充填流体は、液滴操作間隙をフラッシュするために液滴操作によって流さてもよい。フラッシングの完了の際に、液滴操作間隙は、充填流体で充填されたままであり、操作しやすくなっている。特定の実施形態において、液滴操作間隙をフラッシュするのに使用される充填流体は、液滴操作間隙における清浄を高めるために加熱されてもよい。別の実施形態において、液滴操作間隙における汚染は、充填流体のフラッシングの間にモニターされてもよく、適切なレベルの清浄が達成されると、フラッシングは停止されてもよい。
本発明の方法は、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体の少なくとも約５０％を置き換えるために使用されてもよい。本発明の方法は、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体の少なくとも約７５％を置き換えるために使用されてもよい。本発明の方法は、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体の少なくとも約９０％を置き換えるために使用されてもよい。本発明の方法は、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体の少なくとも約９５％を置き換えるために使用されてもよい。本発明の方法は、液滴操作間隙に最初に存在する充填流体の少なくとも約９９％を置き換えるために使用されてもよい。
本発明の他の態様において、洗浄流体は、液滴アクチュエータを洗浄するために液滴操作間隙を通って流されてもよい。洗浄後、新鮮な充填流体が液滴操作間隙に流されてもよい。例えば、溶媒が、新鮮な充填流体を液滴操作間隙に流す前に、液滴アクチュエータを洗浄するために液滴操作間隙を通して流されてもよい。液滴操作間隙の表面を過度に損傷せずに充填流体を除去するのに適切である溶媒が、選択されてもよい。一部の場合において、液滴操作間隙を充填流体に再充填する前に、液滴アクチュエータ間隙を乾燥することが望まれてもよい。一部の場合において、空気などの気体が、液滴操作間隙を充填流体で再充填する前に、液滴操作間隙を乾燥するために、液滴操作間隙を通して流されてもよい。
種々の液体が、本発明の方法における洗浄流体として使用されてもよい。一態様において、選択され得る洗浄液体（その中で油および水の両方が可溶性である）は低沸点を有するものが良好な洗浄剤である。高沸点洗浄流体または洗浄流体成分もまた、使用されてもよい。一実施形態において、高沸点洗浄流体が使用され、その後、より低い沸点でリンスされる。冷却流体は、液滴アクチュエータを操作温度に戻すために、充填流体を充填する前に、液滴操作間隙を通して流されてもよい。
適切な洗浄液体の例としては、アセトン、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、およびそれらの成分の１つ以上を含む混合物などの極性液体が挙げられる。これらの溶媒の混合物もまた、使用されてもよい。水溶性シリコーン油誘導体もまた、使用されてもよい。水ベースの洗浄液体もまた、使用されてもよい。好ましくは、カートリッジは、水ベースの洗浄液体の使用後、再充填する前に乾燥される。多成分混合物もまた、使用されてもよい。一実施形態において、洗浄液体は、水溶性を有する１つ以上の成分および油溶性を有する１つ以上の成分を含む。洗浄流体はまた、種々の触媒または酵素を含んでもよい。例えば、特定の汚染物質を分解する酵素が含まれてもよい。一部の場合において、油は空気または水と置き換えられ、次いで、液滴操作間隙が充填流体で再充填される。
フラッシュアッセイにおいて、液滴輸送経路を洗浄するために誘因溶液を含む洗浄液滴を使用することは有用であり得る。基板を輸送するために使用されている電極経路は、同じ領域の一部または全てにわたって１つ以上の洗浄液滴を輸送することによって洗浄されてもよい。洗浄液滴はフラッシュ酵素を含んでもよい。例えば、洗浄液滴はルシフェラーゼまたはルシフェラーゼとＡＴＰを含んでもよい。一例として、アクリジニウムエステル（ＡＥ）が、本発明のフラッシュアッセイにおける化学発光標識として使用されてもよい。ＡＥシグナルは、誘因溶液の添加時に、典型的に約１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１秒未満で高い値まで急速に上昇する。シグナルは、典型的に約６０、３０、２０または１０秒未満で非常に低い値まで低下する。これにより、検出ループおよび検出スポットでの汚染が除去され得る。しかしながら、汚染物質は洗浄経路および同じ経路上で実施されるその後のアッセイに潜在的に影響を与える可能性があるＡＥで結合された遊離の二次抗体によるインキュベーション領域にさらに存在する場合がある。ＡＥで結合された抗体で汚染されている電極にわたるＡＥ誘因溶液の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の液滴を輸送することは、急速に減少する化学発光を生成し、実質的にＡＥ汚染を除去する。
種々の場合において洗浄流体は、酸性または塩基性、例えば高いｐＨに関してエタノール中の水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、あるいは低いｐＨに関して酢酸または希塩酸であってもよい。一実施形態において、水に対する溶解度を有する溶媒、続いて第１の溶媒に対する溶解度を有する液体で開始する、多段階の洗浄手順が与えられる。
加熱した溶媒が洗浄流体として使用されてもよい。温度は、液滴アクチュエータに対する過度な損傷を引き起こさずに、洗浄を高めるために選択されてもよい。好ましい温度は使用される物質に依存して変化する。一部の場合において、温度は、約３０℃〜約１２５℃、好ましくは約６０℃〜約１１５℃、より好ましくは約７５℃〜約１０５℃の範囲である。好ましい温度は、使用される物質に依存して変化する。ポリカーボネートの上部基板が使用される場合、現在、最大温度は１００℃近くである。ガラスの上部基板が使用される場合、最大温度は、例えば１５０℃以上のように非常に高くてもよい。
一部の場合において、１つ以上の液滴アクチュエータの表面はコーティングを備え、洗浄液体は、洗浄の間にコーティングの非常に薄い層を除去するように選択される。例えば、１つ以上の液滴アクチュエータの表面は疎水性コーティングを備え、洗浄液滴は、洗浄の間に疎水性コーティングの非常に薄い層を除去するように選択される。従って、洗浄液体として使用するために選択され得る液体は、疎水性コーティングに対して非常にわずかな溶解度を有する。例えば、疎水性コーティングはフッ素化ポリマーを含んでもよい。洗浄液体は、完全にフッ素化された溶媒または部分的にフッ素化された溶媒などのフッ素化溶媒を含んでもよい。洗浄液体は、非常に低い濃度で別の溶媒に分散される完全にフッ素化された溶媒を含んでもよい。洗浄液体は、他の有機溶媒に対する溶解度を有する部分的にフッ素化された液体を含んでもよい。洗浄液体はまた、既存の疎水性コーティング上にさらなる薄い疎水性コーティングを堆積させるように選択されてもよい。薄層を除去することによって、またはさらなる量の薄層を堆積させることによって、洗浄液体が疎水性コーティングを変化させるかに関わらず、いずれの場合においてもその効果は、疎水性コーティングをその元の状態まで「再び新しくする」ことである。
（７．２ 並行流路）
図１８は、本発明の液滴アクチュエータの一部の電極構成１８００を示す。電極構成１８００は、液滴アクチュエータの表面で液滴操作を実施するように構成される電極１８０５を備える。本発明の全ての電極構成と同様である電極構成１８００は、より広範囲の電極構成および／またはより広範囲のマイクロ流体ネットワークの一部として提供され得る。液滴アクチュエータは、例えば、単一のサンプル液滴（図示せず）または別の液体源から同一のサブサンプル液滴を分配することによって、一連の同一の反応液滴１８２０を用いて液滴操作表面で他の液滴操作を分配および実施するために使用されてもよい。液滴操作電極１８０５は、一連の液滴輸送経路１８０６を提供するように構成されてもよい。液滴操作電極１８０５は、反応液滴１８２０をいくつかの液滴輸送経路１８０６の１つに輸送するために使用されてもよい。
電極構成１８００はまた、加熱器および／またはヒートシンクなどの１つ以上の温度制御素子１８１０と結合されてもよい。温度制御素子１８１０は、液滴作動表面で液滴を加熱および／または冷却するのに適切な任意の方法で構成されてもよい。温度制御素子１８１０は、液滴操作表面で温度領域を規定するために使用されてもよい。液滴アクチュエータが、液滴操作を実施するための液滴操作間隙を形成するために離間した２つの基板を備える場合、温度制御素子１８１０は、液滴操作間隙内に温度領域を規定するように構成されてもよい。液滴操作間隙が、流動性の充填流体で充填される場合、温度制御素子１８１０は、液滴操作間隙内の充填流体の種々の領域内に温度領域を規定するように構成されてもよい。液滴操作輸送経路１８０６において、液滴は、１つ以上の温度制御素子１８１０によって規定される温度領域の中で、液滴操作電極１８０５によって媒介される液滴操作を用いて輸送されてもよい。
本発明の任意の実施形態はシステムの一部として構成されてもよい。例えば、システムは、本発明の任意の電極構成の電極の活性化を制御することによって、液滴アクチュエータで液滴操作を制御するコンピューターを備えてもよい。図１８の液滴アクチュエータを備えるシステムは、異なる所定数のサイクルについて、各経路における液滴をサイクルするようにプログラムされてもよい。検出は熱サイクル経路自体でなされてもよいか、または液滴は検出のために別の場所に輸送されてもよい。例示した実施形態において、液滴は、その液滴にわたってセンサを走査することによる検出のためにＡと印した経路に滞留される。各経路における熱サイクルが完了した場合に、検出がなされてもよい。あるいは、液滴の一部または全ては熱サイクル後に滞留され、センサは、Ａと印した経路に沿って次々に液滴を走査してもよい。他の適切な検出アプローチが本明細書に記載される。
図１９は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成１９００を示す。構成１９００は、液滴が温度制御素子１８１０から離れて滞留され得るように、経路１８０６が延長されていることを除いて、構成１８００および図１８と同様である。示した例において、上部の経路における液滴は５回のサイクルに供され、次の経路における液滴は１０回のサイクルに供されるなどで、底部までで液滴は３５回のサイクルに供される。任意の数の経路が設けられてもよく、各経路１８０６における液滴１８２０は、温度領域間で任意の数のサイクルの輸送に供されてもよい。所定数のサイクルの完了時に、各液滴は、検出に供され得る場合、Ａと印した経路に沿って、そのそれぞれの経路１８０６における位置まで輸送されてもよい。検出は、例えば液滴からのシグナルの感知を含む。シグナル強度は、液滴における増幅された核酸を定量化するために使用されてもよい。各液滴は、その所定数のサイクルの完了時に迅速に検出に供されてもよい。あるいは、液滴は滞留されて、検出のためのセンサによって後の時間に走査されてもよい。
図２０は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２０００を示す。電極構成２０００は、検出ウィンドウ２００５が、液滴が各経路１８０６から検出ウィンドウ内に輸送できるように配置される電極経路２０１０に沿って与えられることを除いて、概して図１９に示す構成１９００と同一である。検出ウィンドウは、液滴が検出のために輸送され得る任意の電極経路または任意の位置に配置されてもよい。図２０はまた、３つの温度制御素子１８１０を備える実施形態を示す。もちろん、任意の数の温度制御素子が使用されてもよい。
操作において、各液滴がその所定数のサイクルを完了すると、液滴は検出のための検出ウィンドウに輸送される。同様の実施形態において、各液滴がその所定数のサイクルを完了すると、液滴は滞留される。滞留は、液滴を所定の位置に輸送すること、および液滴をその位置に保存することを含む。その位置は、熱サイクル領域に対して液滴アクチュエータの別の領域であってもよい。その後、各液滴は検出のための検出ウィンドウに輸送される。センサは、検出ウィンドウに配置される液滴からシグナルを検出するように配置されてもよい。センサは、各液滴の１つ以上のシグナルを定量化するのに適切であり得る。検出ウィンドウは物理的ウィンドウを必要としない。その最も簡単な形態において、それは単にセンサの近くの領域であり、ウィンドウ内に部分的または完全に配置される液滴はセンサによる検出に感受性がある。
一例において、温度領域はＰＣＲ混合物などの核酸増幅混合物の熱サイクルを実施するように規定される。増幅液滴は、サンプルに潜在的に存在する標的核酸を増幅するのに適切な試薬とともに核酸サンプルを含む。各々の経路は異なる数のサイクルについて熱サイクルに供される。液滴が所定数のサイクルに到達すると、その液滴は、例えば本明細書に記載される種々のスキームに従って、検出に供されてもよい。例えば、液滴は、増幅産物の検出のためのセンサに輸送されてもよい。
一部の場合において、液滴のセットが連続して次々に熱サイクルされる。他の場合において、セット内の液滴が連続して熱サイクルされ、セット外の液滴が並行して熱サイクルされる。各セットは１つ以上の液滴を含んでもよい。適切なデータが、所定の許容可能な程度の確実性で開始サンプルに存在する増幅産物を定量化するために収集されると、熱サイクル反応は終了する。標的核酸がサンプルに存在しないか、または増幅されていないことが統計的に明らかである場合、熱サイクルを停止してもよい。増幅反応が、例えば異なる試薬または異なる液滴アクチュエータを用いて再び作動され得るように、新しいセットのサブサンプルの液滴がサンプルから得られてもよい。他の場合において、熱サイクル液滴のセットからの熱サイクルエンドポイントのセットが十分な曲線を示す場合、生成物を含む（曲線に従う）はずの１つ以上のサブサンプル液滴における生成物の欠如を示すが、新しいサブサンプルの液滴が分配され、熱サイクルプロトコルが、一部または全てのデータポイントについて繰り返されてもよい。
並行アッセイとして図１８〜２０に示すようなアッセイにおいて、複数の液滴が並行に熱サイクルされる。言い換えれば、特定のグループにおける全てのサブサンプルの液滴は、同時に同じ熱領域に存在する。しかしながら、より簡単な実施形態において、全てまたは１つ以上のサブセットの液滴が、連続して熱サイクルされてもよいことは理解されるだろう。一部の場合において、サブセットの各メンバーは、以前のサブセットのメンバーの増幅の完了後に増幅されるが、異なるサブセットが並行して熱サイクルされる。
例えば、単一の経路の熱サイクラーが設けられてもよい。第１の液滴は、５回、経路で熱サイクルされ、次いで検出に供されてもよく、第２の液滴は、１０回、熱サイクルされ、次いで検出に供されてもよいなどである。十分なデータポイントのセットが、曲線を規定するために得られるまで、プロセスは繰り返されてもよく、その曲線から、サンプルにおける標的核酸の量が計算されてもよい。同様に、第１の液滴は３５回、第２の液滴は３０回、第３の液滴は２５回などで熱サイクルされるなどで、第１の液滴は５回までサイクルされる。あるいは、全ての液滴は滞留されて、後の時間に連続または同時検出に供されてもよい。曲線はデータポイントから生成されることができ、サンプルにおける標的核酸の量はその曲線に基づいて計算され得る。一実施形態において、標的核酸が第１の液滴に検出される場合に限り、長いサイクルを最初に、次に短いサイクルの液滴を実施することは有用であり得る。
同様の実施形態において、多くの熱サイクル経路は、熱サイクルのために選択される液滴の総数より少なく与えられてもよい。サブサンプルの液滴はセット内で処理されてもよい。セット内の各液滴は、ほぼ並行して熱サイクルされてもよいが、複数のセットが連続して熱サイクルされてもよい。例えば、５つの経路を備える液滴アクチュエータが、５セットにおいて３５のサブサンプルの液滴、１、２、３．．．３５を処理するために使用されてもよい。例えば、第１のセットの５つの液滴は、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクルおよび５サイクルについてのサブサンプルの液滴を含んでもよく、第２のセットの５つの液滴は、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクルおよび１０サイクルについてのサブサンプルの液滴を処理してもよく、その後のセットは、１１〜１５サイクル、１６〜２０サイクル、２１〜２５サイクル、２６〜３０サイクルなどでサブサンプルの液滴を処理してもよい。
代替の実施形態において、第１のセットの５つの液滴は、５、１５、２５、３５および４０サイクルについてのサブサンプルの液滴を含んでもよく、第２のセットの５つの液滴は、８、１０、２０、３０および３８サンプルについてのサブサンプルの液滴を含んでもよい。他のセットは、以前に実行した数の間のサイクル数で満たしてもよい。さらに、データはセットの間で解析されてもよく、十分なデータが、所定の範囲の統計的確実性までサンプル中の標的核酸を定量化するために得られると、サイクルは終了してもよい。同様に、標的核酸が存在しないか、またはサブサンプルの液滴中で増幅されないことが明らかな場合、サイクルは終了してもよい。後者の場合において、熱サイクルは、例えば異なる液滴アクチュエータおよび／または異なる試薬を用いて繰り返されてもよい。
並行流路のサイクル技術において、全ての経路がサブサンプルの液滴に負荷されてもよい。液滴は、一体となって移動されてもよく、液滴が移動するのに正確な一体化が必要とされなくてもよい。例えば、一部の液滴は反対方向に移動されてもよい。液滴における増幅反応は、概して、異なる回数で停止されるが、一部の液滴は同じ回数サイクルされ、同時に停止されて、繰り返されてもよいことは理解されるだろう。反応は、温度制御領域（例えば図１８に示す）において停止されてもよいか、または温度制御領域（図１９および２０に示す）から離れた位置に輸送されてもよい。液滴が検出領域にわたって輸送される場合、より少ないサイクル数を最初に受けて、続いて、より多いサイクル数を受けた液滴を輸送することは有用であり得る。このアプローチは、高濃度の標的核酸を含む液滴によって引き起こされる可能性がより高い、二次汚染の結果を防止または軽減するのに役立つ。
並行流路の熱サイクル技術の種々の実施形態において、液滴が負荷され、滞留されてもよい。次いで、熱サイクルが同時に開始され、各サブセットの液滴について各液滴がその所定数のサイクルを終える場合、連続して終了されてもよい。別の実施形態において、液滴は負荷され、滞留されてもよく、各液滴または各サブセットの液滴についての熱サイクルは、連続して開始され、同時に終了されてもよい。プロトコルにおいて、１つ以上のサブセットの液滴がサブセットと一緒に開始し、連続して終了するが、液滴の他のサブセットは、連続して開始し、サブセットがまた、本発明の範囲内で可能である場合、それらの熱サイクルを完了する。さらに別の実施形態において、液滴または液滴のサブセットは、その液滴が負荷される場合、連続して負荷され、連続して開始されてもよく、液滴が熱サイクルを例えば連続してまたはグループにおいて完了する場合、終了してもよい。さらに別の実施形態において、液滴は分配され、並行して負荷される。
別の実施形態において、液滴は、同時に熱サイクルを開始し、異なる数のサイクルを同時に完了することができる。このアプローチは、熱領域内または熱領域間の輸送速度および／または滞留時間を調整することを含み、その結果、液滴はそれらの異なる数のサイクルを同時に完了する。同様の実施形態において、液滴の種々のサブセットは、それらの異なる数のサイクルを同時に完了する。例えば、サイクル数１〜５は同時に完了されてもよく、サイクル数６〜１０は同時に完了されてもよいなどである。
さらに別の実施形態において、滞留時間は、個々の液滴の熱サイクルプロファイル内で異なるサイクル数で異なってもよい。例えば、初期サイクルはよりゆっくりでもよいが、後のサイクルはより速くてもよいか、またはその逆でもよい。さらに例示するために、液滴は３５回サイクルされてもよく、各サイクルは前のサイクルよりわずかに速くてもよい。あるいは別の例として、液滴は３５回サイクルされてもよく、サイクル１〜１０は第１の速度で開始されてもよいが、サイクル１０〜２０は第２の速度で開始されるなどである。
別の実施形態において、複数のサイクルが効果的な経路の使用のために経路の中で分配されてもよい。例えば、４つの利用可能な経路を備える熱サイクル液滴アクチュエータにおいて、液滴は以下のようにサイクルされてもよい。
・経路１：７
・経路２：１，６
・経路３：２，５
・経路４：３，４
このように、経路１において、単一の液滴が７回サイクルされる。経路２において、第１の液滴は１回サイクルされ、続いて第２の液滴は６回サイクルされる。経路３において、第１の液滴は２回サイクルされ、第２の液滴は５回サイクルされる。最後に、経路４において、第１の液滴は３回サイクルされ、第２の液滴は４回サイクルされる。各経路は正確に７サイクル実施し、経路空間が効率的に利用され、液滴の全てをサイクルするのに必要とされる全時間を最小化する。さらに、例示において、少ないサイクル数を受けた液滴が最初に処理され、続いて多いサイクル数を受けた液滴が処理される。この方法において、少ない数のコピーの液滴は、同じ液滴アクチュエータの実際の場所で多い数のコピーの液滴に先行する。このアプローチは、第１の液滴によって残される残留物によって引き起こされる二次汚染の可能性を減少させる。もちろん、これは単純な例であり、本明細書を考慮して当業者によって理解されるように、任意の数の経路が任意の数の液滴とともに使用され、同様に組み合わされてもよい。
（７．３ 曲がっている流路）
図２１は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２１００を示す。電極構成２１００は、供給源（示さず）からの液滴１８１５が、２以上の温度領域の間の前後で電極経路に沿って輸送できる方法で構成される電極１８０５を備える電極経路２１０５を備える。以前の例のように、温度領域は、加熱器またはヒートシンクなどの温度制御素子１８１０によって規定される。液滴１８１５は、温度制御素子１８１０によって規定される温度領域の間で前後に曲がっているか、または巻いている電極経路２１０５に沿って蛇行する。他の実施形態のように、液滴アクチュエータは、液滴操作を制御するシステムの一部として与えられてもよい。そのシステムは、熱サイクル領域を通して、検出のための位置に液滴を輸送するようにプログラムされてもよい。
図２２は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２２００を示す。電極構成２２００は、図２１の電極構成２１００と同様である。しかしながら、電極構成２２００は、検出のための熱サイクル領域から離れた位置に液滴を輸送するための電極経路２２０５を備える。電極経路２２０５は、曲がっている電極経路２００５から液滴を輸送するように構成される。
各液滴は所定数のサイクルに関して温度領域を通してサイクルされてもよく、次いで検出のために離れた位置に輸送されてもよい。液滴は滞留されてもよく、次いでセンサによって走査されてもよい。例えば、液滴は線Ａに沿って滞留されてもよく、センサは液滴を走査できる。あるいは、液滴は検出のために検出ウィンドウ２２２０に輸送されてもよい。センサは検出ウィンドウに配置される液滴を検出するように配置されてもよい。センサは、各液滴からシグナルを検出するのに適切であり得る。別の実施形態において、ＣＣＤカメラまたはＬＥＤ−フォトダイオード対のアレイなどのアレイ検出器が、複数の液滴を同時に検出するために使用されてもよい。
このように、一例において、ＰＣＲ混合物などの核酸増幅混合物を含む液滴１８１５、および標的核酸を潜在的に含むサンプルが、電極１８０５によって規定される曲がっている経路２２０５に沿って分配され、輸送されてもよい。液滴１８１５は、温度制御素子１８１０によって規定される温度領域の間の前後を通る曲がっている経路２２０５に沿って液滴１８１５を輸送することによって熱サイクルされてもよい。
各液滴は、所定数の回数、サイクルされてもよく、各液滴がその所定数のサイクルを完了する場合、各液滴は検出のための熱サイクル温度領域から離れた位置に輸送されてもよい。別の実施形態において、各液滴がその所定数のサイクルを完了する場合、各液滴は、熱サイクル温度領域の１つに、または検出のための液滴を維持するのに適切な温度を有する別の熱サイクル温度領域に輸送されてもよい。種々の実施形態において、液滴は滞留され、センサによって走査されてもよい。別の実施形態において、各液滴は検出ウィンドウに輸送されてもよい。このプロセスは液滴のセットを生成し、その各々は、所定の回数、熱サイクルされる。例えば、第１の液滴は５回熱サイクルされてもよく、第２の液滴は１０回熱サイクルされてもよく、第４の液滴は１５回熱サイクルされてもよい、などである。他の例のように、このプロセスは、標的物質を定量化するために適切なデータが得られると、停止されてもよい。
曲がっている経路は、本質的に、温度領域間の前後またはジグザグに曲がっているか、または蛇行している任意の種々の形状をとってもよい。例えば、電極経路は、図４および６に示すように直角に沿って前後に蛇行してもよい。その経路は電極のより大きなアレイの一部を形成してもよく、その電極から曲がっているか、または蛇行している経路が選択されてもよい。曲がっている経路は、ジグザグ形状または曲線形状をとってもよい。曲がっている経路の各曲がり角はほぼ同じサイズであってもよいか、または曲がり角は異なるサイズであってもよい。
液滴は経路の一端で曲がっている経路に継続的に注ぎ込まれてもよく、他端まで流れてもよい。一部の実施形態において、電極経路は、液滴を曲がっている経路上に、または曲がっている経路外に導くように配置されてもよい。例えば、一実施形態において、経路のあらゆる湾曲または曲がり角は、経路から液滴を取り除くため、および／または経路まで液滴を導入するための少なくとも１つの利用可能な電極経路を備える。一部の場合において、液滴は、利用可能な電極経路を通して経路に沿った異なる点で経路に供給されてもよい。一部の場合において、液滴は、利用可能な電極経路を通して経路に沿った異なる点で経路から除去されてもよい。他の実施形態において、液滴は、上部の基板、底部の基板、および／または上部基板と底基板との間の液滴操作間隙内の横方向の開口部などの任意の液滴アクチュエータ基板の開口部を通して経路上に導入され、および／または経路から除去されてもよい。
一部の実施形態において、反応を同時に行うことは有用であり得る。そのような実施形態において、液滴は輸送サイクル時間と等しい速度で供給されてもよい。この実施形態において、進行中の反応の数は各輸送サイクルにて１つ増加する。この実施形態において、同時に行うとは、全ての液滴が同時に熱サイクルの同じ部分にあることを意味する。液滴の同時に行うことにより、輸送速度を変更させることが可能となる。液滴は、同時に熱サイクルの同じ部分内で停止され、インキュベートされてもよい。
種々の実施形態において、液滴が、高サイクル数の液滴、すなわち高濃度の標的核酸を有すると予想され得る液滴によって以前に占められた電極を横切らないことを確実にすることは有用であり得る。
一部の実施形態において、液滴の検出は曲がっている経路上の所定の位置で起こる。他の実施形態において、液滴は検出のために他の場所に輸送される。一部の実施形態において、検出のポイントまで曲がっている経路に沿って液滴を輸送することは有用であり得る。そのような実施形態において、一旦、全ての液滴の熱サイクルが完了すると、温度制御素子は、継続した熱サイクルを必要とせず、曲がっている電極経路に沿って液滴の輸送を可能にするように調節されてもよい。例えば、核酸変性加熱器は、最も低い起こり得る核酸変性温度以下までその温度を低下させることができる。この方法において、液滴は、増幅プロセスを継続せずに曲がっている経路に沿って蛇行し続けてもよい。キャリーオーバーが懸念される場合、液滴の流れの方向を反転させることが有用であり得る。すなわち、最初に少ないサイクル数を有する液滴を除去し、次に多いサイクル数を有する液滴を除去する。この方法において、液滴は、以前に受け入れられた多いサイクル数の液滴を有する電極を通過しない。
別の実施形態において、反応は、それらが、増幅しない熱サイクル温度により輸送され続けることができるように不活性化されてもよい。あるいは、上記のように、液滴は、利用可能な電極経路を通して、検出のための液滴アクチュエータ上の別の位置に輸送されてもよい。
図２３は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２３００を示す。電極構成２３００は、温度制御素子１８１０によって規定される各熱領域内の曲がっている電極経路が、その領域における液滴の保持時間を長くまたは短くするために、どのように長く、または短くすることができるかを示す。
例えば、一実施形態において、熱領域における曲がっている経路の曲がり角の長さ（すなわち熱領域における電極の数）は、液滴の進行方向において徐々に短くなってもよく、それによって、液滴が、電極から電極まで一定の速度で経路に沿って輸送される場合、サイクルは加速する。同様に、熱領域における曲がっている経路の曲がり角の長さ（すなわち、熱領域における電極の数）は、液滴の進行方向において徐々に長くなってもよく、それによって、液滴が電極から電極まで一定の速度で経路に沿って輸送される場合、サイクルは減速する。別の実施形態において、熱領域における曲がっている経路の曲がり角の長さ（すなわち熱領域における電極の数）は、第１のサイクルなどの特定のサイクル数にてより長いインキュベーション時間を与えるように変化させてもよい。
従って、液滴は、２つの温度領域間の曲がっている経路に継続的に供給されてもよく、固定および一定の速度で輸送されてもよい。温度領域における滞留時間は、温度領域を通過するために横切らなければならない液滴の電極の数によって決定されてもよい。この実施形態において、異なる液滴が同時に温度サイクルの異なる段階で存在することができるという意味において、液滴は熱的に同時に行われなくてもよい。この実施形態は、実際の場所をより少なくする方法で液滴アクチュエータ上に電極を配置することによって液滴アクチュエータのサイズを減少させるのに有用であり得る。
本明細書に記載される曲がっている電極構成または他の流路の構成は、概して、２つの温度領域を有するように例示されているが、任意の数の温度領域を有してもよいこともまた、留意されるべきである。
図２４は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２４００を示す。電極構成２４００は曲がっている経路２４２５を備える実施形態を示し、曲がっている経路２４２５の１つ以上の曲がり角はアクセス経路２４２０を備える。例示した実施形態において、アクセス経路２４２０は、曲がっている経路２４２５から、温度制御素子２４０５によって規定される温度制御領域に液滴を輸送するように構成される。温度制御素子２４０５は、例えば、検出前に増幅した液滴を維持するように構成されてもよい。例えば、液滴は、室温または検出前に液滴成分を保存するために選択された温度で維持されてもよい。このように、操作において、一連の液滴は、熱領域１８１０間に液滴を輸送するために長い曲がっている経路２４２５に輸送されてもよい。各液滴に関して、所定数のサイクルが達成されると、液滴はアクセス経路２４２０を通して曲がっている経路２４２５から外側へ輸送されてもよく、検出のため、または未検出物を保持するための保存領域に輸送されてもよい。
図２５は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２５００を示す。電極構成２５００は、構成２５００が、電極の活性化を必要とせずに、検出前に液滴を保存するための滞留領域２５０５を備えるということを除いて、図２４の電極構成２４００と同様である。滞留領域２５０５は、例えば、種々の化学および／または物理的特性により規定されてもよい。例えば、滞留領域２５０５は、液滴操作間隙内または上部の基板または底部の基板（例えば障壁、壁、くぼみおよび／または突起）の物理的特性、および親水性領域などの化学特性により規定されてもよい。物理および／または化学的特性は、検出の間および／または検出に係る間に、所定の場所に液滴１８１５を保持するために共同してもよい。このように、操作において、一連の液滴は、熱領域（図示せず）の間に液滴を輸送するために長い曲がっている経路２４２５に輸送されてもよい。各液滴１８１５に関して、所定数のサイクルが達成されると、液滴１８１５は、アクセス経路２４２０を通して曲がっている経路２４２５から外側に輸送され、未検出物を保持するための滞留領域２５０５に輸送されてもよい。
（７．４ ループ流路）
図２６は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２６００を示す。電極構成２６００は電極ループ２６０５を形成するように配置される電極１８０５を備える。液滴１８１５は、熱サイクルを行うために熱領域を通ってループ中の電極経路に沿って輸送される。液滴は、ループに侵入し、所定の回数、ループの周りを回ることができ、次いでループから出ていく。入口および出口は、例えば、電極経路（図示せず）にアクセスすることによって、および／または液滴アクチュエータの外部から１つ以上の開口部を通して（例えば上部または底部の基板あるいは液滴アクチュエータ内の任意の他の経路を通して）与えられてもよい。
輸送は一定であってもよい。すなわち、液滴は、一定の速度でループの周りを継続的に移動するか、または液滴は、異なる速度だが、実質的に同一の平均速度で移動することができる。一定の輸送の実施形態に関して、電極の配置は、各熱領域における必要な滞留時間を規定するように構成されてもよい。輸送は周期的であってもよい。すなわち、液滴は、一定の期間、熱領域に保持されてもよく、次いでループを通して他の熱領域に輸送されてもよい。
ループは様々な液滴を効率的に収容でき、必要な場合、熱サイクルプロトコルの一部または全プロトコルについての最大数の液滴を負荷できる。ループの周りの液滴の輸送は、一方向であってもよいか、または二方向であってもよい（すなわち液滴輸送の方向は可逆的であってもよい）。検出はループ自体でなされてもよいか、または液滴は検出のためのループから離れた位置に輸送されてもよい。一定の循環は、液滴内の混合および熱均一性を増加でき、同じ経路を通る各液滴の循環は、熱領域内の空間の温度変化に起因する変動性を減少できる。
図２７は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２７００を示す。電極構成２７００は複数の電極経路ループ２７０５を備える。電極構成２７００はまた、電極経路ループ２７０５上に、および／または電極経路ループ２７０５から液滴を輸送するためのアクセス電極経路２７１０を備える。熱サイクルプロトコルは１つ以上のループ２７０５を備えてもよい。例えば、一連の４つのループ２７０５は、複数の液滴が各ループでサイクルされる熱サイクルプロトコルを実施するために使用されてもよい。一般的に、液滴は、ループ上の１または２の空の電極部位によって分離されるべきであり、それによって、各ループ上の液滴の最大数は１／２ｎまたは１／３ｎと等しく、ここでｎはループにおける電極の総数であり、ｎはループにおける電極の数である。検出はリアルタイムであってもよいか、またはサイクルの各々からのエンドポイントデータは、サンプルにおける産物を定量化するために使用される曲線を規定するように使用されてもよい。
図２８は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２８００を示す。電極構成２８００は電極経路ループ２８０５、および電極経路サブループ２８１０を備える。電極経路サブループ２８１０は、熱領域における液滴のための保持領域を与えるように構成される。構成２８１０および同様の構成において、プロトコルが実行でき、ここで、１つ以上の液滴は、輸送速度のみに基づいた有効な滞留時間より長い一定の期間、熱領域内に維持されることを必要とする。ループ２８１０の電極経路は、分岐構造または他の種類のループと置き換えられてもよいことは理解されるだろう。
ループが存在する場合、特定の液滴がアクセスされるまで、保存がサブループ２８１０の周りに液滴を回転させることによってなされてもよい。次いで、特定の液滴は、電極経路ループ２８０５を通して他の熱領域に輸送されてもよい。他の熱領域において、特定の液滴は、ループ上に保存されてもよいか、またはループを通過し、出発熱領域に戻るように方向付けられてもよい。電極経路ループ２８０５および電極経路サブループ２８１０の周りの移動は、一方向であってもよいか、または二方向であってもよい。図１８〜２０に例示されるような直線状の電極経路を備える他の実施形態もまた、熱領域内にループ電極経路または分岐電極経路を備えてもよいこともまた、理解されるだろう。
（７．５ 等分している流路サイクル）
図２９は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成２９００を示す。電極構成２９００は熱サイクルの流路の構成を示し、ここで、小液滴は検出のためのより大きな液滴から分裂される。電極経路２９００は、熱制御素子１１０によって規定される熱領域の間の前後に熱サイクル液滴２９１０を輸送するように構成される電極２９０７を備える第１の電極経路２９０５を備える。電極経路２９０５は、本明細書に記載されるような１つ以上の電極経路ループおよび／または曲がっている流路の電極配置と置き換えられてもよいことは理解されるだろう。電極構成２９００はまた、熱サイクル液滴２９１０から小液滴２９１２を分配するように構成される電極２９１７を備える第２の電極経路２９１５を備える。電極２９０７は、概して、電極２９１７より大きく、従って、比較的大きな体積の液滴２９１０を支持し、その液滴２９１０から複数の小さな液滴の小液滴２９１２が分配されてもよい。電極経路Ａは、熱サイクルの間の液滴２９１０が、熱制御素子１８１０によって規定される熱領域の間に輸送されることを示す。電極経路Ｂは操作を分配する部分を示し、ここで、液滴２９１０は、電極経路２９１５に近接する電極経路２９０５の電極上に位置する。電極経路２９１５上の電極２９１７は活性化され、それによって、液滴２９１０から細長い延長部の形成を引き起こす。電極経路Ｃは、電極経路２９１５上の小液滴２９１２の形成を引き起こすための１つ以上の中間電極２９１７の不活性化を示す。小液滴２９１２は検出に供されてもよく、ここで、小液滴２９１２は形成され、および／または検出のために離れて輸送されてもよい。
一般的に、等分している流路アプローチにおいて、熱サイクル液滴２９１０のサイズは、検出のために取り除かれる小液滴２９１２のサイズの数倍である。一部の実施形態において、新しい液滴が、検出のための小液滴の除去後、熱サイクルしている液滴に追加されてもよい。例えば、追加された液滴は、熱サイクル反応のためのバッファーまたは１つ以上のさらなる試薬を含んでもよい。この方法において、熱サイクル液滴は一定の体積で維持されてもよい。図２９に示す実施形態において、熱サイクル液滴２９１０由来の小液滴から分配するために使用される電極２９１７は、より小さい小液滴２９１２を収容するために、熱サイクル電極２９０７より小さい。しかしながら、代替の構成において、小液滴から分配するために使用される液滴は、熱サイクル液滴を輸送するために使用される液滴と同じサイズであってもよい。一部の場合において、熱サイクル液滴は、細長いスラグ形状の液滴として輸送されてもよく、小液滴は、例えばスラグの下にある中間電極を不活性化することによってスラグ形状の液滴の端部から分配されてもよい。
関連したアプローチにおいて、サンプル液滴のセットが熱サイクルされ、小液滴が各サイクル後、そのセットの１つのメンバーから除去される。このアプローチにおいて、セットにｎのサンプル液滴が存在する場合、小液滴はｎサイクル毎に液滴から除去されてもよい。このアプローチは、より小さい種類の液滴サイズを用いて熱サイクルプロトコルを支持するという利点を有する。例えば、４倍数の液滴の１０の並行反応が、４０の熱サイクルのエンドポイントを与えるために使用されてもよい。
別の関連した実施形態において、より大きな液滴が、上記のように熱サイクルされ得るより小さな液滴に分裂される前に、数回、熱サイクルされてもよい。このアプローチは、複数の小液滴の熱サイクルを含む本明細書に記載される任意の実施形態において有用であり得る。この方法において、産物の開始濃度（例えば核酸産物）が規定されてもよく、それによって、各々の小液滴は、小液滴における増幅を確実にするための十分な産物を含む。従って、本発明は、電極の複数のパッドが、図２９に示す電極経路２９０５および２９１５の結合と同様の方法で互いに結合される、種々の実施形態を含む。例えば、一実施形態において、電極経路には、大きな電極を有する第１の経路と、中間のサイズの電極を有する第２の経路と、小さなサイズの電極を有する第３の経路が備えられる。別の例として、配置は、大きなサイズの電極を有する第１の電極経路を備えてもよい。この第１の電極経路は、同様のサイズの電極を有する２つ以上の第２の電極経路と結合されてもよい。第２の電極経路の各々は、さらに小さなサイズの電極を有する１つ以上の第３の電極経路と結合されてもよい。最初に、大きな液滴は第１の電極経路上で熱サイクルされ、次いで２つ以上の第２の電極経路上に分配されてもよい。２つ以上の第２の電極経路から、液滴は、検出のための１つ以上の第３の電極経路上に分配されてもよい。第２の電極経路上の液滴は熱サイクルされてもよく、続いて各々の所定数の熱サイクルがされ、小液滴は検出のための１つ以上の第３の電極経路上に分配されてもよい。
（７．６ バッチサイクル）
一実施形態において、本発明は一連の検出バッチ熱サイクル技術を与える。このアプローチにおいて、サブサンプル液滴はサンプルから生成され、温度制御領域に配置されてもよい。温度制御素子は、所定の熱サイクルプロトコルに従って温度制御領域において温度をサイクルすることができる。１つの液滴は、所定数のサイクル毎の後に検出されてもよい。このように、例えば一実施形態において、異なる液滴が各サイクルの後に検出される。この方法において、各液滴は一度のみ検出に供される。データは、サンプルに存在する標的物質を定量化するのに適切な曲線を生成するために使用されてもよい。
図３０は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成３０００を示す。液滴アクチュエータ３０００は電極アレイ３００５と、電極アレイ３００５に配置されるサブサンプル液滴３０１０を備える。サブサンプル液滴３０１０は、単一のサンプル液滴（図示せず）から分配されてもよい。サブサンプル液滴３０１０は、（存在する場合）液滴操作間隙の外部まで電極経路（図示せず）または多くの開口部（図示せず）のうちの１つを通して電極アレイ３００５上に負荷されてもよい。
１つ以上の熱サイクル温度制御素子３０１５は、例えばアレイの下および／またはアレイの上にある、アレイ３００５に結合される。熱サイクル温度制御素子３０１５は、電極アレイ３００５上の熱サイクル液滴３０１０を加熱し、能動的または受動的に冷却する。熱サイクルの間、センサは液滴３０１０からの信号を検出するために液滴３０１０上を通過する。例えばセンサは、各サイクル後、単一の液滴を検出するのに十分な速度で液滴３０１０上を通過してもよい。一般的に、センサは、ｎサイクル毎に単一の液滴を検出するのに十分な速度で液滴３０１０を通過してもよい。ここで、ｎは、所定のレベルの統計的有意性にて液滴中の標的産物を定量化するのに有用な曲線を生成するために十分なエンドポイントを達成するのに選択される数である。代替の実施形態において、２つ以上のセンサが使用されてもよい。さらに別の実施形態において、ＣＣＤカメラなどのアレイ検出器、またはＬＥＤ−フォトダイオード対のアレイが、複数の液滴を同時に検出するために使用されてもよい。
同様の実施形態において、サブサンプル液滴は温度制御領域に配置されるサンプルから生成されてもよい。温度制御素子は、所定の熱サイクルプロトコルに従って温度制御領域において温度をサイクルすることができる。熱サイクルの各ｎラウンド後、１つ以上の液滴が検出のための温度制御領域から離れた位置に輸送されてもよい。例えば、輸送は電極経路に沿って液滴操作によって実施されてもよい。液滴は、それらが温度制御領域から離れるか、またはそれらが後の時間での解析のために滞留され得る場合、検出されてもよい。
関連したアプローチにおいて、液滴は、ｎ回の熱サイクル毎の時間に１回以上、熱サイクルユニット上に連続して輸送されてもよい。次いで、検出は最後のサイクルの後に実施されてもよい。例えば、液滴のアレイは、連続して、同時にまたは最後のサイクルの後にサブセットにおいて画像化されてもよく、検出からのデータは、元のサンプル中の標的産物を定量化するための曲線を生成するために使用されてもよい。
図３１は、本発明の別の電極構成３１００を示し、ここで、サンプル液滴は熱サイクルされ、ｎサイクル毎の後、サブサンプルの液滴は分配され、検出のために離れた位置に輸送される。例示した実施形態において、リザーバー３１０５はガスケット３１１０によって規定される。温度制御素子３１１５はリザーバー３１０５の下部にある。ガスケット３１１０における開口部３１２０は、リザーバー３１０５から離れてサブサンプル液滴３１３０を輸送するための液体経路を与える。電極経路３１２５は、サンプル液滴３１３５からサブサンプル液滴３１３０を分配するための手段を与える。分配されたサブサンプル液滴３１３０は検出に供されてもよい。例えば、それらは、形成時にすぐ検出に供されてもよいか、またはそれらは後の時間での検出のために離れた位置に輸送されてもよい。
同様の実施形態において、液滴３１３５は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙に対して外側のリザーバーに与えられてもよい。液滴３１３５はリザーバー内で熱サイクルされてもよく、小液滴３１３０は、任意の種々の液滴分配技術を用いてリザーバーから液滴操作間隙内に分配されてもよい。例えばリザーバーは、リザーバーから、１つ以上の電極に近接する液滴操作間隙に延びる液体経路に結合されてもよい。電極は、熱サイクルの各ｎサイクルの後、液滴を液滴操作間隙に分配するために使用されてもよい。次いで、分配された液滴は、さらなるアッセイ工程および／または検出に供されてもよい。
図３２は、図３１の電極構成３１００と同様の実施形態を示す。電極構成３２００は、小液滴３１３０が、どのように、離れた位置に輸送され、配置され、続いて検出器によって操作され得るかを示す。例えば、検出器は、Ａと印した経路などの経路に沿って連続して各液滴を検出してもよい。あるいは、本明細書に記載されるこの実施形態および他の実施形態において、全ての液滴は、例えばＣＣＤカメラまたはＬＥＤ−フォトダイオード対のアレイなどのアレイ検出器を用いて一緒に画像化されてもよい。
（７．７ 反応クエンチング技術）
図３３は、電極構成３３００が、反応液滴３３０５を配置するために使用される実施形態を示す。反応液滴３３０５は、本明細書の特定の他の実施例に示されるように、熱サイクル液滴（例えば増幅準備液滴）であってもよいか、または反応が経時的に生じる一部の他の反応であってもよい。温度制御素子３３１０は熱サイクルまたは反応液滴３３０５の温度制御を与えられてもよい。反応クエンチング液滴３３１５は、反応液滴３３０５と接触するように輸送されてもよい。反応クエンチング液滴３３１５は、反応液滴３３０５において生じる反応をクエンチ、または後でクエンチするための１つ以上の試薬を含んでもよい。一実施形態において、反応液滴３３０５における反応は実質的に同時に開始され、反応液滴３３０５は連続して反応クエンチング液滴３３１５と混合される。クエンチング後、混合された液滴は、反応速度論の曲線の指標を生成するためのさらなるアッセイ工程および／または検出に供されてもよい。別の実施形態において、反応液滴３３０５における反応は連続して開始され、反応液滴３３０５は反応クエンチング液滴３３１５と実質的に同時に混合される。同様に、クエンチング後、混合された液滴は、反応速度論の曲線の指標を生成するためのさらなるアッセイ工程および／または検出に供されてもよい。中間プロセスにおいて、反応は連続して開始され、連続してクエンチされる。
反応液滴が反応クエンチング液滴と混合される本発明の任意の種々の実施形態において、反応液滴は反応クエンチング液滴と接触するように輸送されてもよく、反応クエンチング液滴は反応液滴と接触するように輸送されてもよく、ならびに／または反応液滴および反応クエンチング液滴は互いに輸送されてもよい。クエンチング液滴は必要な場合、送達されてもよいか、または反応液滴とともに配置され、所定の計時プロトコルに従って混合されてもよい。
熱サイクル増幅プロトコルにおけるこのアプローチの１つの利点は、クエンチ後、液滴が熱サイクルに供され続け得るが、増幅はクエンチング液滴との混合の結果として停止することである。
関連した実施形態において、出願人は、核酸増幅などの特定の反応が、静電場を用いてクエンチされ得ることを発見した。例えば、反応は、電圧信号を下部の電極または液滴に近接する別の電極に印加することによって停止されてもよい。印加される電圧信号は、反応を停止または実質的に停止するのに十分であるように選択されてもよい。例えば、増幅反応を停止するのに必要とされる電圧信号は、１つの電極から次の電極に液滴輸送を実施するのに必要とされる電圧信号に関する電圧信号を単に維持されてもよい。従って、例えば核酸増幅反応は、核酸増幅液滴の輸送を停止させ、反応を停止させるのに十分な期間、活性化された電極上に液滴を保持することによって停止されてもよい。電圧レベル、サイクルおよび／または電圧の種類もまた、増幅反応が実質的に停止されるまで、調節されてもよい。一部の場合において、電極構成は特異的不活性化部位を含んでもよく、その部位に電極が存在し、反応を不活性化するように選択される特性を有する。さらに、増幅が電極に配置される液滴を用いて実施される実施形態において、一部の場合において、増幅の間に増幅準備液滴の下部にある電極上の電圧を不活性化または制御することは有用であり得、それによって、電極は液滴の継続している増幅を過度に妨げない。
別の関連した実施形態において、液滴アクチュエータは、液滴操作電極に近接して位置する１つ以上の阻害剤を含んでもよい。例えば、阻害剤は液滴アクチュエータの表面で乾燥された乾燥阻害試薬であってもよい。別の例として、阻害剤はＰＣＲを阻害することが知られている白金または窒化物などの物質であってもよい。例えば、阻害剤は、液滴が反応を停止させるためにパッドまたはワイヤと接触して輸送され得るように配置される白金パッドまたはワイヤに曝露されてもよい。一部の実施形態において、阻害剤は、液滴アクチュエータ上の種々の電極部位に配置されてもよい。
操作において、反応液滴は、連続して、阻害剤と接触して輸送されてもよく、液滴は、連続して、反応が停止される時間における反応のエンドポイントの曲線の指標を生成するためにさらなるアッセイ工程および／または検出工程に供されてもよい。同様に、反応は連続して開始され、阻害剤のアレイと接触して同時に輸送されてもよい。別の実施形態において、反応は連続して開始されてもよく、液滴は、阻害剤と接触して連続して輸送されてもよい。任意の事象において、液滴は異なる反応時間または熱サイクルを受ける液滴を含み、液滴中の反応産物は、時間またはサイクルに関する反応の進行の曲線の指標を生成するために、さらなるアッセイ工程および／または検出工程に供されてもよい。
（７．８ 反応時間経過のサンプリング）
本発明は、液滴アクチュエータが提供され、反応液滴が液滴アクチュエータ上に提供される、関連する実施形態を提供する。反応液滴は、１つ以上の反応が反応液滴内で起こるという特徴がある。例えば、反応としては、化学反応、生化学反応および／または生物学的反応が挙げられる。反応が進行する場合、１つ以上の小液滴は反応液滴から分配される。各々のこのような小液滴は、反応を停止させる方法で処理されてもよい。例えば、小液滴の温度は、反応が停止または実質的に停止する温度に調節されてもよい。別の例として、各々の小液滴は、反応をクエンチする試薬を含む試薬液滴と混合されてもよい。各々の小液滴は異なる時間で親反応の液滴から除去されてもよく、小液滴は、反応の時間経過を示す曲線を生成するためにさらなる解析に供されてもよい。関連した実施形態において、小液滴における反応はクエンチされないが、各々の小液滴は、親反応の液滴から分配された後、迅速に検出に供される。さらに別の実施形態において、親液滴は多数の小液滴に細分されてもよく、小液滴は、各々の小液滴が異なる時間で検出に供される検出プロトコルに供されてもよい。収集したデータは、反応速度論の曲線の指標を生成するために使用されてもよい。一実施形態において、小液滴の分配は、電極、例えばエレクトロウェッティング媒介、誘電泳動現象媒介液滴分配によって媒介される。
関連した実施形態において、反応速度は、異なる時間で一連の反応を開始するために液滴アクチュエータ上の液滴を混合し、続いて、同時に液滴を画像化し、反応速度論の曲線の指標を生成するためにデータを用いることによって測定される。さらに別の関連した実施形態において、反応速度は、異なる時間で一連の反応を開始するために液滴アクチュエータ上の試薬液滴を混合し、続いて、異なる時間でセンサを用いて反応液滴を走査し、反応速度の異なる反応時間の指標に基づいて曲線を生成することによって測定される。これらの任意の実施形態において、特定の問題のある反応の必要性に依存して、反応は検出前に停止されても、されなくてもよい。
（７．９ さらなる熱サイクルの実施形態）
種々の特性を有するさらなる様々な実施形態は、本発明の範囲内であり得る。少しの例を以下に示す。
図３４は、本発明の液滴アクチュエータの電極構成３４００を示し、ここで、熱サイクル経路３４２５は半径方向に配置される。中心の温度制御素子３４１０は環状である。温度制御素子３４１０は、ディスク形状、六角形、八角形などの様々な代替の形状であってもよい。例示した実施形態において、熱サイクル経路３４０５は温度制御素子３４１０から外側に放射状に広がる。外側の温度制御素子３４１５もまた設けられる。電極経路３４２５は、中心の温度制御素子３４１０から外側の温度制御素子３４１５まで延びる。電極構成３４００は、より大きな電極構成の一部として与えられてもよい。液滴は、液滴アクチュエータの外部に対する開口部を介して、および／または他の電極経路（図示せず）を介して電極経路３４２５に導入されてもよいか、あるいは上部の基板を欠く開口系において、液滴は単に液滴操作表面上に配置されてもよい。外側の温度制御素子３４１５は、ワイヤ３４１６によって接続される個々の温度制御素子として例示される。しかしながら、外側温度制御素子３４１５は異なる形状であってもよく、例えば外側温度制御素子３４１５は、単一の環状の外側温度制御素子、例えば円形、六角形、八角形、または他の環構造を有する環と置き換えられてもよいことは理解されるだろう。
図３５は、複数のセットの液滴輸送経路３５１５を有する電極アレイによって接続される複数の温度制御素子３５１０を有する電極構成３５００を示す。リザーバー電極３５２０もまた、液滴輸送経路３５１５に隣接して与えられる。温度制御素子３５１０は同じであってもよいか、または異なっていてもよい。温度制御素子３５１０は温度制御領域を規定するために使用されてもよい。温度制御領域における温度は同じであってもよいか、または異なっていてもよい。
図３６は、電極構成３６００を示し、ここで、先細（例えば細長い三角形または楔形）の電極３６１０および３６１５が、温度制御素子３６２０と３５２６との間に液滴を輸送するために使用される。電極３６１５は不活性化されるが、電極３６１０の活性化により、温度制御素子３６２０に対して液滴が輸送される。電極３６１５の活性化および電極３６１０の不活性化により、温度制御素子３６２０から温度制御素子３６２５に戻るように液滴が輸送される。この種の電極構成または２００８年１０月１７日に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／８０２７５（その全開示は本明細書に参照として援用される）に記載されるもののような電場勾配を利用する他の構成も使用されてもよい。
図３７は、本発明の液滴アクチュエータカートリッジの底部基板３７００の写真である。この配置（プリントされた回路基板上の銅）は、サンプルおよび試薬を分配するためのリザーバー電極３７１０を備える。この配置は、温度領域３７４０の間に液滴を循環させるための電極ループ３７１６を備える。この配置は、試薬および／またはサンプル液滴を用いて液滴操作を実施するための輸送経路３７２０を備える。例えば、輸送経路３７２０は、リザーバー電極３７１０と電極ループ３７１６および／またはサンプル調製操作および／または他の液滴操作との間の試薬および／またはサンプル液滴を輸送するために使用されてもよい。この配置は検出電極３７１８を備える。検出電極３７１８は、電極ループ３７１６および輸送経路３７２０から構成される他の液滴操作電極より大きい。液滴アクチュエータカートリッジは、電極の構成を覆い、液滴操作を実施するのに適切な液滴操作間隙を形成するために底部基板から分離される上部の基板（図示せず）を備えてもよい。上部の基板は、液滴操作間隙における液滴に対して電気的に露出される参照電極または接地電極を備えてもよい。適切な上部基板の例としては、９月４日，３７０８に出願された「Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｃｔｕａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｐ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」という発明の名称の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７５１６０号に記載されるものが挙げられる。液滴操作間隙は、液滴操作に供される液滴と混合する流動性の充填流体などの流動性の充填流体で充填されてもよい。
図３８は、図３７に示される底部基板３７００の配置の図である。この図は、カートリッジ上に熱サイクル温度領域を作製するのに使用される加熱バー３８０８の配置を示す。
図３９〜４３は、図３７および３８に示すカートリッジ配置を用いた熱サイクル実験の実施の結果を示す。
・ＭＲＳＡ／Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎシステム：
標的物：ｍｅｃＡ遺伝子の１７６ｂｐフラグメント（遺伝子１つにつき８〜１０のコピー）
サンプル：バッファー中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ） ｇＤＮＡ（ＡＴＣＣ＃７００６９９Ｄ−５）
・定量実験：
１００，０００〜１コピーのＭＲＳＡゲノム（反応物中に３００ｐｇ〜３ｆｇ ｇＤＮＡ）
同じ量のＤＮＡを、６６０ｎＬの液滴アクチュエータ反応物およびＢｉｏＲａｄ ５０μｌ反応物（７５倍の濃度差）に加えた。
・ＰＣＲ混合物：
Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ色素
白金Ｔａｑ
・充填流体
ヘキサデカン
・熱プログラム（典型的）：
Ｈｏｔｓｔａｒｔ：６０ｓ＠９５、
４０サイクル：（１０ｓ ９５Ｃ、２０ｓ＠６０Ｃ）
比較実験を、液滴アクチュエータおよび市販のリアルタイムＰＣＲシステム（ＢｉｏＲａｄ ＩＱ５）で実施した。インプットゲノムＤＮＡの量は、１〜１００，０００ＭＲＳＡ細胞におけるＤＮＡの量と対応するように変化させた。ＣＴ値は以下のようであった。
Figure 0005592355
図３９は、カートリッジ上での増幅にいての生のデータおよび正規化したデータを示す。
図４０は、ＢｉｏＲａｄＩＱ５からの正規化したデータと比較した本発明のカートリッジからの正規化したデータを示す。
図４１は、１つの液滴アクチュエータでの１２の併発反応（４つの濃度の各々の３つの複製）の結果を示す。各セットの複製を単一のループで増幅させた。
図４２は、図３７および３８に示すカートリッジ配置を用いる別の熱サイクル実験の結果を示す。実験の詳細は以下の通りである。
・Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ／Ｔａｑ Ｍａｎシステム
−標的物：１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の１７２ｂｐフラグメント（１つのゲノムにつき７０〜１００コピー）
−サンプル：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｇＤＮＡ（ＡＴＣＣ＃１０２３２Ｄ−５）
・ＰＣＲ混合物
−ＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ−ＢＨＱ）
−Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＴａｑ
・充填流体
−シリコーン油
・熱プログラム
−Ｈｏｔｓｔａｒｔ：１２０ｓ＠９５Ｃ
−４０サイクル（１５ｓ ９５Ｃ、６０ｓ＠６０Ｃ）
図４２における定量は、ｇＤＮＡのインプット量の生物またはゲノム等価物の数による。
図４３は、増幅が検出から分離される実験に使用される液滴プロトコルを示す。同一の液滴の集団は色素を用いずに熱サイクルした。周期的に、１つの液滴を除去し、色素液滴と合わせ、検出に供し、次いで廃棄リザーバーに輸送した。上記のＭＲＳＡシステムを、８７，０００コピーおよび５サイクルの間隔で使用した。工程１において、６つの液滴を、図３７および３８に示す液滴アクチュエータの熱サイクルループ上に分配し、輸送した。液滴は増幅試薬を含んだが、検出試薬は含まなかった。工程２において、３つの液滴を各温度制御領域に配置した。工程３において、液滴を、熱サイクルを行うためにループの周りに回転させた。工程４において、ｎ回の熱サイクルの後、液滴を熱サイクルループから取り除いた。工程５において、取り除いた液滴を熱領域から離れた位置へ輸送した。工程６において、除去した液滴を検出液滴と合わせ、検出に供し、処分した。工程４、５および６を後の液滴について繰り返した。
図４４は、図４３に対して記載される実験の結果を示す。その結果は、増幅が検出から分離され、個々の小サンプル液滴のセットが異なって熱サイクルされて、単一のリアルタイム増幅曲線を生成するプロトコルを用いて生成され得る増幅曲線を示す。
（７．１０ 反応の停止）
核酸増幅反応をクエンチまたは実質的に停止することが所望される本明細書の種々の実施形態において、増幅反応を停止することが公知である種々の試薬が使用されてもよい。例えば、試薬は、例えばポリメラーゼを変性および／または分解するために結合することによって、ポリメラーゼ活性を妨げることができる。さらなる例を以下の表に与える。
Figure 0005592355
（７．１１ デジタルＰＣＲ）
デジタルＰＣＲは、サンプル中の正確な数のテンプレートコピーを測定するのに高度に定量的な方法として報告されている。サンプル液滴は、複数のナノリットルサイズのサブユニットに分配されるか、または分裂されてもよい。ほとんどの娘液滴は、０または１つのコピーを含む（一部はポアソン分布に起因して２つ以上のコピーを有する場合がある）。本発明は、液滴アクチュエータ上でデジタルＰＣＲを実施するための技術を提供する。小さなユニットサイズの電極が好ましい。一実施形態において、電極は約２００×２００μｍの電極である。液滴操作間隙の高さも調節されてもよい。２００×２００μｍの電極を備える約１００μｍの液滴操作間隙の高さは、約４ｎＬの体積を有する液滴を規定する。多くのこのような液滴は、種々の液滴分配技術を用いて生成されてもよい。一例において、一連の電極は細長い鎖を生成するように活性化され、次いで活性化された電極の散在された群は不活性化され、活性化された電極上でナノリットルのサイズの娘液滴を生じる。従来の分配および輸送技術もまた、一連の娘液滴を形成するために使用されてもよい。液滴アクチュエータ全体は増幅を実施するために熱サイクルされてもよいか、または個々の液滴は、熱サイクルを行うために熱制御領域を通してサイクルされてもよい。液滴は、液滴アクチュエータ表面上に、電圧、化学的または物理的パターニングによって反応全体にわたって所定の位置に維持されてもよい。増幅核酸の存在は液滴中で検出されてもよく、標的核酸の量が決定されてもよい。
従って、例えば、本発明は、標的核酸、および必要に応じて増幅試薬を含むサンプル液滴を提供する工程と、サンプル液滴から小液滴を分配する工程であって、増幅試薬がサンプル液滴に存在しない場合、増幅試薬を含む各々の小液滴を混合して、増幅準備液滴を生じる工程と、各々の小液滴を、標的核酸を増幅するために選択される熱サイクルプロトコルに供する工程と、各々の小液滴中の増幅産物を検出する工程と、前記増幅産物が生成されるサンプルの一部を含む小液滴の数を決定する工程とを含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記小液滴のうちの少なくとも１つは少なくとも１つの標的核酸分子を含む。増幅試薬は標的物を増幅するのに適切な任意の試薬を含んでもよい。一部の場合において、増幅試薬は、増幅標的分子とハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの際に変化するか、またはハイブリダイゼーションの結果として蛍光特性を有する少なくとも１つのプローブを含む。前記増幅産物が生成されるサンプルの一部を含む小液滴の数を決定する工程は、前記少なくとも１つのプローブのハイブリダイゼーションの結果としての蛍光変化を検出することを含んでもよい。前記増幅産物が生成されるサンプルの一部を含む小液滴の数を決定する工程は、全ての小液滴を一緒に画像化すること、あるいは例えば液滴を一度に輸送することによって、または検出ウィンドウを通してサブグループ内の個々の液滴もしくは液滴のグループを連続して画像化することを含む。小液滴は約１μＬ未満の体積を有してもよい。他の実施形態において、小液滴は、約１μＬより大きい範囲から約１０００μＬ、または約１００μより大きい範囲から約５００μＬの体積を有する。この方法の種々の工程は、液滴アクチュエータの液滴操作間隙中、または液滴操作表面上で実施されてもよい。一部の場合において、小液滴は、液滴操作間隙の２つの基板間で平らまたはディスク形状の構造に圧縮される。液滴操作間隙が設けられる場合、それは、必要とされる液滴操作を実施するのに適切な任意の高さを有してもよい。一部の場合において、液滴操作間隙は、約５０μｍ〜約１０００μｍの範囲、または約１００μｍより大きい範囲〜約５００μの高さを有する。特定の実施形態において、熱サイクルは、１つの熱領域から別の熱領域へ液滴を輸送することによってなされる。特定の実施形態において、液滴アクチュエータはサンプルチャンバを欠き、および／または流路チャネルを欠く。特定の実施形態において、サンプル液滴から小液滴を分配する工程は、流路チャンネルからサンプルを置き換える置き換え流体を用いずになされる。サンプル液滴は増幅試薬とともに与えられてもよいか、または増幅試薬は、増幅準備液滴を得るために、例えば各小液滴と増幅試薬とを混合することによって、液滴操作を用いて加えられてもよい。サンプル液滴は検出試薬とともに与えられてもよいか、または検出試薬は、検出準備液滴を得るために例えば各小液滴と検出試薬とを混合することによって、液滴操作を用いて加えられてもよい。検出試薬は増幅の前後に加えられてもよい。
関連した実施形態に加えて、サンプル液滴がナノリットルの娘液滴のセットに分裂された後、異なるセットのプライマーが、特定の核酸配列についてのＰＣＲを実施するために各娘液滴と混合されてもよい。このアプローチは、液滴アクチュエータで同時に複数の核酸の発現レベルの評価を容易にする。
（７．１２ 検出のための磁性反応ビーズの操作）
液滴アクチュエータベースのＰＣＲ（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ））において、標的核酸は増幅反応のために磁性反応ビーズに固定されてもよい。増幅産物を定量化するために、磁性反応ビーズを含む反応液滴は、液滴操作を用いて液滴アクチュエータ上の検出ウィンドウに輸送されてもよい。一部の例（例えばＱＲＴ−ＰＣＲ）において、増幅産物の検出は、増幅産物の量を定量化するためにＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどの蛍光色素を利用してもよい。しかしながら、サンプル液滴内に分散される磁性反応ビーズは、検出装置（例えば蛍光光度計）から蛍光を遮断することによって蛍光色素の検出を妨げる場合がある。
磁場が、（ａ）組み込まれていない標識ヌクレオチドの検出のために増幅液滴から磁性ビーズを取り除くため、または（ｂ）組み込まれていない標識ヌクレオチドの検出のために増幅液滴内の側へ液滴を引き付けるために使用されてもよい。
図４５は、ビーズが細長い液滴内の端側へ引き付けられ、それによってビーズが検出の間、検出ウィンドウに曝露されない本発明の実施形態を示す。磁石は、もちろん、液滴操作表面または液滴操作に対して様々な配置で与えられてもよい。例えば、図４５に示すように、磁石は液滴操作表面の下に配置される。しかしながら、磁石は、代替として、液滴アクチュエータ間隙において、および／または部分的に液滴アクチュエータを形成する１つ以上の基板上において、液滴アクチュエータの側方に隣接して、液滴アクチュエータの上に配置されてもよい。つまり、磁石は、検出ウィンドウの外側または少なくとも実質的に外側である液滴の領域にビーズを引き付ける任意の位置に与えられてもよい。
代替の実施形態において、磁石は、検出に供される液滴の完全に外側にビーズを引き付けてもよい。例えば、液滴アクチュエータは、ビーズ除去のために規定される液滴アクチュエータの領域に強力な磁石を備えてもよい。磁石の力は、液滴アクチュエータのビーズ除去領域に移動される任意の液滴の外側に磁性ビーズを引き付けるように選択されてもよい。一部の場合において、ビーズの除去は効果的に不可逆的であってもよい。
図４６Ａ、４６Ｂ、および４６Ｃは液滴アクチュエータの領域の上面図を示し、検体検出を改良するために、磁性反応ビーズを操作する方法および結果を示す。液滴アクチュエータ４６００は、ＰＣＲなどの増幅反応などの核酸ベースのアッセイに必要とされる液滴操作を実施するように構成される液滴操作電極４６１０（例えばエレクトロウェッティング電極）の経路またはアレイを備えてもよい。特に、検出ウィンドウ４６１２は液滴操作表面に与えられる。検出ウィンドウ４６１２は特定の液滴操作電極４６１０Ｄに配置されてもよいか、あるいは液滴が、必要に応じて親水性表面または上部基板および／もしくは底部基板の形状のバリエーションなどの他の輸送機構を備える液滴操作電極を用いて輸送され得る領域であってもよい。液滴アクチュエータ４６００は、液滴操作を介して液滴操作電極４６１０に沿って輸送され得るサンプル液滴４６２０を備えてもよい。サンプル液滴４６２０は、解析される標的核酸についての親和性を有する磁性反応ビーズ４６２４などの一定量のビーズを備えてもよい。
図４６Ａにおいて示すように、ビーズ４６２４をその中に有するサンプル液滴４６２０が、検出ウィンドウ４６１２の領域内にある液滴操作電極４６１０Ｄに配置される。検出ウィンドウ４６１２は典型的に、サンプル液滴４６２０より小さい直径である。磁性反応ビーズ４６２４は、検出ウィンドウ４６１２によって占められる領域を含むサンプル液滴４６２０内に分散され、分散された読み取りおよびバックグラウンドノイズを生じる、検出装置（すなわち蛍光光度計）からの蛍光を遮断することによって、増幅シグナル、例えば蛍光色素の検出を妨げる場合がある。
図４６Ｂに示すように、磁石４６３０はサンプル液滴４６２０に近接して配置される。磁石４６３０は永久磁石または電磁石であってもよい。磁石４６３０は、サンプル液滴４６２０の実質的に端部で、かつ検出ウィンドウ４６１２から実質的に離れた位置に磁性反応ビーズ４６２４を引き付け、集めるのに十分な磁場を提供するために操作電極４６１０Ｄおよびサンプル液滴４６２０から一定の距離で配置される。一部の場合において、磁石４６３０によって与えられる磁場の強さは、ビーズ４６２４が密接な凝集を形成しないものであり、後の液滴操作において容易に再分配されてもよい。他の場合において、ビーズの除去が本質的に永続的であると意図される場合、凝集は問題ではない。
図４６Ｃに示すように、磁石４６３０は、サンプル液滴４６２０から磁性反応ビーズ４６２４を分離するために使用されてもよい。十分な数の熱サイクル反応（例えば約１０サイクル）の後、ＰＣＲ液滴の液相における増幅核酸の量は、磁性反応ビーズの非存在下で正確に検出されるのに十分な量であってもよい。液滴操作を用いて、サンプル液滴４６２０は、液滴操作を介して、磁石４６３０の磁場内および磁場外に輸送されてもよい。サンプル液滴４６２０が磁石４６３０から離れた位置に輸送される場合、ビーズ４６２６の集合は、液滴操作電極４６１０Ｍに配置されたままになる。ビーズ液滴４６２６の量は、十分に多い封入ビーズ４６２４であってもよい。ここで、サンプル液滴４６２０は磁性反応ビーズを実質的に含まず、蛍光検出はビーズ干渉物の非存在下で進行されてもよい。
図４６Ｄは、図４６Ｂの方法（すなわち磁石によって凝集される磁性反応ビーズ）および図４６Ｃの方法（磁性反応ビーズを含まないＰＣＲ液滴）を用いて熱サイクル反応から得られるリアルタイムＰＣＲデータのプロットを示す。図４６Ｄは、蛍光シグナルの検出の間の磁性反応ビーズの干渉から生じ得る検出シグナルにおける不安定性およびバックグランドノイズを示す。磁性反応ビーズが、例えば熱サイクル１１（矢印で示す）で除去される場合、検出シグナルは十分に安定である。
（７．１３ 極性蛍光色素分子）
核酸増幅方法は熱サイクルを使用する。すなわち、規定された一連の温度変化によってサンプルおよび増幅試薬を含む液滴を交互に加熱および冷却する。液滴アクチュエータベースの増幅（例えば電極によって媒介される液滴操作などの液滴操作を用いて実施されるＰＣＲ）において、温度制御素子（例えばペルチェユニット、加熱ブロック、冷却ユニットなど）が、液滴アクチュエータ表面上、または液滴アクチュエータ間隙内の充填流体の温度を制御するために使用されてもよい。しかしながら、熱サイクルに必要とされる高温は、蛍光増強が、検出法および検出色素として使用されるＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどの蛍光色素（すなわち蛍光色素分子）として使用される場合、検出シグナルの損失を生じる場合がある。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｄｙｅなどの細胞透過性蛍光色素分子は、疎水性相（例えば油性充填流体）において十分な溶解性を有することができ、水性ＰＣＲ液滴から充填流体に、特に熱サイクルの間に発生するものなどの高温で分配することができる。
細胞透過性蛍光色素分子に対する代替として、極性または細胞不透過性蛍光色素分子が使用されてもよい。例えば、ＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）極性蛍光色素分子が、蛍光検出シグナルを著しく損失せずにＰＣＲに使用されてもよい。ＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）極性蛍光色素分子（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡから入手可能）およびＴＯ−ＰＲＯ１などの多くの異なる極性蛍光色素分子が、増幅産物を検出するためにＰＣＲに使用されてもよい。
（７．１４ 不動態化）
核酸増幅は、反応液滴内に含まれる核酸テンプレート、オリゴヌクレオチドプライマー、試薬および酵素などの多くの異なる反応成分を含むいくつかの工程を必要とする。核酸、タンパク質（すなわち酵素）、および／または色素（例えば蛍光色素）などの増幅液滴のこれらの成分の多くは、基板表面（例えば液滴操作電極）上に吸収され得、および／または液滴アクチュエータの充填流体（例えば油性充填流体）内に分配され得る可能性がある。液滴アクチュエータの基板表面および／または充填流体に対するこれらの重要な成分の損失は、ＰＣＲ反応の低減した効果および／またはＰＣＲ反応の失敗を生じる場合がある。一実施形態において、本発明は、物質がその物質を一緒に使用する前に他の物質に対して「不動態」となる表面安定化技術を提供する。本発明の表面安定化技術は、増幅液滴から液滴アクチュエータの表面までの重要な成分の損失を低減および／または取り除くことができる。
不動態化試薬（すなわち遮断剤）は、基板表面に対する核酸テンプレートおよび／またはオリゴヌクレオチドプライマーの結合ならびに／あるいは充填流体含有の損失を減少および／または防ぐように選択されてもよい。実施例は、非標的ＤＮＡ分子などの他の核酸分子および／またはさらなる量のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
不動態化試薬（すなわち遮断剤）は、基板表面に対するタンパク質の結合および／または充填流体の損失を減少および／または防ぐように選択されてもよい。例としては、限定されないが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）などの界面活性剤、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの種々のポリマーが挙げられる。
一例において、液滴アクチュエータの表面は、前処理液滴内に含まれる一定量の不動態化剤で前処理される。前処理液滴は、１つ以上の反応サイクルを介して液滴アクチュエータの１つ以上のＰＣＲ経路に沿って輸送されてもよい。前処理液滴がＰＣＲ経路内にサイクルされる場合、核酸、タンパク質（すなわち酵素）、および／または色素（例えば蛍光色素）などの不動態化剤が、基板表面（例えば液滴操作電極）上に吸着されてもよく、ならびに／あるいは充填流体（例えば油性充填流体）に分配されてもよく、ＰＣＲ液滴内の成分の次の結合からの潜在的な吸収部位を効果的に飽和させる。別の例において、一定量の不動態化剤は、ＰＣＲ液滴内に直接加えられてもよい（すなわち動的不動態化）。この例において、ＰＣＲ液滴内の不動態化剤は、液滴アクチュエータの基板表面および／または充填流体上の利用可能な吸収部位に対して反応成分と効果的に競合し得る。
（７．１５ 間隙の高さ）
ＰＣＲを実施するのに使用される液滴アクチュエータは、液滴操作間隙によって隔てられる底部基板および上部基板を備えてもよい。表面張力は温度の増加に伴い減少するため、表面張力が非常に低い場合、液滴は、高い温度で分裂または砕け得る。従って、室温で十分に作用することができる間隙の高さの構成は高温で作用しなくてもよい。なぜなら、表面張力は効果的に減少するからである。本発明は、この効果がより大きな間隙を用いることによって埋め合わされてもよいことが発見されている。表面張力（エネルギー）はより大きな間隙について同じであるが、領域はより大きいので、多くの総エネルギーが、砕くために液滴に必要とされる。典型的に、熱サイクルを実施するのに使用される液滴アクチュエータにおける液滴操作間隙の高さは約２００μｍであってもよい。しかしながら、非常に小さな間隙の高さは、熱サイクル領域の間に液滴を往復させるときなどの液滴操作の間に増幅液滴の分裂を生じる場合がある。ＰＣＲ液滴の分裂は、標的核酸および試薬成分の損失を生じる場合がある。これらの重要な成分の損失は、増幅反応の実質的に低減した効果および／または増幅反応の失敗を生じる場合がある。
液滴操作間隙の高さは、単一のサイズの電極および単一のサイズの液滴の量に対して選択されてもよく、それによって液滴は実質的に球形である。より低いアスペクト比の液滴は球形のサイズにより近く、より高いアスペクト比の液滴はよりディスク形状である。本発明者らは、ディスク形状の液滴が、液滴輸送、分配および分裂などの液滴操作に関してより低い電圧を必要とするが、それらはまた、より球状の液滴より容易に微小液滴を形成する傾向があることを発見した。実質的に球状の液滴は、同じ液滴操作に関してより高い電圧を必要とするが、それらは液滴操作の間に微小液滴を形成する傾向がより低い。高温に供される液滴を必要とするアッセイにおいて、微小液滴形成は増加する。一例において、本発明者らは、４：１または３：１の電極ピッチ：ギャップ高さ比（約１２００μｍの電極ピッチおよび約３００μｍまたは約４００μｍの液滴操作間隙の高さと等しい）が、微小液滴の形成を実質的に減少させることを見出した。
本発明は、液滴操作の間の液滴の安定性（例えばＰＣＲ液滴の分裂を実質的に減少させる）を改良するために、高い間隙の高さを有する液滴アクチュエータを提供する。例えば、約３２０μｍ〜約３５０μｍの液滴操作間隙の高さは、液滴操作を介して輸送されたＰＣＲ液滴の向上した安定性を提供する。
一実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は約２５０μｍより大きい。別の実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は、約２５０μｍ〜約５００μｍの範囲の高さを有する。別の実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は約２７５μｍ〜約４５０μｍの範囲の高さを有する。別の実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は約３００μｍ〜約４００μｍの範囲の高さを有する。別の実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は約３２０μｍ〜約３７５μｍの範囲の高さを有する。別の実施形態において、単一のサイズの液滴操作電極の電極ピッチは約１２００μｍであり、液滴操作間隙は、約３２０μｍ〜約３５０μｍの範囲の高さを有する。
一実施形態において、本発明は、約７：１〜約２．８：１の範囲の電極ピッチ：間隙の高さの比を有する液滴アクチュエータを提供する。別の実施形態において、本発明は、約６：１〜約３：１の範囲の電極ピッチ：間隙の高さの比を有する液滴アクチュエータを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、約４．３：１〜約３．４：１の範囲の電極ピッチ：間隙の高さの比を有する液滴アクチュエータを提供する。
別の実施形態において、本発明は、約１２００μｍの電極ピッチおよび約１７５μｍ（約７：１のアスペクト比）〜約４５０μｍ（約２．８：１のアスペクト比）の範囲の液滴操作間隙の高さを有する液滴アクチュエータを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、約１２００μｍの電極ピッチおよび約２００μｍ（約６：１のアスペクト比）〜約４００μｍ（約３：１のアスペクト比）の範囲の液滴操作間隙の高さを有する液滴アクチュエータを提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、約１２００μｍの電極ピッチおよび約２８０μｍ（４．３：１）〜約３５０μｍ（３．４：１）の範囲の液滴操作間隙の高さを有する液滴アクチュエータを提供する。
液滴アクチュエータにおける間隙の高さは、例えば、低部と上部の液滴アクチュエータ表面間に適切な厚さのスペーサー材料を「挟み込むこと」によって制御されてもよい。あるいは、材料の層は、２つの基板の少なくとも一部の間に適切な厚さの間隙空間を規定する絶縁材を提供するように上部または低部の基板のいずれかの内面に接着されてもよい。あるいは、絶縁材は１つまたは両方の基板の一体部分、射出成形または他の形成プロセスの間に、基板に成形または形成される例えば突起柱または他の構造であってもよい。所望の高いアスペクト比を達成するための間隙の高さを制御する種々のさらなる手段は当業者に容易に理解されるだろう。
（７．１６ キャリーオーバー汚染の減少）
液滴アクチュエータでの液滴ベースの核酸増幅は、熱反応領域と検出器との間で電極によって媒介される液滴操作を用いて増幅準備液滴が往復される、一連の液滴操作を含む。このプロセスが共通の経路または近接する経路に沿う複数の液滴の移動に関する場合、増幅液滴からの残留成分は、１つの液滴から別の液滴に移動する場合があり、一連の液滴操作におけるその後の増幅液滴を汚染する。本発明は、油内の増幅液滴を使用する増幅液滴の間の二次汚染を減少させるための液滴アクチュエータおよび方法を提供する。
本発明の液滴アクチュエータは、液滴操作間隙によって分離される底部基板と上部基板とを備えてもよい。液滴アクチュエータの指定された領域において、液滴操作間隙は、油状の充填流体などの流動性の充填流体を含んでもよい。液滴アクチュエータの他の指定された領域において、液滴操作間隙間は空気などの気体状の充填流体を充填されてもよい。
油に囲まれた液滴は、例えば、油でサンプルリザーバーを充填し、続いてリザーバーに水性サンプル、例えばＰＣＲサンプルを負荷し、油層に囲まれる水性ＰＣＲ液滴を分配または「ピンチオフ（ｐｉｎｃｈ ｏｆｆ）」するために液滴操作を用いることによって形成されてもよい。油に囲まれたＰＣＲ液滴の形成を促進するために、高い表面張力を有する高粘性油が使用されてもよい。適切な油の例としては、限定されないが、ヘプタデカンまたはオクタデカン油が挙げられる。油に囲まれたＰＣＲ液滴が分配される場合、それは、その後のＰＣＲ反応のために液滴操作を用いて、油を含まない液滴アクチュエータの領域（すなわち間隙が空気に充填されている）に輸送されてもよい。
高粘性油は室温（すなわち約２２℃〜２８℃）で部分的な固体または固体であってもよい。例えば、ヘプタデカン、オクタデカン、ノナデカン、およびエイコサン油の融点は、それぞれ、２０〜２２℃、２６〜２９℃、３０〜３４℃および３５〜３７℃である。液滴アクチュエータベースの増幅に関して、オイルは異なる増幅のためにその融点に基づいて選択されてもよい。例えば、液滴アクチュエータの輸送が必要とされる製造観点から、リザーバーは、選択される油の融点以上の温度で油を充填され、次いで液滴アクチュエータにおいて冷却および凝固させてもよい。液滴アクチュエータベースのＰＣＲは典型的に、約６０℃以上で操作するため、選択される油は液相内にあり、油で囲まれたＰＣＲ液滴の形成が可能になる。
（７．１７ 標的核酸の濃縮および収集）
液滴アクチュエータベースの核酸増幅の一部の適用において、ＰＣＲ解析の前にサンプル流体中の検体（例えば細菌、ウイルス、真菌、および／または核酸）を濃縮することが必要な場合がある。例えば、最適な解析を与えるために、サンプル流体の量は非常に多く、および／または検体の濃度は非常に小さくてもよい。
図４７Ａおよび図４７Ｉは、液滴アクチュエータ４７００の領域の断面図を示し、核酸増幅および検出のためのサンプル流体由来の標的核酸の濃縮および収集プロセスにおける磁性反応捕捉ビーズの使用を示す。
図４７Ａに示されるように、検出アクチュエータ４７００は底基板４７１０を備え得る。底部基板４７１０は、液滴操作間隙４７１６によって上部基板４７１４から分離されてもよい。リザーバー電極４７１８は底部基板４７１０上に配置されてもよい。リザーバー電極４７１８は、液滴操作電極４７２０（例えばエレクトロウェッティング電極）の経路またはアレイと結合して配置されてもよく、それによって、液滴は、液滴操作電極４７２０の経路またはアレイ上にリザーバー電極４７１８から配置されてもよい。誘電体が電極を覆ってもよい。疎水性層が電極を覆ってもよい（または疎水性誘電体が選択されてもよい）。リザーバー４７３０は、電極が液体経路を通して流される液体と相互作用できるように、リザーバー４７３０から間隙４７１６への液体経路を規定し、リザーバー電極４７１８に十分に近接する上部基板４７１４に設けられる。リザーバー４７３０は、例えば約１ミリリットル（ｍｌ）以上のサンプル流体を含むのに十分なサイズであってもよい。リザーバー４７３０は一定量の磁性反応捕捉ビーズ４７３４を含む。磁性反応捕捉ビーズ４７３４は、例えば、一次捕捉抗体、またはオリゴヌクレオチド配列、あるいは結合および捕捉事象を与える特異的標的検体に対する親和性を有する任意の結合タンパク質を含むビーズであってもよい。リザーバー４７３０は隔壁４７３８によって密閉される。隔壁４７３８は、望まれない物質によるリザーバー４７３０の汚染に対する障壁を与える。
磁石４７４０は液滴アクチュエータ４７００に結合される。磁石は、リザーバー電極４７１８が磁石４７４０の磁場内にあるように配置される。例えば、磁場４７４０は永久磁石または電磁石であってもよい。一例において、磁石４７４０は、リザーバー電極４７１８の近接内、またはリザーバー電極４７１８から離れた位置に移動され得るように位置が調節される永久磁石である。磁石４７４０は、例えば、磁性反応捕捉ビーズ４７３４を引き付けおよび／または固定するように使用されてもよい。操作において、磁石４７４０は、磁性反応捕捉ビーズ４７３４に結合される標的検体を濃縮するプロセスを補助するように使用されてもよい。
超音波処理器４７４２は液滴アクチュエータ４７００に結合される。超音波処理器４７４２は、流体内の粒子を攪拌するために、音波エネルギー（例えば超音波）をリザーバー４７３０内のサンプル流体に与えるように使用されてもよい。別の例において、超音波処理器４７４２はサンプル流体内の粒子を穏やかに攪拌し、再懸濁するために使用されてもよい。別の例において、超音波処理器４７４２はサンプル流体内の粒子を激しく攪拌するために使用されてもよい。一部の適用において、強力な超音波処理が、細胞膜を破壊し、細胞内容物を放出するために使用されてもよい。さらに、リザーバー４７３０に対する超音波処理器４７４２の位置は変化させてもよい。
第２の磁石４７４４は液滴アクチュエータ４７００に結合される。磁石４７４４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。磁石４７４４は、１つ以上の液滴操作電極４７２０が磁石４７４４の磁場内にあるように配置される。磁石４７４４は、さらに標的核酸を濃縮および精製するために、例えば、磁性反応ビーズを用いて第２の捕捉事象に磁場を与えるように使用されてもよい。
サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するために、磁性反応捕捉ビーズを用いるプロセスの例としては、限定されないが、以下の工程が挙げられる。
図４７Ｂは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける第１の工程を示す。この工程において、負荷装置４７５０（例えば、シリンジおよびニードル、マイクロピペット）は、一定量のサンプル流体４７５２をリザーバー４７３０に入れておくために使用される。サンプル流体４７５２は、例えば、約１ｍｌ以上の体積の血液サンプルまたは鼻咽頭洗浄サンプルであってもよい。サンプル流体４７５２は一定量の標的検体４７５４を含んでもよい。標的検体４７５４は、例えば、磁性反応捕捉ビーズ４７３４に対する親和性を有する細菌、ウイルス、および／または真菌標的物であってもよい。リザーバー電極４７１８は活性化されず、磁石４７４０の一部は、実質的にリザーバー電極４７１８に存在する磁場がないため、サンプル流体４７５２はリザーバー４７３０に保持される。
図４７Ｃは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、超音波処理器４７４２は、活性化（例えば低エネルギー操作）され、穏やかに攪拌するために使用され、サンプル流体４７５２中の磁性反応捕捉ビーズ４７３４を再懸濁する。超音波処理器４７４２は、磁性反応捕捉ビーズ４７３４に対する標的検体４７５４の最適な混合および結合（すなわち一次捕捉）を与えるために、十分な時間、活性化されてもよい。
図４７Ｄは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、超音波処理器４７４２はスイッチが切られ、磁石４７４０の位置は、液滴アクチュエータ４７００のリザーバー４７１８に特定の磁場が存在し、リザーバー電極４７１８が活性化されるようにある。リザーバー電極４７１８の磁場および活性化の結果として、結合された標的検体４７５４を含む磁性反応捕捉ビーズ４７３４がリザーバー４７１８に定着し、サンプル流体４７５２内で効果的に濃縮する。
図４７Ｅは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、磁石４７４０は液滴アクチュエータ４７００から離れた位置に物理的に移動され、その結果、リザーバー電極４７１８に実質的に磁場は存在しない。磁場の除去の結果として、磁性反応捕捉ビーズ４７３４はリザーバー電極４７１８の表面に長く固定されず、間隙４７１６内のサンプル体積に分配される。この例において、標的検体４７５４が、例えば細菌、ウイルスおよび／または真菌である場合、溶解試薬液滴４７５６が輸送され、液滴操作を用いて間隙４７１６内でサンプル体積と融合される。１つ以上の溶解試薬液滴４７５６が、標的検体４７５４の十分な溶解および標的核酸の放出を提供するために使用されてもよい。
図４７Ｆは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、超音波処理器４７４２は活性化されるリザーバー４７１８の近接に物理的に移動される。超音波処理器４７４２は活性化され（例えば高エネルギー操作）、激しく攪拌し、サンプル流体４７５２を混合するために使用される。超音波処理器４７４２は、標的検体４７５４の最適な溶解および核酸の放出を提供するのに十分な時間、活性化されてもよい。別の実施形態において、単一の超音波処理器は、液滴操作間隙における液滴およびリザーバー内の流体の同時超音波処理を可能にする方法で戦略的に配置されてもよい。さらに別の実施形態において、１つより多い超音波処理器が設けられてもよい。
一例において、化学試薬および／または酵素溶解試薬（すなわち溶解試薬液滴４７５６）と組み合わせた強力な超音波処理が、真菌病原体を含む生物学的サンプルに有用であり得る。
図４７Ｇは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、磁石４７４０の位置は、液滴アクチュエータ４７００のリザーバー電極４７１８に特定の磁場が存在するような位置である。磁場の結果として、結合される標的検体４７５４を有する磁性反応捕捉ビーズ４７３４はリザーバー電極４７１８に定着される。標的検体４７５４は溶解されるため、核酸はサンプル流体４７５２に放出される。一定量の標的核酸４７６０（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む１つ以上の溶解液滴４７５８は、液滴操作を用いて、磁石４７４４に対して液滴操作電極４７２０の経路に沿ってリザーバー電極４７１８から離れた位置に輸送される。
図４７Ｈは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、一定量の磁性反応捕捉ビーズ４７６４を含む捕捉液滴４７６２は、液滴操作を用いて第２の磁石４７４４に配置される。捕捉ビーズ４７６４は、溶解液滴４７５８中の捕捉標的核酸４７６０をアニールするために使用される一定量のオリゴヌクレオチド配列を含む。液滴操作を用いて、１つ以上の溶解液滴４７５８は、捕捉液滴４７６２に輸送され、融合される。この工程において、標的核酸４７６０はさらに濃縮され、精製される。
図４７Ｉは、サンプル流体由来の標的核酸を濃縮および収集するプロセスにおける別の工程を示す。この工程において、捕捉液滴４７６２は、未結合の物質を除去するために一連の液滴操作を用いて洗浄される。捕捉液滴４７６２中の結合された核酸４７６０は、ここでＰＣＲ用に準備される。
別の実施形態において、標的検体４７５４が核酸である場合、溶解工程（すなわち図４７Ｅおよび４７Ｆ）は必要でなくてもよい。
（７．１８ サンプル）
本発明の種々の実施形態において、本発明は核酸サンプルを使用する。核酸サンプルは、標的分子、細胞または生物などの標的物質に直接または間接的に結合される標的核酸または核酸を少なくとも潜在的に含むサンプルである。特定の実施形態において、核酸サンプルはサブサンプルに細分化されてもよい。例えば、サブサンプル液滴はサンプル液滴から液滴操作を用いて分配されてもよい。
個々のサブサンプルは、一連のエンドポイント測定を生成するための所定数のサイクルのために増幅されてもよい。エンドポイント測定は、特定の所定数の増幅サイクルの後、または終わりに得られるサブサンプル（および／またはサブサンプルのセット）の各々の測定を含んでもよい。異なるサブサンプルのエンドポイント測定は、生物サンプルに存在する標的核酸を定量化するために使用され得る曲線を生成するために使用されてもよい。例えば、異なるサブサンプル液滴のエンドポイント測定は、サンプル液滴、またはサンプル液滴が誘導されるオリジナルのサンプルに存在する標的核酸を定量化するために使用され得る曲線を生成するために使用されてもよい。
核酸サンプルは、対象物、コントロール、標準物または複製物由来のサンプルであってもよい。核酸は、目的の実際の検体である標的分子などの別の物質に結合されてもよい。種々の実施形態において、プロトコルは、１つ以上の対象物のサンプル由来の物質の増幅、ならびに１つ以上のコントロールおよび／または複製物の増幅を含んでもよい。特定の実施形態において、特定のサブサンプルは、単一のデータポイントのみを生成するために使用される。他の実施形態において、複数の同一のサブサンプル液滴は、増幅サイクルの数の関数として検出される増幅シグナルの量を示す一連のデータポイントを生成するように異なって増幅されてもよい。
核酸サンプルは、例えば、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプルなどの環境サンプル；髪の毛のサンプル、皮膚細胞、および他の法医学的残留物などの法医学サンプル；ならびに全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄液、羊膜液、精液、膣分泌物、漿液、滑液、心膜液、腹膜液、胸膜液、浸出液、滲出液、嚢胞液、胆液、尿、胃液、腸液、糞便試料、単細胞および多細胞を含む液体、細胞小器官を含む液体、流動組織、流動器官、多細胞生物を含む液体、生物学的スワブまたは洗浄物などの他の生物学的サンプル由来であってもよい。
（７．１９ 検出）
増幅を検出するための種々のアプローチが本発明の実施に使用されてもよい。例えば、一実施形態において、各サブサンプル液滴は所定の波長で蛍光強度測定に供される。一実施形態において、検出は増幅反応と同時に達成される。言い換えれば、複数のサブサンプル液滴が増幅される間、各サブサンプル液滴はその所定数のサイクルを達成するため、検出に供されてもよい。１つの液滴が検出に供されている間、他の液滴は増幅され続けてもよい。特定の実施形態において、液滴のグループがほぼ同時に達成され、各ｎ回のサイクル後に、少なくとも１つの液滴が検出に供される。各検出工程の間のサイクルの数は、特定のアッセイに必要なデータに基づいて選択されてもよい。一般に、より正確な定量化は、多数または少数の全増幅サイクルの検出を必要とする。
検出は、サブサンプル液滴が利用可能になると、すなわち、所定数のサイクルが完了すると、ほぼ達成され得る。サブサンプル液滴は所定の位置で試験されてもよいか、または後の検出のために他の場所に輸送もしくは移動されてもよい。後のアプローチは、増幅と検出の機能を分けるのに有用であり得る。例えば、サブサンプル液滴は、液滴アクチュエータ上の他の場所に輸送され、それらが検出を待っている間、滞留されてもよい。サブサンプル液滴が検出のために準備されている場合、センサが、液滴が各液滴を測定するために滞留される領域を走査してもよい。あるいは、サブサンプル液滴は、検出のためのセンサの存在下で一定の時間に１つ以上輸送されてもよい。例えば、各サブサンプル液滴は、検出ウィンドウを通して輸送されてもよく、測定は、各液滴が検出ウィンドウに存在している間、その各液滴についてセンサによって得られてもよい。
液滴は種々の技術を用いて検出に供されてもよい。一実施形態において、液滴は検出の存在下で輸送されてもよい。この実施形態において、１つ以上の固定センサが、検出を達成するために使用されてもよい。このような構成は機器のコストおよび複雑性を減少させる。別の実施形態において、センサは検出のための液滴の存在下で移動される。液滴は、後の時間での検出のために液滴アクチュエータに配置されてもよいか、液滴アクチュエータから除去されてもよい。配置された液滴はセンサによって走査されてもよいか、または画像化されてもよい。例えば、配置された液滴は、ＣＣＤまたはＬＥＤ／フォトダイオードアレイなどのアレイ検出器によって画像化されてもよい。液滴は、ＣＣＤもしくはＬＥＤ／フォトダイオードアレイの存在下で移動されてもよく、および／またはＣＣＤもしくはＬＥＤ／フォトダイオードアレイは、液滴の存在下で移動されてもよい。
すでに述べたように、特定の実施形態において、検出における増幅は分けられてもよい。この利点は、経時的な同じ反応の複数の測定よりむしろ、複数のエンドポイント反応の使用によって促進される。このアプローチはまた、検出前であるが増幅後の検出試薬の添加を促進する。熱サイクルおよび検出の分離は、核酸増幅を実施できる液滴アクチュエータを設計する場合、より大きな設計の柔軟性を提供する。
種々の実施形態において、検出試薬は、検出前または間であるが、増幅後に各サブサンプル液滴に加えられる。例えば、挿入色素（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）および／または分子指標を含む液滴が、増幅後にサブサンプル液滴に加えられてもよい。この実施形態は、増幅が完了した後に試薬が加えられるため、増幅を阻害できる試薬の使用を促進する。試薬は、検出前または間に加えられてもよい。別の実施形態において、増幅サイクルの一部は、検出試薬の検出前に実施されてもよい。言い換えれば、検出試薬は、１つ以上の最後のサイクルの間または前に加えられてもよい。このアプローチは、Ｔａｑｍａｎ（ｒ）試薬などの、重合の間に存在する検出試薬を必要とする化学物質を検出するのに有用であり得る。
示されるように、増幅および検出の分離は、検出アクチュエータおよび液滴アクチュエータを操作するのに必要とされる機器についての設計の柔軟性を改良する。例えば、検出器モジュールおよび加熱器モジュールは、それらのそれぞれの機能を実施する位置を交換することができる。このアプローチは、加熱器が検出を妨げずに液滴アクチュエータの両側に配置されることを可能にする。別の例において、分離面が熱サイクルおよび検出のために設けられてもよい。
検出は数秒で達成され得るが、熱サイクルは数分〜１時間までを必要とする場合がある。従って、１つの検出機器は、複数の液滴アクチュエータで熱サイクルを制御するために使用される機器において複数の熱サイクルまたは熱サイクルのブランクを支持するために使用されてもよい。例えば、機器は、熱サイクルのための複数のスロット、および検出のための１つまたは少数のスロットのみを有するように設けられてもよい。液滴アクチュエータは、使用者、ロボット手段または他の手段によってスロットを検出するために熱サイクルスロットから移動されてもよい。
液滴が検出のために準備されている場合、それらは、使用される検出の形態に適切な任意の方法で配置されてもよい。例えば、それらは、単一のファイルに並べられてもよいか、または密度の濃いアレイにパッケージされてもよい。検出のための空間および構成は、熱サイクルの必要性によって抑制されない。液滴を密な１−Ｄアレイに配置する能力により、走査検出器のコストおよび複雑性が減少する。センサについての全移動は、直線状で、１軸の方向のみに低減され得る。同様に、より小さいＣＣＤまたはＬＥＤ／フォトダイオードアレイが使用されてもよい。
他の設計の利点は、熱サイクルおよび検出についての異なる必要性から生じる。例えば、光透過性が検出の一部の形態に必要とされてもよいが、特定の熱サイクルの構成に必要とされなくてもよい。熱特性は液滴アクチュエータの熱サイクル領域について最適化されてもよいが、光学特性は液滴アクチュエータの検出領域に最適化されてもよい。さらに、本発明の液滴アクチュエータは、後の時間に再試験するために液滴アレイを保存するために使用されてもよい。
他の利点の中で、本発明の熱サイクル技術は、増幅の間、液滴に存在する結合剤などの検出剤を必要とせずに液滴の増幅を促進する。示されるように、一部の場合において、小液滴は熱サイクルを受ける液滴から分配されてもよい。小液滴は熱サイクルプロセスから出ていってもよく、適切な検出試薬と混合され、次いで検出に供されてもよい。本明細書に記載されるエンドポイント検出スキームもまた、この技術を利用してもよい。各小液滴は、熱サイクルプロセスの完了後に結合剤を含む液滴と混合されてもよい。
特定の実施形態において、本発明の方法は、サンプルおよび結合剤を一緒に含む増幅反応混合物の熱サイクルを省略する。特定の実施形態において、本発明の技術は、特に、増幅反応が進行中の間に、蛍光シグナルを検出するために操作される検出器を除外してもよい。
種々の実施形態において、検出剤が熱サイクルの後に加えられる場合、他に核酸増幅を妨げる薬剤が利用されてもよい。例えば、増幅の間に存在する場合、熱サイクルを阻害する結合剤が、その結合剤が増幅後に加えられる本発明の技術に使用されてもよい。従って、特定の実施形態において、本発明は、核酸増幅の速度および増幅のための試薬を特異的に阻害する結合剤を利用する。
他の実施形態において、検出は標識ヌクレオチドを用いて達成されてもよい。テンプレートはビーズに結合され、蛍光ヌクレオチドなどの標識ヌクレオチドを用いて増幅されてもよい。標識ヌクレオチドは増幅鎖に導入されてもよく、検出は、（ａ）液滴からの標識核酸の喪失、および／または（ｂ）標識核酸の増幅鎖への導入に基づいてもよい。特定の実施形態において、「Ｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗａｓｈｉｎｇ」という発明の名称の米国特許第７，４３９，０１４号に記載されるものなどのビーズ洗浄技術が、増幅鎖に導入される標識ヌクレオチドの検出のために未結合の標識ヌクレオチドから離れて洗浄するために使用されてもよい。この技術は、内部蛍光を有する捕捉ビーズとともに蛍光ヌクレオチドを用いることによって高められてもよく、ビーズは蛍光ヌクレオチドの蛍光を増幅する。
さらに別の実施形態において、ＤＮＡ合成は、ピロリン酸塩の生成に基づいて測定されてもよい。各サイクルにて、デオキシトリヌクレオチドの導入は、ピロリン酸塩の分子を遊離させる。遊離されるピロリン酸塩の量は、単位複製配列の長さマイナスプライマーの長さに比例する。各サイクルの終わりに、化学的方法がピロリン酸塩を検出するために使用されてもよい。一部の場合において、小液滴は、熱サイクルを受け、ピロリン酸塩遊離についての試験に供される液滴から分配されてもよい。小液滴は、熱サイクルプロセスから出ていき、ピロリン酸塩検出プロトコルに供されてもよい。
本明細書に記載されるエンドポイント検出スキームはまた、この技術を利用してもよい。液滴は、熱サイクルプロセスの完了後にピロリン酸塩検出プロトコルに供されてもよい。いずれの場合においても、ピロリン酸塩検出プロトコルは、２００７年、１０月２５日に公開された「Ｄｒｏｐｌｅｔ−Ｂａｓｅｄ Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」という発明の名称の国際公開第２００７／１２０２４０号に記載されるものなどの液滴操作を用いて達成されてもよい。
本明細書に記載される種々の検出アプローチは、通常、以下に記載される任意の実施形態とともに使用されてもよいことは理解されるだろう。
（７．２０ 加熱バー）
本明細書に記載され、図４８Ａおよび４８Ｂに示されるように、加熱バー４８００は、十分な熱伝導率のために、アルミニウムバー４８０２などのアルミニウムから構成されてもよい。２つの抵抗器４８０４（各々１５Ω）は、均一な加熱を与えるように底側の２つの端部に取り付けられる。サーミスタプローブ４８０６は、加熱器ＰＩＤ制御因子に温度測定を与えるために加熱バーの中央に取り付けられてもよい。加熱バーは、位置決めねじ４８１０を用いてカートリッジデッキ４８０８に配置され、下部のスプリング４８１２によって支持されてもよい。スプリング力は、加熱バー表面と加熱されるＰＣＢカートリッジ４８１４との間の密な接触を確実にする。スプリングにより留められた加熱バーはカートリッジデッキに接触せず、デッキに移動される望まれない加熱器は最小化される。
（７．２１ システム）
当業者によって理解されるように、本発明は、方法、システムまたはコンピュータープログラム製品として具現化されてもよい。従って、本発明の種々の態様は、ハードウェア実施形態、ソフトウェア実施形態（ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含む）、または「回路」、「モジュール」もしくは「システム」として本明細書においてほぼ全て参照され得るソフトウェアおよびハードウェアの態様を組み合わせた実施形態の形態をとってもよい。さらに、本発明の方法は、媒体において具現化されるコンピューターにより使用可能なプログラムコードを有するコンピューターにより使用可能な記録媒体上でコンピュータープログラム製品の形態をとってもよい。
任意の適切なコンピューターにより使用可能な媒体は、本発明のソフトウェアの態様で利用されてもよい。コンピューターにより使用可能またはコンピューターにより読み取り可能な媒体は、例えば限定されないが、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体のシステム、装置、デバイス、または伝搬媒質であり得る。コンピューターにより読み取り可能な媒体のより具体的な例（限定的なリスト）としては、以下の一部または全てが挙げられる：１つ以上のワイヤを有する電気的接続、携帯型フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、消去可能なプログラム可能なリードオンリメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバー、携帯型コンパクトディスクリードオンリメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、光学式記憶デバイス、インターネットもしくはイントラネットをサポートするものなどの伝送媒体、または磁気記憶デバイス。コンピューターにより使用可能またはコンピューターにより読み取り可能な媒体はさらに、紙または別の適切な媒体であってもよく、例えば紙または他の媒体の光学走査によって、プログラムが電子的に捕捉され得るように、その上にプログラムがプリントされ、次いで、必要な場合、適切な方法でコンパイル、読み取り、または処理され、次いで、コンピューターメモリに保存されることに留意すべきである。この文書の文脈において、コンピューターにより使用可能またはコンピューターにより読み取り可能な媒体は、命令実行システム、装置、もしくはデバイスによって、またはそれらと併せて使用するためのプログラムを含有し、保存し、通信し、伝播し、または輸送できる任意の媒体であってもよい。
本発明の操作を実行するためのコンピュータープログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋などのオブジェクト指向のプログラミング言語で書かれてもよい。しかし、本発明の操作を実行するためのコンピュータープログラムコードはまた、「Ｃ」プログラミング言語または同様のプログラミング言語などの従来の手続きプログラミング言語で書かれてもよい。プログラムコードは、使用者のコンピューター上で部分的に、リモートコンピューターで部分的に、またはリモーターコンピューターもしくはサーバーで完全に、スタンドアロンソフトウェアパッケージとして、使用者のコンピューター上で完全に、または使用者のコンピューター上で部分的に実行できる。後者の状況において、リモートコンピューターは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）を介して使用者のコンピューターに接続されてもよいか、その接続は外部コンピューターに対してなされてもよい（例えば、インターネットサービスプロバイダーを使用するインターネットを介して）。
本発明の特定の態様は、種々の方法および方法の工程に対する参照とともに記載される。各方法の工程は、コンピュータープログラム命令によって実行され得ることは理解されるだろう。これらのコンピュータープログラム命令は、機械を生成するために、汎用コンピューター、専用コンピューター、または他のプログラム可能なデータプロセス装置のプロセッサに与えられてもよく、それによって、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータプロセス装置のプロセッサを介して実行する命令は、この方法で指定される機能／作用を実行するための手段を作成する。
コンピュータープログラム命令はまた、特定の方法で機能するように、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータプロセス装置を指示し得るコンピューター読み取り可能メモリに保存されてもよく、それによって、コンピューター読み取り可能メモリに保存される命令は、この方法の工程の様々な態様を実行する命令手段を含む製造物品を生成する。
コンピュータープログラム命令はまた、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータプロセス装置にロードされて、コンピューターにより実行されるプロセスを生成するためにコンピューターまたは他のプログラム可能な装置で実施されるべき一連の操作工程を生じることができ、それによって、コンピューターまたは他のプログラム可能な装置で実行する命令は、本発明の方法において指定される様々な機能／作用を実行するための工程を提供する。
（８ 結びの見解）
上述の実施形態の詳細な説明は、本発明の特定の実施形態を例示する添付の図面を参照する。異なる構造および操作を有する他の実施形態も本発明の範囲から逸脱しない。用語「本発明」などは、本明細書に記載される本出願人の発明の多くの代替の工程または実施形態の特定の具体例に対する参照とともに使用され、その使用が存在してもしなくても、本出願人の発明の範囲または特許請求の範囲を限定することを意図しない。本明細書は、読み手のみの簡便さのためにセクションに分けられる。見出しは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。その定義は本発明の詳細の一部と意図される。本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱せずに変更されてもよいことは理解されるだろう。さらに、上述の詳細は例示のみの目的のためであり、限定を目的とせず、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義される。

Claims (13)

  1. 解析するためのサンプルを調製する方法であって、前記方法は、
    （ａ）（ｉ）液滴操作基板と、（ｉｉ）前記液滴操作基板の液滴操作表面上で液滴操作を実施するように配置される電極と、（ｉｉｉ）前記液滴操作表面とカバーとの間に液滴操作間隙を形成するために、前記液滴操作表面に隣接し、前記液滴操作表面から離間している、カバーを含む上部の基板と、（ｉｖ）前記上部の基板に結合され、１つ以上の標的検体および／または１つ以上の標的検体を含む物質に対する親和性を有する磁性反応ビーズを含むリザーバーと、（ｖ）前記リザーバーから前記液滴操作間隙に延在する液体経路と、（ｖｉ）前記液滴操作基板に結合され、磁性反応ビーズを引き付けるのに十分な磁場を生成するように構成される磁場源と、を備える液滴アクチュエータを提供する工程と、
    （ｂ）前記リザーバー内にサンプル流体を供給する工程であって、前記サンプルは、前記標的検体および／または物質のうちの１つ以上を潜在的に含む工程と、
    （ｃ）前記液体経路を通して前記液滴操作間隙内に前記磁性ビーズを含むサンプル流体を流動させる工程と、
    （ｄ）前記磁性反応ビーズを磁場で凝集させる工程と、
    （ｅ）前記磁場を除去するか、または前記磁場から前記ビーズを除去して、磁性ビーズを含む前記液滴操作間隙内にサンプル液滴を生じさせる工程と、
    を含む、方法。
  2. 前記液滴アクチュエータは、前記液滴操作基板に結合され、前記液体経路を通して前記液滴操作間隙に侵入する流体を受容するように配置されるリザーバー電極を備え、前記磁場源は、前記液体経路に対して前記リザーバー電極の反対側に配置される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記液滴アクチュエータは、前記リザーバー内のサンプル流体に音波エネルギーを与えるように配置される超音波処理器を備え、前記リザーバー内の前記サンプルを超音波処理する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. （ａ）１つ以上の標的検体を含む検体および／または物質は、細胞を含み、前記ビーズは前記細胞に対して親和性を有し、
    （ｂ）前記方法は、請求項１に記載の工程（ｅ）によって生成される磁性ビーズを含む前記液滴操作間隙内の前記サンプル液滴と、細胞溶解試薬を含む溶解液滴とを混合する工程をさらに含み、
    前記磁場を再印加して、前記磁性ビーズを固定化させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記磁性ビーズから離れた位置に液滴を輸送する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記磁性ビーズから離れた位置に前記サンプル液滴の一部を輸送する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
  7. 離れた位置に輸送された前記液滴または前記サンプル液滴の一部と、前記１つ以上の標的検体に対する親和性を有するビーズを含む液滴とを混合する工程をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記１つ以上の標的検体に対する親和性を有する前記ビーズを洗浄するために洗浄プロトコルを実施して、実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む液滴を生じる工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記実質的に精製された標的検体を含む前記ビーズを含む前記液滴を用いて解析プロトコルを実施する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記解析プロトコルを実施する工程は、前記液滴操作間隙内で達成される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む前記液滴は、前記解析プロトコルを実施する前に、前記液滴操作間隙から除去される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記解析プロトコルの結果の出力の指標を提供する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
  13. 前記実質的に精製された標的検体を含むビーズを含む液滴を、前記液滴操作間隙から除去する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
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JP2011509649A Expired - Fee Related JP5592355B2 (ja) 2008-05-13 2009-05-13 液滴アクチュエータ装置、システム、および方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US8088578B2 (ja)
EP (3) EP2672259A1 (ja)
JP (1) JP5592355B2 (ja)
DK (1) DK2279405T3 (ja)
ES (1) ES2438989T3 (ja)
WO (1) WO2009140373A2 (ja)

Families Citing this family (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1859330B1 (en) 2005-01-28 2012-07-04 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
CA2606750C (en) 2005-05-11 2015-11-24 Nanolytics, Inc. Method and device for conducting biochemical or chemical reactions at multiple temperatures
US20140193807A1 (en) 2006-04-18 2014-07-10 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead manipulation techniques
US9476856B2 (en) 2006-04-13 2016-10-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based affinity assays
US10078078B2 (en) 2006-04-18 2018-09-18 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead incubation and washing on a droplet actuator
US8637324B2 (en) 2006-04-18 2014-01-28 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead incubation and washing on a droplet actuator
US8809068B2 (en) 2006-04-18 2014-08-19 Advanced Liquid Logic, Inc. Manipulation of beads in droplets and methods for manipulating droplets
US7901947B2 (en) * 2006-04-18 2011-03-08 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based particle sorting
US7727723B2 (en) 2006-04-18 2010-06-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
US7439014B2 (en) 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
WO2007123908A2 (en) 2006-04-18 2007-11-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based multiwell operations
WO2009140671A2 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods for manipulating beads
US8716015B2 (en) 2006-04-18 2014-05-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Manipulation of cells on a droplet actuator
US8658111B2 (en) 2006-04-18 2014-02-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators, modified fluids and methods
US8980198B2 (en) * 2006-04-18 2015-03-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Filler fluids for droplet operations
US9675972B2 (en) 2006-05-09 2017-06-13 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of concentrating beads in a droplet
US8685344B2 (en) 2007-01-22 2014-04-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Surface assisted fluid loading and droplet dispensing
EP2573562A3 (en) 2007-02-09 2013-10-30 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads
EP2109774B1 (en) 2007-02-15 2018-07-04 Advanced Liquid Logic, Inc. Capacitance detection in a droplet actuator
EP2837692A1 (en) 2007-03-22 2015-02-18 Advanced Liquid Logic, Inc. Enzymatic assays for a droplet actuator
JP2010524002A (ja) * 2007-04-10 2010-07-15 アドヴァンスト リキッド ロジック インコーポレイテッド 液滴分配装置および方法
US8951732B2 (en) 2007-06-22 2015-02-10 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based nucleic acid amplification in a temperature gradient
US20100120130A1 (en) * 2007-08-08 2010-05-13 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet Actuator with Droplet Retention Structures
BRPI0815698A2 (pt) * 2007-08-24 2017-06-13 Advanced Liquid Logic Inc manipulação de contas em um atuador de gotículas.
WO2009032863A2 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator with improved top substrate
US20100236928A1 (en) * 2007-10-17 2010-09-23 Advanced Liquid Logic, Inc. Multiplexed Detection Schemes for a Droplet Actuator
US9631244B2 (en) 2007-10-17 2017-04-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Reagent storage on a droplet actuator
US20100236929A1 (en) * 2007-10-18 2010-09-23 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet Actuators, Systems and Methods
CA2709928A1 (en) * 2007-12-23 2009-07-09 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator configurations and methods of conducting droplet operations
US8617899B2 (en) * 2008-02-14 2013-12-31 Palo Alto Research Center Incorporated Enhanced drop mixing using magnetic actuation
US8852952B2 (en) 2008-05-03 2014-10-07 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of loading a droplet actuator
US20110097763A1 (en) * 2008-05-13 2011-04-28 Advanced Liquid Logic, Inc. Thermal Cycling Method
US8364315B2 (en) * 2008-08-13 2013-01-29 Advanced Liquid Logic Inc. Methods, systems, and products for conducting droplet operations
US12162008B2 (en) 2008-09-23 2024-12-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
CA2738578C (en) 2008-09-23 2021-05-04 Quantalife, Inc. Droplet-based assay system
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US9399215B2 (en) 2012-04-13 2016-07-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
US8951939B2 (en) * 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US12090480B2 (en) 2008-09-23 2024-09-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Partition-based method of analysis
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US9921154B2 (en) 2011-03-18 2018-03-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays
WO2011120006A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Auantalife, Inc. A Delaware Corporation Detection system for droplet-based assays
WO2011120024A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US8877512B2 (en) 2009-01-23 2014-11-04 Advanced Liquid Logic, Inc. Bubble formation techniques using physical or chemical features to retain a gas bubble within a droplet actuator
DE102009035291B4 (de) * 2009-07-30 2011-09-01 Karlsruher Institut für Technologie Vorrichtung zur Erzeugung einer mikrofluidischen Kanalstruktur in einer Kammer, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US8926065B2 (en) 2009-08-14 2015-01-06 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods
EP2473618B1 (en) 2009-09-02 2015-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
WO2011057197A2 (en) 2009-11-06 2011-05-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Integrated droplet actuator for gel electrophoresis and molecular analysis
WO2011066185A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Gen9, Inc. Microfluidic devices and methods for gene synthesis
EP2516669B1 (en) 2009-12-21 2016-10-12 Advanced Liquid Logic, Inc. Enzyme assays on a droplet actuator
WO2011085075A2 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Gen9, Inc. Assembly of high fidelity polynucleotides
US8283569B2 (en) * 2010-01-22 2012-10-09 The Regents Of The University Of Michigan Electrode array and method of fabrication
PL2539450T3 (pl) * 2010-02-25 2016-08-31 Advanced Liquid Logic Inc Sposób wytwarzania bibliotek kwasu nukleinowego
JP6155419B2 (ja) 2010-03-25 2017-07-05 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド 検出用の液滴輸送システム
EP2553473A4 (en) 2010-03-30 2016-08-10 Advanced Liquid Logic Inc DROPLET OPERATION PLATFORM
US10232374B2 (en) 2010-05-05 2019-03-19 Miroculus Inc. Method of processing dried samples using digital microfluidic device
EP2588322B1 (en) 2010-06-30 2015-06-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator assemblies and methods of making same
WO2012009320A2 (en) * 2010-07-15 2012-01-19 Advanced Liquid Logic, Inc. Systems for and methods of promoting cell lysis in droplet actuators
CN103429331B (zh) 2010-11-01 2016-09-28 伯乐生命医学产品有限公司 用于形成乳液的系统
WO2012107101A1 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives Method and microsystem for detecting analytes which are present in drops of liquid.
US12097495B2 (en) 2011-02-18 2024-09-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for detecting genetic material
AU2012231098B2 (en) 2011-03-18 2016-09-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
US9347059B2 (en) 2011-04-25 2016-05-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
WO2012154745A2 (en) 2011-05-09 2012-11-15 Advanced Liquid Logic, Inc. Microfluidic feedback using impedance detection
US9140635B2 (en) 2011-05-10 2015-09-22 Advanced Liquid Logic, Inc. Assay for measuring enzymatic modification of a substrate by a glycoprotein having enzymatic activity
TWI460426B (zh) * 2011-06-21 2014-11-11 Univ Nat Central 應用於毒品偵測的酸性氣體偵測方法及裝置
US8901043B2 (en) 2011-07-06 2014-12-02 Advanced Liquid Logic, Inc. Systems for and methods of hybrid pyrosequencing
WO2013009927A2 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators and techniques for droplet-based assays
WO2013016413A2 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Advanced Liquid Logic Inc Droplet actuator apparatus and system
US8906611B2 (en) * 2011-07-26 2014-12-09 Opgen, Inc. Devices and methods for immobilizing nucleic acids
EP2737089B1 (en) 2011-07-29 2017-09-06 Bio-rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US10130949B2 (en) 2011-09-19 2018-11-20 Sorbonne Universite, Centre National De La Recherche Scientifique Microfluidic system
WO2013070627A2 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
US9433943B2 (en) 2011-11-15 2016-09-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Thermal control of droplets by nanoscale field effect transistors
WO2013078216A1 (en) 2011-11-21 2013-05-30 Advanced Liquid Logic Inc Glucose-6-phosphate dehydrogenase assays
US8821705B2 (en) 2011-11-25 2014-09-02 Tecan Trading Ag Digital microfluidics system with disposable cartridges
US10222391B2 (en) 2011-12-07 2019-03-05 The Johns Hopkins University System and method for screening a library of samples
ES2665252T3 (es) 2011-12-30 2018-04-25 Abbott Molecular Inc. Purificación de ácido nucleico de microorganismos a partir de muestras del hospedador
US9223317B2 (en) 2012-06-14 2015-12-29 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuators that include molecular barrier coatings
EP2867645B1 (en) 2012-06-27 2019-06-05 Advanced Liquid Logic, Inc. Techniques and droplet actuator designs for reducing bubble formation
US9387478B2 (en) * 2012-08-17 2016-07-12 Lexmark International, Inc. Micro-fluidic modules on a chip for diagnostic applications
US9970052B2 (en) 2012-08-23 2018-05-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with a generic reporter
US9863913B2 (en) 2012-10-15 2018-01-09 Advanced Liquid Logic, Inc. Digital microfluidics cartridge and system for operating a flow cell
US20140322706A1 (en) 2012-10-24 2014-10-30 Jon Faiz Kayyem Integrated multipelx target analysis
JP1628115S (ja) 2012-10-24 2019-04-01
WO2014120998A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Luminex Corporation Fluid retention plates and analysis cartridges
CN107866286A (zh) 2013-03-15 2018-04-03 金马克诊断股份有限公司 用于操纵可变形流体容器的系统、方法和设备
US9341639B2 (en) 2013-07-26 2016-05-17 Industrial Technology Research Institute Apparatus for microfluid detection
USD881409S1 (en) 2013-10-24 2020-04-14 Genmark Diagnostics, Inc. Biochip cartridge
US9498778B2 (en) 2014-11-11 2016-11-22 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
WO2015157567A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
EP3131758B1 (en) 2014-04-16 2021-11-24 Abbott Laboratories Droplet actuator fabrication apparatus, systems, and related methods
AU2015273480A1 (en) 2014-06-11 2016-12-08 Samplix S.A.R.L. Nucleotide sequence exclusion enrichment by droplet sorting (needls)
EP3178919B1 (en) * 2014-08-08 2021-01-06 Panasonic Intellectual Property Management Co., Ltd. Nucleic acid amplification device
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
EP3218108B1 (en) 2014-11-11 2020-09-02 Genmark Diagnostics Inc. Fluid sample processing cartridge and use thereof
US9598722B2 (en) 2014-11-11 2017-03-21 Genmark Diagnostics, Inc. Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
US10005080B2 (en) 2014-11-11 2018-06-26 Genmark Diagnostics, Inc. Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation
JP6622811B2 (ja) 2014-12-31 2019-12-18 アボット・ラボラトリーズＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ デジタルマイクロ流体希釈装置、システムおよび関連方法
JP6264595B2 (ja) * 2015-03-09 2018-01-24 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 マイクロ流体デバイス
US10589273B2 (en) 2015-05-08 2020-03-17 Illumina, Inc. Cationic polymers and method of surface application
US10695762B2 (en) 2015-06-05 2020-06-30 Miroculus Inc. Evaporation management in digital microfluidic devices
CN108026494A (zh) * 2015-06-05 2018-05-11 米罗库鲁斯公司 限制蒸发和表面结垢的空气基质数字微流控装置和方法
DK3384046T3 (da) * 2015-12-01 2021-07-12 Illumina Inc Digitalt mikrofluidisk system til enkeltcelleisolering og karakterisering af analytter
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
CN109715781A (zh) 2016-08-22 2019-05-03 米罗库鲁斯公司 用于数字微流控设备中的并行液滴控制的反馈系统
EP3516401B1 (en) 2016-09-19 2025-07-30 Roche Diagnostics GmbH Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system
WO2018067878A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Abbott Laboratories Devices and methods for sample analysis
CN110383061A (zh) 2016-12-28 2019-10-25 米罗库鲁斯公司 数字微流控设备和方法
US10839948B2 (en) 2016-12-29 2020-11-17 Intel Corporation Microfluidic information-encoding polymer data storage
US11623219B2 (en) 2017-04-04 2023-04-11 Miroculus Inc. Digital microfluidics apparatuses and methods for manipulating and processing encapsulated droplets
EP3658908B1 (en) 2017-07-24 2025-11-12 Integra Biosciences AG Digital microfluidics systems and methods with integrated plasma collection device
CA3073058A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 Miroculus Inc. Digital microfluidics devices and methods of using them
EP3697927B1 (en) 2017-10-19 2022-12-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital amplification assays with unconventional and/or inverse changes in photoluminescence
TWI623487B (zh) * 2017-10-24 2018-05-11 友達光電股份有限公司 微流體感測元件及其製作方法
WO2019103730A1 (en) * 2017-11-22 2019-05-31 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Temperature-controlling microfluidic devices
AU2018353924A1 (en) 2017-12-29 2019-07-18 Clear Labs, Inc. Automated priming and library loading device
US20190262829A1 (en) 2018-02-28 2019-08-29 Volta Labs, Inc. Directing Motion of Droplets Using Differential Wetting
WO2019226919A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Miroculus Inc. Control of evaporation in digital microfluidics
US11207686B2 (en) 2018-08-21 2021-12-28 Sharp Life Science (Eu) Limited Microfluidic device and methods for digital assays in biological analyses
US10913067B2 (en) * 2018-10-01 2021-02-09 Sharp Life Science (Eu) Limited Barrier droplet configurations against migration between droplets on AM-EWOD devices
EP3917670A4 (en) 2019-01-31 2022-11-02 Miroculus Inc. ANTIFOULING COMPOSITIONS AND METHODS FOR HANDLING AND TREATING ENCAPSULATED DROPLET
US12582991B2 (en) 2019-02-28 2026-03-24 Integra Biosciences Ag Digital microfluidics devices and methods of using them
GB201902810D0 (en) * 2019-03-01 2019-04-17 Vidya Holdings Ltd Disposition of reagents in assay device
CN114206499B (zh) 2019-04-08 2024-10-08 米罗库鲁斯公司 多盒式数字微流控装置和使用方法
FR3096905A1 (fr) * 2019-06-06 2020-12-11 Centre National De La Recherche Scientifique Puce microfluidique pour la structuration d’agrégat de cellules par exclusion optique et lévitation acoustique.
US11376597B2 (en) * 2019-07-08 2022-07-05 Sharp Life Science (Eu) Limited Use of multiple filler fluids in an EWOD device via the use of an electrowetting gate
US11524298B2 (en) 2019-07-25 2022-12-13 Miroculus Inc. Digital microfluidics devices and methods of use thereof
JP2022547801A (ja) * 2019-08-27 2022-11-16 ヴォルタ ラブズ，インク． 液滴操作のための方法およびシステム
WO2021252923A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Genmark Diagnostics, Inc. Systems and methods for assessing bays on diagnostic devices
WO2022043697A1 (en) * 2020-08-26 2022-03-03 Sense Biodetection Limited Devices
JP2023539299A (ja) 2020-08-26 2023-09-13 センス バイオディテクション リミテッド デバイス
AU2021347675A1 (en) * 2020-09-22 2023-04-20 Catalog Technologies, Inc. Temperature-controlled fluidic reactions system
WO2022256514A1 (en) * 2021-06-02 2022-12-08 Baebies, Inc. Micro-regional thermal control for digital microfluidics
US11772093B2 (en) 2022-01-12 2023-10-03 Miroculus Inc. Methods of mechanical microfluidic manipulation
US20250283151A1 (en) * 2022-05-02 2025-09-11 University Of Cincinnati Methods for nuclear extraction and amplification using a bio-field programmable gate array
CN116347782B (zh) * 2023-01-10 2024-08-20 湖北全成信精密电路有限公司 碳油印刷的制作方法
WO2026006598A1 (en) * 2024-06-28 2026-01-02 Idexx Laboratories, Inc. Methods, systems and devices for electrowetting analysis

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2319175A1 (de) 1973-04-16 1974-10-31 Oxford Lab Detail-kolbenpipette
CH596313A5 (ja) 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5038852A (en) 1986-02-25 1991-08-13 Cetus Corporation Apparatus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
FR2599369B1 (fr) 1986-05-30 1989-03-31 Europ Propulsion Procede de preparation de disilylmethanes
GB8917963D0 (en) * 1989-08-05 1989-09-20 Scras Apparatus for repeated automatic execution of a thermal cycle for treatment of biological samples
US5498392A (en) 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
EP0636413B1 (en) * 1993-07-28 2001-11-14 PE Corporation (NY) Nucleic acid amplification reaction apparatus and method
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
DE19717085C2 (de) * 1997-04-23 1999-06-17 Bruker Daltonik Gmbh Verfahren und Geräte für extrem schnelle DNA-Vervielfachung durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)
EP0965044B1 (en) 1997-11-18 2003-03-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplex flow immunoassays with magnetic particles as solid phase
US6565727B1 (en) 1999-01-25 2003-05-20 Nanolytics, Inc. Actuators for microfluidics without moving parts
US6294063B1 (en) * 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6977145B2 (en) * 1999-07-28 2005-12-20 Serono Genetics Institute S.A. Method for carrying out a biochemical protocol in continuous flow in a microreactor
US6773566B2 (en) 2000-08-31 2004-08-10 Nanolytics, Inc. Electrostatic actuators for microfluidics and methods for using same
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US7217542B2 (en) * 2002-10-31 2007-05-15 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic system for analyzing nucleic acids
GB0304033D0 (en) 2003-02-21 2003-03-26 Imp College Innovations Ltd Apparatus
US7041481B2 (en) * 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
TWI230760B (en) * 2003-07-29 2005-04-11 Univ Tsinghua Electrowetting electrode design with electromagnetic field for actuation of the magnetic-beads biochemical detection system
CA2479452C (en) 2003-08-30 2008-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Method and device for determining analytes in a liquid
CA2553833C (en) * 2004-01-28 2012-10-02 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
FR2866493B1 (fr) 2004-02-16 2010-08-20 Commissariat Energie Atomique Dispositif de controle du deplacement d'une goutte entre deux ou plusieurs substrats solides
KR100552706B1 (ko) * 2004-03-12 2006-02-20 삼성전자주식회사 핵산 증폭 방법 및 장치
JP4547301B2 (ja) 2005-05-13 2010-09-22 株式会社日立ハイテクノロジーズ 液体搬送デバイス及び分析システム
CN101371124B (zh) * 2006-02-13 2012-02-29 新加坡科技研究局 处理生物样品和/或化学样品的方法
EP2016189B1 (en) * 2006-04-18 2012-01-25 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
US7816121B2 (en) * 2006-04-18 2010-10-19 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuation system and method
US7439014B2 (en) * 2006-04-18 2008-10-21 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based surface modification and washing
US8685754B2 (en) * 2006-04-18 2014-04-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods for immunoassays and washing
US7727723B2 (en) 2006-04-18 2010-06-01 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet-based pyrosequencing
US7629124B2 (en) 2006-06-30 2009-12-08 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Real-time PCR in micro-channels
US8338166B2 (en) * 2007-01-04 2012-12-25 Lawrence Livermore National Security, Llc Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture
EP2573562A3 (en) * 2007-02-09 2013-10-30 Advanced Liquid Logic, Inc. Droplet actuator devices and methods employing magnetic beads
US20080283414A1 (en) 2007-05-17 2008-11-20 Monroe Charles W Electrowetting devices
WO2010054515A1 (zh) 2008-11-17 2010-05-20 上海医药工业研究院 4-(1-羟基-1-甲基乙基)-2-丙基咪唑-5-羧酸酯的制备方法

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