JP5773392B2 - Ｌ−セリンを含有する末梢神経障害の予防・治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、末梢神経障害の予防・治療剤や、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
末梢神経は、中枢神経系以外のすべての神経、すなわち脳と脊髄（せきずい）以外のすべての神経であり、運動神経や感覚神経を含む。末梢神経が、虚血、抗癌剤投与、糖尿病、感染症などの内的因子や、事故による外傷などの外的因子により侵されると、末梢神経の機能障害（末梢神経障害）が起こり、感覚障害、麻痺、疼痛、筋力低下、筋肉萎縮、深部腱反射低下、血管運動神経症状等の末梢神経障害症状が生じる。末梢神経障害の症状は長期間持続することが多く、患者の生活の質（Quality of life：ＱＯＬ）を低下させる。
末梢神経障害の中でも、抗癌剤投与や糖尿病によるものは、症状が重篤になり得ることや、障害に罹患している患者数が多いことから、特に問題とされている。例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標））は、卵巣癌、乳癌、肺癌など多くの種類の悪性腫瘍に対して用いられる最も効果的な抗癌剤のひとつである。しかし、パクリタキセルを投与すると、副作用として末梢神経障害（機械誘発性アロディニア、冷感アロディニア、継続する灼熱痛、うずき、しびれ）や骨髄抑制が高率で発生することが知られている。このような末梢神経障害に対しては、鎮痛剤、ビタミン剤（ビタミンＢ剤）、ステロイド等の対症療法が行われているが、十分な効果は得られない。そのため、末梢神経障害がパクリタキセルの用量規制因子となり、化学療法中断の原因となることも少なくない。
以上のようなことから、末梢神経障害を改善する手段が強く求められている。そのため、末梢神経障害を改善する試みがこれまでにもなされている。例えば特許文献１には、ホスファチジルセリンを有効成分とする末梢神経障害改善剤が記載されている。また、特許文献２には、脳下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化ポリペプチドを有効成分とする薬剤投与による末梢神経障害の軽減剤が記載されている。
Ｌ−セリン（(Ｓ)−２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸）は、非必須アミノ酸の１種である。Ｌ−セリンは、プリン、ピリミジン、システインなどの生合成に関与するため、代謝において重要である。生体内では、Ｌ−セリンは、解糖系の中間体である３−ホスホグリセリン酸から、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.95）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.52）、及び、ホスホセリンホスファターゼ（EC 3.1.3.3）の３つの酵素の働きを順に経て合成される。
非特許文献１には、Ｌ−セリンが、ニワトリの胚細胞における後根神経節の神経突起の伸長をインビトロにおいて促進することが記載されている。また、非特許文献２には、Ｌ−セリンが、ラット胎児細胞由来の海馬ニューロンの生存をインビトロにおいてサポートすることが記載されている。さらに、非特許文献３には、Ｌ−セリンが、ラット胎児由来の小脳のプルキンエニューロンの生存や分化をインビトロにおいて促進することが記載されている。このように、非特許文献１〜３はいずれも、Ｌ−セリンが発生期における中枢神経系に対してどのような作用を示すかをインビトロにおいて確認したに過ぎない。
J. Neurosci. Methods, (1995) 61, 159-167
Neurosci. Res., (1998) 30, 195-199
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000), 97, 11528-11533
本発明の課題は、実用的な末梢神経障害の予防・治療剤を提供することや、実用的な末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行い、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の知見を見い出した。
（Ａ）インビボにおいて、パクリタキセルは、坐骨神経や脊髄におけるＬ−セリン濃度は低下させないが、末梢神経である後根神経節（ＤＲＧ）におけるＬ−セリン濃度を低下させること。
（Ｂ）インビボにおいて、パクリタキセルが、ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨ（３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）の発現を低下させること。
（Ｃ）免疫組織化学染色によると３ＰＧＤＨはＤＲＧのニューロンではなく、衛星細胞に局在していること。
（Ｄ）パクリタキセル（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｅ）オキサリプラチン（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｆ）ストレプトゾトシン（糖尿病誘発剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、予防・改善すること。
（Ａ）インビボにおいて、パクリタキセルは、坐骨神経や脊髄におけるＬ−セリン濃度は低下させないが、末梢神経である後根神経節（ＤＲＧ）におけるＬ−セリン濃度を低下させること。
（Ｂ）インビボにおいて、パクリタキセルが、ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨ（３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ）の発現を低下させること。
（Ｃ）免疫組織化学染色によると３ＰＧＤＨはＤＲＧのニューロンではなく、衛星細胞に局在していること。
（Ｄ）パクリタキセル（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｅ）オキサリプラチン（抗癌剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、改善すること。
（Ｆ）ストレプトゾトシン（糖尿病誘発剤）によって誘導される末梢神経障害が、Ｌ−セリンの投与によって、予防・改善すること。
つまり、本発明者らは、Ｌ−セリンがインビボにおいて各種の末梢神経障害を改善すること等の知見を見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、（１）Ｌ−セリンを含有する末梢神経障害の予防・治療剤や、（２）末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする上記（１）に記載の末梢神経障害の予防・治療剤や、（３）末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の末梢神経障害の予防・治療剤に関する。
また本発明は、（４）以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を有することを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法：（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：や、（５）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法：（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：に関する。
本発明によれば、末梢神経障害を予防又は治療することができる。しかも、本発明における末梢神経障害の予防・治療効果は、インビボにおいても実証されているため、実用性がきわめて高い。また、本発明を、抗癌剤による末梢神経障害に用いる場合は特に、抗癌剤の選択の幅が広がったり、抗癌剤の投与量を十分に確保することが可能となり、その結果、癌患者の生存率や予後の改善が期待できる。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、末梢神経障害の予防・治療剤を効率的にスクリーニングすることができる。
本発明の末梢神経障害の予防・治療剤（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、Ｌ−セリンを含有している組成物であれば特に制限されず、また本発明と技術的に同範疇の発明として、末梢神経障害の予防・治療方法や、Ｌ−セリンの使用方法の発明を挙げることができる。上記末梢神経障害の予防・治療方法としては、Ｌ−セリンを対象に投与する方法であれば特に制限されず、そしてまた、Ｌ−セリンの使用方法としては、Ｌ−セリンを末梢神経障害の予防・治療剤の調製のために使用する方法であれば特に制限されない。後述の実施例の結果から明らかなように、Ｌ−セリンは様々な原因による末梢神経障害に対する予防・治療効果を有しているからである。なお、本明細書における「末梢神経障害に対する予防・治療効果」とは、末梢神経障害の発症を抑制（予防）、及び／又は、末梢神経障害を改善（治療）する効果を意味し、中でも、機械誘発性アロディニアや痛覚過敏や感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）の低下を予防及び／又は治療する効果を好適に含む。
本発明におけるＬ−セリンとしては、市販のものを用いることができ、天然物由来であってもよいし、合成したものであってもよい。
本発明の予防・治療剤中のＬ−セリンの含有量としては、特に制限されないが、該予防・治療剤全量に対して例えば０．０１〜１００質量％、好ましくは０．５〜１００質量％、より好ましくは５〜１００質量％、さらに好ましくは２０〜１００質量％、より好ましくは５０〜１００質量％、さらに好ましくは７０〜９５質量％を好適に例示することができる。
本発明の予防・治療剤中に含まれる全アミノ酸（又はアミノ酸残基）のモル数に対する、Ｌ−セリンのモル数の好適な割合（％）としては、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくはＬ−セリン以外のアミノ酸を含まないことを好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤中のＤ−セリンのモル数に対するＬ−セリンのモル数の好適な割合（％）としては、例えば４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上を好適に例示することができ、さらには、Ｄ−セリンを含まないことを最も好適に例示することができる。
本発明の末梢神経障害の予防・治療効果を確認する方法としては、特に制限されないが、感覚障害、麻痺、疼痛、筋力低下、筋肉萎縮、深部腱反射低下、血管運動神経症状等の末梢神経障害症状が軽減するかを確認する公知の方法を利用することができる。
本発明の予防・治療剤における末梢神経障害の予防・治療効果の好適な程度としては、２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを隔日で４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入したラットに、本発明の予防・治療剤をＤ１〜Ｄ２８まで毎日腹腔内投与または経口投与したときのＤ２９におけるvon Frey刺激（４ｇ、８ｇ又は１５ｇ）に対する引込み反応の割合が、本発明の予防・治療剤を投与しなかった場合のその割合と比較して、２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上低下することを好適に例示することができる。
また、本発明の予防・治療剤における末梢神経障害の予防・治療効果の好適な程度の他の態様としては、２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを隔日で４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入したラットに、本発明の予防・治療剤をＤ１〜Ｄ２８まで毎日腹腔内投与または経口投与したときのＤ２９における感覚神経伝導速度試験（記録用の針電極は尾部の肛門から２ｃｍ及び８ｃｍの位置に注入し、刺激電極は肛門から１２ｃｍの位置に設置し、また、ラットの皮膚温度は３６〜３７℃に維持して行った試験）で、２箇所の記録用針電極で記録された電位の潜時が、本発明の予防・治療剤を投与しなかった場合のその潜時と比較して、４％以上、好ましくは６％以上、さらに好ましくは８％以上低下することを好適に例示することができる。
本発明の予防・治療剤は、所望の末梢神経障害の予防・治療効果が得られる限り、Ｌ−セリンの他に、他の末梢神経障害の予防・治療剤等の任意成分を含んでいてもよい。
本発明の予防・治療剤に含有されるＬ−セリンは、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、末梢神経障害の優れた予防・治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＬ−セリンを溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＬ−セリンを製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
本発明の予防・治療剤の投与方法としては、所望の末梢神経障害の予防・治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与等を例示することができ、中でも、静脈内投与、経口投与を好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象の末梢神経障害の状態や、投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができるが、一日あたりのＬ−セリン換算で、例えば、０．００１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１ｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１００ｍｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは１０ｎｍｏｌ／ｋｇ〜５ｍｍｏｌ／ｋｇを投与することができる。
本発明の予防・治療剤の適用対象となる末梢神経障害の種類としては、特に制限されず、抗癌剤投与、糖尿病、虚血、感染症などの内的因子により引き起こされる末梢神経障害であってもよいし、事故による外傷などの外的因子によって引き起こされる末梢神経障害であってもよいが、抗癌剤投与、糖尿病、虚血、感染症などの内的因子により引き起こされる末梢神経障害を好適に例示することができ、中でも、抗癌剤投与や、糖尿病により引き起こされる末梢神経障害をより好適に例示することができ、中でも、抗癌剤投与により引き起こされる末梢神経障害をさらに好適に例示することができる。かかる抗癌剤としては、投与により末梢神経障害を引き起こし得る抗癌剤である限り特に制限されないが、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系抗癌剤；オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の白金錯体系抗癌剤；ビンクリスチン等のビンカアルカロイド系抗癌剤；イホスファミド等のアルキル化剤系抗癌剤；メトトレキサート、フルオロウラシル、シタラビン等の代謝拮抗性抗癌剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン等の抗生物質系抗癌剤；を好適に例示することができ、中でも、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系抗癌剤；オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の白金錯体系抗癌剤；をより好適に例示することができ、中でも、パクリタキセル、オキサリプラチンを特に好適に例示することができる。また、本発明の予防・治療剤の適用対象となるその他の好ましい末梢神経障害としては、ＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度の低下が関与する末梢神経障害を例示することができる。
本発明の予防・治療剤の投与対象としては、哺乳動物である限り特に制限されず、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
本発明の末梢神経障害の予防・治療方法におけるＬ−セリンの投与方法等については、本発明の予防・治療剤について前述したのと同様である。また、本発明の予防・治療剤の調製のための使用において、Ｌ−セリンを本発明の予防・治療剤に調製する方法も、本発明の予防・治療剤について前述したのと同様である。
本発明の末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：及び、（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：を有するか、又は、（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：及び、（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：を有している限り特に制限されない。このような本発明の末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法によれば、末梢神経障害の予防・治療剤を効率良くスクリーニングすることができ、すなわち、実用性の高い末梢神経障害の予防・治療剤を効率良くスクリーニングすることができる。
上記のスクリーニング方法における末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物としては、末梢神経障害を自然に発症した非ヒト哺乳動物であってもよいし、抗癌剤（好ましくはパクリタキセル、オキサリプラチン）や糖尿病誘発剤（好ましくはストレプトゾトシン）等の末梢神経障害誘導剤を投与することによって末梢神経障害を人為的に発症させた非ヒト哺乳動物であってもよい。
上記の工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定は、ＨＰＬＣ等を用いて行うことができ、上記の工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量の測定は、後根神経節細胞についてのウェスタンブロット等により行うことができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［使用した動物、及び、該動物の一般的な健康状態］
本願実施例のすべての実験は、札幌医科大学動物実験委員会により承認され（Ｎｏ．０８−０２８）、アメリカ国立衛星研究所（National Institutes of Health）の倫理指針に従って行われた。本願実施例の実験には、成熟した雄のSprague-Dawley ラット(実験開始時の体重１６０〜２００ｇ；日本エスエルシー社製)を用いた。ラットは、温度制御（２１±１℃）された室内で１２時間の明暗周期で飼育し、食品及び水は自由に与えた。
本願実施例のすべての実験は、札幌医科大学動物実験委員会により承認され（Ｎｏ．０８−０２８）、アメリカ国立衛星研究所（National Institutes of Health）の倫理指針に従って行われた。本願実施例の実験には、成熟した雄のSprague-Dawley ラット(実験開始時の体重１６０〜２００ｇ；日本エスエルシー社製)を用いた。ラットは、温度制御（２１±１℃）された室内で１２時間の明暗周期で飼育し、食品及び水は自由に与えた。
なお、実験開始時のラットの平均体重は、ビヒクル処理群、パクリタキセル処理群でそれぞれ、１６７ｇ及び１７５ｇであった。ビヒクル処理群及びパクリタキセル処理群の各ラットは、通常通りに体重が増加し続け、実験期間終了時（Ｄ４３）のラットの平均体重は、ビヒクル処理群、パクリタキセル処理群でそれぞれ、４０３ｇ及び４０７ｇであった。実験の４３日間中の、２つの群の平均体重増加量に有意な差はなかった。全てのラットは、脱毛症（alopecia）や下痢を含む健康障害を示すことなく、実験の終了時まで生存した。
また、以下のすべての実施例におけるデータは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した。また、各データは、Mann-Whitney U test又はKruskal-Wallis test及びその後のBonferroni’s testにより分析した。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。統計分析は、Statview 5.0ソフトウェア（Abacus Concepts社製）及びNP Multi (Nagata T 社製)を用いて行った。
［パクリタキセルによる末梢神経障害モデルラットの作製］
パクリタキセル（Sigma社製）を、６ｍｇ／ｍＬでクレモフォールＥＬ／無水エタノールに溶解し、次いで、最終濃度２ｍｇ／ｋｇ／ｍＬになるまで生理食塩水で希釈することによって、投与用のパクリタキセル溶液を調製した。また、パクリタキセルを用いずに、前述のパクリタキセル溶液と同様の割合でクレモフォールＥＬ／無水エタノールと生理食塩水とを混合することによって、ビヒクル（コントロール溶液）を調製した。
パクリタキセル（Sigma社製）を、６ｍｇ／ｍＬでクレモフォールＥＬ／無水エタノールに溶解し、次いで、最終濃度２ｍｇ／ｋｇ／ｍＬになるまで生理食塩水で希釈することによって、投与用のパクリタキセル溶液を調製した。また、パクリタキセルを用いずに、前述のパクリタキセル溶液と同様の割合でクレモフォールＥＬ／無水エタノールと生理食塩水とを混合することによって、ビヒクル（コントロール溶液）を調製した。
実施例１で用意したパクリタキセル処理群のラットには前述のパクリタキセル溶液を、また、ビヒクル処理群のラットには前述のビヒクルを、Polomano et al（Pain 2001; 94:293-304）記載の方法で、隔日４回（Ｄ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７）腹腔内注入した。なお、パクリタキセル処理又はビヒクル処理の開始前と開始後に各ラットの体重を測定し、記録した。
（von Freyテスト）
これらの両群のラットについて、文献（Pain 2006; 122: 245-57）記載のvon Freyテストを行い、機械感受性の評価を行った。具体的には以下のような方法で行った。
これらの両群のラットについて、文献（Pain 2006; 122: 245-57）記載のvon Freyテストを行い、機械感受性の評価を行った。具体的には以下のような方法で行った。
透明のプラスチック製の折畳み式ケージ (寸法２９×１８×１３ｃｍ)内に、金網床をある程度の高さになるように配置した。この金網床の上に、各ラットを収容して２０分間放置し、この環境に順応させた。次に、曲げに要する力が４ｇ、８ｇ、及び１５ｇである３本のvon Freyフィラメントを用意し、それぞれのvon Freyフィラメントで、ラットの後肢の足裏の皮膚に１回につき５秒ずつ、１０回の刺激を与えた。von Freyフィラメントに対する後肢の引込み反応を計測し、後肢の引込み反応の回数を、与えた刺激の回数に対する割合（％）として表した。
このvon Freyテストを、パクリタキセル又はビヒクル処理前（Ｄ０）及び、処理開始後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９、Ｄ３６及びＤ４３に、両群（各群ｎ＝６）について行った。なお、パクリタキセルに誘導される４ｇに対する反応は、一般的にアロディニアと呼ばれ、１５ｇに対する反応は知覚過敏症と呼ばれ、８ｇに対する反応はそれらの中間である（Pain 2004; 109:150-161）。このvon Freyテストの結果を図１Ａに示す。図１Ａの結果から分かるように、パクリタキセル溶液又はビヒクルの初回の注入前のＤ０には、パクリタキセル処理群とビヒクル処理群との間に、４ｇ、８ｇ又は１５ｇのvon Frey 刺激に対する反応に有意な差はみられなかった。しかし、パクリタキセル処理群の４ｇ及び１５ｇのvon Frey刺激に対する引込み反応の割合は、ビヒクル処理群と比較して、Ｄ２２、Ｄ２９、及びＤ３６で有意に上昇した（図１Ａ）。さらに、パクリタキセル処理群の８ｇに対する反応も、ビヒクル処理群と比較して、Ｄ２２及びＤ２９で有意に上昇した（図１Ａ）。これらの結果から、パクリタキセルに誘導される機械的アロディニア／知覚過敏症の発症が示された。
（感覚神経伝導速度試験）
次に、前述のパクリタキセル処理群のラット及びビヒクル処理群のラットについて、感覚神経伝導速度試験を行った。各ラットにおけるvon Freyフィラメントに対する後肢の引込み反応を測定した直後、すなわち、パクリタキセル又はビヒクル処理前（Ｄ０）及び、処理開始後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９、Ｄ３６及びＤ４３に、各ラットの尾部の感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）を、刺激及び、記録用の電子機器（Neuropak 2: 日本光電工業株式会社製）を使用して測定した。尾部のＳＮＣＶは、文献（Clin Cancer Res 2003; 9: 5756-67）記載の通りに測定した。具体的には、以下のような方法で行った。
次に、前述のパクリタキセル処理群のラット及びビヒクル処理群のラットについて、感覚神経伝導速度試験を行った。各ラットにおけるvon Freyフィラメントに対する後肢の引込み反応を測定した直後、すなわち、パクリタキセル又はビヒクル処理前（Ｄ０）及び、処理開始後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９、Ｄ３６及びＤ４３に、各ラットの尾部の感覚神経伝導速度（ＳＮＣＶ）を、刺激及び、記録用の電子機器（Neuropak 2: 日本光電工業株式会社製）を使用して測定した。尾部のＳＮＣＶは、文献（Clin Cancer Res 2003; 9: 5756-67）記載の通りに測定した。具体的には、以下のような方法で行った。
ペントバルビタール腹腔内注射でラットに軽麻酔を施した。次いで、記録用の針電極を、尾部の肛門から２ｃｍ及び８ｃｍの位置に注入した。刺激電極は、肛門から１２ｃｍの位置に設置した。神経刺激後、２箇所で記録された電位の潜時（ピークからピークまで）を測定し、それによりＳＮＣＶを算出した。なお、ラットの皮膚温度は、実験中３６〜３７℃に維持した。算出したＳＮＣＶの結果を図１Ｂに示す。図１Ｂの結果から分かるように、Ｄ０では、パクリタキセル処理群とビヒクル処理群ではＳＮＣＶは同程度だった。しかし、処理後においては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較してＳＮＣＶが低下した（図１Ｂ）。特に、Ｄ１５（３４．６±０．７ ｖｓ ３８．４±０．９ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）、Ｄ２９（３９．５±０．９ ｖｓ ４２．８±１．１ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）及びＤ３６（４１．６±０．５ ｖｓ ４３．０±０．６ｍ／ｓ、Ｐ＜０．０５）においては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較してＳＮＣＶが有意に低下した（図１Ｂ）。
以上のことから、パクリタキセル処理により、末梢神経障害モデルラットが作製されたことが示された。
［パクリタキセル処理の、神経におけるセリン量への効果］
神経におけるセリン量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下の実験を行った。
神経におけるセリン量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下の実験を行った。
von Freyフィラメントへの反応測定及びＳＮＣＶの測定前のＤ０、並びに、測定後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ４３に、ウレタンでラットに深麻酔を施し、ラットを断頭した。そのラットから脊髄、坐骨神経及びＬ３／４／５ＤＲＧを迅速に除去し、−８０℃で凍結した。脊髄、坐骨神経及びＤＲＧのサンプルを、氷上のメタノールでホモジネートした。メタノールの添加量は、サンプル重量の１０倍であった。ホモジネートを、１５，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を、１０倍量の蒸留水で希釈し、１／４量（ｖ）の５ｍＭ オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）／Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）溶液を添加した。室温で２分間静置させた後、反応液を２０μＬ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）システムに注入した。ＨＰＬＣシステムは、２つのＥＰ−３００ポンプ（Eicom Corporation社製）、ＤＧ−３００移動相脱ガス装置（Eicom Corporation社製）、ＡＴＣ−３００カラムオーブン（Eicom Corporation社製）及びＦＬＤ−３７０蛍光検出器（Eicom Corporation社製）を備える。サンプルと標準溶液を自動的に誘導体化し、Ｍ−２３１ＳＬオートサンプラー（Eicom Corporation社製）にてＭＰＬＣシステムに注入した。ＯＰＡ／ＮＡＣ中のＤ−セリン及びＬ−セリンのジアステレオマー誘導体を、ＳＣ−５ＯＤＳ逆相カラム（１５０×３ｍｍ i.d.、粒径５μｍ；Eicom Corporation社製）にて分離し、３４０ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発光波長でモニタリングした。５ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａを含むメタノールと０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）との混合物（８６：１４、ｖ／ｖ）を移動相として使用した。Ｄ−セリン及びＬ−セリン誘導体の溶出後、５ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ−２Ｎａを含むメタノールと０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）との混合物（８：２、ｖ/ｖ）で遅い溶出ピークを流出させた。流出は、注入後１４．０分から１５．０分にかけて行った。移動相流出速度は、０．５ｍＬ／分に設定し、カラム温度は、３０℃に設定した。Ｄ−セリン及びＬ−セリンの保持時間は、それぞれ１１．４５分と１２．５分であった。この方法は、本発明者が修正したAswad（Anal Biochem 1984; 137: 405-9）の方法にしたがった、アミノ酸の光学的異性体分離法に基づくものである。
これらのＨＰＬＣの結果を図２に示す。図２Ａの左のグラフには、Ｌ−セリン及びＤ−セリンを含む標準溶液についてのＨＰＬＣの結果を示し、図２Ａの右のグラフには、ＤＲＧサンプルについてのＨＰＬＣの結果を示す。図２Ａの結果から分かるように、このＨＰＬＣにおいて、Ｌ−セリン及びＤ−セリンを同時に分離し、測定することができることが示された。図２Ｂには脊髄におけるＬ−セリン量の測定結果を示し、図２Ｃには坐骨神経におけるＬ−セリン量の測定結果を示し、図２ＤにはＤＲＧにおけるＬ−セリン量の測定結果を示す。坐骨神経及び脊髄におけるＬ−セリン濃度に関しては、ビヒクル処理群とパクリタキセル処理群との間に有意な差は見られなかった（図２Ｂ及びＣ）。一方、末梢神経であるＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度に関しては、パクリタキセル処理群では、ビヒクル処理群と比較して低下傾向を示し、特に、Ｄ１５（５．９±０．４２ ｖｓ １０．０±０．９９ｎｇ／ｍｇ、Ｐ＜０．０５）及びＤ２２（７．７±０．５ ｖｓ ９．５±０．５ｎｇ／ｍｇ、Ｐ＜０．０５）においては、有意な低下を示した（図２Ｄ）。なお、Ｄ−セリン濃度についても同様の測定を行ったが、坐骨神経、脊髄及びＤＲＧのいずれにおいても、ビヒクル処理群とパクリタキセル処理群との間に有意な差は見られなかった（データは示さず）。
［パクリタキセル処理の３ＰＧＤＨ発現への効果］
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの発現量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下のウェスタンブロットを行った。なお、３ＰＧＤＨは、３−ホスホグリセリン酸からのＬ−セリン生合成における初期酵素であり、３−ホスホグリセリン酸から３−ホスホヒドロキシピルビン酸を生成する酵素である。
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの発現量が、パクリタキセル処理によりどのような影響を受けるかを調べるために、以下のウェスタンブロットを行った。なお、３ＰＧＤＨは、３−ホスホグリセリン酸からのＬ−セリン生合成における初期酵素であり、３−ホスホグリセリン酸から３−ホスホヒドロキシピルビン酸を生成する酵素である。
ビヒクル又はパクリタキセル処理後のＤ８、Ｄ１５、Ｄ１２、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ４３に、ウェスタンブロットを行った。具体的には以下のような方法で行った。ラットの腹腔内にウレタン（３．０ｇ／ｋｇ）を注入して深麻酔を施した後、ラットを断頭した。そのラットから、両側のＬ３−５ ＤＲＧを迅速に除去し、そのＤＲＧを、氷上のＰＢＳ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma社製）中でホモジネートした。粗ホモジネートを、１５，０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。上清を回収した後、上清中のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としたＤＣタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories社製）により測定した。等量のタンパク質を、ラウリル酸硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（４％）で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Millipore社製）に転写した。この膜を、１０％スキムミルクを含むＰＢＳ中のモルモット抗３ＰＧＤＨ抗体（１μｇ／ｍＬ）にて、４℃で、一晩インキュベートした。次いで、上記膜におけるモルモット抗３ＰＧＤＨ抗体を免疫反応で検出することにより、ＤＲＧ中の３ＰＧＤＨ濃度を測定した。また、ハウスキーピングタンパク質である、アクチンの濃度も、ウサギ抗アクチン抗体（１：５，０００；Ａ２０６６、Sigma社製）を用いて測定した。なお、免疫反応については、化学発光増幅法及び化学発光検出システム（AmershamBiosciences社製）を用いて可視化した。なお、バンドの強度は、イメージデンシトメーター（ＮＩＨImage 1.63; National Institutes of Health社製）を用いて判定し、β−アクチンの強度で標準化した。
これらのウェスタンブロットの結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、パクリタキセル処理群におけるＤＲＧの３ＰＧＤＨタンパク質レベル（３ＰＧＤＨ／βアクチン）は、ビヒクル処理群のそのレベルと比較して、Ｄ１５（２．５±０．２ ｖｓ ３．９±０．３、Ｐ＜０．０５）、及びＤ２２（３．０±０．３ ｖｓ ４．６±０．２、Ｐ＜０．０５）に有意な低下が示された。ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨ発現のこの経時変化は、ＤＲＧにおけるＬ−セリン濃度の経時変化（図２Ｄ）と一致した。
［ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの局在］
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの局在を調べるために、以下の免疫組織化学的解析を行った。
ＤＲＧにおける３ＰＧＤＨの局在を調べるために、以下の免疫組織化学的解析を行った。
免疫組織化学的解析には、以下のポリクロナール抗体を使用した。モルモット抗３ＰＧＤＨ抗体（１．０μｇ／ｍＬ；北海道大学から提供）、ウサギ抗タンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５）（１：４０００、ＲＡ９５１０１；Ultraclone社製）、マウス抗ＣＤ３１抗体（１：１００、１０Ｒ−ＣＤ３１ｇＲＴ；Fitzgerald社製）及びウサギ抗Ｓ−１００β抗体（１：１００、ＲＹ３３０；矢内原研究所製）。なお、これまでの研究により、上記の抗３ＧＰＤＨ抗体の特異性が確認されている（J. Neurosci 2001; 21: 7691-704; Arch Histol Cytol2003; 66: 429-36）。ラットに５０ｍｇ／ｋｇのケタミンを腹腔内注射して、深麻酔を施した後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝液（９６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ及び２５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏを含む水溶液）で経心的に灌流を行った。左側のＬ４ ＤＲＧを除去し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むリン酸緩衝液（ＰＢ）に２時間浸漬して固定した。次にＤＲＧを、２５％スクロースを含むＰＢＳ（９．６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ、２．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏ及び１３６ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液）内で一晩４℃にて凍結保護した。このＤＲＧを、Tissue-Tek包埋培地（Sakura社製）内に入れた後、急速凍結した。凍結した切片を、スライディングクリオスタット（Sakura社製）を用いて２０μｍに切断し、ゼラチンでコーティングされたスライド上に解凍して載せた。この組織切片をＰＢＳ中で洗浄し、１０％の正常ロバ血清及び０．２％のTritonX-100(Sigma社製)を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）からなるブロッキング溶液で、室温にて１時間インキュベートした。その後、切片を、一次抗体の混合物中で一晩インキュベートした。切片をＰＢＳ−Ｔでリンスした後、ＰＢＳ−Ｔで５０１倍希釈したAlexa Fluor 488-、Alexa 597-、及びAlexa 647 標識種特異的二次抗体（Invitrogen社製）溶液でその切片を室温にて２時間インキュベートした。２次抗体の蛍光イメージは、共焦点レーザー走査顕微鏡（Digital Eclipse C1; Nikon社製）で得た。にじみや蛍光色素分子の交差励起を防ぐために、line-by-line 連続スキャニングにより、各イメージにつき１つのスタックを得た。
これらの免疫組織化学的解析の結果を図４に示す。図４Ａは、ＤＲＧの組織切片を、３ＰＧＤＨ、ＰＧＰ９．５（ニューロンのマーカー）、ＣＤ３１（血管マーカー）について三重染色したイメージを表している。３ＰＧＤＨの強力な免疫染色が、ＤＲＧニューロンの体細胞の多くを取り巻く大きなリング様構造として観察された（図４Ａ）。次に、ＤＲＧの組織切片を、３ＰＧＤＨ、Ｓ１００β（衛星細胞のマーカー）について二重染色した。図４Ｂ１は３ＰＧＤＨについて染色したイメージを示し、図４Ｂ２はＳ１００βについて染色したイメージを示し、図４Ｂ３は図４Ｂ１と図４Ｂ２のイメージを重ねたイメージを示す。図４Ｂ１〜Ｂ３から分かるように、３ＰＧＤＨの免疫染色と、Ｓ１００β（衛星細胞のマーカー）の免疫染色とが重複することが観察された。このことから、３ＰＧＤＨは、文献（Neurosci Res 1998; 30: 195-9）記載の通り、衛星細胞に局在していることが示された。さらに３ＰＧＤＨの免疫染色は、血管マーカーであるＣＤ３１の免疫染色と隣接していた（図４Ａ）。以上の結果から、３ＰＧＤＨが、血管とＤＲＧニューロンの細胞体との間に位置する衛星細胞に局在していることが示された。
［パクリタキセルによる末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
末梢神経障害（特に、機械的アロディニア／知覚過敏症、及び、ＳＮＣＶの低下）に対するＬ−セリンの効果を確認するために、上記実施例２で作製した末梢神経障害モデルラットを用いたＬ−セリン投与を行い、von Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。具体的には、腹腔内投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）、０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）若しくは０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）、又は、ビヒクル（０．９％の生理食塩水）（１ｍＬ）をさらに腹腔内投与したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。また、経口投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）をさらに経口投与（胃管を経口的に挿入して投与）したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。
末梢神経障害（特に、機械的アロディニア／知覚過敏症、及び、ＳＮＣＶの低下）に対するＬ−セリンの効果を確認するために、上記実施例２で作製した末梢神経障害モデルラットを用いたＬ−セリン投与を行い、von Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。具体的には、腹腔内投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）、０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇ（１ｍＬ）若しくは０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）、又は、ビヒクル（０．９％の生理食塩水）（１ｍＬ）をさらに腹腔内投与したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。また、経口投与群については、ラットにパクリタキセル溶液を注入した日から、２８日間連続して毎日１回、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン溶液（１ｍＬ）をさらに経口投与（胃管を経口的に挿入して投与）したこと以外は、前述の実施例２に記載の方法と同じ方法でvon Freyテスト及び感覚神経伝導速度試験を行った。
これらのvon Freyテストの結果を図５Ａに示し、感覚神経伝導速度試験の結果を図５Ｂに示す。図５Ａの結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、ビヒクル腹腔内投与群と比較して、機械的アロディニア／知覚過敏症が改善された。特に、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、Ｄ２２及びＤ２９における４ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合、Ｄ２９における８ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合、及び、Ｄ２９における１５ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合が、ビヒクル腹腔内投与群のその割合と比較して有意に減少した。また、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群でも、Ｄ２２における４ｇのvon Frey刺激に対する引っ込み反応の割合がビヒクル腹腔内投与群のその割合と比較して有意に減少した。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。
また、図５Ｂの結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群では、ビヒクル腹腔内投与群と比較して、ＳＮＣＶの低下が改善された。特に、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群や０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン経口投与群のＤ１５、Ｄ２２、Ｄ２９及びＤ３６におけるＳＮＣＶは、ビヒクル腹腔内投与群のＳＮＣＶと比較して有意に上昇していた。また、０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ又は０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群のＤ２２におけるＳＮＣＶは、ビヒクル腹腔内投与群のＳＮＣＶと比較して有意に上昇していた。なお、本実施例６においては、いずれのＬ−セリンの用量でも、ラットは標準通り体重が増加し、好ましくない行動的影響は示されなかった。
以上の結果から、Ｌ−セリンは、パクリタキセルによる末梢神経障害の改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。
［オキサリプラチンによる末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
パクリタキセル以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、別の抗癌剤であるオキサリプラチンを用いた実験を行った。具体的には、実施例２及び実施例６の実験において、パクリタキセルに代えてオキサリプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）を用い、１週間に２回、計９回腹腔内投与したこと以外は同様の実験を行った。このオキサリプラチンによる末梢神経障害モデルラットを用いたvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図６に示す。図６の結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。また、感覚神経伝導速度についても、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、有意に上昇していた。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。
パクリタキセル以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、別の抗癌剤であるオキサリプラチンを用いた実験を行った。具体的には、実施例２及び実施例６の実験において、パクリタキセルに代えてオキサリプラチン（２ｍｇ／ｋｇ）を用い、１週間に２回、計９回腹腔内投与したこと以外は同様の実験を行った。このオキサリプラチンによる末梢神経障害モデルラットを用いたvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図６に示す。図６の結果から分かるように、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。また、感覚神経伝導速度についても、０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリン腹腔内投与群（ＯＸ＋０．１Ｓ）では、ビヒクル腹腔内投与群（ＯＸ）と比較して、有意に上昇していた。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。
以上の結果から、Ｌ−セリンは、オキサリプラチンによる末梢神経障害に対しても、改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。
［糖尿病性末梢神経障害モデルラットに対する、Ｌ−セリン投与の効果］
抗癌剤投与以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いた実験を行った。具体的には、前述の実施例１で用意したのと同様のラットを３群に分け、非投与群（ＮＳ）、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (i.p.)）、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）とした。ＳＴＺ腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入し、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを腹腔内注入した。また、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを経口投与した。なお、ストレプトゾトシンは膵臓のβ細胞に取り込まれ、そこでラジカル反応を生じることによって、β細胞を破壊する性質を有しているため、糖尿病モデルを作製する際に一般的に用いられている。上記の４群（非投与群、ＳＴＺ腹腔内投与群、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群）のラットについて、上記実施例２に記載の方法で行ったvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図７の上パネルに示す。図７の上パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較してvon Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が上昇し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。さらに、感覚神経伝導速度については、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較して有意に低下し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、有意に上昇した。なお、上記の４群について、Ｄ２９における血糖値と体重を測定した結果を図７の下パネルに示す。図７の下パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）では、非投与群と比較して血糖値（ＢＳ）が有意に増加しており、また、体重が有意に低下していた。すなわち、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）は糖尿病を発症していることが示された。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。
抗癌剤投与以外の要因による末梢神経障害へのＬ−セリンの効果を確認するために、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いた実験を行った。具体的には、前述の実施例１で用意したのと同様のラットを３群に分け、非投与群（ＮＳ）、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (i.p.)）、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）とした。ＳＴＺ腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入し、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを腹腔内注入した。また、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群には、Ｄ１に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを腹腔内注入した後、Ｄ１から連日０．１ｍｍｏｌ／ｋｇのＬ−セリンを経口投与した。なお、ストレプトゾトシンは膵臓のβ細胞に取り込まれ、そこでラジカル反応を生じることによって、β細胞を破壊する性質を有しているため、糖尿病モデルを作製する際に一般的に用いられている。上記の４群（非投与群、ＳＴＺ腹腔内投与群、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群）のラットについて、上記実施例２に記載の方法で行ったvon FreyテストのＤ２９における結果、及び、感覚神経伝導速度試験のＤ２９における結果を図７の上パネルに示す。図７の上パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較してvon Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が上昇し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、von Frey刺激（４ｇ、８ｇ、１５ｇ）に対する反応が有意に減少した。さらに、感覚神経伝導速度については、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）では、非投与群と比較して有意に低下し、また、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(i.p.)）や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ(p.o.)）では、ＳＴＺ腹腔内投与群（ＳＴＺ）と比較して、有意に上昇した。なお、上記の４群について、Ｄ２９における血糖値と体重を測定した結果を図７の下パネルに示す。図７の下パネルの結果から分かるように、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）では、非投与群と比較して血糖値（ＢＳ）が有意に増加しており、また、体重が有意に低下していた。すなわち、ＳＴＺ腹腔内投与群や、ＳＴＺ及びＬ−セリン腹腔内投与群や、ＳＴＺ腹腔内投与及びＬ−セリン経口投与群（ＳＴＺ＋０．１Ｓ (p.o.)）は糖尿病を発症していることが示された。なお、各群はｎ＝６で実験を行った。
以上の結果から、Ｌ−セリンは、糖尿病による末梢神経障害に対して、予防・改善効果を有していることがin vivoにおいて実証された。
本発明は、末梢神経障害の予防・治療に関する分野や、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法の分野において特に好適に利用することができる。
Claims (4)
- ヒトを含む哺乳動物に対する、Ｌ−セリンを含有する末梢神経障害の予防・治療剤であって、前記末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤。
- 末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害であることを特徴とする請求項１に記載の末梢神経障害の予防・治療剤。
- 末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法であって、
（Ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節におけるＬ−セリン濃度を測定する工程：
（Ｃ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値を、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較する工程：及び、
（Ｄ）工程（Ｂ）におけるＬ−セリン濃度の測定値が、被検物質を投与しなかった場合のＬ−セリン濃度の測定値と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：
を有し、かつ、前記末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。 - 末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する工程：
（ｂ）末梢神経障害モデル非ヒト哺乳動物の後根神経節における３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（３ＰＧＤＨ）の発現量を測定する工程：
（ｃ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量を、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較する工程：及び、
（ｄ）工程（ｂ）における３ＰＧＤＨの発現量が、被検物質を投与しなかった場合の３ＰＧＤＨの発現量と比較して高い場合に、該被検物質を末梢神経障害の予防・治療剤と評価する工程：
を有し、かつ、前記末梢神経障害が、抗癌剤投与による末梢神経障害、又は、糖尿病による末梢神経障害であることを特徴とする、末梢神経障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。
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