JP5872032B2 - 放射線滅菌耐性蛋白質組成物 - Google Patents

Description

本発明は、セルロースエーテル誘導体を含む、放射線滅菌耐性をもつ放射線滅菌された蛋白質組成物に関する。

近年、天然および合成蛋白質は薬剤としてその重要性が増大している。また、医療用途に使用する場合、製品が滅菌されていることが必須である。滅菌方法として、オートクレーブでの加熱滅菌、γ線や電子線による電離放射線滅菌、エチレンオキサイドガスでのガス滅菌、過酸化水素によるプラズマ滅菌、グルタルアルデヒド製剤を使用した化学滅菌剤およびフィルターを使用した分離滅菌等が知られている。しかし、生理活性蛋白質などの蛋白質は、熱や放射線による滅菌により活性が低下する。エチレンオキサイドによる滅菌は、化学反応により副生成物が生成する可能性があるばかりか、毒性が強く、残留ガスが人体等に悪影響を及ぼす可能性がある。化学滅菌剤による滅菌は、蛋白質の滅菌剤に対する耐性、ｐＨの変化、イオン強度の変化または温度の変化を考慮する必要があるといった問題があった。そこで、蛋白質を含有・固定した医薬品・医療品を製造する場合は、製造プロセスをすべて無菌状態にして製造しなければならず、莫大な製造コストが必要となっているのが現状である。
また、蛋白質を含む溶液はフィルターにより分離滅菌しているが、大きい粒子を含む組成物、または固体もしくは半固体組成物には適用が困難であった。

特許文献１にはヘパリンまたはヘパリンフラグメントと複合する中和酸化セルロース生成物（ｎＯＲＣ）をガンマ線照射で滅菌できることが示されている。しかし、この文献には蛋白質が結合しているＯＲＣまたはｎＯＲＣを滅菌することは示されていない。
特許文献２にはコラーゲンスポンジマトリックス、第二の生体吸収性ポリマー（例えば酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の分散繊維）、および活性剤（例えばペプチド）を含む複合傷手当物質が示されている。活性剤はマトリックスまたは生体吸収性ポリマー、またはそれらの両方に含むことができ、該複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できることが記載されている。
特許文献３には生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線または電子ビーム照射で滅菌する方法が示されている。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来蛋白質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結または凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む技術であり、外来蛋白質の存在がペプチドを安定化してペプチドの活性低下を防ぐと記載されている。
特許文献４には治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体が記載されている。そして電離放射線で滅菌する前にペプチドを有効量のポリサッカライドと共に製剤することにより、電離放射線で滅菌してもペプチド治療剤の生物学的活性は消失しないで安定化すると記載されている。

しかし、これらの文献は、電離放射線で滅菌する際の蛋白質の失活をセルロースエーテル誘導体や特定のアミノ酸群と共存させることにより抑制できることは示唆していない。
一方で、特許文献５には酵素活性に優れる酵素含有ナノファイバーの製造方法が記載されている。この方法は、酵素と非水溶媒に溶解したポリマーとを含有する紡糸液を、静電紡糸法により紡糸して酵素前駆ナノファイバーを形成後、水を付与し乾燥するものである。しかし、この文献には酵素含有ナノファイバーを滅菌することに関する記述はない。

ＥＰ０４３７０９５号 ＥＰ０５６２８６４号 ＵＳ５７３０９３３号 国際公開ＷＯ２０００／０３３８９３号 特開２０１１−４７０８９号公報

本発明の目的は、放射線滅菌に対して耐性を有し、放射線滅菌された蛋白質組成物を提供することである。
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、グリシンとフェニルアラニンとヒスチジンとからなる混合物、およびセルロースエーテル誘導体を共存させることにより、放射線滅菌に対する蛋白質の耐性が向上することを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、フィブリノゲン、セルロースエーテル誘導体およびグリシンとフェニルアラニンとヒスチジンとからなる混合物を含んでなり、フィブリノゲンの少なくとも一部分がフィブリノゲン粒子の状態でセルロースエーテル誘導体内部に入り込んでいる、水分率が１０重量％以下の、放射線滅菌された蛋白質組成物である。

本発明の蛋白質組成物は放射線滅菌耐性を有する。本発明の滅菌組成物は、滅菌されていながら蛋白質の構造や機能が保持されている。

本発明のセルロースエーテル誘導体と特定添加剤の組合せによる蛋白質の滅菌耐性効果（縦軸：ゲル強度相対値（滅菌前：１００））を示す。 本発明のセルロースエーテル誘導体と特定添加剤の組合せによる滅菌耐性効果（縦軸：蛋白質凝集体増加量（％））を示す。

本発明は、上記のように、セルロースエーテル誘導体を含む、蛋白質組成物である。
本発明で用いられる蛋白質はフィブリノゲンである。

本発明において使用される蛋白質は、動物由来のものでも遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、遺伝子組み換え技術により作製された蛋白質は、本質的な生物活性が同様であればアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換した改変体でもよい。また、これらの蛋白質を修飾したもの、およびこれらの混合物を用いることもできる。
また、本発明で用いられる蛋白質は、当該成分に加えて、薬学的に許容しうる安定剤や添加剤を添加してもよい（以下、これを「安定剤等」と表現し、本発明において放射線滅菌耐性を与えるために蛋白質と共存させる添加剤とは区別する。）。そのような安定剤等の例としては、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、クエン酸類、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、プロテアーゼ抑制剤（例えばアプロチニン）、アルブミン、界面活性剤、リン脂質、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、トレハロースおよび糖アルコール（例えばグリセロール、マンニトール）などが挙げられ、なかでも好ましいのは、アルギニン、塩化ナトリウム、トレハロース、マンニトール、およびクエン酸類から選ばれる１種以上であり、特にクエン酸類が好ましい。
本発明で用いられる蛋白質と安定剤等との混合物は、蛋白質を当該混合物１００重量部に対して、３５重量部以下、好ましくは３０重量部以下含有する。

本発明で用いる添加剤がグリシンとフェニルアラニンとヒスチジンとからなる混合物である場合、添加剤と蛋白質の合計１００重量部に対し、グリシンは通常、５重量部以上９０重量部以下、好ましくは１５重量部以上６０重量部以下、さらに好ましくは２０重量部以上４０重量部以下、フェニルアラニンは通常１重量部以上８０重量部以下、好ましくは２重量部以上４０重量部以下、さらに好ましくは４重量以上２０重量部以下、ヒスチジンは通常２重量部以上７０重量部以下、好ましくは５重量部以上４０重量部以下、さらに好ましくは８重量部以上２０重量部以下、含有することが好ましい。

本発明における添加剤がセルロースエーテル誘導体である場合、本発明で用いられる蛋白質または蛋白質と安定剤等との混合物は、セルロースエーテル誘導体中に含有（ここで含有とは、蛋白質の少なくとも一部分がセルロースエーテル誘導体内部に入り込んでいる状態をいう）された状態で存在している。この場合、セルロースエーテル誘導体中に蛋白質や安定剤等の分子が分散して存在していてもよいが、蛋白質分子や安定剤等の分子がそれぞれ集まったものがさらに集まった粒子（以下安定剤等との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。）として分散して存在することが好ましい。
こうした蛋白質や蛋白質粒子のセルロースエーテル誘導体における好適な存在態様は、添加剤がセルロースエーテル誘導体のみでなく、グリシンとフェニルアラニンとヒスチジンとからなる混合物およびセルロースエーテル誘導体である場合も同様である。

本発明において使用されるセルロースエーテル誘導体の具体例としては、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびナトリウム カルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物が例示できる。
これらの中でも、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシプロピルセルロースである。
また、本発明で用いるセルロースエーテル誘導体の分子量は特に限定されるものではないが、例えば濃度２％、２０℃で粘度測定を行った場合、１〜１００００ｍＰａ・ｓ、好ましくは２〜５０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは２〜４０００ｍＰａ・ｓの粘度を示す分子量が選択される。

本発明の蛋白質組成物においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。
本発明で用いるセルロースエーテル誘導体は高純度であることが好ましく、とりわけセルロースエーテル誘導体中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ない方が好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
本発明の蛋白質組成物の形状は不定形のものを含み特に限定されるものではなく、例えばフィルム、繊維、シート、板状体、管状体、線状体、棒状体、クッション材、発泡体、多孔質体等が挙げられる。成形品を製造する際の成形方法は、蛋白質の活性が低下しない方法であれば特に制限されず、例えば押出成形、射出成形、カレンダー成形、圧縮成形、ブロー成形、真空成形、粉末成形、流延成形、注型などの適当な成形方法を採用することができる。その中でも、本発明の蛋白質組成物はフィルムおよび繊維形状が適している。ここで繊維形状とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維形状に含まれる。
それらの製造に当たってはフィルムまたはプラスチック繊維の製造に従来から採用されているいずれの方法も採用でき、例えば流延法（キャスト法）、エレクトロスピニング法、インフレーション押出成形法、Ｔダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法などを挙げることができる。前記成形は、溶液成形によって行っても、または溶融成形によって行ってもよいが、蛋白質の機能低下を防ぐべく蛋白質または蛋白質粒子を容易に分散させるためには溶液成形が好ましい。

本発明のうち、フィルム形状を有する蛋白質組成物の製造法を、流延法を例にとり説明する。蛋白質の凍結乾燥粉末を乳鉢等で粉砕し溶媒への分散に適当な平均粒子径（通常０．１〜２００μｍ、好ましくは１〜１００μｍ）を有する蛋白質粒子を作製する。これを、セルロースエーテル誘導体を溶解可能で、かつ蛋白質粒子と懸濁液を形成し、フィルム作製段階で蒸発しフィルムを形成可能な一種または複数の適当な溶媒（２−プロパノールやエタノール等）に分散させた後、セルロースエーテル誘導体さらに必要に応じてマクロゴール等の可塑剤を溶解し、蛋白質粒子がセルロースエーテル誘導体溶液中に分散されたドープ液を調製する。得られたドープ液を用いて流延法によりフィルムを作製する。
本発明のうちフィルム形状を有する蛋白質組成物において、蛋白質または蛋白質粒子は、セルロースエーテル誘導体に対して、蛋白質やセルロースエーテル誘導体の種類にもよるが、通常１００重量％以上、好ましくは５００重量％以上、より好ましくは８００〜９５０重量％含有する。これらより少ないと、蛋白質の機能が十分発揮されない場合があり、多いとフィルムの成形性が不良となる場合がある。

本発明のうちフィルム形状を有する蛋白質組成物のフィルムの平均厚み（厚さ）は、用途にもよるが、１０〜１０００μｍであることが好ましい。
本発明のうち、繊維形状を有する蛋白質組成物は、その平均繊維径は、例えば０．０１〜５０μｍであるが、当業者であれば使用目的に応じて適宜定めることができる。また、長繊維よりなるものであってもよい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができるが、熱を加えずに成形でき、蛋白質の機能低下を抑制できる点からエレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーが溶解している液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、ポリマーが溶解している紡糸液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
以下、エレクトロスピニング法を例にとり、本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する蛋白質組成物の製造法を説明する。

エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、セルロースエーテル誘導体溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
該懸濁液におけるセルロースエーテル誘導体の濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。セルロースエーテル誘導体の濃度が１重量％より低いと繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり、また懸濁液の粘度が高くなり好ましくない。より好ましい懸濁液におけるセルロースエーテル誘導体の濃度は１．５〜２０重量％である。

セルロースエーテル誘導体の溶媒は、セルロースエーテル誘導体を溶解可能で、かつ蛋白質粒子と懸濁液を形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、また一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン、水、およびこれらの溶媒の混合溶媒が挙げられる。これらのうち、取り扱い性や物性などから、２−プロパノール、エタノールを用いることが好ましい。
セルロースエーテル誘導体溶液と蛋白質粒子を混合し、懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。

また、溶媒と蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、セルロースエーテル誘導体を添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においては、いずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。
乾式粉砕処理としては、ボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。
一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に蛋白質粒子を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。
さらには、スプレードライヤーにより作製した蛋白質粒子を使用することもできる。

本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する蛋白質組成物において、蛋白質粒子のサイズは特に限定されるものではないが、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さい蛋白質粉末を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、繊維成形体が脆弱となり好ましくない。
本発明の蛋白質組成物で用いる滅菌方法は、放射線滅菌である。放射線としては、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、電子線、およびエックス線が挙げられる。なかでもガンマ線あるいは電子線が好ましく、最も好ましいのは電子線である。これらの滅菌方法は、特に限定されるものではないが、放射線の照射量としては１０〜８０ｋＧｙ、好ましくは２０〜３０ｋＧｙである。温度条件としては、特に限定されるものではないが−８０〜４０℃、好ましくは−８０〜３０℃である。

アルファ線、陽電子線、ガンマ線、中性子線、電子線、エックス線などの放射線は、物質に当たると物質を構成する分子・原子から電子をはぎ取る。この際に分子結合が切断され、反応性の高いラジカル等が生じ、周辺物質と２次的に化学反応する。
蛋白質は放射線照射により機能（活性）を失いやすいことがよく知られている。
これは照射により分子結合が切れ、機能発現の根源である「高次構造」が壊されることによるものと考えられる。しかしながら、本発明の蛋白質組成物は放射線照射してもその機能低下が抑制されている。これは本発明組成物中の蛋白質の高次構造が保持されていることを意味し、これは蛋白質一般において共通の効果である。この効果は透過するセルロースエーテル誘導体の厚みから考えて遮蔽によるものとは考えられず、抑制機構は定かではない。また、当該セルロースエーテル誘導体の効果が、特定のアミノ酸群の添加によって顕著に向上する現象の機構も不明である。

本発明の蛋白質組成物は、さらに電子・イオン捕捉剤、エネルギー移動剤、ラジカル捕捉剤、酸化防止剤、可塑剤を含んでもよい。電子・イオン捕捉剤としては、Ｎ，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、ジフェニレンジアミン、ピレン、キノン等が挙げられる。エネルギー移動剤としては、アセナフテン等が挙げられる。ラジカル捕捉剤としては、メルカプタン、オクタヒドロフェナントレン、モノアルキルジフェニルエーテル、トコフェロール、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキノン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸誘導体等が挙げられる。酸化防止剤としては、ＢＨＴ、亜リン酸トリエステル、フェノール系老化防止剤、有機チオ酸塩類等が挙げられる。なかでも食品や医薬品に使用するのに安全であると一般に認められている添加剤が好ましい。添加剤の量は特に限定されるものではないが、例えば蛋白質組成物におけるセルロースエーテル誘導体に対して０．０１〜１０重量％の添加剤を含むことができる。

また、滅菌工程における蛋白質を含有するセルロースエーテル誘導体は水分を含んでいないことが好ましい。水分率は１０重量％以下が好ましく、より好ましくは４重量％以下、さらに好ましくは実質的に無水のものである。
また、本発明の蛋白質組成物は、包装材に包装して放射線滅菌してもよい。かかる包装材料として、アルミニウムのようなガスバリア性の高い材料を使用することが好ましい。また、脱酸素剤や乾燥剤と共に密封包装しても、脱気後に不活性ガスを充填した状態で包装しても、これら両方を行ってもよい。かかる脱酸素剤および乾燥剤は、人体に害がなく、放射線滅菌時に失活しないものが好ましい。
本発明の蛋白質組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療用材料として使用できる。
また、本発明には、本発明の蛋白質組成物を放射線滅菌してなる滅菌蛋白質組成物が含まれる。

以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。なお、実施例１〜７は参考例である。

実施例１〜４および比較例１〜２についての測定法
１．平均繊維径：
得られた繊維成形体の表面を走査型電子顕微鏡（キーエンス株式会社：商品名「ＶＥ８８００」）により、倍率３０００倍で撮影して得た写真から無作為に２０箇所を選んで繊維の径を測定し、すべての繊維径の平均値を求めて平均繊維径とした。ｎ＝２０である。
２．平均厚み：
５０ｍｍ×１００ｍｍのサイズにカットした繊維成形体を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測長力０．０１Ｎによりｎ＝１５にて繊維成形体の膜厚を測定した平均値を算出した。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。

３．ＥＬＩＳＡ測定
（１）フィブリノゲン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ ４６８６６７）に抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＤＡＫＯ Ａ００８０）を１０μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングを行う。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトフィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｎｏ．ＦＩＢ３）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＣＰＬ５５２３）を添加し、反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ ５０−７６−０２ ５０−６５−０２）を添加し、６分間静置して発色させた。１Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。

（２）トロンビン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ ４６８６６７）に抗ヒトトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＡＰ）を５μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社：ＨＣＴ−００２０）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトトロンビン抗体（（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）を０．１μｇ／ｍＬで添加した。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＤａＫｏ Ｓ１５９９）を添加し、１０分間静置して発色させた。０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。

４．トロンビン活性測定
ＢＤ社製ポリスチレンチューブに試料２０μＬと活性測定用希釈溶液（０．０１％ Ｆ−６８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４）８０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品として組換トロンビン（ＪＰＵ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ４００Ｕ／ｍＬまたはＷＨＯ／ＵＳ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ、１１０ＩＵ／ｍＬ：自社調整品）を同バッファーでＪＰＵの場合、４、２、１、０．５、０．２５Ｕ／ｍＬ、ＩＵの場合、６、３、１．５、０．７５、０．３７５ＩＵ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で７分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。

実施例１
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール（登録商標、以下同じ）組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ 和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン含有粒子／ヒドロキシプロピルセルロース＝２０（フィブリノゲンとして９．２）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１１ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．８６μｍ、平均厚みは１３７μｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．１５ｍｇ／ｃｍ^２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様にＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、固定化蛋白質量は、０．１６ｍｇ／ｃｍ^２であった。以上のことから、未滅菌シートに対しての滅菌シートの蛋白回収率は９４％であった。

実施例２
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ 和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝４０（フィブリノゲンとして１８）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．４３μｍ、平均厚みは１５２μｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．２７ｍｇ／ｃｍ^２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様にＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、固定化蛋白質量は、０．３０ｍｇ／ｃｍ^２であった。以上のことから、未滅菌シートに対しての滅菌シートの蛋白回収率は９０％であった。

実施例３
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ、和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００（フィブリノゲンとして４６）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．７８ｍｇ／ｃｍ^２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様にＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、固定化蛋白質量は、０．７６ｍｇ／ｃｍ^２であった。以上のことから、未滅菌シートに対しての滅菌シートの蛋白回収率は１０２％であった。

比較例１
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、ＥＬＩＳＡ測定値は、３１μｇ／ｍＬであった。一方で、滅菌処理していないフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール）についても同様にＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、ＥＬＩＳＡ測定値は、９０μｇ／ｍＬであった。以上のことから、未滅菌シートに対しての滅菌シートの蛋白質回収率は３４％であった。

実施例４
２−プロパノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、１３重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ 日本曹逹製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００／１００（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは２０４μｍ、目付けは２．０８ｍｇ／ｃｍ^２、嵩密度１０１ｍｇ／ｃｍ^３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は１１０．３Ｕ／ｃｍ^２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、トロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％としたとき、６８．４％の保持率であった。

比較例２
トロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）に３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、トロンビン活性を測定した。照射前のトロンビン活性は、４０４．７３Ｕ／バイアルであった。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％としたとき、５１．８％の保持率であった。

実施例５〜６および比較例３〜４についての測定法
１．平均厚み：
適当なサイズにカットした組成物を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測長力０．０１Ｎによりｎ＝９にて繊維成形体の膜厚を測定した平均値を算出した。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
２．酵素活性測定
リパーゼの活性測定にはＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｌｉｐａｓｅ Ｔｅｓｔキット（ＰＲＯＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＫ ＧＭＢＨ製）を使用した。以下の式により活性保持率を算出した。活性酵素量は、活性値から濃度換算して算出した。
活性保持率（％）＝｛滅菌後の活性酵素量（ｍｇ／ｃｍ^２）／滅菌前の活性酵素量（ｍｇ／ｃｍ^２）｝×１００
一方、β‐グルコシダーゼの活性測定にはＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ（登録商標、以下同じ。）−βＧｌｕ（積水メディカル株式会社）を用いた蛍光測定により行った。以下の式により活性回収率を算出した。固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量％と組成物の重量から算出した。
活性回収率（％）＝｛活性酵素量（ｍｇ）／（固定化酵素理論重量（ｍｇ）｝×１００
以下の式により活性保持率を算出した。
活性保持率（％）＝｛滅菌後の活性回収率（％）／滅菌前の活性回収率（％）｝×１００

実施例５
２−プロパノールにリパーゼ粉末（ブタ膵臓由来、和光純薬製、以下同じ）を分散させた後、１３ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ 和光純薬製）を溶解し、リパーゼ粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝５０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２７％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１８ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１６．５ｃｍであった。得られた繊維成形体（１０ｃｍ×１４ｃｍ）の平均厚みは１６８μｍであった。得られた繊維成形体を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌した繊維成形体を１ｃｍ×１ｃｍに切断後、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。結果、活性酵素量は０．４６ｍｇ／ｃｍ^２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性酵素量は、０．４０ｍｇ／ｃｍ^２であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は１１５％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。

実施例６
２−プロパノールにリパーゼ粉末を分散させた後、１３ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ、和光純薬製）を溶解し、リパーゼ粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝５０／１００（ｗ／ｗ）のキャスト液を調製した。ドクターブレード（ＹＯＳＨＩＭＩＴＳＵ製、ＹＢＡ−３型）を用い、塗工幅１５ｍｉｌでキャスティングし、シートを得た。得られたシート（４ｃｍ×６ｃｍ）の平均厚みは１８０μｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを１ｃｍ×１ｃｍに切断後、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。結果、活性酵素量は０．６９ｍｇ／ｃｍ^２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性酵素量は、０．６４ｍｇ／ｃｍ^２であった。以上のことから、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は１０８％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。

実施例７
２−プロパノールにβ‐グルコシダーゼ粉末（アーモンド由来、オリエンタル酵母工業製、以下同じ）を分散させた後、１３ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ 和光純薬製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２７％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１８ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１６．５ｃｍであった。得られた繊維成形体（１０ｃｍ×１０ｃｍ）の平均厚みは２０７μｍであった。得られた繊維成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。結果、活性回収率は４２％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は４６％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は９１％であり、セルロースエーテル誘導体に包含されることによって酵素の失活を抑制できることがわかった。

比較例３
リパーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末１ｍｇに１ｍＬのＬｉｐａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを添加して活性測定を実施した。結果、活性値は、０．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ・ｍｉｎ．であった。一方で、滅菌処理していないリパーゼ粉末についても同様に活性測定を実施した結果、活性値は０．３４ｐｍｏｌ／ｍＬ・ｍｉｎ．であった。以上のことから、未滅菌粉末に対しての滅菌粉末の活性保持率は７４％であった。

比較例４
β‐グルコシダーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末２ｍｇを１ｍＬの生理食塩水に溶解させ、Ｔｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性保持率は８１％であった。

実施例８〜１０についての測定法
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（フィブリノゲン含有粒子）に対して電子線を照射した際、フィブリノゲンの変化（凝集体増加、ゲル強度低下）が生じる。電子線照射によるフィブリノゲンの変化を抑制する効果（滅菌耐性効果）を調べるために、フィブリノゲンのバルク液を調製し、５ｍＬのガラスバイアルに１ｍＬを充填後に凍結乾燥を実施した。凍結乾燥が終了した一部のバイアルについて３０ｋＧｙの電子線を照射し、滅菌前後の比較を各凍結乾燥品について行った。
比較評価は、小型卓上試験機ＥＺＴｅｓｔ（島津製作所製）によるゲル強度測定およびＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）による凝集体含量測定(分析条件：５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｍ アルギニン塩酸塩 を移動相として、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎにて分画、２８０ｎｍの波長により目的物質を検出；単量体ピークより早く検出されるピークを凝集体として定量)を実施した。
分析に際しての検体（分析用検体）調製手順は、未滅菌凍結乾燥品および滅菌済凍結乾燥品のバイアルを１ｍＬの蒸留水により溶解。その溶液を遠心チューブ１５０００ｒｐｍ×５分間遠心し、０．４５μｍのろ過フィルターを通液した後、分析用検体として用いた。

実施例８
以下の方法によりセルロースエーテル誘導体と特定添加剤の組合せによる蛋白質の滅菌耐性効果を調べた。
（方法）「セルロースエーテル誘導体＋特定添加剤」組成（下記表１のＮｏ．１〜６に示す組成（１））およびこれらよりセルロースエーテル誘導体を除いた組成に相当する組成（２）の、フィブリノゲンのバルク液を用い、そのゲル強度を測定することでフィブリノゲンとしての機能を評価し滅菌前後のゲル強度を比較することで滅菌耐性効果を調べた。結果を表２に示した。
組成（１）（凍結乾燥粉末とヒドロキシプロピルセルロースを２−プロパノールに懸濁後シート化）、組成（２）（凍結乾燥粉末）共に、各試料を１％ Ｆｂｇ濃度になるように水にて溶解後、１０ｍＭ アルギニン、２７０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．５の緩衝液にて２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した。
２ｍＬポリプロピレンチューブにフィブロガミン（２４０単位／ｍＬ）１０μＬ、トロンビン溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ、１００ｍＭ 塩化カルシウムを含む）１１０μＬを加え、ピペッティング後に２ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン溶液９００μＬを気泡が入らないよう添加し、３７℃で１時間静置した後、小型卓上試験機ＥＺＴｅｓｔ（島津製作所製）にてゲルの強度を測定した。

組成（２）：特定添加剤組成
上記組成（１）に対しセルロースエーテル誘導体（ヒドロキシプロピルセルロース：ＨＰＣ）を含有しないもの。
（結果）
滅菌前を１００とした場合の滅菌後のゲル強度の値を表２および図１に示す。

組成Ｎｏ．１でセルロースエーテル誘導体の存在による滅菌耐性向上効果が認められなかったのに対し組成Ｎｏ．２〜６ではセルロースエーテル誘導体の存在による同効果が認められ、特に組成Ｎｏ．３〜６で顕著であった。

実施例９
実施例８と同様の方法により、下記表３の組成（２種）によりグリシンの滅菌耐性効果を調べた。結果を表４に示した。

グリシン添加によりフィブリノゲン凝集体含量増加を抑制した。

実施例１０
実施例８と同様の方法により、セルロースエーテル誘導体と特定添加剤の組合せによる滅菌耐性効果を調べた。
セルロースエーテル誘導体としてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）および下記表５の８種の組成のフィブリノゲンのバルク溶液を用いた。１．０％ フィブリノゲン、１１０ｍＭ 塩化ナトリウム、１．０％グリシン、０．２％マンニトールは下記８種の組成について共通である。結果を表６と図２に示した。

セルロースエーテル誘導体添加により、蛋白質凝集体含量の増加が抑制された。また、セルロースエーテル誘導体の存在による同含量の増加抑制効果は、フェニルアラニンとヒスチジンが共存する組成２〜４で顕著であった。このことから、実施例７において組成Ｎｏ．１でセルロースエーテル誘導体の存在による滅菌耐性向上効果が認められなかったのに対し組成Ｎｏ．３〜６で認められかつ顕著であったことは、組成Ｎｏ．３〜６のフェニルアラニンとヒスチジンがセルロースエーテル誘導体と共存することで顕著な蛋白の滅菌耐性効果をもたらしているためであると考えられた。

本発明の蛋白質組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療品の製造業で利用される。

Claims (6)

1. フィブリノゲン、セルロースエーテル誘導体およびグリシンとフェニルアラニンとヒスチジンとからなる混合物を含んでなり、フィブリノゲンの少なくとも一部分がフィブリノゲン粒子の状態でセルロースエーテル誘導体内部に入り込んでいる、水分率が１０重量％以下の、放射線滅菌された蛋白質組成物。
2. セルロースエーテル誘導体がヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の蛋白質組成物。
3. セルロースエーテル誘導体がヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１に記載の蛋白質組成物。
4. セルロースエーテル誘導体がヒドロキシプロピルセルロースである請求項１に記載の蛋白質組成物。
5. フィルム形状である請求項１から４のいずれかに記載の蛋白質組成物。
6. 繊維形状または不織布形状である請求項１から４のいずれかに記載の蛋白質組成物。

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