ES2485901T3

ES2485901T3 - Preparación sólida de fibrinógeno

Info

Publication number: ES2485901T3
Application number: ES08722618.9T
Authority: ES
Inventors: Shinichi Miyagawa; Tatsuya Araki; Tsutomu Hamuro; Mika Okuda; Hiroshi Kaetsu
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2014-08-14
Anticipated expiration: 2028-03-21
Also published as: CN101678086B; AU2008230476A1; KR20090122279A; EP2130549A4; US9775884B2; WO2008117746A1; EP2130549B1; AU2008230476B2; EP2130549A1; US20100119563A1; JP5393447B2; CA2682173A1; CA2682173C; JPWO2008117746A1; CN101678086A

Abstract

Una preparación sólida de fibrinógeno que comprende fibrinógeno como ingrediente principal y que contiene además los siguientes componentes: 5 (a) albúmina; (b) un tensioactivo no iónico; (c) un aminoácido básico o una sal del mismo; y (d) al menos dos aminoácidos, o una sal de los mismos, seleccionados de entre un aminoácido ácido o una sal del mismo y un aminoácido neutro o una sal del mismo.

Description

Preparación sólida de fibrinógeno

5 Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de un fármaco médico, en concreto, al fibrinógeno y a una preparación de fibrinógeno como componente de un adhesivo tisular. Más concretamente, la presente invención se refiere a una preparación sólida de fibrinógeno que comprende, como ingrediente principal, fibrinógeno y que contiene además albúmina, un tensioactivo no iónico, un aminoácido básico y al menos dos aminoácidos seleccionados de entre un aminoácido ácido o un aminoácido neutro, y que tiene una mejor solubilidad, y a un adhesivo tisular usando la misma.

Antecedentes de la técnica

15 El fibrinógeno es un factor de coagulación muy importante que actúa en la etapa final de la cascada de coagulación sanguínea. El fibrinógeno, por ejemplo, tras la activación del sistema de coagulación después de una lesión, es transformado por la trombina de su forma soluble en fibrina insoluble que desempeña un papel importante en la hemostasia y la cicatrización de las heridas.

El fibrinógeno tiene importancia en la hemostasia y la cicatrización de las heridas. Por ejemplo, el fibrinógeno se ha usado clínicamente como forma de dosificación intravenosa en una terapia de reemplazo contra deficiencias congénitas y adquiridas de fibrinógeno etc. para impedir un sangrado grave mediante al aumento del nivel de fibrinógeno en sangre. Además, en los últimos años, el fibrinógeno mezclado con la trombina se usa en cirugía como

25 adhesivo para sustituir la sutura de órganos blandos como el hígado y el bazo o como un agente auxiliar para la sutura. El fibrinógeno también se ha aplicado ampliamente en otros entornos clínicos.

Dicha preparación, capaz de adherirse a una herida o a una superficie de tejido, puede mejorar la resistencia a la tracción de una zona de adhesión o una herida unida, puede ser totalmente absorbida en el organismo vivo y puede promover la cicatrización de la herida.

Como se describe en la referencia de patente 1, se conoce un método de preparación de un adhesivo tisular que comprende fibrinógeno y factor de coagulación sanguíneo XIII (factor XIII). El factor XIII es activado por la trombina en presencia de iones de calcio (factor XIII activado). El factor XIII activado forma una reticulación de enlace

35 isopeptídico entre las moléculas de fibrina, es decir, un dímero γ, aumentando de ese modo la resistencia física y la estabilidad del coágulo de fibrina. Por lo tanto, el adhesivo de fibrina, usado ampliamente como adhesivo tisular, comprende una cantidad sustancialmente necesaria de factor XIII con independencia de si dicho factor XIII se añade externamente como factor XIII purificado o está contenido como un contaminante de los materiales generado al prepararse el fibrinógeno. La expresión "una cantidad sustancialmente necesaria de factor XIII" como se usa en el presente documento, se refiere a una concentración que genera un dímero γ (patente no de referencia 1).

Un adhesivo tisular no es estable en forma de solución y, por lo tanto, en la práctica clínica, se usa en una forma de dosificación en solución congelada o polvo liofilizado. Así pues, una preparación disponible en el mercado se tiene que descongelar o rehidratar antes de su aplicación, gastándose en cualquiera de los casos una gran cantidad de

45 tiempo.

Además, para obtener una acción adhesiva suficiente como adhesivo de fibrina, es necesario disolver el fibrinógeno a una alta concentración. Cuanto mayor sea la concentración de fibrinógeno que se vaya a coagular, mejor. Sin embargo, existía el problema de que dicha solución de fibrinógeno a alta concentración no era adecuada para su uso en la cirugía de urgencia, dado que se necesita mucho tiempo para preparar la solución a partir de una preparación de fibrinógeno liofilizado. Existe la preocupación de que una preparación prolongada que incluya la disolución de un fibrinógeno liofilizado pueda afectar negativamente a un paciente.

Por otra parte, cuando se prepara una solución de fibrinógeno a una alta concentración, la rehidratación de un polvo

55 liofilizado tiende a formar burbujas. Tras la rehidratación, la solución de fibrinógeno resultante se transfiere a un aplicador tal como una jeringa, pero debido a la formación de burbujas, el tiempo de preparación se prolonga todavía más. Por lo tanto, en la práctica clínica, se desea una preparación con una mejor propiedad antiespumante.

Así pues, los médicos exigen una reducción del tiempo de preparación, porque una disponibilidad rápida es de importancia fundamental, especialmente en casos de emergencia que incluyan el procedimiento quirúrgico.

Por las razones descritas anteriormente, se han hecho muchos intentos por obtener un producto liofilizado que tenga un mejor tiempo de rehidratación. Por ejemplo, la referencia de patente 2 describe un método y un procedimiento de mejora de la solubilidad de un medicamento liofilizado mediante el uso de un aparato en combinación con

65 calentamiento y agitación que, sin embargo, sigue siendo insuficiente para mejorar el tiempo de rehidratación.

Se sabe que es posible mejorar la solubilidad de una proteína poco soluble mediante la adición de ciertos aditivos. Por ejemplo, la referencia de patente 3 desvela una composición de fibrinógeno liofilizado que contiene urea o una sustancia con un resto de guanidina. Además, la referencia de patente 4 desvela una composición de fibrinógeno liofilizado que contiene al menos un tensioactivo biológicamente compatible. Sin embargo, en las preparaciones

5 disponibles en el mercado fabricadas mediante cualquier método, se requiere una gran cantidad de tiempo para rehidratar un polvo liofilizado y, por tanto, se desea una mejora adicional del tiempo de disolución.

Referencia de patente 1: publicación de patente japonesa Nº 63-40546 Referencia de patente 2: patente canadiense 1.182.444

10 Referencia de patente 3: publicación de patente japonesa Nº 4-7328 Referencia de patente 4: publicación de patente japonesa N º 2-36872 Referencia no de patente 1: Dickneite, G., et al, Pharma Medica 21 (9), pág.105-118 (2003).

La técnica anterior también incluye el documento US5407671, que desvela composiciones de fibrinógeno que 15 comprenden albúmina, arginina, glutamato sódico e isoleucina, junto con otros componentes adicionales tales como citrato trisódico, cloruro de calcio y factor XIII.

Divulgación de la invención

20 (Problema técnico por resolver mediante la invención)

En dichas circunstancias, es un objeto de la presente invención proporcionar una preparación de fibrinógeno que tenga un tiempo de preparación reducido y se pueda usar rápidamente en la práctica clínica en comparación con las preparaciones que usan la técnica anterior, y un adhesivo tisular que comprenda la misma.

25 La dificultad en la consecución del objeto anterior está en que se pueda usar una preparación de fibrinógeno de la misma manera que las preparaciones que usan la técnica anterior, aún reduciendo el tiempo de preparación.

(Medios para resolver los problemas)

30 Por lo tanto, en vista de los problemas anteriores, los presentes inventores han estudiado intensamente y, como resultado de ello, han conseguido reducir el tiempo de rehidratación mediante la combinación de albúmina, un tensioactivo no iónico, un aminoácido básico y dos o más aminoácidos seleccionados de entre un aminoácido ácido

o un aminoácido neutro en una composición que comprende fibrinógeno como ingrediente principal para completar 35 así la presente invención.

La presente invención, como preparación de fibrinógeno que es estable en estado sólido y tiene un tiempo de preparación reducido, incluía las siguientes:

40 (1) Una preparación sólida de fibrinógeno que comprende fibrinógeno como ingrediente principal y que contiene además el siguiente componente:

(a) albúmina;

(b): un tensioactivo no iónico; 45 (c) un aminoácido básico o una sal del mismo; y

(d) al menos dos aminoácidos o sales de los mismos seleccionados de entre un aminoácido ácido o una sal del mismo y un aminoácido neutro o una sal del mismo.

(2): La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con el apartado (1) anterior, donde dicho aminoácido básico 50 o sal del mismo es cualquiera de entre arginina o una sal del mismo y lisina o una sal del mismo.

(3) La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con el apartado (1) anterior, donde dicho aminoácido ácido o sal del mismo es cualquiera de entre ácido glutámico, ácido aspártico o una sal de los mismos, dicho aminoácido neutro o sal del mismo es cualquiera de entre isoleucina, leucina, glicina, alanina, serina, treonina, glutamina o una sal de los mismos.

55 (4) La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con el apartado (3) anterior, donde dicho componente (d) incluye al menos dos aminoácidos o sales de los mismos, seleccionados de entre al menos dos de los siguientes grupos:

(d-1) ácido glutámico o ácido aspártico; 60 (d-2) isoleucina o leucina; (d-3) glicina, alanina, serina, treonina o glutamina.

(5) La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (4) anteriores, donde

una combinación de dicho componente (c) y componente (d) es cualquiera de las siguientes: 65

arginina, ácido glutámico e isoleucina, o sales de los mismos; arginina, ácido glutámico y glicina, o sales de los mismos; arginina, glicina e isoleucina, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos;

5 lisina, isoleucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, leucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, alanina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, serina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, treonina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glutamina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido aspártico, o sales de los mismos.

(6) La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (5) anteriores, que comprende además al menos uno seleccionado de entre factor XIII, cloruro sódico, citrato sódico o aprotinina.

15 (7) Un adhesivo de fibrina que comprende la preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (6) anteriores en combinación con un componente que comprende trombina como ingrediente principal.

(8): Un material de soporte que sostiene el fibrinógeno, donde los componentes de la preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de los apartados (1) a (6) anteriores están sostenidos sobre un material médico.

(9): Un adhesivo de fibrina que comprende el material de soporte que sostiene el fibrinógeno de acuerdo con el apartado (8) anterior en combinación con un componente que comprende trombina como ingrediente principal.

Efectos de la invención

25 De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar una preparación sólida de fibrinógeno que se rehidrate a un estado líquido en un tiempo más corto que las preparaciones que usan la técnica anterior. La preparación de fibrinógeno de la presente invención, debido a su reducido tiempo de rehidratación, tiene la ventaja de que se puede usar más rápidamente en caso de emergencia. Además, la preparación de fibrinógeno de la presente invención tiene la ventaja adicional de que, debido a un efecto antiespumante de un tensioactivo, es posible succionar rápidamente una solución de fibrinógeno reconstituida en un aplicador, reduciéndose así aún más el tiempo de preparación.

Por otra parte, la composición de fibrinógeno obtenida mediante la presente invención se puede mantener de forma preliminar sobre un material de soporte para proporcionar una preparación de fibrinógeno que se pueda aplicar

35 directamente en una zona afectada sin rehidratarla con una solución. La preparación de fibrinógeno de la presente invención que está soportada sobre el material de soporte se puede disolver rápidamente con una pequeña cantidad de agua en la zona aplicada para ejercer de este modo una gran fuerza adhesiva en un tiempo menor.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un gráfico que compara los tiempos de rehidratación de las composiciones de fibrinógeno de la presente invención y de la técnica anterior. La Fig. 2 es un gráfico que muestra los aditivos necesarios para reducir el tiempo de rehidratación. La Fig. 3 incluye gráficos que muestran el tiempo de rehidratación de la composición de fibrinógeno de la

45 presente invención donde se sustituye cada aminoácido. La Fig. 4 es un gráfico que compara las resistencias a la tracción de las composiciones de fibrinógeno de la presente invención y de la técnica anterior.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La preparación sólida de fibrinógeno de la presente invención comprende fibrinógeno como ingrediente principal y una cantidad sustancialmente necesaria de albúmina, un tensioactivo no iónico, un aminoácido básico y dos o más aminoácidos seleccionados de entre un aminoácido ácido o un aminoácido neutro en un solución tampón adecuada, tal como una solución que contiene cloruro sódico, citrato trisódico.

55 Una concentración de fibrinógeno comprendida en la preparación de la presente invención es preferentemente de 40 mg/ml o más, más preferentemente de 80 mg/ml o más.

La albúmina contenida en la preparación de la presente invención es preferentemente albúmina de suero. Cuando la preparación de la presente invención se aplica a un ser humano, se prefiere la albúmina de suero humano. Una concentración de albúmina comprendida en la preparación de la presente invención es preferentemente de 5 mg/ml

o superior. El límite superior de la concentración se puede decidir convenientemente en base al conocimiento común de la técnica e incluir, pero sin limitación, 15 mg/ml.

65 Un tensioactivo no iónico comprendido en la preparación de la presente invención incluye un tensioactivo de ácido graso tal como éster de ácido graso de sacarosa, éster de ácido graso de sorbitán, éster de ácido graso de sorbitán

polioxietilenado, alcanolamida de ácido graso y similares, un tensioactivo de alcohol superior tal como polioxietilenalquiléter, alquilglucósido y similares, y un tensioactivo de alquilfenol tal como polioxietilenalquilfeniléter y similares. Entre éstos, un ejemplo adecuado es tensioactivo Tween y tensioactivo Triton. Un ejemplo de estos tensioactivos no iónicos adecuados incluye monooleato de sorbitán polioxietilenado (20) (Tween 80) y tiloxapol.

5 Es necesario que una concentración de dicho tensioactivo no iónico sea superior a la concentración micelar crítica de cada tensioactivo, y que preferentemente sea de 0,1 mg/ml o superior. El límite superior de la concentración se puede decidir convenientemente en base al conocimiento común de la técnica e incluir, pero sin limitación, 0,5 mg/ml.

El aminoácido básico comprendido en la preparación de la presente invención se selecciona de entre cualquiera de arginina o una sal de la misma y lisina o una sal de la misma.

Para el aminoácido ácido o el aminoácido neutro comprendido en la preparación de la presente invención, se 15 pueden seleccionar dos o más aminoácidos de entre un aminoácido ácido tal como ácido glutámico, ácido aspártico

: o una sal de los mismos, o un aminoácido neutro tal como isoleucina, leucina, glicina, alanina, serina, treonina, glutamina o una sal de los mismos.

Además, para dicho aminoácido ácido o dicho aminoácido neutro, se pueden seleccionar al menos dos aminoácidos

: o sales de los mismos de al menos 2 de los siguientes grupos:

(1): ácido glutámico o ácido aspártico;

(2): isoleucina o leucina;

(3): glicina, alanina, serina, treonina o glutamina.

25 Por otra parte, una combinación preferida de dicho aminoácido básico con dicho aminoácido ácido o aminoácido neutro incluye las siguientes:

arginina, ácido glutámico e isoleucina o sales de los mismos; arginina, ácido glutámico y glicina o sales de los mismos; arginina, glicina e isoleucina o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido glutámico o sales de los mismos; lisina, isoleucina, glicina y ácido glutámico o sales de los mismos; arginina, leucina, glicina y ácido glutámico o sales de los mismos;

35 arginina, isoleucina, alanina y ácido glutámico o sales de los mismos; arginina, isoleucina, serina y ácido glutámico o sales de los mismos; arginina, isoleucina, treonina y ácido glutámico o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glutamina y ácido glutámico o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido aspártico o sales de los mismos.

La concentración de cada aminoácido o sal del mismo comprendida en la preparación de la presente invención es preferentemente de 2 mg/ml o superior. En caso de una combinación particularmente preferida de los aminoácidos, que incluye arginina, isoleucina, glicina y ácido glutámico, la concentración de cada uno de los aminoácidos es preferentemente de 3 mg/ml o superior, 3 mg/ml o superior, 2 mg/ml o superior y 2,5 mg/ml o superior,

45 respectivamente. El límite superior de concentración se puede decidir convenientemente en base al conocimiento común de la técnica e incluir, pero sin limitación, 36 mg/ml, 13 mg/ml, 15 mg/ml y 30 mg/ml, respectivamente.

Además, se puede añadir factor XIII a la preparación de fibrinógeno de la presente invención con el fin de mejorar la resistencia física y la estabilidad del coágulo de fibrina. Una concentración de Factor XIII comprendida en la preparación de la presente invención es la que permita la formación de la reticulación de enlace isopeptídico entre las moléculas de fibrina, es decir, el dímero γ, y es preferentemente, por ejemplo, de 0,4 unidades o más/ml de la preparación.

El método para la preparación de fibrinógeno, albúmina y factor XIII usado en la presente invención no se limita a

55 uno en particular, e incluye, por ejemplo, la separación de la sangre humana o una técnica de recombinación genética.

El fibrinógeno, un ingrediente principal de la preparación de la presente invención, se puede preparar mediante métodos conocidos que incluyen, por ejemplo, la precipitación con etanol frío combinada con glicina, que reduce la solubilidad del fibrinógeno (Blomback, B. y Blomback, M., Arkiv Kemi, 10, pág. 415-443 (1956)), y la precipitación con glicina usando solo glicina (Kazal, L. A. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 113, pág. 989-994 (1963)), y similares, según lo publicado. Como alternativa, también se puede usar fibrinógeno producido mediante una técnica de recombinación genética.

65 El factor XIII se puede preparar mediante métodos conocidos que incluyen, por ejemplo, la purificación a partir de plasma (Curtis, C. G., Lorand, L., Methods Enzymol., 45, pág. 177-191 (1976)) según lo publicado. Como alternativa,

también se puede usar el factor XIII producido mediante una técnica de recombinación genética.

La preparación de fibrinógeno de la presente invención, además de proporcionarse en una forma de dosificación contenida en un vial, se puede sostener en un material médico para formar un material de soporte que sostenga el 5 fibrinógeno.

En concreto, se puede empapar un material médico en la solución de fibrinógeno compuesta por la composición de la presente invención y después secarlo, por ejemplo, mediante liofilización, produciéndose un material de soporte que sostenga fibrinógeno.

10 No se especifica ningún ejemplo de dicho material de soporte en particular en la medida en que se pueda usar médicamente, e incluye, por ejemplo, celulosa, un derivado de celulosa, colágeno, gelatina, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, copolímero de ácido láctico-ácido glicólico, ácido poliglutámico, amilosa y similares. El material de soporte puede estar en una forma que incluya un conjunto de fibras tal como monofilamento, algodón, papel, tela no

15 tejida, producto textil y tejido de punto, película, esponja y similares. Un ejemplo preferido es una tela no tejida de ácido poliglicólico, un material bioabsorbible, como el usado en los ejemplos de la memoria descriptiva.

Además, la preparación de fibrinógeno y el material de soporte que sostiene el fibrinógeno de la presente invención no solo se pueden usar solos, sino también en combinación con un componente que comprenda trombina como

20 ingrediente principal, formándose así un adhesivo biológico (adhesivo de fibrina) para el tejido humano y animal que se pueda aplicar ampliamente en el entorno clínico.

La presente invención se explica más detalladamente por medio del siguiente ensayo y los siguientes ejemplos, pero no se limita a los mismos.

25 Ejemplos

Ensayo: ensayo y método

30 (1) Preparación del polvo de fibrinógeno liofilizado

Se descongeló plasma congelado donado interno a baja temperatura, y se trató el crioprecipitado resultante mediante una combinación de precipitación con etanol frío y precipitación con glicina, produciéndose fibrinógeno. Se preparó una solución de fibrinógeno para su uso en la liofilización, disolviendo el fibrinógeno en una solución tampón

35 de ácido cítrico que contenía cloruro sódico y añadiendo después cada uno de los aditivos (preparados a 1/4 de la concentración final). Se sometió la solución de fibrinógeno resultante a filtración aséptica y se dispensaron cantidades de 12 ml en recipientes finales (botellas de vidrio) que, a continuación, se liofilizaron y se cerraron herméticamente.

40 (2) Tiempo de rehidratación

El tiempo de rehidratación se determinó como el tiempo necesario para la disolución completa a una temperatura de 23 a 26 ºC tras añadir 3 ml del disolvente (H2O) al polvo liofilizado. Para disolver el polvo liofilizado, se sacudió vigorosamente el recipiente de vial que contenía el disolvente con la mano. El contenido de proteína coagulable

45 (fibrinógeno) tras la disolución se estableció en 80 mg/ml a 90 mg/ml. El tiempo de rehidratación se presentó como la media (± DE) de cuatro mediciones.

(3) Tiempo de eliminación de la espuma

50 El tiempo de eliminación de la espuma se determinó como el tiempo total transcurrido desde el momento en que se disolvió el polvo liofilizado y se dejó reposar a temperatura ambiente hasta que las burbujas formadas en la disolución desaparecieron y apareció la superficie de la solución de fibrinógeno. El tiempo de eliminación de la espuma se presentó como la media (± DE) de cuatro mediciones.

55 (4) Contenido de proteína coagulable (fibrinógeno)

El contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) se determinó de acuerdo con los ensayos de contenido de proteína coagulable y pureza, que es un ensayo para un producto detallado que se describe en la notificación del Ministerio de Asuntos Sociales estadounidense, "MINIMUM REQUIREMENTS FOR BIOLOGICAL PRODUCTS". En

60 resumen, se determina una cantidad de proteínas precipitadas tras la adición de trombina a las muestras. La pureza del material usado en los ejemplos (una proporción de la cantidad de proteína coagulable con respecto a las proteínas totales) fue del 90 % o superior. El contenido de fibrinógeno descrito en los ejemplos se presentó como una media de dos mediciones.

(5) Preparación de una lámina de fibrinógeno

Se preparó una lámina de fibrinógeno empapando una lámina de ácido poliglicólico (Gunze: Neoveil (marca registrada)), un material médico en forma de lámina, con una solución de fibrinógeno a 50 l/cm2, tras lo que se 5 realizó la liofilización. La lámina de fibrinógeno se preparó de manera que tuviera una concentración final de fibrinógeno de 80 mg/ml a 90 mg/ml al rehidratarse la lámina de fibrinógeno con 50 l/cm2 de solución salina.

(6) Tiempo de saturación de la lámina de fibrinógeno con solución salina

10 El tiempo de saturación se determinó como el tiempo (segundos) transcurrido desde la adición gota a gota de solución salina (200 l) sobre la lámina de fibrinógeno (2 x 2 cm) hasta completarse la absorción de la solución salina en la lámina, mientras se dejaba reposar. El tiempo de saturación se presentó como la media (± DE) de tres mediciones.

15 (7) Ensayo de resistencia a la tracción

La resistencia a la tracción de la lámina de fibrinógeno se determinó mediante el método descrito en la norma ASTM (sociedad estadounidense para pruebas y materiales) (F2258: Prueba estándar) con alguna modificación. En primer lugar, se obtuvieron 2 láminas de dermis porcina y se fijaron por separado (2,5 x 2,5 cm). A continuación, se

20 absorbieron 300 l de 30 U/ml de trombina en las láminas de dermis porcina, y se intercaló una lámina de fibrinógeno (2,5 x 2,5 cm) entre estas dermis y se dejó reposar durante 1 a 5 min. Tras ello, se determinó la resistencia a la tracción mientras se tiraba de las láminas de dermis porcina hacia arriba y hacia abajo a una velocidad de movimiento de 2 mm/min. El contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) tras la disolución se estableció en 80 mg/ml a 90 mg/ml.

(8) Otros reactivos

Como se usa en los siguientes ejemplos, el NaCl se adquirió en Tomita Pharmaceutical Co., Ltd. El citrato trisódico dihidratado, la serina, la treonina, la glutamina, la leucina, la alanina y la isoleucina se adquirieron en Wako Pure

30 Chemical Industries, Ltd. La glicina, el monoclorhidrato de arginina, el glutamato sódico, el aspartato sódico, el monoclorhidrato de lisina y el tiloxapol (Triton WR-1339) se adquirieron en Nacalai Tesque, y el Tween 80 se adquirió en NOF CORPORATION. La albúmina se purificó de donaciones de plasma internas en Juridical Foundation the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute.

35 Ejemplo 1: Tiempo de rehidratación en relación con la técnica anterior

Se preparó un polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendía fibrinógeno como ingrediente principal, una cantidad sustancialmente necesaria de albúmina, isoleucina o glicina como aminoácido neutro, monoclorhidrato de arginina como aminoácido básico, glutamato sódico como aminoácido ácido, y Tween80 o tiloxapol como tensioactivo, y se

40 determinó el tiempo de rehidratación tras la adición del disolvente.

Se preparó una composición de polvo de fibrinógeno liofilizado de la presente invención que comprendía, tras la rehidratación, 84 mg/ml o más de fibrinógeno, 17,5 mg/ml de NaCl, 12 mg/ml de citrato trisódico dihidratado, 10 mg/ml de HSA (albúmina de suero humano), 0,2 mg/ml de Tween80 o 0,3 mg/ml de tiloxapol, isoleucina, glicina,

45 monoclorhidrato de arginina y glutamato sódico, y se determinó el tiempo de rehidratación como se ha descrito anteriormente. Además, como técnica anterior, se prepararon polvos liofilizados por referencia a las composiciones de fibrinógeno descritas en las instrucciones de los adhesivos de pegamento de fibrina disponibles en el mercado (tres tipos), y se determinó el tiempo de rehidratación de la misma manera para compararlo con los de la composición de la presente invención.

50 La Tabla 1 muestra las composiciones, las concentraciones de cada componente y un contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) tras la disolución. Además, la Figura 1 muestra un tiempo de rehidratación de las composiciones de la presente invención (Nº 1 a Nº 3) y las composiciones basadas en la técnica anterior (técnica anterior 1 a la técnica anterior 3). Estos resultados demuestran que la composición de la presente invención (Nº 1 a

55 Nº 3) mostró un tiempo de rehidratación significativamente reducido en comparación con la técnica anterior 1, la técnica anterior 2 y la técnica anterior 3 (véase la Figura 1). Por lo tanto, se demostró que la composición de la presente invención tiene una ventaja frente a la técnica anterior.

Ejemplo 2: Aditivos necesarios para reducir el tiempo de rehidratación

5 Se prepararon una composición de polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendía, tras la rehidratación, 4 mg/ml de isoleucina (I), 2 mg/ml de glicina (G), 12 mg/ml de monoclorhidrato de arginina (R), 10 mg/ml de glutamato sódico (E), 10 mg/ml de HSA (albúmina de suero humano: Al) y 0,2 mg/ml de Tween80 (De) además de 84 mg/ml o más de fibrinógeno, 17,5 mg/ml de NaCl y 12 mg/ml de citrato trisódico dihidratado (IGRE-AlDe), así como composiciones de polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendían la composición de IGRE-AlDe eliminando uno cualquiera de entre

10 HSA, isoleucina, glicina, monoclorhidrato de arginina, glutamato sódico o Tween80 (IGRE-De, GRE-AlDe, IRE-AlDe, IGE-AlDe, IGR-AlDe e IGRE-Al, respectivamente). Se determinó el tiempo de rehidratación como se ha descrito

anteriormente. Además, como técnica anterior, se prepararon los polvos de fibrinógeno liofilizados de las composiciones de la Técnica anterior 1 a la Técnica anterior 3 usadas en el Ejemplo 1, y se determinó el tiempo de rehidratación para compararlo con los de las composiciones como se ha descrito anteriormente.

5 La Tabla 2 muestra las composiciones, las concentraciones de cada componente y un contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) tras la disolución. Además, la Figura 2 muestra las mediciones del tiempo de rehidratación. Como resultado, se demostró que IGRE-AlDe, GRE-AlDe, IRE-AlDe e IGR-AlDe se rehidrataron en un tiempo más corto que el de la técnica anterior (Técnica anterior 1 a 3), mostrando IGRE-AlDe el tiempo de rehidratación más corto. Por otro lado, el tiempo de rehidratación de IGRE-De, IGE-AlDe e IGRE-Al fue similar al de la preparación

10 usando la técnica anterior. Esto demuestra que, para alcanzar el tiempo de rehidratación reducido de la presente invención, son esenciales la albúmina, la arginina y un tensioactivo, siendo necesarios al menos dos de entre isoleucina, glicina o ácido glutámico.

Ejemplo 3: Tiempo de rehidratación al sustituir los aminoácidos

Se preparó una composición de polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendía la composición, tras la rehidratación, de IGRE-AlDe preparada en el Ejemplo 2, así como composiciones de polvo de fibrinógeno liofilizado que 5 comprendían la composición de IGRE-AlDe con la sustitución de cada uno de los cuatro aminoácidos con otros aminoácidos. Se determinó el tiempo de rehidratación como se ha descrito anteriormente. Además, como técnica anterior, se preparó el polvo de fibrinógeno liofilizado de la composición de la Técnica anterior 2 usada en el Ejemplo 1, y se determinó el tiempo de rehidratación para compararlo con los de las composiciones de la presente invención.

10 Composiciones que comprenden IGRE-AlDe con sustitución de aminoácidos

Sustitución de la isoleucina (I):

La isoleucina (I) se sustituyó con leucina (L), un aminoácido neutro (LGRE-AlDe). 15 Sustitución de la glicina (G):

La glicina (G) se sustituyó con alanina (A), serina (S), treonina (T) o glutamina (Q), aminoácidos neutros (IARE-AlDe, ISRE-AlDe, ITRE-AlDe, IQRE-AlDe, respectivamente). Sustitución de la arginina (R): 20 La arginina (R) se sustituyó con lisina (K), clasificada como un aminoácido básico al igual que la arginina (IGKE-AlDe).

Sustitución del ácido glutámico (E):

25 El ácido glutámico (E) se sustituyó con ácido aspártico (D), clasificado como aminoácido ácido al igual que el ácido glutámico (IGRD-AlDe).

La Tabla 3 muestra las composiciones, las concentraciones de cada componente y un contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) tras la disolución. Además, la Figura 3 muestra las mediciones del tiempo de rehidratación. 30 Como resultado, se demostró que la isoleucina se podía sustituir con leucina (Figura 3, parte superior izquierda) y que la glicina se podía sustituir con alanina, serina, treonina y glutamina (Figura 3, parte superior derecha). También se demostró que la arginina se podía sustituir con lisina (Figura 3, parte inferior izquierda) y el ácido glutámico se podía sustituir con ácido aspártico (Figura 3, parte inferior derecha). La Tabla 4 muestra los aminoácidos considerados como reemplazables por cada uno de los cuatro aminoácidos. Por lo tanto, se demostró que los

35 aminoácidos comprendidos en el polvo de fibrinógeno liofilizado de la presente invención no se limitan a los cuatro aminoácidos, es decir, isoleucina, glicina, arginina y ácido glutámico, descritos en las Tablas 1 y 2 anteriores, sino que pueden ser cualquier otro aminoácido que tenga una propiedad similar a estos cuatro aminoácidos.

Tabla 4

Aminoácido neutro: Aminoácido básico Aminoácido ácido

Isoleucina: Glicina Arginina Ácido glutámico

Sustituible: Leucina Alanina Serina Treonina Glutamina Lisina Ácido aspártico

Ejemplo 4: efecto antiespumante con tensioactivo

5 Se preparó una composición de polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendía la composición, tras la rehidratación, de IGRE-AlDe preparada en el Ejemplo 2, así como composiciones de polvo de fibrinógeno liofilizado que comprendían la composición de IGRE-AlDe con la eliminación bien de Tween 80 o de uno de los aminoácidos. Se determinó el tiempo de eliminación de la espuma tras la rehidratación.

10 La Tabla 5 muestra las composiciones, las concentraciones de cada componente, un contenido de proteína coagulable (fibrinógeno) tras la disolución y un tiempo de eliminación de la espuma. Como resultado, la eliminación de la espuma se pudo detectar aproximadamente a los 2,5 a 6 min para las composiciones que contenían un tensioactivo: IGRE-AlDe, IGRE-AlDe (con la sustitución de Twee80 con tiloxapol), GRE-AlDe, IRE-AlDe e IGR-AlDe, mientras que la composición que no contenía tensioactivo, IGRE-Al, necesitó 121 min para que se eliminara la

15 espuma. Esto demostró que la adición de un tensioactivo permitió la extinción rápida de las espumas procedentes de la rehidratación del polvo de fibrinógeno liofilizado.

Ejemplo 5: Propiedad de saturación y resistencia a la tracción de la lámina de fibrinógeno

Se usaron las soluciones de fibrinógeno de la composición de IGRE-AlDe preparada en el Ejemplo 2, de la composición de IGRE-AlDe con la eliminación de isoleucina o del ácido glutámico (GRE-AlDe, IGR-AlDe,

5 respectivamente) y de la composición de un adhesivo de pegamento de fibrina disponible en el mercado (Técnica anterior 1 a 3) para preparar láminas de fibrinógeno, y se determinaron el tiempo de saturación y la resistencia a la tracción.

La Tabla 6 muestra las composiciones, las concentraciones de cada componente tras la adición de solución salina y

10 un tiempo de saturación. Además, la Figura 4 muestra los resultados del ensayo de resistencia a la tracción. Como resultado, en comparación con la técnica anterior (Técnica anterior 1 a 3), las láminas de fibrinógeno preparadas usando las composiciones de la presente invención (IGRE-AlDe, GRE-AlDe, IGR-AlDe) se saturaron con solución salina en un tiempo sumamente corto y proporcionaron una resistencia a la tracción superior.

15 Estos resultados demuestran que, de hecho, se pudo obtener una potente adhesión sin el procedimiento de disolución de un polvo liofilizado en una solución, que se ha usado comúnmente en la técnica anterior. Por lo tanto, se espera que el uso de la preparación sólida de fibrinógeno que comprende la composición de la presente invención permita disponer de una preparación capaz de ejercer una potente adhesión en un corto período de tiempo.

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar una preparación sólida de fibrinógeno que se rehidrata a un estado líquido en un tiempo más corto que las preparaciones que usan la técnica anterior. La preparación de fibrinógeno de la presente invención, debido a su reducido tiempo de rehidratación, tiene la ventaja de que se puede

usar más rápidamente en caso de emergencia. Además, la preparación de fibrinógeno de la presente invención tiene la ventaja adicional de que, debido a un efecto antiespumante de un tensioactivo, es posible succionar una solución de fibrinógeno reconstituida rápidamente en un aplicador, reduciéndose así todavía más el tiempo de preparación.

5 Por otra parte, la composición de fibrinógeno obtenida mediante la presente invención se puede mantener de forma preliminar sobre un material de soporte para proporcionar una preparación de fibrinógeno que se pueda aplicar directamente en una zona afectada sin rehidratarla con una solución. La preparación de fibrinógeno de la presente invención que se mantiene sobre el material de soporte se puede disolver rápidamente con una pequeña cantidad de agua en la zona aplicada, ejerciendo de este modo una gran fuerza adhesiva en un período de tiempo más corto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación sólida de fibrinógeno que comprende fibrinógeno como ingrediente principal y que contiene

además los siguientes componentes: 5

(a)

albúmina;

(b)

un tensioactivo no iónico;

(c)

un aminoácido básico o una sal del mismo; y

(d)

al menos dos aminoácidos, o una sal de los mismos, seleccionados de entre un aminoácido ácido o una sal 10 del mismo y un aminoácido neutro o una sal del mismo.
2. La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho aminoácido básico o sal del mismo es arginina o una sal de la misma, o lisina o una sal de la misma.

15 3. La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho aminoácido ácido o sal del mismo es ácido glutámico, ácido aspártico o una sal de los mismos, y dicho aminoácido neutro o sal del mismo es isoleucina, leucina, glicina, alanina, serina, treonina, glutamina o una sal de los mismos.
4. La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho componente (d) incluye al 20 menos dos aminoácidos, sales de los mismos, seleccionados de entre al menos dos de los siguientes grupos:

(d-1) ácido glutámico o ácido aspártico; (d-2) isoleucina o leucina; (d-3) glicina, alanina, serina, treonina o glutamina.
5. La preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde una combinación de dicho componente (c) y componente (d) es cualquiera de las siguientes:

arginina, ácido glutámico e isoleucina, o sales de los mismos;

30 arginina, ácido glutámico y glicina, o sales de los mismos; arginina, glicina e isoleucina, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos; lisina, isoleucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, leucina, glicina y ácido glutámico, o sales de los mismos;

35 arginina, isoleucina, alanina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, serina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, treonina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glutamina y ácido glutámico, o sales de los mismos; arginina, isoleucina, glicina y ácido aspártico, o sales de los mismos.
6. La preparación sólida de fibrinógeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además al menos uno seleccionado de entre Factor XIII, cloruro sódico, citrato sódico o aprotinina.
7. Un adhesivo de fibrina que comprende la preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de las 45 reivindicaciones 1 a 6 en combinación con un componente que comprende trombina como ingrediente principal.
8. Un material de soporte que sostiene fibrinógeno, donde los componentes de la preparación sólida de fibrinógeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 son sostenidos sobre un material médico.

50 9. Un adhesivo de fibrina que comprende el material de soporte que sostiene fibrinógeno de acuerdo con la reivindicación 8 en combinación con un componente que comprende trombina como ingrediente principal.