JP5941460B2 - チミジル酸合成酵素に対するｓｈＲＮＡ分子を含むリポソームおよびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、チミジル酸合成酵素に対するｓｈＲＮＡ分子を含むリポソームを有効成分とする抗腫瘍剤ならびにその用途、特に化学療法剤と併用するその用途に関する。

近年、ＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉ）を引き起こすＲＮＡｉ分子は、腫瘍などを治療するための有用なツールとして注目されており、腫瘍の増殖を抑制することが可能な様々なＲＮＡｉ分子が開発されている。本発明者らは以前に、ＤＮＡ合成に関与しているチミジル酸合成酵素（以下、ＴＳ）を標的とするＲＮＡｉ分子を報告し、当該ＲＮＡｉ分子がＴＳの発現を顕著に抑制することにより、抗腫瘍効果を有すること、また５−ＦＵ系抗腫瘍剤（特にテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）の抗腫瘍効果を増強することを報告した（特許文献１）。

しかしながら、一般的にＲＮＡｉ分子はｉｎ ｖｉｖｏ投与によって迅速に分解されてしまう。そのため、腫瘍に対して十分な量のＲＮＡｉ分子を送達することは極めて困難であった。

当該課題を解決すべく、今日、様々なＲＮＡｉ分子の送達方法が開発されている。例えば、ＲＮＡｉ分子（特にショートヘアピン構造を有するＲＮＡｉ分子（ｓｈＲＮＡ））をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込んで、当該ベクターを投与する方法が挙げられる（特許文献１）。しかし、この方法では当該ベクターを腫瘍内に直接注入して投与しなければならず、臨床応用を考慮すると、より容易な投与方法（例えば、静脈内投与など）が望まれていた。また、ＲＮＡｉ分子とリポソームからなる複合体（リポプレックス）を用いて、ＲＮＡｉ分子を腫瘍細胞へ送達する方法が開発されている（非特許文献１−３）。しかし、これらリポプレックスの繰り返し投与に際しては、投与された生体における免疫系の働きによりリポプレックスは、速やかに排除されてしまい十分な効果を得ることができない、また重篤な副作用が生じるなどの問題を生じていた。

したがって、当該分野においては依然として、ｉｎ ｖｉｖｏ投与によってＲＮＡｉ分子を効率的に腫瘍に送達する方法が切望されている。

ＷＯ２０１０／１１３８４４

Ｑｉｘｉｎ Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｆｕｔｕｒｅ．２００９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３４（９）：７２１． Ｓｈｅｒｒｙ Ｙ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．４，Ｄｅｃｍｂｅｒ ２００９ Ｂ．Ｏｚｐｏｌａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２６７；４４−５３ ２００９

本発明は、ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡの簡易かつ効率的なｉｎ ｖｉｖｏ送達方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＴＳの発現を抑制することが可能なｓｈＲＮＡをＰＥＧ修飾したカチオン性リポソーム表面に静電的に結合させることによって簡易に癌細胞へ送達できることを見出した。また、ｓｈＲＮＡを結合したＰＥＧ修飾したカチオン性リポソームを化学療法剤、特に５−ＦＵ系抗腫瘍剤と併用することによって、癌細胞への指向性を高め、癌細胞における効果を顕著に増大できることを見出した。さらに、ｓｈＲＮＡを結合したＰＥＧ修飾したカチオン性リポソームを、ＴＳ阻害作用を有する化学療法剤（例えば５−ＦＵ系抗腫瘍剤やペメトレキセドナトリウム水和物）と併用することによって、癌細胞における当該化学療法剤に対する感受性を高め、抗腫瘍効果を増強できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。

すなわち本発明は、以下のとおりである。

［１］ ＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを含む、抗腫瘍剤であって、該ｓｈＲＮＡは該ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの表面に結合されており、かつ３’末端に少なくとも２塩基からなるオーバーハングを有する、上記抗腫瘍剤。

［２］ ｓｈＲＮＡが配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖および該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む、［１］の抗腫瘍剤。

［３］ ｓｈＲＮＡが配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む、［１］または［２］の抗腫瘍剤。

［４］ ｓｈＲＮＡが配列番号８で表される塩基配列からなる、［１］〜［３］のいずれかの抗腫瘍剤。

［５］ ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルグリセロホスホコリン（ＰＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）およびＯ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル） ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）より構成されるカチオン性リポソームを含む、［１］〜［４］のいずれかの抗腫瘍剤。

［６］ ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＣ−６−１４が、３：２：３：２のモル比で含まれる、［５］の抗腫瘍剤。

［７］ 抗腫瘍剤の粒径が２００〜３００ｎｍである、［１］〜［６］のいずれかの抗腫瘍剤。

［８］ さらに、腫瘍細胞の増殖に関与する遺伝子からなる群より選択される遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの表面に結合されている、［１］〜［７］のいずれかの抗腫瘍剤。

［９］ 腫瘍細胞の増殖に関与する遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、Ｗｉｎｔ、Ｂｃｌ−２、サバイビン、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される一または複数の遺伝子である、［８］の抗腫瘍剤。

［１０］ 腫瘍を処置するための化学療法剤と併用される、［１］〜［９］のいずれかの抗腫瘍剤。

［１１］ ［１］〜［１０］のいずれかの抗腫瘍剤と腫瘍を処置するための化学療法剤とを含む、組み合わせ物。

［１２］ 腫瘍を処置するための化学療法剤が、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤である、［１０］の抗腫瘍剤および［１１］の組み合わせ物。

［１３］ ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が、５−ＦＵ系抗腫瘍剤またはペメトレキセドナトリウム水和物である、［１２］の抗腫瘍剤または組み合わせ物。

［１４］ ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、［１３］の抗腫瘍剤または組み合わせ物。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-114946号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明に係るチミジル酸合成酵素に対するｓｈＲＮＡ分子を含むリポソームを有効成分とする抗腫瘍剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与により、ＴＳを発現する腫瘍の増殖を抑制することが可能である。

図１は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１（Ａ）およびＤＬＤ−１／ＦＵ（Ｂ）における、ＴＳを標的としたｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのＴＳ発現抑制効果を示す特性図である。各レーンはそれぞれ以下のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡで処理したサンプルを示す。１：未処理；２：ｓｉＣｏｎｔ １０ｎＭ；３：ｓｉＴＳ １ｎＭ；４：ｓｉＴＳ ５ｎＭ；５：ｓｉＴＳ １０ｎＭ；６：ｓｈＴＳ １ｎＭ；７：ｓｈＴＳ ５ｎＭ；８：ｓｈＴＳ １０ｎＭ。 図２は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１における、ＴＳを標的としたｓｉＲＮＡ（Ａ）およびｓｈＲＮＡ（Ｂ）の５−ＦＵの有無によるＴＳ発現抑制効果を示す特性図である。（Ｃ）新しい培地を添加して９６時間後の各サンプルにおける細胞成長阻害率（％）を示す。 図３は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１／ＦＵにおける、ＴＳを標的としたｓｉＲＮＡ（Ａ）およびｓｈＲＮＡ（Ｂ）の５−ＦＵの有無によるＴＳ発現抑制効果を示す特性図である。（Ｃ）新しい培地を添加して９６時間後の各サンプルにおける細胞成長阻害率（％）を示す。 図４は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１担癌マウスにおける、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡのＳ−１の有無による腫瘍成長抑制効果（Ａ）および体重の増減（Ｂ）を示す特性図である。 図５は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１担癌マウスにおける、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡのＴＳ−１の有無による腫瘍成長抑制効果を示す写真図である。１：対照（スクロース投与）；２：Ｓ−１；３：ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポソーム；４：Ｓ−１＋ＴＳ−ｓｈＲＮＡリポソーム。 図６は、ヒト悪性胸膜中皮腫株ＭＳＴＯ ２１１ Ｈにおける、ペメトレキセドナトリウム水和物、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡ、あるいはペメトレキセドナトリウム水和物およびＴＳを標的としたｓｈＲＮＡによる、細胞成長阻害率（％）の経時的変化を示す。 図７は、ヒト悪性胸膜中皮腫株ＭＳＴＯ ２１１ Ｈ担癌マウスにおける、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡのペメトレキセドナトリウム水和物の有無による腫瘍成長抑制効果を示す特性図である。

本発明におけるチミジル酸合成酵素（以下、「ＴＳ」と記載）の発現を抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（以下、「ｓｈＲＮＡ」と記載）は、チミジル酸合成酵素のｍＲＮＡ部分を標的とすることにより、ＴＳ特異的にＲＮＡｉ作用を奏し、ＴＳの発現を顕著に抑制することができる。ここで本発明のＲＮＡｉ分子が、「ｍＲＮＡ部分を標的とする」とは、下記に詳述するｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡ部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることをいう。

ストリンジェントな条件下とは、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて求めることができる。例えば、ハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。

本発明におけるｓｈＲＮＡは、ＴＳをコードするＯＲＦの塩基配列またはその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と、当該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む。ここで「ＯＲＦの塩基配列またはその一部に同一な塩基配列」とは、ＯＲＦの塩基配列中のチミンをウラシルに置換して表される塩基配列またはその一部に同一である塩基配列を意味する。

当該センス鎖は１５〜２５塩基、好ましくは１９塩基からなる。センス鎖の塩基配列は、ＴＳをコードするＯＲＦの塩基配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一、すなわち相同な配列であってもよい。すなわち、センス鎖の塩基配列は、ＯＲＦの塩基配列において１または複数、すなわち、１〜３の塩基、好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基の置換、欠失、挿入および／または付加があってもよい。

当該アンチセンス鎖は、センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を有する。アンチセンス鎖は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる限り、１〜３の塩基、好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基の置換、欠失、挿入および／または付加を含むミスマッチを有するものであってもよい。好ましくは、アンチセンス鎖は、センス鎖と完全に相補的な塩基配列からなる。

センス鎖およびアンチセンスの塩基配列は、ＴＳをコードする公知の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＲ６０１５２８．１）に基づいて選択することができる。これらの塩基配列を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）などを用いることが可能である。

本発明において、センス鎖として以下の塩基配列からなるものが挙げられるがこれらに限定されない：５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号１）；５’−ＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＡＵＡＵＧＧＡＡＵ−３’（配列番号３）；５’−ＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＡＧＡＧＵＧＵ−３’（配列番号５）；５’−ＧＧＧＵＧＵＵＵＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＧＴＴ−３’（配列番号１１）。

好ましくは本発明におけるｓｈＲＮＡは、センス鎖５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号１）とアンチセンス鎖５’−ＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＧＧＵＧＵＵＡＣ−３’（配列番号２）；センス鎖５’−ＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＡＵＡＵＧＧＡＡＵ−３’（配列番号３）とアンチセンス鎖５’−ＡＵＵＣＣＡＵＡＵＣＵＣＵＧＵＡＵＵＣ（配列番号４）；またはセンス鎖５’−ＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＡＧＡＧＵＧＵ−３’（配列番号５）とアンチセンス鎖５’−ＡＣＡＣＵＣＵＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＧ−３’（配列番号６）；センス鎖５’−ＧＧＧＵＧＵＵＵＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＧＴＴ−３’（配列番号１１）とアンチセンス鎖５’−ＡＡＣＡＡＣＵＣＣＵＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣ−３’（配列番号１２）を含む。

さらに好ましくは、本発明におけるｓｈＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む。

センス鎖とアンチセンス鎖は、リンカー部分を介して連結され、当該リンカー部分がループを形成することにより折りたたまれ、当該アンチセンス鎖と当該センス鎖がハイブリダイズして、二本鎖部分を形成する。ｓｈＲＮＡ分子に含まれるリンカー部分は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知である２〜２２塩基のポリヌクレオチドリンカーが好ましい。具体的には、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣおよびＵＵＣＧが例示でき、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）が好ましい。

本発明におけるｓｈＲＮＡは３’末端に少なくとも２塩基からなるオーバーハングを有する。

本発明において、オーバーハングとは、アンチセンス鎖の３’末端に付加された塩基であって、センス鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有していない場合、オーバーハングを有している場合と比べて、下記にて詳述するＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを用いたトランスフェクションにおいて、ｓｈＲＮＡによるＴＳの発現抑制の程度がおよそ４０〜６０％低下する。当該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＴＴＴ、ＵＵやＴＴが挙げられる。好ましくは、ＵＵである。

本発明において、好ましいｓｈＲＮＡとしては、配列番号８で表される塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡである。

また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、５’末端がリン酸化されていてもよく、５’末端に三リン酸（ｐｐｐ）が結合していても良い。

本発明におけるＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、カチオン性リポソームの表面に一または複数のポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）が共有結合されてなり、これによってカチオン性リポソームのｉｎ ｖｉｖｏでの血中滞留性を増加させることができる。

カチオン性リポソームは公知の手法、例えば薄膜振とう法（Ｂａｎｇｈａｍ法）に基づいて作製することができる（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３，２３８−２５２（１９６５）；Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｒ．Ｗ．Ｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８，６６０−６６８（１９６４））。すなわち、フラスコ等の容器内において少なくとも１種のリン脂質をクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、当該有機溶媒を揮発させて容器の底部に脂質膜を形成させた後、そこに緩衝液等の水溶液を入れて攪拌することによって、リポソームを含む懸濁液を得ることができる。

本発明におけるカチオン性リポソームは、以下より選択される一以上のリン脂質からなる１つまたは複数の膜を有する：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（以下、「ＤＯＰＥ」と記載）、パルミトイルオレオイルグリセロホスホコリン（以下、「ＰＯＰＣ」と記載）、コレステロール（以下、「ＣＨＯＬ」と記載）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル） ジエタノールアミンクロリド（以下、「ＤＣ−６−１４」と記載）、水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンおよび１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン。

好ましくは本発明におけるカチオン性リポソームは、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＣ−６−１４からなる。カチオン性リポソームにおけるＤＯＰＥ、ＰＯＰＣおよびＤＣ−６−１４の含有比（モル比）は、ＤＯＰＥ：ＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＣ−６−１４＝２〜４：４〜１：３〜１：１〜４であり、好ましくは３：２：３：２である。

カチオン性リポソームの表面に結合されるＰＥＧは、分子量５００〜５０００の範囲にあるものから選択され、好ましくは分子量２０００程度である。カチオン性リポソームへのＰＥＧの結合は、公知の手法によって行うことができ、特に限定されないがポストインサーション法を用いて行うことができる。すなわち、上記カチオン性リポソームの形成後、リン脂質とＰＥＧからなる複合分子を当該カチオン性リポソームと適当な条件下（例えば、３０〜６０℃、３０分間〜３時間）でインキュベートすることによって、複合分子の脂質部分をカチオン性リポソームの外側のリン脂質膜中に、ＰＥＧをカチオン性リポソームの表面に曝露する形態で組み込むことができる。この際、用いる複合分子の量は、上記カチオン性リポソームの総脂質に対して３〜１０％（モル比）好ましくは５％である。本発明において利用し得るリン脂質とＰＥＧからなる複合分子としては、ｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥが挙げられるがこれに限定されない。

本発明におけるＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、粒径が８０〜２００ｎｍ、好ましくはおよそ１００ｎｍである。本発明におけるＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、ゼータ電位が１０〜４０ｍＶ、好ましくはおよそ２５ｍＶである。

上記ｓｈＲＮＡは、上記ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの膜表面に共有結合または非共有結合によって結合している。上記ｓｈＲＮＡと上記ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの結合に際しては、上記ｓｈＲＮＡと上記ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを含む混合液を１〜１５分間、好ましくは１０分間程度激しく攪拌することが好ましい。攪拌を加えることによって、得られるｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの粒径を数百ｎｍのサイズに調製できる（Ｂａｒｉｃｈｅｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０１１），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｊｐｈａｒｍ．２０１１．０３．００１）。また、攪拌を加えることによって、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソーム上に上記ｓｈＲＮＡを均一に分散させ結合させることができ、ｓｈＲＮＡの不均一な結合によってもたらされる組織によるＰＥＧ修飾カチオン性リポソーム取り込みの不均一性を防ぐことができる。

本発明において、ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは粒径が１２０〜６００ｎｍ、好ましくは２００〜３００ｎｍである。また、本発明において、ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームはゼータ電位が、５〜３０ｍＶ、好ましくはおよそ１０〜２５ｍＶである。ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの表面電荷はより中性に近く、またＰＥＧによる立体障害の存在から血清タンパク質と結合することが少ないために、肺胞にトラップされることを防ぐことができ、血中滞留性を増加させることができる。

本発明におけるｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、上記ｓｈＲＮＡに加えて、腫瘍細胞において発現する別の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含んでも良い。「腫瘍細胞において発現する別の遺伝子」とは、腫瘍細胞の増殖に関与する因子、例えばＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、Ｗｉｎｔ、Ｂｃｌ−２、サバイビンなどの増殖調節因子群、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成関連酵素群などをコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。上記ｓｈＲＮＡと腫瘍細胞において発現する別の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、同一のＰＥＧ修飾カチオン性リポソームに結合していても良いし、それぞれ別個のＰＥＧ修飾カチオン性リポソームに結合していても良い。

なお、本明細書において、ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを、「ＰＥＧ修飾リポプレックス」と呼ぶ場合がある。

下記実施例にて詳述されるように、ｉｎ ｖｉｖｏ投与により上記ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能であり、癌を治療するための抗腫瘍剤として使用できる。

本発明の抗腫瘍剤を用いて治療できる癌としては、ＴＳを高発現している癌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍、悪性胸膜中皮腫等が挙げられる。好ましくは結腸・直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肝臓癌、悪性胸膜中皮腫であり、特に好ましくは結腸・直腸癌、悪性胸膜中皮腫である。

本発明の抗腫瘍剤はまた、ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームと共に、医薬の製造において通常用いられている、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、ヒスチジン等を含んでも良い。

賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸およびこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリンおよびこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。

本発明の抗腫瘍剤は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によって、投与することができる。好ましくは、本発明の抗腫瘍剤は、静脈内投与、腹腔内投与または胸腔内投与である。

また、本発明の抗腫瘍剤は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。

本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、腫瘍の大きさが当該抗腫瘍剤を投与していない（または投与前の）細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。本発明の抗腫瘍剤の効果を評価するのに利用できる癌細胞として、ＴＳが発現していれば癌種等は特に制限されず、例えば、ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ＤＬＤ−１／５ＦＵ（５−ＦＵ耐性のＤＬＤ−１株）、ＫＭ１２Ｃ／５ＦＵ（５−ＦＵ耐性のＫＭ１２Ｃ株）、ＨＴ２９／５ＦＵ（５−ＦＵ耐性のＨＴ２９株）、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ−３／５ＦＵ（５−ＦＵ耐性のＮＵＧＣ−３株）、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞株（ＭＳＴＯ ２１１Ｈ）等が挙げられる。

本発明の抗腫瘍剤の効果は、ＴＳのｍＲＮＡを標的とする当業者に公知のＲＮＡｉ分子を有効成分とする抗腫瘍剤と比べて、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の抗腫瘍効果を有し得る。

従来的にｓｈＲＮＡの標的細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ送達は、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含むウイルスベクターが利用されており（ＷＯ２０１０／１１３８４４）、当該ウイルスベクター注入時の水圧またはウイルス感染により当該ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡは細胞内に移行し、核内でｓｈＲＮＡは発現する。発現されたｓｈＲＮＡは、内在性のｓｈＲＮＡと同様に、ダイサーと呼ばれる酵素と接触してステムループ構造が切り出され、相補的な二本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡとなりＲＮＡｉ作用を生じる。一方、本発明の抗腫瘍剤は経口または非経口投与により、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームに担持されるｓｈＲＮＡを腫瘍細胞に送達する。腫瘍細胞に送達されたｓｈＲＮＡはエンドサイトーシスにより細胞内へ移行する。すなわち、上記従来技術と異なり、本発明におけるｓｈＲＮＡは標的細胞にて発現されたものではない。このようにｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞外から導入されたｓｈＲＮＡが分解されることなくＲＮＡｉ作用を発揮し、標的細胞にて発現される内在性の遺伝子の発現を抑制できることは、本発明者らによって初めて見出されたことである。

また、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームにｓｉＲＮＡを担持させる場合、その製造過程において相補的な二本鎖を形成していない、センス鎖またはアンチセンス鎖のみが担持される可能性がある。このようなセンス鎖またはアンチセンス鎖のみが担持されたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは不純物であるといえ、医薬品という観点から望ましくない。一方、ｓｈＲＮＡをＰＥＧ修飾カチオン性リポソームに担持させることによって、上記のような不純物が生じる可能性は低く、医薬品という観点から望ましいといえる。

本発明の抗腫瘍剤は、既存の化学療法剤と共に使用することができる。既存の化学療法剤としては、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が挙げられる。

「ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤」としては、ＴＳの機能を阻害しうる限り特に限定されず、例えば、５−ＦＵ系抗腫瘍剤、ペメトレキセドナトリウム水和物、ラルチトレキセド（Ｔｏｍｕｄｅｘ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ＯＳＩ−７９０４Ｌ（ＯＳＩ社）などが挙げられる。

ＴＳの発現量と５−ＦＵ系抗腫瘍剤の感受性の関係が報告されている（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｇ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９５；５５：１４０７−１２．およびＫｕｎ−Ｈｕｅｉ Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １９９８；８２：１６２６−３１）。癌患者の中でもＴＳの発現が比較的低い癌患者は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤が顕著に奏効する一方で、癌患者の中でもＴＳの発現が比較的亢進している癌患者の多くは、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対して耐性を有する。本発明の抗腫瘍剤を投与することによって、腫瘍組織内のＴＳの産生を抑えることができ、当該腫瘍組織の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の感受性を高めることができる。また、上記ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、５−ＦＵ系抗腫瘍剤と併用した場合に、選択的に腫瘍内に蓄積される（Ｙｕｓｕｋｅ Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１０，ｖｏｌ．１０１，ｎｏ．１１，２４７０−２４７５）。

これらの効果によって、５−ＦＵ系抗腫瘍剤と併用した場合に、当該ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを含む本発明の抗腫瘍剤は、上記ｓｈＲＮＡを腫瘍に効率的に送達することが可能であり、５−ＦＵ系抗腫瘍剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。

「５−ＦＵ系抗腫瘍剤」としては、５−ＦＵおよび活性代謝物質が５−ＦＵである５−ＦＵ誘導体が挙げられる。５−ＦＵ誘導体としては例えば、テガフールを含有するものを挙げることができる。５−ＦＵ誘導体としては好ましくは、テガフール含有配合剤であり、具体的には、テガフール・ウラシル配合剤（例えば、ユーエフティ（登録商標）（大鵬薬品工業株式会社））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤などが例示できる。この中でも、下記に詳述されるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、例えばティーエスワン（登録商標）（大鵬薬品工業株式会社）が特に好ましい。なお、本明細書において、５−ＦＵ系抗腫瘍剤を「Ｓ−１」、「ＴＳ−１」と記載する場合があるが、これらの用語は相互に互換的に用いられる。

また、ペメトレキセドナトリウム水和物としては、アリムタ（登録商標）（日本イーライリリー株式会社）が挙げられる。ペメトレキセドナトリウム水和物も、上記５−ＦＵ系抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、上記ｓｈＲＮＡを腫瘍に効率的に送達することが可能である、および／または当該ペメトレキセドナトリウム水和物または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。

本発明の抗腫瘍剤は、上記ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤に加えて、または変えて、他の既存の化学療法剤と共に使用することができる。このような化学療法剤としては、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード Ｎ−オキシド、イホスファサミド、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、カルムスチン、ペメトレクスドジソディウム、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、ペメトレキセド、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン、カペシタビンなどが挙げられ、これらから選択される一または複数の化学療法剤を用いることができる。これらの化学療法剤も、上記ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤と同様に、本発明の抗腫瘍剤との併用により、上記ｓｈＲＮＡを腫瘍に効率的に送達することが可能である、および／または当該化学療法剤または本発明の抗腫瘍剤を単独で用いた場合と比べて、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の顕著に高い抗腫瘍効果を得ることができる。

本発明の抗腫瘍剤と、上記既存の化学療法剤とは併用投与される限り、組み合わせ物として提供することができる。

「組み合わせ物」は、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の化学療法剤とを有効成分として含む配合剤であっても良いし、ならびに本発明の抗腫瘍剤と上記既存の化学療法剤を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもあっても良い。

「併用投与」には、本発明の抗腫瘍剤と上記既存の化学療法剤とを同時に投与する場合だけではなく、本発明の抗腫瘍剤および上記既存の化学療法剤を間隔をあけて投与する場合も含まれる。

本発明の抗腫瘍剤の投与量および投与回数は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、ｓｈＲＮＡの量にして１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲から適宜選択される量を、１日に１〜３回、毎日または１〜２１日毎に投与することができる。本発明の抗腫瘍剤に含まれる上記ｓｈＲＮＡを備えたＰＥＧ修飾カチオン性リポソームは、従来公知のＲＮＡｉ分子とリポソームからなる複合体（リポプレックス）と比べて高い血中滞留性を有するために、頻回投与を回避することができる。これによって、投与された生体内における免疫系の異物認識を受け難くすることができる。

上記既存の化学療法剤の投与量は、有効成分である化学物質の種類、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、１回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲から適宜選択される量を、１日に１〜３回、毎日または１〜１４日毎に投与することができる。例えば、既存の化学療法剤が５−ＦＵ系抗腫瘍剤である場合、１日にテガフールにして６０〜１６０ｍｇを毎日または１〜７日毎に投与することができる。上記既存の化学療法剤は単独で用いる場合と比べて、低用量かつ頻回投与することができる。これによって、上記既存の化学療法剤の投与により引き起こされ得る副作用（例えば、骨髄抑制、溶血性貧血、播種性血管内凝固症候群、劇症肝炎、脱水症状、腸炎、間質性肺炎、口内炎、消化管潰瘍、消化管出血、消化管穿孔、急性腎不全、皮膚粘膜眼症候群、中毒性表皮壊死症、精神神経障害、急性膵炎、横紋筋融解症、嗅覚脱失など、これらに限定されない）の発症を抑制または遅延することができる。

本発明はまた、上記本発明の抗腫瘍剤を用いた癌の治療方法に関する。当該方法により治療し得る癌としては、上に定義したような癌が含まれる。また、当該方法において上記本発明の抗腫瘍剤および既存の化学療法剤の用法および用量は上記したとおりである。

以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

実施例１：ＲＮＡｉ分子の調製
以下のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを、公知の一般的な手法に基づいて合成した。

（Ｉ）ＴＳを標的とするｓｉＲＮＡ
ＴＳを標的とするｓｉＲＮＡは、抗腫瘍効果が既に確認されているＴＳに対するｓｉＲＮＡ（ＷＯ２０１０／１１３８４４）に基づいて合成されており、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる。

センス鎖：
５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：
５’−ＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＧＧＵＧＵＵＡＣ−３’（配列番号２）
なお、以下、ＴＳを標的とするｓｉＲＮＡを「ｓｉＴＳ」と記載する。

（ＩＩ）ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ
対照のｓｉＲＮＡとして、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを合成した。当該ｓｉＲＮＡは以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる。

センス鎖：
５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：
５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＴＴ−３’（配列番号１０）
なお、以下、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを「ｓｉＣｏｎｔ」と記載する。

（ＩＩＩ）ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡ
ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡは、抗腫瘍効果が既に確認されているＴＳに対するｓｈＲＮＡ（ＷＯ２０１０／１１３８４４）に基づいて合成されており、以下の配列を有する。

ＴＳ−ｓｈＲＮＡ：
５’−ＧＵＡＡＣＡＣＣＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＧＧＵＧＵＵＡＣＵＵ−３’（配列番号８）
３’末端の２つのウラシル（オーバーハング）を有する点で、前記公知のＴＳに対するｓｈＲＮＡと異なる。なお、以下、ＴＳを標的とするｓｈＲＮＡを「ｓｈＴＳ」と記載する。

実施例２：ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡによるＴＳ発現抑制
＜トランスフェクション＞
トランスフェクション試薬には、カチオニックリポソームの一種であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（以下、「Ｌｆ ＲＮＡｉ ＭＡＸ」と記載）を使用した。

実施例１で調製したｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡならびにＬｆ ＲＮＡｉ ＭＡＸをそれぞれ、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈し、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡとＬｆ ＲＮＡｉ ＭＡＸの比率が１００（ｐｍｏｌ）：５（μＬ）になるように混合した。このとき、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ溶液とＬｆ ＲＮＡｉ ＭＡＸ溶液の量は等量とした。この混合液を１０〜２０分間室温で放置することで複合体（リポプレックス）を形成した。

各リポプレックスを、あらかじめＯｐｔｉＭＥＭの入っている１０ｃｍディッシュにそれぞれ直接添加し、合計容積が５ｍｌとなるように調整した。次にＤＬＤ−１もしくはＤＬＤ−１／ＦＵ細胞懸濁液１０ｍｌを当該ディッシュに５００，０００細胞／ディッシュとなるように播種し、最終合計容積を１５ｍｌとし、トランスフェクションを行った。このとき、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの最終濃度が１，５，１０ｎＭとなるように調整した。トランスフェクションを開始してから３７℃、５％ＣＯ_２条件下、培地中で７２時間培養し、その後、以下の方法により細胞抽出液を調製した。

＜細胞抽出液の調製＞
トランスフェクションを開始してから７２時間後、培地を除去し、冷ＰＢＳ（−）で洗浄した後、トリプシン溶液を用いて細胞をはがし、遠心して上清を取り除いた。さらに冷ＰＢＳ（−）で洗浄後、冷Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１％ＮＰ−４０，０．２５％デオキシコール酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌおよびＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ））を１００〜１５０μＬ添加し、１時間、氷上（４℃）の条件下インキュベートして細胞を溶解した。その後、遠心分離し（１５，０００×ｇ、１５分間、４℃）、得られた上清を細胞抽出液とした。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの調製＞
上記細胞抽出液と２×サンプルバッファーを等量ずつ混合し、９５℃に設定したマイクロチューブ用ホットプレートを用いて３分間加熱した。その後３０秒間遠心し、室温で冷ましてＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
上記サンプルを６μＬ（９μｇタンパク質／レーン）ずつゲルにアプライし、パワーサプライ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とつないでゲル２枚で４０ｍＡ（ゲル１枚では２０ｍＡ）の定電流で約８０分間電気泳動した。

＜ウェスタンブロッティング＞
適当な大きさに切ったろ紙及びＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬを、前処理としてブロッティングバッファーに浸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、トランスファー装置を用いてタンパクをＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬに転写した。転写したＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬをブロッキングバッファー（５％スキムミルク）に浸して室温で１時間ブロッキングし、Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄した。

ＴＳ及びβ−アクチンを検出するために、Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒで希釈したそれぞれの一次抗体（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＴＳ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１０００）（ＡＮＡＳＰＥＣ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ β−ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５００）（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ））を４℃で一晩反応させた。Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄後、Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒで希釈した二次抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：２０００）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｊａｐａｎ））溶液を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒで５分間３回洗浄後、ＥＣＬ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔと約１分間反応させた。目的タンパク質のバンドはＸ線フィルムにより検出した。

結果を図１に示す。

実施例１で調製したｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡが、ＤＬＤ−１細胞およびＤＬＤ−１／ＦＵ細胞におけるＴＳの発現を顕著に抑制できることが明らかとなった。

実施例３：ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡによる癌細胞（ヒト結腸腺癌細胞）増殖阻害効果
本実験では９６ウェルプレートスケールで実験を行った。上記実施例２と同様に調製したリポプレックスをあらかじめＯｐｔｉＭＥＭを入れておいたウェルに直接添加し、全容積が５０μｌとなるようにした。次にヒト結腸腺癌細胞ＤＬＤ−１またはＤＬＤ−１／ＦＵの細胞懸濁液（２，０００細胞／１００μｌ）を、リポプレックスを入れたウェルに添加し（最終合計容積を１５０μｌ）トランスフェクションを行った。ここで、ウェル中のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの最終濃度は５ｎＭである。

トランスフェクション開始２４時間後、培地を除去し、既存の化学療法剤５−ＦＵ（フルオロウラシル）を含むまたは含まない新しい培地を（２００μｌ）添加した。ここで、ＤＬＤ−１に対しては５−ＦＵを０．１μｇ／ｍＬの濃度で、ＤＬＤ−１／ＦＵに対しては５−ＦＵを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。新しい培地を添加して０、２４、４８、７２、９６時間後、培地を除去し、０．５％ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液を５０μＬ加え、４時間、３７℃、５％ＣＯ_２条件下でインキュベーションした。また細胞の入っていないウェルにも０．５％ＭＴＴ溶液を加えバックグラウンドとした。

インキュベーション終了後、それぞれのウェルに酸性イソプロパノール１５０μＬを加え、シェイカーを用いホルマザン結晶を溶解し、プレートリーダーを用いて、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定し、細胞の増殖率を算出した。

細胞の増殖率（％）＝［Ａ５７０（新しい培地を添加してＸ時間後）／Ａ５７０（新しい培地を添加して０時間後）］×１００
結果を図２および３示す。

図２および図３に示すとおり、ｓｉＴＳおよびｓｈＴＳは５−ＦＵの存在下において、ＤＬＤ−１細胞およびＤＬＤ−１／ＦＵ細胞の増殖を顕著に阻害した。

実施例４：ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの調製
カチオン性リポソームはＢａｎｇｈａｍ法により調製した。

カチオン性脂質、すなわちＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＣ−６−１４はそれぞれあらかじめクロロホルムで溶解させ、ストック溶液を調製した。脂質組成がＤＯＰＥ：ＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＣ−６−１４＝３：２：３：２（モル比）となるようにそれぞれストック溶液からガラスシリンジを用いて正確に量り取り、栓付き試験管に入れ、混合した（総脂質量として１５０ｍｍｏｌ）。次に、ロータリーエバポレーター（ＩＷＡＫＩ、東京）を用いて減圧下クロロホルムを除去し、その後、完全にクロロホルムを取り除くために試験管を一晩真空ポンプに入れ、試験管内に脂質薄膜を形成させた。この脂質薄膜に内水相として９％スクロース溶液（３０ｍＬ，ｐＨ７．４）を加え、３７℃で激しく攪拌することで脂質薄膜を完全に水和させ、ＭＬＶ（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を得た（最終脂質濃度は５０ｍＭ）。この溶液を３７℃に加温しながら、２００、１００、５０ｎｍのポリカーボネート膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ，ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてエクストリュージョン法により粒子径が約１００ｎｍとなるＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を調製した。リポソームの粒子径（動的光散乱法）及びゼータ電位（電気泳動光散乱法）はＮＩＣＯＭＰ ３７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）により測定した。調製したリポソームの平均粒子径１１９．９ｎｍであり、ゼータ電位は２５．５６ｍＶであった。

リポソームへのＰＥＧ修飾は、ポストインサーション法により行った。基本となるリポソームを調製後、９％スクロース溶液中に完全に溶解させたｍＰＥＧ_２０００−ＤＳＰＥを脂質（ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＣ−６−１４）総量に対してモル比で５％となるようにリポソーム溶液に添加し、振盪機付きインキュベータ中で３７℃、１時間、軽く振盪させながら行った。

実施例５：ＰＥＧ修飾リポプレックスの調製
ＰＥＧ修飾リポプレックスは、上記実施例４で調製したＰＥＧ修飾カチオン性リポソームと上記実施例１で調製したｓｈＴＳとを、カチオン性リポソーム：ｓｈＴＳ＝２０００：１（モル比）となるように混合し、１０分間激しく攪拌することで調製した。調製したＰＥＧ修飾ｌｉｐｏｐｌｅｘの平均粒子径及びゼータ電位は、２８６．８ｎｍ及び１５．８１ｍＶであった。

実施例６：ＰＥＧ修飾リポプレックスのＤＬＤ−１担がんマウスへの全身投与による抗腫瘍効果
ＤＬＤ−１担がんマウスの作製
ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ雄性マウスの皮下にＤＬＤ−１細胞懸濁液（２×１０^６細胞／１００μＬ）を接種した。細胞移植８日後、腫瘍体積が５０−１００ｍｍ^３に達したマウスをｉｎ ｖｉｖｏの実験に用いた。

ＰＥＧ修飾リポプレックスの制がん活性評価
上記ＤＬＤ−１担がんマウスに対し、腫瘍移植後８日目からＰＥＧ修飾リポプレックスをｓｈＲＮＡ量で８０μｇ／３００μＬずつ１日間隔で合計８回マウス尾静脈より投与した。

既存の化学療法剤「ＴＳ−１」（大鵬薬品工業）を併用する場合には、腫瘍移植後８日目から、６．９ｍｇテガフール／ｋｇの用量で１５日間、毎日経口投与した。

制がん活性は、腫瘍体積変化と体重変化について検討した。

腫瘍体積は以下の式に基づいて算出した。

腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（腫瘍の長辺）×（腫瘍の短辺）^２×０．５
結果を図４および図５に示す。

対象群と比較して、ＴＳ−１またはＰＥＧ修飾リポプレックスを単独で用いて処置した群では約３４％の腫瘍成長抑制効果が示された。一方、ＴＳ−１およびＰＥＧ修飾リポプレックスの併用処置群では約６６％の腫瘍成長抑制効果が示された。いずれの処置群においても体重増加抑制を含む、重篤な毒性は見られなかった。また、図５に示されるとおり、ＰＥＧ修飾リポプレックスとＴＳ−１とを併用することによって、腫瘍成長が顕著に抑制されることが確認できた。

実施例７：ｓｈＲＮＡによる癌細胞（ヒト悪性胸膜中皮腫細胞）増殖阻害効果
本実験は、ヒト結腸腺癌細胞ＤＬＤ−１またはＤＬＤ−１／ＦＵに代えて、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞ＭＳＴＯ ２１１Ｈを癌細胞として使用し、５−ＦＵに代えて、ペメトレキセドナトリウム水和物（アリムタ（日本イーライリリー株式会社））を既存の化学療法剤として使用した点を除いて、上記実施例３と同様の方法を用いて行った。なお、トランスフェクションを行う際の、ウェル中のｓｈＲＮＡの最終濃度は５ｎＭおよび１０ｎＭに調整し、ペメトレキセドナトリウム水和物は１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培地に添加して用いた。

細胞の増殖率は、上記実施例３と同様の方法で測定した。結果を図６に示す。

図６に示すとおり、ｓｈＴＳはペメトレキセドナトリウム水和物の存在下において、ＭＳＴＯ ２１１Ｈ細胞の増殖を顕著に阻害した。

実施例８：ＰＥＧ修飾リポプレックスのＭＳＴＯ ２１１Ｈ担がんマウスへの全身投与による抗腫瘍効果
ＭＳＴＯ ２１１Ｈ担がんマウスの作製
ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ雄性マウスの皮下にＭＳＴＯ ２１１Ｈ細胞懸濁液（５×１０^６細胞／１００μＬ）を接種した。細胞移植１４日後、腫瘍体積が５０−１００ｍｍ^３に達した事を確認し、ｉｎ ｖｉｖｏの実験に用いた。

ＰＥＧ修飾リポプレックスのＭＳＴＯ ２１１Ｈ担がんマウスにおける制がん活性評価
上記ＭＳＴＯ ２１１Ｈ担がんマウスに対し、腫瘍移植後１４日目から、上記実施例５で調製したＰＥＧ修飾リポプレックスをｓｈＲＮＡ量で４０μｇ／２００μＬずつ１日間隔で合計６回マウス尾静脈より投与した。

既存の化学療法剤ペメトレキセドナトリウム水和物（アリムタ（日本イーライリリー株式会社））を併用する場合には、腫瘍移植後１４日目から、１００ｍｇ／ｋｇの用量で６回（１，２，３，８，９，１０日目）腹腔内投与した。

制がん活性は、投与開始後２１日目における腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ（％））で示し、ＴＧＩ（％）は上記実施例６と同様に算出した。

結果を図７に示す。

ペメトレキセドナトリウム水和物、またはＴＳに対するｓｈＲＮＡ（ＴＳ ｓｈＲＮＡ）を含むＰＥＧ修飾リポプレックス、を単独で用いて処置した群ではそれぞれ約２８％、約１９％の腫瘍成長抑制効果が示された。また、ペメトレキセドナトリウム水和物と標的をもたないｓｈＲＮＡ（ＮＳ ｓｈＲＮＡ）を含むＰＥＧ修飾リポプレックスを併用した場合、約２２％の腫瘍成長抑制効果が示されたが、これはペメトレキセドナトリウム水和物単独処置群における腫瘍成長抑制効果と同等であった。一方、ペメトレキセドナトリウム水和物およびＴＳ ｓｈＲＮＡを含むＰＥＧ修飾リポプレックスの併用処置群では約４２％の腫瘍成長抑制効果が示された。図７に示すとおり、ペメトレキセドナトリウム水和物およびＴＳ ｓｈＲＮＡを含むＰＥＧ修飾リポプレックスとを併用することによって、腫瘍成長が顕著に抑制されることが確認できた。

本発明に係るチミジル酸合成酵素に対するｓｈＲＮＡ分子を含むリポソームを有効成分とする抗腫瘍剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与により、ＴＳを発現する腫瘍の増殖を抑制することが可能である。さらに、当該抗腫瘍剤を化学療法剤と併用することによって、癌組織への指向性を高め抗腫瘍効果を顕著に向上させることができる。本発明は癌治療の分野における貢献が期待される。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (12)

1. ＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームを含む、抗腫瘍剤であって、該ｓｈＲＮＡは該ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの表面に結合されており、かつ３’末端に少なくとも２塩基からなるオーバーハングを有し、ＰＥＧ修飾カチオン性リポソームが、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルグリセロホスホコリン（ＰＯＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）およびＯ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）より構成されるカチオン性リポソームを含み、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＣＨＯＬおよびＤＣ−６−１４が、３：２：３：２のモル比で含まれる、上記抗腫瘍剤。
2. ｓｈＲＮＡが配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖および該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
3. ｓｈＲＮＡが配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖を含む、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
4. ｓｈＲＮＡが配列番号８で表される塩基配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
5. 抗腫瘍剤の粒径が２００〜３００ｎｍである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
6. さらに、腫瘍細胞の増殖に関与する遺伝子からなる群より選択される遺伝子の発現を抑制することができるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡがＰＥＧ修飾カチオン性リポソームの表面に結合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
7. 腫瘍細胞の増殖に関与する遺伝子が、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、Ｗｉｎｔ、Ｂｃｌ−２、サバイビン、リボヌクレオチドレダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子からなる群から選択される一または複数の遺伝子である、請求項６に記載の抗腫瘍剤。
8. 腫瘍を処置するための化学療法剤と併用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤と腫瘍を処置するための化学療法剤とを含む、組み合わせ物。
10. 腫瘍を処置するための化学療法剤が、ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤である、請求項８に記載の抗腫瘍剤または請求項９に記載の組み合わせ物。
11. ＴＳ阻害作用を有する抗腫瘍剤が、５−ＦＵ系抗腫瘍剤またはペメトレキセドナトリウム水和物である、請求項１０に記載の抗腫瘍剤または組み合わせ物。
12. ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、請求項１１に記載の抗腫瘍剤または組み合わせ物。

Images