JP6033301B2 - 組織切片の画像を提供するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫組織化学の分野、および、コンピュータベースの画像分析に関する。より具体的には、本願は、一連の画像内で領域を区別する方法を提供する。

組織学的組織試料の分析は、診断目的で、たとえば、乳がんを診断するための乳房組織試料の分析、または、研究目的で、たとえば、ぜん息、アテローム性動脈硬化、または炎症性腸疾患のような炎症状態にある炎症性細胞型を研究するために一般的に使用されている。

高原特異抗体によってマーカ（すなわち、抗原）が検出される免疫組織化学（ＩＨＣ）は、組織切片内で細胞を識別するのに一般的に使用されている。理想的には、細胞型の識別は、１つの細胞特異的な細胞抗原を検出することによって得ることができる。しかしながら、いくつかの細胞型について、適切な識別のためにいくつかの抗原の組合せが分析されなければならない。

任意の病変組織は一般的に、変化した細胞組成と関連付けられる。たとえば、ぜん息において炎症を起こした気道内には、上皮細胞、腺細胞、血管細胞、神経などのような、気道を構成する、変化した組成の構造細胞がある。加えて、いくつかの型の免疫細胞（すなわち、白血球）は炎症を起こした気道に浸潤する。

多くの疾患において、組織内の病変（すなわち、有害な変化）は１つの細胞型によって引き起こされるものではなく、いくつかの細胞型の間の複雑な相互作用によって引き起こされる。したがって、病変組織試料を調査するとき、いくつかの細胞集団および組織構造を研究することが望ましいことが多い。細胞内容物に関する情報は、１つの細胞型を、連続して切断した切片においてその時点で染色することによって得ることができる。この手法は組織試料内のいくつかの細胞型の内容物の良好な推定をもたらすが、分析された細胞型の間の空間的関係（すなわち、位置関係）については詳細な情報を提供しない。

細胞の組成が特定の疾病状態をどのように定義し得るかをより良好に調査するために、または細胞がどのように相互作用し互いに関連しあうかを研究するために、同じ３次元空間内、たとえば、単一の組織切片内の複数の細胞型を視覚化する手段を開発することが望ましい。

現在利用可能なＩＨＣ技法では、複数の色原体または複数の免疫蛍光検査法を使用して１つの切片内で最大４つの細胞型を染色することが可能である。しかしながら、一般的な方法では、一次検出抗体の適切な組合せがないことに起因して、２つの細胞型しか同時に検出することができないことが多い。

１つの組織切片におけるマーカの数を増大させるために、国際公開第２０１０／１１５０８９号パンフレットに開示されているＳＩＭＰＬＥ技法およびＭＥＬＣ技法（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．２４，ｐｐ．１２７０−１２７８）のような、新規の方法論的手法が開発されている。強力であるが、これらの新規のタイプの技法は、主に共局在化研究のために開発されており、組織破壊性の手順、検出基の破壊を伴う手順、または分子標識一次抗体の検出の依存、染色することができる細胞マーカの数を制限する特徴のいずれかを伴う。

上述の技法は主に共局在化研究のために開発されているため、それらは、多くの識別マーカが時として意図しない細胞型にも存在する場合があることには対処していない。

そのため、多数の細胞型が同時に、１つの組織切片のような、同じ物理的空間内で適切に識別されることができる新規の技術的手法が必要とされている。理想的には、任意のそのような技法は、試料の大きな切片全体を分析し、すべてのマーキングされた個々の細胞に関する、それらの組織内の空間座標、それらのサイズおよび形状パラメータなどのような詳細な情報を提供することが可能であるべきである。

国際公開第２０１０／１１５０８９号パンフレット

Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．２４，ｐｐ．１２７０−１２７８

第１の態様において、本発明は、一連のＮ個の一次デジタル画像内で領域を区別する方法であって、Ｎは２以上の整数であり、当該方法によって、新規画像が生成され、当該方法は、
（ａ）未確定マーカ領域を備える一連のＮ個の一次デジタル画像を提供するステップであって、画像Ｉ_ｎ＋１は少なくとも、一次デジタル画像Ｉ_ｎ（２≦ｎ≦Ｎ）と同じ量の未確定マーカ領域を備え、ｎは整数である、提供するステップと、
（ｂ）所定の選択基準にしたがってすべての一次デジタル画像Ｉ_ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）を評価し、画像マーカ領域を、所定の選択基準を満たす未確定マーカ領域として画定し、任意のそのような画像マーカ領域に関する情報を、結果生じる対応する二次デジタル画像内に、またはそれに関係／関連付けて記憶し、それによって、一連のＮ個の二次デジタル画像を得るステップと、
（ｃ）新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）において得られた前記一連の二次デジタル画像のうちのｎ（２≦ｎ≦Ｎ）個すべてについて、新規画像Ｉ_ｎｅｗ内に新規画像マーカ領域を挿入するステップであって、当該新規画像マーカ領域は、画像Ｉ_ｎ内には存在するが画像Ｉ_ｎ−１内には存在しない画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有し、当該新規画像マーカ領域は、固有の特徴によってＩ_ｎｅｗ内で識別可能である、挿入するステップと、
（ｅ）新規画像Ｉ_ｎｅｗ内に新規画像マーカ領域を挿入するステップであって、当該新規画像マーカ領域は、画像Ｉ_１内に存在する画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有し、当該画像マーカ領域は、固有の特徴によってＩ_ｎｅｗ内で識別可能である、挿入するステップ
とを含む。

好ましくは、新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップは、組織試料の画像を提供するステップを含む。

好ましくは、新規画像Ｉ_ｎｅｗは、前記一連の画像内の画像のうちの１つのコピーである。

好ましくは、ステップ（ｄ）および（ｅ）における前記固有の特徴は、各ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）に対する固有値を有する特徴である。

好ましくは、前記固有の特徴は一般色であり、前記固有の特徴の前記固有値は、特定の細胞マーカに関連付けられる特異的な色である。

好ましくは、所定の選択基準は、未確定マーカ領域の視覚的性質に関する閾値を含む。

第２の態様において、本発明は、組織学的組織切片内の細胞集団を視覚化するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）既知の様式で分子染色する準備ができた状態にされている組織切片を提供するステップと、
（ｂ）所定の一連のＫ個の細胞マーカのうちの、ステップ（ａ）の組織切片内に存在し得る成員に特異的に結合し、それを検出するための、一連のＫ個の特定の分子検出手段を提供するステップであって、当該分子検出手段は、始動可能かつ検出可能応答の生成を引き起こすことが可能であり、Ｋは３以上の整数である、提供するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の各特定の分子検出手段ｋ＝１、２、．．．、Ｋについて、以下の手順、すなわち、
（１）ステップ（ａ）の前記組織切片を、前記特定の分子検出手段と接触させる手順であって、その結果、前記所定の一連の細胞マーカのうちの特定の成員に特異的に結合することになる、接触させる手順と、
（２）いかなる細胞マーカにも結合しなかった分子検出手段を除去するために前記組織切片を洗浄する手順と、
（３）組織切片の細胞マーカに結合した可能性がある分子検出手段からの応答を始動する手順であって、それによって、前記分子検出手段の検出が可能になる、始動する手順と、
（４）前記分子検出手段を検出することができると、検出可能ポリマーの生成に関連付けられる１つまたは複数の未確定マーカ領域を含み得る一次デジタル画像Ｉ_ｋを生成するために、組織切片をスキャン／画像化する手順とを実行するステップであって、
それによって、増大する量の未確定マーカ領域を含む一連のＫ個の一次デジタル画像Ｉ_ｋ（ｋ＝１、．．．、Ｋ）が得られる、実行するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた前記一連のＫ個の一次デジタル画像Ｉ_ｋ（ｋ＝１、．．．、Ｋ）に対して第１の態様の方法を実行するステップであって、それによって、前記細胞構造を視覚化する画像Ｉ_ｎｅｗを生成する、実行するステップ
とを含む。

第２の態様の方法の好ましい実施形態において、前記分子検出手段は抗体、好ましくはモノクローナル抗体または抗体フラグメントのセットであり、各抗体は特定の細胞マーカに結合し、酵素が各抗体に接合されており、前記酵素は１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーの生成を引き起こすことが可能であり、
ステップ（ｃ）の項目（１）および（２）は、
（ｉ）ステップ（ａ）の前記組織切片が、前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合している抗体と接触させられ、前記抗体は酵素に接合されており、該酵素は、１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーの生成を引き起こすことが可能であり、
（ｉｉ）上記ステップ（ｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために前記組織切片が洗浄されるように実行され、
ステップ（ｃ）の項目（３）は、
（ｉｉｉ）項目（２）の後に、前記組織切片が前記酵素の１つまたは複数の適切な基質に曝露され、それによって、前記組織切片内に前記所定の一連の細胞マーカのうちの前記特定の成員が存在する場合に検出可能ポリマーが生成されるように実行される。

第２の態様の方法の別の好ましい実施形態において、前記分子検出手段は分子錯体のセットであり、各錯体は、特定の細胞マーカに結合する第１の抗体、好ましくはモノクローナル抗体、第２の抗体または抗体フラグメント、好ましくは前記第１の抗体に特異的に結合されるモノクローナル抗体、および前記第２の抗体に接合される酵素を備え、前記酵素は１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーの生成を引き起こすことが可能であり、
ステップ（ｃ）の項目（１）および（２）は、
（ｉ）ステップ（ａ）の組織切片が、前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合している第１の抗体と接触させられ、
（ｉｉ）上記ステップ（ｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために組織切片が洗浄され、
（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉｉ）の後に、組織切片が、前記第１の抗体に特異的に結合している第２の抗体と接触させられ、前記第２の抗体は酵素に接合されており、当該酵素は、１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーの生成を引き起こすことが可能であり、
（ｉｖ）上記ステップ（ｉｉｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために組織切片が洗浄されるように実行され、
ステップ（ｃ）の項目（３）は、
（ｖ）項目（２）の後に、組織切片が上記酵素の１つまたは複数の適切な基質に曝露され、それによって、前記組織切片内に上記所定の一連の細胞マーカの前記特定の成員が存在する場合に検出可能ポリマーが生成されるように実行される。

好ましくは、前記酵素は、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼから成る群から選択される。

好ましくは、前記基質は、３，３’−ジアミノベンジジン、Ｆｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎ、およびアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）から成る群から選択される。Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎは、特定の条件下で少なくとも部分的に水溶性であるポリマーを生成する基質の一例である。アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、特定の条件下で、エタノールのような低級アルコールに少なくとも部分的に可溶性であるポリマーを生成する基質の一例である。３，３’−ジアミノベンジジン、Ｆｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ、およびＶｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄは、不溶性ポリマーを生成する基質の例である。

本方法の実行中に種々の基質および／または酵素が利用されてもよいことが理解される。たとえば、ジアミノベンジジンが項目（２）を最初に実行するときに基質として利用されてもよく、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄがその後項目（２）を実行するときに基質として利用されてもよい。

第２の態様の方法のまた別の好ましい実施形態において、前記分子検出手段は、検出部に結合されている認識部を備える分子複合体のセットであり、前記認識部は前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合することが可能であり、前記認識部は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそのフラグメントのような抗体、ならびにＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子のような核酸分子から成る群から選択され、前記検出部は蛍光色素であり、当該蛍光色素は、放出される放射とは異なる始動放射に曝露された後、特定の波長の放射を放出することが可能であり、
ステップ（ｃ）の項目（３）は、組織切片、および、それに結合された任意の分子検出手段が、前記所定の一連の細胞マーカの前記特定の成員が前記組織切片内に存在する場合には、始動放射に曝露され、それによって特定の波長の放射が放出されるように実行され、
ステップ（ｃ）の項目（４）は、前記特定の波長の放射が放出されるように実行される。

第２の態様の方法のまた別の好ましい実施形態において、Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎまたはアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）のような、少なくとも部分的に可溶性のポリマーを生成する基質が検出可能ポリマーとして使用される。この実施形態は、
（ｅ）可溶性検出可能ポリマーを除去するために前記組織切片を洗浄するステップと、
（ｆ）新規の一連の分子検出手段を用いてステップｂ〜ｄを反復するステップとをさらに含む。この実施形態は、大量の細胞マーカが評価されるべきであるときに有用である。

第３の態様において、本発明は、組織学的試料における同じ３次元空間内の複数の細胞集団および細胞構造の３次元分布を視覚化するための方法であって、
（ｉ）組織試料を提供し、当該試料を既知の様式で切断して複数の元々は重なり合っていた組織切片にするステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において得られたすべての組織切片に対して第２の態様による方法を実行するステップと、
（ｉｉｉ）既知の原理にしたがってステップ（ｉｉ）において得られた画像を重ね合わせるステップであって、それによって、組織学的試料における同じ３次元空間内の複数の細胞集団および細胞構造の３次元分布の３次元視覚化を得る、重ね合わせるステップと
を含む、方法を提供する。

定義
本発明を説明し特許請求するにあたって、下記に記載する定義にしたがって以下の用語を使用する。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等な任意の方法および材料を本発明を実践するのに使用することができるが、本明細書においては好ましい方法および材料を記載する。本明細書において使用される場合、以下の用語の各々は、この節においてそれに関連付けられる意味を有する。ラジカル、置換基に関して下記にリストする特定のおよび好ましい値、ならびに範囲は例示のみを目的とし、ラジカルおよび置換基の画定されている範囲内の他の規定されている値を除外するものではない。

細胞マーカとは、細胞型に応じて、程度の差はあるが特異的に、多くの場合はその細胞型の細胞の表面上であるが、時として細胞内にも存在し得る特異的構造を意味する。一般的に、細胞マーカは特定の標的分子に特異的に結合することが可能な受容体である。細胞マーカは、タンパク質、糖タンパク質、もしくは炭水化物、核酸、脂質または別のタイプの天然由来の生体分子であってもよい。当業者にはこのような細胞マーカ、およびそれらが存在する細胞型を既知である。１つまたは複数のそのような細胞型が存在することは、その細胞が特定の分類または型の細胞に属することを示し得る。

分子検出手段とは、特定の細胞マーカに特異的に結合することが可能な第１の部分と検出可能応答を引き起こすことが可能な第２の部分とを備える、二元機能凝集体または複合体を意味する。多くの異なるタイプの分子検出手段が本発明に使用され得る。

一般的に、特定の細胞マーカに特異的に結合することが可能な前記第１の部分は、抗体もしくはＦａｂフラグメントのようなそのフラグメント、またはナノボディ、またはＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子のような核酸分子、またはＰＮＡのような核酸誘導体であり得る。一般的に、検出可能応答を引き起こすことが可能な前記第２の部分は、酵素、または、蛍光色素のような、特定の作用によって誘起されると何らかの種類の検出可能信号を生成することが可能な化合物であり得る。

分子検出手段は、その最も単純な実施形態では、酵素または蛍光色素のような第２の部分が結合されている、抗体または核酸分子のような第１の部分から成り得る。代替的に、適切な分子検出手段は、第１のエンティティ、一般的には、特定の細胞マーカに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、第１の抗体に特異的に結合している第２のエンティティ、一般的にはモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、第２の抗体に結合されている第３のエンティティとを備える錯体であり得、前記第３のエンティティは酵素、または、蛍光色素のような、特定の作用によって誘起されると何らかの種類の検出可能信号を生成することが可能な化合物であり得る。

検出可能応答とは、スキャン／画像化ステップにおいて、当該応答が前記スキャン／画像化ステップによって生成される画像内に位置し得るように検出され得る応答を意味する。

一実施形態において、検出可能応答は、不透明かつ／または着色ポリマーの生成である。そのようなポリマーは、適切な条件下で、分子検出手段の一部分である特定の酵素を特定の基質と接触させることによって生成され得る。適切な酵素の例は、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼである。そのような酵素に対する適切な基質の例は、３，３’−ジアミノベンジジン、Ｆｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、およびＶｉｎａ ｇｒｅｅｎである。

別の実施形態において、検出可能応答は、励起後に蛍光色素分子によって放出される放射のような、特定の波長を有する放射の放出である。

別の実施形態において、異なる複数の形態の検出可能応答が、本方法の一回の実行の中で利用される。

一次デジタル画像とは、組織切片の直接デジタル化（たとえば、スライドスキャンまたは顕微鏡写真）によって得られたデジタル画像を意味する。画像をさらに適合、編集または評価することは行われていない。そのような画像は未加工のソースデータとみなすべきである。

二次デジタル画像とは、一次デジタル画像の何らかの種類のデジタル編集または評価によって得られた画像を意味する。二次デジタル画像は、たとえば、一次デジタル画像を編集および／または評価することによって得ることができる。一次デジタル画像はそれによって二次デジタル画像として再画定される。

未確定マーカ領域とは、組織切片の一次デジタル画像内の検出可能要素または構造を意味する。未確定マーカ領域は、組織切片内の、血管および細胞小器官のような天然由来の不透明構造および要素、または組織要素内の内在性色素が存在することを示すことができる。これは、検出可能ポリマーまたは蛍光色素のような検出可能マーカ手段が存在することも示すことができ、当該検出可能マーカ手段は、そのようなポリマーの生成または励起後の検出可能放射の放出を引き起こす分子検出手段によって検出された細胞マーカの存在を示す。

画像マーカ領域とは、組織切片の二次ジタル画像内の領域を意味する。画像マーカ領域は、一次デジタル画像内の未確定マーカ領域の全体または一部分に対応する。画像マーカ領域は、一次デジタル画像、特に一次デジタル画像の未確定マーカ領域を評価し、指定の選択基準にしたがって画像マーカ領域を画定することによって得られる。画像マーカ領域を含む二次デジタル画像はまた、各画像マーカ領域に関する情報も含むか、またはそれに関係／関連付けられている。

マーカ領域の形状とは、当該領域の周囲の形状を意味する。国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって提供されているＩｍａｇｅＪおよびＡｄｏｂｅ（登録商標）によって提供されているＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）のようなソフトウェアに含まれる、デジタル画像内の領域の形状を画定するためのいくつかの既知の方法がある。

画像内の領域のロケーションは、当該画像内で当該領域がいずれの位置を有するかを意味する。異なる複数の画像内である領域のロケーションが同じであるということは、
−その同じ位置がそれらの画像に対して等しく構築されている座標系に関連するか、または、
−２つの画像が同じ対象を描いている場合には、描かれている対象に関して位置が対応していることを意味する。

選択基準とは、画像マーカ領域を画定するために一次デジタル画像を評価するために使用され得る選択基準を意味する。この基準は、たとえば、色および／または画像内の１つのピクセルもしくは隣接するピクセルから成る群の強度に関する閾値を含む。選択基準は、形状基準、色基準、サイズ基準、または、詳細な説明において説明する、および、当業者にとって明らかである他のタイプの基準を含み得る。さらに、特定の状況に対してパラメータおよび選択基準を当業者が最適化することは当然のことである。

固有の特徴とは、他の画像マーカ領域から区別される特定の型として識別される１つまたは複数の画像マーカの特性を意味する。固有の特徴は、色、記号、形状、標識のような視覚的特徴を含んでもよく、または、画像マーカ領域とそれらの特定の型（たとえば、初代細胞型）との間のデジタルな関連付けであってもよい。この関連付けは、たとえば、データベース内に記憶される。固有の特徴は、デジタル画像内の特定の型のマーカ領域を他の型のマーカ領域から区別するための任意の他の適切な特徴であってもよい。

そのような特徴はまた、固有値にさらに細分化されてもよい。たとえば、類似しているが異なる細胞マーカを検出するための分子検出手段が、固有の特徴（色など）によって識別可能であり得、各個々の細胞マーカは固有値（前記色のニュアンスなど）によって識別され得る。

ここで、本発明を、添付の図面を参照して説明する。

本発明による方法を実行する装置を示す図である。 本発明による、一連の画像内でマーカ領域を区別するための方法を示す。 本発明による、一連の画像内でマーカ領域を区別するための方法を示す。 一次デジタル画像の評価を示す図である。 組織切片の一連の画像を示す図である。 本発明による方法によって作成された画像を示す図である。 本発明による方法によって作成された画像を示す図である。 本発明による方法によって作製された画像中の画像マーカ領域の視覚的な特有の特徴を示す図である。 本発明による方法によって作製された画像中の画像マーカ領域の視覚的な特有の特徴を示す図である。 本発明による方法によって作製された画像中の画像マーカ領域の視覚的な特有の特徴を示す図である。 本発明の一実施形態によるグラフィカルインターフェースを示す図である。 本発明による検出過程を示す図である。

本発明は、除外および減算ベース多色染色法、略称（ＥＳＭＳ）と称される技法に関する。この技法は、組織学的組織切片の高分解能画像を提供することを可能にし、複数の細胞型および組織構造が識別され得る。組織切片に関する、既知の方法では提供することができない有用な空間情報を提供するために、複数の細胞および細胞型に関する空間分析方法を適用することができる。本発明は、そのような情報は、組織切片を分析するときには大きい値に成り得るという認識に基づく。本発明の発明者は、単純かつ効率的な様式で空間情報を含む組織切片の画像を提供するための技術を見つけ出した。この技術は、組織試料内の同じ３次元空間内での細胞および組織構造の複雑な相互作用の研究を容易にする、３次元における高分解能画像を提供することも可能にする。

本方法は、同じ切片内の複数のマーカ分布を視覚化することとは別に、組織切片内の構造および要素の分布パターンの高度な数学的分析に使用することができる情報の基礎を提供する組織切片の合成画像を提供する。そのような情報の例は、細胞のような要素間の関係、または、組織の損傷、発育不全、組織改造などの組織学的構造または焦点領域のような、従来の青色背景染色によって明らかになる切片内の構造に関する情報である。

本発明は、組織学的研究において分子または構造を検出するのに使用され得る任意の組織試料から開始することによって実行され得る。本出願における分子検出の例は、免疫組織学的方法に関するが、分子を染色する他の手段、たとえば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法、非抗体依存リガンド結合技法、または酵素組織化学も使用され得る。一般的に、分子検出の前に、組織試料は固定剤（たとえば、４％緩衝ホルムアルデヒド、ｐＨ７．６）に一晩浸した後、アルコール（ＥｔＯＨ）の濃度が増大していく一連の溶液において脱水し、最後にキシレンに浸される。脱水工程の後、脱水された標本はパラフィン内に包埋され、パラフィン切片が所定のパラフィン切断ミクロトームによって生成される。パラフィン切片は標準的な顕微鏡スライドガラス上に載置され、使用されるまで４℃で保存される。当業者は異なる種類の組織切片のための異なる適切な固定剤および固定化過程を周知しており、それゆえ、冷凍切片化技法を含む、上述の方法とは別のそのような方法を使用してもよい。

実際の免疫組織染色（略称ＩＨＣ）の前に、パラフィン切片は脱パラフィンされ、一般的に、熱誘導または酵素的抗原回復を受ける。そのような過程も当業者には周知である。

脱パラフィンおよび熱誘導抗体除去の後に得られる組織切片はその後、さらなる特異的検出を受ける。そのような組織切片内に含まれる細胞型および組織型を判定することが可能であることは必須である。そうすることを可能にするために、組織切片における何らかの特異的な細胞マーカの発生が検査される。

下記の表１は、本発明において使用するのに適した免疫細胞マーカ、およびそれらを発現する細胞のいくつかの例を列挙したものである。

本発明にしたがって組織切片内の細胞マーカの存在を判定するとき、組織切片は前記細胞マーカに特異的に結合する分子検出手段に曝露される。

分子検出手段の第１の部分は、それが特異的に結合する細胞マーカに関連付けられる天然リガンドであり得る。代替的に、かつ好ましくは、第１の部分は抗体であり、多くの場合、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。

分子検出手段の第２の部分は一般的に、適切な基質の存在下で検出可能ポリマーを生成することが可能な酵素を含む。そのような酵素の非限定的な例は、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼである。たとえば、ペルオキシダーゼは、３，３’−ジアミノベンジジン（略称ＤＡＢ）の存在下で検出可能な褐色ポリマーを生成し、アルカリホスファターゼは、Ｆｅｒａｎｇｉ ＢｌｕｅおよびＶｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄの存在下で検出可能ポリマーを生成する。少なくとも部分的に可溶性のポリマーを生成する基質の別の非限定的な例は、Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎである。Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎから生じるポリマーは、一定の条件下で水溶性である。少なくとも部分的に可溶性のポリマーを生成する基質の別の非限定的な例は、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）である。アミノエチルカルバゾールから生じるポリマーは、一定の条件下で、エタノールのような低級アルコールに可溶性である。他の基質が、他の液体に可溶性であるポリマーを生成してもよい。

当業者は、他の適切なそのような酵素および基質を発見することが可能であり、または、酵素の代わりに、免疫蛍光顕微鏡検査法によってマーカ分子を視覚化するために蛍光色素を使用することができることも知るであろう。

分子検出手段は、一般的には、細胞マーカに結合する抗体、および、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素を含む単一の複合体として提供され得、抗体および酵素は化学連結基によって接合されている。代替的に、かつより好ましくは、分子検出手段は、第１のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメント、および、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素に化学的に連結されている第２の抗体またはそのフラグメントを含む分子凝集体として提供される。第２の分子抗体またはそのフラグメントは、第１の分子抗体またはそのフラグメントに特異的に結合し、それによって、分子凝集体を形成する。

本発明の方法は、組織切片内の要素および構造を区別するやり方を提供し、したがって一連のそのような分子検出手段が使用される。組織切片が取り出された器官または組織の型、および、種々の細胞型および組織からの細胞マーカの基礎知識に応じて、当業者は、組織切片内の細胞および組織の型を区別するのに使用されることになる適切な一連の分子検出手段を設計することが可能である。

本発明の方法の一回の実行の中で種々の型の分子検出手段を組み合わせてもよいことが理解される。これは、一次デジタル画像の画像分析中に要素および構造が互いから、およびその周囲状況からより容易に区別されることができるため、有利であり得る。

本発明によれば、一度に前記の一連の分子検出手段のうちの１つの分子検出手段を用いて組織切片に対する以下の検出過程が実行される。
（１）ステップ（ａ）の前記組織切片を、前記特定の分子検出手段と接触させ、その結果、前記所定の一連の細胞マーカのうちの特定の成員に特異的に結合することになり、
（２）いかなる細胞マーカにも結合されなかった分子検出手段を除去するために前記組織切片を洗浄し、
（３）結果として検出可能ポリマーを生成することになる適切な基質を添加し、
（４）残りの基質を除去するために組織切片を洗浄し、
（５）検出可能ポリマーの生成に関連付けられる１つまたは複数の未確定画像マーカ領域を含み得る一次デジタル画像を生成するために、組織切片をスキャン／画像化する。

検出過程は図８に方法として示されており、当該方法は、
−組織切片を提供するステップ（８１１）と、
−分子検出手段を提供するステップ（８１２）と、
−上記ステップ（１）において開示したように、組織切片を分子検出手段と接触させるステップ（８１３）と、
−上記ステップ（２）において開示したように、組織切片を洗浄するステップ（８１４）と、
−上記ステップ（３）において開示したように、適切な基質を添加するステップ（８１５）と、
−上記ステップ（４）において開示したように、組織切片を洗浄するステップ（８１６）と、
−上記ステップ（５）において開示したように、組織切片を画像化するステップ（８１７）と
を含む。

８２１によって示すように、異なる初代細胞型に適した異なる分子検出手段および基質についてステップ８１２〜８１７を繰り返すことによって、ステップ８１７において生成された画像を含む一連の画像が提供される。そのような一連の画像の一例が、より詳細に後述する図４に示されている。

検出過程のステップ５に含まれるスキャン／視覚化ステップは、任意の市販のスライドスキャン機器、デジタルカメラを備えた顕微鏡または全面スキャナロボットを用いて実行され得る。

繰り返されるステップ８１２〜８１７は、自動的に実行されてもよい。非限定的な例として、いわゆるスライドチャンバ技法が繰り返されるステップに利用されてもよい。スライドチャンバ技法において、組織切片は、分子検出手段、洗浄液などが通過し得るマイクロコンパートメント内に配置される。そのため、組織試料を画像化手段へ、および画像化手段から移動させる必要なしに、種々のステップ８１２〜８１７を実行することができる。そのため、組織試料の正確に同じ部分を開示し、同じ焦点深度を有するような、同じ画像特性を有する一次画像を提供することができる。また、方法は、より時間効率的に、かつ手動で操作またはやり取りする必要なしに実行することができる。当業者であれば、本方法は他の自動化技法によっても実行されてもよいことを認識するものである。

検出過程が一連の分子検出手段のすべてについて実行されると、有色点の量が増大した一連の画像が得られる。少量の分子検出手段による処置に対応する第１の画像は、わずかな点しか含まない場合がある。他方、最後の画像は複数の点を含むはずであり、いくつかの点は融合および拡大して大きい有色領域になる可能性もある。

一実施形態において、一連の画像は、以下の検出過程にしたがって組織切片を画像化することによって提供されてもよい。
（１）組織切片を、結果として前記所定の一連の細胞マーカに特異的に結合する特定の分子検出手段と接触させ、
（２）いかなる細胞表面マーカにも結合されなかった分子検出手段を除去するために組織切片を洗浄し、
（３）一次検出抗体を認識する二次抗体のよな適切な検出試薬を添加する。一般的に、二次抗体は酵素、たとえば、ペルオキシダーゼを用いて標識され、
（４）いかなる細胞マーカにも結合されなかった分子検出手段を除去するために組織切片を洗浄し、
（５）結果として検出可能ポリマーを生成することになる酵素基質を添加し、
（６）残りの基質を除去するために組織切片を洗浄し、
（７）検出可能ポリマーの生成に関連付けられる１つまたは複数の未確定マーカ領域を含み得る一次デジタル画像を生成するために、組織切片をスキャン／画像化する。

上記表１に示すように、いくつかの細胞表面マーカは限られた範囲の細胞と関連付けられ、他のマーカはより広い範囲に現れる。表１において、たとえば、ＣＤ２０が主にＢリンパ球と関連付けられることが留意され得る。対照的に、ＣＤ１２３は大幅により大きい範囲の細胞型と関連付けられる。前記一連の分子検出手段を設定するとき、一連の分子検出手段の始まりにある少量の細胞型、好ましくはただ１つの細胞型のみに対して特異的な分子検出手段を含むことが有利である。その結果、後でより一般的な分子検出手段を使用して細胞型および構造を判定するときに、第１の分子検出手段と関連付けられ、それによって検出される、混同される細胞型および構造を除外することができ、細胞識別の精度が増大する。この情報に基づいて、当業者には適切な一連の分子検出マーカを着想することが容易になる。

細胞表面マーカに結合する一連の分子検出手段の以下の例が良好な結果をもたらすことが分かった。

本発明の核心部分は、得られた一連の画像がどのように分析され、新規に編集された画像、ならびに、複数の細胞集団および組織構造と同じ２次元または３次元空間内のそれらの空間的関係を視覚化するための追加の情報を含む３次元描画に変換されるかに関する。

これより、本発明の画像分析部分を、以下、本発明の特定の実施形態が図示されている添付の図面を参照しながらより十分に説明する。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態において具現化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全になり、当業者に本発明の範囲を完全に伝達するように例として提供されている。全体を通じて同様の参照符号は同様の要素を指す。

図１は、全体的に符号１を与えられている、本発明による一連の画像内の領域を区別するためのデバイスを示すブロック図である。デバイスは、プロセッサ１１とメモリ１２とを備える装置１０を備える。装置１０はコンピュータの一部であり得る。プロセッサ１１は、画像内の領域の形状およびロケーションを記録するように構成することができる。形状およびロケーションは、たとえば、メモリ１２内のデータベース内の画像に関連付けてまたは関係付けて記憶され得る。プロセッサ１１は、所定の選択基準にしたがって画像マーカ領域を識別するために画像を評価するようにさらに構成することができる。プロセッサ１１は、２つの画像を比較して、それらの画像の一方には存在するが他方には存在しない画像マーカ領域を識別するようにさらに構成することができる。プロセッサ１１はまた、別の画像内の識別された画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域を挿入するように構成することもでき、挿入されたマーカは固有の特徴によって他の画像内で識別可能である。

一実施形態において、画像化ユニット１３が装置１０に接続される。画像化ユニット１３は、たとえば、デジタルＣＣＤカメラ、または、スライドスキャナのようなデジタルスキャナである。代替的に、画像化ユニット１３を装置１０に接続する代わりに、画像を含む、ＵＳＢのような記憶媒体を接続することによって、装置１０に画像を提供することができる。提供された画像はメモリ１２内に記憶することができる。

装置１０からの出力をユーザに提供するために、出力ユニット１４を装置１０に接続することができる。出力ユニット１４は、たとえば、コンピュータ画面または携帯電話ディスプレイのようなディスプレイである。出力は好ましくは、ソフトウェアインターフェース、すなわち、画像を表示するためのグラフィカルユーザインターフェースの形態である。装置１０は好ましくは、ユーザ入力を受信するための入力ユニット１５をさらに備える。入力ユニット１５の一般的な例は、キーパッドまたはデータ接続手段である。

図２ａは概して、装置１０において実行されてもよい一連の画像内でマーカ領域を区別するための本発明による方法を示す。方法は、以下の、
−所定の選択基準にしたがって画像マーカ領域を画定するために一連の一次デジタル画像を評価する第１のステップ２１１と、
−先行するステップ２１１において画定された画像マーカ領域に対応する新規マーカを、マーカが識別可能であるように挿入することによって、一連の画像に基づいて新規画像を作成する第２のステップ２１２と
を含む。

ここで、図２ｂおよび図１を参照して方法を詳細に説明する。

ステップ２２１は、一連のＮ個の一次デジタル画像Ｉ_１、Ｉ_２、．．．、Ｉ_Ｎを提供することを含み、Ｎは２以上の整数である。画像は、装置１０に接続されている画像化ユニット１３によって、または記憶装置（図示せず）によって提供される。

一連のＮ個の一次デジタル画像は、以下の検出過程（上記でも開示されており、図８によって示されてもいる）にしたがって組織切片を画像化することによって提供される。
（１）組織切片を、結果として前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合する特定の分子検出手段と接触させ、
（２）いかなる細胞マーカにも結合しなかった分子検出手段を除去するために組織切片を洗浄し、
（３）結果として検出可能ポリマーを生成することになる適切な基質を添加し、
（４）残りの基質を除去するために組織切片を洗浄し、
（５）検出可能ポリマーの生成に関連付けられる１つまたは複数の未確定マーカ領域を含み得る一次デジタル画像を生成するために、組織切片をスキャン／画像化する。

検出過程は所望の回数繰り返される。ステップ５（図８におけるステップ８１７に対応する）は過程サイクルごとに一次デジタル画像を生成する。したがって、Ｎ回のサイクルによって一連のＮ個の画像が生成される。

この過程は画像を生成し、画像Ｉ_ｎ＋１が少なくとも、画像Ｉ_ｎ（２≦ｎ≦Ｎ）と同じ量の未確定画像マーカ領域を備え、ｎは整数である。それによって、一連の画像は、増大していく量の未確定マーカ領域を備え、画像Ｉ_Ｎが最大量の未確定マーカ領域を備え、Ｉ_１が最小量の未確定マーカ領域を備える。

次に、ステップ２２２は、所定の選択基準にしたがってすべての画像Ｉ_ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）を評価し、画像マーカ領域を画定することを含む。特に、未確定マーカ領域が評価される。画像内の所定の選択基準を満たす領域が画像マーカ領域として画定される。上記の定義節においてすでに述べたように、一般的にサイズ基準、形状基準および色基準があり得る。選択基準は評価過程の結果に大きく影響する。たとえば、サイズに関する比較できるほどに高い閾値レベルによって、評価するのが容易であるより明瞭な画像がもたらされ得るが、サイズがより小さい関連構造が検出されなく成るという危険性が常にある。それゆえ、選択基準を決定するとき、研究しようとしている組織型の切片内に通常存在する細胞および細胞構造に関するデータを考慮することが好ましい。当業者はこの知識を有する。

領域は、１つまたは複数のピクセルを含む。領域はさらに、画像内の複数の隣接するピクセルとして画定され得る。どのように領域が画定されるかは所定の選択基準の一部であり得る。基準は、たとえば、２１ピクセル以上から成る領域のみが画像マーカ領域として画定されるべきであるという基準を含み得る。別の基準は、領域を形成するピクセルは特定の形状に類似すべきであるというものであり得る。ステップ２２２は図２ａ内のステップ２１１に対応する。

ステップ２２３は、新規の二次デジタル画像Ｉ_ｎｅｗを提供することを含む。新規画像は、一連の画像と同じ対象を表し得る。特に、新規画像は、一連の画像内の一次デジタル画像のうちの１つのコピーであってもよい。そのような実施形態では、Ｉ_ｎｅｗは、一連の画像内の画像のうちの１つをコピーすることによって作成されてもよい。

有利には、新規画像は、可能な限り元の組織試料に近い、すなわち、任意の検出過程サイクルの前の組織試料を表す。これは、第１の検出過程サイクルが実行される前に組織切片を画像化し、したがって画像Ｉ_０を作成することによって達成され得る。そのような実施形態では、画像１０は一連の画像を提供するステップ２２１の前のステップにおいて提供され得る。

代替的に、新規画像は空白画像であってもよく、すなわち、内容物が一切なくてもよい。空白画像はプロセッサ１１によって作成することができる。空白画像とは、たとえば、すべてのピクセル値、たとえば、ＲＧＢ値がゼロにセットされている画像を意味する。

別の代替的な実施形態において、新規画像は、ヘマトキシリンのような標準的な対比染色剤、または、組織背景に関する有益な情報を提供し後続の免疫組織染色および検出工程を妨げない任意の他の染色剤を用いて組織試料を最初に染色した後の画像をキャプチャすることによって提供される。

新規画像は、たとえば、画像化ユニットから、またはメモリユニットから提供され得ること、および、方法はこれらの代替形態のいずれにも限定されないことが留意されるべきである。

新規画像マーカ領域は任意の順序でＩ_ｎｅｗ内に挿入されてもよい。

新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップ２２３は、すべての画像を評価するステップ２２２の前に、または、一連の画像を提供するステップ２２１の前に実行されてもよく、すなわち、新規画像を提供するステップはそれに先行するステップに依存しないことが留意されるべきである。

ステップ２２４は新規画像Ｉ_ｎｅｗ内に新規画像マーカ領域を挿入することを含む。すべての画像Ｉ_ｎ（２≦ｎ≦Ｎ）について、画像Ｉ_ｎ内には存在するが画像Ｉ_ｎ−１内には存在しない画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域がＩ_ｎｅｗ内に挿入される。これは、各画像をその後続の画像Ｉ_ｎ−１と比較し、Ｉ_ｎには存在するがＩ_ｎ−１には存在しない画像マーカ領域を識別することによって達成される。ｎについての評価は一定の順序で実行する必要はなく、事実、適切であると分かったいずれの順序でも実行することができる。しかしながら、一連の画像内の画像の順序は保持されること、および、画像Ｉ_ｎ内には存在するが画像Ｉ_ｎ−１内には存在しない画像マーカ領域のみが識別されることが重要である。

新規画像と同じ形状およびロケーションを有する画像マーカ領域を比較および挿入する方法は、当業者にすべて既知である多くの様式で実行されてもよい。例としては、データベース内に形状および／またはロケーションを記憶し、画像編集ソフトウェアのコピー−ペースト機能を使用することである。ステップ２２４を、図４〜図５に関連してさらに説明する。

Ｉ_ｎｅｗ内に挿入される画像マーカ領域はさらに、固有の特徴、特に固有の特徴の固有値によってＩ_ｎｅｗ内で識別可能にされる。識別可能な特徴は、Ｉ_ｎｅｗ内には元々存在しない特徴であり、たとえば、色であり得る。この場合、色の固有値は特定の、かつ固有のニュアンスであり得る。この値は、画像Ｉ_ｎを生成する検出過程サイクルに使用される特定の分子検出手段に対して固有であり、それゆえ、対応する要素または構造に対して固有であることが重要である。固有の特徴／値の目的は、それらが、検出過程の異なるサイクルに由来する異なる画像マーカ、および、したがって組織切片の異なる要素／初代細胞および構造に対する異なる分子検出手段を区別することである。一実施形態において、固有の特徴は新規画像内の視覚的マーカである。一実施形態において、固有の特徴は一般色であり、固有の特徴の固有値は、特定の細胞マーカに関連付けられる特異的な色である。

別の実施形態において、Ｉ_ｎに由来する画像マーカ領域の固有の特徴は、画像マーカ領域と、検出過程のサイクルｎにおいてマーキング対象とされる、対応する要素および／または構造との間のデジタルな関連付け／関係である。関連付け／関係は、メモリ１２内の関連データベース内などに、画像Ｉ_ｎに関連／関係付けて記憶される。

これより、所定の選択基準にしたがって画像マーカ領域を画定するために一連の画像を評価するステップ２１１を図３を参照して説明する。

図３は、組織切片を表す一次デジタル画像を示す。画像は、上記で開示した、図８に示すような検出過程のあるサイクルに由来する。Ｉ_１ａは、組織切片の要素および構造に対応する種々の要素および構造を含む。教授する上での理由から、組織試料の要素および構造は図３において単純化された幾何形状として表されている。現実には、画像は一般的に数千の要素および構造を含む。

この例において、検出過程は、検出可能ポリマーの生成が、ポリマーが生成される領域内に色の遷移をもたらすように選択されている。色の遷移は、領域がより暗くなるようなものである。検出過程（図８のステップ８１５）の影響を受けるとき、検出可能ポリマーの生成が引き起こされた領域は未確定マーカ領域と称される。図３において、未確定マーカ領域は３１ａ、３２ａ、３３ａおよび３４ａによって示されている。

これらの領域は検出可能ポリマーによって生成されるため、それらはポリマーを検出することによって識別することができる。

本実施例では、領域内で検出可能ポリマーがより多く生成されると、領域はより暗くなる。理想的な検出過程では、検出可能ポリマーの生成は、特定の分子検出手段を選択するときに対象とされている要素に関連してのみ存在する。しかしながら、検出可能ポリマーは、検出抗体（または分子検出に使用される構成要素）の交差反応および非特異的結合にも起因して他の領域においても生成されることが多い。画像は、検出過程によって影響を受けていないさらなる未確定マーカ領域を含み得る。「真の」要素および構造、すなわち、特定の検出過程サイクルにおいてマーキングされるように意図されている要素および構造に由来する可能性が最も高い領域を選別することが所望される。それゆえ、一連の画像内の各画像は、所定の選択基準にしたがって、図３のステップ３１０に示すように評価される。選択基準は、特定の検出過程に適するように選択される。

選択基準は、以下のような複数の副基準を含んでもよい。
−色閾値
−色間隔
−幾何学的特性（形状およびサイズのパラメータ）
−マーキング領域内の染色パターンの性質（たとえば、粒度、粗大化、滑らかで均一な染色、点状染色などのテクスチャパラメータ）。
−ロケーション（たとえば、例として非染色切片においてすでに識別されている可能性があるか、または背景組織染色の後の組織構造に関連する）。

これらのまたは類似の基準を使用して画像を評価することは当業者には既知であり、米国の国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって提供されるＩｍａｇｅＪ、米国のＭｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃａ ＩｎｃによるＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、デンマークのｉｓｉｏｐｈａｒｍ Ａ／ＳによるＶｉｓｉｏｍｏｒｐｈ、ドイツのＤｅｆｉｎｉｅｎｓ ＡＧによるＤｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｕｄｉｏ、米国のＡｐｅｒｉｏ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＧｅｎｉｅ、米国のＭａｔｈｗｏｒｋｓ ＩｎｃによるＭＡＴＬＡＢ、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐなどのようなソフトウェアを使用して為され得る。

色閾値とは、ＨＬＳ（色相、彩度、飽和）カラースケールのようなカラースケールにおける閾値を意味し、特定のカラースケールの閾値を上回るまたは下回る色値を有するピクセルが選択副基準を満たす。

色間隔とは、２００〜２３０のような、特定の間隔内にあるＲＧＢカラースケール画像のＲ値のような、カラースケール内の間隔を意味する。ピクセルがその間隔内のピクセル値を有する領域が選択副基準を満たす。

色閾値および色間隔基準は、ＨＳＢカラースケールまたはＨＩＳカラースケールのような他のカラースケールでも同様に適用可能である。当業者に既知であるような多くの他のカラースケールも存在する。

幾何学的特性とは、領域の形状および／またはサイズに関連付けられるパラメータを意味する。例としては、丸み、真円度、長さ、不規則性パラメータなどである。真の要素／構造を、それらの形状によって真でない要素／構造から画定するために形状値基準を使用することができる。たとえば、神経は細長い形状を有し、それによって、細長い形状以外の形状を有する、神経に対する検出過程から生じる未確定マーカ領域は、特定の画像の画像マーカ領域として画定されるものから除外することができる。

当業者には理解されるように、他の適切な型の選択基準も本発明において使用されてもよい。適切であるとは、選択基準が、特定の対応する検出過程サイクルにおいて対象とされている要素および構造に由来する可能性が最も高い未確定マーカ領域を選別するように適合されていることを意味する。

一実施形態において、選択基準は、色、テクスチャ、サイズ、または丸みのような、視覚的特性に対する閾値を含む。視覚的特性とは、マーカ領域の何らかの種類の外観的特性を意味する。特性は、視覚的特性であるためにたとえば、出力ユニット上で視覚化される必要はないことに留意されたい。

選択基準は、上述の基準型のうちの１つまたは複数を含んでもよい。色閾値基準と形状値基準との組合せのような異なる型の基準の組合せも含まれてもよく、画像マーカ領域として画定されるためには両方の基準が未確定マーカ領域によって満たされなければならない。

この例において、選択基準は視覚的特性、より詳細には色閾値を含む。十分に暗い色を有する領域のみが画像マーカ領域として画定され、したがって「真の」要素および構造と相関すると考えられる。この例はグレースケール色のみを含むため、色閾値はグレースケール上の一定の値よりも高い強度を有するすべてのピクセルにセットされ得る。０が黒に対応し１が白に対応する０〜１のグレースケールにおいて、０．７５の閾値がセットされてもよい。別のカラースケール、たとえば、ＲＧＢカラースケールの画像を含む他の実施形態において、閾値は当業者に理解されるような対応する方法でセットされてもよい。

異なる選択基準によって異なる評価結果、および、したがって異なる二次画像がもたらされる。図３の本実施例において、選択基準は未確定マーカ領域のピクセルがグレースケール色閾値を上回らなければならないということを含む。評価によって、画像マーカ領域３１ｂを有する二次デジタル画像ｂが得られる。画像マーカ領域３１ｂは、選択基準を満たす未確定マーカ領域３１ａを評価することによって画定される。他の未確定マーカ領域３２ａ、３３ａ、３４ａは選択基準を満たしておらず、そのため画像マーカ領域として画定されない。追加のステップ３１１において、たとえば、評価されたマーカ領域の幾何空間パラメータ（座標）または形状インデックスを含む評価の情報が、二次画像ｂ内に、または、関連データベース内のように、それに関係／関連付けて記憶される。そのようなデータベースは、画像マーカ領域として画定されている未確定マーカ領域に関連する情報を用いて後に更新されてもよい。情報は、ステップ２２４において新規画像内に新規画像マーカ領域を挿入するのに使用することができる。

画像Ｉ_１ｂは、Ｉ_１ａと正確に同じ画像であってもよく、または、コピーおよび／もしくは、画像マーカ領域によって視覚的マークを挿入することなどによってデジタル的に編集されてもよい。しかしながら、二次デジタル画像は、一次デジタル画像と同じ画像であることには限定されない。

二次デジタル画像と一次デジタル画像との間の差は、二次デジタル画像が画像マーカ領域を画定するために評価されている一方で、一次デジタル画像は未加工の編集されておらず評価されていないデータであることである。本方法における任意の編集または作成されたデジタル画像は、デジタル画像化またはスキャンから直接得られるいかなる未加工画像でもないため、二次画像と称される。それゆえ、たとえば、本発明のステップ２１２および２２４において作成される新規画像も、二次デジタル画像と称される。

一実施形態において、ユーザは、画像ソフトウェアを使用し、一定の色強度、ロケーション、周囲状況および／または形状のような所定の選択基準にしたがって画像マーカ領域を画定することによって、一次デジタル画像を評価してもよい。この種の評価に有用な画像ソフトウェアの例は、米国のＭｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃａ ＩｎｃによるＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ、デンマークのＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ Ａ／ＳによるＶｉｓｉｏｍｏｒｐｈ、ドイツのＤｅｆｉｎｉｅｎｓ ＡＧによるＤｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｕｄｉｏ、および米国のＭａｔｈｗｏｒｋｓ ＩｎｃによるＭａｔｌａｂである。

これより、画定された画像マーカ領域に対応する識別可能な分類された新規マーカを挿入することによって新規画像を作成するステップ２１２を図４を参照して説明する。

図４は、本発明の一実施形態の画像系列を開示している。画像Ｉ_１、Ｉ_２、Ｉ_３、Ｉ_４が一連のＮ個の画像を形成しており、Ｎ＝４である。各画像内の描画されている対象物は組織切片（または組織切片の一部）である。各画像は同じ組織切片（の同じ部分）を含む。画像は各々、ステップ２１１およびステップ２２２にしたがって評価されている。

各画像は画像マーカ領域を含み、すなわち、Ｉ_１は画像マーカ領域４１１ａを含み、Ｉ_２は画像マーカ領域４１１ｂおよび４２１ａを含み、Ｉ_３は画像マーカ領域４１１ｃ、４２１ｂ、４３１ａ、および４３２ａを含み、Ｉ_４は画像マーカ領域４１１ｄ、４２１ｃ、４３１ｂ、４３２ｂ、４４１ａ、および４４２ａを含む。ロケーションパラメータ、形状パラメータ、色値、強度値などのような画像マーカ領域に関する情報が、好ましくは、画像自体の中に、または、画像に関連付けられているデータベース内のように、画像自体に関係／関連付けられて記憶されている。そのようなデータベースはメモリ１２内に配置することができる。パラメータはたとえば、図３のステップ３１１（上述）にしたがって記憶される。

すでに開示されたように、画像系列内の画像は少なくとも同じ、または一般的には増大していく量の画像マーカ領域を含む。Ｉ_４は最大量の画像マーカ領域を含み、Ｉ_１は最小量の画像マーカ領域を含む。Ｉ_ｎは少なくともＩ_ｎ−１（ｎ＝２、３または４）と同じ量の画像マーカ領域を含む。

Ｉ_４、Ｉ_３および／または関連データベース内のそれらに関連する情報を比較することによって、画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ａはＩ_４内には存在するがＩ_３内には存在しないことが分かる。したがって、画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ａと同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域が、ステップ２２４にしたがってＩ_ｎｅｗ内に挿入される。新規画像マーカ領域はさらに、固有の特徴、特に固有の特徴の固有値によって識別可能にされる。

図５ａおよび図５ｂに、新規画像の例が与えられている。これらは本実施例において得ることができる。図５ａ内の新規画像Ｉ_ｎｅｗは、画像Ｉ_１〜Ｉ_４のうちの１つ、たとえばＩ_１をコピーすることによって提供される。図５ｂにおいて、新規画像Ｉ_ｎｅｗが、空白画像、すなわち、何ら情報を有しない画像を作成することによって提供される。

上記で開示したように、画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ａと同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域が挿入される。図５ａ〜図５ｂにおいて、これらは５４１および５４２として参照される。

図５ａ〜図５ｂにおいて、固有の特徴は視覚マーカであり、特異的なグループの挿入されている画像マーカ領域に固有のパターンを含む。画像マーカ領域５４１および５４２は、Ｉ_３の画像化とＩ_４の画像化との間の検出過程サイクルにおいてマークされているグループ領域に属する。画像マーカ領域５４１および５４２について、固有の特徴の視覚マーカは点状パターンである。

画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ａと同じ形状およびロケーションを有する画像マーカ領域５４１および５４２を挿入するために、データベースは、画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ａを参照する情報を含んでもよい。上記で開示したように、そのような情報は、図３の追加のステップ３１１においてデータベース内に記憶されてもよい。さらに、図２ｂによる方法は、所定の選択基準にしたがって識別された各画像マーカ領域の形状およびロケーションを記録する追加のステップを含んでもよい。画像マーカ領域４４１ａおよび４４２ｂの形状およびロケーションを知ることによって、新規画像マーカ領域５４１および５４２を挿入することができる。当業者であれば理解し得るように、新規画像マーカ領域は、当該技術分野において一般的に既知である他の手順によって新規画像内に挿入することができる。

Ｉ_３をＩ_２と比較することによって、画像マーカ領域４３１ａおよび４３２ａがＩ_３内には存在するが、Ｉ_２内には存在しないものとして識別される。画像マーカ領域４３１ａおよび４３２ａと同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域５３１および５３２が、Ｉ_ｎｅｗ内に挿入される。図５ａ〜図５ｂにおいて、５３１および５３２の固有の特徴の視覚マーカは塗りつぶしパターンである。

Ｉ_２をＩ_１と比較することによって、画像マーカ領域４２１ａがＩ_２内には存在するが、Ｉ_１内には存在しないものとして識別される。画像マーカ領域５２１ａと同じ形状およびロケーションを有する新規画像マーカ領域５２１が、Ｉ_ｎｅｗ内に挿入される。図５ａおよび図５ｂにおいて、５２１の固有の特徴の視覚マーカは線入りパターンである。

Ｉ_１は検出過程の第１のサイクルの結果であるため、いかなる他の画像とも比較する必要はない。この例において、画像マーカ領域４１１ａは、Ｉ_１内に存在するものとして識別され、したがって、Ｉ_１を生成する検出過程サイクルに由来する。４１１ａと同じ形状およびロケーションを有する新規マーカ領域５１１がＩ_ｎｅｗ内に挿入される。画像マーカ領域５１１はさらに、固有の特徴にしたがって識別可能にされる。図５ａおよび図５ｂにおいて、画像マーカ領域５１１の固有の特徴の視覚マーカは正方形パターンである。

それによって、分類された画像マーカ領域を含む新規画像が作成されており、それにしたがって、各画像マーカが検出サイクル、ならびに、それゆえ細胞マーカおよび初代細胞を表す。本発明の方法によって、複数の細胞または組織構造が同じ型の検出過程の反復を使用して識別および分類され得る。検出可能ポリマーまたは蛍光色素のような、組織要素または構造をマークするのに使用されるマーカはそれら自体が固有である必要はない。特異的な波長を有する単一の型の検出可能ポリマーまたは蛍光色素が、検出過程のすべてのサイクルに使用され、同じ強度、色または発光波長を有するマーカ領域を生成してもよい。この利点は、図４の画像Ｉ_４および、たとえば、図５ａのＩ_ｎｅｗによって示される。既知の技法によって、複数回の検出過程の結果、画像Ｉ_４が生成される。ここで、マーカ領域を互いから区別することは不可能である、すなわち、Ｉ_４内の画像領域がいずれの型の初代細胞または組織構造を表すかを知ることは可能ではない。しかしながら、複数回の画像化が開示されている画像分析方法と組み合わされている本発明の新規の概念によって、分類を有する画像マーカ領域を含む画像を、単純かつ効率的な方法で達成することができる。したがって、同じ切片内で複数のマーカを検出することの制限のような、既知の方法に伴う多くの問題を克服することができる。

図６ａ〜図６ｂは、本発明による、画像Ｉ_ｎｅｗ内の分類された画像マーカ領域のための固有の視覚的特徴の例を示す。画像は、要素および構造を有する組織試料を表す。画像は、本発明の方法を通じて提供されている。

図６ａにおいて、固有の特徴は異なるパターンである。

図６ｂにおいて、固有の特徴はグレーの色であり、固有値はグレーカラーの強度、特に異なるグレースケール強度である。新規画像は、異なる色のような複数の特徴を含み、当該色はさらに固有値に細分化され得、その値は前記異なる色の異なる強度であり得る。

図６ｃにおいて、固有の特徴は異なる符号である。この実施形態において、記号は文字であるが、それらはまた、数字、幾何学記号など、またはそれらの組合せであってもよい。記号は、デジタル画像Ｉ_ｎｅｗ内でそれが表す画像マーカ領域付近に配置され、それによって、いずれの画像マーカがそれに関連付けられているかが明瞭である。

前述のように、固有の特徴は必ずしも新規画像内に配置された視覚的特徴である必要はないことが留意されるべきである。その代わりに、それと組み合わせて、視覚マーカは固有のデジタル値のようなデジタル情報であってもよく、あるグループの画像マーカ領域が互いに関連付けられる。そのような情報は、データベース内に、好ましくは、画像マーカ領域のロケーション、形状、および他の染色特性に関連する情報を含む上述のデータベース内に記憶されてもよい。

図７は、本発明の一実施形態を示し、全体的に符号７を与えられているグラフィカルインターフェースが、ユーザに本発明の方法に関連する情報を提供するのに使用される。グラフィカルインターフェース７を提供するコンピュータプログラムがメモリ１２内に記憶され、プロセッサ１１によって実行され得る。コンピュータプログラムは、代替的に、ＵＳＢスティックまたはＣＤ−ＲＯＭのような、任意の適切な記憶装置上に記憶されてもよい。コンピュータプログラムはさらに、本発明による、一連の画像内でマーカ領域を区別する方法を実行することができる。

グラフィカルインターフェース７は、装置１０に接続されている、コンピュータ画面のような出力ユニット１４を通じてユーザに提示されるグラフィカルウィンドウ７１を備える。ユーザは、装置１０に接続されている、コンピュータマウスまたはキーボードのような入力ユニット１５によって、選択のような入力をコンピュータプログラムに提供することができる。

グラフィカルウィンドウ７１は、本発明による方法によって提供される新規画像Ｉ_ｎｅｗに対応する画像７２を含む。この実施形態において、画像７２は、図４〜図５内のものと同じ組織切片を表す。

グラフィカルウィンドウ７１は、画像７２の見え方を適応させるための少なくとも１つのボックス７５をさらに含む。ボックス７５は、異なる複数の選択肢の間での選択を提供するための選択ボックス７６を含んでもよい。この実施形態において、ボックス７５は、いずれの群の初代細胞集団を画像７２内で強調するかの選択を提供する。選択ボックス７６内で選択肢「Ｂリンパ球」を選択することによって、Ｂリンパ球に関連付けられる画像マーカ領域７５１および７５２が強調される。画像マーカ領域と初代細胞との間の関連付けはデータベース内に記憶されてもよく、関連付けに関する情報はコンピュータプログラムによってデータベースから得ることができる。データベースは、上記で開示したような本発明による方法によって、特にステップ３１１によって達成することができる。ボックス７５によって提供される選択肢は、１つのみの型の細胞型を含むようには限定されず、複数の細胞型からなる群も同様に等しく含み得る。

グラフィカルウィンドウ７１は、複数の選択ボックス、または、チェックボックス、複数の選択ウィンドウなどのような他の適切な適応手段をさらに含んでもよい。

グラフィカルウィンドウ７１は、情報ボックス７９に関連付けられるボックス７７をさらに含む。情報ボックスにおいて提供される情報は、画像７２の画像マーカ領域に関連付けられる。情報は、画像７２の画像マーカ領域に関連する情報を含むデータベースによって得ることができる。選択ボックス７７は選択ボックス７８を含む。ユーザは、情報ボックス７９内に画像マーカ領域に関する特定のそのような情報を示すために、異なる情報型の間で選択することができる。この示されている例において、ユーザは、選択ボックス７８内で「ｘ，Ｙ座標」を選択することによって、座標を示すことを選択している。選択ボックス７６によって選択されている、強調されている画像マーカ領域７５１および７５２のｘおよびｙ座標に関連する情報は、情報ボックス７９によって提供される。

無論、グラフィカルインターフェース７は多くの異なる形態をとり、多くの異なる機能を含んでもよい。したがって、グラフィカルインターフェース７によってユーザに提供することができる、画像マーカ領域に関連する情報の型は、この例によって限定されない。特許請求する方法によって、ユーザに以下のような情報を提供することができる。
−たとえば、μｍ^２単位で表される、任意のマーカ領域の面積。
−画像マーカ領域の形状値、たとえば、周および丸み
−強度値、たとえば、画像マーカ領域内のピクセルの平均強度値
−画像内の距離、たとえば、２つの画像マーカ領域間の距離
−画像マーカ領域、またはマーカ領域のグループの間の空間相関、たとえば、ソフトウェア内の統計アルゴリズムを使用することによって、ユーザは、たとえば、Ｂリンパ球に対応するマーカ領域と、たとえばＴリンパ球の細胞集団に対応する同じ組織領域ニアのマーカ領域との間の空間的関係に関する情報を得ることができる。

連続して切断した組織切片（たとえば、各々がたとえば４μｍ^２の固定厚さを有する２０個の連続した切片）に本発明を適用するとき、図７に示すもののような同様のグラフィカルインターフェースが、３Ｄ画像において画像マーカ領域の３次元分布を表示することもできることが留意されるべきである。同様に、このときユーザは、画像マーカ領域に関する、それらのｘ、ｙ、およびｚ座標のような３Ｄ情報を得ることができる。３Ｄレンダリングについて一般的に既知であるアルゴリズムを使用することによって、ユーザは、マークされている細胞または組織構造の体積に関する計算（またはグラフィック表示）を得ることができる。

コンピュータプログラムおよびグラフィカルインターフェース７は、ユーザに、本発明の方法の画像から抽出することができる任意の情報を提供するための手段と考えるべきである。たとえば、データベースにおいてそのような情報を抽出および記憶する方法は、当業者にとっては一般的な知識である。上記に関連して記載した特徴を達成するためにコンピュータプログラムを形成する方法も、当業者によって達成され得る。コンピュータプログラムは上述の特徴に限定されず、たとえば、デジタル画像の編集および検討のようなさらなる既知の特徴を含み得ることが留意されるべきである。グラフィカルインターフェース７はさらに、一次デジタル画像の評価を実行するための特徴をも含み得る。

要約すると、本出願は、一連のデジタル画像内で領域を区別するための方法を開示し、方法は、未確定マーカ領域を備える一連のＮ個の一次デジタル画像を提供するステップと、所定の選択基準にしたがってすべての一次デジタル画像Ｉ_ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）を評価し、画像マーカ領域を、所定の選択基準を満たす未確定マーカ領域として画定するステップと、新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップと、新規画像Ｉ_ｎｅｗ内に新規画像マーカ領域を挿入するステップであって、当該新規画像マーカ領域は、画像Ｉ_ｎ内には存在するが画像Ｉ_ｎ−１内には存在しない画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有し、当該新規画像マーカ領域は、固有の特徴によってＩ_ｎｅｗ内で識別可能である、挿入するステップとを含む。

さらに、本出願は、組織学的試料の組織切片内の細胞集団を視覚化するための方法を開示する。

さらに、本出願は、組織学的試料内の複数の細胞集団の３次元分布を視覚化するための方法を開示する。

これより、本発明を、これに含まれる実施例を参照してさらに開示する。

実施例１：組織の処理、試料の作製、および切片の生成。
以下のヒト組織が含まれた。
−ヒト遠位結腸：慢性炎症、および非特異性結腸炎の疑いにより外科的に切除。
−慢性閉塞性肺疾患、ＣＯＰＤおよび嚢胞性線維症の患者からのヒト肺組織：肺がんの疑いにより肺切除、分析した組織にがんの影響はなく、可能な限り腫瘍から離れた部分を得た。
−ヒトリンパ節：重篤なＣＯＰＤまたは嚢胞性線維症による肺移植に関連して収集した大きい流入領域リンパ節。
−ヒト扁桃腺：扁桃腺炎の繰り返す発作により所定の扁桃摘出術の一部として収集。

すべての組織型からの試料（すなわち、組織のブロック）が、所定の固定剤（４％緩衝ホルムアルデヒド、ｐＨ７．６）に浸すことによる所定の固定化を受けた。一晩固定化した後、試料はアルコール（ＥｔＯＨ）の濃度が増大していく一連の溶液において脱水され、最後にキシレンに浸された。脱水は自動脱水機（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｈｙｐｅｒｃｅｎｔｅｒ ＸＰ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｓｈａｎｄｏｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）において実行された。脱水した標本はその後、パラフィン包埋機を使用して６０℃でパラフィン内に包埋された。所定のパラフィン切断ミクロトーム（Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ３６０パラフィンミクロトーム、Ｍｉｃｒｏｍ、ドイツ）を用いてパラフィン切片（４μｍ）が生成され、標準的な顕微鏡スライドガラス上に載置された。その後切片を使用するまで４℃で保存した。

実施例２：複数回の免疫組織化学的染色および連続したデジタル画像の生成。
ＤＡＫＯ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ検出システム）を有する自動免疫組織染色ロボット（Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＣＬ−ｃｌａｓｓｉｃ；Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、グロストルップ、デンマーク）、一次マウスまたはウサギ抗体の検出を意図した反応性の高い標準的な方法（ＩＨＣキットコードＫ５００７、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク、詳細についてはｗｗｗ．ｄａｋｏ．ｃｏｍを参照）を使用して免疫組織化学的染色が実行された。細胞特異的抗原を検出するのに使用される一次抗体（上記で「細胞マーカ」として参照）が表２にリストされており、所定の病理学検査のために準備されたヒト組織の免疫組織化学的染色のために商業生産者が推奨する希釈において切片（すなわち、ホルマリン固定化およびパラフィン包埋された試料からの切片）に添加される。ＥＳＭＳの評価に使用された一連のマーカの例を表３に列挙する。

実際の免疫組織染色工程の前に、パラフィン切片は脱パラフィンされ、熱誘導抗原回復を受けた。この手順は、９５℃のピーク温度およびＥｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ ６．１（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて市販のプログラム可能な抗原賦活化機（ＰＴ Ｌｉｎｋ、Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク）を使用して実行された。

抗原賦活化の後、スライドがＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｒｏｂｏｔ内に配置された。プログラムされた免疫組織染色プロトコルは以下のようなものであった。
（１）Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ洗浄緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた５分間にわたる洗い流し工程。
（２）ｄＨ_２０中の０．３％Ｈ_２Ｏ_２における内因性ペルオキシダーゼのブロック（１０分間）。
（３）適切に希釈した一次抗体（表２参照）による６０分間にわたるインキュベーション。抗体は、０１％ｔｗｅｅｎ洗浄剤が添加されたＰＢＳ緩衝液内に希釈された。
（４）Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ洗浄緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた５分間にわたる洗い流し工程。
（５）検出酵素、ＨＲペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を付加されたデキストランポリマーに架橋された二次試薬（抗マウスおよび抗ウサギ抗体を用いた３０分間にわたるインキュベーション。
（６）Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ洗浄緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた５分間にわたる反復洗い流し工程。
（７）ＨＲＰ酵素基質（ジアミノベンジジン、ＤＡＢ）溶液を用いた１０分間にわたるインキュベーション。
（８）Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ洗浄緩衝液（ｐＨ７．６）を用いた５分間にわたる反復洗い流し工程。
（９）封入剤として０．１％ｔｗｅｅｎが添加されたＰＢＳ緩衝液を使用して、発色された切片が標準的なカバースリップを用いて穏やかに封入された。
（１０）各切片内の染色パターンの次の情報がデジタル化された。免疫活性のある部位においてＨＲＰ酵素によって形成された褐色の不溶性沈殿物が、市販のホールスライドスキャナロボット（Ａｐｅｒｉｏ Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ ＣＳ、Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を使用して切片全体を通じてキャプチャされた。デジタル化は、２０倍顕微鏡レンズを使用して実行され、各切片について生成された超高分解能画像のサイズは、一般的に２〜５ＧＢのサイズであった（また、元々はＳＶＳ画像ファイルフォーマットであり、また大容量のＳＶＳ画像の部分が、Ａｐｅｒｉｏによって提供されるＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアのエクスポート機能を使用してＴＩＦＦ画像としてエクスポートされた、下記参照）。
（１１）代替的に、またはホールスライドデジタル化に対する補完としえ、切片から選択された領域が、カラーデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ−５０、オリンパス、日本）および画像キャプチャソフトウェア（Ｖｉｅｗｆｉｎｄｅｒ Ｌｉｔｅ，ｖ１．０，２０００、Ｐｉｘｅｒａ Ｃｏ）を装備した明視野顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ニコン、日本）を使用してより高倍率（４００倍または６００倍；ＴＩＦＦまたはＪＰＥＧ画像）でもキャプチャされた。
（１２）デジタル化の後、カバースリップが穏やかに取り外され、スライドが新たな免疫組織染色サイクル（プロトコルのステップ２において開始する）に入る前に緩衝液内で洗い流された。いくつかの場合において、切片が、次の染色サイクルに入る前に、先行する一次抗体を後続の染色サイクルにおける二次検出抗体に対して認識不可能にするブロッキング溶液に浸された。抗原認識部位の破壊は、化学修飾によって実行された。そのような化学修飾は、２つの異なる方法で行われた。いずれにおいても、抗原認識部位が、米国カリフォルニア州コンコルドのＢｉｏＣＡＲＥ製の変性ブロッキング溶液ＤＮＳ００１ Ｈを使用したタンパク質変性によって破壊された。代替的に、抗体は酵素によって切断され得る。
（１３）次に、切片は、ステップ２によって開始する新たな染色サイクルに入った（上記のプロトコルにおけるＨ_２Ｏ_２ブロック）。
（１４）ｎ回のサイクルおよび最後のマーカの免疫活性の発現の後、切片はｄｄＨ_２Ｏ中で洗い流され、ヘマトキシリン（（Ｈｔｘ、Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて対比染色され、一連のアルコール溶液およびキシレンを通じて脱水され、最後にＰｅｒｔｅｘ封入剤（ＨｉｓｔｏＬａｂ、ヨーテボリ、スウェーデン）を用いて封入された後、上述のようにデジタル化される。

実施例３：マーカ特異的染色パターンのコンピュータ化画像分析および復号。
開示される発明による一連の一次画像に対応する、Ａｐｅｒｉｏのスライドスキャナからのデジタル化切片が閲覧ソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０．３５．１７９８、Ａｐｅｒｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を使用して手動で検査された。最初の評価において、各切片内の対象領域が、さらなる詳細な分析のために選択された。ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアの画像抽出およびエクスポート機能を使用して、未加工の画像、すなわち、一次デジタル画像が各染色サイクルについて１画像ずつ、ＴＩＦＦまたはＪＰＥＧファイルとしてエクスポートされた。それとともに、画像は対象領域あたり１系列の画像を形成した。

いくつかの画像について、褐色ＤＡＢ沈殿物の分布パターンが、褐色ＤＡＢ沈殿物のＲＧＢおよびＨｕｅ値特性を選択した後にＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアに含まれている色区分機能（「陽性ピクセル」アルゴリズム）によって画像エクスポートの前にすでにアウトライン化されている。

褐色免疫染色、すなわち、画像マーカ領域の場合がまだＩｍａｇｅＳｃｏｐｅにおいてアウトライン化されていなかった場合、これは、色認識機能を有する、すぐに利用できるソフトウェア（たとえば、ＩｍａｇｅＪ，ｖｅｒｓｉｏｎ１．４４ｏ、米国国立衛生研究所、または、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳ４ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ，ｖｅｒｓｉｏｎ１１．０．２、Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国）を使用して実行されている。検出された点の視覚フィードバックを通じて、各細胞型の一般的な染色パターンおよび染色外観に関する知識を有する者が、最適な検出が得られるまで閾値を微調整した。

次に、各分子検出サイクル後に生成された累積未確定マーカ領域を有する一連の画像が評価された。画像マーカ領域は、その後、デジタル的に切り離され、検出過程の対応するサイクルに固有の疑似色を与えられた。最後の画像、すなわち、一連のＮ個の画像の画像Ｎをテンプレートとして使用して、色分けされた累積染色点、すなわち、色付けされた画像マーカ領域が、テンプレートに逆順にコピー−ペーストされた（必要な場合、この手順の前に、組織輪郭を基準点として使用することによって、同じ系列内の画像の間の物理的な向きに時折見られるわずかな差を補正する位置整合工程が実行された）。

たとえば、７個の画像を有する、すなわち、７回の検出過程サイクルの結果得られる画像系列の場合、すべての累積された染色を有する最後の画像（７番目）が新規画像テンプレートとして使用されている。いくつかの実施形態において、最後の画像は、組織切片を有するスライドが、最後にかつ最適に非水封入剤に封入された後、最後の一次デジタル画像が生成されていることに起因して最良の形態を有するため、これをコピーすることが有利である。第６の画像内の画像マーカ領域が新規画像内にコピー−ペーストされた。したがって、新規画像内にすでに存在する画像マーカ領域はマスクされた、すなわち、第７の検出ラウンドにおいて生成されなかったマーカ領域がマスクされた。同様に、第５の画像内の画像マーカ領域は、第６の検出過程ラウンドにおいて生成されなかったすべての画像マーカ領域をマスクした。

生成された合成新規画像は最終的に、異なる染色サイクル、すなわち検出過程サイクルに由来する各グループの画像マーカ領域に対して１色の、７つの別個の色を表示した。

マーカ色を（たとえば、ＩｍａｇｅＪソフトウェアまたはＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を使用して）自動的に選択し、その後、「粒子分析（ａｎａｌｙｓｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）アルゴリズム」、または同様の演算を使用して、各染色点に関する詳細な情報（周、面積、形状インデックス、点の重心のｘ座標、ｙ座標など）を生成することによって新規画像から情報を抽出することが可能であった。この機能は、開示されているグラフィカルユーザインターフェース（図７に示す）にも含まれ得る。

画像系列を評価することによって合成画像を生成するための別の手法は、ＩｍａｇｅＪ（ｖ１．４４）およびＩｍａｇｅＪのための無料で利用可能なプラグインによって提供される色区分化ツールおよび粒子分析ツールを使用することであった。簡潔には、系列内の各画像は、以下の手順を受けた。
（１）褐色ＤＡＢ染色点、すなわち、画像領域が、適切なＨＳＢ（色相、飽和度、彩度）閾値を含む選択基準を用いて画像を評価することによる、色ベースの区分化によって区分化され、
（２）画像が２値白黒画像に変換され（すなわち、２値化された）、
（３）ステップ（２）からの変換された画像が、適切なサイズ制約を用いてＩｍａｇｅ Ｊ（ｖｅｒｓｉｏｎ１．４４）の粒子分析ツールを使用して評価され、すべての画像マーカ領域、すなわち、すべての染色マーカ領域のデータリスト、すなわち、データベースが生成および記憶された。データリストは、すべての個々の画像マーカ領域のｘ座標、ｙ座標、面積、周、真円度、丸み、平均染色強度などを含んでいた。プログラムが、マークアップ画像を自動的に生成しており、マーカ領域は、データリスト内の同じ点に対応するマーカ領域番号とともにアウトライン化されている。

次に、マーカ領域分布の数値（すなわち、ｘ座標、ｙ座標）を比較することによって、たとえば、画像ｎ内には存在するが、ｎ−１内には存在しない画像領域を計算することができた。この手法がすべての連続する画像の対に対して実行され、したがって、各新規分子検出サイクル後に現れた画像マーカに関する情報が生成された。最後に、この情報を、最後の画像からのすべての累積マーカ領域のデータリストとともに使用して、新規合成画像を作成することができた。対象領域（ＲＯＩ）マネージャを起動した後、特異的な分子検出サイクルに属する各マーカ領域に、対応するマークアップ画像内の特異的な色が与えられた。

抽出することができる情報の利点を示すために、炎症組織、および、組織浸潤性免疫細胞（白血球）の複数の集団に関する染色のシナリオを考える。従来の所定の切片では、各集団に一般的に数十〜数千の細胞がある。複数の白血球集団内の個々の細胞のｘ、ｙ座標を抽出することによって、細胞パターンの新規の型の強力な分析を実行することが可能になる。比較的新しい新興の空間分析（空間統計学）およびクラスタ分析を実行して、可能性として疾患特異的な細胞集団（浸潤パターン）に関する情報を得ることができ、これらの細胞は互いに引きつけあい、または、組織内の一定の微小域もしくは細胞の組合せなどに引きつけられる。

Claims (14)

1. 一次デジタル画像が組織切片の画像である、一連のＮ個（Ｎは２以上の整数）の一次デジタル画像において領域を区別して新規画像を生成する方法であって、
   （ａ）未確定マーカ領域を有する一連のＮ個の一次デジタル画像であって、画像Ｉ_ｎ＋１ が、一次デジタル画像Ｉ_ｎ（ｎは２≦ｎ≦Ｎを満たす整数）の未確定マーカ領域と少なくとも同じ量の未確定マーカ領域を有するようなＮ個の一次デジタル画像を提供するステップ（２２１）と、
   （ｂ）所定の選択基準にしたがってすべての一次デジタル画像Ｉ_ｎ（１≦ｎ≦Ｎ）を評価して、前記所定の選択基準を満たす未確定マーカ領域として画像マーカ領域を画定し、画定した画像マーカ領域の情報を、対応する二次デジタル画像の内部に記憶し、または関係付けて記憶することによって、一連のＮ個の二次デジタル画像を取得するステップ（２１１、２２２、３１０）と、
   （ｃ）新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップ（２２３）と、
   （ｄ）ステップ（ｂ）において得られた一連の二次デジタル画像のうち、２≦ｎ≦Ｎを満たすすべてのｎについて、画像Ｉ _ｎ−１ には存在しないが画像Ｉ_ｎ には存在する画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有する画像マーカ領域を、Ｉ_ｎｅｗ に固有の特徴として識別可能な新規画像マーカ領域として新規画像Ｉ _ｎｅｗ に挿入するステップと、
   （ｅ）画像Ｉ_１ に存在する画像マーカ領域と同じ形状およびロケーションを有する画像マーカ領域であって、Ｉ_ｎｅｗ に固有の特徴として識別可能な新規画像マーカ領域として新規画像Ｉ _ｎｅｗ に挿入するステップ（２１２、２２４）と
   を含む方法。
2. 前記新規画像Ｉ_ｎｅｗを提供するステップは、組織切片の画像を提供するステップを含むことを特徴とする
   請求項１に記載の方法。
3. 前記新規画像Ｉ_ｎｅｗは、前記一連の一次デジタル画像に含まれる１つ画像のコピーであることを特徴とする
   請求項２に記載の方法。
4. ステップ（ｄ）および（ｅ）における前記固有の特徴は、１≦ｎ≦Ｎを満たすｎ毎に固有値を有する特徴であることを特徴とする
   請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記固有の特徴は一般色であり、前記固有の特徴の前記固有値は、特定の細胞マーカに関連付けられる特異的な色であることを特徴とする
   請求項４に記載の方法。
6. 前記所定の選択基準は、未確定マーカ領域の視覚的性質に関する閾値を含むことを特徴とする
   請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 組織学的組織切片内の細胞集団を視覚化するための方法であって、
   （ａ）既知の様式で分子染色する準備ができた状態にされている組織切片を提供する（８１１）ステップと、
   （ｂ）所定の一連のＫ個（Ｋは３以上の整数）の細胞マーカの成員にして、ステップ（ａ）の前記組織切片内に存在し得る成員に特異的に結合して検出する、一連のＫ個の特定の分子検出手段であって、始動可能で検出可能な応答が形成可能な分子検出手段を提供する（８１２）ステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）における特定の分子検出手段ｋ＝１、２、．．．、Ｋ毎に、
   （１）ステップ（ａ）の前記組織切片を、前記特定の分子検出手段と接触させる（８１３）ことにより、前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合させる手順と、
   （２）どの細胞マーカにも結合しなかった分子検出手段を除去するために前記組織切片を洗浄する（８１４）手順と、
   （３）前記組織切片の細胞マーカに結合した可能性がある分子検出手段からの応答を始動する（８１５）ことによって、前記分子検出手段の検出を可能にする手順と、
   （４）前記分子検出手段が検出可能状態になれば、検出可能ポリマーの生成に関連付けられる１つまたは複数の未確定マーカ領域を含み得る一次デジタル画像Ｉ_ｋを生成するために、前記組織切片をスキャン／画像化する手順（８１７）と
   を実行することによって、増大する量の未確定マーカ領域を含む一連のＫ個の一次デジタル画像Ｉ_ｋ（ｋ＝１、．．．、Ｋ）を取得するステップと、
   （ｄ）ステップ（ｃ）で取得した前記一連のＫ個の一次デジタル画像Ｉ_ｋ（ｋ＝１、．．．、Ｋ）に対して請求項１に記載の方法を実施することにより、細胞構造を視覚化した画像Ｉ_ｎｅｗを生成するステップと
   を含む方法。
8. 前記分子検出手段は抗体のセット、好ましくはモノクローナル抗体または抗体フラグメントのセットであって、各抗体が特定の細胞マーカに結合し、各抗体に接合されている酵素が１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーを生成可能な抗体のセットであり、
   ステップ（ｃ）の項目（１）および（２）の実施は、
   （ｉ）前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合している抗体であって、１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーを生成可能な酵素に接合された抗体に、ステップ（ａ）の組織切片を接触させること、
   （ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために組織切片を洗浄することによって行われ、
   ステップ（ｃ）の項目（３）の実施は、
   （ｉｉｉ）項目（２）の後に、組織切片を前記酵素の１つまたは複数の適切な基質に曝露することにより、前記組織切片内に前記所定の一連の細胞マーカのうちの前記特定の成員が存在する場合に検出可能ポリマーを生成することによって行われることを特徴とする
   請求項７に記載の方法。
9. 前記分子検出手段は分子錯体のセットであって、各錯体が、（ア）特定の細胞マーカに結合する第１の抗体、好ましくはモノクローナル抗体、（イ）前記第１の抗体に特異的に結合される第２の抗体または抗体フラグメント、好ましくはモノクローナル抗体、および（ウ）前記第２の抗体に接合される酵素にして１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーを生成可能な酵素を備える分子錯体のセットであり、
   ステップ（ｃ）の項目（１）および（２）の実施は、
   （ｉ）前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合している第１の抗体に、ステップ（ａ）の組織切片を接触させること、
   （ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために前記組織切片を洗浄すること、
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の後に、前記組織切片を、前記第１の抗体に特異的に結合している第２の抗体に接触して、１つまたは複数の適切な基質の存在下で検出可能ポリマーを生成可能な酵素に、前記第２の抗体を接合すること、
   （ｉｖ）ステップ前記（ｉｉｉ）の後に、結合していない抗体を除去するために前記組織切片を洗浄することにより行われ、
   ステップ前記（ｃ）の項目（３）の実施は、
   （ｖ）項目（２）の後に、前記組織切片を前記酵素の１つまたは複数の適切な基質に曝露することにより、前記組織切片内に前記所定の一連の細胞マーカのうちの前記特定の成員が存在する場合に検出可能ポリマーを生成することによって行われることを特徴とする
   請求項７に記載の方法。
10. 前記酵素は、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼから成る群から選択される
    請求項８または請求項９に記載の方法。
11. 前記基質は、３，３’−ジアミノベンジジン、Ｆｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）、およびＶｉｎａ ｇｒｅｅｎから成る群から選択されることを特徴とする
    請求項１０に記載の方法。
12. 前記分子検出手段は、検出部に結合されている認識部を備える分子複合体のセットであり、前記認識部は、前記所定の一連の細胞マーカの特定の成員に特異的に結合可能であって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそのフラグメントのような抗体、ならびにＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子のような核酸分子から成る群から選択され、前記検出部は、蛍光色素であって、放出される放射とは異なる始動放射に曝露された後、特定の波長の放射を放出可能であり、
    ステップ（ｃ）の項目（３）は、前記組織切片およびそれに結合された分子検出手段が始動放射に曝露されることにより、前記所定の一連の細胞マーカの前記特定の成員が前記組織切片内に存在する場合には、特定の波長の放射を放出することにより実施され、
    ステップ（ｃ）の項目（４）は、前記特定の波長の放射が放出された場合に実施されることを特徴とする
    請求項７に記載の方法。
13. Ｖｉｎａ ｇｒｅｅｎまたはアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）のような、少なくとも部分的に可溶性のポリマーを生成する基質が検出可能ポリマーを生成する基質として使用され、
    （ｅ）前記検出可能ポリマーを除去するために前記組織切片を洗浄するステップと、
    （ｆ）新規の一連の分子検出手段を用いてステップｂ〜ｄを反復するステップと
    をさらに含む、請求項８乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 組織学的試料における同じ３次元空間内の複数の細胞集団および細胞構造の３次元分布を視覚化するための方法であって、
    （Ａ）組織試料を提供し、前記組織試料を、既知の様式で切断して複数の元々は重なり合っていた組織切片にするステップと、
    （Ｂ）ステップ（Ａ）において得られたすべての組織切片に対して請求項７乃至１３のいずれか１項に記載の方法を実施するステップと、
    （Ｃ）既知の原理にしたがってステップ前記（Ｂ）において得られた前記画像を重ね合わせるステップであって、それによって、組織学的試料における同じ３次元空間内の複数の細胞集団および細胞構造の３次元分布の３次元視覚化を得る、重ね合わせるステップと
    を含む方法。

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