KR20140063574A - 조직 절편의 이미지를 제공하는 방법 - Google Patents
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Abstract
일련의 디지털 이미지에서 영역을 구별하는 방법으로서, 이 방법은 미확정 마커 영역을 포함하는 일련의 이미지를 제공하고, 소정의 선택 기준에 따라 1≤n≤N에서 모든 이미지 In을 평가하고, 소정의 선택 기준을 만족하는 미확정 마커 영역으로서 이미지 마커 영역을 정의하고, 새로운 이미지 Inew를 제공하고, 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 것을 포함하고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 In-1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징에 의해 Inew에서 식별 가능하다. 또한, 본 출원은 조직학적 시료의 조직 절편의 세포 집단을 시각화하는 방법을 개시한다. 또한, 본 출원은 조직학적 시료에서 다수의 세포 집단의 3차원적 분포를 시각화하는 방법을 개시한다.
Description
본 출원은 면역 조직 화학 분야뿐만 아니라 이미지의 컴퓨터 기반 분석에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원은 일련의 이미지에서 영역을 구별하는 방법을 제공한다.
조직학적 조직 시료의 분석은 진단 목적, 예를 들면 유방암 진단을 위한 유방 조직 시료의 분석, 또는 연구 목적, 예를 들면 천식, 죽상동맥경화증, 또는 염증성 장 질환 등의 염증 상태의 염증성 세포 유형을 연구하는데 일반적으로 이용된다.
마커(즉, 항원)가 항원 특이적 항체에 의해 검출되는 면역 조직 화학(IHC)은 조직학적 절편의 세포를 식별하는데 일반적으로 사용된다. 이상적으로는, 세포 유형의 식별은 하나의 세포 특이적 세포 항원의 검출로 얻어질 수 있다. 그러나, 복수의 세포 유형에 대해서는 적절한 식별을 위해 복수의 항원의 조합이 분석되어야 한다.
임의의 병변 조직은 일반적으로 변화한 세포 조성과 연관된다. 예를 들면, 천식의 염증 기도에서, 상피 세포, 선 세포, 혈관 세포, 신경 등의 기도를 구성하는 구조적 세포의 변화한 조성이 있다. 또한, 복수 유형의 면역 세포(즉, 백혈구)가 염증 기도에 침투한다.
많은 질환에서, 조직의 병리학적인 것(즉, 파괴적인 변화)은 하나의 세포 유형에 의해서가 아니라 복수의 세포 유형 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 야기된다. 따라서, 병변 조직 시료를 탐구할 때, 복수의 세포 집단 및 조직 구조를 연구하는 것이 종종 바람직하다. 연속 절단 절편에서 한 번에 하나의 세포 유형을 염색하여 세포 내용물에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이 접근법은 조직 시료 내의 복수의 세포 유형의 내용물의 양호한 추정을 제공하지만, 분석된 세포 유형 간의 공간적 관계(즉, 물리적 관계)에 대한 구체적인 정보는 제공하지 않는다.
세포 조성이 특정 질환 상태를 어떻게 정의할 수 있는지를 더 양호하게 탐구하거나 세포가 병변 조직 내에서 어떻게 상호 작용하고 서로 관련되는지를 연구하기 위해, 동일한 3차원 공간, 예를 들면 하나의 단일 조직 절편 내에서 다수의 세포 조직을 시각화하는 수단을 개발하는 것이 바람직하다.
현재 이용 가능한 IHC 기술에서는, 다수의 색소원 또는 다수의 면역 형광 기술을 사용하여 하나의 절편에서 4 개의 세포 유형까지 염색할 수 있다. 그러나 실제로는 일차 검출 항체의 적절한 조합의 부족으로 인해 종종 2 개의 세포 유형만이 동시에 검출될 수 있다.
하나의 조직 절편(tissue section)에서 마커의 수를 증가시키기 위해, 새로운 방법론적 접근 방식, 예를 들면 WO 2010/115089에 공개된 SIMPLE 기술 및 MELC 기술(Schubert 외, Nature Biotechnology v.24, 1270-1278) 등이 개발되었다. 강력하지만, 이 새로운 유형의 기술은 주로 공동-로컬화 연구를 위해 개발되었고, 조직 파괴적인 절차, 검출 그룹의 파괴를 수반하는 절차, 또는 검출 분자 라벨의 일차 항체 의존성, 염색될 수 있는 세포 마커의 수를 제한하는 특징을 수반한다.
상술한 기술은 주로 공동 로컬화 연구를 위해 개발되었기 때문에, 그들은 많은 식별 마커가 가끔 의도되지 않은 세포 유형에 존재할 수 있다는 사실을 다루고 있지 않다.
따라서, 하나의 조직 절편 등과 같이 동일한 물리적 공간 내에서, 다수의 세포 유형이 동시에 적절하게 식별될 수 있는 새로운 기술적 접근 방식이 필요하다. 이상적으로, 임의의 이러한 기술은 시료 전체의 큰 절편을 분석하고 조직에서의 그 공간 좌표, 그 크기 및 형상 파라미터 등의 모든 마크된 개별 세포에 대한 자세한 정보를 제공할 수 있어야 한다.
제 1 실시양태에서, 본 발명은 일련의 N개의 일차 디지털 이미지에서 영역을 구별하는 방법을 제공하고, N은 정수>1이고, 상기 방법에 의해 새로운 이미지를 생성하게 되고,
상기 방법은,
a) 미확정 마커 영역을 포함하는 상기 일련의 N개의 일차 디지털 이미지를 제공하는 단계 - 이미지 In+1은 2≤n≤N에서 일차 디지털 이미지 In과 적어도 동일한 양의 미확정 마커 영역을 포함하고, 여기서 n은 정수임 - ,
b) 소정의 선택 기준에 따라 1≤n≤N에서 모든 일차 디지털 이미지 In을 평가하고, 상기 소정의 선택 기준을 만족하는 미확정 마커 영역으로서 이미지 마커 영역을 정의하고, 이러한 임의의 이미지 마커 영역에 관한 정보를 결과로서의 대응하는 이차 디지털 이미지 내에 또는 그와 관련/연관하여 저장함으로써, 일련의 N개의 이차 디지털 이미지를 얻는 단계,
c) 새로운 이미지 Inew를 제공하는 단계,
d) 단계 b)에서 얻어진 상기 일련의 이차 디지털 이미지의 2≤n≤N에서 모든 n에 대해, 상기 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 단계 - 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 In-1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고 상기 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징에 의해 Inew에서 식별 가능함 - , 및
e) 상기 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 단계 - 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 I1에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고 상기 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징에 의해 Inew에서 식별 가능함 - 를 포함한다.
바람직하게는, 상기 새로운 이미지 Inew를 제공하는 단계는 조직 시료의 이미지를 제공하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 새로운 이미지 Inew는 상기 일련의 이미지 중 하나의 이미지 사본이다.
바람직하게는, 상기 단계 d) 및 단계 e)에서의 상기 고유 특징은 1≤n≤N에서 각 n에 대해 고유 값을 갖는 특징이다
바람직하게는, 상기 고유 특징은 일반적인 색이고, 상기 고유 특징의 고유 값은 특정 세포 마커와 연관된 특정 색이다.
바람직하게는, 상기 소정의 선택 기준은 미확정 마커 영역의 시각적 속성에 대한 임계값을 포함한다.
제 2 실시양태에서, 본 발명은 조직학 조직 절편 내의 세포 집단을 시각화하는 방법을 제공하고, 이 방법은,
a) 종래 공지의 방법으로 분자 염색이 준비된 조직 절편을 제공하는 단계,
b) 상기 단계 a)의 조직 절편에 존재할 수 있는 소정의 일련의 K개의 세포 마커의 멤버에 특이적으로 결합하여 검출하기 위한 일련의 K개의 특정 분자 검출 수단을 제공하는 단계 - 상기 분자 검출 수단은 개시 및 검출 가능한 반응의 형성을 일으킬 수 있고, K는 정수>2임 - ,
c) 상기 단계 b)의 각각의 특정 분자 검출 수단 k = 1,2,..., K에 대해,
1) 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적 결합을 일으키는 상기 특정 분자 검출 수단과, 상기 단계 a)의 상기 조직 절편을 접촉시키는 단계,
2) 임의의 세포 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 상기 조직 절편을 세척하는 단계,
3) 상기 조직 절편의 세포 마커에 결합될 수 있었던 분자 검출 수단으로부터의 반응을 개시해서 상기 분자 검출 수단의 검출을 가능하게 하는 단계, 및
4) 상기 분자 검출 수단이 검출될 수 있을 경우, 검출 가능한 폴리머의 생성과 연관된 하나 이상의 미확정 마커 영역을 포함할 수 있는 일차 디지털 이미지 IK를 생성하기 위해 조직 절편을 스캐닝/이미지화하는 단계
를 포함하는 절차를 수행하는 단계 - 이에 의해 증가된 양의 미확정 마커 영역을 포함하는, k=1, ...,K에서의 일련의 K개의 일차 디지털 이미지 Ik가 얻어짐 - , 및
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 k=1, ...,K에서의 일련의 K개의 일차 디지털 이미지 Ik에 대해, 제 1 실시양태에 기재된 방법을 수행해서, 세포 구조를 시각화하는 이미지 Inew를 생성하는 단계를 포함한다.
제 2 실시양태의 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 분자 검출 수단은 항체의 세트이며, 바람직하게는 단클론 항체 또는 항체 단편(fragment)이고, 각각의 항체는 특정 세포 마커에 결합하고 효소가 각 항체에 결합되어 있고, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있고,
상기 단계 c)의 항목 1) 및 2)는,
i) 상기 단계 a)의 조직 절편이 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하고 - 상기 항체는 효소와 결합되어 있고, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있고 - ,
ii) 상기 단계 i) 후에, 상기 조직 절편은 미결합 항체를 제거하기 위해 세척되는
방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
iii) 상기 항목 2) 후에, 상기 조직 절편이 상기 효소를 위한 하나 이상의 적절한 기질에 노출되어, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우 검출 가능한 폴리머를 형성하게 되는
방식으로 수행된다.
제 2 실시양태의 방법의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 분자 검출 수단은 분자 복합체의 세트이고, 각각의 복합체는 특정 세포 마커에 결합하는, 바람직하게는 단클론 항체인 제 1 항체, 상기 제 1 항체에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 단클로 항체인 제 2 항체 또는 항체 단편, 및 상기 제 2 항체에 결합되어 있으며 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있는 효소를 포함하고,
상기 단계 c)의 항목 1) 및 2)는,
i) 상기 단계 a)의 조직 절편이 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합하는 제 1 항체와 접촉하고,
ii) 상기 단계 i) 후에, 상기 조직 절편은 미결합 항체를 제거하기 위해 세척되고,
iii) 상기 단계 ii) 후에, 상기 조직 절편이 상기 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체와 접촉하고 - 상기 제 2 항체는 효소와 결합되어 있으며, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시에 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있음 - ,
iv) 상기 단계 iii) 후에, 상기 조직 절편은 미결합된 항체를 제거하기 위해 세척되는
방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
v) 상기 항목 2) 후에, 상기 조직 절편이 상기 효소를 위한 하나 이상의 적절한 기질에 노출되어, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우 검출 가능한 폴리머를 형성하게 되는
방식으로 수행된다.
바람직하게는, 상기 효소는 서양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase) 등의 페록시다아제 및 알칼리 포스파타아제 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 기질은 3,3'-디아미노벤지딘, 페랑지 블루(Ferangi Blue), 발칸 패스트 레드(Vulcan Fast Red), 아미노에틸 카바졸(AEC), 및 비나 그린(Vina green)의 그룹으로부터 선택된다. 비나 그린은 특정 조건에서 적어도 부분적으로 수용성인 폴리머를 생성하는 기질의 일례이다. 아미노에틸 카바졸(AEC)은 특정 조건에서, 에탄올 등의 저알콜에서 적어도 부분적으로 용해성인 폴리머를 생성하는 기질의 예이다. 3,3'-디아미노벤지딘, 페랑지 블루, 및 발칸 패스트 레드는 불용성 폴리머를 생성하는 기질의 예이다.
이 방법을 실시하는 동안 다른 기질 및/또는 효소가 사용될 수 있음이 이해된다. 예를 들면, 디아미노벤지딘이 항목 2)의 제 1 실행에서 기질로서 사용될 수 있고, 발칸 패스트 레드가 항목 2)의 후속 실행에서 기질로서 이용될 수 있다.
제 2 실시양태의 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 분자 검출 수단은 검출부에 결합된 인식부를 포함하는 분자 복합체의 세트이고, 상기 인식부는 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 인식부는 다클론 항체, 단클론 항체 및 그 단편 등의 항체, 및 RNA 분자 및 DNA 분자 등의 핵산 분자의 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출부는 형광 색소이고, 상기 형광 색소는 방출되는 방사선과는 다른 개시 방사선에 노출 후에 특정 파장의 방사선을 방출할 수 있고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
상기 조직 절편 및 이에 결합된 임의의 분자 검출 수단이, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우에 특정 파장의 방사선을 방출하게 되는 개시 방사선에 노출되는 방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 4)는, 상기 특정 파장의 방사선이 방출될 경우 수행된다.
제 2 실시양태의 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서, 비나 그린 또는 아미노에틸 카바졸(AEC) 등의 검출 가능한 폴리머로서 적어도 부분적으로 용해성 폴리머를 생성하는 기질이 이용된다. 이 실시예는,
e) 상기 용해성 검출 가능한 폴리머를 제거하기 위해 상기 조직 절편을 세척하는 단계, 및
f) 새로운 일련의 분자 검출 수단으로 단계 b) - d)를 반복하는 단계를 더 포함한다.
이 실시예는 다량의 세포 마커의 존재가 평가될 때 유용하다.
제 3 실시양태에서, 본 발명은 조직학적 시료에서 동일한 3차원 공간 내의 다수의 세포 집단의 3차원 분포 및 세포 구조를 시각화하는 방법을 제공하고,
i) 종래의 공지된 방법으로, 조직 시료를 제공하고, 복수의 본래 중첩된 조직 절편에서 상기 시료를 절단하는 단계,
ii) 상기 단계 i)에서 얻어진 모든 조직 절편에 대해 제 2 실시양태에 따른 방법을 수행하는 단계, 및
iii) 공지된 원리에 따라 단계 ii)에서 얻어진 이미지를 중첩하여, 상기 조직학적 시료에서 동일한 3차원 공간 내의 다수의 세포 집단의 3차원 분포 및 세포 구조의 3차원적 시각화를 얻는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 실행하는 장치를 나타낸 도면이다.
도 2a-도 2b는 본 발명에 따른 일련의 이미지에서 마커 영역을 구별하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 3은 일차 디지털 이미지의 평가를 설명한 도면이다.
도 4는 조직 절편의 일련의 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5a-도 5b는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6a-도 6c는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 이미지에서 이미지 마커 영역의 서로 다른 시각적 고유 특징을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 그래픽 인터페이스를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 검출 프로세스를 나타낸 도면이다.
도 2a-도 2b는 본 발명에 따른 일련의 이미지에서 마커 영역을 구별하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 3은 일차 디지털 이미지의 평가를 설명한 도면이다.
도 4는 조직 절편의 일련의 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5a-도 5b는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6a-도 6c는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 이미지에서 이미지 마커 영역의 서로 다른 시각적 고유 특징을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 그래픽 인터페이스를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 검출 프로세스를 나타낸 도면이다.
정의
본 발명의 설명 및 특허청구범위에 있어서, 다음의 용어는 이하에 제시되는 정의에 따라 사용된다. 달리 정의하지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되는 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있다. 본원에서 사용되는 다음의 용어 각각은 이 절에서의 것과 연관된 의미를 갖는다. 기본 원리, 치환 및 범위에 대해 이하에 열거되는 특정 및 바람직한 값은 예시일뿐이고, 그들은 기본 원리 및 치환에 대해 정의된 범위 내의 다른 정의된 값을 배제하는 것은 아니다.
세포 마커(cell marker)란, 세포 유형에 따라 종종 세포 유형의 세포 표면뿐만 아니라, 때때로 세포 내에서 어느 정도 특이적으로 발생할 수 있는 특정 구조를 의미한다. 일반적으로, 세포 마커는 특정 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 수용체이다. 세포 마커는 단백질, 당단백질, 또는 탄수화물, 핵산, 지질 또는 다른 유형의 자연적으로 발생하는 생체 분자일 수 있다. 당업자는 이러한 세포 마커 및 이들이 발생하는 세포 유형을 주지하고 있다. 하나 이상의 이러한 세포 마커의 존재는 세포가 세포의 특정 클래스 또는 유형에 속함을 지시할 수 있다.
분자 검출 수단(molecular detection means)이란, 특정 세포 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 제 1 부분, 및 검출 가능한 반응을 일으킬 수 있는 제 2 부분을 포함하는 2 기능성 집합체 또는 복합체를 의미한다. 많은 다양한 유형의 분자 검출 수단이 본 발명에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 특정 세포 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 제 1 부분은 항체 또는 Fab 단편 등의 그 단편, 또는 나노보디, 또는 DNA 분자 또는 RNA 분자 등의 핵산 분자 또는 PNA 등의 핵산 유도체일 수 있다. 일반적으로, 검출할 수 있는 반응을 일으킬 수 있는 상기 제 2 부분은 특정 작용에 의한 유도 시, 형광 색소 등의 일부 종류의 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 효소 또는 화합물일 수 있다.
분자 검출 수단은, 가장 간단한 실시예에서, 효소 또는 형광 색소 등의 제 2 부분이 결합된 항체 또는 핵산 분자 등의 제 1 부분으로 구성될 수 있다. 또는, 적절한 분자 검출 수단은, 일반적으로 특정 세포 마커에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체인 제 1 엔티티(entity), 일반적으로 제 1 엔티티에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체인 제 2 엔티티, 및 제 2 엔티티에 결합되는 제 3 엔티티를 포함하는 복합물일 수 있고, 상기 제 3 엔티티는 특정 작용에 의한 유도 시 형광 색소 등의 일부 종류의 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 효소 또는 화합물일 수 있다.
검출 가능한 반응(detectable response)이란, 스캐닝/이미지화 단계에 의해 생성된 이미지 내에서 반응을 찾을 수 있는 방식으로 상기 스캐닝/이미지화 단계에서 검출될 수 있는 반응을 의미한다.
일 실시예에서, 검출 가능한 반응은 불투명 및/또는 착색 폴리머의 형성이다. 이러한 폴리머는, 적절한 조건 하에서 분자 검출 수단의 일부인 특정 효소를 특정 기질과 접촉시킴으로써 형성될 수 있다. 적절한 효소의 예로는 서양고추냉이 페록시다아제 등의 페록시다아제 및 알칼리 포스파타아제이다. 이러한 효소에 대한 적합한 기질의 예로는 3,3'-디아미노벤지딘, 페랑지 블루, 발칸 패스트 레드, 아미노에틸 카바졸(AEC), 및 비나(Vina) 그린이다.
다른 실시예에서, 검출 가능한 반응은 여기(excitation) 후에 플루오로포어(flourophore)에 의해 방출되는 방사선 등의 특정 파장의 방사선의 방출이다.
다른 실시예에서, 검출 가능한 반응의 다른 형태는 상기 방법의 단일 실행 내에서 이용된다.
일차 디지털 이미지(primary digital image)란, 조직 절편의 직접 디지털화(예를 들면 슬라이드 스캐닝 또는 마이크로 포토그래피)에 의해 얻어진 디지털 이미지를 의미한다. 이미지의 추가적인 적응, 편집 또는 평가는 이루어지지 않았다. 이러한 이미지는 원시 소스 데이터로 간주되어야 한다.
이차 디지털 이미지(secondary digital image)란, 일차 디지털 이미지의 일부 종류의 디지털 편집 또는 평가에 의해 얻어진 이미지를 의미한다. 이차 디지털 이미지는, 예를 들면 일차 디지털 이미지를 편집 및/또는 평가함으로써 얻어질 수 있다. 이에 의해 일차 디지털 이미지는 이차 디지털 이미지로서 재정의된다.
미확정 마커 영역(undetermined marker area)이란, 조직 절편의 일차 디지털 이미지에서 검출 가능한 요소 또는 구조를 의미한다. 미확정 마커 영역은 조직 절편 또는 조직 요소의 내인성 색소에서, 혈관 및 세포 소기관 등의 자연적으로 발생하는 불투명 구조 및 요소의 존재를 지시할 수 있다. 또한, 검출 가능한 폴리머 또는 형광 색소 등의 검출 가능한 마커 수단의 존재도 지시할 수 있으며, 이는 결과적으로 이러한 폴리머를 생성 및 여기 후의 검출 가능한 방사선의 방출을 발생시키는 분자 검출 수단에 의해 검출된 세포 마커의 존재를 지시한다.
이미지 마커 영역(image marker area)이란, 조직 절편의 이차 디지털 이미지의 영역을 의미한다. 이미지 마커 영역은 일차 디지털 이미지의 미확정 마커 영역의 전체 또는 일부에 해당한다. 이미지 마커 영역은 일차 디지털 이미지, 및 일차 디지털 이미지의 미확정 마커 영역을 평가하고, 지정된 선택 기준에 따라 이미지 마커 영역을 정의함으로써 얻어진다. 이미지 마커 영역을 포함하는 이차 디지털 이미지는 또한 각 이미지 마커 영역에 관한 정보를 포함하거나 그와 관련/연관되어 있다.
마커 영역의 형상(shape)이란, 영역의 외주의 형상을 의미한다. NIH(National Institute of Health)에 의해 제공되는 ImageJ 및 Adobe®에 의해 제공되는 Photoshop® 등의 소프트웨어에 포함된, 디지털 이미지의 영역의 형상을 판정하는 공지된 많은 방법이 있다.
이미지의 영역의 위치(location)란, 영역이 이미지에서 어느 위치를 가지는지를 의미한다. 다른 이미지에서 영역에 대한 동일한 위치(same location)란,
- 이미지에 대해 동등하게 구성된 좌표계와 관련하여 동일한 위치, 또는
- 2개의 이미지가 동일한 대상을 나타낼 경우, 나타난 대상에 있어서 대응하는 위치
를 의미한다.
선택 기준(selection criteria)이란, 이미지 마커 영역을 정의하기 위해 일차 디지털 이미지를 평가하는 데 사용될 수 있는 선택 기준을 의미한다. 이 기준은, 예를 들면 이미지에서 하나의 화소 또는 인접 화소의 그룹에 대한 색 및/또는 강도의 임계값을 포함할 수 있다. 선택 기준은 형상 기준, 색 기준, 크기 기준 또는 상세한 설명에 기재되고 당업자에 의해 이해되는 다른 유형의 기준을 포함할 수 있다. 또한, 본 방법을 실시하는 당업자가 특정 상황에 대해 파라미터 및 선택 기준을 최적화하는 것은 당연하다.
고유 특징(unique feature)이란, 다른 이미지 마커 영역과 구별되는 특정 유형으로 식별되는 하나 이상의 이미지 마커 영역의 특징을 의미한다. 고유 특징은 색, 기호, 형상, 라벨 등의 시각적 특징을 포함하거나 이미지 마커 영역과 해당 특정 유형(예를 들면 일차 세포 유형) 사이의 디지털 연관일 수 있다. 이 연관은, 예를 들면 데이터베이스에 저장된다. 고유 특징은 디지털 이미지의 특정 유형의 마커 영역을 다른 유형의 마커 영역과 구별하기 위한 임의의 다른 적절한 특징일 수 있다.
이러한 특징은 또한 고유 값으로 세분화될 수 있다. 예를 들면, 유사하지만 서로 다른 세포 마커를 검출하는 분자 검출 수단은 고유 특징(색 등)에 의해 식별될 수 있었고, 개별 세포 마커는 고유 값(상기 색의 뉘앙스 등)에 의해 식별될 수 있었다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 ESMS(Exclusion and Substraction-based Mutiple Staining)라는 기술에 관한 것이다. 이 기술은, 복수의 세포 유형 및 조직 구조가 식별될 수 있는 조직학적 조직 절편의 고해상도 이미지를 제공할 수 있게 한다. 복수의 세포 및 세포 유형에 대한 공간적 분석 방법은 공지의 기술로는 제공할 수 없는 조직 절편에 대한 유용한 공간적 정보를 제공하는 데 적용될 수 있다. 본 발명은 이러한 정보가 조직 절편의 분석 시 매우 가치가 있을 수 있다는 인식에 의거한다. 본 발명의 발명자는 간단하고 효율적인 방법으로 공간 정보를 포함하는 조직 절편의 이미지를 제공하는 기술을 고안했다. 이 기술은 또한, 조직 시료의 동일한 3차원 공간 내에서의 세포의 복잡한 상호 작용 및 조직 구조의 연구를 용이하게 하는 3차원의 고해상도 이미지 데이터를 제공 가능하게 한다.
이 방법은, 동일한 절편 내에서 다수의 마커 분포를 시각화하는 것뿐만 아니라, 조직 절편에서 구조 및 요소의 분포 패턴의 진보된 수학적 분석에 사용될 수 있는 정보를 추출하기 위한 기초를 제공하는 조직 절편의 합성 이미지를 제공한다. 이러한 정보의 예는, 세포 등의 요소간의 관계이거나, 또는 조직학적 구조 등의 종래의 푸른 배경 염색에 의해 드러나는 절편에서의 구조, 또는 조직 손상의 병소 영역, 발육 부전, 조직 리모델링 등의 정보이다.
본 발명은 조직학적 연구에서 분자 또는 구조를 검출하는 데 사용될 수 있는 임의의 조직 시료에서 출발하여 실시될 수 있다. 본 출원의 분자 검출의 예는, 면역 조직학적 방법에 관한 것이지만, 분자를 염색하는 다른 수단, 예를 들면 가시적 분자 결합화, 비항체 의존성 리간드 결합 기술, 또는 효소 조직 화학이 이용될 수 있다. 일반적으로, 분자 검출에 앞서, 조직 시료는 밤새 고정액(예를 들면, 4 % 완충 포름알데히드, pH 7.6)에 침지되고, 이어서 알코올(EtOH) 농도를 높인 일련의 용액에서 탈수되고, 마지막으로 크실렌에 침지된다. 탈수 단계 후, 탈수된 시료를 파라핀에 포매하여 정형의 파라핀-절단 마이크로톰으로 파라핀 절편이 생성된다. 파라핀 절편은 표준 현미경 유리 슬라이드에 재치되며 사용할 때까지 4℃에서 저장된다. 당업자는 다른 종류의 조직 절편에 대해 다른 적절한 고정제 및 고정 프로세스를 주지하고 있으며, 따라서 당업자는 크라이오(cryo) 절편 기술을 포함하여, 상술한 방법 이외의 다른 방법을 이용할 수 있다.
실제 면역 조직 화학(IHC라 약기함) 전에, 파라핀 절편은 탈파라핀화되고 일반적으로 열 유도 또는 효소 항원 회복을 받는다. 이러한 프로세스는 또한, 당업자에게 주지되어 있다.
탈파라핀 및 열 유도 항원 회복 후 얻은 조직 절편은 추가적인 특이적 검출이 실시된다. 이러한 조직 절편에 포함된 세포 유형 및 조직 유형을 판정할 수 있는 것은 중요하다. 이를 가능하게 하기 위해, 조직 절편에서 일부 특정 세포 마커의 발생을 체크한다.
다음 표 1은 본 발명에서의 사용에 적합한 면역 세포 마커 및 그들을 표현하는 세포의 일부 예를 열거한다.
표 1 : 조직하적 절편에서 세포의 IHC 검출을 위한 세포 마커
본 발명에 따라 조직 절편의 세포 마커의 존재를 판정할 때, 조직 절편은 상기 세포 마커에 특이적으로 결합하는 분자 검출 수단에 노출된다.
분자 검출 수단의 제 1 부분은, 특이적으로 결합하는 세포 마커와 연관된 자연적 리간드일 수 있다. 대체로서, 및 바람직하게는, 제 1 부분은 항체이며, 종종 단클론 항체 또는 그 단편일 수 있다.
일반적으로, 분자 검출 수단의 제 2 부분은 적절한 기질의 존재 시에 검출 가능한 폴리머를 생성할 수 있는 효소를 포함한다. 그러한 효소의 비제한적인 예로는, 서양고추냉이 페록시다아제 등의 페록시다아제 및 알칼리 포스파타아제이다. 페록시다아제는, 예를 들면 페록시다아제 기질 3,3'-디아미노벤지딘(DAB라 약기함)의 존재 시에 검출 가능한 갈색 착색 폴리머를 생성하고, 알칼리 포스파타아제는 페랑지 블루 및 발칸 패스트 레드의 존재 시에 검출 가능한 폴리머를 생성한다. 적어도 부분적으로 용해성인 폴리머를 생성하는 기질의 다른 비제한적인 예는 비나 그린이다. 비나 그린으로부터 얻어지는 폴리머는 특정 조건에서 수용성이다. 적어도 부분적으로 용해성인 폴리머를 생성하는 기질의 다른 비제한적인 예는 아미노에틸 카바졸(AEC)이다. 아미노에틸 카바졸로부터 얻어지는 폴리머는 특정 조건에서 에탄올 등의 저(低)알코올 용해성이다. 다른 기질은 다른 유체에 의해 용해성인 폴리머를 생성할 수 있다.
당업자는 그러한 다른 적절한 효소 및 기질을 찾아 낼 수 있거나, 효소를 대신하여 형광 색소가 면역 형광 현미경에 의해 마커 분자를 시각화하는 데 사용될 수 있음을 또한 알 것이다.
분자 검출 수단은 세포 마커에 결합하는 항체 및 페록시다아제 또는 알칼리성 포스파타아제 등의 효소를 일반적으로 포함하는 단일 복합체로 제공될 수 있으며, 여기에서 항체 및 효소는 화학 결합기에 의해 결합된다. 대체로서, 및 보다 바람직하게는, 분자 검출 수단은, 제 1 단클론 또는 다클론 항체 또는 그 단편 및 알칼리 포스파타아제 또는 페록시다아제 등의 효소에 화학적으로 결합된 제 2 항체 또는 그 단편을 포함하는 분자 집합체로서 제공된다. 제 2 분자 항체 또는 그 단편은 제 1 일차 항체 또는 그 단편에 특이적으로 결합하여, 분자 집합체를 형성한다.
본 발명의 방법은 조직 절편의 요소 및 구조를 구별하는 방법을 제공하고 그에 따라 이러한 일련의 분자 검출 수단이 사용된다. 서로 다른 세포 유형 및 조직으로부터의 세포 마커의 기본적인 지식뿐만 아니라 조직 절편이 취해진 기관 또는 조직 유형에 따라, 당업자는 조직 절편의 세포 및 조직 유형을 구별하는 데 이용되는 적절한 일련의 분자 검출 수단을 설계할 수 있다.
분자 검출 수단의 서로 다른 유형이 본 발명의 방법의 단일 실행에서 조합될 수 있음이 이해된다. 이는, 일차 디지털 이미지의 이미지 분석 동안에 요소 및 구조가 서로에게서 및 그 주변과 보다 쉽게 구별될 수 있으므로 유익할 수 있다.
본 발명에 따르면, 조직 절편에 대한 다음의 검출 프로세스가, 한 번에 일련의 상기 분자 검출 수단의 하나의 분자 검출 수단으로 실시된다.
1) 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적 결합을 일으키는 상기 특정 분자 검출 수단과 단계 a)의 상기 조직 절편을 접촉,
2) 임의의 세포 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 상기 조직 절편을 세척,
3) 검출 가능한 폴리머의 생성을 일으키는 적절한 기질을 추가,
4) 잔류 기질을 제거하기 위해 조직 절편을 세척, 및
5) 하나 이상의 미확정 이미지 마커 영역 또는 검출 가능한 폴리머의 생성과 연관된 영역을 포함할 수 있는 일차 디지털 이미지를 생성하기 위해 조직 절편을 스캐닝/이미지화.
검출 프로세스는 도 8에서의 방법과 같이 예시되며, 이 방법은
- 조직 절편을 제공(811),
- 분자 검출 수단을 제공(812),
- 상기 단계 1)에 개시된 바와 같이 조직 절편을 분자 검출 수단과 접촉(813),
- 상기 단계 2)에 개시된 바와 같이 조직 절편을 세척(814),
- 상기 단계 3)에 개시된 바와 같이 적절한 기질을 추가(815),
- 상기 단계 4)에 개시된 바와 같이 조직 절편을 세척(816), 및
- 상기 단계 5)에 개시된 바와 같이 조직 절편을 이미지화(817)
단계들을 포함한다.
단계 821-817을 반복함으로써, 821에 의해 나타나는 바와 같이, 서로 다른 분자 검출 수단 및 서로 다른 일차 세포 유형에 적합한 기질에 대해, 단계 817에서 생성된 이미지를 포함하는 일련의 이미지가 제공된다. 이러한 일련의 이미지의 예는 차후에 보다 상세히 설명하는 도 4에 의해 예시된다.
검출 프로세스의 단계 5로서 포함되는 스캐닝/시각화 단계는 조직 절편용 임의의 상용 슬라이드 스캐닝 장비, 디지털 카메라를 구비한 현미경 또는 전측(whole side) 스캐너 로봇으로 수행될 수 있었다.
반복 단계 812-817은 자동으로 수행될 수 있다. 비제한적인 예로서, 소위 슬라이드 챔버 기술이 반복 단계에 이용될 수 있다. 슬라이드 챔버 기술에서, 조직 절편은 분자 검출 수단, 세척 유체 등이 통과할 수 있는 마이크로 구획부에 배치된다. 따라서, 서로 다른 단계 812-817은 촬상 수단에 대해 조직 시료를 이동시킬 필요 없이 수행될 수 있다. 따라서, 조직 시료의 정확히 동일한 부분을 개시하며 병소의 동일한 깊이를 갖는 등의 동일한 이미지 특징을 갖는 일차 이미지가 제공될 수 있다. 또한, 이 방법은 보다 시간 효율적이고 수동 취급 또는 상호 작용을 필요로 하지 않고 수행될 수 있다. 당업자는 본 방법이 또한 다른 자동화 기술 수단에 의해 수행될 수 있음을 이해한다.
검출 프로세스는 일련의 모든 분자 검출 수단에 대해 행해질 경우, 증가된 양의 착색 스폿이 있는 일련의 이미지가 얻어진다. 적은 양의 분자 검출 수단으로의 처리에 대응하는 제 1 이미지는 적은 스폿만을 포함할 수 있다. 한편, 마지막 이미지는 다수의 스폿을 포함하고, 일부 스폿은 융합되어 큰 착색 영역으로 확대되었을 수도 있다.
일 실시예에서, 일련의 이미지가 이하의 검출 프로세스에 따라 조직 절편을 이미지화함으로써 제공될 수 있다.
1) 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 분자에의 특이적 결합을 일으키는 특정 분자 검출 수단과 조직 절편을 접촉,
2) 임의의 세포 표면 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 조직 절편을 세척,
3) 일차 검출 항체를 인식하는 이차 항체 등의 적절한 검출 시약을 추가(일반적으로 이차 항체는 효소, 예를 들면 페록시다아제라 레이블됨),
4) 임의의 세포 표면 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 조직 절편을 세척,
5) 검출 가능한 폴리머의 생성을 일으키는 효소 기질을 추가,
6) 잔류 기질을 제거하기 위해 조직 절편을 세척, 및
7) 검출 가능한 폴리머의 생성과 연관된 하나 이상의 미확정 마커 영역을 포함할 수 있는 일차 디지털 이미지를 생성하기 위해 조직 절편을 스캐닝/이미지화.
상기 표 1에 지시된 바와 같이, 일부 세포 표면 마커는 제한된 범위의 세포와 연관되는 반면, 다른 마커는 더 넓은 범위에서 일어난다. 표 1에서, 예를 들면, CD20는 주로 B 림프구에 연관됨을 유념한다. 대조적으로, CD123는 실질적으로 더 큰 범위의 세포 유형과 연관된다. 상기 일련의 분자 검출 수단을 마련할 경우, 일련의 분자 검출 수단의 초기에 있어, 적은 양의 세포 유형에만, 바람직하게는 하나의 세포 유형에만 특이적인 분자 검출 수단을 포함하는 것이 유익하다. 이어서, 제 1 분자 검출 수단과 연관되며 검출되는 교란 세포 유형 및 구조는, 차후에 보다 일반적인 분자 검출 수단을 사용하여 세포 유형 및 구조를 판정할 때 배제될 수 있어 세포 식별의 정확성이 증가된다. 이 정보에 의거하여, 적절한 일련의 분자 검출 마커를 인식하는 것은 당업자에게 용이하다.
세포 표면 마커에 결합하는 일련의 분자 검출 수단의 다음의 예가 양호한 결과를 제공함이 밝혀졌다.
A : 향상된 세포 식별을 갖는 10 백혈구 집단의 동시 검출
B : 다수의 조직학적 조직 구획부의 동시 확인
C : 기도의 중요한 조직학적 조직 구획부 및 손상/회복의 조직 영역과 관련해서 백혈구 침투 패턴의 분석
E: 조직 수지상 세포(DC) 집단의 향상된 식별
* 향상된 세포 식별에 관련된 양성 및 음성 마커만이 윤곽이 나타난다(기술적으로, 임의의 단계에서 염색되는 세포는 이전 염색 사이클에서 사용되는 모든 마커에 대해 음성임).
본 발명의 핵심은, 얻어진 일련의 이미지를 분석하고, 동일한 2차원 또는 3차원 공간에서 다수의 세포 집단 및 조직 구조 및 그들의 공간 관계를 시각화하는 추가적 정보를 포함하는 3차원적 묘사로 변환하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 이미지 분석 부분을 본 발명의 특정 실시예를 나타내는 첨부 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본원에서 제시된 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 이들 실시예는, 본 개시가 철저하고 완전하게 되고, 본 발명의 범위를 당업자에게 완전히 전달할 수 있도록 예시로서 제공된다. 전반에 걸쳐 동일한 부호는 동일한 요소를 말한다.
도 1은 본 발명에 따른 일련의 이미지에서의 영역을 구분하기 위해, 전반적으로 1이 부여되어 있는 디바이스를 나타낸 블록도이다. 이 디바이스는 프로세서(11) 및 메모리(12)를 포함하는 장치(10)를 포함한다. 장치(10)는 컴퓨터의 일부일 수 있다. 프로세서(11)는 이미지의 영역의 형상 및 위치를 등록하도록 마련될 수 있다. 이 형상 및 위치는, 이미지와 연관되어 또는 그와 관련되어, 예를 들면 메모리(12) 내의 데이터베이스에 저장될 수 있다. 프로세서(11)는 또한 소정의 선택 기준에 따라 이미지 마커 영역을 식별하기 위해 이미지를 평가하도록 마련될 수 있다. 프로세서(11)는 또한 두 이미지를 비교하여 하나의 이미지에는 존재하지만 다른 하나의 이미지에는 존재하지 않는 이미지 마커 영역을 식별하도록 마련될 수 있다. 프로세서(11)는 또한 다른 이미지에, 식별된 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖는 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하도록 마련될 수 있고, 이 삽입되는 마커는 고유 특징에 의해 다른 이미지에서 식별 가능하다.
일 실시예에서, 촬상부(13)는 장치(10)에 연결되어 있다. 촬상부(13)는, 예를 들면 디지털 CCD 카메라 및 슬라이드 스캐너 등의 디지털 스캐너이다. 또는, 장치(10)에 연결되는 촬상부(13)를 갖는 대신, 이미지를 갖고 있는 USB 메모리 등의 저장 매체를 연결함으로써, 장치(10)에 이미지가 제공될 수 있다. 제공되는 이미지는 메모리(12)에 저장될 수 있다.
출력부(14)는 장치(10)로부터 사용자에게 출력을 제공하기 위해 장치(10)에 연결될 수 있다. 출력부(14)는 예를 들면 컴퓨터 화면이나 휴대 전화 디스플레이 등의 디스플레이이다. 출력은 소프트웨어 인터페이스, 즉 이미지를 표시하는 그래픽 사용자 인터페이스인 것이 바람직하다. 장치(10)는 사용자 입력을 받는 입력부(15)를 더 포함하는 것이 바람직하다. 입력부(15)의 일반적인 예는 키패드 또는 데이터 연결 수단이다.
도 2a는 일반적으로 장치(10)에서 실행될 수 있는 일련의 이미지에서 마커의 영역을 구별하는 본 발명에 따른 방법을 나타낸다. 이 방법은 다음 단계를 포함한다.
- 소정의 선택 기준에 따라 이미지 마커 영역을 정의하기 위해, 일련의 일차 디지털 이미지를 평가하는 제 1 단계(211).
- 마커가 식별 가능하도록, 일련의 이미지에 의거하여 이전 단계 211에서 정의된 이미지 마커 영역에 대응하는 새로운 마커를 삽입함으로써, 새로운 이미지를 생성하는 제 2 단계(212).
이하, 이 방법을 도 2b 및 도 1을 참조하여 상세하게 설명한다.
단계(221)는 일련의 N개의 일차 디지털 이미지(I1, I2,...,IN)를 제공하는 것을 포함하고, 여기에서 N은 2 이상의 정수이다. 이 이미지는 장치(10)에 연결되는 촬상부(13) 또는 저장부(도시 생략)에 의해 제공된다.
일련의 N개의 일차 디지털 이미지는 다음의 검출 프로세스(또한, 상술되었고 도 8의 예시와 같음)에 따라 조직 절편을 이미지화함으로써 제공된다.
1) 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적 결합을 일으키는 특정 분자 검출 수단과 조직 절편을 접촉,
2) 임의의 세포 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 조직 절편을 세척,
3) 검출 가능한 폴리머의 생성을 일으키는 적절한 기질을 추가,
4) 잔류 기질을 제거하기 위해 조직 절편을 세척, 및
5) 검출 가능한 폴리머의 생성과 연관된 하나 이상의 소정의 마커 영역을 포함할 수 있는 일차 디지털 이미지를 생성하기 위해 조직 절편을 스캐닝/이미지화.
검출 프로세스는 원하는 횟수 반복된다. 단계 5(도 8의 단계 817에 해당)는 프로세스 사이클마다 일차 디지털 이미지를 생성한다. 따라서, N개의 사이클은 일련의 N개의 이미지를 생성한다.
이 프로세스 이미지를 생성하며, 이미지 In+1은 이미지 In(2≤n≤N)과 적어도 동일한 양의 미확정 이미지 마커 영역을 포함하며, 여기에서 n은 정수이다. 따라서, 일련의 이미지는 증가된 양의 미확정 마커 영역을 포함하며, 이미지 In은 최대 양의 미확정 마커 영역을 포함하고, I1은 최소 양의 미확정 마커 영역을 포함한다.
다음으로, 단계 222는 소정의 선택 기준에 따라 모든 이미지 In(1≤n≤N)을 평가하고, 이미지 마커 영역을 정의하는 것을 포함한다. 특히, 미확정 마커 영역이 평가된다. 소정의 선택 기준을 만족하는 이미지의 영역은 이미지 마커 영역으로서 정의된다. 앞서 정의 부분에서 언급한 바와 같이, 일반적으로 크기 기준, 형상 기준 및 색 기준이 있을 수 있다. 선택 기준은 평가 프로세스의 결과에 크게 영향을 미친다. 예를 들면, 크기에 대한 상대적으로 높은 임계값 레벨은 평가가 용이한 보다 선명한 이미지로 이어지지만, 작은 크기를 갖는 관련 구조는 검출되지 않을 위험이 있다. 따라서, 선택 기준의 결정 시, 연구하려고하는 조직 유형의 절편에 일반적으로 존재하는 세포 및 세포 구조에 대한 데이터를 고려하는 것이 바람직하다. 당업자는 이 지식을 갖고 있다.
하나의 영역은 하나 이상의 화소를 포함한다. 하나의 영역은 또한 이미지에서 복수의 인접한 화소로서 정의될 수 있다. 영역의 정의 방법은 소정의 선택 기준의 일부일 수 있다. 기준은 예를 들면 20개 이상의 화소 영역만이 이미지 마커 영역으로서 정의되는 기준을 포함할 수 있다. 다른 기준은 영역을 형성하는 화소가 특정 형상과 유사해야하는 것일 수 있다. 단계 222는 도 2a의 단계 211에 대응한다.
단계 223은 새로운 이차 디지털 이미지 Inew를 제공하는 것을 포함한다. 새로운 이미지는 일련의 이미지와 동일한 대상을 묘사할 수 있다. 특히, 새로운 이미지는 일련의 이미지에서 일차 디지털 이미지의 하나의 사본일 수 있다. 이러한 실시예에서, Inew는 일련의 이미지 중 하나의 이미지를 복사함으로써 생성될 수 있다.
새로운 이미지는 가능한 한 원래의 조직 시료에 가까운, 즉 임의의 검출 프로세스 사이클 전의 조직 시료를 묘사하는 것이 유익하다. 이는, 제 1 검출 프로세스 사이클이 행해지기 전에 조직 절편을 이미지화하고, 이에 따라 이미지 I0를 생성함으로써 달성될 수 있다. 이러한 실시예에서, 이미지 I0는 일련의 이미지를 제공하는 단계 221 전의 단계에서 제공될 수 있다.
또는, 새로운 이미지는 블랭크(blank), 즉 콘텐츠가 없는 이미지일 수 있다. 블랭크 이미지가 프로세서(11)에 의해 생성될 수 있다. 블랭크 이미지란, 예를 들면 모든 화소 값, 예를 들면 RGB 값이 0으로 설정된 이미지를 의미한다.
다른 대체 실시예에서, 헤마톡시린 등의 표준 대비 염색, 또는 조직 배경에 대한 귀중한 정보를 제공하며 후속 면역 조직 화학 및 검출 단계를 방해하지 않는 임의의 다른 염색으로 조직 시료를 초기 염색한 후 이미지를 촬상함으로써 새로운 이미지가 제공된다.
새로운 이미지가 예를 들면 촬상부 또는 메모리부로부터 제공될 수 있고 이 방법은 이러한 대안의 어느 하나에 제한되지 않음을 유념한다.
새로운 이미지 마커 영역은 임의의 순서로 Inew에 삽입될 수 있다.
새로운 이미지 Inew를 제공하는 단계 223은, 모든 이미지를 평가하는 단계 222 전에 또는 일련의 이미지를 제공하는 단계 221 전에 실시될 수 있으며, 이는 즉 새로운 이미지를 제공하는 단계가 그 이전 단계에 독립적일 수 있음을 유념한다.
단계 224는 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 것을 포함한다. 2≤n≤N인 이미지 In마다, 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 In-1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖는 Inew에 삽입된다. 이는, 각각의 이미지 In를 후속 이미지 In-1과 비교하고, In-1이 아닌 In에 존재하는 이미지 마커 영역을 식별함으로써 달성된다. 이 평가는 특정 순서로 n에 대해 행해질 필요가 없고 실제 적절하다고 발견된 어떠한 순서로도 행해질 수 있다. 그러나, 중요한 것은, 일련의 이미지의 순서가 유지되며 이미지 In-1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역만이 식별된다는 점이다.
새로운 이미지에서 동일한 형상 및 위치를 갖는 이미지 마커 영역을 비교하고 삽입하는 방법은 당업자에게 모두 주지되어 있는 많은 방법으로 수행될 수 있다. 예에서는 데이터 베이스에 형상 및/또는 위치 파라미터를 저장하고, 이미지 에디터 소프트웨어의 복사-붙여넣기 기능 등을 사용한다. 단계 224를 도 4-5와 관련하여 더 설명한다.
Inew에 삽입된 이미지 마커 영역은 또한 고유 특징, 특히 고유 특징의 고유 값에 의해 Inew에서 식별 가능해진다. 식별 가능한 특징은 Inew에 원래 존재하지 않는 특징이며, 예를 들면 색일 수 있다. 이 경우, 색의 고유 값은 특정의 고유 뉘앙스일 수 있다. 중요한 것은, 이미지 In를 생성하는 검출 프로세스 사이클에서 사용되는 특정 분자 검출 수단 및 결과적으로는 해당 요소 또는 구조에 값이 고유하다는 점이다. 고유 특징/값의 목적은 이들이 검출 프로세스의 서로 다른 사이클에서 비롯된 서로 다른 이미지 마커, 및 이에 따라 조직 절편의 서로 다른 요소/일차 세포 및 구조에 대한 서로 다른 분자 검출 수단을 구별하는 것이다. 일 실시예에서, 고유 특징은 새로운 이미지에서 시각적 마커이다. 일 실시예에서, 고유 특징은 일반적인 색이고 고유 특징의 고유 값은 특정 세포 마커와 연관된 특정 색이다.
다른 실시예에서, In으로부터 비롯되는 이미지 마커 영역에 대한 고유 특징은 검출 프로세스의 사이클 n에서 마크의 대상의 이미지 마커 영역과 해당 요소 및/또는 구조 사이의 디지털 연관/관련이다. 이 연관/관련은 메모리(12)의 연관된 데이터베이스 등에 이미지 In에 대한 연관/관련되어 저장된다.
이하, 소정의 선택 기준에 따라 이미지 마커 영역을 정의하기 위해 일련의 이미지를 평가하는 단계 211에 대해 도 3을 참조하여 설명한다.
도 3은 조직 시료를 묘사하는 일차 디지털 이미지 I1a를 나타낸다. 이 이미지는 도 8에 예시한 바와 마찬가지로 상술한 검출 프로세서의 사이클에서 비롯되었다. I1a는 조직 절편의 요소 및 구조에 대응하는 서로 다른 요소 및 구조를 포함한다. 교시적 이유로, 조직 시료의 요소 및 구조는 도 3에서의 단순 기하학적 형상으로 표현된다. 실제, 이미지는 일반적으로 수천의 요소 및 구조를 포함한다.
이 예에서, 검출 가능한 폴리머의 생성으로 인해 폴리머가 생성되는 영역에서의 색 변화가 야기되도록, 검출 프로세스가 선택되었다. 색 변화는 영역이 진해지는 것과 같은 것이다. 검출 프로세스(도 8의 단계 815)에 의해 영향을 받을 경우, 검출 가능한 폴리머의 생성이 발생된 영역은 미확정 마커 영역이라고 한다. 도 3에서, 미확정 마커 영역이 31a, 32a, 33a 및 34a에 의해 지시되어 있다.
이 영역은 검출 가능한 폴리머에 의해 생성되므로, 폴리머를 검출함으로써 식별될 수 있다.
본 실시예에서, 영역에서 검출 가능한 폴리머의 더 큰 발생은 영역을 보다 진하게 한다. 이상적인 검출 프로세스에서, 검출 가능한 폴리머의 생성은, 특정 분자 검출 수단의 선택 시 목표로 하는 요소와 관련해서만 존재한다. 그러나, 검출 가능한 폴리머는, 검출 항체(또는 분자 검출에 이용되는 구성 요소)의 교차 반응 및 비특이적 결합으로 인해서도 다른 영역에서도 빈번히 발생된다. 이미지는 검출 프로세스에 의해 영향을 받지 않은 미확정 마커 영역을 더 포함할 수 있다. "진짜" 요소 및 구조, 즉 특정 검출 프로세스 사이클에서 마크가 의도되는 요소 및 구조로부터 가장 가능성이 높게 비롯되는 영역을 선별하는 것이 바람직하다. 따라서, 일련의 이미지에서 각 이미지는 소정의 선택 기준에 따라 도 3의 스텝 310에 의해 예시되는 바와 같이 평가된다. 선택 기준은 특정 검출 프로세스에 맞춰 선택된다.
선택 기준은 다음과 같은 복수의 하위 기준을 포함할 수 있다.
- 색 임계값
- 색 간격
- 기하학적 특성(형상 및 크기 파라미터)
- 마크된 영역의 염색 패턴의 성질(예를 들면, 텍스처 파라미터; 입도, 거칠기, 매끄러운 균등 염색, 도트 염색 등).
- 위치(예를 들면, 앞선 비염색된 절편에서 또는 배경 조직 염색 후 식별될 수 있는 조직 구조와 관련하여).
- 이들 또는 유사한 기준을 이용하여 이미지를 평가하는 것은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 미국 NIH(National Institute of Health)에 의해 제공되는 ImageJ, 미국 Media Cybernetica에 의한 Image-Pro Plus, 덴마크 Visiopharm A/S에 의한 Visiomorph, 독일 Definiens AG에 의한 Definiens Tissue Studio, 미국 Aperio Technologies에 의한 Genie, 미국 Mathworks Inc에 의한 MATLAB, Adobe Photoshop 등의 소프트웨어를 이용하여 행해질 수 있다.
색 임계값이란, HLS(hue-lightness-saturation) 색 스케일 등의 색 스케일에서의 임계값을 의미하고, 특정 색 스케일의 임계값보다 위 또는 아래의 색 값을 갖는 화소가 선택 하위 기준을 만족한다.
색 간격이란, 200 ~ 230 등의 특정 간격 내의 RGB 색 스케일 이미지에 대한 R 값 등의 색 스케일 내의 간격을 의미한다. 화소가 간격 내의 화소 값을 갖는 영역은 선택 하위 기준을 만족한다.
색 임계값 및 색 간격 기준은, HSB 색 스케일 또는 HIS 색 스케일 등의 다른 색 스케일로도 적용 가능하다. 많은 다른 색 스케일이 또한 당업자에게 주지되어 있다.
기하학적 속성이란, 영역의 형상 및/또는 크기와 연관된 파라미터를 의미한다. 예로는, 원마도, 진원도, 길이, 불규칙성 파라미터 등이다. 형상 값 기준은 그 형상에 의해 허위 요소/구조로부터 진짜 요소/구조를 정의하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 신경은 가늘고 긴 형상을 가지며, 그에 의해 신경 검출 프로세스로부터 얻어지며 가늘고 긴 형상 이외의 다른 형상을 갖는 이미지의 미확정 마커 영역은 특정 이미지에 대한 이미지 마커 영역으로서 정의되는 것에서 배제될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 선택 기준의 다른 적절한 유형이 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 적절한이란, 특정 대응하는 검출 프로세스 사이클에서 목표로 하는 요소 및 구조로부터 가장 가능성이 높게 비롯되는 미확정 마커 영역을 선별하는 데 이 선택 기준이 적합한 것을 의미한다.
일 실시예에서, 선택 기준은 색, 텍스처, 크기, 또는 원마도 등의 시각적 속성에 대한 임계값을 포함한다. 시각적 속성이란, 마커 영역의 외관 특징의 몇 가지 유형을 의미한다. 속성은 시각적 속성이기 위해, 예를 들면 출력부에서 시각화될 필요는 없음을 유념한다.
선택 기준은 하나 이상의 상술한 기준 유형을 포함할 수 있다. 컬러 임계값 기준과 형상 값 기준의 조합 등의 서로 다른 유형의 기준의 조합이 구성될 수 있으며, 이 양쪽 기준은 이미지 마커 영역으로서 정의되기 위해 미확정 마커 영역에 의해 만족되어야 한다.
이 예에서, 선택 기준은 시각적 속성, 특히 색 임계값을 포함한다. 충분히 진한 색을 갖는 영역만이 이미지 마커 영역으로서 정의되며, 이에 따라 "진짜" 요소 및 구조에 상관된다라고 한다. 이 예는 그레이스케일 컬러만을 포함하므로, 색 임계값은 높은 강도를 갖는 모든 화소에 대해 그레이 스케일의 특정 값으로 설정될 수 있다. 0-1의 그레이스케일에서, 0은 검은 색에 대응하고 1은 흰색에 대응하며, 0.75의 임계값이 설정될 수 있다. 다른 색 스케일, 예를 들면 RGB 색 스케일의 이미지를 포함하는 다른 실시예에서, 임계값은 당업자에 의해 이해될 수 있는 대응 방법으로 설정될 수 있다.
서로 다른 선택 기준은 서로 다른 평가 결과를, 이에 따라 서로 다른 이차 이미지를 가져온다. 도 3의 본 예에서, 선택 기준은 미확정 마커 영역의 화소가 그레이스케일 색 임계값 이상이어야 하는 것을 포함한다. 평가에 의해, 이미지 마커 영역(31b)을 갖는 이차 디지털 이미지 I1b가 얻어진다. 이미지 마커 영역(31b)은, 선택 기준을 만족하는 미확정 마커 영역(31a)을 평가함으로써 정의된다. 다른 미확정 이미지 마커 영역(32a, 33a, 34a)은 선택 기준을 만족하지 못하므로, 이미지 마커 영역으로서 정의되지 않는다. 추가적인 단계 311에서, 예를 들면 평가된 마커 영역의 기하학적 공간 파라미터(좌표) 또는 형상 인덱스를 포함하는 평가 정보가, 연관 데이터베이스 내 등과 같이 이차 이미지 I1b 내에 또는 관련/연관되어 저장된다. 이러한 데이터베이스는 차후 이미지 마커 영역으로서 정의되는 어느 미확정 마커 영역에 대한 정보로 업데이트될 수 있다. 정보는 단계 224에서 새로운 이미지에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 데 사용될 수 있다.
이미지 I1b는 I1a와 정확히 동일한 이미지일 수 있거나 이미지 마커 영역에 의해 시각적 마크를 삽입하는 등과 같이 복사 및/또는 디지털적으로 편집될 수 있다. 그러나, 이차 디지털 이미지는 일차 디지털 이미지와 동일한 이미지인 것으로 제한되지 않는다.
이차 디지털 이미지와 일차 디지털 이미지 사이의 차이는, 이차 디지털 이미지는 이미지 마커 영역을 정의하기 위해 평가된 반면 일차 디지털 이미지는 원시의 미편집 및 미평가 데이터라는 점이다. 이 방법에서의 임의의 편집 또는 생성된 디지털 이미지를 이차 이미지라 하며, 이는 디지털 이미지화 또는 스캐닝으로부터 직접 얻어지는 어떠한 원시 이미지도 아니기 때문이다. 따라서, 예를 들면 본 발명의 단계 212 및 224에서 생성된 새로운 이미지도 이차 디지털 이미지라고 한다.
일 실시예에서, 사용자는 이미지 소프트웨어의 사용에 의해 일차 디지털 이미지를 평가하고, 특정 색 강도, 주위 위치 및/또는 형상 등의 소정의 선택 기준에 따라 이미지 마커 영역을 정의한다. 이 종류의 평가에 유용한 이미지 소프트웨어의 예는, 미국 Media Cybernetica에 의한 Image-Pro Plus, 덴마크 Visiopharm A/S에 의한 Visiomorph, 독일 Definiens AG에 의한 Definiens Tissue Studio, 및 미국 Mathworks Inc에 의한 Matlab이다.
이하, 정의된 이미지 마커 영역에 대응하는 식별 가능하고 카테고리화되는 새로운 마커를 삽입하여 새로운 이미지를 생성하는 단계 212를 도 4를 참조하여 설명한다.
도 4는 본 발명의 실시예의 일련의 이미지를 개시한다. 여기에서, 이미지 I1, I2, I3, I4는 일련의 N개의 이미지를 형성하며, 여기에서 N=4이다. 각 이미지의 도시된 오브젝트(object)는 조직 절편(또는 조직 절편의 일부)이다. 각 이미지는 동일한 조직 절편(동일한 부분)을 포함한다. 이미지는 각각 단계 211 및 단계 222에 따라 평가되었다.
각 이미지는 이미지 마커 영역을 포함하고: I1은 이미지 마커 영역(411a)을 포함하고, I2는 이미지 마커 영역(411b 및 421a)을 포함하고, I3은 이미지 마커 영역(411c, 421b, 431a, 및 432a)을 포함하고, I4는 이미지 마커 영역(411d, 421c, 431b, 432b, 441a, 및 442a)을 포함한다. 예를 들면, 위치 파라미터, 형상 파라미터, 색 값, 강도 값 등과 같은 이미지 마커 영역에 대한 정보는 이미지와 연관된 데이터베이스 등에, 이미지 자체 내에 또는 그와 관련/연관되어 저장되는 것이 바람직하다. 이러한 데이터베이스는 메모리(12) 내에 마련될 수 있다. 파라미터는, 예를 들면 도 3의 단계 311에 따라 저장된다(상술함).
이전에 개시된 바와 같이, 일련의 이미지에서 이미지는 적어도 동일하거나 일반적으로 증가된 양의 이미지 마커 영역을 포함한다. I4는 최대 양의 이미지 마커 영역을 포함하고, I1은 최소 양의 이미지 마커 영역을 포함한다. In은, n=2, 3 또는 4에서 In-1과 적어도 동일한 양의 이미지 마커 영역을 포함한다.
I4, I3 및/또는 연관 데이터베이스 내의 그들에 대한 관련 정보를 비교함으로써, 이미지 마커 영역(441a 및 442a)은 I3이 아닌 I4에 존재함을 알았다. 따라서, 단계 224에 따라 이미지 마커 영역(441a 및 442a)과 동일한 형상 및 위치를 갖는 새로운 이미지 마커 영역이 Inew에 삽입된다. 또한, 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징, 특히 고유 특징의 고유 값에 의해 식별 가능해진다.
도 5a 및 5b에서, 새로운 이미지의 예가 주어져 있다. 이들은 본 실시예에서 얻어질 수 있다. 도 5a에서 새로운 이미지 Inew는 예를 들면 I1 등의 이미지 I1-I4의 하나를 복사함으로써 제공된다. 도 5b에서, 새로운 이미지 Inew는 빈, 즉 어떠한 정보도 없는 이미지를 생성함으로써 제공된다.
상술한 바와 같이, 이미지 마커 영역(441a 및 442a)과 동일한 형상 및 위치를 갖는 새로운 이미지 마커 영역이 삽입된다. 도 5a-도 5b에서, 이들은 541 및 542라 한다.
도 5a-도 5b에서, 고유 특징은 시각적 마커이고 특정 그룹의 삽입 이미지 마커 영역에 대한 고유 패턴을 포함한다. 이미지 마커 영역(541 및 542)은 I3의 이미지화와 I4의 이미지화 사이의 검출 프로세스 사이클에서 마크되는 그룹 영역에 속한다. 이미지 마커 영역(541 및 542)에 대해서, 고유 특징의 시각적 마커는 도트 패턴이다.
이미지 마커 영역(441a 및 442a)과 동일한 형상 및 위치를 갖는 이미지 마커 영역(541 및 542)을 삽입하기 위해, 데이터베이스는 이미지 마커 영역(441a 및 442a)을 참조하는 정보를 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 이러한 정보는 도 3의 추가적인 단계 311에서 데이터베이스에 저장될 수 있다. 또한, 도 2b에 따른 방법은 소정의 선택 기준에 따라 식별된 각 이미지 마커 영역의 형상 및 위치를 등록하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 이미지 마커 영역(441a 및 442b)의 형상 및 위치를 알고 있음으로써, 새로운 이미지 마커 영역(541 및 542)이 삽입될 수 있다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 새로운 이미지 마커 영역은 일반적으로 당 기술 분야에서 공지된 다른 절차에 의해 새로운 이미지에 삽입될 수 있다.
I3을 I2와 비교함으로써, 이미지 마커 영역(431a 및 432a)은 I2에서가 아닌 I3에 존재하는 것으로서 식별된다. 새로운 이미지 마커 영역(531 및 532)은 이미지 마커 영역(431a 및 432a)과 동일한 형상 및 위치를 갖고 Inew에 삽입된다. 도 5a-도 5b에서, 531 및 532의 고유 특징의 시각적 마커는 채워진 패턴이다.
I2를 I1과 비교함으로써, 이미지 마커 영역(421a)은 I1에서가 아닌 I2에 존재하는 것으로서 식별된다. 새로운 이미지 마커 영역(521)은 이미지 마커 영역(521a)과 동일한 형상 및 위치를 갖고 Inew에 삽입된다. 도 5a 및 도 5b에서, 521의 고유 특징의 시각적 마커는 선들이 그어진 패턴이다.
I1은 검출 프로세스의 제 1 사이클의 결과이기 때문에, I1은 임의의 다른 이미지와 비교될 필요는 없다. 이 예에서, 이미지 마커 영역(411a)은 I1에서 존재하는 것으로 식별되며, 이에 따라 I1을 생성하는 검출 프로세스 사이클로부터 비롯된다. 새로운 마커 영역(511)은 411a와 동일한 형상 및 위치를 갖고 Inew에 삽입된다. 이미지 마커 영역(511)은 또한 고유 특징에 따라 식별 가능해진다. 도 5a 및 도 5b에서, 이미지 마커 영역(511)의 고유 특징의 시각적 마커는 사각형 패턴이다.
이에 의해, 새로운 이미지 Inew는 어느 검출 사이클 및 결과적으로 어느 세포 마커 및 일차 세포가 각각의 이미지 마커 영역을 나타내는지에 따라 카테고리화된 이미지 마커 영역을 포함하여 생성되었다. 본 발명의 방법에 의해, 다수의 세포 또는 조직 구조가 검출 프로세스의 동일한 유형의 반복을 이용하여 식별 및 카테고리화될 수 있다. 조직 요소 또는 구조를 마크하는 검출 가능한 폴리머 또는 형광 색소 등의 사용되는 마커는 그 자체로 고유할 필요는 없다. 특정 파장의 형광 색소 또는 검출 가능한 폴리머의 단일 유형이 검출 프로세스의 모든 주기에서 사용될 수 있고, 동일한 강도, 색 또는 발광 파장을 갖는 마커 영역을 생성할 수 있다. 이점은 예를 들면 도 4의 이미지 I4 및 도 5a의 Inew에 의해 나타나 있다. 공지된 기술을 이용하여, 다수의 검출 프로세스의 결과로 이미지 I4가 생성된다. 여기에서, 마커 영역을 서로 구별하는 것은 불가능하고, 즉 I4의 이미지 영역이 어느 유형의 일차 세포 또는 조직 구조를 나타내는지 알 수 없다. 그러나, 다수의 이미지화가 개시된 이미지 분석 방법과 조합되는 본 발명의 신규한 개념에 의해, 카테고리화를 갖는 이미지 마커 영역을 포함하는 이미지가 단순하고 효율적인 방법으로 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들면 동일한 절편 내에서 다수의 마커를 검출하는 한계 등의 공지된 기술의 많은 문제가 극복될 수 있다.
도 6a-6b는 본 발명에 따른 이미지 Inew에서 카테고리화된 이미지 마커 영역에 대한 고유 시각적 특징의 예를 나타낸다. 이미지는 요소 및 구조를 갖는 조직 시료를 도시한다. 이미지는 본 발명의 방법을 통해 제공되었다.
도 6a에서, 고유 특징은 서로 다른 패턴이다.
도 6b에서, 고유 특징은 색 그레이이고 고유 값은 그레이 색의 강도, 특히 서로 다른 그레이스케일 강도이다. 새로운 이미지는 서로 다른 색 등의 복수의 특징을 포함할 수 있고, 이러한 상기 색은, 값이 상기 서로 다른 색의 서로 다른 강도일 수 있는 고유 값으로 세분화될 수 있다.
도 6c에서, 고유 특징은 서로 다른 기호이다. 이 실시예에서, 기호는 문자이지만, 숫자, 기하학적 기호 등, 또는 그 조합에 상당할 수도 있다. 기호는 나타내는 이미지 마커 영역 근처의 디지털 이미지 Inew에 배치되어 어느 이미지 마커와 연관되는지를 명확히 한다.
앞서 언급한 바와 같이, 고유 특징은 반드시 새로운 이미지에 배치되는 시각적 특징일 필요는 없음을 유념한다. 시각적 마커를 대신하여 또는 그와 조합하여 고유 디지털 값 등의 디지털 정보일 수 있고, 그룹의 이미지 마커 영역은 서로 연관된다. 이러한 정보는 데이터베이스에, 바람직하게는, 이미지 마커 영역의 위치, 형상, 및 다른 염색 특징에 속하는 정보를 포함하여 상술한 데이터베이스에 저장될 수 있다.
도 7은, 전체적으로 7이 부여된 그래픽 인터페이스가 사용자에게 본 발명의 방법에 속하는 정보를 제공하는 데 사용되는 본 발명의 실시예를 나타내고 있다. 그래픽 인터페이스(7)를 제공하는 컴퓨터 프로그램은 메모리(12)에 저장되고 프로세서(11)에 의해 실행될 수 있다. 또는, 컴퓨터 프로그램은 USB 스틱 또는 CD-ROM 등의 임의의 적절한 저장부에 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 또한 본 발명에 따른 일련의 이미지에서 마커 영역을 구별하는 방법을 실행할 수 있다.
그래픽 인터페이스(7)는 장치(10)와 관련하여 컴퓨터 화면 등의 출력부(14)를 통해 사용자에게 제공되는 그래픽 윈도우(71)를 포함한다. 사용자는 장치(10)와 관련하여 컴퓨터 마우스 또는 키보드 등의 입력부(15)에 의해 선택 등의 입력을 컴퓨터 프로그램에 제공할 수 있다.
그래픽 윈도우(71)는 본 발명에 따른 방법에 의해 제공되는 새로운 이미지 Inew에 대응하는 이미지(72)를 포함한다. 이 실시예에서, 이미지(72)는 도 4-5와 동일한 조직 절편을 도시한다.
그래픽 윈도우(71)는 이미지(72)를 보는 방법에 적합한 적어도 하나의 박스(75)를 더 포함한다. 박스(75)는 서로 다른 택일 사이의 선택을 제공하기 위한 선택 박스(76)를 포함할 수 있다. 이 실시예에서, 박스(75)는 이미지(72)에서 어느 일차 세포 집단의 그룹을 강조할지의 선택을 제공한다. 선택 박스(76)에서 택일적 "B 림프구"를 선택함으로써, B 림프구 일차 세포와 연관된 이미지 마커 영역(751 및 752)이 강조된다. 이미지 마커 영역과 일차 세포 사이의 연관은 데이터베이스에 저장될 수 있고, 연관에 속하는 정보는 컴퓨터 프로그램에 의해 데이터베이스로부터 얻어질 수 있다. 데이터베이스는 상술한 바와 같이, 특히 단계 311에 의해, 본 발명에 따른 방법에 의해 달성될 수 있다. 박스(75)에 의해 제공된는 택일은 세포 유형의 일 유형만을 포함하는 것으로 제한되는 것이 아니고, 마찬가지로 또한 복수의 세포 유형의 그룹을 포함할 수 있다.
그래픽 윈도우(71)는 다수의 선택 박스, 또는 체크 박스, 다수의 선택 윈도우 등의 다른 적절한 적합 수단을 포함할 수 있다.
그래픽 윈도우(71)는 정보 박스(79)와 연관된 박스(77)를 더 포함한다. 정보 박스에서 제공되는 정보는 이미지(72)의 이미지 마커 영역과 연관된다. 정보는 이미지(72)의 이미지 마커 영역에 속하는 정보를 포함하는 데이터베이스에 의해 얻어질 수 있다. 선택 박스(77)는 선택 박스(78)를 포함한다. 사용자는 정보 박스(79)의 이미지 마커 영역에 대한 이러한 특정 정보를 나타내기 위해 서로 다른 정보 유형간에서 선택할 수 있다. 이 예시된 예에서, 사용자가 선택 박스(78)에서 택일적 "X, Y 좌표"를 선택함으로써 좌표를 나타내는 것을 선택했다. 선택 박스(76)에 의해 선택된 강조된 이미지 마커 영역(751 및 752)의 x, y 좌표에 속하는 정보가 정보 박스(79)에 의해 제공된다.
그래픽 인터페이스(7)는 많은 다양한 형태를 취하고 많은 서로 다른 기능을 포함할 수 있음은 물론이다. 따라서, 그래픽 인터페이스(7)에 의해 사용자에게 제공될 수 있는 이미지 마커 영역에 속하는 정보의 유형은 이 예로 제한되는 것은 아니다. 청구되는 방법에 의해, 사용자에게는 다음과 같은 정보가 제공될 수 있다.
- 임의의 마커 영역에 대해, 예를 들면 ㎛2로 표현된 영역
- 이미지 마커 영역에 대한 형상 값, 예를 들면 주변 길이 및 원마도
- 강도 값, 예를 들면 이미지 마커 영역의 화소의 평균 강도
- 이미지 내의 거리, 예를 들면 두 이미지 마커 영역 사이의 거리
- 이미지 마커 영역들 또는 마커 영역의 그룹 사이의 공간적 상관 관계, 예를 들면 소프트웨어에서 통계 알고리즘의 사용을 통해, 사용자는 예를 들면 B 림프구에 대응하는 마커 영역과 T 림프구의 세포 집단에 대응하는 동일한 조직 영역 내의 해당 마커 영역 사이의 공간적 관계에 대한 정보를 얻을 수 있다.
연속적으로 절단된 조직 절편(예를 들면, 30개의 연속적인 절편, 그 각각의 예를 들면 4㎛2의 고정 두께를 가짐)에 본 발명을 적용할 경우, 도 7에서 드러나는 것과 같은 유사한 그래픽 인터페이스가 또한 3차원 이미지의 이미지 마커 영역의 3차원 분포를 표시할 수도 있음을 유념한다. 마찬가지로, 사용자는 이어서 해당 x, y, 및 z 좌표 등의 이미지 마커 영역에 대한 3차원 정보를 얻을 수 있다. 3D 렌더링을 위한 일반적으로 알려진 알고리즘의 사용을 통해, 사용자는 마크된 세포 또는 조직 구조의 볼륨에 대한 계산(또는 그래픽 표시)을 얻을 수 있다.
컴퓨터 프로그램 및 그래픽 인터페이스(7)는 본 발명의 방법의 이미지로부터 추출될 수 있는 모든 정보를 사용자에게 제공하기 위한 수단으로서 보아야 한다. 예를 들면 데이터베이스에서 이러한 정보를 추출하고 저장하는 방법은 당업자에게 있어 일반적인 지식이다. 상기와 관련하여 설명된 특징을 달성하기 위해 컴퓨터 프로그램을 형성하는 방법도 당업자에 의해 달성될 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램은 상술한 특징에 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 이러한 디지털 이미지의 편집 및 리뷰 등의 주지의 특징을 더 포함할 수 있음을 유념한다. 그래픽 인터페이스(7)는 또한 일차 디지털 이미지의 평가를 행하는 기능을 더 포함할 수 있다.
요약하면, 본 출원은 일련의 디지털 이미지에서 영역을 구별하는 방법을 개시하며, 이 방법은, 미확정된 마커 영역을 포함하는 일련의 이미지를 제공하는 것, 소정의 선택 기준에 따라 1≤n≤N에서 모든 이미지 In을 평가하고 소정의 선택 기준을 만족하는 미확정된 마커 영역으로서 이미지 마커 영역을 정의하고, 새로운 이미지 Inew를 제공하고, 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 단계들을 포함하고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 In-1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 Inew에서 고유 특징에 의해 식별된다.
또한, 본 출원은 조직학적 시료의 조직 절편에서 세포 집단을 시각화하는 방법을 개시한다.
또한, 본 출원은 조직학적 시료에서 다수의 세포 집단의 3차원적 분포를 시각화하는 방법을 개시한다.
실시예
이하, 본 발명을 다음의 예를 참조하여 더 개시한다.
실시예 1 : 조직 처리, 샘플 준비, 및 절편의 생성.
다음의 인체 조직이 포함되었다.
- 인간 원위 결장 : 만성 염증 및 의심되는 비특이적 대장염으로 인한 외과적 절제.
- 만성 폐쇄성 폐 질환, COPD 및 낭포성 섬유증을 갖는 환자로부터의 인간 폐 조직 : 의심되는 폐암으로 인한 폐 절제, 분석되는 조직은 암의 영향을 받지 않았고 종양에서 가능한 한 떨어져서 얻어졌음.
- 인간 림프절 : 심한 COPD 또는 낭포성 섬유증으로 인해, 폐 이식과 관련하여 수집된 큰 배출 림프절.
- 인간 편도선 : 편도선염의 반복된 에피소드로 인해 정해진 편도 절제의 일부로서 수집.
모든 조직 유형으로부터의 시료(즉, 조직 블록)은 정해진 고정액(4% 완충된 포름알데히드, pH7.6)에의 침지에 의해 루틴 고정되었다. 하룻밤 고정 후, 샘플은 알코올(EtOH)의 농도를 증가시킨 일련의 용액에서 탈수했고, 최종적으로 크실렌에 침지했다. 탈수는 자동화된 탈수기(Shandon Hypercenter XP Tissue Processor, Shandon/ThermoFisher Sceintific, Waltham, 매사추세츠, 미국)에서 행해졌다. 그 후, 탈수된 시료는 파라핀 포매 머신을 이용하여 60 ℃에서 파라핀에 포매되었다. 파라핀 절편(4㎛)은 루틴 파라핀 절단 마이크로톰(Microm HM360 파라핀 마이크로톰, Microm, 독일)으로 생성되었고 표준 현미경 유리 슬라이드에 재치되었다. 이어서 절편을 사용할 때까지 4℃에서 저장했다.
예 2 : 일련의 디지털 이미지의 다수의 면역 조직 화학적 염색 및 생성.
면역 조직 화학적 염색은, DAKO REAL EnVision 검출 시스템을 갖는 자동화 면역 조직 화학적 로봇(Autostainer CL-클래식, Dako Cytomation, Glostrup, 덴마크), 일차 쥐 또는 토끼 항체(IHC 키트 Code K5007, Dako Cytomation, 덴마크, 상세히는 www.dako.com을 참조)의 검출을 위한 민감한 표준 방법을 이용하여 행해진다. 세포 특이적 항원(앞서 "세포 마커"라 함)을 검출하는 데 이용되는 일차 항체는 표 2에 열거되어 있고 정해진 병리 검사를 위해 준비된 인체 조직의 면역 조직 화학적 염색을 위해 상업적 생산자에 의해 권장되는 희석으로 절편(즉, 포르말린 고정 및 파라핀 포매 샘플로부터의 절편)에 적용된다. ESMS의 평가에 사용된 일련의 마커의 예를 표 3에 열거한다.
표 2. ESMS 기술의 실험적 검증에 사용되는 항체의 예
실제 면역 조직 화학 단계 전에, 파라핀 절편는 탈파라핀화하고 열 유도 항원 회복을 시켰다. 이 절차는 95℃의 피크 온도를 갖는 상용 및 프로그래머블 항원 회복기(Dako Cytomation으로부터의 PT Link, 덴마크) 및 Envision FLEX 표적 회복 용액, pH 6.1(Dako Cytomation)을 사용하여 수행되었다.
항원 회복 후, 슬라이드를 Autostainer Robot에 넣었다. 프로그램된 면역 조직 화학적 프로토콜은 다음과 같다.
1) 5분간 Envision FLEX 세척 완충액(pH7.6)으로 세척 단계.
2) (10분간) dH2O의 0.3 % H2O2에서 내생 페록시다아제의 블록(block).
3) 60분간 적절하게 희석된 일차 항체(표 2 참조)로 인큐베이션. 항체를 0.01 % 트윈 디터전트를 보충한 PBS 완충액으로 희석.
4) 5분간 Envision FLEX 세척 완충액(pH7.6)으로 린스 단계.
5) 이차 시약(부착된 검출 효소, HR 페록시다아제(HRP)로 덱스트란 폴리머에 링크된 항-쥐 및 항-토끼 항체)으로 30분간 인큐베이션.
6) 5분간 Envision FLEX 세척 완충액(pH7.6)으로 반복 린스 단계.
7) 10분간 HRP 효소 기질(디아미노벤지딘, DAB) 용액으로 인큐베이션.
8) 5분간 Envision FLEX 세척 완충액(pH7.6)으로 반복 린스 단계.
9) 봉입제로서 0.1% 트윈을 보충한 PBS 완충액을 이용하여 표준 슬립으로 현상 절편을 조심히 마운트했다.
10) 다음으로 각 절편의 염색 패턴의 정보가 디지털화되었다. 면역 반응성 부위에서 HRP 효소에 의해 형성된 갈색의 불용성 침전이 상용 전체 슬라이드 스캐너 로봇(Aperio Scanscope CS, Aperio Technology, 미국)을 사용하여 전체 절편에 걸쳐 촬상되었다. 디지털화는 ×20의 현미경 렌즈를 사용하여 행해졌고, 각 절편에 대해 생성된 초고해상도 이미지의 크기는 일반적으로 2-5 GB의 크기였다(및 원래 SVS 이미지 파일 포맷에서, 큰 SVS 이미지의 부분은 또한 Aperio에 의해 제공되는 ImageScope 소프트웨어에 의해 제공되는 내보내기 기능을 사용하여 TIFF 이미지로 내보내기되었음, 이하 참조).
11) 택일적으로, 또는 전체 슬라이드 디지털화를 보완하는 것으로서, 컬러 디지털 카메라(Olympus DP-50, Olympus, 일본)를 장착한 명시야 현미경(Nikon 80i Research Microscope, Nikon, 일본) 및 이미지 캡처 소프트웨어(Viewfinder Lite, v1.0, 2000, Pixera Co)를 이용하여 고배율(×400 또는 600, Tiff 또는 JPEG 이미지)로 절편으로부터 선택된 영역이 또한 촬상되었다.
12) 디지털화한 후, 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 슬라이드는 새로운 면역 조직 화학적 사이클(프로토콜의 단계 2에서 개시)에 들어가기 전에 완충액에서 린스되었다. 일부 경우에, 절편은 다음 염색 사이클에 들어가기 전에, 후속 염색 사이클에서 이전 일차 항체가 이차 검출 항체에 대해 인식 불가능하게 하는 차단 용액에 침지되었다. 항원 인식 부위의 파괴는 화학 수식(chemical modification)에 의해 행해졌다. 이 화학 수식은 두 가지 서로 다른 방법으로 행해졌다. 항원 인식 부위는 미국, CA, Concord, BioCARE로부터 변성 차단 용액 DNS001H를 이용하여 단백질 변성에 의해 파괴되었다. 또는, 항체는 효소적으로 절단될 수 있다.
13) 다음으로, 절편은 단계 2(상기 프로토콜에서 H2O2 블록)로 시작되는 새로운 염색 사이클에 들어갔다.
14) 마지막 마커의 면역 반응의 현상 및 사이클의 n 횟수 후에, 절편은 ddH20에서 린스되고, 카운터는 헤마톡실린(독일, Darmstadt, Merck, Htx)으로 염색되고, 일련의 알콜 용액 및 크실렌을 통해 탈수되고, 마지막으로, 상술한 바와 같이 디지털화되기 전에 Pertex 봉입제(스웨덴, Gothenburg, HistoLab)로 마운트된다.
표 3. ESMS 기술의 검증에 사용되는 마커 시리즈의 예
SMA = 알파 평활근 액틴, Chym = 키마제, Trypt = 트립타제, Cytok = 시토케라틴, NSE = 뉴런 특이적 에놀라아제
실시예 3 : 마커 특이적 염색 패턴의 컴퓨터화 이미지 분석 및 디코딩.
개시된 발명에 따라 일련의 일차 이미지에 대응하는 Aperio의 슬라이드 스캐너로부터 디지털화된 절편은 뷰 소프트웨어(Aperio ImageScope, 버전 10.0.35.1798, Aperio Technologies Inc.)를 이용하여 수동으로 검사되었다. 초기 평가에서 각 절편의 관심 영역이 보다 자세한 분석을 위해 선택되었다. ImageScope 소프트웨어에서 추출 및 내보내기 이미지 기능을 이용하여, 원시 이미지, 즉 일차 디지털 이미지가 TIFF 또는 JPEG 파일로서, 각 염색 사이클마다 하나의 이미지로서 내보내진다. 이와 함께, 이미지는 관심 영역마다 일련의 이미지를 형성했다.
일부 이미지에서, 갈색 DAB 침지의 분포 패턴은, 갈색 DAB 침지의 RGB 및 Hue 값 특성을 선택한 후 ImageScope 소프트웨어에 포함된 색 세분화 특징("양의 화소" 알고리즘)에 의해 내보내진 이미지 전에 미리 윤곽이 그려졌다.
갈색 면역 염색, 즉 이미지 마커 영역이 미리 ImageScope에서 윤곽이 그려져 있지 않을 경우에, 이것은 색 인식 기능을 갖는 쉽게 이용 가능한 소프트웨어(예를 들면, 미국, NIH(National Institute of Health) 버전 1.44ο, ImageJ, 미국 Adobe Systems Incorporated, 버전 11.0.2, Adobe Photoshop®CS4 Extended)를 이용하여 행해졌다. 검출되는 부위의 시각적 피드백을 통해, 각 세포의 유형의 일반적인 염색 패턴 및 염색 형태에 관한 지식을 가진자가, 최적의 검출이 이루어질 때까지 임계값을 미세 조정한다.
다음으로, 각 분자 검출 사이클 후에 생성되는 축적된 미확정 이미지 마커 영역이 생성된 일련의 이미지가 평가되었다. 이어서, 이미지 마커 영역은 디지털적으로 잘라져 검출 프로세스의 해당 주기에 고유한 가색(pseudo colour)을 부여했다. 마지막 이미지, 즉 일련의 N개의 이미지에서 이미지 N을 템플릿으로서 이용하여, 색 코드의 축적된 염색 도트, 즉 착색 이미지 마커 영역이 하위 순서로 템플릿에 복사-붙여넣기되었다(필요할 경우, 이 절차는, 기준점으로서 조직 윤곽을 사용함으로써 동일한 시리즈 내의 이미지 중에서 물리적 배향에서 때때로 약간의 차이에 대해 보정한 얼라인먼트 단계에 의해 진행되었음).
예를 들면, 7개의 이미지, 즉 7번의 검출 프로세스 사이클로부터 얻은 이미지 시리즈의 경우에, 모두 축적된 염색을 갖는 마지막 이미지(제 7)의 사본이 새로운 이미지 템플릿으로서 사용되었다. 일부 실시예에서, 마지막 일차 디지털 이미지를 생성하기 전에 비수성 봉입재에 조직 절편을 갖는 슬라이드가 마지막으로 최적으로 마운트되어, 최선의 형태성을 가지므로 마지막 것을 복사하는 것이 유익하다. 제 6 이미지의 이미지 마커 영역은 새로운 이미지에 복사-붙여넣기되었다. 따라서, 새로운 이미지에 이미 존재하는 이미지 마커 영역은 마스크되었고, 즉 제 7 검출 라운드에서 생성되지 않았던 마커 영역이 마스크되었다. 마찬가지로, 제 5 이미지의 이미지 마커 영역은 제 6 검출 프로세스 라운드에서 생성되지 않았던 모든 이미지 마커 영역을 마스크했다.
생성된 합성의 새로운 이미지는 결국 제 7 개의 구별되는 색을 디스플레이했고, 이미지 마커 영역의 각 그룹마다 하나는 서로 다른 염색 사이클, 즉 검출 프로세스 사이클로부터 비롯되었다.
정보는 (예를 들면, ImageJ 소프트웨어 또는 MATLAB®를 이용하여) 마커 색을 자동적으로 선택함으로써 새로운 이미지로부터 추출될 수 있고 이어서 "분석 입자 알고리즘", 또는 유사한 작업을 이용하여, 각각의 염색된 부위에 관한 상세한 정보(주변 길이, 면적, 형상 인덱스, 부위의 중심에 대한 x, y 좌표 등)를 생성한다. 또한, 이 기능은 개시된 그래픽 사용자 인터페이스(도 7에 도시)에 포함될 수 있다.
이미지 시리즈를 평가하여 합성 이미지를 생성하는 다른 접근 방법은 ImageJ(v 1.44)에 의해 제공되는 색 세분화 툴 및 분석 입자 툴 및 Image에 대해 자유롭게 이용 가능한 플러그인을 이용하는 것이었다. 환언하면, 일련의 각 이미지에는 다음의 절차가 행해졌다.
1) 갈색의 DAB 염색된 부위, 즉 이미지 마커 영역은 적절한 HSB(색조, 채도, 밝기) 임계값을 포함하는 선택 기준으로 이미지를 평가함으로써 색 기반의 세분화에 의해 세분화되었다.
2) 이미지는 이진 블랙/화이트 이미지로 변환되었다(즉, 이진화)
3) 단계 2)에서 변환된 이미지는 적절한 크기 제한으로 ImageJ(버전1.44)의 분석 입자 툴을 이용하여 평가되었고, 모든 이미지의 마커 영역, 즉 모든 염색된 마커 영역의 데이터 리스트, 즉 데이터베이스가 형성 및 저장되었다. 데이터 리스트는 모든 개별 이미지 마커 영역에 대해 x, y 좌표, 면적, 주변 길이, 진원도, 원마도, 평균 염색 강도 등을 포함했다. 프로그램은, 데이터 리스트의 동일한 부위에 대응하는 마커 영역 번호와 함께 마커 영역의 윤곽이 그려진 마크업(mark up)된 이미지를 자동으로 생성했다.
다음으로, 마커 영역 분포의 수치(즉, x, y 좌표)를 비교함으로써, 예를 들면 이미지 n-1이 아닌 이미지 n에 존재한 이미지 영역을 계산할 수 있었다. 이 접근 방법은 연속적인 이미지의 모든 쌍에 대해 행해지고, 이에 따라 각각의 새로운 분자 검출 사이클 후에 나타난 이미지 마커에 대한 정보를 생성했다. 마지막으로, 이 정보를 이용하여, 마지막 이미지로부터의 모든 축적된 마커 영역의 데이터 리스트와 함께, 새로운 합성 이미지를 생성할 수 있었다. ROI(Region Of Interest)-관리자를 활성화시킨 후에, 특정 분자 검출 사이클에 속하는 각 마커 영역은 대응하는 마그업된 이미지에서 특정 색이 부여되었다.
추출될 수 있는 정보의 이점을 설명하기 위해, 염증 조직 및 조직의 침투 면역 세포(백혈구)의 다수의 집단에 대한 염색의 경우를 생각한다. 종래의 정해진 절편에서는, 일반적으로 각 집단의 수만 세포가 있다. 다수의 백혈구 집단 내의 개별 세포에 대한 x, y 좌표를 추출하는 것은 세포 패턴의 새로운 유형의 강력한 분석을 실시하는 것을 가능하게 한다. 예를 들면, 공간 분석(공간 통계) 및 클러스터 분석의 상대적으로 새롭게 부상하고 있는 분야는 잠재적으로 질환 특이적 세포 집합체(침투 패턴), 서로 끌려지는거나 조직의 특정 마이크로 로컬화에 끌려지는 세포, 또는 세포의 특정 조합 등에 관한 정보를 얻는 데 행해질 수 있다.
Claims (14)
- 일련의 N개의 일차 디지털 이미지에서 영역을 구별하는 방법으로서,
N은 정수>1이고, 상기 방법에 의해 새로운 이미지를 생성하게 되고,
상기 방법은,
a) 미확정 마커 영역을 포함하는 일련의 N개의 일차 디지털 이미지를 제공하는 단계(221)로서, 이미지 In +1은 2≤n≤N에서 일차 디지털 이미지 In과 적어도 동일한 양의 미확정 마커 영역을 포함하고, 여기서 n은 정수인, 단계,
b) 소정의 선택 기준에 따라 1≤n≤N에서 모든 일차 디지털 이미지 In을 평가하고(211, 222, 310), 상기 소정의 선택 기준을 만족하는 미확정 마커 영역으로서 이미지 마커 영역을 정의하고, 이러한 임의의 이미지 마커 영역에 관한 정보를 결과로서의 대응하는 이차 디지털 이미지 내에 또는 그와 관련/연관하여 저장함(311)으로써, 일련의 N개의 이차 디지털 이미지를 얻는 단계,
c) 새로운 이미지 Inew를 제공하는 단계(223),
d) 단계 b)에서 얻어진 상기 일련의 이차 디지털 이미지의 2≤n≤N에서 모든 n에 대해, 상기 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 단계로서, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 In -1이 아닌 이미지 In에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징에 의해 Inew에서 식별 가능한, 단계, 및
e) 상기 새로운 이미지 Inew에 새로운 이미지 마커 영역을 삽입하는 단계(212, 224)로서, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 이미지 I1에 존재하는 이미지 마커 영역과 동일한 형상 및 위치를 갖고, 상기 새로운 이미지 마커 영역은 고유 특징에 의해 Inew에서 식별 가능한, 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 새로운 이미지 Inew를 제공하는 단계는 조직 시료의 이미지를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 2 항에 있어서,
상기 새로운 이미지 Inew는 상기 일련의 이미지 중 하나의 이미지의 사본인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 d) 및 단계 e)에서의 상기 고유 특징은 1≤n≤N에서 각 n에 대해 고유 값을 갖는 특징인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고유 특징은 일반적인 색이고, 상기 고유 특징의 상기 고유 값은 특정 세포 마커와 연관된 특정 색인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 소정의 선택 기준은 미확정 마커 영역의 시각적 속성에 대한 임계값을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 조직학 조직 절편 내의 세포 집단을 시각화하는 방법으로서,
a) 종래 공지의 방법으로 분자 염색이 준비된 조직 절편을 제공하는 단계(811),
b) 상기 단계 a)의 조직 절편에 존재할 수 있는 소정의 일련의 K개의 세포 마커의 멤버에 특이적으로 결합하여 검출하기 위한 일련의 K개의 특정 분자 검출 수단을 제공하는 단계(812)로서, 상기 분자 검출 수단은 개시 및 검출 가능한 반응의 형성을 일으킬 수 있고, K는 정수>2인, 단계,
c) 상기 단계 b)의 각각의 특정 분자 검출 수단 k = 1,2,..., K에 대해,
1) 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적 결합을 일으키는 상기 특정 분자 검출 수단과, 상기 단계 a)의 상기 조직 절편을 접촉시키는 단계(813),
2) 임의의 세포 마커에 결합되지 않은 분자 검출 수단을 제거하기 위해 상기 조직 절편을 세척하는 단계(814),
3) 상기 조직 절편의 세포 마커에 결합될 수 있었던 분자 검출 수단으로부터의 반응을 개시해서 상기 분자 검출 수단의 검출을 가능하게 하는 단계(815), 및
4) 상기 분자 검출 수단이 검출될 수 있을 경우, 검출 가능한 폴리머의 생성과 연관된 하나 이상의 미확정 마커 영역을 포함할 수 있는 일차 디지털 이미지 IK를 생성하기 위해 상기 조직 절편을 스캐닝/이미지화하는 단계(817)
를 포함하는 절차를 수행하는 단계로서, 이에 따라 증가된 양의 미확정 마커 영역을 포함하는, k=1, ...,K에서의 일련의 K개의 일차 디지털 이미지 Ik가 얻어지는, 단계, 및
d) 상기 단계 c)에서 얻어진 k=1, ...,K에서의 일련의 K개의 일차 디지털 이미지 Ik에 대해, 제 1 항에 기재된 방법을 수행하여, 세포 구조를 시각화하는 이미지 Inew를 생성하는 단계를 포함하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 분자 검출 수단은 항체의 세트이며, 바람직하게는 단클론 항체 또는 항체 단편(fragment)이고, 각각의 항체는 특정 세포 마커에 결합하고 효소가 각 항체에 결합되어 있고, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있고,
상기 단계 c)의 항목 1) 및 2)는,
i) 상기 단계 a)의 조직 절편이 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉하되, 상기 항체는 효소와 결합되어 있고, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있으며,
ii) 상기 단계 i) 후에, 상기 조직 절편은 미결합 항체를 제거하기 위해 세척되는
방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
iii) 상기 항목 2) 후에, 상기 조직 절편이 상기 효소를 위한 하나 이상의 적절한 기질에 노출되어, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우 검출 가능한 폴리머를 형성하게 되는
방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 분자 검출 수단은 분자 복합체의 세트이고, 각각의 복합체는 특정 세포 마커에 결합하는, 바람직하게는 단클론 항체인 제 1 항체, 상기 제 1 항체에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 단클론 항체인 제 2 항체 또는 항체 단편, 및 상기 제 2 항체에 결합되어 있으며 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있는 효소를 포함하고,
상기 단계 c)의 항목 1) 및 2)는,
i) 상기 단계 a)의 조직 절편이 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합하는 제 1 항체와 접촉하고,
ii) 상기 단계 i) 후에, 상기 조직 절편은 미결합 항체를 제거하기 위해 세척되고,
iii) 상기 단계 ii) 후에, 상기 조직 절편이 상기 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체와 접촉하되, 상기 제 2 항체는 효소와 결합되어 있으며, 상기 효소는 하나 이상의 적절한 기질의 존재 시에 검출 가능한 폴리머의 형성을 일으킬 수 있으며,
iv) 상기 단계 iii) 후에, 상기 조직 절편은 미결합된 항체를 제거하기 위해 세척되는
방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
v) 상기 항목 2) 후에, 상기 조직 절편이 상기 효소를 위한 하나 이상의 적절한 기질에 노출되어, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우 검출 가능한 폴리머를 형성하게 되는
방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 효소는 서양고추냉이 페록시다아제 등의 페록시다아제 및 알칼리 포스파타아제 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 기질은 3,3'-디아미노벤지딘, 페랑지 블루(Ferangi Blue), 발칸 패스트 레드(Vulcan Fast Red), 아미노에틸 카바졸(AEC), 및 비나 그린(Vina green)의 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 분자 검출 수단은 검출부에 결합된 인식부를 포함하는 분자 복합체의 세트이고, 상기 인식부는 상기 소정의 일련의 세포 마커의 특정 멤버에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 인식부는 다클론 항체, 단클론 항체 및 그 단편 등의 항체, 및 RNA 분자 및 DNA 분자 등의 핵산 분자의 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출부는 형광 색소이고, 상기 형광 색소는 방출되는 방사선과는 다른 개시 방사선에 노출 후에 특정 파장의 방사선을 방출할 수 있고,
상기 단계 c)의 항목 3)은,
상기 조직 절편 및 이에 결합된 임의의 분자 검출 수단이, 상기 소정의 일련의 세포 마커의 상기 특정 멤버가 상기 조직 절편에 존재할 경우에 특정 파장의 방사선을 방출하게 되는 개시 방사선에 노출되는 방식으로 수행되고,
상기 단계 c)의 항목 4)는, 상기 특정 파장의 방사선이 방출될 경우 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
비나 그린 또는 아미노에틸 카바졸(AEC) 등의 적어도 부분적으로 용해성 폴리머를 생성하는 기질이 검출 가능한 폴리머를 생성하는 기질로서 이용되고,
상기 방법은,
e) 상기 검출 가능한 폴리머를 제거하기 위해 상기 조직 절편을 세척하는 단계, 및
f) 새로운 일련의 분자 검출 수단으로 단계 b) - d)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 조직학적 시료에서 동일한 3차원 공간 내의 다수의 세포 집단의 3차원 분포 및 세포 구조를 시각화하는 방법으로서,
iv) 종래의 공지된 방법으로, 조직 시료를 제공하고, 복수의 본래 중첩된 조직 절편에서 상기 시료를 절단하는 단계,
v) 단계 i)에서 얻어진 모든 조직 절편에 대해 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계, 및
vi) 공지된 원리에 따라 단계 ii)에서 얻어진 이미지를 중첩하여, 조직학적 시료에서 동일한 3차원 공간 내의 다수의 세포 집단의 3차원 분포 및 세포 구조의 3차원적 시각화를 얻는 단계를 포함하는 방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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