JP6037149B2 - 頭頸部扁平上皮癌の治療に使用されるｃｄ４４に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

本発明は、一又は複数の癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）を使用する、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を予防し、治療し又は診断するための方法に関する。ある態様では、ＣＤＭＡＢは、ＣＤ４４に対して特異的な抗体である。癌を予防又は治療する手段として、本発明に係るＣＤＭＡＢを、場合によっては一又は複数の第２のＣＤＭＡＢ及び／又は化学療法剤と組合せて使用することを含む、併用治療法がまた開示される。

頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、通常、後期で発見される衰弱し死に至る疾患であり、毎年、アメリカ合衆国で５００００人の人々、世界中では５０００００人の個人が罹患している。ＨＮＳＣＣは、特に発声及び嚥下機能に関して、有意な罹患率を生じさせる疾患である。手術、放射線療法、化学療法、又はこれらの組合せが、治療選択肢として一般に利用できる。

手術、化学療法及び放射線の厳密な併用にもかかわらず、後期疾患に対する治癒率は、わずか３０％に達しているだけであり、再発が、標準的な治療後の失敗の最も一般的な原因として残ったままである（患者の４０％−５０％）。救援（サルベージ）療法は、第一選択治療と同じ治療選択肢からなる。しかしながら、姑息手術は、多くの場合困難で外観が美しくない。さらに、放射線治療は、めったに実用可能とならないか、有益ではなく、化学療法は、ＨＮＳＣＣ患者における生存率を実質的に改善しない。これらの患者にとっての予後は良好ではなく、再発後の生存期間中央値は、約６ヶ月にすぎない。

転帰不良は、腫瘍始原細胞又は癌幹細胞（ＣＳＣ）の無効殺傷による可能性がある。ＣＳＣは自己再生可能であり、分化した表現型及び制限された自己再生を有する子孫を生じさせる。正常な幹細胞と同様に、ＣＳＣは、生存優位性、例えば増加したＤＮＡ修復能力のために、化学療法及び放射線治療に対して耐性がある。実際、標準的な化学療法、例えばシスプラチン、及び放射線治療レジメンは、幹細胞集団を実際に増殖する。

ＣＤ４４は、腫瘍形成において重要な役割を担っている。膜貫通糖タンパク質、ＣＤ４４は、細胞外マトリックス及び細胞骨格タンパク質においてヒアルロン酸（ＨＡ）に結合する。ＣＤ４４、ＨＡ、細胞骨格成分、及びシグナル伝達分子、例えばサイクリンＤ１、ＥＧＦＲ、Ｒｈｏ及びＲａｓの間の相互作用により、増殖及び遊走が促進される。さらに、ＣＤ４４は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）により、膜から放出されて可溶型（ｓｏｌＣＤ４４）になるが、これは細胞遊走にとって重要なイベントである。また、ＣＤ４４は、乳癌、結腸直腸癌及びＨＮＳＣＣに見いだされる重要なＣＳＣマーカーであることが見いだされている。また、ＣＤ４４活性は、異種移植モデルにおいて腫瘍形成に活性を示すことが分かっている；ＣＤ４４＋ＨＮＳＣＣ腫瘍細胞は、易感染性マウスにおいて腫瘍化するが、コントロールＣＤ４４−ＨＮＳＣＣ腫瘍細胞は、同じモデルで腫瘍を生成した。

ＢＩＷＡ１とも命名されているＶＦＦ-１８は、ポリペプチドの３６０−３７０領域に特異的な、ＣＤ４４のｖ６変異体に対する高親和性抗体である。ＢＩＷＡ１の様々なバージョン又は誘導体は、癌の治療のための臨床試験を受けている。特に、ＢＩＷＡ１は、頭頸部の扁平上皮癌を有する１２名の患者において、安全性及びターゲティングの可能性の試験についての第１相臨床試験において、^９９ｍテクネチウム標識コンジュゲートとして使用されている。注射後４０時間で、注射された用量の１４パーセントが腫瘍に取り込まれ、他の器官、例えば腎臓、脾臓及び骨髄では最小の蓄積であった。高度に選択的な腫瘍結合性は、ＢＩＷＡ１の放射免疫療法における役割を示唆しており、この抗体の非常に高度な親和性が、腫瘍の深層への浸透を防止した。さらに、ＢＩＷＡ１は、有意に免疫原性であることが見いだされている。１２の研究の１１で、患者には、腫瘍のあらゆる場所で不均一な蓄積を示したヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)が生じており、抗体-可溶性ＣＤ４４複合体の形成に至る。

国際公開第０２／０９４８７９号には、ＢＩＷＡ４及びＢＩＷＡ８と命名された、ＨＡＭＡ反応を克服するように設計されたＶＦＦ-１８のヒト化型が開示されている。ＢＩＷＡ４は、親ＶＦＦ１８抗体と比較して、有意に低い抗原結合親和性を有していることが見いだされている。しかしながら、より低い親和性のＢＩＷＡ４抗体は、より高い親和性のＢＩＷＡ８に対して、優れた腫瘍取込特性を有することが示された。^９９ｍテクネチウム標識及び^１８６レニウム標識抗体の双方が、安全性、耐用性、腫瘍蓄積性を、また^１８６Ｒｅ-標識ＢＩＷＡ４については最大耐用量を決定するために、３３名の患者での第１相臨床試験において評価された。^９９ｍＴｃ標識ＢＩＷＡ４の腫瘍関連の取込があるようであった。如何なる用量の^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４でも腫瘍反応は観察されなかった。多くの患者は、研究の過程を通して安定（不変）を示したが、用量規制毒性が６０ｍＣｉ／ｍ^２で生じた。また、５０−６５パーセントの割合の有害事象が存在し、３３名の患者のうち１２名が、重度の有害事象（血小板減少症、白血球減少症及び発熱）を有すると判断された。さらに、これら１２名の患者のうち６名は、全て^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４で治療され、疾患進行のため、治療又は経過観察の過程で死亡した。また、２名の患者では、ヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）が生じた。従って、放射標識ＶＦＦ-１８は、如何なる臨床効果も示さなかった。

また、^１８６Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の第１相用量漸増試験を２０名の患者で実施した。口腔粘膜炎及び用量規制血小板減少症及び白血球減少症が観察された；１名の患者ではＨＡＨＡ反応が生じた。安定が、最も高い用量６０ｍＣｉ／ｍ^２で治療された５名の患者で見られた。この用量範囲では安全性及び耐用性の双方が許容可能であると思われるが、研究では、疾患の安定性のみという結果になった。さらに、これらの研究は、臨床研究における、他の非放射性同位元素コンジュゲート生物学的療法と比較して、高い割合の有害事象を有している。

米国特許出願第２００３／０１０３９８５号には、ＢＩＷＩ１と命名された、腫瘍治療に使用するために、メイタンシノイドにコンジュゲートしたＶＦＦ-１８のヒト化型（ＢＩＷＡ４）が開示されている。ＢＩＷＩ１は、外陰部のヒト類表皮癌、咽頭の扁平上皮癌及び乳癌のマウスモデルにおいて、有意な抗腫瘍効果を有することが見いだされている。未コンジュゲート型、すなわちＢＩＷＡ４は、抗腫瘍効果を示さなかった。コンジュゲートＢＩＷＩ１は、ヒトにおいて、安全性または効能の証拠がない。

Ｍａｂ Ｕ３６は、ＵＭ-ＳＣＣ-２２Ｂヒト下咽頭癌細胞での免疫化により生じたマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体で、癌及び組織特異性について選択されている。ｃＤＮＡクローニング及び配列分析を介した抗原の特徴付けにより、ケラチノサイト特異的ＣＤ４４スプライスバリアントエピカンのｖ６ドメイン内に存在するＭａｂ Ｕ３６のエピトープが同定された。免疫組織化学研究により、細胞膜に制限される認識エピトープが示されている。Ｍａｂ Ｕ３６は、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の９４パーセントを強く標識し、これらの腫瘍内は、細胞染色に均一性があった。

１０名の患者の^９９ｍＴｃ標識Ｍａｂ Ｕ３６研究では、ＨＮＳＣＣ癌に対して抗体の選択的蓄積（２日で、２０．４＋／−１２．４パーセントの注射用量／ｋｇ）が示された；何の有害作用も報告されていないが、２名の患者ではＨＡＭＡが生じていた。放射性ヨウ化マウスＭａｂ Ｕ３６の研究において、１８名の患者において３例のＨＡＭＡ、及びＨＮＳＣＣに選択的に均質な取込があった。Ｍａｂ Ｕ３６の抗原性を増加させ、ＨＡＭＡの比率を低減させるために、ＡＤＣＣ活性を示す、キメラ又は元来のマウスＭａｂ Ｕ３６のどちらも用いず、キメラ抗体を構築した。しかしながら、研究では、未標識Ｍａｂ Ｕ３６の抗癌活性の証拠は見いだせなかった。

^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂ Ｕ３６は、治療剤としての、Ｍａｂ Ｕ３６の有用性を決定するために使用した。この第１相用量漸増試験では、１３名の患者が、偵察用量の^９９ｍＴｃ標識キメラＭａｂ Ｕ３６、続いて^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂ Ｕ３６を受容した。しかしながら、治療後、用量規制骨髄毒性（１．５ＧＢｑ／ｍ^２）が、３名の患者のうち２名にあり、最大耐用性用量（１．０ＧＢｑ／ｍ^２）で治療された１名の患者に、血小板減少症が観察された。腫瘍サイズに対してある程度の効果があったが、これらの効果は、治療に対する奏効性についての基準を満たしていなかった。^１８６Ｒｅ標識キメラＭａｂ Ｕ３６のさらなる研究では、２．８Ｇｙに対して２倍の最大耐用活性まで、顆粒球コロニー刺激因子で刺激された全血の再注入を使用する方策を用いた。頭頸部の様々な腫瘍を有する９名の患者のこの研究では、薬剤関連貧血に対して３名が輸血を必要とした。他の毒性は、グレード３の骨髄毒性及びグレード２の粘膜炎を含む。安定は、５名の患者で３−５ヶ月の間に達成されたが、腫瘍の奏効は報告されなかった。

ＨＮＳＣＣ患者に対する予後不良、生活の質に対する疾患の影響、及び制限された治療選択肢のために、ＨＮＳＣＣに対する新規な治療法の開発には、かなりの関心と、切迫した需要がある。今日まで、ＨＮＳＣＣに効力のある、いわゆる「ネイキッド」（すなわち未コンジュゲート）抗ＣＤ４４抗体の報告はない。よって、ＣＤ４４は免疫治療のための潜在的な抗癌標的であると思われるところ、抗ＣＤ４４抗体が、抗癌効果を達成するためには放射性免疫コンジュゲートを必要とする。しかしながら、放射標識抗ＣＤ４４の研究では、達成される臨床効果に関連し、治療に付随して許容できない毒性が証明された。従って、新規なＨＮＳＣＣ特異的治療を開発する必要性がある。

本発明の基礎をなす技術的課題は、抗ＣＤ４４抗体、特にいくつかの態様では、未標識抗ＣＤ４４抗体を使用して、ＨＮＳＣＣを予防し、治療し又は診断する方法及び手段を提供することにある。

該技術的課題は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施態様の提供により解決される。

本発明は、抗ＣＤ４４抗体の使用を含む、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を予防し、治療し又は診断するための新規方法に関する。ある態様では、本発明は、ＣＤ４４の細胞外ドメインのアミノ末端ドメインに結合し、及び／又はヒトにおいて発現される一又は複数の、好ましくは多くのヒト変異体ＣＤ４４に免疫特異的に結合する抗ＣＤ４４抗体の使用を含む。特定の態様では、本発明は、受託番号ＰＴＡ-４６２１を有する、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成される抗ＣＤ４４抗体、及びその変異体及び／又は誘導体、例えばＰＴＡ-４６２１のキメラ及びヒト化型の使用を含む。本発明はさらにＰＴＡ-４６２１と結合について競合する抗体及びその抗原結合断片の使用を包含する。

本発明の方法に従って使用される抗体及び断片は、ＣＤ４４、特に細胞表面に発現するＣＤ４４に特異的であり、好ましくは、例えばＨＮＳＣＣ癌細胞の表面で発現したヒトＣＤ４４の一又は複数の変異体のアミノ末端細胞外ドメインに対して特異的である。ある種の態様では、ここで開示された方法に従って使用される抗体は、受託番号ＰＴＡ-４６２１を有し、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成される抗体のヒト化又はキメラ型である。特定の実施態様では、ここで開示された方法に従って使用される抗体、又はその抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＲＹＷＭＳ（配列番号：３）を有する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＥＶＮＰＤＳＴＳＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号：４）を有するＶ_ＨＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＰＮＹＹＧＳＲＹＨＹＹＡＭＤＹ（配列番号：５）を有するＶ_ＨＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号：６）を有する軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：７）を有するＶ_ＬＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＧＳＴＬＰＦＴ（配列番号：８）を有するＶ_ＬＣＤＲ３、
の一又は複数を含む。

また、本発明に包含される抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３の２又はそれ以上、３又はそれ以上、４又はそれ以上、５又はそれ以上、ある態様においては全てを含む。

本発明の方法に従って使用される抗体及び抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＴＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＶＮＰＤＳＴＳＩＮＹＴＰＳＬＫＤＱＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＤＬＱＭＳＫＶＳＳＥＤＴＡＬＹＹＣＴＲＰＮＹＹＧＳＲＹＨＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ(配列番号：１)を有するＶ_Ｈドメイン、及び／又は
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＮＣＲＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＴＩＳＮＬＥＫＥＤＶＡＴＹＦＣＱＱＧＳＴＬＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ(配列番号：２)を有するＶ_Ｌドメイン、
を含みうる。

ある態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含有する、抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片の使用を包含する。

本発明は、ＨＮＳＣＣを治療し、予防し又は診断するための、抗ＣＤ４４抗体、又はその抗原結合断片の使用をさらに包含し、ここで、抗ＣＤ４４抗体はヒト化されている。いくつかの態様では、ヒト化された抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片は、
アミノ酸配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＧＥＶＮＰＤＳＴＳＩＮＹＴＰＳＬＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＰＮＹＹＧＳＲＹＨＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：９)、又は
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＩＧＥＶＮＰＤＳＴＳＩＮＹＴＰＳＬＫＤＱＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＰＮＹＹＧＳＲＹＨＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：１０)
を有するＶ_Ｈドメイン、及び／又は
アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＳＴＬＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ(配列番号：１１)を有するＶ_Ｌドメイン
を含む。

特定の態様では、本発明は、被験者において、ＨＮＳＣＣを予防し、治療し又は診断する際に使用するための、ヒト化抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、該ヒト化抗ＣＤ４４抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含み、又はここで該抗ＣＤ４４抗体は、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含む。特定の態様では、被験者はヒトである。また本発明は、被験者におけるＨＮＳＣＣの予防、治療又は診断のための、ヒト化抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を提供し、ここで、該ヒト化抗ＣＤ４４抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含み、又はここで該抗ＣＤ４４抗体は、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含む。

ある態様では、本発明の方法に従って使用される抗体又は抗体断片は、アミノ酸配列ＡＦＤＧＰＩＴＩＴＩＶ（配列番号：１２）を有するＣＤ４４の細胞外領域のアミノ酸末端ドメイン内のエピトープを認識する。

本発明での使用のための抗ＣＤ４４抗体は、活性部分、例えば治療又はレポーター部分にコンジュゲートされうる。また、抗ＣＤ４４抗体は、患者からの造血細胞(hematogeneous cells)にコンジュゲートされうる。ある態様では、治療部分は、ＨＮＳＣＣの治療、予防又は診断に有益であることが、当該技術分野で知られている部分、例えば限定されるものではないが、細胞毒、酵素、放射性元素、サイトカイン、代謝拮抗剤、又はインターフェロンである。

また本発明は、単剤治療として、又は一又は複数の他の化学療法又は診断剤及び／又は治療法と組合せての、抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片の使用を含む。従って、本発明は、ＨＮＳＣＣのための標準的又は実験的治療レジメン（例えば、化学療法、放射免疫治療、放射線治療）と組合せての、抗ＣＤ４４抗体（例えば、ヒト化又はキメラ抗体）、又はその抗原結合断片の使用を含む。ＨＮＳＣＣを予防し、治療し又は診断するためのここで開示された方法に従い、ＣＤ４４特異的抗体又はその抗原結合断片と組合せて特に有用な治療剤の例には、限定されるものではないが、当該技術技術で知られている化学療法剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、及びホルモン類が含まれる。ここで開示された併用療法では、治療又は予防効果を達成するために、ＨＮＳＣＣを患っている被験者に、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片を投与する頻度を少なくし、及び／又は抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の投与量を少なくすることができる。ここで開示された方法に従い、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合部位は、一又は複数の他の化学療法剤又は診断剤と同時投与され、同時的に投与され、及び／又は逐次投与され得、又は放射線治療又は外科手術と併せて投与されうる。抗体、断片及び／又は付加的な薬剤又は治療の投与は、腫瘍部位に特定の薬剤又は治療を送達させるのに適した、当該技術分野で知られている任意の手段でありうる。このような投与は、非経口（例えば、ＩＶ、筋肉内又は皮下投与）、経口的であり得、又はある態様では、腫瘍部位又は腫瘍の発生又は再発が疑われる部位に直接送達されうる。また、抗体、断片及び／又は組成物は、徐放性製剤として投与されうる。

さらに、本発明は、（ｉ）ここで開示された抗ＣＤ４４抗体（例えば、キメラ又はヒト化抗体）、又はその抗原結合断片の治療的有効量と；（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含有する、被験者におけるＨＮＳＣＣの予防、治療又は診断のための薬学的組成物を提供する。

またここに開示されるものは、（ｉ）ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、又はその抗原結合断片を有効量、被験者からの生体試料と接触させ；（ｉｉ）該抗体又はその断片との結合性を検出するもので、バックグラウンド又は標準レベル以上での、該抗体又は断片の検出により、該被験者がＨＮＳＣＣを患っていると示されることを含む、このような疾患に罹患していることが疑われている被験者において、ＨＮＳＣＣを診断する方法が開示される。抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の検出は、当該技術分野で知られている検出可能マーカーの使用により補助されうる。また本発明は、ＨＮＳＣＣ細胞を含むことが知られているか又は疑われている被験者からの組織試料において、ＨＮＳＣＣを検出するための診断又は予後キットを含む。ある態様では、キットは、特にＨＮＳＣＣ細胞を含むことが知られているか又は疑われている被験者からの組織試料、及び／又はＨＮＳＣＣ細胞により発現された、ＣＤ４４を検出する手段を含む。キットは、（１）受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体、（２）受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体と結合について競合する抗体；（３）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３の一又は複数を含む抗体；又は（４）（１）、（２）又は（３）の抗体の抗原結合断片を含みうる。またキットは次の一又は複数を含みうる：生体試料、溶液又は固体形態でのバイオマーカー(類)の参照標準体(類)（例えば、抗体ＰＴＡ-４６２１により生成される抗体に特異的に結合するＣＤ４４又はペプチド）、バイオマーカーに特異的な一又は複数の抗体（例えば、抗体ＰＴＡ-４６２１、及びその抗原結合断片、又はその変異体又は誘導体）を保持するための基材又は容器、及びキットの内容物を用いてバイオマーカーとの検出アッセイ(群)を実施するための指示書。

さらに、抗体ＰＴＡ-４６２１又はその抗原結合断片を使用するＨＮＳＣＣの治療方法を教示することが本発明の目的である。抗体ＰＴＡ-４６２１又はその抗原結合断片を使用するＨＮＳＣＣの診断を教示することが本発明の他の目的である。ＨＮＳＣＣの予後又はステージ分類のためのＰＴＡ-４６２１又はその抗原結合断片の使用を教示することが、本発明のさらなる目的である。ＨＮＳＣＣの治療のための患者の選択のための、ＰＴＡ-４６２１又はその抗原結合断片の使用を教示することが本発明のさらなる目的である。

ある態様では、ここで開示された方法に従って使用される、抗ＣＤ４４抗体及びその抗原結合断片は、受託番号ＰＴＡ-４６２１を有し、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されるマウスモノクローナル抗体のＶ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインのアミノ酸と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である、Ｖ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインのアミノ酸配列を含んでいてよく、但し、抗ＣＤ４４抗体又は断片は、ＣＤ４４に対する結合特異性を示し、及び／又はＰＴＡ-４６２１と結合について競合する。また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び／又は配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインと、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である、Ｖ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインのアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を包含し、但し、抗ＣＤ４４抗体又は断片は、ＣＤ４４に対する結合特異性を示し、及び／又はＰＴＡ-４６２１と結合について競合する。ある態様では、本発明は、ＣＤ４４に特異的に結合し、受託番号ＰＴＡ-４６２１を有し、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されるマウスモノクローナル抗体の一又は複数のＣＤＲのアミノ酸と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である、一又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を含み、但し、該抗体又は断片は、ＣＤ４４に対する結合特異性を示し、及び／又はＰＴＡ-４６２１と結合について競合する。また本発明は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３の一又は複数と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である、一又は複数のＣＤＲのアミノ酸配列を含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を包含し、但し、該抗体又は断片は、ＣＤ４４に対する結合特異性を示し、及び／又はＰＴＡ-４６２１と結合について競合する。

また本発明は、ＣＤ４４に対して特異的であるか、又は抗体ＰＴＡ-４６２１と結合について競合するヒト化抗体及び抗体断片の使用を包含し、ここで、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域の一又は複数のＣＤＲの一又は複数の領域が、例えばクローンＰＴＡ-４６２１により生成されるマウスモノクローナル抗体の、ＣＤ４４に特異的に結合するドナーモノクローナル抗体の一又は複数のＣＤＲの類似部分に置き換えられている。好ましくは、ヒト化抗体は、ドナーマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。当業者であれば、本発明が、一般的に抗体のＣＤＲグラフティングを含むことを理解するであろう。特定の態様では、本発明は、ＣＤ４４に特異的に結合し、及び／又はＰＴＡ-４６２１と結合について競合するヒト化抗体又は抗体断片の使用を包含し、ここでヒト化抗体又は抗体断片は、配列番号：９又は配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び／又は配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインと、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である。

ここで開示された方法に従って使用される、抗ＣＤ４４抗体及び抗原結合断片は、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１のＶ_Ｈドメイン、完全重鎖、Ｖ_Ｌドメイン又は完全軽鎖をコードするヌクレオチド配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列によりコードされうる。他の態様では、本発明は、配列番号：１、配列番号：９又は配列番号：１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする、核酸配列によりコードされるＶ_Ｈドメインを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を含む。他の態様では、本発明は、配列番号：２又は配列番号：１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする、核酸配列によりコードされるＶ_Ｌドメインを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を含む。本発明は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３の一又は複数をコードする核酸配列、又はマウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１の一又は複数のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列に対して、緊縮条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列によりコードされる一又は複数のＣＤＲを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を含む。緊縮ハイブリダイゼーション条件は、限定されるものではないが、（ｉ）約４５℃での６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での、フィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０−６５℃での、０．２Ｘ ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにおける一又は複数の洗浄；（ｉｉ）高度な緊縮条件、例えば約４５℃での６Ｘ ＳＳＣにおける、フィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約６０℃での、０．１Ｘ ＳＳＣ／０．２％のＳＤＳにおける一又は複数の洗浄、又は（ｉｉｉ）当業者に知られている任意の他の緊縮ハイブリダイゼーション条件が含まれる。

また本発明は、ここで開示された核酸（抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片のＶ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン及び／又は一又は複数のＣＤＲをコードする核酸）を含むベクターの使用に関する。ある実施態様では、前記ベクターは発現ベクターであり、ここで記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列は、コードされたアミノ酸配列の適切な発現に必要な、核酸制御配列又はアミノ酸制御配列をコードする配列（例えば、転写、翻訳、転座シグナル）に、作用可能に結合している。さらに本発明は、ここで開示された抗体又は抗体断片をコードするヌクレオチド配列又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明の他の目的及び利点は、例証及び実施例、この発明の所定の実施態様により記載される以下の記載から明らかになるであろう。

(定義)
一般に、以下の用語又は語句は、概要、説明、実施例、及び特許請求の範囲で使用される場合、示した定義を有する。

「抗体」なる用語は、最も広義に使用され、例えば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体、脱免疫化(de-immunized)、マウス、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、単鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、免疫-コンジュゲート、合成抗体、ラクダ化(camelized)抗体、単鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')断片、ジスルフィド結合断片、細胞内抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗抗Ｉｄ抗体）、及び上述のいずれかのエピトープ結合断片を特に包含する。特に、抗体には、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子を包含する。

「抗体断片」又は「抗原結合断片」には、インタクトな抗体の一部で、好ましくは、その抗原結合又はエピトープ結合、又はその可変領域を含むものが含まれる。抗体断片の例には、全長未満の抗体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')_２、並びに抗体可変ドメインのコンストラクト、例えばＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；融合タンパク質、組換えタンパク質及び多重特異性抗体で、抗体断片から形成されたものが含まれる。

非ヒト（例えばマウス）抗体／免疫グロブリンの「ヒト化」及び／又は「キメラ」型とは、元々の抗体と比較して、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）又はヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）応答の低減を生じる特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、又は抗体の他の抗原結合サブシーケンス）を含む抗体を意味し、前記非ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を同時に保持しながら、所望の効果を再現するのに必要な前記非ヒト免疫グロブリンから誘導された必要な部分（例えば、ＣＤＲ、抗原結合領域、可変ドメイン等）を含む。殆どの部分において、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の補体決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力(例えば、ＣＤ４４に対する特異性)を有する非ヒト種(ドナー抗体)の補体決定領域の残基に置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲ又はＦＲ配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練し、最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含む。

ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、Kabatら, Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)に従った、軽鎖可変ドメイン中の残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３））からのアミノ酸残基、及び／又は「高頻度可変ループ」（つまり、軽鎖可変ドメイン中の残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）と、重鎖可変ドメイン中の２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及び Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))からの残基を含む。「フレームワーク領域」あるいは「ＦＲ」残基は、ここに定義される高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。ここで使用される場合、「重鎖可変ドメイン」、「Ｖ_Ｈドメイン」及び／又は「Ｖ_Ｈ」は、交換可能に使用され、抗体の重鎖の高頻度可変領域(ＣＤＲ及びフレームワークドメインの双方を含む)を言及し；「軽鎖可変ドメイン」、「Ｖ_Ｌドメイン」及び／又は「Ｖ_Ｌ」は、交換可能に使用され、抗体の重鎖の高頻度可変領域(ＣＤＲ及びフレームワークドメインの双方を含む)に言及する。

本明細書を通して、ハイブリドーマ細胞株、並びにそこから生成されるモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ-４６２１により引用される。この抗体の内部名称はＡＲＨ４６０-１６-２である。よって、ＰＴＡ-４６２１に対する引用は、抗ＣＤ４４抗体を生成するＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞クローンに言及し得、又はハイブリドーマそれ自体により生成される抗ＣＤ４４に言及しうる。また、ＰＴＡ-４６２１に対する引用は、内部名称ＡＲＨ４６０-１６-２を有する抗体も意味する。従って、ここで使用される場合、ＰＴＡ-４６２１のキメラ型は、「ｃｈＰＴＡ-４６２１」又は「ｃｈＡＲＨ４６０-１６-２」と言及されてもよく、ＰＴＡ-４６２１のヒト化型は、「ｈｕＰＴＡ-４６２１」又は「ｈｕＡＲＨ４６０-１６-２」と言及されてもよい。当業者であれば、抗体又はハイブリドーマクローンに言及されているかどうかにかかわらず、文脈からすぐに認識するであろう。マウスモノクローナル抗ＣＤ４４抗体ＰＴＡ-４６２１は、米国特許第６１８０３５７号で教示された患者特異的抗癌抗体を生成するための方法論を使用して発見された。該プロセスを使用し、患者の肺腫瘍バイオプシー及びＮＣＩ-Ｈ４６０肺癌細胞株の双方からの細胞で、マウスを免疫化した。抗体は米国特許第７２５２８２１号に開示され、抗体を発現するハイブリドーマ細胞株は、受託番号ＰＴＡ-４６２１にて、2002年9月4日に、American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209に寄託されている。この抗体は、双方の予防性を含む、多くの前臨床性異種移植において、かなりの抗腫瘍効果を示し、ヒトの乳癌(米国特許第７２５２８２１号に開示)、肝臓癌(米国特許出願第１１／７８６１６５号に開示)、及び前立腺癌(米国特許第７５０７５３７号に開示)のインビボモデルで確立されている。さらに、化学療法剤(シスプラチン)と併用したＰＴＡ-４６２１治療により、インビボ前立腺癌モデル(同頁)で樹立された抗腫瘍活性が示された。マウス抗体ＰＴＡ-４６２１／ＡＲＨ４６０-１６-２のキメラ及びヒト化型は、米国特許出願第１１／８０７８８７号に開示されている。

ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一な抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって合成的に汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築されたものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ(マウス又はヒト)法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)。また「モノクローナル抗体」は、Clacksonら.,Nature, 352:624-628(1991)及びMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載の技術を使用し、ファージ抗体ライブラリーから単離することができる。

「癌性疾患修飾抗体」(ＣＤＭＡＢ)は、患者に有益な方法、例えば腫瘍量を低減させ、又は腫瘍を担持する個体、及びその抗体-リガンドの生存率を長くすることにより、癌性疾患のプロセスを修飾するモノクローナル抗体を称する。

関心ある抗原、例えばＣＤ４４に「結合する」又は「特異的に結合する」抗体又は抗体断片は、抗体が抗原を発現する細胞のターゲティングにおける治療剤又は診断剤として有用であるように、十分な親和性で抗原と結合可能なものである。抗体がＣＤ４４に結合する場合、通常は、他のレセプターに対して、ＣＤ４４に優先的に結合し、偶発的結合、例えば非特異的Ｆｃ定常、又は他の抗原と共通の翻訳後修飾への結合を含まず、他のタンパク質と実質的に交差反応しないものであってよい。関心ある抗原に結合する抗体を検出する方法は、当該技術でよく知られており、限定されるものではないが、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ、及びウエスタンブロット等のアッセイが含まれる。

好ましい実施態様では、本発明の方法に使用される抗体又は抗体断片は、当該技術分野で知られている標準的な方法を使用し、ＣＤ４４へのマウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１の結合に競合し、及び／又は、特にＨＮＳＣＣにおいて発現する場合に、ＣＤ４４に特異的に結合する。ＣＤ４４は、細胞外マトリックスと細胞骨格との間の、それらの保存された細胞外ＨＡ結合領域及び細胞内アンキリン結合領域を介した、直接結合を媒介する。また、ＣＤ４４タンパク質はプロテアーゼを介して可溶性形態(ｓｏｌＣＤ４４)で放出され、通常の循環中、及び唾液で検出可能である。ＣＤ４４レセプターは、多くの細胞型で発現するイソ型のファミリーを含む。これらのイソ型は、ＣＤ４４ｍＲＮＡに存在する可変エクソン(エクソン５-１４)の領域の代替スプライシングにより生じ、膜貫通ドメインに細胞外領域のアミノ末端ドメインを結合させる、異なる「幹」に帰する。イソ型は、ケラチノサイトにおいて、ＣＤ４４ｖ３-１０、及びＣＤ４４ｖ８-１０又はＣＤ４４上皮(ＣＤ４４Ｅ)、ＣＤ４４標準(ＣＤ４４ｓ)等、正常細胞で見いだされる。他のＣＤ４４変異体イソ型(ＣＤ４４ｖ)は、種々の腫瘍で特異的に発現する。特定の態様では、本発明の方法に使用される抗体及びその抗原結合断片は、ＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端ドメインに免疫特異的に結合し、よってヒトにおいて発現するＣＤ４４の多く、好ましくは全ての機能的イソ型に対する特異性を示す。特定の態様では、本発明は、ＨＮＳＣＣにより発現した場合、ＣＤ４４に特異的に結合する抗体及び抗原結合断片の使用を含む。特定の態様では、本発明の方法に使用される抗体及び抗原結合断片は、ＡＦＤＧＰＩＴＩＴＩＶ(配列番号：１２)のアミノ酸配列を有するＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端ドメインのエピトープに結合する。好ましくは、ここで開示された方法に使用される抗体は、当該技術分野で知られている標準的な方法により決定される場合、ＰＴＡ-４６２１とＣＤ４４と結合について競合する。

ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、全てのこのような名称は子孫を含む。また、全ての子孫は、計画的又は偶発的な突然変異により、ＤＮＡ含有量が厳密に同一でなくてもよいと理解される。最初に形質転換した細胞についてスクリーニングし、同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。それは明確な命名が意図される文脈から明らかになるであろう。

ここで使用される場合、「癌又は腫瘍部位に直接投与」なる語句、及び類似する語句は、限定されるものではないが、腫瘍又は腫瘍周囲に直接、腫瘍又は腫瘍周囲に連続又は不連続にかん流、腫瘍又は腫瘍周囲に容器の導入、腫瘍又は腫瘍周囲に持続放出装置の導入、腫瘍又は腫瘍周囲に持続放出製剤の導入、腫瘍への直接適用、腫瘍領域に実質的に直接供給される動脈に直接注射、腫瘍領域に実質的に排出されるリンパ管に直接注射、実質的に被包化された腔(例えば、胸膜腔)又は管腔(例えば、小胞内)に直接又は実質的に直接導入等、抗体、断片又は組成物を一回又は複数回注射することを含む、直接又は実質的直接導入を称する。「腫瘍周囲」は、腫瘍境界、例えば限定するものではないが、触知知る腫瘍境界に関し、約１０ｃｍ内、好ましくは５ｃｍ内、より好ましくは１ｃｍ内の領域を記載する用語である。発生予防又は再発予防において「直接投与」は、癌の発症又は再発の危険性がある部位に、直接投与することと定められる。

ここで使用される場合、「核酸」、「核酸配列」及び「ヌクレオチド配列」なる用語には、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ＤＮＡとＲＮＡ分子の組合せ、又はハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ又はＲＮＡ分子の類似体が含まれる。このような類似体は、例えば限定されるものではないが、イノシン又はトリチル化塩基を含む、ヌクレオチド類似体を使用して生じさせることができる。またこのような類似体は、ヌクレアーゼ耐性又は細胞膜を通過する能力の増大等、分子に有益な特性を付与する修飾骨格を有する、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むことができる。核酸又はヌクレオチド配列は単鎖、二本鎖であってよく、単鎖及び二本鎖部分の双方を含んでいてよく、三本鎖部分を含んでいてよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

ここで使用される「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズ」なる用語は、緊縮又は非緊縮条件下でのハイブリダイゼーションに関する。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, Russell;「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001); Ausubel; 「Current Protocols in Molecular Biology」, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989),又は Higgins and Hames(編); 「Nucleic acid hybridization, a practical approach」 IRL Press Oxford, Washington DC,(1985)に記載されている従来からのプロトコルに従い確立されていてよい。条件の設定は当業者の技量の範囲内であり、当該技術で記載されているプロトコルに従い決定することができる。よって、特異的にハイブリダイズする配列のみの検出には、通常、緊縮ハイブリダイゼーション、及び洗浄条件、例えば６５℃で、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳが必要となるであろう。相同又は厳密ではない相補性配列についての、非緊縮ハイブリダイゼーション条件は、６５℃での、６ｘ ＳＳＣ、１％のＳＤＳに設定可能である。よく知られているように、測定される核酸の組成及びプローブ長は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。上述した条件の変形例の記載は、ハイブリダイゼーション実験の背景を抑制するために使用される代替ブロック試薬の包含及び／又は置換を介して、当該技術で常套的な方法に従い達成されてよい。典型的なブロック試薬には、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び商業的に入手可能な特許製剤が含まれる。特定のブロック試薬の包含には、融和性の問題のために、上述したハイブリダイゼーション条件の変更を必要とする可能性がある。また、ハイブリダイズする核酸分子は上述した分子の断片も含む。このような断片は、ＷＡＶＥ１をコードする核酸配列、又は少なくとも１２のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５、さらに好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも２１のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４０のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも６０のヌクレオチド長を有するその機能的断片を含む。さらに、上述した任意の核酸分子とハイブリダイズするあ、核酸分子には、これらの分子の相補性断片、誘導体及び対立遺伝子変異体が含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション複合体は、相補性Ｇ及びＣ塩基の間、相補性Ａ及びＴ塩基の間の水素結合の形成による、２つの核酸配列の間の複合体を称し；これらの水素結合は、塩基の積み重ね相互作用により、さらに安定化させることができる。２つの相補的核酸配列は、抗平行配置に水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中(例えば、Ｃｏｔ又はＲｏｔ分析)、又は一方が溶液中に存在する核酸配列と、他方が固体状支持体(例えば、膜、フィルター、チップ、ピン又はスライドガラスで、そこに細胞が固定化されるもの)に固体化された核酸配列との間に形成されてもよい。「相補的」又は「相補性」なる用語は、塩基対形成による、許容的塩及び温度条件下での、ポリヌクレオチドの自然な結合を称する。例えば、配列「Ａ-Ｇ-Ｔ」は相補性配列「Ｔ-Ｃ-Ａ」に結合する。２本の単鎖分子間の相補性は、いくつかの核酸のみが結合する場合は「部分的」であってよく、又は全体的な相補性が単鎖分子間に存在する場合には完全であってよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖のハイブリダイゼーションの効率及び強度において、十分な効果を有している。このことは、増幅反応において特に重要であり、核酸鎖間の結合に依存する。

「ハイブリダイズする配列」なる用語は、本発明の抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片ＭＰＶＨドメイン又はＶＬドメインをコードする上述した核酸配列（例えば、配列番号：１-１１）、及び／又はこのような抗ＣＤ４４抗体又は断片のＣＤＲと、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、より特に好ましくは少なくとも９０％、さらに特に好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を示す配列を意味する。

本発明において、２又はそれ以上の核酸又はアミノ酸配列における「同一性」又は「パーセント同一性」なる用語は、比較ウインドウ上、又は当該技術分野で知られている配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合の指定領域上の最大一致について比較又は整列させた場合、又は手動アルゴリズム及び目視検査により、同様であるか、特定のパーセンテージのアミノ酸残基又はヌクレオチドが同様である(例えば、配列番号：１−１１のアミノ酸配列、又は配列番号：１−１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列と６０％又は６５％同一性、好ましくは７０−９５％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性)、２又はそれ以上の配列又はサブシーケンスを称する。例えば、６０％ないし９５％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列は、実質的に同一であるとみなされる。また、このような定義は試験配列の相補鎖に適用される。当業者であれば、アルゴリズム、例えば当該技術分野で知られているＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム(Thompson, Nucl. Acids Res. 2(1994) 4673-4680)又はＦＡＳＴＤＢ(Brutlag, Comp. App. Biosci. 6(1990) 237-245)をベースにしたものを使用し、如何にして配列間の同一性を決定するか分かるであろう。

ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは、典型的には、その計算において、配列内部の非適合欠失又は付加、すなわちギャップを考慮しないが、これは手動で訂正可能で、％同一性の過大評価を回避することができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その同一性の計算において、考慮される配列ギャップをとる。また、これにおいて当業者が入手可能なのはＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムｓ(Altschul, Nucl. Acids Res. 25(1997) 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36(1993) 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215(1990) 403-410)である。核酸配列についてのＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、ワード長(Ｗ)３、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び双方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長(Ｗ)３、及び期待値(Ｅ)１０を使用する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス(Henikoff, PNAS 89(1989) 10915)は、アラインメント(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び双方の鎖の比較を使用する。

さらに、本発明は、その配列が、上述のハイブリダイズする分子の配列との比較において変化している核酸分子に関する。本発明で使用される場合、「遺伝コードの結果として変化」なる用語は、同様のアミノ酸に対して、遺伝コードが異なるヌクレオチド配列の重複のためであることを意味する。

ＢＬＡＳＴを使用する類似のコンピューター技術を用い、ヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＥＭＢＬにおいて、同一又は関連する分子について探索する。この分析は多重膜ベースのハイブリダイゼーションよりもかなり速い。さらに、コンピューター探索の感度を変更し、任意の特定の適合が正確又は類似に分類されているかどうかを決定することができる。探索の基本は、
(％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア)／１００
として定義される生成物スコアであり、２つの配列間の類似度合い、及び配列適合の長さの双方を考慮する。例えば、生成物スコア４０であると、適合は１−２％の誤差内で正確であり、７０であると、適合は正確であろう。類似の分子が、１５〜４０の生成物スコアを示すものを選択することにより同定されるが、低スコアであると、関連分子が同定される可能性がある。配列アルゴリズムを生成可能なプログラムの他の例は、当該技術分野で知られているＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム(Thompson, Nucl. Acids Res. 2(1994) 4673-4680)又はＦＡＳＴＤＢ(Brutlag, Comp. App. Biosci. 6(1990) 237-245)である。

「治療又は治療する」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の双方を意味し、ここで目的は、標的となる病状又は疾患(例えば、ＨＮＳＣＣ)、又はそれに関連した一又は複数の症候を予防、寛解又は遅延化させる(和らげる)ことである。また、本用語は、癌、特にＨＮＳＣＣに罹患している患者の発症の遅延、阻害(又は増殖の低減又は停止)、影響の軽減、生命の延長を示すためにも使用される。処置が必要な者には、疾患を患っていると診断された者、疾患に罹患している疑いがある者、疾患に罹患しやすい者、並びに疾患が予防される者が含まれる。よって、ここで処置される哺乳動物は、疾患を患っているか、又は疾患に罹患しやすいか、又はその疑いがあると診断されている。いくつかの実施態様では、処置は、本発明の方法の一又は複数の治療剤の投与に起因して、原発性、局所性、又は転移性の癌組織を根絶、除去、変性、又は制御することを意味する。他の実施態様では、このような用語は、このような病気を患っている被験者への、一又は複数の治療剤の投与に起因して、癌の広がりを最小化又は遅延化させることを意味する。

ここで使用される場合、「予防する」、「予防の」及び「予防」なる用語は、予防又は治療剤の投与に起因して、被験者における癌疾患の一又は複数の症候の発生又は再発を予防することを意味する。

主として、疾患の何らかの証拠（例えば、前悪性「前癌」又は異形成病変で、裸眼で可視できる又はできないが、組織学的に前悪性的変化を包含しているもの）が存在する前に、予防処置を開始することができるため、本発明は、癌を発症する危険性があるとみなされている個体に特に有益である。「危険性がある」個体には、例えば、影響を受けやすい個体において、統計的に癌を促進させることが示されているレベルで、例えば消費、例えば吸入及び／又は摂取により、発癌性物質に暴露されている個体が含まれる。また、紫外線に暴露されている、又はその環境、職業、及び／又は遺伝の危険性にある個体、並びにポリープ等、前癌状態の兆候を示す者も含まれる。同様に、癌又は転移発症の非常に初期（すなわち、一つのみ又は数個の異常細胞が個体の体内、又は個体の組織の特定の部位に存在している）段階の個体には、このような予防的処置が有益である。

ここで使用される「有効量」及び「治療に有効」なる用語は、意図する効果又は生理学的結果を生じさせるために、その投与内で効果的な期間有用な、抗体の量及び濃度を意味する（急性又は慢性投与、及び周期的又は連続投与を含む）。本発明で使用される抗体の有効量は、例えば癌、特に腫瘍及び／又は腫瘍細胞の増殖を阻害し、癌に罹患している、又は癌の危険性にある患者の予後を改善する、他の癌治療の予後を改善する量を含む。

「患者」及び「被験者」なる用語は交換可能に使用され、本発明の方法での治療又は診断が提供される動物、ヒト又は非ヒトを記述するために、本明細書で使用される。

「頭頸部扁平上皮癌」又はＨＮＳＣＣなる用語には、限定されるものではないが、口、唇、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、上咽頭、喉及び気管の癌が含まれる。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。

治療目的の「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を意味し、ヒト、マウス、ＳＣＩＤ又はヌードマウス又はマウス系統のもの、飼育動物及び家畜、動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。

ここで使用される場合、「併用して」なる用語は、１を越える予防及び／又は治療剤、例えば、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片に加えて、予防又は治療剤を使用することを意味する。「併用して」なる用語の使用は、予防及び／又は治療剤を、ＨＮＳＣＣ等の疾患を患っている被験者に投与する順番を制限するものではない。第１の予防又は治療剤は、第２の予防又は治療剤の投与の（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間）前、同時、又は逐次（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間後に）、疾患に罹患しているか、又は罹患している疑いのある被験者に投与することができる。予防又は治療剤は、それらが他の方法で投与されるよりも、増加した有益性をもたらすように、本発明の薬剤を他の薬剤と一緒に作用可能な順序及び時間間隔で、被験者に投与される。任意の付加的な予防又は治療剤は、他の付加的な予防又は治療剤と共に、任意の順序で投与することができる。また「併用して」なる用語は、当該技術分野で知られている標準的な抗癌処置様式、例えば放射線治療又は外科手術と共に、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片を使用することを意味する。

ここで使用される場合、「イムノ-コンジュゲート」は、例えば細胞毒、放射性剤、サイトカイン類、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍剤又は治療剤に、化学的又は生物学的に結合した抗体のような任意の分子又はＣＤＭＡＢを意味する。抗体又はＣＤＭＡＢは、それがその標的と結合できる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍剤又は治療剤と結合されうる。イムノ-コンジュゲートの例には、抗体毒素化学コンジュゲート、及び抗体-毒素融合タンパク質が含まれる。イムノコンジュゲートは特に診断剤としての用途が見いだされている。

抗腫瘍剤としての使用に、及び／又はここで開示された診断方法に関連して、適した放射性剤は当業者に知られている。例えば、^１３１Ｉ又は^２１１Ａｔが使用されうる。これらの同位体は一般的な技術を使用して抗体に結合させられる（例えば、Pedleyら, Br. J. Cancer 68, 69-73(1993)）。あるいは、抗体に結合される抗腫瘍剤は、プロドラッグを活性化させる酵素である。抗体複合体が投与されるとすぐに、その細胞毒型に転換される腫瘍部位に到達するまで、その不活性型を保持しているプロドラッグが投与されうる。実際、抗体-酵素コンジュゲートが患者に投与され、治療される組織の領域への局在が許容される。ついで、プロドラッグは、細胞毒剤への転換が、処置される組織の領域で生じるように、患者に投与される。あるいは、抗体にコンジュゲートされる抗腫瘍剤は、サイトカイン、例えばインターロイキン-２(ＩＬ-２)、インターロイキン-４(ＩＬ-４)、又は腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦ-α)である。抗体は、サイトカインが、他の組織に影響を及ぼすことなく、腫瘍への損傷又はその破壊を媒介するように、腫瘍へのサイトカインを標的とする。サイトカインは、一般的な組換えＤＮＡ技術を使用し、ＤＮＡレベルで抗体に融合される。インターフェロンもまた使用することができる。

図１は、ＨＮＳＣＣ細胞株Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２(図１Ａ)に対するＡＲＨ４６０-１６-２抗体の代表的ＦＡＣＳヒストグラムを示し、ＡＲＨ４６０-１６-２がこのような細胞株に結合することが示されている。図１Ａにおいては、抗体Ｃ２２５(抗ＥＧＦＲ)がコントロールである。 図１は、ＨＮＳＣＣ細胞株ＣＡＬ２７(図１Ｂ)に対するＡＲＨ４６０-１６-２抗体の代表的ＦＡＣＳヒストグラムを示し、ＡＲＨ４６０-１６-２がこのような細胞株に結合することが示されている。図１Ｂにおいては、抗ＣＤ２０抗体リツキサン^ＴＭがコントロールである。 図２は、樹立されたヒトＴ.Ｔｎ ＨＮＳＣＣモデルでの腫瘍増殖に対するｃｈＡＲＨ４６０-１６-２の効果を示す。垂直の破線は、抗体が腹腔内投与された期間を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図３は、樹立されたヒトＴ.Ｔｎ ＨＮＳＣＣモデルでのマウス体重における、キメラＰＴＡ-４６２１の効果を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図４は、樹立されたＳＣＣ-１５ ＨＮＳＣＣモデルでの腫瘍増殖に対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。垂直な破線は、抗体が腹腔内投与された期間を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図５は、樹立されたＳＣＣ-１５ ＨＮＳＣＣモデルでのマウス体重における、ヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図６は、樹立されたＤｅｔｒｏｉｔ５６２ ＨＮＳＣＣモデルでの腫瘍増殖に対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。垂直な破線は、抗体が腹腔内投与された期間を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図７は、樹立されたＤｅｔｒｏｉｔ５６２ ＨＮＳＣＣモデルでのマウス体重に対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。データ点は平均＋／−ＳＥＭを表す。 図８は、樹立されたＣＡＬ２７ ＨＮＳＣＣモデルでの相対的腫瘍体積に対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。 図９は、樹立されたＣＡＬ２７ ＨＮＳＣＣ異種移植モデルでの腫瘍増殖に対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。腫瘍体積は群平均±マイナスＳＥＭで提供される。垂直な破線は、投与の初日及び最終日を示す。 図１０は、樹立されたＣＡＬ２７ ＨＮＳＣＣモデルでのマウスに対するヒト化ＰＴＡ-４６２１の効果を示す。体重は群平均±ＳＥＭで提供される。 図１１は、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１(配列番号：１)のＶ_Ｈドメインのアミノ酸配列を表す。配列の残基はカバットに従い番号付けされている。ＣＤＲには下線を付し、さらに配列の上部に破線で識別し；Ｖ_ＨＣＤＲ１(配列番号：３)は残基３１から３５に相当し、Ｖ_ＨＣＤＲ２(配列番号：４)は残基５０から６５に相当し、Ｖ_ＨＣＤＲ３(配列番号：５)は残基９５から１０２に相当する。 図１２は、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１(配列番号：２)のＶ_Ｌドメインのアミノ酸配列を表す。配列の残基はカバットに従い番号付けされている。ＣＤＲには下線を付し、さらに配列の上部に破線で識別し；Ｖ_ＬＣＤＲ１(配列番号：６)は残基２４から３４に相当し、Ｖ_ＬＣＤＲ２(配列番号：７)は残基５０から６７に相当し、Ｖ_ＬＣＤＲ３(配列番号：８)は残基８９から９７に相当する。 図１３は、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１(配列番号：９及び１０)に基づく２つの代替的ヒト化Ｖ_Ｈドメインのアミノ酸配列を表す。配列の残基はカバットに従い番号付けされている。 図１４は、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１(配列番号：１１)に基づくヒト化Ｖ_Ｌドメインのアミノ酸配列を表す。配列の残基はカバットに従い番号付けされている。

（詳細な説明）
本発明は、抗ＣＤ４４抗体ＰＴＡ-４６２１が、ネイキッド(すなわち未コンジュゲート)抗体として、ＨＮＳＣＣの治療に効果的であることを驚くべきことに示したという点で、特定された技術的問題を解決する。特に、ＨＮＳＣＣの樹立されたモデルにおける過去の抗ＣＤ４４治療とは異なり、ＰＴＡ-４６２１の未コンジュゲートキメラ及びヒト化型が、Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２及びＣａｌ２７細胞の異種移植を含むＨＮＳＣＣモデルにおいて腫瘍増殖を有意に低減し、及び／又は阻害した。

従って、本発明は、抗ＣＤ４４抗体、特に当該技術分野で知られている方法に従い、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１と結合について競合する抗ＣＤ４４抗体、及び／又はＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端ドメインに免疫特異的に結合し、ヒトにおいて発現する場合、ＣＤ４４の一又は複数のアイソタイプを認識する抗ＣＤ４４抗体の使用を含む、ＨＮＳＣＣに罹患している患者の臨床状態を予防し、治療し及び／又は寛解する方法を提供する。ある態様では、本発明は、ここで開示されたような抗ＣＤ４４抗体、又はその抗原結合断片を有効量、患者に投与することを含む、（ｉ）ＨＮＳＣＣの腫瘍サイズ、増殖速度、感染度、悪性度合い、及び／又は再発の危険性を低減させ、（ｉｉ）治療後の無病間隔を長くし、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＮＳＣＣを患っている患者における、呼吸、嚥下、及び／又は言語機能を改善する方法を提供する。臨床的改善性は、例えば被験者があまり困難なく呼吸できる能力、患者が固形物に対して液体を嚥下する能力、閉塞度合い、言語の質又は量、及び臨床技術分野で知られている他の指標を評価することにより、主観的又は客観的に決定することができる。

本発明の方法を使用する癌治療の臨床転帰は、関連する技術の当業者、例えば医師により、容易に識別可能である。例えば、癌の臨床マーカーを測定するための標準的医療試験を、処置の有効性の強力な指標とすることができる。このような試験には、限定されるものではないが、理学的検査、性能尺度、疾患マーカー、１２誘導心電図、腫瘍測定、組織バイオプシー、細胞検査、細胞学、腫瘍計測の最長径、Ｘ線写真、腫瘍のデジタル画像、バイタルサイン、重量、有害事象の記録、感染エピソードの評価、併用剤の評価、痛みの評価、血液又は血清生化学検査、尿検査、ＣＴスキャン、及び薬物動態分析が含まれる。さらに、本発明の方法で開示されたような抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物と、他の癌治療とを含む併用治療の相乗効果は、単独治療を受けた患者での比較研究により測定されてよい。

特に、ＨＮＳＣＣの場合、呼吸、嚥下、言語、及びある種の寿命測定の質における改善性は、容易に解明可能である。さらに、ＨＮＳＣＣの寛解は、当業者により許容可能な基準、例えば「New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada」,J Natl Cancer Inst. 92(2000) 205-16を使用して評価することができる。

ある実施態様では、癌は、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物の直接投与による治療に対して影響を受けやすい。例えば、標的となる腫瘍質量は、皮膚の表面に近い場合がある。他の例では、病変組織は嚢胞により被包されている場合があるし、又は限定されるものではないが、管腔を含む実質的に囲い込まれた腔に見いだされる。投与されるここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物の有効投与量は、投与態様に応じて変化しうる。直接投与(例えば、腫瘍内注射)は、全身、静脈内投与と比較して、かなり少量の、開示された抗ＣＤ４４抗体又は断片の全身投与量を必要とする。それらの環境では、局所投与をさらに少量にでき、免疫毒素の循環血漿レベルの低下が予期及び所望されていることは、当業者には明らかであろう。このような場合、ここで開示されたような抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片は、サイクル当量当たりの全投与量で、又は安全性が樹立された最大耐性投与量以下で、腫瘍内的に投与することができるが、投与量は腫瘍量に関して標準化される。ある実施態様では、投与量は、腫瘍量の約２０−５０％を超えない容量で投与される。

また本発明は、ＨＮＳＣＣを治療するための外科手術前、手術中、又は手術後に、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物を有効量投与することを含む、手術後の合併症の危険性を低減するための方法を提供する。

さらに本発明は、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物を有効量、それを必要とする患者に投与(例えば、直接投与)することを含む、ＨＮＳＣＣの発症を予防し、再発を予防し又は遅延化させ、又は再発率を低減するための方法を提供する。このような処置を必要とする患者への、ここで開示されたような抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物の直接投与により、臨床的に有意な効能を有する他の癌治療剤の用量を低減させることができる。他の癌治療剤の用量を低減させるというかかる有用性は、本発明の方法なしには観察されない場合がある。従って、本発明は、一又は複数の他の癌の治療剤を低減した用量で投与することを含む、腫瘍又は癌を治療するための方法を提供する。

また本発明は、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物を投与することを含む、一又は複数の他の癌治療剤に対して腫瘍又は癌を感作させるための方法を提供する。非限定的実施態様では、他の癌治療剤は、当該技術分野で知られているＨＮＳＣＣに対して活性があることが知られている化学療法剤を含む。他の非限定的実施態様では、他の癌治療剤は放射線を含む。他の癌治療剤は、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物の投与前、重複して、同時に、及び／又は後に投与されうる。同時に投与される場合、ここで開示された抗ＣＤ４４抗体、断片又は組成物と他の癌治療剤は、単一の製剤又は別の製剤で投与され得、別々であるならば、場合によっては、異なった投与方法による。従って、一又は複数の免疫毒素と一又は複数の他の癌治療剤との組合せが、腫瘍又は癌に抗するように、相乗的に作用しうる。

本発明の方法に使用される抗ＣＤ４４抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号：１、配列番号：９又は配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、配列番号：２又は配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメイン、及び／又は配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３の一又は複数を含みうる。特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：２の配列を有するＶ_Ｌドメインを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を包含する。他の実施態様では、本発明は、配列番号：９のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１の配列を有するＶ_Ｌドメインを含み、又は配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１の配列を有するＶ_Ｌドメインを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を包含する。ある種の実施態様では、本発明は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ_ＬＣＤＲ３のそれぞれを含む、抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を包含する。

本発明の方法に使用される抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片は、(ｉ)ＣＤ４４、特にＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端ドメインに特異的に結合することを特徴とし、(ｉｉ)ＡＦＤＧＰＩＴＩＴＩＶ(配列番号：１２)のアミノ酸配列を有するＣＤ４４の細胞外領域のアミノ末端ドメインのエピトープに特異的に結合することを特徴とし、又は(ｉｉｉ)ＣＤ４４又はそのエピトープに対する(特異的)抗体の相互作用の定量化を含むことを特徴とする、当該技術分野で知られている任意の免疫学又は生化学をベースとした方法を使用し、マウスモノクローナル抗体ＰＴＡ-４６２１と結合について競合することを特徴としうる。ＣＤ４４又はそのエピトープへの、本発明の抗体の特異的又は競合的結合は、例えば限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、及び平衡透析を含む、免疫学又は生化学をベースとした方法を使用して測定可能である。イムノアッセイには、限定されるものではないが、若干の例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ等の技術を使用する、競合及び非競合アッセイシステムが含まれる。 このようなアッセイは常套的であり、当該技術分野でよく知られている。

本発明のヒト化抗体は、抗原、例えばＣＤ４４と、抗体との相互作用の動力学的パラメータを特徴とする、当該技術分野で知られている任意の表面プラズモン共鳴をベースにしたアッセイを使用して、アッセイすることができる。当該技術分野で知られているように、商業的に入手可能な任意のＳＰＲ機器を本発明で使用することができる。

本発明は、標的又はレポーター部分が結合する、ＣＤＭＡＢ、例えば抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合断片の使用を考慮する。標的部分は、結合対の第１のメンバーである。例えば抗腫瘍剤は、このような対の第２のメンバーにコンジュゲートし、抗原結合タンパク質が結合する部位を指向する。このような結合対の一般的な例は、アビジン及びビオチンである。好ましい実施態様では、ビオチンは本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原にコンジュゲートし、よってアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートする抗腫瘍剤又は他の部分に対しての標的が提供される。また、ビオチン又は他のこのような部分は、本発明のＣＤＭＡＢの標的抗原に結合し、検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートする、例えば診断システムにおけるレポーターとして使用される。さらに本発明の方法のＣＤＭＡＢは、付与された生物学的反応を修飾する治療剤又は薬剤部分にコンジュゲートすることもできる。治療剤又は薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されるとは解釈されない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、例えば毒素(例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン、ゲオニン)、及び酵素、タンパク質(例えば、腫瘍壊死因子)、インターフェロン(例えば、α-インターフェロン(ＩＦＮ-α)、β-インターフェロン(ＩＦＮ-β))、アポトーシス剤、血栓剤、抗血管新生剤(例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン)、生体応答修飾物質(例えば、リンホカイン、マクロファージコロニー刺激因子又は増殖因子)、プロテアーゼ、又はリボヌクレアーゼが含まれうる。また、本発明の方法に使用されるＣＤＭＡＢは、治療部分、例えば放射活性物質又は大環状キレート剤で、放射性金属イオンのコンジュゲートに有用なものにコンジュゲートすることもできる。大環状キレート剤の一般的な例には、リンカー分子を介して抗体に結合可能な、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ''-四酢酸(ＤＯＴＡ)である。このようなリンカー分子は一般的に知られており、当該技術分野で常套的に使用されている。

標識化抗体、特にここで開示された抗ＣＤ４４抗体又はそれらの抗原結合断片は、癌性疾患を検出、診断、又はモニターするための、診断又は予防目的で、本発明の方法に使用することができる。ここで記載される標識は、例えば本発明のインビボ又はインビトロ診断方法に使用される、抗ＣＤ４４抗体又は抗原結合断片にカップリングする検出可能なシグナルである。シグナル生成剤は、外部手段、通常は電子放射により検出可能で、測定可能なシグナルである。最も多くの部分について、シグナル生成剤は、酵素、又は発色団又は放射性核種であるか、又は蛍光、リン光、又は化学発光により光を放出する。発色団は、紫外線又は可視領域の光を吸収する染料を含み、酵素触媒反応の基質又は分解生成物とすることができる。

さらに、本発明の範疇には、当該技術分野でよく知られている調査又は診断方法のための、インビボ又はインビトロでのＣＤＭＡＢの使用が含まれる。ここで考慮されるような診断方法を実施するために、本発明は、本発明に有用なＣＤＭＡＢを収容するキットをさらに含む。このようなキットは、このような個体の細胞における、ＣＤＭＡＢ標的抗原の過剰発現を検出することによる、ある種の癌の危険性がある個体を同定するのに有用である。

本発明の実施に有用な抗体は、癌を予防し、治療し又は診断するための組成物として使用することができる。これらの組成物は低毒性であり、それらが液状調製物の形態である場合、又はヒトもしくは哺乳動物に経口的又は非経口的(例えば、血管内、腹腔内、皮下的等)に適した調製物の薬学的組成物である場合に、投与することができる。本発明の実施に有用な抗体は、それら自体により投与されてもよいし、又は適切な組成物として投与されてもよい。このような投与に使用される組成物は、抗体又はその塩、希釈剤又は賦形剤と共に、薬理学的に許容可能な担体を含有していてもよい。このような組成物は、経口又は非経口投与に適した薬学的調製物の形態で提供される。

非経口投与用の組成物の例は、注射可能な調製物、坐薬等である。注射可能な調製物は、血管内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴、関節内注射等の投与形態を含みうる。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法により調製することができる。例えば、注射可能な調製物は、注射用に従来から使用されている滅菌された水性媒体又は油性媒体に、本発明の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化させることによって調製することができる。注射用の水性媒体である場合、例えば、生理食塩水、等張液で、適切な可溶化剤、例えばアルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート８０、硬化ヒマシ油のＨＣＯ-５０(ポリオキシエチレン(５０ｍｏｌ)付加物))等と組合せて使用可能な他の補助剤、及びグルコースを含有するものが存在する。油性媒体の場合、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と組合せて、例えば、ゴマ油、大豆油などが使用される。このように調製された注射は、通常、適切なアンプルに充填される。直腸投与用に使用される坐薬は、本発明の抗体又はその塩と、坐薬用の従来からの基剤を混合することにより調製することができる。経口投与用の組成物には、固体状又は液状の調製物、特に錠剤(糖衣及びフィルムコーティング錠剤)、丸薬、顆粒、パウダー状調製物、カプセル(ソフトカプセルを含む)、シロップ、エマルション、懸濁剤等が含まれる。このような組成物は、公に知られている方法により製造され、薬学的調製物の分野で常套的に使用されているビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含みうる。錠剤用のビヒクル又は賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウム等である。

有利には、上述の経口又は非経口用途の組成物は、活性成分の用量に適した単位用量で、薬学的調製物に調製される。このような単位用量調製物には、例えば錠剤、丸薬、カプセル、注射(アンプル)、坐薬等が含まれる。

本発明の方法の抗体を含有する、前述の予防剤／治療剤の用量は、投与される被験者、標的とする病気、状態、投与経路等に応じて変えることができる。例えば、成人におけるＨＮＳＣＣ等を治療／予防する目的で使用される場合は、患者の体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、又は０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で、本発明の抗体を静脈内に投与することが有利である。他の態様では、患者に投与される用量は、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇである。一般的に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応のために、他の種からの抗体よりも、ヒトの体内でより長い半減期を有する。よって、多くの場合、ヒト抗体の投与量を低下させ、投与頻度を少なくすることは可能である。さらに、例えば脂質化等の修飾により、抗体の組織浸透度、及び取込を高めることで、本発明の抗体又はその断片の投与量及び投与頻度は低減させることができる。他の態様では、本発明の抗体は、他の治療用組成物と組合せて使用され、被験者に投与される投与量は、該抗体が単剤治療として使用される場合よりも少ない。

ここて提供される投与量及び投与頻度は、治療的に有効な及び予防的に有効なという用語に包含される。さらに、投与量及び頻度は、典型的には、投与される特定の治療剤又は予防剤、重症度、投与経路、並びに年齢、体重、反応性、及び患者の過去の病歴に応じて、各患者についての特異的な要因に従い変えることができる。適切なレジメンは、このような要因を考慮し、文献で報告され、米医薬品便覧(56.sup.th ed., 2002)で推奨されている投与量に従い、当業者により選択可能である。本発明の抗体、断片又は組成物の毎日の投与量は、単一のボーラス投与、又は２４時間以上送達されるように、複数回投与に分割して投与することができる。また、毎日の全投与量は、全投与量が１２時間、６時間、４時間、２時間、１．５時間、１．０時間、４５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、又は１分以上投与されるように、例えば注入を介して、延長期間投与されてもよい。状態が特に重度である場合は、投与量を状態に応じて増やしてもよい。

本発明の方法に使用される抗体は、そのままで、又は適切な組成物の形態で投与することができる。投与に使用される組成物は、前述の抗体又はその塩、希釈剤又は賦形剤と共に、薬理学的に許容可能な担体を含有していてもよい。このような組成物は、経口又は非経口投与(例えば、血管内注射、皮下注射等)に適した、薬学的調製物の形態で提供される。上述した各組成物は、他の活性成分をさらに含有していてもよい。さらに本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、イホスファミド等)、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキセート、５-フルオロウラシル等)、抗腫瘍抗生物質(例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン等)、植物由来の抗腫瘍剤(例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等)、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン等と組合せて使用してもよい。本発明の抗体及び上述した薬剤は、同時に、又は時差的に投与されてよい。本発明のヒト化抗体の投与方法には、限定されるものではないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下)、硬膜外、及び粘膜(例えば、鼻腔内及び経口経路)が含まれる。特定の実施態様では、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、又は皮下的に投与される。組成物は、任意の簡便な経路、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜裏層(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜)を介して吸収されることにより投与され得、他の生物学的活性剤と共に投与されうる。投与は、全身又は局所的でありうる。さらに、例えば、吸入剤又はネブライザー、及びエアロゾル化剤を含有する製剤の使用による、肺投与も使用可能である。

利用される化学療法剤／他の抗体レジメンは、患者の状態の治療に適していると思われる任意のレジメンを含む。種々の悪性腫瘍は、特定の抗腫瘍抗体と特定の化学療法剤の使用が必要であり、患者間ベースで測定されるであろう。本発明の好ましい実施態様では、化学療法剤は、抗体治療と同時に、より好ましくはその後で投与される。しかしながら、本発明は、特定の方法又は投与経路に限定されるものではないことを強調すべきである。

この明細書で述べられる全ての特許及び文献は、本発明が関連する分野の当業者のレベルを示している。

本発明のある種の形態が例証されるが、ここに記載され、本発明は示される特定の形態及び部分の配置に限定されるものではないことが理解される。本発明の範囲を逸脱しない限り、様々な変化がなされ、本発明が明細書に示され記載されたものに限定されるとみなされるべきではないことは、当業者には明らかであろう。

当業者であれば、本発明は、目的を実施し、記載された目標及び利点、並びにそこに固有のものを得るのに、良好に適合化されることを、容易に理解するであろう。ここに記載した任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技術は、現在、好ましい実施態様を表すものであり、例示を意図するもので、範囲の限定を意図しているものではない。発明の精神に含まれ、添付の特許請求の範囲により定まるここでの変更及び他の使用が当業者には生じる。本発明は、特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、請求項記載の発明は、このような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されなければならない。実際、当業者には自明である本発明を実施するための記載された態様の様々な変形が、次の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

本発明にまた含まれるものは次の項目である：
１項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、哺乳動物の腫瘍量の低減を生じさせるのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を治療する方法。
２項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体がＡＲＨ４６０-１６-２である、１項の方法。
３項： 前記モノクローナル抗体が細胞毒部分にコンジュゲートしている、２項の方法。
４項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のヒト化型、又は該ヒト化抗体から生成された抗原結合断片である、１項の方法。
５項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のキメラ型、又は該キメラ抗体から生成された抗原結合断片である、１項の方法。
６項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、哺乳動物の腫瘍量の低減を生じさせるのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＨＮＳＣＣの治療のための、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の使用。
７項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体がＡＲＨ４６０-１６-２である、６項の使用。
８項： 前記モノクローナル抗体が細胞毒部分にコンジュゲートしている、７項の使用。
９項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のヒト化型である、６項の使用。
１０項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のキメラ型である、６項の使用。
１１項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を、哺乳動物の腫瘍量の低減を生じさせるのに有効な量で、少なくとも１の化学療法剤と共に哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＨＮＳＣＣを治療する方法。
１２項： 抗ＣＤ４４モノクローナル抗体がＡＲＨ４６０-１６-２である、１３項の方法。
１３項： 前記モノクローナル抗体又はＣＤＭＡＢが、前記化学療法剤にコンジュゲートしている、１４項の方法。
１４項： 前記化学療法剤が細胞毒部分である、１５項の方法。
１５項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のヒト化型である、１１項の方法。
１６項： 前記モノクローナル抗体が、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のキメラ型である、１１項の方法。
１７項： 受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成された抗ＣＤ４４モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片；及び
必要量の薬理学的に許容可能な担体；
を組み合わせて含有する、ＨＮＳＣＣの治療に有効な組成物。
１８項： 細胞毒部分、酵素、放射活性化合物、サイトカイン類、インターフェロン、標的又はレポーター部分、及び造血細胞からなる群から選択されるメンバーと、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片のコンジュゲートをさらに含む、１７項の組成物。
１９項： ＨＮＳＣＣの存在を検出するためのアッセイキットであって、該ＨＮＳＣＣが、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片に特異的に結合する抗原の少なくとも１のエピトープを発現し、該キットが、受託番号ＰＴＡ-４６２１として、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより生成され、特定のカットオフレベルでのその存在が前記ＨＮＳＣＣの前記存在の診断となるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含むキット。

ここに開示された発明がさらに十分に理解されるように、以下の非限定的実施例を記載する。

実施例１
ＨＮＳＣＣ細胞株へのインビトロ結合
ＰＴＡ-４６２１のキメラ及びヒト化型を、ここに開示したようにして生じさせた。キメラＰＴＡ-４６２１(「ｃｈＰＴＡ-４６２１」)は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含む。それらの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に少しの差異を有する、ＰＴＡ-４６２１の２つのヒト化型(ｈｕＰＴＡ-４６２１)を生じさせた。ｈｕＰＴＡ-４６２１は、配列番号：９又は配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインを含む。ｈｕＰＴＡ-４６２１の２つの型の抗原結合親和性及び結合活性は、当該技術分野で知られている標準的なアッセイを使用して、識別不能であった。

ＨＮＳＣＣ細胞株Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５、Ｄｅｔｒｏｉｔ-５６２及びＣＡＬＬ２７に対するｃｈＰＴＡ-４６２１及びｈｕＰＴＡ-４６２１の結合を、フローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)により評価した。細胞を、最初にＤＰＢＳ(Ｃａ^＋＋及びＭｇ^＋＋を含有しない)を用いて細胞単層を洗浄することにより、ＦＡＣＳ用に調製した。ついで、細胞解離バッファー(INVITROGEN, Burlington, ON；Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２用)、又は細胞剥離溶液ＡＣＣＵＴＡＳＥ^ＴＭ(SIGMA, St. Lois, MO, USA, ＣＡＬ２７用)のいずれかを使用し、３７℃で、その細胞培養プレートから細胞を取り除いた。遠心分離及び収集後、細胞を、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２及び２パーセント(Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２)又は３パーセント(ＣＡＬ２７)のウシ胎児血清(染色媒体)を含むＤＰＢＳに、４℃で再懸濁させ、カウントし、適切な細胞密度に等分し、細胞をペレットにスピンさせ、試験抗体(キメラ又はヒト化ＰＴＡ-４６２１)、又はコントロール抗体(アイソタイプコントロール、抗ＥＧＦＲ(Ｃ２２５；Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２)又は抗ＣＤ２０(リツキサン^ＴＭ；ＣＡＬ２７)の存在下、４℃で染色媒体に再懸濁させた。アイソタイプコントロール及び試験用抗体を、３０分、氷上にて、２０μｇ／ｍＬで評価した。結合抗体を検出するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６コンジュゲート二次抗体を、Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２細胞に対して、ＡＰＣコンジュゲート二次抗体を、ＣＬＡ２７試験において使用した。二次抗体を添加する前に、細胞を染色媒体で洗浄した。ついで、染色媒体に二次抗体が入ったものを、製造者の指示書に従い添加した。ついで、最終的な時間、細胞を洗浄し、固定媒体(１．５％パラホルムアミドを含む染色媒体)に再懸濁させた。Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２細胞のフローサイトメトリー取得を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences, Oakville, ON)を使用し、ＦＡＣＳｃａｎに試料を流すことにより評価する一方、ＣＡＬ２７細胞の取得を、Ｄｉｖａ６システムソフトウェア(BD Biosciences, Rockville, MD USA)を使用し、ＬＳＲ-ＩＩに試料を流すことにより評価した。細胞の前方(ＦＳＣ)及び側方散乱(ＳＳＣ)を、ＦＳＣ及びＳＳＣ検出器において、電圧及び振幅を調節することにより設定した。蛍光(ＦＩＴＣ又はＡＰＣ)チャンネルを、染色されていないか、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６-コンジュゲート二次抗体(Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２)でのみ染色された細胞(ＣＡＬ２７)を流すことにより、細胞が、約１-５単位の蛍光強度中央値を有する均一なピークを有するように調節した。各試料について、約１００００の染色された固定細胞を分析用に得、結果を図１Ａ−Ｂにまとめる。

要約すれば、得られたデータは、ＰＴＡ-４６２１及びキメラ及びヒト化型が、Ｔ.Ｔｎ、ＳＣＣ-１５及びＤｅｔｒｏｉｔ-５６２(図１Ａ)、及びＣＡＬ２７(図１Ｂ)細胞株に結合することを示している。

実施例２
ヒトＴ.Ｔｎ細胞を用いたインビボ実験
ヒトＨＮＳＣＣ癌細胞株に対する効能をインビボで証明するために、キメラＰＴＡ-４６２１(ｃｈＰＴＡ-４６２１)を、樹立されたＴ.Ｔｎ ＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて試験した。図２及び３を参照し、６から８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液に１０００００００のＴ.Ｔｎ細胞が入ったものを、右側腹部に皮下注射して移植した。マウスを、１０を２つの治療群にランダムに分けた。マウスの平均腫瘍体積が約２６４−２６８ｍｍ^３に達した時に、２０ｍｇ／ｋｇのｃｈＰＴＡ-４６２１試験用抗体、又はバッファーコントロールを、２．７ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４を含む希釈液で、原液濃度から希釈した後、３００マイクロリットルの容量で、各コホートに腹腔内的に投与した。ついで、抗体又はコントロール試料を、研究期間中、週当たり３回投与した。腫瘍増殖をノギスを使用し、約７日毎に測定した。抗体を１０回投与した後に、研究を完了した。動物の体重を、研究期間中、１週間に１回記録した。研究の終わりに、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従い安楽死させた。

ｃｈＰＴＡ-４６２１は、ヒトＨＮＳＣＣのＴ.Ｔｎインビボでの樹立されたモデルにおいて、腫瘍増殖を低減した。抗体ｃｈＰＴＡ-４６２１を用いた治療により、１０５日目、研究期間の最終日に測定した場合、バッファーで処置された群と比較して、５４．９パーセント(ｐ＝０．００６８、ｔ-検定)まで、Ｔ.Ｔｎ腫瘍の増殖が低減した(図２)。

この研究を通して、毒性の臨床的兆候はなかった。週間隔で測定された体重は、満足と成功の失敗のサロゲートであった(図３)。治療期間の終わりに、群間で、平均体重に有意差はなかった。また、研究の始まりから終わりまで、各群内での平均体重にも有意差はなかった。

要約すると、ｃｈＰＴＡ-４６２１は良好な耐性を有し、このヒトＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて、腫瘍量を有意に低減させた。

実施例３
ヒトＳＣＣ-１５細胞を用いたインビボ実験
ヒトＨＮＳＣＣ癌細胞株に対するインビボでの効能を証明するために、ヒト化ＰＴＡ-４６２１(ｈｕＰＴＡ-４６２１)を、ＳＣＣ-１５ ＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて試験した。図４及び５を参照し、６から８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液に３００００００のＳＣＣ-１５細胞が入ったものを、右側腹部に皮下注射して移植した。マウスを、１０を２つの処置群にランダムに分けた。マウスの平均腫瘍体積が約２３３−２３５ｍｍ^３に達した時に、３０ｍｇ／ｋｇのｈｕＰＴＡ-４６２１試験用抗体、又はＨＮＴバッファーコントロールを、２０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％のポリソルベート８０、Ｐｈ６．０を含む希釈液で、原液濃度から希釈した後、１００マイクロリットルの容量で、各コホートに腹腔内的に投与した。ついで、抗体又はコントロール試料を、研究期間中、週当たり１回投与した。腫瘍増殖をノギスを使用し、約７日毎に測定した。抗体を４回投与した後に、研究を完了した。動物の体重を、研究期間中、週毎に１回記録した。研究の終わりに、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従い安楽死させた。

ｈｕＰＴＡ-４６２１は、ヒトＨＮＳＣＣのＳＣＣ-１５インビボでの樹立モデルにおいて、腫瘍増殖を低減した。抗体ｈｕＰＴＡ-４６２１を用いた治療により、２３日目、研究期間の最終日に測定した場合、バッファーで処置された群と比較して、４４．５パーセント(ｐ＝０．０３７９、ｔ-検定)まで、ＳＣＣ-１５腫瘍の増殖が低減した(図４)。

この研究を通して、毒性の臨床的兆候はなかった。週間隔で測定された体重は、満足と成功の失敗のサロゲートであった(図５)。治療期間の終わりに、群間で、平均体重に有意差はなかった。また、研究の始まりから終わりまで、各群内での平均体重にも有意差はなかった。

要約すると、ｈｕＰＴＡ-４６２１は良好な耐性を有し、このヒトＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて、腫瘍量を有意に低減させた。

実施例４
ヒトＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を用いたインビボ実験
ヒトＨＮＳＣＣ癌細胞株に対するインビボでの効能を証明するために、ｈｕＰＴＡ-４６２１を、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２ ＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて試験した。図６及び７を参照し、６から８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、１００マイクロリットルのＰＢＳ溶液に３００００００のＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞が入ったものを、右側腹部に皮下注射して移植した。マウスを、１０を２つの治療群にランダムに分けた。マウスの平均腫瘍体積が約１８８−１９２ｍｍ^３に達した時に、３０ｍｇ／ｋｇのｈｕＰＴＡ-４６２１試験用抗体、又はバッファーコントロールを、２０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％のポリソルベート８０、Ｐｈ６．０を含有する希釈液で、原液濃度から希釈した後、１００マイクロリットルの容量で、各コホートに腹腔内的に投与した。ついで、抗体又はコントロール試料を、研究期間中、週当たり１回投与した。腫瘍増殖をノギスを使用し、約７日毎に測定した。抗体を５回投与した後に、研究を完了した。動物の体重を、研究期間中、週毎に１回記録した。研究の終わりに、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従い安楽死させた。

ｈｕＰＴＡ-４６２１は、ヒトＨＮＳＣＣのＤｅｔｒｏｉｔ５６２インビボでの樹立モデルにおいて、腫瘍増殖を低減した。抗体ｈｕＰＴＡ-４６２１を用いた治療により、４２日目、研究期間の最終日に測定した場合、バッファーで処置された群と比較して、５２．１パーセント(ｐ＝０．０２５９、ｔ-検定)まで、Ｔ.Ｔｎ腫瘍の増殖が低減した(図６)。

この研究を通して、毒性の臨床的兆候はなかった。週間隔で測定された体重は、満足と成功の失敗のサロゲートであった(図７)。処置期間の終わりに、群の間で、平均体重に有意差はなかった。また、研究の始まりから終わりまで、各群内での平均体重にも、有意差はなかった。

要約すると、ｈｕＰＴＡ-４６２１は良好な耐性を有し、このヒトＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて、腫瘍量を有意に低減させた。

実施例５
ヒトＣＡＬ２７細胞を用いたインビボ実験
ヒトＨＮＳＣＣ癌細胞株に対するインビボでの効能を証明するために、ｈｕＰＴＡ-４６２１を、ＣＡＬ２７細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-２０９５)が移植されたヌードマウス(NU/J, stock #: 002019, Jackson Laboratories)を含む、ＣＡＬ２７ＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて試験した。ＣＡＬ２７細胞を、細胞がコンフルエントになるまで、空気雰囲気中５％のＣＯ_２、３７℃にて、７５ｍｍ^２のフラスコに１０％のＦＢＳ(ＡＴＣＣカタログ番号３０-２０２０)が補填されたＤＭＥＭ(ＡＴＣＣ、カタログ番号３０-２００２)において培養した。ヒトＣＡＬ２７細胞を、０．２５％(ｗ／ｖ)のトリプシン(Invitrogen、カタログ番号２５２００)を使用して培養フラスコから剥離させ、計測し、ＰＢＳに溶解させ、０．２ｍｌ容量に、マトリゲル^ＴＭ(BD Biosciences、カタログ番号３５４２４８)と３ｘ１０^６細胞／動物が入った用量(ＰＢＳ＋１００μｌのマトリゲルに１００μｌの細胞が入ったもの)で、７週齢の雄ヌードマウスの中背部領域に皮下的に注射した。細胞の注射後、２週間経過させ、腫瘍小結節を形成させた。腫瘍量(ｍｍ^３)をデジタルノギス(VWR、カタログ番号３６９３４-１５２)で測定し、楕円式：[π／６]×ａ×ｂ^２によって推定し、ここで、ａ及びｂは、腫瘍のｍｍでの第１及び第２の最も長い直交測定値である。腫瘍体積が４００−６００ｍｍ^３に達した時、動物を２つの群(ｎ＝５)に無作為化した。モノクローナル抗体ｈｕＰＴＡ-４６２１及びヒトＩｇＧ１(Sigma、Ｉ５１５４)を、全体で１０回、週当たり３回、３ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射により投与した。デジタルノギスを使用し、腫瘍小結節を、週当たり３回モニターした。抗腫瘍活性を、次の式：ＲＴＶ＝ＴＶ_ｎ／ＴＶ_０に従い、相対的腫瘍体積(ＲＴＶ)を算出することで、一次腫瘍増殖阻害に関して測定し、ここでＴＶ_ｎはｎ日目の腫瘍量であり、ＴＶ_０は０日目の腫瘍量である。腫瘍サイズを２７日間追跡した。治療の２７日後、Ｔ／Ｃ％＝１００×(治療群の平均ＲＴＶ)／(コントロール群の平均ＲＴＶ)として、ＲＴＶを算出することにより、Ｔ／Ｃ％を測定した。６０％の腫瘍増殖阻害が抗体治療群で見いだされ(図８)、治療が腫瘍量の軽減に有用であることが示された(Ｐ＜０．０００２)。

これらのデータには、ｈｕＰＴＡ-４６２１が、この研究で試験されたＣＡＬ２７異種移植腫瘍に対して有意な治療活性を有していることが明確に証明されている。

実施例６
ヒトＣＡＬ２７細胞を用いたインビボ実験
ＰＴＡ-４６２１抗体治療の効能を標準的な化学療法治療と比較するため、実施例５に記載したモデルシステムを使用して、シスプラチンを用いた治療と、ＰＴＡ-４６２１治療を比較した。実施例５に記載したようにして、ＣＡＬ２７細胞を培養し、収集した。ＣＡＬ２７細胞異種移植モデルを、１００μｌのマトリゲルと１００μｌのＤ-ＰＢＳに５Ｘ１０^６のＣＡＬ２７細胞が入ったものを、７週齢の雄ヌードマウス(NU/J, stock #: 002019, Jackson Laboratories)の中背部領域に皮下的に注射することで樹立させた。接種の１８日後、マウスを腫瘍形成について評価し、３つの群（各コホートについて、ｎ＝６）：ｈｕＰＴＡ-４６２１での治療、シスプラチンでの治療又はコントロールでの治療（無関係のコントロールＩｇＧ１抗体での治療）に無作為化した。腫瘍体積（ｍｍ^３）をデジタルノギス（VWR、カタログ番号３６９３４-１５２）で測定し、楕円式：[π／６]×ａ×ｂ^２によって推定し、ここで、ａ及びｂは、腫瘍のｍｍでの第１及び第２の最も長い直交測定値である。無作為化で、平均腫瘍体積は８４ｍｍ^３（７９−９４ｍｍ^３の範囲）であった。

無作為化で、試験用又はコントロール抗体を３ｍｇ／ｋｇの用量、又はシスプラチンを０．７５ｍｇ／ｋｇの用量、動物にｉ.ｐ.投与した。全ての治療に対して投与量は６．６ｍｌ／ｋｇであった。その後、抗体及びコントロール治療を、第１週及び第３週については週当たり３回、第２週については週当たり２回の投与、全体で８回の治療になるようにした。最後の処置から１週間後、動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従い安楽死させ；４６日目に研究を完了した。腫瘍成長及び体重を、研究の間、週当たり３回測定した。

抗腫瘍活性を、次の式：ＲＴＶ＝ＴＶ_ｎ／ＴＶ_０に従い、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を算出することで、一次腫瘍増殖阻害を決定した。ここで、ＴＶ_ｎはｎ日目の腫瘍体積であり、ＴＶ_０は０日目の腫瘍体積である。腫瘍サイズを４６日間追跡した。研究の完了時、Ｔ／Ｃ％＝１００×（治療群の平均ＲＴＶ）／（コントロール群の平均ＲＴＶ）として、ＲＴＶを算出することにより、Ｔ／Ｃ％を決定した。８６％の腫瘍増殖阻害度が抗体治療群で見いだされ（図９）、治療が腫瘍量の軽減に有用であることが示された（Ｐ＝０．０２４）。有意な増殖阻害は、コントロールと比較して、シスプラチンで治療された群では観察されなかった（図９）。従って、ｈｕＰＴＡ-４６２１は、ヒトＨＮＳＣＣのＣＡＬ２７インビボ樹立モデルにおいて腫瘍増殖を低減した。

治療期間の終わりに、群の間で、平均体重に有意差はなかった。また、試験の始まりから終わりまで、各群内での平均体重にも有意差はなかった（図１０）。コントロールＩｇＧ１群の一匹の動物は、研究決定のためのＩＡＣＵＣエンドポイントに達したために、２６日目に屠殺した。

要約すると、ｈｕＰＴＡ-４６２１は良好な耐性を有し、このヒトＨＮＳＣＣ異種移植モデルにおいて、標準的な化学療法剤（シスプラチン）に対して、腫瘍量を有意に低減させた。

Claims (4)

1. 哺乳動物の頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を治療するための医薬であって、前記医薬はヒト化モノクローナル抗ＣＤ４４抗体又はその抗原結合性断片を含んでなり、前記ＨＮＳＣＣがＣＤ４４の発現により特徴付けられ、該ヒト化抗体は
   （ａ）配列番号：９又は配列番号：１０のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメインに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶ_Ｈドメイン、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメインに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有するＶ_Ｌドメイン、及び
   （ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＶ _Ｈ ＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＶ _Ｈ ＣＤＲ２、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＶ _Ｈ ＣＤＲ３、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＶ _Ｌ ＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を有するＶ _Ｌ ＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＶ _Ｌ ＣＤＲ３
   を含む、医薬。
2. 前記抗体又は断片が、治療部分又はレポーター部分に、あるいは造血細胞にコンジュゲートしている、請求項１に記載の医薬。
3. 前記治療部分が細胞毒部分、酵素、サイトカイン、又はインターフェロンである、請求項２に記載の医薬。
4. 前記治療部分又はレポーター部分が、放射性同位元素又は放射性核種である、請求項２に記載の医薬。

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