JP6077763B2 - ヒトヘモグロビンの安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトヘモグロビン含有液中におけるヒトヘモグロビンの安定化方法、ヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液及びヒトヘモグロビン含有液に関する。

ヘモグロビンは、生体内において酸素運搬機能を担っており、二酸化炭素の運搬にも重要な役割を果たしている。また、糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、過去１〜２ヶ月間の血液中の血糖値を反映する。従って、血液中のヒトヘモグロビン類の濃度を測定することは、貧血の診断や糖尿病の診断に重要である。また、便に含まれる微量のヘモグロビンを測定する便潜血検査により、大腸癌などの診断も行なわれている。

血液や便中のヘモグロビンの測定試薬には、ヘモグロビン標準試料が必要であり、ヘモグロビン標準試料を調製するための溶液が必要となることもある。また、便潜血測定には、便溶解液が必要である。しかし、ヒトヘモグロビンは安定性が低く、安定な標準試料やコントロール試薬を調製することが困難である。

ヒトヘモグロビンの安定化手段として、ヘモグロビンを分子間架橋することにより、あるいは架橋ヘモグロビンをメト化して安定化する方法（特許文献１、２）；ＥＤＴＡ、ピルビン酸、オキザロ酢酸、２−ケトグルタル酸などの有機酸、アルデヒド、フェノール等を添加する方法（特許文献３〜７）；脱脂アルブミンと有機酸を添加する方法（特許文献８）；動物ヘモグロビン、その分解物を添加する方法（特許文献９、１０）；アミノ酸とアルブミンと添加する方法（特許文献１１）等が知られている。

特開平１１−２６４８２４号公報 特開２００６−２２０６６５号公報 特開平５−９９９２３号公報 特開２０００−２５８４２０号公報 特開２００３−１４７６８号公報 特開２００３−３４４４１７号公報 特開２００４−１２５５６０号公報 特開２００３−１９４８２５号公報 特開平２−２９６１４９号公報 特開平１１−２１８５３３号公報 特開平８−２４５４２１号公報

しかしながら、これら従来のヘモグロビン安定化手段では、十分な安定化効果が得られない、多量の添加物が必要である等の問題があり、なるべく少ない成分の添加でヒトヘモグロビンを安定化できる手段の開発が望まれていた。
従って、本発明の課題は、新たなヒトヘモグロビンの安定化手段を提供することにある。

そこで本発明者は、ヒトヘモグロビンの安定化手段について種々検討してきたところ、グリオキシル酸又はその塩を添加すればpH５以上９以下というヒトヘモグロビンの測定系と同様のpH範囲でヒトヘモグロビンが安定化され、安定なヒトヘモグロビン標準試料液や便溶解液が得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ヒトヘモグロビンにpH５以上９以下においてグリオキシル酸又はその塩を共存させることを特徴とするヒトヘモグロビンの安定化方法を提供するものである。
また、本発明は、グリオキシル酸又はその塩を含有し、pH５以上９以下であることを特徴とする、ヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液を提供するものである。
さらに、本発明は、ヒトヘモグロビン及びグリオキシル酸又はその塩を含有し、pH５以上９以下であることを特徴とするヒトヘモグロビン含有液を提供するものである。

本発明によれば、ヒトヘモグロビンにグリオキシル酸又はその塩を共存させるという手段だけで、pH５以上９以下という条件下、室温２０〜３７℃で保存しても長時間ヒトヘモグロビンの劣化又は変性が防止できる。従って、安定なヒトヘモグロビン標準試料溶液や便潜血検査用の便溶解液が供給可能であり、その結果、正確なヒトヘモグロビンの測定が可能となる。

本発明における安定化の対象となるヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンであり、例えば、血液、糞便、尿、唾液など生体試料に含まれる、または生体試料から得たヒトヘモグロビン、遺伝子組み換技術等により人工的に得たヒトヘモグロビンであって、ヘモグロビンＡ１ｃ等の糖化されたヒトヘモグロビン、アセチル化やカルバミル化、カルボキシメチル化、架橋、重合等の修飾されたヒトヘモグロビンも含まれる。
安定化の対象となるヒトヘモグロビンの濃度は、定量可能な濃度であれば、低濃度でも高濃度でもよく、通常１ｎｇ/ｍｌ以上あればよい。なお、試料中のヘモグロビン濃度が高い場合は、試料を適宜希釈して測定する。

本発明においてヒトヘモグロビン安定化剤として用いられるグリオキシル酸又はその塩としては、グリオキシル酸、グリオキシル酸アルカリ金属塩、グリオキシル酸水和物等が挙げられる。本発明においてグリオキシル酸又はその塩の濃度は、グリオキシル酸無水物換算の濃度である。

グリオキシル酸又はその塩の濃度は、溶液中に０．００００８〜０．４質量％であるのが好ましく、ヒトヘモグロビン安定化効果の点から、０．０００４〜０．０８質量％がより好ましく、０．００８〜０．０８質量％がさらに好ましく、０．００４〜０．０４質量％が特に好ましい。

本発明においては、グリオキシル酸又はその塩を用いれば、pH５以上９以下の範囲でヒトヘモグロビンが安定化できる。好ましいpH範囲は、６．０以上７．５以下であり、より好ましくは６．５〜７．０である。このようなpH範囲でヒトヘモグロビンの安定化効果が得られることは、ヒトヘモグロビンの測定条件を考慮すれば重要である。

pHを５以上９以下にするには、種々の緩衝剤を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などが利用できる。グッド緩衝液としては、グリシン、グリシルグリシン、トリス−塩酸、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ’Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン）酸、Ｔｒｉｃｉｎｅ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）等が好適に用いられる。また、アンモニア水などもpH調整剤として用いることができる。

本発明においては、グリオキシル酸又はその塩以外に、種々の安定化剤を併用することができる。そのような安定化剤としては、ＥＤＴＡ又はその塩等のキレート剤、亜硝酸又はその塩、亜硫酸又はその塩、二亜硫酸又はその塩、ヨウ素イオン、ピルビン酸又はその塩、オキザロ酢酸又はその塩、ジカルボン酸又はその塩（コハク酸、フマル酸等）、ヒドロキシカルボン酸又はその塩（リンゴ酸、グリコール酸等）、アミノ酸、２−ケトグルタル酸又はその塩、動物ヘモグロビン（ウマＨｂなど）、アルブミン（ＢＳＡなど）、アジ化ナトリウム等が挙げられる。このうち、亜硝酸又はその塩を併用するのがより好ましく、亜硝酸ナトリウムは例えば０．００１〜０．５質量％の範囲で使用するのがより好ましい。アルブミンを使用する場合、その濃度は０．０００５〜２．０質量％、さらに０．０１〜１質量％が好ましい。アジ化ナトリウムを使用する場合、その濃度は、０．００１〜１質量％、さらに０．０１〜０．５質量％が好ましい。ＥＤＴＡ等のキレート剤を使用する場合、その濃度は、０．００１〜５質量％、さらに０．０１〜１質量％が好ましい。

本発明のヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液は、グリオキシル酸又はその塩を含有し、pH５以上９以下であればよい。当該ヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液には、前記の各種安定化剤を含有させることができる。当該ヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液としては、便潜血検査における便溶解液、ヘモグロビン標準試料調製用溶液が挙げられる。

本発明のヒトヘモグロビン含有液は、ヒトヘモグロビン及びグリオキシル酸又はその塩を含有し、pH５以上９以下である。当該ヒトヘモグロビン含有液には、前記の各種安定化剤を含有させることができる。ヒトヘモグロビン含有液としては、ヒトヘモグロビン標準試料液、ヒトヘモグロビン管理用試料、検体抽出液、検体希釈液、検体保存液が挙げられる。

本発明のヒトヘモグロビン含有液は、室温〜３７℃において１日以上ヒトヘモグロビンを安定化できるので、ヒトヘモグロビン測定時の標準試料として特に好ましい。
なお、ヒトヘモグロビンの測定方法としては、特に限定されないが、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が好ましい。免疫学的検出方法としては、例えば、金コロイド凝集比色法がある。金コロイド凝集比色法は、金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体がヒトヘモグロビンを介して凝集する際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定して、ヒトヘモグロビンを検出する方法である。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）、０．９％塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％アジ化ナトリウムを基準液として調製した。基準液に各濃度のグリオキシル酸１水和物（表中にはグリオキシル酸濃度として表示）及び４００ng／mLヒトヘモグロビン（溶血液）を添加し、更に、４mg／mLの便を添加した試料を調製し、２５℃及び３７℃で数日間保存した。保存期間中のヒトヘモグロビン濃度を金コロイド凝集比色法で測定し、その残存率（％）を比較した。測定は、便潜血分析装置ＦＯＢＩＴＷＡＫＯ（ヒロセ電子システム(株)製）を用いて金コロイド凝集比色法を原理とする測定試薬ＬタイプＩＧオートＨｅｍ（合同酒精株式会社製）で行った。その結果を表１に示す。

その結果、グリオキシル酸の０．００００８〜０．４質量％、好ましくは０．０００４〜０．０８質量％添加により、ヒトヘモグロビンの変性又は劣化が顕著に防止できることが判明した。

実施例２
グリオキシル酸１水和物に代えて、グリオキシル酸ナトリウムを用い、実施例１と同様にヒトヘモグロビン濃度を測定した。その残存率を表２に示す。

実施例３
グリオキシル酸(GA)の添加量を０．００８質量％とし、基準液のpHを２８％アンモニア水を用いて５．０〜９．０に変化させて実施例１と同様に保存し、ヒトヘモグロビン濃度を測定した。その結果を表３に示す。

表３より、グリオキシル酸の添加により、pH５．０以上９．０以下、好ましくは６．０以上７．５以下、さらに好ましくは６．５以上７．０以下でヒトヘモグロビンを安定化できることが判明した。

実施例４
グリオキシル酸に加えて、さらに亜硝酸ナトリウムを添加する以外は、実施例１と同様に保存し、ヒトヘモグロビン濃度を測定した。その結果を表４に示す。

表４より、グリオキシル酸に加えて亜硝酸又はその塩を添加するとヒトヘモグロビンの安定化効果がさらに増強されることが判明した。

Claims (14)

1. ヒトヘモグロビンにｐＨ６．０以上７．５以下において０．０００４〜０．０８質量％のグリオキシル酸又はその塩を共存させることを特徴とする、２０〜３７℃条件下でヒトヘモグロビンの安定化方法。
2. グリオキシル酸又はその塩の濃度が、０．０００４〜０．０４質量％である請求項１記載の安定化方法。
3. ｐＨが６．５以上７．０以下である請求項１又は２記載の安定化方法。
4. さらに、亜硝酸又はその塩を共存させる請求項１〜３のいずれかに記載の安定化方法。
5. グリオキシル酸又はその塩０．０００４〜０．０８質量％を含有し、ｐＨ６．０以上７．５以下であることを特徴とする、ヒトヘモグロビンを２０〜３７℃条件下で保存するためのヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液。
6. グリオキシル酸又はその塩の濃度が、０．０００４〜０．０４質量％である請求項５記載のヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液。
7. ｐＨが６．５以上７．０以下である請求項５又は６記載のヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液。
8. さらに、亜硝酸又はその塩を含有する請求項５〜７のいずれかに記載のヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液。
9. ヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液が、便潜血検査における便溶解液又はヘモグロビン標準試料液調製用液である請求項５〜８のいずれかに記載のヒトヘモグロビン含有物溶解用溶液。
10. ヒトヘモグロビン及び０．０００４〜０．０８質量％のグリオキシル酸又はその塩を含有し、ｐＨ６．０以上７．５以下であることを特徴とする、２０〜３７℃条件下で安定なヒトヘモグロビン含有液。
11. グリオキシル酸又はその塩の濃度が、０．０００４〜０．０４質量％である請求項１０記載のヒトヘモグロビン含有液。
12. ｐＨが６．５以上７．０以下である請求項１０又は１１記載のヒトヘモグロビン含有液。
13. さらに、亜硝酸又はその塩を含有する請求項１０〜１２のいずれかに記載のヒトヘモグロビン含有液。
14. ヒトヘモグロビン含有液が、ヒトヘモグロビン標準試料液である請求項１０〜１３のいずれかに記載のヒトヘモグロビン含有液。