JP3848459B2 - ヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化ヘモグロビン、特に糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標として広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がその濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標とされ、通常、糖化ヘモグロビンのうち、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）を用いたＨｂＡ１ｃ値〔糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの合計に対するＨｂＡ１ｃの割合（％）〕が、糖尿病の診断の最適な指標として広く使用されている。
【０００３】
このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられているが、液体クロマトグラフィー法はその高精度性により最も汎用されている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という。なお、ＨｂＡ０は非糖化ヘモグロビンなどである）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００５】
しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定することが困難であった。そこで、不安定型ＨｂＡ１ｃピークの影響をなくす方法が以下のように種々考えられ、実施されているがそれぞれまだ欠点がある。すなわち、例えば、特開昭６３−２９８０６３号公報に記載の試薬を添加することにより不安定型ＨｂＡ１ｃを除く方法があるが、この方法は除去のための前処理操作が煩雑となる点が問題となる。また、例えば、特公平８−７１９７号公報に記載のような充填剤を用いることにより、比較的長時間を要してクロマトグラム上でピークとして分離する方法も考えられるが測定時間が長くなる点が問題となる。
【０００６】
この液体クロマトグラフィー法には、上記のように、充填剤としてはカチオン交換樹脂が一般的に用いられており、そのイオン交換基としてはカルボキシル基及びスルホン酸基が用いられている。また、溶離液としては、殆どがリン酸緩衝液が用いられている。
【０００７】
この液体クロマトグラフィー法は測定時間の短縮化が進み、１検体あたり数分間で測定が可能となっているが、各ピークの分離は未だ不十分である。
【０００８】
また、液体クロマトグラフィー法での測定においては、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響を受けるといわれる。更に、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型ＨｂＡ１ｃピーク付近に溶出するため、短時間での分離が困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来法の欠点がなく、従来より短時間で、精度良く、ヘモグロビン類を測定する方法を提供することである。
【００１０】
請求項１記載の発明及び請求項２記載の発明（以下、本発明１という）は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、充填剤のイオン交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１１】
請求項３記載の発明（以下、本発明２という）は、充填剤がカルボキシル基を有する充填剤であり、溶離液がカルボキシル基を有するグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液であることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１３】
以下、本発明１の詳細を説明する。
本発明１で用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のイオン交換基を有している粒子よりなる充填剤である。上記のイオン交換基含有充填剤は、後に詳細に説明するように、高分子粒子にイオン交換基を導入することなどにより製造される。上記イオン交換基は、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン性官能基及び第３級アミンや第４級アンモニウム基などのアニオン性官能基である。また、複数の官能基が混在されていても良い。上記混在とは、一つの粒子が複数の官能基を有している場合だけでなく、一つの官能基を有する粒子を複数混合して用いる場合も含むものとする。これらのイオン交換基の導入量は特に制限されないが、好ましくは、充填剤の乾燥重量１ｇ当たり０．１μｅｑ〜１００ｍｅｑである。充填剤粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。充填剤の粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均粒径×１００）として、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下である。
【００１４】
本発明１で用いられる充填剤を製造する方法は、特に限定されないが、例えば、（ａ）高分子粒子にイオン交換基を導入する方法、（ｂ）イオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子とする方法、（ｃ）重合性のイオン交換基含有エステル（（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなど）を架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをイオン交換基に変換させる方法などが挙げられる。
【００１５】
上記（ａ）高分子粒子にイオン交換基を導入する方法、について以下説明する。
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００１６】
上記高分子粒子としては、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましく、また、耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００１７】
高分子粒子がシリカ粒子の場合、該シリカ粒子は、例えばアルコキシラン誘導体をアルコール／水の混合溶媒に添加し、触媒存在下に重合することにより得ることができる。さらに必要に応じて、官能基含有シランカップリング剤を反応させることにより、適当な官能基を導入することもできる。
【００１８】
高分子粒子がセルロース粒子の場合、該セルロース粒子は、例えば、三酢酸セルロースを有機溶媒に溶解し、さらにゼラチン水溶液を添加して有機溶媒を除去後、アルカリ性下で加水分解することにより得ることができる。
【００１９】
高分子粒子がポリアミノ酸粒子の場合、該ポリアミノ酸粒子は、例えば、Ｎ−カルボン酸無水物を重合することにより得ることができる。
【００２０】
高分子粒子が合成高分子粒子の場合、該合成高分子粒子は、例えば、スチレン、ジビルベンゼン、ジビニルトルエン；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの単量体を、重合開始剤存在下で重合することにより得ることができる。
【００２１】
高分子粒子にイオン交換基を導入する方法は、該高分子粒子が反応性の官能基（例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など。以下、反応性基という）を有する場合であれば、該反応性基に反応性を有する官能基及びイオン交換基の両者を有する化合物と上記高分子粒子とを化学結合させればよい。上記反応性基を有する高分子粒子を調製するには、例えば、水酸基含有単量体（２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレートなど）；アミノ基含有単量体（（メタ）アクリルアミド、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノメチル（メタ）アクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミンなど）；カルボキシル基含有単量体（（メタ）アクリル酸、イタコン酸など）；又はエポキシ基含有単量体（グリシジル（メタ）アクリレートなど）を、架橋性単量体などと混合し、重合開始剤の存在下に重合すればよい。
【００２２】
上記反応性基を有さない高分子粒子の場合であれば、種々の公知の化学反応を用いて、高分子粒子に反応性基を導入すればよい。
【００２３】
高分子粒子に導入されるイオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基；第３級アミノ基、第４級アンモニウム基などのアニオン交換基が挙げられる。
【００２４】
上記（ｂ）イオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子とする方法、について以下説明する。
上記イオン交換基を有する単量体としては、イオン交換基がカルボキシル基の場合であれば、例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などが挙げられ、スルホン酸基の場合であれば、例えば、スチレンスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピルイタコレート、Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アリルスルホン酸などが挙げられ、リン酸基の場合であれば、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシメチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートなどが挙げられ、例えば、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基の場合であれば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリレートヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリレートジメチルアミノエチルトリメチルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
【００２５】
上記の重合方法は、上記単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明１の測定方法の実施に際して、充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．５〜１０ｍｍ、長さ５〜３００ｍｍのものが好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００２７】
上記測定に使用される液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００２８】
本発明１の測定方法に用いる溶離液は、使用する充填剤が有するイオン交換基と同種のイオン種（以下、同種イオンという）を含む緩衝液からなる。例えば、充填剤としてカルボキシル基を有する充填剤を用いる場合には、カルボキシル基を有する化合物〔具体的には、例えば、グリシン等のアミノ酸；酢酸、クエン酸、フタル酸等の酸類；Ｎ−（アセトアミド）−２−イミノ２酢酸（以下、ＡＤＡという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（以下、ＴＲＩＣＩＮＥという）等のＧｏｏｄの緩衝液組成物など〕を含む緩衝液；充填剤としてスルホン酸基を有する充填剤を用いる場合には、スルホン酸基を有する化合物〔具体的には、例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下、ＴＥＳという）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＢＥＳという）など〕を含む緩衝液；充填剤としてリン酸基を有する充填剤を用いる場合には、リン酸基を有する化合物〔具体的には、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、リン酸マグネシウムなど〕を含む緩衝液を用いる。
【００２９】
溶離液の濃度は、充填剤や測定対象試料、その他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の同種イオン緩衝液同士を、複数混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明１の測定方法では、上記同種イオン緩衝液は、ヘモグロビン類の分析時における糖化ヘモグロビン類の溶出時の溶離液に必ず含有される。しかしながら同種イオンのみで構成される必要はなく、異種イオン（充填剤のイオン交換基と異種のイオン種）が混合されていてもよい。この場合も同種イオンは、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭ含まれている必要がある。
【００３１】
また充填剤として２種以上の異なるイオン交換基を有する充填剤を使用した場合には、溶離液としてどちらか一方のイオン交換基種との同種イオンを用いればよい。例えば、カルボキシル基及びスルホン酸基の両者を有する充填剤を使用した場合、カルボキシル基を有する緩衝液でもよいし、スルホン酸基を有する緩衝液でもよいし、両者の混合緩衝液でもよい。
【００３２】
また以下の化合物を同種イオン緩衝液に添加してもよい。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど）を添加してもよい。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）塩酸などの無機酸類、酢酸などの有機酸類を添加してもよい。これらの無機酸類、有機酸類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭである。
（３）水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基類を添加してもよい。これらの塩基類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭである。
（４）メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（Ｖ／Ｖ）である。
【００３３】
また溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。この場合、上記のように、糖化ヘモグロビン類の溶出時には上記同種イオン緩衝液を含む溶離液で分離を行う必要があるが、他の分画（例えば、ＨｂＡ０分画）の溶出時には、必ずしも同種イオン緩衝液成分を含む必要はない。上記の「糖化ヘモグロビン類の溶出時」とは、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの分画を、この順序に含む、いわゆるｆｉｒｓｔｆｒａｃｔｉｏｎの溶出時のことを指す。ただし、この場合、他の物質がピークとして混在している場合も含む。
【００３４】
本発明１の測定方法において、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５０μｌ程度である。
【００３５】
以下、本発明２の詳細を説明する。
本発明２で用いられる充填剤は、本発明１で用いられる充填剤のうちのカチオン交換樹脂に相当するものであることの他は本発明１で用いられる充填剤と同様であり、その製造方法も本発明１の説明と同様である。
【００３６】
本発明２の測定方法の実施に際して、上記充填剤がカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられること、及び上記測定に使用される液体クロマトグラフなどは本発明１と同様である。
【００３７】
本発明２の測定方法に用いる溶離液は、一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものの中から選択される。具体的には、例えば、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（以下、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓという）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳなどが挙げられる。
【００３８】
溶離液の濃度は、他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の緩衝液を複数混合して用いてもよい。また他の緩衝液（リン酸塩、ホウ酸塩などを含む無機系緩衝液、クエン酸、コハク酸などを含む有機酸系緩衝液など）；塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど）；塩酸などの無機酸；酢酸などの有機酸；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基；メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒と混合して用いても良い。
【００３９】
また溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。この際、糖化ヘモグロビン類の溶出は、上記Ｇｏｏｄの緩衝液を含む溶離液で行う必要があるが、他の分画（例えばＨｂＡ０分画）の溶出時には、必ずしもＧｏｏｄの緩衝液成分を含む必要はない。
【００４０】
本発明２の測定方法において、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５０μｌ程度である。
【００５７】
（作用）
本発明１の測定方法は、充填剤のイオン交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用いるので、従来のヘモグロビン類の測定法における問題点であった測定時間の延長や、分離性能が解決され、短時間内に、かつ高精度にヘモグロビン類を分離できる。
【００５８】
本発明２の測定方法は、充填剤がカチオン交換樹脂であり、溶離液がＧｏｏｄの緩衝液であることを特徴とする本発明１のヘモグロビン類の測定方法であるので、従来分離が困難であった安定型ＨｂＡ１ｃの短時間での高精度測定、及びＡＨｂ、ＣＨｂの分離定量が可能となった。
【００６０】
【実施例】
以下、本発明の非限定的な実施例を挙げることにより、本発明を更に明らかにする。
【００６１】
（参考例１）カルボキシル基を有する充填剤を用いるもの
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤１という）を得た。
【００６２】
カラムの充填
得られた充填剤１をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６３】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。測定条件
【００６４】
測定試料
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ（糖負荷血）：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させたもの。
試料ｂ（カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させたもの。
試料ｃ（アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させたもの。
試料ｄ：上記試料ｂと試料ｃを等量混合したもの。
【００６５】
次いで、上記試料ａと試料ｄをそれぞれ以下のように処理して試料Ａと試料Ｄを作製し測定試料とした。
試料Ａ：上記試料ａを、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料Ａとした。
試料Ｄ：上記試料ｄを、溶血希釈液Ｙ（溶血希釈液Ｘにポリリン酸ナトリウム（太平化学社製）を０．０５重量％となるよう添加したもの）で１５０倍に溶血希釈し、３５℃で２分間加温して試料Ｄとした。
【００６６】
測定結果
上記測定条件により、試料Ａを測定して得られたクロマトグラムを図１に、試料Ｄを測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図１では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図２ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００６７】
（実施例２）リン酸基を有する充填剤を用いるもの
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート（共栄社化学社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤２という）を得た。
参考例１と同様にして、充填剤２をカラムに充填し、ヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い参考例１に準じて測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、良好であった。
【００６８】
（実施例３）スルホン酸基を有する充填剤を用いるもの
特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、グリセロールジメタクリレート（新中村化学社製）１００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で１時間重合した。１時間後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１００ｇを添加し、さらに６５℃で３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤３という）を得た。イオン交換容量を測定したところ、乾燥粒子１ｇ当たり１１．３μｅｑであった。参考例１と同様にして充填剤３をカラムに充填し、ヘモグロビン類の測定を行った。溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．７）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い参考例１に準じて測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、良好であった。
【００６９】
（比較例１）
参考例１と同様にして充填剤１をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムを図３（試料Ａ）及び図４（試料Ｄ）に示す。
図１及び図２に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７０】
（比較例２）
参考例１と同様にして充填剤２をカラムに充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．９）、溶離液ＢとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を５００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．９）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図３及び図４と同様であった。
【００７１】
（比較例３）
参考例１と同様にして充填剤３をカラムに充填し、溶離液Ａとして２０ｍＭクエン酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図３及び図４と同様であった。
【００７２】
（実施例４）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）１００ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍ（以下、充填剤４という）の粒子を得た。
【００７３】
参考例１と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１０ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．７）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、参考例１に準じて（但し、流速は１．５ｍｌ／分とした）ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図５に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図６に示した。図５では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図６ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００７４】
（実施例５）
特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で１時間重合した。１時間後メタクリル酸１５０ｇを添加し、さらに１時間８０℃で重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤５という）を得た。
参考例１と同様にして充填剤５をカラムに充填し、溶離液Ａとして２０ｍＭ濃度でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（和光純薬社製）を含む１１０ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じてヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図５及び図６と同様であった。
【００７５】
（比較例４）
実施例４と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムを図７（試料Ａ）及び図８（試料Ｄ）に示す。
図５及び図６に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７６】
（比較例５）
実施例５と同様にして充填剤５をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７及び図８と同様であった。
【００７７】
（参考例６）
実施例４と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む１００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｂとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む２００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｃとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む４００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．８）を用いて、測定開始より０〜０．３分の間は溶離液Ａを流し、０．３〜１．０分の間は溶離液Ｂを流し、１．０〜１．２分の間は溶離液Ｃを流し、１．２〜２．０分の間は溶離液Ａを再び流したことの他は、実施例４に準じて（但し、試料注入量は１０μｌ）ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図９に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図１０に示した。図９では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図１０ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００７８】
（比較例６）
参考例６と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｂとして１２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）及び溶離液Ｃとして４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）を用いて、参考例６に準じて（溶離液Ａ、Ｂ及びＣの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図１１に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図１２に示した。図９及び図１０に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明１の測定方法によれば、従来のヘモグロビン類の測定法における問題点であった測定時間の延長や、分離性能が解決され、短時間内に、かつ高精度にヘモグロビン類を分離できる。
【００８０】
本発明２の測定方法によれば、従来短時間では分離が困難であった不安定型ＨｂＡ１ｃを安定型ＨｂＡ１ｃから分離できるため、従来より短時間で、精度良く、ヘモグロビン類を測定できる。また、ＡＨｂ、ＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも安定型ＨｂＡ１ｃより分離でき、またＡＨｂとＣＨｂも分離できるため、それぞれを定量することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 参考例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】 参考例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】 参考例６の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】 参考例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】比較例６の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】比較例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＡＨｂのピーク
７ ＣＨｂのピーク
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化ヘモグロビン、特に糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）が糖尿病診断の指標として広く測定されている。糖化ヘモグロビンとは血液中の糖がその濃度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合して生成したものである。溶血血液試料中の糖化ヘモグロビンは、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映するので溶血血液中の糖化ヘモグロビンは、糖尿病の診断の指標とされ、通常、糖化ヘモグロビンのうち、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）を用いたＨｂＡ１ｃ値〔糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの合計に対するＨｂＡ１ｃの割合（％）〕が、糖尿病の診断の最適な指標として広く使用されている。
【０００３】
このＨｂＡ１ｃの測定方法としては、一般に液体クロマトグラフィー法や免疫法が用いられているが、液体クロマトグラフィー法はその高精度性により最も汎用されている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃの液体クロマトグラフィー法による測定は、主にカチオン交換液体クロマトグラフィー法により行われている（特公平８−７１９８号公報など）。溶血血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離すると、通常、ヘモグロビンＡ１ａ（以下、ＨｂＡ１ａという）及びヘモグロビンＡ１ｂ（以下、ＨｂＡ１ｂという）、ヘモグロビンＦ（以下、ＨｂＦという）、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ並びにヘモグロビンＡ０（以下、ＨｂＡ０という。なお、ＨｂＡ０は非糖化ヘモグロビンなどである）などのピークが出現する。なお、糖尿病の診断の指標として使用されているＨｂＡ１ｃは、上記のうちの安定型ＨｂＡ１ｃであり、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）として求められている。
【０００５】
しかしながら安定型ＨｂＡ１ｃピークと不安定型ＨｂＡ１ｃピークの分離が困難であるため、通常、精度良く安定型ＨｂＡ１ｃピークのみを測定することが困難であった。そこで、不安定型ＨｂＡ１ｃピークの影響をなくす方法が以下のように種々考えられ、実施されているがそれぞれまだ欠点がある。すなわち、例えば、特開昭６３−２９８０６３号公報に記載の試薬を添加することにより不安定型ＨｂＡ１ｃを除く方法があるが、この方法は除去のための前処理操作が煩雑となる点が問題となる。また、例えば、特公平８−７１９７号公報に記載のような充填剤を用いることにより、比較的長時間を要してクロマトグラム上でピークとして分離する方法も考えられるが測定時間が長くなる点が問題となる。
【０００６】
この液体クロマトグラフィー法には、上記のように、充填剤としてはカチオン交換樹脂が一般的に用いられており、そのイオン交換基としてはカルボキシル基及びスルホン酸基が用いられている。また、溶離液としては、殆どがリン酸緩衝液が用いられている。
【０００７】
この液体クロマトグラフィー法は測定時間の短縮化が進み、１検体あたり数分間で測定が可能となっているが、各ピークの分離は未だ不十分である。
【０００８】
また、液体クロマトグラフィー法での測定においては、アセチル化ヘモグロビン（以下、ＡＨｂという）やカルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂという）などの修飾ヘモグロビンの影響を受けるといわれる。更に、ＡＨｂやＣＨｂのピークも安定型ＨｂＡ１ｃピーク付近に溶出するため、短時間での分離が困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記従来法の欠点がなく、従来より短時間で、精度良く、ヘモグロビン類を測定する方法を提供することである。
【００１０】
請求項１記載の発明及び請求項２記載の発明（以下、本発明１という）は、液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、充填剤のイオン交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１１】
請求項３記載の発明（以下、本発明２という）は、充填剤がカルボキシル基を有する充填剤であり、溶離液がカルボキシル基を有するグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液であることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法である。
【００１３】
以下、本発明１の詳細を説明する。
本発明１で用いられる充填剤は、少なくとも１種以上のイオン交換基を有している粒子よりなる充填剤である。上記のイオン交換基含有充填剤は、後に詳細に説明するように、高分子粒子にイオン交換基を導入することなどにより製造される。上記イオン交換基は、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン性官能基及び第３級アミンや第４級アンモニウム基などのアニオン性官能基である。また、複数の官能基が混在されていても良い。上記混在とは、一つの粒子が複数の官能基を有している場合だけでなく、一つの官能基を有する粒子を複数混合して用いる場合も含むものとする。これらのイオン交換基の導入量は特に制限されないが、好ましくは、充填剤の乾燥重量１ｇ当たり０．１μｅｑ〜１００ｍｅｑである。充填剤粒子の直径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、より好ましくは１〜１０μｍである。充填剤の粒度分布は、変動係数値（ＣＶ値）（粒径の標準偏差÷平均粒径×１００）として、好ましくは２０％以下、より好ましくは１５％以下である。
【００１４】
本発明１で用いられる充填剤を製造する方法は、特に限定されないが、例えば、（ａ）高分子粒子にイオン交換基を導入する方法、（ｂ）イオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子とする方法、（ｃ）重合性のイオン交換基含有エステル（（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチルなど）を架橋性単量体などと混合し、重合開始剤存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステルをイオン交換基に変換させる方法などが挙げられる。
【００１５】
上記（ａ）高分子粒子にイオン交換基を導入する方法、について以下説明する。
上記高分子粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子；セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなどの天然高分子粒子；ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などが挙げられる。
【００１６】
上記高分子粒子としては、導入されるイオン交換基以外の構成成分は、より親水性であることが好ましく、また、耐圧性・耐膨潤性の点から架橋度の高いものが好ましい。
【００１７】
高分子粒子がシリカ粒子の場合、該シリカ粒子は、例えばアルコキシラン誘導体をアルコール／水の混合溶媒に添加し、触媒存在下に重合することにより得ることができる。さらに必要に応じて、官能基含有シランカップリング剤を反応させることにより、適当な官能基を導入することもできる。
【００１８】
高分子粒子がセルロース粒子の場合、該セルロース粒子は、例えば、三酢酸セルロースを有機溶媒に溶解し、さらにゼラチン水溶液を添加して有機溶媒を除去後、アルカリ性下で加水分解することにより得ることができる。
【００１９】
高分子粒子がポリアミノ酸粒子の場合、該ポリアミノ酸粒子は、例えば、Ｎ−カルボン酸無水物を重合することにより得ることができる。
【００２０】
高分子粒子が合成高分子粒子の場合、該合成高分子粒子は、例えば、スチレン、ジビルベンゼン、ジビニルトルエン；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの単量体を、重合開始剤存在下で重合することにより得ることができる。
【００２１】
高分子粒子にイオン交換基を導入する方法は、該高分子粒子が反応性の官能基（例えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基など。以下、反応性基という）を有する場合であれば、該反応性基に反応性を有する官能基及びイオン交換基の両者を有する化合物と上記高分子粒子とを化学結合させればよい。上記反応性基を有する高分子粒子を調製するには、例えば、水酸基含有単量体（２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレートなど）；アミノ基含有単量体（（メタ）アクリルアミド、２−アミノエチル（メタ）アクリレート、２−アミノメチル（メタ）アクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、アリルアミンなど）；カルボキシル基含有単量体（（メタ）アクリル酸、イタコン酸など）；又はエポキシ基含有単量体（グリシジル（メタ）アクリレートなど）を、架橋性単量体などと混合し、重合開始剤の存在下に重合すればよい。
【００２２】
上記反応性基を有さない高分子粒子の場合であれば、種々の公知の化学反応を用いて、高分子粒子に反応性基を導入すればよい。
【００２３】
高分子粒子に導入されるイオン交換基は、公知のものでよく特に制限はない。例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基などのカチオン交換基；第３級アミノ基、第４級アンモニウム基などのアニオン交換基が挙げられる。
【００２４】
上記（ｂ）イオン交換基を有する単量体を重合して高分子粒子とする方法、について以下説明する。
上記イオン交換基を有する単量体としては、イオン交換基がカルボキシル基の場合であれば、例えば、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などが挙げられ、スルホン酸基の場合であれば、例えば、スチレンスルホン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリレート、３−スルホプロピルイタコレート、Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、アリルスルホン酸などが挙げられ、リン酸基の場合であれば、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシメチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートなどが挙げられ、例えば、第３級アミノ基、第４級アンモニウム基の場合であれば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリレートヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド、（メタ）アクリレートジメチルアミノエチルトリメチルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
【００２５】
上記の重合方法は、上記単量体と架橋性単量体等とを混合し、重合開始剤の存在下に重合する方法などが挙げられる。
【００２６】
本発明１の測定方法の実施に際して、充填剤はカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられる。上記カラムは公知のステンレス製、ガラス製、樹脂製など、特に限定されない。カラムサイズとしては、内径０．５〜１０ｍｍ、長さ５〜３００ｍｍのものが好ましい。充填剤のカラムへの充填方法は、公知の任意の方法が使用できるがスラリー充填法がより好ましい。具体的には、例えば、充填剤粒子を溶離液などの緩衝液に分散させたスラリーを送液ポンプなどによりカラムに圧入することにより行う。
【００２７】
上記測定に使用される液体クロマトグラフは、公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料注入装置（サンプラ）、カラム、検出器などから構成される。また、他の付属装置（カラム恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００２８】
本発明１の測定方法に用いる溶離液は、使用する充填剤が有するイオン交換基と同種のイオン種（以下、同種イオンという）を含む緩衝液からなる。例えば、充填剤としてカルボキシル基を有する充填剤を用いる場合には、カルボキシル基を有する化合物〔具体的には、例えば、グリシン等のアミノ酸；酢酸、クエン酸、フタル酸等の酸類；Ｎ−（アセトアミド）−２−イミノ２酢酸（以下、ＡＤＡという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（以下、ＴＲＩＣＩＮＥという）等のＧｏｏｄの緩衝液組成物など〕を含む緩衝液；充填剤としてスルホン酸基を有する充填剤を用いる場合には、スルホン酸基を有する化合物〔具体的には、例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以下、ＴＥＳという）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＢＥＳという）など〕を含む緩衝液；充填剤としてリン酸基を有する充填剤を用いる場合には、リン酸基を有する化合物〔具体的には、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウム、リン酸マグネシウムなど〕を含む緩衝液を用いる。
【００２９】
溶離液の濃度は、充填剤や測定対象試料、その他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の同種イオン緩衝液同士を、複数混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明１の測定方法では、上記同種イオン緩衝液は、ヘモグロビン類の分析時における糖化ヘモグロビン類の溶出時の溶離液に必ず含有される。しかしながら同種イオンのみで構成される必要はなく、異種イオン（充填剤のイオン交換基と異種のイオン種）が混合されていてもよい。この場合も同種イオンは、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭ含まれている必要がある。
【００３１】
また充填剤として２種以上の異なるイオン交換基を有する充填剤を使用した場合には、溶離液としてどちらか一方のイオン交換基種との同種イオンを用いればよい。例えば、カルボキシル基及びスルホン酸基の両者を有する充填剤を使用した場合、カルボキシル基を有する緩衝液でもよいし、スルホン酸基を有する緩衝液でもよいし、両者の混合緩衝液でもよい。
【００３２】
また以下の化合物を同種イオン緩衝液に添加してもよい。
（１）無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど）を添加してもよい。これらの塩類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜１５００ｍＭである。
（２）塩酸などの無機酸類、酢酸などの有機酸類を添加してもよい。これらの無機酸類、有機酸類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭである。
（３）水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基類を添加してもよい。これらの塩基類の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．００１〜１００ｍＭである。
（４）メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒と混合してもよい。これらの有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、好ましくは０〜８０％（Ｖ／Ｖ）である。
【００３３】
また溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。この場合、上記のように、糖化ヘモグロビン類の溶出時には上記同種イオン緩衝液を含む溶離液で分離を行う必要があるが、他の分画（例えば、ＨｂＡ０分画）の溶出時には、必ずしも同種イオン緩衝液成分を含む必要はない。上記の「糖化ヘモグロビン類の溶出時」とは、ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃの分画を、この順序に含む、いわゆるｆｉｒｓｔｆｒａｃｔｉｏｎの溶出時のことを指す。ただし、この場合、他の物質がピークとして混在している場合も含む。
【００３４】
本発明１の測定方法において、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５０μｌ程度である。
【００３５】
以下、本発明２の詳細を説明する。
本発明２で用いられる充填剤は、本発明１で用いられる充填剤のうちのカチオン交換樹脂に相当するものであることの他は本発明１で用いられる充填剤と同様であり、その製造方法も本発明１の説明と同様である。
【００３６】
本発明２の測定方法の実施に際して、上記充填剤がカラムに充填されて液体クロマトグラフィー測定に用いられること、及び上記測定に使用される液体クロマトグラフなどは本発明１と同様である。
【００３７】
本発明２の測定方法に用いる溶離液は、一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液といわれるものの中から選択される。具体的には、例えば、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（以下、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓという）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳなどが挙げられる。
【００３８】
溶離液の濃度は、他の測定条件により異なるが、好ましくは１〜１０００ｍＭ、より好ましくは５〜８００ｍＭである。また、上記の緩衝液を複数混合して用いてもよい。また他の緩衝液（リン酸塩、ホウ酸塩などを含む無機系緩衝液、クエン酸、コハク酸などを含む有機酸系緩衝液など）；塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなど）；塩酸などの無機酸；酢酸などの有機酸；水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基；メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒と混合して用いても良い。
【００３９】
また溶離液を測定途中で切り替えたり、グラディエント溶出を行ってもよい。この際、糖化ヘモグロビン類の溶出は、上記Ｇｏｏｄの緩衝液を含む溶離液で行う必要があるが、他の分画（例えばＨｂＡ０分画）の溶出時には、必ずしもＧｏｏｄの緩衝液成分を含む必要はない。
【００４０】
本発明２の測定方法において、他の測定条件としては、公知の条件でよく、溶離液の流速は、好ましくは０．０５〜５ｍｌ／分、より好ましくは０．１〜３ｍｌ／分である。ヘモグロビン類の検出は、４１５ｎｍの可視光が好ましい。測定試料は、界面活性剤など溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。液体クロマトグラフへの試料注入量は、希釈倍率により異なるが、好ましくは１〜５０μｌ程度である。
【００５７】
（作用）
本発明１の測定方法は、充填剤のイオン交換基と同種のイオン種を含む緩衝液を溶離液として用いるので、従来のヘモグロビン類の測定法における問題点であった測定時間の延長や、分離性能が解決され、短時間内に、かつ高精度にヘモグロビン類を分離できる。
【００５８】
本発明２の測定方法は、充填剤がカチオン交換樹脂であり、溶離液がＧｏｏｄの緩衝液であることを特徴とする本発明１のヘモグロビン類の測定方法であるので、従来分離が困難であった安定型ＨｂＡ１ｃの短時間での高精度測定、及びＡＨｂ、ＣＨｂの分離定量が可能となった。
【００６０】
【実施例】
以下、本発明の非限定的な実施例を挙げることにより、本発明を更に明らかにする。
【００６１】
（参考例１）カルボキシル基を有する充填剤を用いるもの
充填剤の調製
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及びメタクリル酸（和光純薬社製）１５０ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で７５℃に昇温し、８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤１という）を得た。
【００６２】
カラムの充填
得られた充填剤１をカラムに以下のようにして充填した。粒子０．７ｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製の空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力３００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填した。
【００６３】
ヘモグロビン類の測定
得られたカラムを用いて、以下の測定条件でヘモグロビン類の測定を行った。測定条件
測定試料
健常人血をフッ化ナトリウム採血し、以下の試料を調製した。
試料ａ（糖負荷血）：健常人血に、５００ｍｇ／ｄｌとなるようグルコース水溶液を添加し、３７℃で３時間反応させたもの。
試料ｂ（カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させたもの。
試料ｃ（アセチル化ヘモグロビン（ＡＨｂ）含有試料）：健常人血１０ｍｌに、０．３重量％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍｌを添加し、室温で３時間反応させたもの。
試料ｄ：上記試料ｂと試料ｃを等量混合したもの。
【００６５】
次いで、上記試料ａと試料ｄをそれぞれ以下のように処理して試料Ａと試料Ｄを作製し測定試料とした。
試料Ａ：上記試料ａを、溶血希釈液Ｘ（０．１重量％トリトンＸ−１００のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して試料Ａとした。
試料Ｄ：上記試料ｄを、溶血希釈液Ｙ（溶血希釈液Ｘにポリリン酸ナトリウム（太平化学社製）を０．０５重量％となるよう添加したもの）で１５０倍に溶血希釈し、３５℃で２分間加温して試料Ｄとした。
【００６６】
測定結果
上記測定条件により、試料Ａを測定して得られたクロマトグラムを図１に、試料Ｄを測定して得られたクロマトグラムを図２に示す。ピーク１はＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂ、ピーク２はＨｂＦ、ピーク３は不安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク４は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク５はＨｂＡ０、ピーク６はＡＨｂ、ピーク７はＣＨｂを示す。
図１では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図２ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００６７】
（実施例２）リン酸基を有する充填剤を用いるもの
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート（共栄社化学社製）１００ｇの混合物に、過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤２という）を得た。
参考例１と同様にして、充填剤２をカラムに充填し、ヘモグロビン類の測定を行った。
溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い参考例１に準じて測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、良好であった。
【００６８】
（実施例３）スルホン酸基を有する充填剤を用いるもの
特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、充填剤を調製した。
テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、グリセロールジメタクリレート（新中村化学社製）１００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で１時間重合した。１時間後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１００ｇを添加し、さらに６５℃で３時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤３という）を得た。イオン交換容量を測定したところ、乾燥粒子１ｇ当たり１１．３μｅｑであった。参考例１と同様にして充填剤３をカラムに充填し、ヘモグロビン類の測定を行った。溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．７）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い参考例１に準じて測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図１及び図２と同様、良好であった。
【００６９】
（比較例１）
参考例１と同様にして充填剤１をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムを図３（試料Ａ）及び図４（試料Ｄ）に示す。
図１及び図２に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７０】
（比較例２）
参考例１と同様にして充填剤２をカラムに充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．９）、溶離液ＢとしてＭＥＳを１００ｍＭ濃度で、食塩を５００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．９）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行ったところ、得られたクロマトグラムは図３及び図４と同様であった。
【００７１】
（比較例３）
参考例１と同様にして充填剤３をカラムに充填し、溶離液Ａとして２０ｍＭクエン酸ナトリウム（和光純薬社製）水溶液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、参考例１に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図３及び図４と同様であった。
【００７２】
（実施例４）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇ及び２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東京化成社製）１００ｇの混合物に過酸化ベンゾイル（和光純薬社製）１．５ｇを溶解した。これを４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学製）水溶液２５００ｍｌに分散させ、撹拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍ（以下、充填剤４という）の粒子を得た。
【００７３】
参考例１と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液ＡとしてＭＥＳを１０ｍＭ濃度で、食塩を１００ｍＭ濃度で含む水溶液（ｐＨ５．７）、溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、参考例１に準じて（但し、流速は１．５ｍｌ／分とした）ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図５に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図６に示した。図５では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図６ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００７４】
（実施例５）
特公平８−７１９７号公報に記載の方法により、充填剤を調製した。
トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４００ｇに過酸化ベンゾイル１．５ｇを溶解し、４重量％ポリビニルアルコール水溶液２５００ｍｌに分散した。撹拌しながら窒素雰囲気下で昇温し、８０℃で１時間重合した。１時間後メタクリル酸１５０ｇを添加し、さらに１時間８０℃で重合した。重合後、洗浄し乾燥した後、分級して平均粒径６μｍの粒子（以下、充填剤５という）を得た。
参考例１と同様にして充填剤５をカラムに充填し、溶離液Ａとして２０ｍＭ濃度でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（和光純薬社製）を含む１１０ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ６．０）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じてヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは、図５及び図６と同様であった。
【００７５】
（比較例４）
実施例４と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムを図７（試料Ａ）及び図８（試料Ｄ）に示す。
図５及び図６に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７６】
（比較例５）
実施例５と同様にして充填剤５をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）及び溶離液Ｂとして３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、実施例４に準じて（溶離液Ａ及びＢの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。得られたクロマトグラムは図７及び図８と同様であった。
【００７７】
（参考例６）
実施例４と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む１００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｂとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む２００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｃとして１０ｍＭの濃度でコハク酸を含む４００ｍＭ食塩水溶液（ｐＨ５．８）を用いて、測定開始より０〜０．３分の間は溶離液Ａを流し、０．３〜１．０分の間は溶離液Ｂを流し、１．０〜１．２分の間は溶離液Ｃを流し、１．２〜２．０分の間は溶離液Ａを再び流したことの他は、実施例４に準じて（但し、試料注入量は１０μｌ）ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図９に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図１０に示した。図９では、ピーク３及び４が良好に分離されている。また、図１０ではＡＨｂやＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも良好に分離されていることがわかる。
【００７８】
（比較例６）
参考例６と同様にして充填剤４をカラムに充填し、溶離液Ａとして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、溶離液Ｂとして１２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）及び溶離液Ｃとして４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．９）を用いて、参考例６に準じて（溶離液Ａ、Ｂ及びＣの通流時間は、実用的な測定時間の範囲内で、できるだけ良好な分離ができるように変えた）、ヘモグロビン類の測定を行った。試料Ａを用いて得られたクロマトグラムを図１１に、試料Ｄを用いて得られたクロマトグラムを図１２に示した。図９及び図１０に比較して、測定時間が長いにもかかわらず、分離能が悪いことが分かる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明１の測定方法によれば、従来のヘモグロビン類の測定法における問題点であった測定時間の延長や、分離性能が解決され、短時間内に、かつ高精度にヘモグロビン類を分離できる。
【００８０】
本発明２の測定方法によれば、従来短時間では分離が困難であった不安定型ＨｂＡ１ｃを安定型ＨｂＡ１ｃから分離できるため、従来より短時間で、精度良く、ヘモグロビン類を測定できる。また、ＡＨｂ、ＣＨｂのような修飾ヘモグロビンも安定型ＨｂＡ１ｃより分離でき、またＡＨｂとＣＨｂも分離できるため、それぞれを定量することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 参考例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】 参考例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】比較例１の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】比較例１の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例４の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図８】比較例４の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図９】 参考例６の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１０】 参考例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１１】比較例６の測定条件により、試料Ａのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図１２】比較例６の測定条件により、試料Ｄのヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１ ＨｂＡ１ａ及びＨｂＡ１ｂのピーク
２ ＨｂＦのピーク
３ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
４ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
５ ＨｂＡ０のピーク
６ ＡＨｂのピーク
７ ＣＨｂのピーク
Claims (3)
- 液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、スルホン酸基を有する充填剤を用い、かつ、スルホン酸基を有する化合物を含む緩衝液を溶離液として用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、リン酸基を有する充填剤を用い、かつ、リン酸基を有する化合物を含む緩衝液を溶離液として用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
- 液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であって、カルボキシル基を有する充填剤を用い、かつ、カルボキシル基を有するグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液を溶離液として用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
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