JP6283517B2 - 抗体調製物 - Google Patents

Description

本発明は、特異的な補体活性化活性を有するが非特異的な補体活性化能が低いＩｇＭを含む抗体（免疫グロブリン）調製物に関する。本発明はまた、前記抗体調製物の医薬における使用に関する。

ヒト血漿から調製され、静脈内投与に適する免疫グロブリン組成物は、当技術分野において知られており、数十年間に亘って広範な疾患の治療において重要な役割を果たしてきた。免疫グロブリンは、例えば、ヒトの感染症の治療に用いられ、様々な生化学的及び生理学的性質に基づいて様々なクラスに分類することができる。免疫グロブリンＧは、ウイルス抗原に対する防御に関与し、一方、ＩｇＭは、抗細菌及び抗毒素免疫反応において主たる活性を有する。

免疫グロブリン溶液は、様々な割合のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含み、これらの割合が異なる調製物は、その治療適応も異なる。例えば、高割合のＩｇＭを含む調製物は、細菌感染症の予防又は治療に用いられる。

免疫グロブリン溶液は、通常、血漿又は血清の画分、例えば、Ｃｏｈｎ画分から調製される。次いで、これら画分は、多数の精製工程に付されて、ウイルス、変性タンパク質、プロテアーゼ、及び脂質等の混入物が除去される。

分画するためのヒト血漿は、数千人のドナーから回収されるので、元血漿を徹底的に試験しているにも関わらず、病原ウイルスを含有している場合がある。したがって、医療で使用するための安全な製品を得るためには、ウイルスを不活化又は除去するためのプロセス工程が必須である。ウイルスを不活化／除去するための幾つかの技術が、当技術分野において知られている。例えば、化学的処理、ＵＶＣ光の照射、又はナノ濾過であり、これらは、全体的なウイルス安全性を保証するために実施される。

前記プロセス工程のウイルス除去能又は不活化能は、生産プロセスの実験室規模のモデルを用いて検証され、各工程について、除去又は不活化係数が求められる。不活化／除去係数を増加させることにより、更なるウイルス安全性が医薬品に付加される。今日、規制機関による指針では、血漿に由来する医薬品の製造において、エンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスに対する少なくとも２つの有効な工程を実施することが必要である。エンベロープウイルスの不活化又は除去には、溶剤／界面活性剤処理、オクタン酸処理、ナノ濾過、及び熱処理等の幾つかの方法が有効であるが、例えば、パルボウイルス等の非エンベロープウイルスを不活化又は除去するための方法は、僅かしか知られていない。これら非エンベロープウイルスは、多くの場合非常に小さく、通常２０ｎｍ超の孔径のナノフィルタを通過する。この孔径は、３０ｎｍ以下の直径を有するＩｇＭ分子には小さすぎる。非エンベロープウイルスは、β−プロピオラクトン等の化学物質により有効に不活化されるが、機能の低下した修飾免疫グロブリンも生じさせる。別の有効な処理は、ＵＶＣ照射（特許文献１、ＣＡＦ−ＤＣＦ）である。しかし、知られた溶剤／界面活性剤処理、オクタン酸処理、及び穏やかな熱処理は、非エンベロープウイルスに対して実質的に効果を有しない。

上述したように、潜在的に存在するウイルスに加えて、脂質、プロテアーゼ、タンパク質凝集体、及び変性免疫グロブリン等の他の混入物を除去する必要もある。これらのあらゆる混入物を除去することは、（１）製品が、ウイルスの混入に関する生物学的安全性の指針に準拠することを保証するため、（２）製品が、静脈内投与後患者にとって忍容性を有するようにするため、（３）製品が、長期保存に対し安定であるようにするため（タンパク質分解活性が少しでも残存すると、長期保存期間、例えば２年間に亘る保存期間において製品を分解させる場合がある）、及び（４）望ましい化合物混合物／医薬組成物を得るために、必須である。

しかし、同時に、混合物を除去するための精製工程は、できる限り免疫グロブリン分子がその正常な生物学的活性を保持し且つ溶液中に大量に保持されるように、免疫グロブリン分子に干渉しないことが必須である。例えば、ＵＶＣを長時間照射すると、最終免疫グロブリン溶液中で得られるネイティブで活性のあるＩｇＭの収量が低下する場合があるなど、多くの知られた精製工程は、免疫グロブリンの活性、特にＩｇＭに対してネガティブな影響を及ぼす場合があるので、このバランスをとることは困難である。これは、最終免疫グロブリン溶液の有効性を低下させるだけでなく、インビボにおける前記溶液の忍容性を低下させる場合もある。

特定の精製工程により増加する場合がある凝集体及び変性免疫グロブリンは、特に、患者に対する潜在的なリスクとなる。その理由は、補体を非特異的に活性化する能力が高いので、これら変性免疫グロブリンを投与された患者において重篤な副作用を生じさせるためである。非特異的な補体活性化とは、特定の抗体−抗原複合体が存在しなくても補体カスケードが開始されることを指す。非特異的な補体活性化は、血圧低下、紅潮、頭痛、発熱、悪寒、悪心、嘔吐、筋肉痛、呼吸困難、及び頻拍等の望ましくない副作用を引き起こす場合があるので、厳密に避けるべきことである。他方、特異的な補体活性化は、望ましいものであり、免疫グロブリンが特定の抗原に結合した後で初めて生じる。

非特異的な補体活性化は、欧州薬局方に記載されている標準化試験により、所謂抗補体活性（ＡＣＡ）として測定される。

病原体の免疫防御における補体系の役割は、よく知られている。補体系は、約２０のタンパク質からなり、これらが順次活性化される。古典的補体経路は、通常、その活性化に特定の抗原抗体複合体を必要とし、一方、第二経路は、抗体が存在しなくても抗原により活性化することができる。補体活性化の古典的経路及び第二経路はいずれも、プロテアーゼＣ３コンベルターゼを生成する。Ｃ３コンベルターゼは、Ｃ３成分を切断及び活性化してＣ３ａ及びＣ３ｂを生成し、Ｃ５コンベルターゼによるＣ５ａ及びＣ５ｂの生成という更なる切断及び活性化事象のカスケードを引き起こす。Ｃ５ｂは、膜侵襲経路を開始させ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及び多量体Ｃ９からなる膜侵襲複合体を生じさせる。これは、膜貫通チャネルを形成する補体カスケードの細胞溶解性最終産物であり、細菌等の標的細胞の浸透圧溶解を引き起こす。

補体活性化は、更に、生物学的活性タンパク質Ｃ５ａなどのアナフィラトキシンを形成させる。このアナフィラトキシンは、免疫細胞及び炎症性細胞に対して強力な走化作用を有する物質であり、細胞を活性化させ、マスト細胞からヒスタミンを放出させる。補体活性化が過剰であるか若しくは制御されていない及び／又は非特異的である場合、Ｃ５ａの過剰産生は、患者に有害な作用を引き起こす場合がある。

Ｃ５ａは、有効な白血球の化学誘引物質であり、補体活性化部位に白血球、特に好中顆粒球を蓄積させる。Ｃ５ａは、白血球を活性化し、また、強力な炎症メディエータである。これら機能は、特定の抗体−抗原複合体が反応している間は有益であるが、副作用の可能性があるので、Ｃ５ａの非特異的生成を全て避けなければならない。

ＩｇＧ調製物とは対照的にＩｇＭ抗体が溶液中で容易に凝集するので、非特異的な補体活性化は、ＩｇＭ免疫グロブリン調製物（即ち、少なくとも５％のＩｇＭを含む調製物）において特に問題である。ＩｇＭ調製物は、特に、血漿濃度に比べてＩｇＭ濃度が富化されており且つ液体溶液で保存される場合、安定化させるのが困難である。ＩｇＭは、補体の強力なアクチベータであり、僅か１分子が抗原に結合しただけで補体を活性化させることができることが知られている。これは、補体を活性化させるためには、互いに近接する抗原に２分子以上のＩｇＧが結合しなければならないＩｇＧとは対照的である。

更に、ＩｇＭ含有免疫グロブリン調製物により治療される主な適応症は、細菌感染症及び敗血症である。これら疾患患者は、既に低血圧でもあるので、更に望ましくない非特異的な補体活性化及びＣ５ａが生じると、患者の状態は極めて悪化する。したがって、ＩｇＭ調製物は、静脈内投与用に調製することが困難であると報告されている。

ヒト血漿からＩｇＭ含有免疫グロブリン調製物を製造するための幾つかの方法が、当技術分野において報告されている。

ヒトＩｇＭ溶液の初期における精製は、古典的なＣｏｈｎ血漿分画法又はそのよく知られた改良法（例えば、Ｃｏｈｎ／Ｏｎｃｌｅｙ、Ｋｉｓｔｌｅｒ／Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）により実施されている。低温エタノール沈殿プロセスを用いると、ＩｇＭ画分は、画分ＩＩＩ又は画分Ｉ／ＩＩＩ（Ｂ又はＢ＋Ｉとも呼ばれる）に回収される。ＩｇＭが富化されたタンパク質溶液を精製するために、画分ＩＩＩ又は画分Ｉ／ＩＩＩから出発する方法が報告されている。特許文献２には、オクタン酸、β−プロピオラクトン処理を用いる工程と、陰イオン交換樹脂を用いる吸着工程とを含む画分ＩＩＩから出発する精製方法が記載されている。この方法を用いてＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（登録商標）が製造される。Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎは、今日まで、唯一市販されている静脈内投与用ＩｇＭ製品である。β−プロピオラクトンは、存在する可能性のあるウイルスを不活化するために殺菌工程で用いられるよく知られた化学物質である。β−プロピオラクトンは、タンパク質の化学修飾を引き起こす非常に反応性の高い物質であるので、免疫グロブリンの抗ウイルス活性及び抗細菌活性もかなり失われる。他方、この化学修飾は、化学修飾されていない免疫グロブリンと比べて抗補体活性を低下させる。特許文献３は、陰イオン交換クロマトグラフィー、β−プロピオラクトン、ＵＶＣ光照射、及び高温（４０℃〜６０℃）におけるインキュベート工程を用いることにより抗補体活性の低下した静脈内投与用ＩｇＭ濃縮物の調製について記載している。この方法により製造される調製物は、化学修飾されているので液体溶液中で安定である時間は限られていた。ＩｇＭ濃度は、総免疫グロブリン含量の５０％超であった。

β−プロピオラクトンで化学修飾されていないＩｇＭ富化タンパク質溶液の調製について、特許文献４及び５に記載されている。これらの方法は、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩ又は画分ＩＩ／ＩＩＩから出発して、好適なタンパク質溶液をオクタン酸処理及び陰イオン交換クロマトグラフィーに付すことを含む。特許文献４では、Ｃｏｈｎ画分ＩＩＩ中に存在する脂質を除去するために、１５分間撹拌することによりオクタン酸処理が実施される。

特許文献４に係る調製物は、０．６ＣＨ５０／ｍｇタンパク質〜０．８ＣＨ５０／ｍｇタンパク質という低い抗補体活性を有していたが、安定化及びβ−プロピオラクトンによるウイルスの不活化を行わなければならなかった。低い抗補体活性とは、免疫グロブリンに関するＥＰモノグラフに従って１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質以下であるとみなす。

特許文献５には、抗補体活性を低下させるために、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることによる静脈内投与用ＩｇＭ富化調製物の調製について記載されている。更に、４０℃〜６０℃、好ましくは５０℃〜５４℃にてｐＨ４〜ｐＨ４．５で熱処理すると抗補体活性が低下することが記載されている。この調製物は、数ヶ月間調製物の安定性を確保するために凍結乾燥させなければならなかった。液体溶液として長期安定性を有することについて示すことはできなかった。

非特許文献１は、ＰＥＧ沈殿により単離したＩｇＭ調製物が、標準的な補体固定試験により高い抗補体活性（ＡＣＡ）を有しており、３７℃で８時間ｐＨ４．０にて前記ＩｇＭ調製物をインキュベートし、次いで中性ｐＨに再調整することによりこのＡＣＡ活性が１０倍低下することを示した。この１０倍低下が静脈内投与に対する忍容性を確保するのに十分であるかどうかは示されていない。非特許文献１は、ＩｇＭ濃縮物の特異的な補体活性化能について評価しておらず、また、任意の動物又はヒトモデルにおける安全性も評価していない。

４０℃〜６２℃、好ましくは４５℃〜５５℃で、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．０にてＩｇＭ調製物を穏やかに熱処理して、非特異的な補体活性化を減少させる別の方法が記載されている（特許文献６）。この特許出願では、プレカリクレインアクチベータ及びリポタンパク質を遠心分離により除去するために、オクタン酸をＣｏｈｎ画分ＩＩＩ懸濁液に添加する。しかし、この穏やかな熱処理でもＩｇＭの抗原決定基が一部失われる。これによって、新生抗原が生じるリスクが増し、ヒトにおける免疫原性の上昇又は活性の喪失が導かれる場合もある。

オクタン酸沈殿工程後にプロテアーゼ処理（例えば、ペプシン処理）を行うことによる静脈内投与用ＩｇＭ含有タンパク質溶液の調製が、特許文献７に記載されている。プロテアーゼ処理により、免疫グロブリン分子が部分的に断片化され、Ｆａｂ及びＦｃ部分の全体的な機能活性が低下する。したがって、プロテアーゼ処理された免疫グロブリンは、修飾されていないとみなすことはできない。また、この調製方法では、分子量１００ｋＤ未満の断片が約５％生じる。

オクタン酸処理を実施するための知られた方法（特許文献４及び７）は、非エンベロープウイルスの除去及び不活化に対してオクタン酸処理が有効ではなく、また、全てのタンパク質分解活性を実質的に除去するものではないという問題点を有する。

特許文献８には、治療用途のための少なくとも３３％のＩｇＭを含む高濃度ＩｇＭ調製物が開示されており、前記調製物は、同種凝集素力価を実質的に有しない。この特許出願では、オクタン酸を添加することによりオクタン酸沈殿が実施され、同種凝集素は、Ｓｙｎｓｏｒｂアフィニティクロマトグラフィーにより除去される。最終調製物は、凍結乾燥させる必要があった。

総じて、免疫グロブリンが化学的に若しくは酵素的に修飾されている、クロマトグラフィーにより更に精製される、及び穏やかな熱処理に付される、のうちの少なくとも１つにより、抗補体活性の低いＩｇＭ含有調製物の製造が可能である。しかし、これら方法は、ウイルスが除去／不活化されない（延いては、ウイルス安全性ではない）、ネイティブ型の免疫グロブリンの量が低下している、及び／又は抗補体活性が残存しているという問題点を有する。したがって、ヒトにおける静脈内投与に適した、改善されたＩｇＭ含有免疫グロブリン調製物の提供が依然として必要とされている。

欧州特許第１８４２５６１号明細書 欧州特許第００１３９０１号明細書 欧州特許第０３５２５００号明細書 欧州特許第０４１３１８７号明細書（Ｂｉｏｔｅｓｔ） 欧州特許第０４１３１８８号明細書（Ｂｉｏｔｅｓｔ） 欧州特許第０４５０４１２号明細書（Ｍｉｌｅｓ） 欧州特許第０８３５８８０号明細書（米国特許第６１３６３１２号明細書、ＺＬＢ） 欧州特許第０３４５５４３号明細書（Ｂａｙｅｒ、Ｍｉｌｅｓ）

Ｍ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．"Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ"，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ２３，１１９−１２５（１９７２）

第１の態様において、本発明は、ヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物であって、ＩｇＧと、ＩｇＡと、抗体の総量の少なくとも５重量％のＩｇＭ抗体とを含み、ヒト血漿から調製され、特異的な補体活性化活性を有すると共に、非特異的な補体活性化能の測定に適したヒト血清を用いるインビトロアッセイにおいて、Ｃ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかを実質的に産生しない抗体調製物を提供する。

驚くべきことに本出願人らは、特異的な補体活性化活性を有すると共に非特異的な補体活性化活性を実質的に有しないＩｇＭ抗体調製物をヒト血清から製造することが可能であることを見出した。該調製物は、静脈内投与後の非特異的な補体活性化に伴う血圧低下などの望ましくない副作用を低減しつつ製造効率を維持するので、有利である。

更なる態様において、本発明は、
（ａ）ヒト血漿から血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として調製する工程；
（ｂ）Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；
（ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程；
（ｄ）前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲でインキュベートしてインキュベート溶液を得る工程；
（ｅ）前記インキュベート溶液にＵＶＣを照射してＵＶＣ照射溶液を得る工程；及び
（ｆ）前記ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得る工程；
を含む本発明の抗体調製物をヒト血漿から調製する方法を提供する。

驚くべきことに本出願人らは、免疫グロブリン溶液をカルボン酸と混合する工程における振動式撹拌機の使用が、非常に有利であることを見出した。該工程により、望ましくないタンパク質（プロテアーゼなど）がより効率的に除去され、免疫グロブリン製剤を製造するために行われる下流の処理工程により適した中間生成物が得られる。即ち、該中間生成物は、これら下流の処理工程をより効率的にする。したがって、下流の処理工程は、より穏やかな工程とすることができ、これは、特異的な補体活性化活性を有すると共に非特異的な補体活性化活性を実質的に有しない本発明の抗体調製物の達成を促す。

特に、工程（ｃ）で得られるＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物は、穏やかな酸性条件での処理、ＵＶＣ照射による処理などの更なる処理工程に付すことができ、これにより、静脈内投与に適した、次の有利な性質、即ち、抗補体活性が低い；ネイティブで活性のあるＩｇＭを高レベルに維持する；ウィルス安全性を有し、そのためヒトにおける静脈内投与に適する、という性質を有するＩｇＭ含有免疫グロブリン製品又は抗体調製物が製造される。本明細書に記載の方法で達成されるウィルス安全性のレベルは、これまで得られるレベルではない。更なる利点は、タンパク質分解活性が低いこと（そのため、長期保存安定性を有すること）及び化学的に修飾されていないことである。

更に本発明は、医薬において使用するための本発明の抗体調製物を提供する。一実施形態においては、前記抗体調製物は、免疫障害又は細菌感染症の治療において使用される。

更なる態様において、本発明は、本発明の抗体調製物を投与することを含む患者の治療方法を提供する。

添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明するが、以下の説明はほんの１例に過ぎない。

図１は、本発明に係る静脈内投与に適した抗体調製物を得るために用いることができる各工程の概要である。このうち、振動式混合機を用いるオクタン酸処理、ｐＨ４処理、及びＵＶＣ処理がハイライトされている。出発材料は、ヒト血漿の標準的な低温エタノール沈殿プロセスにより得られる。 図２は、ＩｇＭ調製物とインキュベーションした後のヒト血清中に存在するＣ５ａの経時における平均濃度を示すグラフである。 図３は、ＩｇＭ調製物とインキュベーションした後のヒト血清中に存在するＣ３ａの経時における平均濃度を示すグラフである。

抗体調製物
上述の通り、本発明は、ヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物であって、ＩｇＧと、ＩｇＡと、抗体の総量の少なくとも５重量％のＩｇＭ抗体とを含み、ヒト血漿から調製され、特異的な補体活性化活性を有すると共に、非特異的な補体活性化能の測定に適したヒト血清を用いるインビトロアッセイにおいて、Ｃ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかを実質的に産生しない抗体調製物を提供する。

本発明の抗体調製物は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が免疫グロブリン（ポリクローナル抗体）であるヒト血漿タンパク質を含む。特に、前記調製物は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを含み、該免疫グロブリンの少なくとも５％はＩｇＭである。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ免疫グロブリンの量は、比濁分析法又はＰｈ．Ｅｕｒ．２．７．１に基づく免疫沈降法により測定することができる。

前記抗体調製物は、少なくとも１０％のＩｇＭを含むことがより好ましく、少なくとも１５％のＩｇＭを含むことが最も好ましい。ＩｇＧ及びＩｇＡに関しては、前記抗体調製物は、５％超のＩｇＡ及び４０％超のＩｇＧの少なくともいずれかを含むことが好ましい。パーセンテージ（％）はいずれも、抗体の総量に対するパーセンテージである（例えば、ＩｇＭの量（ｇ）／（ＩｇＧの量（ｇ）＋ＩｇＡの量（ｇ）＋ＩｇＭの量（ｇ））×１００など）。

免疫グロブリン分子のＦｃ部分の機能的活性を評価することによって前記抗体調製物が特異的な補体活性化活性（即ち、抗原の存在下での補体カスケード活性化能）を有することを判定する方法は、当技術分野において知られている。特に、好適な方法が風疹抗原を用いる欧州ガイドラインＩＣＨ Ｓ６（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／３０２／９５）による現行のＥｕｒ．Ｐｈ．方法に記載されている。以下、生物学的活性に言及して、特異的な補体活性化についてより詳細に説明する。

前記抗体調製物は、正常なヒト血清（即ち、健常人由来の血清）における非特異的な補体活性化の判定に適したインビトロアッセイにおいて、非特異的な補体活性化（即ち、抗原の不存在下での免疫グロブリンによる補体カスケードの活性化）を実質的に引き起こさない。特に、該アッセイは、抗原の不存在下でアッセイで生じたＣ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかの量を測定することができるものである。上述したように、補体が活性化されるとＣ５ａ及びＣ３ａが産生される。これらのタンパク質はいずれも補体系の終末経路（古典的／レクチン経路又は第二経路のいずれでもなく）に関わるので、これらは、補体活性化の判定に特に有用である。

前記抗体調製物は、抗原の不存在下におけるヒト血清を用いた適切なインビトロアッセイにおいて、Ｃ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかを実質的に産生しない。好ましい実施形態においては、１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に調整された前記抗体調製物が６０分間の前記アッセイ後に産生するＣ５ａが２００ｎｇ／ｍＬ未満であるか、１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に調整された前記抗体調製物が６０分間の前記アッセイ後に産生するＣ３ａが６，０００ｎｇ／ｍＬ未満であるか、又は１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に調整された前記抗体調製物が６０分間の前記アッセイ後に産生するＣ５ａが２００ｎｇ／ｍＬ未満であり且つＣ３ａが６，０００ｎｇ／ｍＬ未満である。

これに代えて或いはこれに加えて、前記アッセイにおいて、前記抗体調製物により産生されるＣ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかの量が、同一のアッセイにおいて、ヒト血清単独により産生されるＣ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかの量の±７０％と同量である。これは、前記アッセイの６０分間後であることが好ましい。

好適なアッセイが当技術分野において知られている。好ましい実施形態においては、前記アッセイは、次の工程を含む：
（ａ）抗体調製物を１００μＬのヒト血清に添加して１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭを含有する反応混合物を調製し、該反応混合物を３７℃で６０分間、定速撹拌下にてインキュベートする工程；
（ｂ）ＥＬＩＳＡに適した前記反応混合物の希釈系列を調製する工程；
（ｃ）Ｃ５ａ又はＣ３ａに対する一次抗体及び二次抗体並びに発色性物質を用いて、前記反応混合物の希釈系列に対してサンドイッチＥＬＩＳＡを行う工程であって、前記二次抗体は、酵素とコンジュゲートされており、前記発色性物質は、前記酵素の基質である工程；
（ｄ）前記発色性物質を、前記二次抗体を介してＣ５ａ又はＣ３ａと結合した前記酵素に接触させた結果生じる色の変化に基づいて前記反応混合物中のＣ５ａ又はＣ３ａの量を測定する工程。

前記ＥＬＩＳＡにおいては、前記一次抗体でコーティングしたアッセイプレートの各ウェルに各希釈系列を接触させる。インキュベーション後、ウェルを洗浄して希釈サンプルを除去する。続いて、前記二次抗体をインキュベートすると、ウェル中の一次抗体に結合したＣ３ａ／Ｃ５ａに結合する。これは、一次抗体に結合したＣ３ａ／Ｃ５ａ上に固有のエピトープが存在するからである。結合していない二次抗体を除去する更なる洗浄を行った後、前記発色原体をインキュベートすると、二次抗体にコンジュゲートされた前記酵素と反応する。この結果生じる色の変化は、光度計による吸光度測定により測定することができ、各希釈系列中に存在するＣ５ａ／Ｃ３ａ濃度に比例する。

ここで、工程（ａ）で添加される前記抗体調製物の量は、前記反応混合物のＩｇＭ濃度を１．７２ｍｇ／ｍＬとするのに適切な量である。工程（ｃ）及び（ｄ）は、次の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を含むことができる：（ｉ）前記反応混合物の希釈系列を、Ｃ３ａ／Ｃ５ａに対する一次抗体（即ち、「捕捉抗体」）をコーティングしたアッセイプレートの各ウェルに添加すること；（ｉｉ）前記プレートをインキュベートしてＣ３ａ／Ｃ５ａを前記一次抗体と結合させること；（ｉｉｉ）前記プレートを洗浄して、一次抗体に結合していない希釈液中の物質を除去すること；（ｉｖ）Ｃ３ａ／Ｃ５ａと結合する酵素結合二次抗体（検出抗体）を添加すること；（ｖ）前記プレートをインキュベートして二次抗体をＣ３ａ／Ｃ５ａと結合させること；（ｖｉ）前記プレートを洗浄して結合していない二次抗体を除去すること；（ｖｉｉ）前記酵素によって発色シグナルに変換される化学物質を添加すること；及び（ｖｉｉｉ）前記プレートの各ウェルの吸光度を測定してＣ３ａ／Ｃ５ａの有無及び量を測定すること。

前記サンドイッチＥＬＩＳＡは、当技術分野において知られた方法に従って行われる、及び／又は、市販のキットを用い製造業者の説明書に従って行われる。好適で特に好ましい市販の酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットは、Ｑｕｉｄｅｌ社製 ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ５ａ Ｐｌｕｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ；Ａ０２５、及びＱｕｉｄｅｌ社製 ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ３ａ Ｐｌｕｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ；Ａ０３２である。

本発明の更なる実施形態においては、前記抗体調製物は、１，２００ｋＤａ以上の凝集体の含有量が２％未満、好ましくは１．５％未満である。これは、免疫グロブリン量のパーセンテージ（％）を意味する。凝集体の含有量は、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により測定することができる。これは、当技術分野において知られた方法により行うことがきる。

これに代えて或いはこれに加えて、前記抗体調製物の非特異的な補体活性化を実質的に生じさせない能力は、前記抗体調製物の抗補体活性として定義することができ、該抗補体活性は、１．０ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満であり、より好ましくは０．７５ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満である。このスケールで抗補体活性を測定するアッセイは、欧州薬局方（方法２．６．１７，Ｐｈ．Ｅｕｒ．６．Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８）に記載の方法に従って行うことができる。このアッセイについては、以下のアッセイの項目で詳述する。

好ましい実施形態においては、前記抗体調製物は、抗体の化学的又は酵素的修飾を伴う工程を行うことなしに、ヒト血清から調製されたものである。即ち、ヒト血清からの前記抗体調製物の製造プロセスは、抗体と、酵素的又は化学的修飾を引き起こし得る試薬とを接触させる工程を含まない。特に、前記プロセスは、抗体と該抗体の化学的修飾を引き起こし得るβ−プロピオラクトンとを接触させる工程、及び抗体と該抗体の酵素的分解を引き起こし得るペプシンとを接触させる工程のいずれも含まない。

これに代えて或いはこれに加えて、前記抗体調製物は、抗体を４０℃以上で１０分間以上加熱することを伴う工程を行うことなしに、ヒト血清から調製されたものである。加熱工程により、免疫グロブリンが変性し免疫グロブリン凝集体を生じることが知られている。

前記抗体調製物は、非エンベロープウィルスを３ｌｏｇ_１０超、好ましくは４ｌｏｇ_１０超、最も好ましくは５ｌｏｇ_１０超除去可能なプロセスで調製されることが更に好ましく、前記抗体調製物にウィルス安全性をもたせる。そのため、前記抗体調製物は、従来の抗体調製物よりも安全であり、特に、例えばパルボウィルスなどの活性な非エンベロープウィルスに関して安全である。これにより、ウィルスを実質的に含有しない抗体調製物、特に非エンベロープウィルスを実質的に含有しない抗体調製物となる。更に、本発明の方法は、前記抗体調製物の活性ＩｇＭの量と抗補体活性のいずれに対しても大きな影響を与えることなく、前記レベルのウィルス粒子除去／不活化を達成することが可能である。

特に、前記抗体調製物は、次の（ａ）〜（ｆ）の工程を含むプロセスによってヒト血漿から調製することができる：
（ａ）ヒト血漿から血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として調製する工程；
（ｂ）Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；
（ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程；
（ｄ）前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲でインキュベートしてインキュベート溶液を得る工程；
（ｅ）前記インキュベート溶液にＵＶＣを照射してＵＶＣ照射溶液を得る工程；及び
（ｆ）前記ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得る工程。

前記プロセスは、工程（ｄ）で得られたインキュベート溶液を、工程（ｅ）における照射の前にナノ濾過に付すことを更に含むことが好ましい。前記製造方法の更なる詳細と好ましい態様については、以下の項目で記載する。

本発明の更に好ましい実施形態においては、前記抗体調製物は、投与前のレベルから１０％超の動脈圧の低下を伴うことなしに、カニクイザルに１１５ｍｇＩｇＭ／ｋｇ体重／時間で投与することが可能である。上述したように、非特異的な補体活性化は血圧低下を引き起こすので、動脈圧に大きな変化がないことは、健常なサルのインビボで補体の非特異的活性化が実質的に生じていないことを示す。動脈圧は、右大腿動脈を介して下腹部大動脈に圧力カテーテルを挿入することにより測定することができる。

好ましい実施形態においては、前記抗体調製物は、肺炎球菌多糖体、大腸菌、エンテロコッカスフェカーリス、カンジダアルビカンス、及びクラミジアの１種以上に対する抗体を更に含むことができる。

更に好ましい実施形態においては、前記抗体調製物中の抗体の少なくとも９０％が生物学的に活性である。「生物学的に活性」という用語は、前記調製物中の抗体がネイティブの形態であり、特に抗原との特異的結合の結果、補体カスケードの活性化が可能であることを意味する。抗体調製物の生物学的活性は、抗体の力価／結合活性及びＦｃの完全性／機能を測定する当技術分野で知られたアッセイに基づいて評価することができる。特に、Ｆｃ機能の測定に適した風疹抗原を用いるインビトロアッセイにおいて、前記抗体調製物の抗体のＦｃ部分の活性が生物学的レファレンス調製物の活性の±１０％、より好ましくは±５％と同等である。

生物学的レファレンス調製物は、インターナショナルメディカルヘルスケアコミュニティ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）により用いられており、医薬品のコンシステンシーの確認に役立つ。このように、前記アッセイに好適な生物学的レファレンス調製物は、当技術分野において知られており入手可能である（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（バッチ番号３など）。特に、前記アッセイは、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ （バッチ番号３）をコントロールとして用いる国際的に認識されたＥｕｒ．Ｐｈ．２．７．９ 免疫グロブリンのＦｃ機能のための試験（Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｆｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（現行版２０１１年４月）に従って行うことができ、前記抗体調製物の活性（％）は、該コントロールに対して測定される。この試験は、次の工程（ｉ）〜（ｉｖ）を含む：（ｉ）タンニン酸処理済Ｏ型ヒト赤血球に風疹ウィルス抗原をロードして抗原被覆血球を調製する工程；（ｉｉ）前記抗体調製物を前記血球と共にインキュベートし、モルモットの補体を添加して補体により開始される血球の溶解を開始させる工程；（ｉｉｉ）５４１ｎｍにおける吸光度の経時変化に基づいて溶血速度を測定する工程；（ｉｖ）時間当たりの吸光度の最大変化を用いて前記抗体調製物の抗体の機能を評価する工程。

前記抗体調製物はまた、先行技術における抗体調製物よりもタンパク質分解活性が低いことが好ましい。特に、２℃〜８℃で保存したときに、前記調製物にタンパク質分解活性が検出されない。タンパク質分解活性は、以下のアッセイの項目及び実施例６に記載される発色性基質を用いる方法など、当技術分野において知られた標準的な試験方法により測定することができる。

本発明の抗体調製物は、グリシンなどの安定化剤を更に含むことができる。

当技術分野において知られた調製物と同様に、本発明の抗体調製物は、５℃±３℃で保存することができる。しかしながら、本発明の方法による効率的な精製により、前記抗体調製物の安定性は非常に優れている。最終産物は、２℃〜８℃で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、最も好ましくは２年間、液状で安定である。これは、ＨＰＳＥＣで測定される１．５％超のＩｇＭの断片化及び重合化がないこと、タンパク質分解活性の上昇がないこと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対するＩｇＭ抗体活性及びＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅに対するＩｇＭ抗体活性の２５％超の低下がないこと、抗補体活性の２５％超の上昇がなく１ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満を維持していることを意味する。更に、本発明の方法により製造される最終産物は、同一の基準で評価されたときに、室温（２３℃〜２７℃）で少なくとも３ヶ月間、好ましくは６ヶ月間、最も好ましくは１年間、液状で安定である。

抗体調製物の製造方法
上述したように、本発明は、免疫グロブリンを含む血漿画分からのＩｇＭ含有抗体調製物の調整を提供する。特に、本発明は、ヒト血漿から本明細書に記載の抗体調製物を製造するための方法であって、次の工程（ａ）〜（ｆ）を含む：
（ａ）ヒト血漿から血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として調製する工程；
（ｂ）Ｃ_７〜Ｃ_９カルボン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；
（ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程；
（ｄ）前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲でインキュベートしてインキュベート溶液を得る工程；
（ｅ）前記インキュベート溶液にＵＶＣを照射してＵＶＣ照射溶液を得る工程；及び
（ｆ）前記ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得る工程。

免疫グロブリン医薬組成物の調製に適した血漿画分及びそれらの製造方法は当技術分野においてよく知られている。前記血漿画分は、沈殿した血漿画分が好ましく、Ｃｏｈｎ分画法又はそのよく知られた改良法（例えば、Ｋｉｓｔｌｅｒ−Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ）のプロセスにより得られた沈殿血漿画分が最も好ましい。前記画分は、低温エタノール分画法により得られる画分Ｉ／ＩＩＩ又は画分ＩＩＩ（画分Ｂ＋Ｉ又は画分Ｂとしても知られる）が最も好ましい。前記血漿画分の免疫グロブリンは、少なくとも５％のＩｇＭを含むことが好ましい。

工程（ａ）は、血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として準備することを含む。多くの場合、免疫グロブリンの含有する血漿画分は、固体又は半固体の形態となる。したがって、この工程の目的は、前記血漿画分のタンパク質を確実に工程（ｂ）におけるカルボン酸との混合に適した状態にする、又はそのような状態になるように前記血漿画分のタンパク質を溶液状にすることである。この工程は、血漿画分を好適なバッファと混合することを含んでいてもよい。バッファのモル濃度は低いことが好ましく（即ち、１Ｍ未満）、ｐＨは４．５〜５．５であることが好ましい（例えば、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ５．０５±０．１）。混合は、ブレードミキサー又は振動式撹拌機を用いて完了させることができる。

工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた溶液をＣ_７〜Ｃ_９カルボン酸と振動式撹拌機を用いて混合し、混入タンパク質（例えば、プロテアーゼ、ウィルスなど）を沈殿させる。前記カルボン酸は、分岐していてもよいし、工程（ｂ）の効果を実質的に変えることがない置換基を有していてもよいし、分岐しており且つそのような置換基を有していてもよい。前記カルボン酸は、オクタン酸が好ましい。前記カルボン酸は、少なくとも０．０７５ｋｇ／ｋｇ血漿画分の濃度、多くても０．２ｋｇ／ｋｇ血漿画分の濃度で添加されることが好ましい。前記カルボン酸は、０．８ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．１５ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることがより好ましく、０．０９ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．１３ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることが最も好ましい。酸のモル濃度を適宜調整するで正確な濃度にすることができる。

振動式撹拌機は、化学品／医薬品業界での使用に好適ないかなる種類の市販の振動式撹拌機も用いることができる。好適な振動式撹拌機としては、例えば、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｎｇｅｒ有限会社から市販されている。特に、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ １」振動式混合機は実験室規模の実験に用いることができ、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｍｉｘｅｒ Ｔｙｐ ４」は生産規模の調製に用いることができる。前記振動式混合機は、製造業者の説明書に従って、特にタンパク質を含有する溶液の混合に好適であるとして製造業者によって記載されている設定で用いることができる。前記振動式混合機は、通常、１００Ｈｚ未満、振幅１０ｍｍ未満で運転させることができる。例えば、本発明者らは、「Ｌａｂｏｒｍｏｄｅｌｌ Ｔｙｐ １」を用いる実験室規模での振動混合を、２３０Ｖ電源を用いる場合には、５０Ｈｚで行った。前記混合プロセスの振動振幅は、０ｍｍ〜３ｍｍとし、ＩｇＭ調製物の場合には、好ましい振幅である３ｍｍとした。直径２３ｍｍ〜６５ｍｍの撹拌プレートを実験室規模の実験に用いた。生産規模では、直径３９５ｍｍの撹拌プレートを用いた（孔径：１３．５ｍｍ〜１６ｍｍ）。

工程（ｂ）においては、混合溶液のｐＨは、４．５〜５．５が好ましく、４．８〜５．３がより好ましい。この工程は、酢酸ナトリウムバッファ中で行うことができ、例えば、約０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファが用いられる。工程（ｂ）を行う際の温度は、１０℃〜３５℃が好ましく、１４℃〜３０℃がより好ましい。

振動式撹拌機による混合時間は、特に限定されないが、少なくとも３０分間〜最長３時間であることが好ましく、４０分間〜１１０分間であることがより好ましい。インキュベーション時間が３０分間未満であると、ウィルスの不活化レベルが低下することがある。

工程（ｂ）の一実施形態においては、リン酸三カルシウムを工程（ｂ）における前記溶液と混合する。これは、０．０１ｋｇ／ｋｇ血漿画分〜０．０２ｋｇ／ｋｇ血漿画分で添加されることが好ましい（リン酸三カルシウムは、固体又は半固体の形態であるので）。リン酸三カルシウムは、カルボン酸と同時に、別々に又は順次添加することができる。好ましい実施形態においては、リン酸三カルシウムは、カルボン酸の添加後少なくとも２０分間の間に添加される。

工程（ｃ）では、工程（ｂ）で沈殿させた混入タンパク質を前記溶媒から分離除去してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る（即ち、免疫グロブリン含有溶液）。この分離工程は、特に限定されず、当技術分野で知られたいかなる好適な方法によっても行うことができる。しかしながら、前記分離工程は、濾過により行うことが好ましく、限外濾過により行うことがより好ましい。したがって、工程（ｃ）の結果物は、濾過溶液である。

上述したように、本発明の方法は、混入タンパク質をより効率的に沈殿させ、その結果、工程（ｃ）が実施し易くなるので、製造効率の点で有利である。工程（ｂ）の結果得られる混合物を分離すると、透明で清澄な溶液、即ち、ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物が得られる。したがって、濾過は、より迅速且つより容易になる。

後続の処理工程（ｄ）〜（ｆ）は、工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を静脈内投与に適した抗体調製物にするために必要である。

工程（ｄ）は、工程（ｃ）で得られたＩｇＭ免疫グロブリン組成物を穏やかな酸性条件で処理することを含む。工程（ｅ）は、酸処理済組成物にＵＶＣを照射してＵＶＣ照射溶液を得ることを含む。工程（ｆ）は、ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得ることを含む。

穏やかな酸性条件での処理のために、工程（ｃ）で得られた前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物をｐＨ３．５〜ｐＨ４．５、好ましくはｐＨ３．８〜ｐＨ４．２でインキュベートして、インキュベート溶液を得る。穏やかな酸性条件は、好適な酸をＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物に添加することにより達成できる。例えば、０．２Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを調整することができる。

このインキュベーション工程は、３２℃〜４２℃で行うことが好ましく、３５℃〜３９℃で行うことがより好ましい。インキュベーション時間は、少なくとも２時間〜最長２４時間であることが好ましく、少なくとも９時間〜最長１６時間であることがより好ましい。

前記照射工程では、上述の穏やかな酸処理により得られたインキュベート溶液をＵＶＣ光で処理してＵＶＣ照射溶液を得る。この工程は、ＵＶｉｖａｔｅｃ（登録商標）装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）などの市販の装置を用いて行うことができる。潜在的に存在するウィルス及びプロテアーゼを更に不活化するためには、前記インキュベート溶液は、２５４ｎｍ±１０ｎｍで２００Ｊ／ｍ^２〜５００Ｊ／ｍ^２、より好ましくは２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２で処理することが好ましい。なお、通常必要とされるよりも穏やかな条件でのＵＶＣ処理は、振動撹拌によるオクタン酸処理後に本発明によって得られる清澄な濾液で初めて可能となる。標準的な撹拌技術で通常得られる、より乳白色又は不透明な溶液の場合には、照射時間をより長くする必要があり、ＩｇＭ活性の変性を促進すると共にウィルス不活化率を低下させ得る。

工程（ｆ）では、照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得る。前記濾過は、ナノ濾過であることが好ましく、孔径４０ｎｍ〜５０ｎｍのフィルタで行うことがより好ましい。

前記穏やかな酸処理、ＵＶＣ照射及び濾過工程のほかに、静脈内投与用の免疫グロブリン調製物を得るための追加の工程として、一回以上の更なる濾過工程を任意に行うことができる。一実施形態においては、処理されるタンパク質溶液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）に吸着させた後、深層濾過によりＳｅｐｈａｄｅｘから分離することができる。望ましくない付随タンパク質であるセルロプラスミンを除去するために、例えば、タンパク質溶液を７５ｍｇ／ｋｇＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ｐＨ５．８でバッチ式吸着に更に付してもよい。

特に好ましい実施形態においては、ＵＶＣ照射処理に先立ち、穏やかな酸処理により得られたインキュベート溶液をＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘに吸着させ、深層濾過により前記Ｓｅｐｈａｄｅｘから分離する。

他の実施形態においては、処理される免疫グロブリン溶液をナノメートルフィルタで濾過してもよい。孔径７５ｎｍ±５ｎｍ〜３５ｎｍ±５ｎｍのフィルタ、又は公称孔径７５ｎｍ〜３５ｎｍのフィルタ（例えば、Ｐａｌｌ社製 Ｕｌｔｉｐｏｒ（登録商標） ＤＶ５０）を前記プロセス中の各段階で用いることができる（例えば、公称孔径５０ｎｍは、５０ｎｍ以上の大きさのウィルスに対して保持率４ｌｏｇ_１０以上であることを意味する）。好ましい実施形態においては、上記段落に記載したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ工程から得られた溶液を、ＵＶＣ照射に先立ち０．２μｍフィルタで濾過する。

上に定義したプロセスにより得られた最終抗体調製物（即ち、処理されたＩｇＭ含有免疫グロブリン溶液）は、滅菌条件下でそのまま容器に充填してもよい。或いは、前記抗体調製物は、ｐＨ４〜ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ４．１〜ｐＨ４．５でグリシン含有バッファ中で製剤化してもよい。前記抗体調製物はまた、４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌのタンパク質濃度、好ましくは５５ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌのタンパク質濃度に希釈してもよい。なお、陰イオン交換クロマトグラフィーなどのよく知られた方法で、前記抗体調製物のＩｇＭ含量を上げることもできる。

既に述べたように、上記の方法は、ウィルス粒子の不活化率及び除去率をより高め、特にパルボウィルスなどの耐性の高い非エンベロープウィルスの不活化率及び除去率を高める。これらのウィルスは、通常、オクタン酸処理に対する感受性があまりない。更に、従来の撹拌に比べて、タンパク質分解活性をよりよく取り除くことができる。これらの特徴は、化学的に修飾されていないＩｇＭの量を高く維持しながら達成される。この知見は、オクタン酸による処理は、非エンベロープウィルスに対して有効な工程ではなく、ウィルス安全性を改善するためには、β−プロピオラクトン処理などのより過酷な方法でウィルスを不活化しなければならないという従来の見解と対照的である。また、タンパク質分解活性を完全に取り除くために例えばオクタン酸濃度を上げることが、多量のＩｇＭを失うことになることは、よく知られていた。

前記方法のこのような結果は、オクタン酸処理と組合わせて振動式の混合装置を使用することで達成される。ＩｇＭは、不所望の高い抗補体活性をもたらし得るせん断応力に対して感受性が非常に高いことが知られているので、この事実は、特に驚くべきことである。即ち、ＩｇＭ組成物を調製するために振動式混合機を用いることは、誰も考えないであろうし、ＩｇＭ含有溶液の処理に振動式混合機を用いることでこのような望ましい影響を期待する者もないであろう。

更に、前記方法において、工程（ｂ）で得られるオクタン酸処理済溶液の濾過による清澄化などの工程（ｃ）で達成される分離は、振動式混合装置を用いることで向上する。分離がより容易に達成されると、処理時間が短縮され製造コストが低減する。工程（ｃ）により、下流の処理に有利な透明溶液が得られる。オクタン酸処理済ＩｇＭ含有溶液を撹拌し濾過して得られる従来の溶液は、乳白色又は不透明である。

工程（ｃ）で得られるＩｇＭ含有組成物は、穏やかな酸性条件（例えば、ｐＨ４）での処理及びＵＶＣ照射工程に付して、ウィルス安全性を更に高めると共に最終産物を安定化させることが好ましい。工程（ｃ）で得られたＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物の清澄度を高めることにより、３ｌｏｇ_１０超又は４ｌｏｇ_１０超の非エンベロープウィルスを不活化するために必要なＵＶＣ照射時間を短縮することが可能である。これにより、ＵＶＣ処理後のネイティブで活性のあるＩｇＭの量がより多くなる。

驚くべきことに、これらの工程により、ネイティブで活性のあるＩｇＭが高量であり、抗補体活性が低く、タンパク質分解活性が低く、抗菌活性及び抗ウィルス活性が高く、静脈内投与用の医薬にとって重要な特徴であるエンベロープウィルス及び非エンベロープウィルスに関する顕著なウィルス安全性を有する、化学的にも酵素的にも修飾されていないＩｇＭ含有溶液が得られる。更に、処理されたＩｇＭ含有溶液は、改善された長期安定性を有し、２℃〜８℃で１２ヶ月間を超える期間、溶液として非常に安定である。

医薬用途
本発明の抗体調製物は、医薬における使用に適しており、免疫障害及び感染症、特に、ＩｇＭ欠乏症及び細菌感染症の治療に用いることができる。静脈内投与用のヒトＩｇＭ富化多価免疫グロブリン調製物は、多価免疫グロブリンＧ調製物に比べて、臨床的に重要なグラム陰性菌及びグラム陽性菌に対する抗体力価が高く、且つグラム陰性菌のエンドトキシン及びグラム陽性菌のエンドトキシンに対する抗体力価も高い。

特に、本発明の抗体調製物は、患者への静脈内投与に適している。

本発明はまた、本発明の抗体調製物を患者に投与することを含む患者の治療方法を提供する。特に、前記患者は、免疫障害又は細菌感染症に罹患している患者である。より好ましい実施形態においては、前記抗体調製物は、静脈内投与される。

本発明をより詳細に説明するが、以下の説明はほんの一例に過ぎない。

アッセイ方法
ＩｇＭ濃縮物についてのＨＰＬＣによる分子サイズの分布
以下の方法を利用して、抗体調製物中の凝集体の割合（％）（実施例８で使用する）を求めることができる。
試験溶液：約５０ｇ／Ｌの未希釈のサンプルを注入体積１０μＬで注入する（タンパク質量は約５００μｇである）。
レファレンス溶液：ヒト免疫グロブリン（例えば、Ｉｎｔｒａｔｅｃｔ（登録商標），Ｂｉｏｔｅｓｔ ＡＧ社製）
標準溶液：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製ゲル濾過標準（商品番号１５１−１９０１）
カラム：
−サイズ：１＝３０ｍｍ、φ＝７．８ｍｍ
−固定相：２０，０００Ｄａ〜７×１０^６Ｄａの相対分子量を有する球状タンパク質の分画に適しているＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｇ４０００ ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
移動相：４．８７３ｇのリン酸水素二ナトリウム二水和物、１．７４１ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物、１１．６８８ｇの塩化ナトリウム、及び５０ｍｇのアジ化ナトリウムを１Ｌの水に溶解させる。
流速：０．５ｍＬ／分
検出：分光光度計、２８０ｎｍ（レファレンス溶液で得られたクロマトグラムにおいて）
以下のスキームに従ってクロマトグラムを積分し、ピークを同定する：
・ポリマー（＞１，２００ｋＤ）、１０分〜１３分
・ＩｇＭ（１，２００ｋＤ〜７５０ｋＤ）、１３分〜１９分
・ダイマー／ＩｇＡ（７５０ｋＤ〜３５０ｋＤ）、１９分〜２０分
・ＩｇＧ（３５０ｋＤ〜１００ｋＤ）、２０分〜２６分
・フラグメント（＜１００ｋＤ）、２６分〜４０分
・フラグメント（＜１００ｋＤ）、２６分〜４０分

非特異的な補体活性化の測定
ヘモリシンで前処理したヒツジ赤血球を補体により溶血させる。サンプル中の補体結合抗体により、溶血を抑制する。１ｍｇの免疫グロブリンに結合している（不活化されている）補体の量を求める。

一定量の免疫グロブリン（１０ｍｇ）とモルモットの補体とを混合し、遊離補体を滴定する。抗補体活性は、レファレンス溶液中の使用された補体に対する、使用された補体として表される。補体活性の溶血単位（ＣＨ_５０）は、最適なバッファ条件において、合計５×１０^８個の赤血球のうち、最適に調製された赤血球を２．５×１０^８個溶血させる補体の量である。

最適に調製された赤血球（ヒツジ由来の安定化赤血球８ｍＬをゼラチン−バルビタール−バッファで３回洗浄し、最後に赤血球沈殿物１ｍＬをゼラチン−バルビタール−バッファ２４ｍＬに懸濁させる）は、２０ｍＬの赤血球懸濁液と２０ｍＬのヘモリシン（２ＭＨＥ／ｍＬ（最低溶血単位）に調整されている）とを混合し、３７℃で１５分間インキュベートすることにより調製する。

１０ｍｇの免疫グロブリンをゼラチン−バルビタール−バッファ（バルビタールバッファ１Ｌ中ゼラチン１ｇ（ｐＨ７．３）、５倍バルビタールバッファ溶液：水２Ｌ中塩化ナトリウム８３ｇ、バルビタールナトリウム１０．１９２ｇ（ｐＨ７．３））で希釈する。最終体積が１ｍＬになるように、２００μＬの補体１００ＣＨ５０／ｍＬを添加する。３７℃で１時間、振盪させながら試験管をインキュベートする。サンプルを希釈し、最適に調製された赤血球に対して滴定する。３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルを遠心分離し、５４１ｎｍの波長で分光光度計を用いることにより吸光度を求める。

タンパク質分解活性の測定
タンパク質分解活性は、発色基質（特に、少なくとも１つのセリンプロテアーゼに対して感受性である発色基質）と３７℃の抗体調製物のサンプル（通常、バッファで希釈して線形範囲でアッセイできるようにする）とを混合し、分光光度計を用いて吸収動態をモニタリングすることによりアッセイすることができる。サンプルのタンパク質分解活性は、方程式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝Ｓ×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性；Ｓ＝発色基質の特異的吸光変化に関する変換係数；及びＦ＝希釈倍率）を用いることにより、初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）から計算される。基質の使用は、製造業者の説明書に従う。

タンパク質分解活性は、具体的には、以下の工程でアッセイすることができる：
（ａ）２５ｍｇの基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を７．２ｍＬの注射用水に溶解させる；
（ｂ）抗体調製物のサンプルをバッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４、１０６ｍＭのＮａＣｌ）で希釈して、線形範囲でアッセイできるようにし、温度を３７℃に調整する；
（ｃ）等量（例えば、２００μＬ）の希釈された抗体調製物と溶解した基質とを混合する；
（ｄ）分光光度計を用いて３７℃で１分間〜３分間、４０５ｎｍで吸収速度を測定する；
（ｅ）等式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈倍率）を用いることにより初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）からタンパク質分解活性を計算する。

この方法の定量限界は、８Ｕ／Ｌであり、本発明の抗体調製物のサンプルは検出不可能である。したがって、本発明の最終産物におけるタンパク質分解活性のレベルは、８Ｕ／Ｌ未満である。

実施例１−画分Ｉ／ＩＩＩからのＩｇＭを富化した調製物の調製
ヒト血漿の低温エタノール分画から得られたＣｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩ １８０ｋｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０５）７２０Ｌに懸濁させ、懸濁温度（２２±４℃）に達した後１５分間〜３０分間混合する。

室温のオクタン酸（用いたペーストＩ／ＩＩＩ １ｋｇ当たり０．１１０ｋｇ）１９．８ｋｇを添加することにより溶液を処理し、振動式混合機（Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ（登録商標）、サイズ−４、Ｇｒａｂｅｒ＋Ｐｆｅｎｎｉｇｅｒ有限会社製、レベル２〜３に調整されたＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒ）を用いてタンパク質溶液を更に８０分間混合する。オクタン酸は、３０分間かけてゆっくりと添加する。

約３ｋｇのリン酸三カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）を添加し、タンパク質溶液を少なくとも１５分間更に混合する。フィルタプレスを用いて清澄濾過することにより沈殿物を除去する。更に０．２μｍ濾過を実施し、タンパク質溶液を１０ｋＤの膜を用いる限外濾過に付す。タンパク質溶液を０．０４ＭのＮａＣｌで透析し、その後、タンパク質濃度を４０ｇ／Ｌに調整する。

注射用水で１＋１希釈した後、タンパク質溶液をｐＨ４．０±０．１で処理する。ｐＨの調整は、１ＭのＨＣｌを用いて行い、タンパク質溶液は、３７℃±２℃で９時間インキュベートする。ｐＨ４でのインキュベーションの後、タンパク質溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨを用いて５．８に調整する。バッチ方式でＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを添加することにより（タンパク質１ｋｇ当たりＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５ｇ）、得られたタンパク質溶液を更に精製する。タンパク質溶液を室温で６０分間以上撹拌しながらインキュベートする。清澄濾過によりＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘを除去する。タンパク質溶液を０．２μｍ濾過に付す。

タンパク質溶液を０．１μｍのフィルタ及びＵｌｔｉｐｏｒ ＶＦ ＤＶ５０，２０”フィルタ（Ｐａｌｌ社製）に通して濾過する。ＵＶＣ線量２４０Ｊ／ｍ^２で、フロースルーＵＶｉｖａｔｅｃ処理装置（Ｂａｙｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ社製）を用いて、２５４ｎｍでＵＶＣ光処理することにより濾液を更に処理する。製造業者の説明書に従ってＵＶＣ反応機を通過する流速を計算する。照射されたタンパク質溶液を、限外濾過によりタンパク質濃度が５０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌになるように濃縮し、透析（１０ｋＤの膜、０．３２Ｍのグリセリンバッファ（ｐＨ４．３）を用いる）に付す。最終産物を０．２μｍのフィルタに通して濾過し、２℃〜８℃で保存する。

実施例２−オクタン酸処理工程における条件の検討
オクタン酸処理に関して、実施例１に記載の方法を用いて以下の実験範囲について、また実験範囲を互いに組み合わせて試験した（結果は示さない）。
− オクタン酸の量：０．０９ｋｇ／ｋｇ〜０．１３ｋｇ／ｋｇ（用いた画分Ｉ／ＩＩＩ １ｋｇ当たりのオクタン酸量）（１２０ｍＭ〜１８０ｍＭのオクタン酸）
− オクタン酸処理のｐＨ：ｐＨ４．８〜ｐＨ５．３
− 反応の温度範囲：１４℃〜３０℃
− インキュベート時間：４０分間〜１１０分間

試験した全ての条件で、更に処理するための清澄化が容易であり、且つタンパク質分解活性が、懸濁Ｃｏｈｎ画分Ｉ／ＩＩＩ中数百Ｕ／Ｌから著しく低下している中間体が得られる。これら中間体から、定量限界である８Ｕ／Ｌ（下記実施例６に記載の通り計算）未満のタンパク質分解活性を有する最終産物が得られる。

実施例３−Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒの使用によるウイルスの減少−オクタン酸処理にＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いる場合及び用いない場合のウイルス除去係数の決定
２５０ｍＬの懸濁画分Ｉ／ＩＩＩをｐＨ５．０５及び２２℃で３０分間ホモジナイズした。懸濁液に２．６ｍＬのウイルス原液を加えた。オクタン酸を添加し（１１０ｇ／ｋｇ）、Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いて６０分間ホモジナイズした。平行して、同じ混合物を標準的な撹拌機でホモジナイズした。６０分間後、リン酸三カルシウム（０．１５ｇ／ｋｇオクタン酸）を添加し、懸濁液を１５分間撹拌した。フィルタディスクを用いて深層濾過により懸濁液を清澄化した。フィルタディスクは、７０ｍＬ〜８０ｍＬのバッファで予めすすいでおいた。濾過後、８０ｍＬのバッファでフィルタをすすいだ。濾液及び洗浄液をプールし、ウイルス滴定のためのサンプルを抜き取った。

ＳＶ４０、Ｒｅｏ、及びＰＰＶ（ＣＶ−１、ＣＣＬ．７．１、及びＰＫ１３）について適切な指示細胞において、オクタン酸の添加前及び濾過後に採取したサンプルのウイルス力価を求めた。最後に、ウイルス検証研究に関する現行の指針に従ってウイルス除去係数を計算した。

ウイルス検証研究では、ＳＶ４０及びＲｅｏ等の非エンベロープウイルスは、それぞれ４ｌｏｇ_１０超及び５ｌｏｇ_１０超のオーダーで効果的に除去された。更に、ＰＰＶは、３ｌｏｇ_１０超除去された。これら値は、Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いずに標準的な撹拌条件下で同じオクタン酸処理を行ったときの１０倍〜１，０００倍高い値である。

実施例４−ＵＶＣ処理の評価
ＵＶＣ照射線量の最適範囲について評価した。非エンベロープウイルスについて少なくとも４ｌｏｇ_１０不活化するための最低必須線量と、Ｆａｂの抗原に結合する機能を低下させ且つ補体活性化に影響を与えるＦｃの機能を低下させるＩｇＭ分子の変性を避けるための最高耐性線量とのバランスがある。２００Ｊ／ｍ^２〜４００Ｊ／ｍ^２の範囲では、免疫グロブリンの凝集体の僅かな増加がみられ、断片含量に対する著しい影響はなかった。

実験のために、オリジナルのタンパク質溶液の吸光度（ＯＤ）を用いて、ＢＴＳより提供されるＥｘｃｅｌシート（ｃｕｓｔｏｍｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｓｈｅｅｔ ＵＶｉｖａｔｅｃ Ｌａｂ ＩＩバージョン３．０）を用いてＵＶｉｖａｔｅｃラボシステムにおける流速を計算する。ランプの性能、ＵＶシグナルランプセンサの設定点、及び望ましいＵＶＣ照射線量を考慮して、流速を計算する。

シグナルフロースルーについて２００Ｊ／ｍ^２の線量を得るために、流速５．８Ｌ／ｈでＵＶｉｖａｔｅｃシステムを通過するように、タンパク質含量が約５５ｇ／ＬであるＩｇＭ含有溶液（Ｂａｔｃｈ ８６ＧＢ００５ＢＥ０７）をポンプで送った。流速３．９Ｌ／ｍ^２で前記システムを通過するようにタンパク質溶液をポンプで送ることにより、３００Ｊ／ｍ^２の線量を得た。流速２．９Ｌ／ｍ^２で前記システムを通過するようにタンパク質溶液をポンプで送ることにより、４００Ｊ／ｍ^２の線量を得た。

２００Ｊ／ｍ^２〜４００Ｊ／ｍ^２の範囲では、免疫グロブリン含量、タンパク質分解活性、又はＡＣＡについて有意な差はみられなかった。非エンベロープウイルスを不活化するには２００Ｊ／ｍ^２で十分であり、且つ３００Ｊ／ｍ^２で凝集体の形成及び抗体力価に対する著しい影響がみられなかったので、線量の好ましい範囲を２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２に設定した。好ましい線量は、２２５Ｊ／ｍ^２である。

シングルフロースルーについて２００Ｊ／ｍ^２〜３００Ｊ／ｍ^２の線量を得るために、流速５．８Ｌ／ｈでＵＶｉｖａｔｅｃシステムを通過するように、タンパク質含量が８ｇ／Ｌ〜１２ｇ／Ｌである希釈したＩｇＭ含有溶液（Ｂａｔｃｈ ８６ＢＢ０５９ＢＥ０７）をポンプで送った。

この線量範囲内のＵＶ照射では、免疫グロブリンのクラスの分布は影響を受けなかった。ＨＰＳＥＣにより分析した分子量分布パターンも変化しない。ＣＺＥにより分析した純度のレベルも変化しなかった。タンパク質分解活性（ＰＡ）、プレカリクレインアクチベータ（ＰＫＡ）、及び抗補体活性（ＡＣＡ）も変化しない。また、ＥＬＩＳＡ法により測定した抗細菌活性は、全ての免疫グロブリンのクラスについて有意には変化しない。

漸増強度のＵＶを照射したアリコートを最終産物まで更に処理し、同パネルの分析試験に付した。この試験でも、最終産物に有意な差はみられなかった。試験した抗体力価は全て、常に、ＵＶＣ処理していない対照調製物の１００±１０％の範囲内である。

実施例５−Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ／ｐＨ４処理及びＵＶＣ処理の使用による全体的なウイルス減少−ウイルス除去係数の決定
以下の３工程：Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒで撹拌しながらオクタン酸処理する工程と、ｐＨ４処理工程と、ＵＶＣ処理（２１５Ｊ／ｍ^２）工程とによるウイルス除去／不活化の検証を、以下のモデルウイルスを用いて実施した：Ｃ型肝炎ウイルスのモデルウイルスとしてのウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ヒトヘルペスウイルスのモデルウイルスとしての偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、コロナウイルスとしてのウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、フラビウイルスのモデルウイルスとしてのシンドビスウイルス（ＳｉｎＶ）、Ａ型肝炎ウイルスのモデルウイルスとしてのマウス脳脊髄炎ウイルス（ＭＥＶ）、他の非エンベロープウイルスのモデルウイルスとしてのレオウイルス（Ｒｅｏ）、ヒトパルボウイルスＢ１９のモデルウイルスとしてのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）。

以下の３工程：オクタン酸処理工程、ｐＨ４処理工程、及びＵＶＣ処理工程を用いたこれら研究結果を以下の表４に示す。

公称孔径約５０ｎｍのフィルタを用いて更にナノ濾過して、ウイルスのサイズに依存して１７ｌｏｇ_１０超まで合計減少量を増加させることにより更に安全性を高める。例えば、ＨＩＶ−１では１７．５ｌｏｇ_１０超に達したが、ＰＰＶは、ナノ濾過を行ってもそれ以上除去されなかった。

したがって、ＩｇＭ含有調製物では現在までウイルス不活化／減少量が８ｌｏｇ_１０超に達しており、本発明に係る精製手順により優れたウイルス安全性を有するＩｇＭ調製物が得られる。これは、一般的に、サイズが小さく且つ脂質エンベロープが存在しないのでウイルス不活化及び除去手順に対する耐性が高いＭＥＶ、Ｒｅｏ、及びＰＰＶ等の非エンベロープウイルスにとって特に重要である。

実施例６−オクタン酸処理にＶｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いる場合及び用いない場合の残存タンパク質分解活性の測定
Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを用いずに、ブレードスターラを用いて激しく標準的な撹拌を行いながら、実施例１及び並行実験と同様にオクタン酸処理を実施した。オクタン酸／リン酸三カルシウム処理及び限外濾過／透析後のサンプルのタンパク質分解活性を、製造業者の説明書に従って発色基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社製）を用いて測定した。２５ｍｇの基質Ｓ−２２８８を７．２ｍＬの注射用水に溶解させる。サンプルをバッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１０６ｍＭのＮａＣｌ）で希釈して、線形範囲でアッセイできるようにする。例えば、２００μＬのバッファと２００μＬのサンプル（混合及び３７℃への温度調整）及び２００μＬの発色基質溶液とを混合する。分光光度計を用いて３７℃で４０５ｎｍ（１分間〜３分間）にて吸収動態を測定する。サンプルのタンパク質分解活性を、方程式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＡｂｓ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈倍率）を用いることにより初期吸収差（ΔＡｂｓ／分）から計算する。

Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒを使用したとき、オクタン酸処理後の濾液は澄んでいた。比較実験において、ブレードスターラを用いてオクタン酸処理した後の濾液は、非常に不透明であり、濾過が困難であった。

実施例７：本発明に係るＩｇＭ調製物における抗細菌力価
唯一市販されている静脈内耐性ＩｇＭ含有調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎと比較するために、この十分に確立されている薬剤３バッチで抗細菌活性を分析し、本発明に係る調製物と比較した。抗細菌抗原又は抗真菌抗原に対するＩｇＭ調製物中におけるＩｇＡ又はＩｇＭクラスの抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。対応する抗原でマイクロタイタープレートをコーティングし、標準物質又はＩｇＭ調製物と共にインキュベートした。抗原に結合している抗体を抗ヒトＩｇＡ又は抗ヒトＩｇＭコンジュゲートで検出した。酵素の基質を用いることにより検出を行った。生じる色の変化は、ＩｇＭ調製物中に存在する抗体の量に対応する。

新規調製物におけるＩｇＭ及びＩｇＡ媒介活性は、典型的に、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの少なくとも１．５倍高かったが、これは、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ中のＩｇＭ及びＩｇＡがβ−プロピオラクトンで化学的に修飾されているという事実により説明することができる。この工程は、本発明に係るより穏やかな手順により置換される。

これらデータは、全体的に、最終調製物中のＩｇＭ分子の結合領域が機能的に完全に活性であることを示す。

実施例８：液体ＩｇＭ生成物を用いた保存安定性試験
ＵＶＣ処理を行わなかった実施例１の生成物を、２℃〜８℃にて１０ｍＬ又は１００ｍＬのガラスバイアル（充填体積５ｍＬ又は５０ｍＬ）中で保存し、仕様に従って全てのパラメータについて分析した。結果を表８に示す。安定性に関連するパラメータは、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を用いて測定する凝集体及び断片の含量、タンパク質分解活性（ＰＡ）、並びに抗補体活性（ＡＣＡ）である。これらパラメータは、静脈内耐性にとって重要であり、長期保存中に変化しやすい。２℃〜８℃では、これらパラメータに有意な変化はみられなかった。室温（２３℃〜２７℃）保存した場合でさえも、これら値は仕様の範囲内であったが、室温で２４ヶ月間保存した後は断片が僅かに増加する。着色、オパール光、ｐＨ値等の他のパラメータについても測定したが、全試験期間に亘って変化していなかった。様々な細菌に対するＩｇＭ及びＩｇＡの力価は、２℃〜８℃で２年間に亘って安定である。

また、ＵＶＣ処理を行った実施例１の生成物を、２℃〜８℃及び室温にて１０ｍＬ又は１００ｍＬのガラスバイアル（充填体積５ｍＬ又は５０ｍＬ）中で保存し、仕様に従って全てのパラメータについて分析した。結果を表９に示す。この進行中の安定性試験では、現在入手可能な１２ヶ月間のデータは、ＵＶＣ処理を行わなかった生成物と同じ安定性プロファイルを示しているので、２４ヶ月間安定であると推定できる。

実施例９：ＩｇＭ生成物によるインビトロにおける非特異的な補体活性化
実施例９Ａ：Ｃ５ａ濃度の測定
末端補体経路の活性化のマーカーとしてＣ５ａ因子を用いて、インビトロにおいて非特異的に補体を活性化するＩｇＭ調製物の能力の分析を実施した。この目的のために、ヒト血清を免疫グロブリン製品又はバッファと共に１２０分間インキュベートした。０分間、５分間、１５分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした後にサンプルを採取した。インビトロ系が適切に機能していることを示すために、補体阻害及び補体系の完全活性化を示した。市販の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｑｕｉｄｅｌ社製 ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ５ａ Ｐｌｕｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ；Ａ０２５）を用い、光度計による吸光度測定を行って補体因子の濃度を測定した。

ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ社製 ＮＨＳ；Ａ１１３）を３７℃で急速に解凍させ、直ちに氷上に置いた。全ての単一サンプルは、血清を含有する反応バッチ（１００μＬ）からなっていた。先ず、添加剤をピペッティングして添加し、次いで、ヒト血清を添加して、全ての反応バッチで反応を開始させた。

任意の添加剤を含まないヒト血清は、ブランクとして機能し、実験設定に起因するベースラインの補体活性化を示した。熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＡＧ Ｑｕｉｄｅｌ社製；Ａ１１４；１．３μＬ）の添加は、インビトロ系の応答性を示すためのヒト血清補体の強力なアクチベータとして機能した。ＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）は、全反応時間及び実験処理について補体活性化を完全に阻害するためにヒト血清に添加した。各反応において、ＩｇＭ調製物、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（欧州特許第００１３９０１号明細書）及びＩｇＭ調製物（欧州特許第０４１３１８７号明細書）のＩｇＭ濃度を１．７２ｍｇ／ｍＬに調整した。ネガティブコントロールとして、それぞれの体積の製剤バッファを用いた。

安定化溶液（Ｑｕｉｄｅｌ社製 サンプル安定化剤Ａ９５７６；１４０μＬ）を添加することにより、常時撹拌しながら３７℃で０分間、５分間、１５分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした後、全ての反応を停止させた。次いで、サンプルを希釈し、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡ分析を実施した。２つの別々の複製物を用いて実験を実施し、平均値を計算した。結果を表１０及び図２に示す。

アクチベータ（熱凝集ＩｇＧ）の添加により、１５分間以内にＣ５ａが大きく増加した。これは、補体活性化を検出するためにインビトロ系が高感度で応答することを示す。阻害剤としてＥＤＴＡを添加しても、全インキュベート時間に亘って値は変化せず、これは、補体活性化が特異的であり、且つサンプルの取扱又は調製に起因するアーティファクトではないことを示す。３７℃でヒト血清をインキュベートし、人工表面に曝露すると、ブランク値として記録される僅かな補体活性化が誘導される。

欧州特許第０４１３１８７号明細書に係るＩｇＭレファレンス調製物では、６０分間後に１，０００ｎｇ／ｍＬ超まで補体が活性化される（表１０）。しかし、市販の化学的に修飾されているレファレンス調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（欧州特許第００１３９０１号明細書）は、欧州特許第０４１３１８７号明細書に係る生成物に比べて半分の補体活性化能しか示さなかった。

本発明に係るＩｇＭ調製物で処理した血清中のＣ５ａ濃度は、添加剤を含まない血清（ブランク）又は製剤バッファ（３００ｍＭのグリセリン（ｐＨ４．３）又は０．４５％のＮａＣｌ／２．５％のグルコース（ｐＨ６．８））で処理した血清において測定されたＣ５ａ濃度と同程度である。したがって、本発明に係るＩｇＭ調製物中の免疫グロブリンは、実質的に、インビトロ試験系においてヒト血清中の補体を非特異的に活性化するものではない。

実施例９Ｂ：Ｃ３ａ濃度の測定
補体経路の活性化のマーカーとしてＣ３ａ因子を用いて、インビトロにおいて非特異的に補体を活性化するＩｇＭ調製物の能力の分析を実施した。この目的のために、ヒト血清を免疫グロブリン製品又はバッファと共に１２０分間インキュベートした。０分間、５分間、１５分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした後にサンプルを採取した。インビトロ系が適切に機能していることを示すために、補体阻害及び補体系の完全活性化を示した。市販の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｑｕｉｄｅｌ社製 ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ３ａ Ｐｌｕｓ ＥＩＡ Ｋｉｔ；Ａ０３２）を用い、光度計による吸光度測定を行って補体因子の濃度を測定した。

ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ社製 ＮＨＳ；Ａ１１３）を３７℃で急速解凍させ、直ちに氷上に置いた。全ての単一サンプルは、血清を含有する反応バッチ（１００μＬ）からなっていた。先ず、添加剤をピペッティングして添加し、次いで、ヒト血清を添加して、全ての反応バッチで反応を開始させた。

任意の添加剤を含まないヒト血清は、ブランクとして機能し、実験設定に起因するベースラインの補体活性化を示した。コブラ毒素因子（ＣＶＦ Ｑｕｉｄｅｌ社製；Ａ６００；２０Ｕ／ｍＬ）の添加は、インビトロ系の応答性を示すためのヒト血清補体の強力なアクチベータとして機能した。ＥＤＴＡ（最終濃度１０ｍＭ）は、全反応時間及び実験処理について補体活性化を完全に阻害するためにヒト血清に添加した。各反応において、ＩｇＭ調製物及びＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（欧州特許第００１３９０１号）のＩｇＭ濃度を１．７２ｍｇ／ｍＬに調整した。ネガティブコントロールとして、それぞれの体積の製剤バッファを用いた。

安定化溶液（Ｑｕｉｄｅｌ社製 サンプル安定化剤Ａ９５７６；１４０μＬ）を添加することにより、常時撹拌しながら３７℃で０分間、５分間、１５分間、６０分間、及び１２０分間インキュベートした後、全ての反応を停止させた。次いで、サンプルを希釈し、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡ分析を実施した。２つの複製物を用いて独立に実験を実施し、平均値を計算した。結果を表１１及び図３に示す。

アクチベータ（ＣＶＦ）の添加により、１５分間以内にＣ３ａが大きく増加し、これは、補体活性化を検出するためにインビトロ系が高感度で応答することを示す。阻害剤としてＥＤＴＡを添加しても、全インキュベート時間に亘って値は変化せず、これは、補体活性化が特異的であり、且つサンプルの取扱又は調製に起因するアーティファクトではないことを示す。３７℃でヒト血清をインキュベートし、人工表面に曝露すると、ブランク値として記録される僅かな補体活性化が誘導される。市販の化学的に修飾されているレファレンス調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎ（欧州特許第００１３９０１号明細書）は、ブランクと比べて３倍高いＣ３活性化能を示した。

本発明に係るＩｇＭ調製物で処理した血清中のＣ３ａ濃度は、添加剤を含まない血清（ブランク）又は製剤バッファ（３００ｍＭのグリセリン（ｐＨ４．３）又は０．４５％のＮａＣｌ／２．５％のグルコース（ｐＨ６．８））で処理した血清において測定されたＣ３ａ濃度と同程度である。したがって、本発明に係るＩｇＭ調製物中の免疫グロブリンは、実質的に、インビトロ試験系においてヒト血清中の著しい量の補体を非特異的に活性化するものではない。

実施例１０ ＩｇＭ生成物を用いたインビトロ実験
安全性及び忍容性を確認するために、５日間に亘って反復静脈内注射した後の動脈圧に対するＩｇＭ調製物の影響を８頭の覚醒カニクイザルで試験した。１９０ｍｇ／ＩｇＭ／ｋｇ／日の用量の本明細書に記載の方法に従って調製したＩｇＭ調製物を投与した。比較物質として、市販の静脈内耐性ＩｇＭ含有調製物であるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎを何頭かのサルに投与した。同用量のＩｇＭを投与する方法でＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎを投与した。投与により、許容できないレベルの非特異的な補体活性化が起こっているかどうかを調べるために、注射後の血圧を測定した。免疫グロブリン調製物を投与する数時間前に、対照用量の０．９％ＮａＣｌを動物に投与した。右大腿動脈を介して下腹部大動脈に圧力カテーテルを挿入することにより血圧を測定した。結果をテレメトリーにより送信した。

ＩｇＭ調製物（１５ｍＬ／ｋｇ／日）の投与は、動脈圧（平均、収縮期、及び拡張期）に対して僅かな影響しか与えなかった。予備試験の値と比較した各注射の４時間後までの差は、４ｍｍＨｇを超えなかった。これら差を、生物学的に関連しているとみなすことはできない。

補体経路の非特異的な活性化のマーカーとして注射後に採取した血漿サンプル中のＣ３ａ濃度を測定した。Ｃ３ａ濃度［ｎｇ／ｍＬ］は、ＩｇＭ調製物を投与しても僅かに増加するのみであり（１５ｍＬ／ｋｇＢＷ）、ＩｇＭと等量の市販のレファレンス調製物Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎによる増加よりも更に少なかった。処理の約６時間後に血液をサンプリングした。

ＩｇＭ調製物に起因する実質的な毒物学的所見はみられず、Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎではみられなかった明らかな変化も生じなかった。Ｐｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの安全性は長年に亘る臨床試験で十分に確立されているので、これら変化が任意の臨床的関連性を有しないと結論付けるのが合理的である。

また、ＩｇＭ調製物の優れた忍容性及び安全性は、２４人の健常男性及び女性のボランティアにおけるヒトの第Ｉ相試験でも検証された。投与の最初の４時間後における収縮期血圧は、平均して、０．５ｍＬ／分で９１ｍｇ〜２７４ｍｇのＩｇＭ調製物／ｋｇＢＷ／日を注射した後、約９％（１１．９ｍｍＨｇ）しか低下しなかった。

これは、プラセボである０．９％ＮａＣｌ溶液と同程度であった（９．４％、１１．７ｍｍＨｇ）。

重篤な有害事象は記録されず、全ての重篤ではない有害事象は自己制限的であった。更に、ＰＣＴ測定により示される通り、感染因子の伝染の証拠は存在しなかった。

関連疾患の動物モデルにおける有効性試験の有用性は、免疫原性及びヒト血漿から得られたＩｇＭ調製物中で予め形成されているＧａｌ抗体により制限されることに留意すべきである。しかし、疾患の治療におけるＰｅｎｔａｇｌｏｂｉｎの使用に関する先行技術の知見及び本発明の方法により調製されるＩｇＭ調製物の抗細菌抗体力価（実施例７に示す）を鑑みて、ＩｇＭ調製物は臨床的有効性を有すると結論付けることができる。

実施例１１ 抗体調製物のＦｃ部分の機能的完全性
本明細書に記載の方法に従って調製した抗体調製物中の抗体のＦｃ部分の機能的完全性を、ＩｇＧ調製物に関するＥｕｒｏｐｅａｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＩＣＨ Ｓ６（ＣＰＭＰ／ＩＣＨ／３０２／９５）（バイオテクノロジー応用医薬品の非臨床における安全性評価に関する指針）に従って、現行の欧州薬局方法（２．７．９ 免疫グロブリンのＦｃの機能についての試験、欧州薬局方、現行版、２０１１年４月）を用いて分析した。免疫グロブリンに関する欧州薬局方のモノグラフ（０１／２００５：２０７０９）は、免疫グロブリンのＦｃ機能について風疹抗原に基づく試験を推奨している。

具体的には、タンニン酸処理済Ｏ型ヒト赤血球を風疹ウイルス抗原でロードする。特定の体積の抗体調製物を、抗原で被覆された血球と共にインキュベートした。モルモットの補体を添加することにより、補体によって開始される血球の溶解を開始させた。５４１ｎｍにおける吸光度の時間依存性変化を用いて、その後の溶血速度を測定した。時間当たりの吸光度の最大変化を用いて評価を行った。ヒト免疫グロブリン生物学的レファレンス調製物；ＢＲＰバッチ番号３を比較物質として用いた。

抗体分子のＦｃ部分の活性を、７バッチのＩｇＭ含有抗体調製物で測定したところ、全てのバッチにおいて、生物学的レファレンス調製物（ＢＲＰ）に比べて９６．５％〜１０３．３％であった。したがって、ＩｇＭ含有抗体調製物の機能が証明された。

Claims (18)

1. ヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物であって、抗体の総量の４０重量％超のＩｇＧと、抗体の総量の５重量％超のＩｇＡと、抗体の総量の少なくとも５重量％のＩｇＭとを含み、ヒト血漿から調製され、特異的な補体活性化活性を有し、非エンベロープウイルスを実質的に含有せず、非特異的な補体活性化能の測定に適したヒト血清を用いるインビトロアッセイにおいて、Ｃ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかを実質的に産生せず、１，２００ｋＤａ以上の凝集体の含有量が１．５％未満である抗体調製物。
2. 抗体の総量の少なくとも１０重量％のＩｇＭを含む請求項１に記載の抗体調製物。
3. 抗体の総量の少なくとも１５重量％のＩｇＭを含む請求項２に記載の抗体調製物。
4. １．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に調整された抗体調製物が、アッセイの６０分間後に産生するＣ５ａが２００ｎｇ／ｍＬ未満である請求項１から３のいずれかに記載の抗体調製物。
5. １．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ濃度に調整された抗体調製物が、アッセイの６０分間後に産生するＣ３ａが６，０００ｎｇ／ｍＬ未満である請求項１から４のいずれかに記載の抗体調製物。
6. インビトロ血清アッセイにおいて、ヒト血清を含む抗体調製物が、ヒト血清単独の場合の±７０％と同量のＣ５ａ及びＣ３ａの少なくともいずれかを産生する請求項１から５のいずれかに記載の抗体調製物。
7. 抗体調製物がＣ５ａを実質的に産生しないことを判定するインビトロ血清アッセイが、次の工程：
   （ａ）抗体調製物を１００μＬのヒト血清に添加して１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭを含有する反応混合物を調製し、該反応混合物を３７℃で６０分間、定速撹拌下にてインキュベートする工程；
   （ｂ）ＥＬＩＳＡに適した前記反応混合物の希釈系列を調製する工程；
   （ｃ）Ｃ５ａに対する一次抗体及び二次抗体並びに発色性物質を用いて、前記反応混合物の希釈系列に対してサンドイッチＥＬＩＳＡを行う工程であって、前記二次抗体は、酵素とコンジュゲートされており、前記発色性物質は、前記酵素の基質である工程；
   （ｄ）前記発色性物質を、前記二次抗体を介してＣ５ａと結合した前記酵素に接触させた結果生じる色の変化に基づいて前記反応混合物中のＣ５ａの量を測定する工程；
   を含む請求項１から６のいずれかに記載の抗体調製物。
8. 抗体調製物がＣ３ａを実質的に産生しないことを判定するインビトロ血清アッセイが、
   次の工程：
   （ａ）抗体調製物を１００μＬのヒト血清に添加して１．７２ｍｇ／ｍＬのＩｇＭを含有する反応混合物を調製し、該反応混合物を３７℃で６０分間、定速撹拌下にてインキュベートする工程；
   （ｂ）ＥＬＩＳＡに適した前記反応混合物の希釈系列を調製する工程；
   （ｃ）Ｃ３ａに対する一次抗体及び二次抗体並びに発色性物質を用いて、前記反応混合物の希釈系列に対してサンドイッチＥＬＩＳＡを行う工程であって、前記二次抗体は、酵素とコンジュゲートされており、前記発色性物質は、前記酵素の基質である工程；
   （ｄ）前記発色性物質を、前記二次抗体を介してＣ３ａと結合した前記酵素に接触させた結果生じる色の変化に基づいて前記反応混合物中のＣ３ａの量を測定する工程；
   を含む請求項１から７のいずれかに記載の抗体調製物。
9. 抗補体活性が１．０ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満である請求項１から８のいずれかに記載の抗体調製物。
10. 抗補体活性が０．７５ＣＨ５０／ｍｇタンパク質未満である請求項９に記載の抗体調製物。
11. 免疫グロブリン含量が、総タンパク質含量の９５％超である請求項１から１０のいずれかに記載の抗体調製物。
12. 投与前のレベルから１０％超の動脈圧の低下を伴うことなしに、カニクイザルに１１５ｍｇＩｇＭ／ｋｇＢＷ／ｈｒで投与することが可能である請求項１から１１のいずれかに記載の抗体調製物。
13. 調製物中の抗体の少なくとも９０％が生物学的に活性である請求項１から１２のいずれかに記載の抗体調製物。
14. Ｆｃ機能の測定に適した風疹抗原を用いるインビトロアッセイにおいて、抗体調製物の抗体のＦｃ部分の活性が生物学的レファレンス調製物の活性の±１０％と同等である請求項１から１３のいずれかに記載の抗体調製物。
15. 請求項１から１４のいずれかに記載の抗体調製物をヒト血漿から調製する方法であって、
    （ａ）ヒト血漿から血漿画分を免疫グロブリン含有溶液として調製する工程；
    （ｂ）オクタン酸を前記溶液と混合し、該混合溶液を振動式撹拌機で処理して混入タンパク質を沈殿させる工程；
    （ｃ）沈殿した前記タンパク質を前記溶液から分離してＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を得る工程；
    （ｄ）前記ＩｇＭ含有免疫グロブリン組成物を、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲でインキュベートしてインキュベート溶液を得る工程；
    （ｅ）前記インキュベート溶液にＵＶＣを照射してＵＶＣ照射溶液を得る工程；及び
    （ｆ）前記ＵＶＣ照射溶液を滅菌条件下で濾過してヒトにおける静脈内投与に適した抗体調製物を得る工程；
    を含む方法。
16. 医薬において使用するための請求項１から１４のいずれかに記載の抗体調製物。
17. 免疫障害又は細菌感染症の治療において使用するための請求項１６に記載の抗体調製物。
18. 免疫障害がＩｇＭ欠乏症である請求項１７に記載の抗体調製物。

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