JP6285532B2 - タンパク質ａに基づくクロマトグラフィを使用するタンパク質純度を増加させる方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドを使用する、タンパク質Ａに基づくクロマトグラフィを用いて試料中のタンパク質凝集体のレベルを低下させることにより、Ｆｃ含有タンパク質の純度を増加させる方法を提供する。

タンパク質の純度に関する従来の方法は、例えば、関心のあるタンパク質を生じるよう組み換え技術によって作られた哺乳類または細菌のいずれかの細胞株を使用する細胞培養法であって、その後に（ａ）例えば、分画遠心法および／またはろ過を使用する、細胞および細胞片の除去のための清澄化ステップ；および（ｂ）清澄化された細胞培養フィード中の各種不純物から関心のあるタンパク質を分離するための１以上の下流クロマトグラフィステップが続く細胞培養法を典型的には含む。

タンパク質凝集体または高分子量タンパク質種は、関心のある生成物、例えば、Ｆｃ含有タンパク質または抗体分子、を含むバイオ医薬製剤から取り除く必要がある重要な不純物の一つである。例えば、タンパク質凝集体および他の汚染物質は、生成物を診断、治療または他の用途において使用できる前に、関心のある生成物を含むバイオ医薬製剤から取り除かなければならない。これは治療用途の場合および食品医薬品局の認可を得るためには特に重要である。

モノクローナル抗体およびＦｃ含有タンパク質の場合、精製方法についての業界標準は典型的にはいくつかのステップを含む精製方法を含む。その重要なステップの一つは、タンパク質Ａと呼ばれ、黄色ブドウ球菌から単離され、抗体のＦｃ領域に結合する親和性リガンドを使用する精製ステップである。典型的には、タンパク質凝集体もタンパク質Ａカラムに結合し、Ｆｃ含有タンパク質と同じ溶離プールにしばしば含まれる。

バイオ医薬製剤中のタンパク質凝集体および、一般的には単量体分子である関心のある生成物の物理的および化学的特性の間にしばしば類似性があるため、タンパク質凝集体の除去は厄介になり得る。タンパク質Ａのクロマトグラフィに続き、Ｆｃ含有タンパク質の場合には、１以上の異なる方法がバイオ医薬製剤からタンパク質凝集体を除去するために下流で使用でき、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィがある。

以前、ｐＨ勾配溶離を使用することによって、タンパク質Ａクロマトグラフィステップの間にいくらかのタンパク質凝集体を除去できることが報告された。国際公開第２０１１／０２８７５３号およびＰａｎ氏らのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８８（２００９）２７３−２７８（これらを参照により援用する）を参照されたい。しかし、これらの文献で検討されているように、タンパク質凝集体はＦｃ含有タンパク質の溶離の後又はこれと共にタンパク質Ａカラムから溶離される。

国際公開第２０１１／０２８７５３号

Ｐａｎ氏らのＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８８（２００９）２７３−２７８

本発明は、以前に記載された方法に対しＦＣ含有タンパク質を含む試料からより多くの量のタンパク質凝集体を除去する新規で改良された方法を提供する。本明細書に記載された方法は、タンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドを使用し、ｐＨ勾配溶離又はｐＨステップ溶離のいずれかを使用し、Ｆｃ含有タンパク質の溶離後のタンパク質凝集体の除去に加えてＦｃ含有タンパク質の溶離の前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体の溶離を得る。結果として、本明細書に記載された方法は、主としてＦｃ含有タンパク質の溶離後にタンパク質凝集体を除去する従来技術に記載された方法に対し全体としてより多くのタンパク質凝集体の除去をもたらす。

本発明は、少なくとも部分的に、タンパク質ＡのＣドメインに基づいてＦｃ含有タンパク質を固定化タンパク質Ａリガンドに結合させることにより、およびｐＨ勾配法またはｐＨステップ法を使用する溶離により、本明細書に記載したように、Ｆｃ含有タンパク質の溶離に続くタンパク質凝集体の除去に加えてＦｃ含有タンパク質の溶離前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体を除去するという新規な予期し得ぬ知見に基づいている。従来技術の方法よりもより多くの量のタンパク質凝集体を除去することによって、溶離プール中のＦｃ含有タンパク質の純度を増加させるのみならず、そのようなタンパク質凝集体を除去するために使用され得る１以上の追加の下流ステップの負荷が軽減される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法はタンパク質凝集体を除去するための下流ステップの数を低下させ、またはタンパク質Ａステップに続く溶離プールからタンパク質凝集体を除去するための１以上の下流ステップを使用する必要性を取り除く。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質を含む溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルを低下させる方法であって、Ｆｃ含有タンパク質およびタンパク質凝集体を含む試料を提供するステップ；Ｆｃ領域を含むタンパク質がタンパク質Ａに結合するように該試料を固体支持体上に固定化されたタンパク質Ａリガンドに接触させるステップであって、タンパク質Ａリガンドはタンパク質ＡのＣドメインに基づくステップ；高ｐＨバッファおよび低ｐＨバッファを使用するｐＨ勾配法を用いてＦｃ含有タンパク質を含む溶離プールを得るステップを含み、Ｆｃ含有タンパク質の溶離後に除去されるタンパク質凝集体に加えてＦｃ含有タンパク質の溶離前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体が除去され、それにより溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルを低下させる方法が提供される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質を含む溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルを低下させる方法であって、Ｆｃ含有タンパク質およびタンパク質凝集体を含む試料を提供するステップ；Ｆｃ領域を含むタンパク質がタンパク質Ａに結合するように該試料を固体支持体上に固定化されたタンパク質Ａリガンドに接触させるステップであって、タンパク質Ａリガンドはタンパク質ＡのＣドメインに基づくステップ；ｐＨの高い順に連続して使用される２以上のバッファを用いるｐＨステップ法を使用してＦｃ含有タンパク質を含む溶離プールを得るステップを含み、Ｆｃ含有タンパク質の溶離後に除去されるタンパク質凝集体に加えてＦｃ含有タンパク質の溶離前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体が除去され、それにより溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルを低下させる方法が提供される。

いくつかの実施形態では、溶離プールはｐＨ値の高い順に一連の小さいｐＨ変化のステップを使用するｐＨステップ法を使用して得られる。いくつかの実施形態では、各々の小さいｐＨ変化は０．１から０．５のオーダーである。特定の実施形態では、各々の小さいｐＨ変化は０．２のオーダーである。

いくつかの実施形態では、該一連の小さいｐＨ変化のステップは２以上のステップ、または３以上のステップ、または４以上のステップ、または５以上のステップ、または６以上のステップ、または７以上のステップ、または８以上のステップ、または９以上のステップ、または１０以上のステップを含む。特定の実施形態では、使用される該一連のｐＨ変化のステップは、ｐＨ５．０；ｐＨ４．８；ｐＨ４．６；ｐＨ４．４；ｐＨ４．２；ｐＨ４．０；ｐＨ３．８；ｐＨ３．６；ｐＨ３．４；ｐＨ３．２；ｐＨ３．０の順である。

本発明によるいくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質の純度を増加させる方法であって、Ｆｃ含有タンパク質およびタンパク質凝集体を含む試料を提供するステップ；該試料を固体試料に固定化されたタンパク質Ａリガンドに接触させるステップであって、タンパク質Ａリガンドはタンパク質ＡのＣドメインに基づき、Ｆｃ含有タンパク質はタンパク質Ａリガンドに結合するステップ；およびｐＨ勾配溶離法またはｐＨステップ法を使用してＦｃ含有タンパク質を含む溶離プールを得るステップを含み、Ｆｃ含有タンパク質の溶離後に除去されるタンパク質凝集体に加えてＦｃ含有タンパク質の溶離前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体が除去され、それにより溶離プール中のＦｃ含有タンパク質の純度を増加させる方法が提供される。

いくつかの実施形態では、タンパク質ＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、タンパク質ＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態では、溶離のｐＨ勾配法の場合、高ｐＨバッファは約６．０のｐＨを有し、低ｐＨバッファは約３．０のｐＨを有する。

本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態では、溶離のｐＨステップ法の場合、使用されるバッファの少なくとも１つは３．６から４．４の範囲のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたステップ溶離は、一連の小さいｐＨ変化のステップを使用し、ここでｐＨステップは約５．０の高いｐＨから約３．０の低いｐＨまで変動し、各ｐＨステップはその前のｐＨより０．１、０．２、０．３、０．４または０．５のｐＨだけ異なっている。特定の実施形態では、小さいｐＨ変化のステップは、５．０；４．８；４．６；４．４；４．２；４．０；３．８；３．６；３．４；３．２および３．０の順で使用される。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質は抗体またはＦｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該抗体はモノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配溶離の場合、ｐＨ勾配は５カラム体積から３０カラム体積まで及ぶ。

タンパク質Ａの固定に使用する典型的な固体支持体は、孔制御ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレン並びにその誘導体を含むが、これらに限定されない。

図１Ａは３種の樹脂（Ａ−ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（商標）；Ｂ−樹脂ＡおよびＣ−樹脂Ｃ）からのｐＨ勾配溶離を用いたｍＡｂ−１（ローディング密度１２ｍｇ／ｍＬ）についてのクロマトグラムの溶離領域を図示しており、ここでＸ軸はカラム体積（ＣＶ）を表し、左側Ｙ軸はＵＶ２８０吸光度（ｍＡＵ、実線）であり、右側Ｙ軸はＳＥＣにより決定された各画分中の凝集体種の百分率（連結された正方形）である。樹脂Ａおよび樹脂Ｂに関しプレピーク（ｐｒｅ−ｐｅａｋ）で除去されたタンパク質凝集体の量はＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）についての量よりもずっと多く、プロファイルの始めにおいて、より効率の良い凝集体種除去を示す。３種の樹脂すべてに対し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（商標）に対し以前報告されたように、溶離プロファイルの最後尾の画分においても大集団の凝集体種が得られる。 図１Ｂは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ひし形で示される）、樹脂Ａ（正方形で示される）および樹脂Ｂ（三角形で示される）からのｐＨ勾配溶離を使用する、ｍＡｂ−１（ローディング密度１２ｍｇ／ｍＬ）に対する収率対単量体純度を図示している。樹脂Ａおよび樹脂Ｂは、高収率を維持しつつ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）よりも高いレベルの単量体純度を達成する。 図２は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）および樹脂Ａの溶離画分に対し得られたそれぞれのＳＥＣプロファイルを示す。Ｘ軸は時間を表し、Ｙ軸は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度である。溶離プロファイルの始め（プレピーク、灰色の破線で示される）、溶離プロファイルの中間（黒い破線で示される）および溶離ピークの後半（ポストピーク（ｐｏｓｔ ｐｅａｋ）、点線で示される）からの画分と同様に、フィードプロファイルが示される（黒の実線で示される）。ピークは標準化され、単量体ピーク（８〜９分）に基づいて位置合わせされている。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）に対しては、プロファイルの終わりに向けた画分溶離においてより多い量の凝集体の除去が観察される。樹脂Ａに対してはプレピークとポストピークにおいてより多い量の凝集体の除去が観察される。 図３は５種の樹脂（Ａ−ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ （商標）；Ｂ−ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ） Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ；Ｃ−樹脂Ａ；Ｄ−樹脂Ｂ；およびＥ−樹脂Ｃ）からのｐＨ勾配溶離を用いたｍＡｂ−２（ローディング密度１２ｍｇ／ｍＬ）についてのクロマトグラムの溶離領域を図示しており、ここでＸ軸はカラム体積（ＣＶ）を表し、左側Ｙ軸はＵＶ２８０吸光度（ｍＡＵで測定され、実線で示される）であり、右側Ｙ軸はＳＥＣにより決定された各画分中の凝集体種の百分率（連結された正方形）である。樹脂Ａおよび樹脂Ｂについてプレピークにおいて除去された凝集体の量は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ） Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓまたは樹脂Ｃに対する量よりもずっと多い。 図４は３種の樹脂（Ａ−ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ （商標）；Ｂ−樹脂ＡおよびＣ−樹脂Ｃ）からのｐＨ勾配溶離を用いたｍＡｂ−２（ローディング密度４０ｍｇ／ｍＬ）についてのクロマトグラムの溶離領域を図示しており、ここでＸ軸はカラム体積（ＣＶ）を表し、左側Ｙ軸はＵＶ２８０吸光度（ｍＡＵで測定され、実線で示される）であり、右側Ｙ軸はＳＥＣにより決定された各画分中の凝集体種の百分率（連結された正方形）である。 図５は３種の樹脂（Ａ−ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ （商標）；Ｂ−樹脂ＡおよびＣ−樹脂Ｃ）からのｐＨステップ溶離を用いたｍＡｂ−２（ローディング密度１２ｍｇ／ｍＬ）についてのクロマトグラムの溶離領域を図示しており、ここでＸ軸はカラム体積（ＣＶ）を表し、左側Ｙ軸はＵＶ２８０吸光度（ｍＡＵで測定され、実線で示される）であり、右側Ｙ軸はＳＥＣにより決定された各画分中の凝集体種の百分率（連結された正方形）である。 図６は、溶離についてその前のｐＨステップとは０．２の値分異なる各ｐＨステップを有する、一連の小さいｐＨ変化のステップを使用する樹脂Ａを用いたｍＡｂ−３についてのクロマトグラムを図示しており、図６ａは一連の小さいｐＨ変化のステップを使用したｍＡｂ−３の溶離に対するクロマトグラムを図示しており、ここでＸ軸はカラム体積（ＣＶ）を表し、左側Ｙ軸はＵＶ２８０吸光度（ｍＡＵで測定される）であり、右側Ｙ軸はｐＨであり、ここで小さいｐＨ変化のステップは、ｐＨ５．０；ｐＨ４．８；ｐＨ４．６；ｐＨ４．４；ｐＨ４．２；ｐＨ４．０；ｐＨ３．８；ｐＨ３．６；ｐＨ３．４；ｐＨ３．２；ｐＨ３．０である。図６ｂは図６ａのクロマトグラムの主要な溶離ピークの拡大版を図示し、各ステップ溶離画分に存在する凝集体種の割合を示す。

本発明は、少なくとも、本明細書に記載したようにｐＨ勾配溶離又はｐＨステップ溶離を使用してタンパク質Ａクロマトグラフィカラムからの標的タンパク質（例えば、Ｆｃ含有タンパク質）の溶離を実行する場合に、標的タンパク質の溶離後のタンパク質凝集体の除去に加えて標的タンパク質の溶離前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体が除去され、溶離プールにおいて標的タンパク質のより高い純度がもたらされるという驚くべき予期し得ぬ知見に基づいている。従って、本発明の１つの実施形態では、標的タンパク質を精製する方法であって、標的タンパク質をタンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドに結合させるステップと、ｐＨ勾配を用いて溶離させるステップを含む方法が提供される。本発明の別の実施形態では、標的タンパク質を精製する方法であって、標的タンパク質をタンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドに結合させるステップと、ｐＨステップ法を用いて溶離させるステップを含む方法が提供される。

本開示をもっと容易に理解できるようにするために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義は明細書全体に記載される。

１．定義
本明細書で使用する場合、用語「ＳｐＡ」、「タンパク質Ａ」または「黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ」は、バクテリア黄色ブドウ球菌から単離された４２ｋＤａマルチドメインタンパク質を指す。ＳｐＡは、Ｘドメインと呼ばれる、そのカルボキシ末端細胞壁結合領域を介して該バクテリアの細胞壁に結合される。アミノ末端領域では、それは、Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣと呼ばれる、５つの免疫グロブリン−結合ドメインを含む（Ｓｊｏｄｈａｌ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｅｐ ７８（２）：４７１−９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎ氏ら， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． Ｆｅｂ ２５９（３）：１６９５−７０２（１９８４））。これらのドメインの各々は約５８のアミノ酸残基を含み、それらは６５〜９０％のアミノ酸配列の同一性を共有する。

ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメインの各々は、異なるＩｇ−結合部位を有する。一つの部位は、Ｆｃ（ＩｇのｌｇＧのクラスの定常領域）に関するものであり、他方は特定のＩｇ分子のＦａｂ部分（抗原認識を担当するＩｇの部分）に関するものである。ドメインのそれぞれはＦａｂ結合部位を含むことが報告された。ＳｐＡの非Ｉｇ結合部分はＣ−終端に位置しており、Ｘ領域またはＸドメインに指定される。

本明細書において互換的に使用する場合、用語「Ｃドメイン」、「ＳｐＡのＣドメイン」、「タンパク質ＡのＣドメイン」および「黄色ブドウ球菌のタンパク質ＡのＣドメイン」とは、そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されているポリペプチドまたは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されたヌクレオチド配列によってコード化されたポリペプチドを指す。「Ｃドメイン」は、３ヘリックスバンドル構造へ折り畳まれる５８アミノ酸ポリペプチドである。それは、ヘリックス１および２の表面上の残基を介してＦｃ結合することが可能であるか、またはヘリックス２および３の表面上の残基を介してＦａｂに結合することが可能である。本明細書中の方法において使用する場合、Ｃドメインに基づくタンパク質Ａリガンドは、野生型Ｃドメイン配列ならびにそれらの任意の変異体および誘導体とを含み、該変異体および誘導体は、本明細書に記載の方法を用いて、Ｆｃ含有タンパク質に結合し、より多くのタンパク質凝集体除去をもたらす。

種々の実施形態において、本明細書に記載された方法で使用されるタンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用する用語「クロマトグラフィ」は、混合物中において標的タンパク質（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を他の分子から分離し、それを単離することができるようにする動的な分離技術を指す。典型的には、クロマトグラフィ法において、移動相（液体またはガス）は固定相（通常は固体）媒体を横切ってまたは固定相媒体を通って目的の標的分子を含む試料を輸送する。固定相への分離または親和性の違いにより異なる分子が分離される一方、移動相が異なる時間に異なる分子を運び出す。

本明細書で使用する用語「親和性クロマトグラフィ」は分離されるべき標的分子（例えば、Ｆｃ含有タンパク質）が標的分子と特異的に相互作用する分子（タンパク質Ａベースのリガンド）とのその相互作用によって単離される、クロマトグラフィのモードを指す。本明細書に記載された種々の実施形態では、親和性クロマトグラフィは標的分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）を含む試料を、その上にタンパク質ＡのＣドメインに基づくリガンドを担持する固体支持体に添加することを含む。

本明細書で使用する用語「タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ」は、本明細書に記載されているもののような、タンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質ＡまたはＳｐＡベースリガンドを使用する物質の分離又は単離を指し、ＳｐＡまたはタンパク質Ａリガンドは、例えば、固体支持体上に固定化される。

この分野で知られているタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ媒体／樹脂の例は、孔制御ガラスの骨格上に固定化されたタンパク質Ａを有するもの、例えば、ＰＲＯＳＥＰ（Ｒ） ＡおよびＰＲＯＳＥＰ（Ｒ） ｖＡ媒体／樹脂（ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）；ポリスチレン固相上に固定化されたタンパク質Ａを有するもの、例えば、ＰＯＲＯＳ（Ｒ） ５０ＡおよびＰＯＲＯＳ（Ｒ） ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標） Ａ媒体／樹脂（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ， ＩＮＣ．);アガロース固体支持体上に固定化されたタンパク質Ａを有するもの、例えば、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（商標）またはＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）媒体または樹脂（ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）を含む。本明細書に記載された方法で使用されるタンパク質Ａリガンドは前述の固体支持体のいずれかの上に固定化することができる。

前述のマトリックスに加えて、タンパク質Ａは親水性架橋ポリマーに固定化することもできる。例えば、米国特許第７９５１８８５号明細書（その全体を参照により援用する）を参照されたい。この特許は典型的な親水性架橋ポリマーを記載する。理論によって縛られることを望まないが、本発明に包含されるリガンドは米国特許第７９５１８８５号明細書に記載されているもののような親水性架橋ポリマー上に固定化され得ることが期待される。

本明細書において互換的に使用される用語「親和性マトリックス」または「親和性クロマトグラフィマトリックス」は、親和性クロマトグラフィリガンド（例えば、タンパク質ＡのＣドメインに基づく）を付着させている固体支持体を指す。このリガンドは混合物から精製または除去されるべき親和性相互作用を介して関心のある分子（例えば、免疫グロブリンまたはＦｃ含有タンパク質）に結合することができる。

本明細書において互換的に使用される用語「標的タンパク質」または「関心のあるタンパク質」は、タンパク質ＡのＣドメインまたはその変異体もしくは誘導体を用いて精製することができるあらゆるタンパク質を指す。様々な実施形態において、標的タンパク質はＦｃ融合タンパク質の免疫グロブリンのようなＦｃ含有タンパク質である。

（本明細書において互換的に使用される）用語「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる塩基性の四ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質であって、鎖が、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化され、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。（本明細書において互換的に使用される）用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」は、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる二ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質であって、鎖が、例えば、鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。用語「ドメイン」は、例えば、β-プリーツシートおよび/または鎖間ジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループ（例えば、３〜４ペプチドループを含む）を含む１つの重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインはさらに、「定常」ドメインの場合には様々なクラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如に基づいて、または「可変」ドメインの場合には様々なクラスメンバーのドメイン内の「有意な変動」に基づいて、「定常」または「可変」と呼ばれる。抗体またはポリペプチド「ドメイン」はしばしば抗体またはポリペプチド「領域」とこの分野で互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に呼ばれる。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメイン」と互換的に呼ばれる。

免疫グロブリンまたは抗体はモノクローナルでもポリクローナルであってもよく、単量体または多量体形態、例えば、五量体形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または、単量体、二量体または多量体形態で存在するＩｇＡ抗体、で存在してもよい。用語「断片（フラグメント）」は、無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片は無傷のまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。断片はまた組換え手段により得ることができる。典型的な断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃおよび/またはＦｖ断片を含む。

本発明の方法は、プロテインＡに結合することができるあらゆる抗体またはそれらの断片（ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそれらの断片を含むがこれらに限定されない）を精製するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法を用いて精製した抗体は治療抗体である。

典型的な治療抗体は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）；Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）；Ａｖａｓｔｉｎ（商標）；Ｂｅｘｘａｒ（商標）；Ｃａｍｐａｔｈ（商標）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）；Ｈｕｍｉｒａ（商標）；Ｒａｐｔｉｖａ（商標）：Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）：ＲｅｏＰｒｏ（商標）:Ｐｒｏｌｉａ（Ｒ）；Ｘｇｅｖａ（Ｒ）；Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（商標）；Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）；Ｘｏｌａｉｒ（商標）；Ｚｅｎａｐａｘ（商標）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（商標）を含む。典型的なＦｃ融合タンパク質は、ＥＮＢＲＥＬ（Ｒ）のような、可溶性形態の受容体または酵素およびそれらの変異体、誘導体、または類似物への融合を含む。

本明細書に記載される方法を使用して精製された標的タンパク質はＦｃ領域を含むものであり、従ってタンパク質Ａによる精製に適していることが理解される。本明細書で使用する用語「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ」は、タンパク質Ａと相互作用する免疫グロブリン分子のそれらのアミノ酸残基を指す。Ｆｃ領域は抗体の結晶性テール領域であり、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する。

用語「Ｆｃ結合」、「Ｆｃ部分に結合する」または「Ｆｃ部分への結合」は、本明細書に記載する親和性リガンドの抗体の定常部分（Ｆｃ）に結合する能力を指す。いくつかの実施形態では、本発明によるリガンドは、少なくとも１０^−７Ｍまたは少なくとも１０^−８Ｍまたは少なくとも１０^−９Ｍの親和性で抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）のＦｃ部分に結合する。

本明細書で使用する場合、用語「断片」は、例えば、免疫グロブリンのような、完全長のＦｃ含有タンパク質の部分を指す。断片の例は、抗体断片から形成された、Ｆａｂ断片、単鎖抗体分子、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体、および多特異的抗体を含む。

本明細書に記載の方法を用いて精製されるＦｃ含有タンパク質は、任意の適切な発現系または細胞型を使用して発現させることができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、哺乳類の細胞、例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０細胞、ハイブリドーマ、マウス細胞などにおいて発現される。別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、非哺乳類細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌等）を用いて発現される。細胞培養中での発現後、不溶性種は、典型的には、例えば、深層濾過、遠心分離、軟凝集／沈殿（例えば、酸沈殿または刺激応答性ポリマー）のような清澄化方法を使用して除去される。この清澄化細胞培養は、典型的にはタンパク質Ａカラム上にロードされ、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、または他の不純物のような可溶性不純物からＦｃ含有タンパク質を分離する。

本明細書で使用する場合、用語「精製ポリペプチド」または「精製タンパク質」は、本明細書に記載されるｐＨ勾配またはｐＨステップ法を用いるタンパク質Ａ親和性ステップからの溶離生成物である。精製ポリペプチド／タンパク質は、好ましくは、主としてポリペプチド単量体を含む。

本明細書で使用する場合、用語「未精製ポリペプチド」、「未精製タンパク質」または「タンパク質ロード」は、タンパク質Ａの親和性精製ステップ前のローディング材料または出発物質中のポリペプチドまたはタンパク質である。

本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ含有タンパク質の純度」は、タンパク質Ａクロマトグラフィカラムから溶離した全タンパク質に対する標的タンパク質（即ち、Ｆｃ含有タンパク質）の単量体種として定義され、タンパク質Ａのクロマトグラフィカラムは固体支持体上に固定化されたタンパク質ＡのＣドメインに基づくリガンドを使用する。従って、純度は、溶離プール中の全タンパク質に対する全単量体の比によって計算することができる。全タンパク質は、タンパク質断片、凝集体、標的タンパク質の単量体種およびその変異体の一つ以上を含んでもよい。本明細書に記載された様々な方法において、Ｆｃ含有タンパク質の純度は、この分野に記載されたタンパク質Ａクロマトグラフィ法に対して、少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、またはそれ以上増加する。

典型的には、本明細書に記載のタンパク質Ａクロマトグラフィ法の場合、標的タンパク質を含む試料によるタンパク質Ａカラムのロード後、適切な溶離バッファを用いて標的タンパク質はカラムから溶離され、同時に２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定が行われ、それにより標的タンパク質に対する溶離プロファイルが得られる。溶離プロファイルは、典型的にはプレピーク、ピーク、ポストピークを含む。一旦溶離が開始すると、２８０ｎｍで測定されたタンパク質吸光度が一定のレベル、例えば５０ｍＡＵ以上に達すると画分が所定のカラム体積で集められ、２８０ｎｍでのタンパク質吸光度が、例えば、５０ｍＡＵ未満に達すると終了される。高い吸光度値を有する溶離画分はピークを形成する画分であり、標的タンパク質を含む。これらは、標的タンパク質を含む溶離プールを生成するためにプールすることができる。このような画分は、典型的には、溶離プロファイルの中央に入る。より低い吸光度値を有する溶離画分（溶離プロファイルの最初または終わりに向けて現れる）はタンパク質凝集体を含むため、一般的には破棄される。

本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ含有タンパク質の収率」は、タンパク質Ａクロマトグラフィカラムから溶離したタンパク質の合計量に対する溶離プールに集められたタンパク質の量として定義される。いくつかの実施形態において、溶離プールは５００ｍＡＵ以上の吸光度値で開始し、５００ｍＡＵ以下の吸光度値で終わる画分を含む。

本明細書で使用する場合、用語「プレピーク」は指定されたＵＶ吸光度前に収集されるタンパク質に対する溶離プロファイルの部分を指し、溶離プールには含まれない。いくつかの実施形態では、プレピークは吸光度が５００ｍＡＵ以上に到達する前に回収された全タンパク質を指す。

本明細書で使用する場合、用語「ポストピーク」は、指定されたＵＶ吸光度後に収集されるタンパク質に対する溶離プロファイルの部分を指す。いくつかの実施形態では、ポストピークは吸光度が５００ｍＡＵ未満に到達した後に回収された全タンパク質を指す。

本明細書において互換的に使用される用語「タンパク質凝集体」は、関心のある生成物、例えば、Ｆｃ含有タンパク質、の少なくとも２つの分子の会合体を指す。関心のある生成物の少なくとも２つの分子の会合は、例えば、電荷−電荷相互作用、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用のような非共有結合性相互作用；およびジスルフィド相互作用または非還元性架橋のような共有結合性相互作用を含むが、これらに限定されない任意の手段によって発生し得る。凝集体は、二量体、三量体、四量体、四量体よりも大きい多量体等であり得る。用語「タンパク質凝集体」はＦｃ含有タンパク質のあらゆるより高次の種を含む。

凝集体濃度は、この分野で周知の広く受け入れられている方法であるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用してタンパク質試料において測定することができる（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ氏ら、Ｊ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ，９６，（２００７），２６８−２７９を参照されたい）。いくつかの実施形態では、様々な分子量の種の相対濃度はＵＶ吸光度を使用して溶離画分中で測定されており、一方画分の分子量はカラムメーカーの指示に従ってシステム較正を実行することによって決定される。凝集体濃度を測定するための他の方法には、例えば、ゲル電気泳動および光散乱が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「単量体」はＦｃ含有タンパク質の単一の単位を指す。例えば、抗体の場合には、単量体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、片腕抗体の場合には、単量体は、１つの重鎖及び１つの軽鎖からなる。

本明細書で使用する用語「リガンド」は、固体支持体（例えば、多孔質表面）上に固定化され、Ｆｃ含有タンパク質を引き付けることが可能なタンパク質ＡのＣドメインに基づく生体分子を指す。本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されたアミノ酸配列、またはその変異体、断片もしくは誘導体を含む。本明細書に記載された他のいくつかの実施形態では、リガンドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列、またはその変異体、断片もしくは誘導体を含む。

用語「固体支持体」は一般に、リガンドを付着させている（多孔質または非多孔質の）任意の材料を指す。固体支持体へのリガンドの付着は、グラフト化の場合におけるような共有結合を介して、またはコーティング、接着、吸着、および同様の機構を介してのいずれかで行うことができる。本明細書に記載される方法および組成物に使用される固体支持体の例としては、膜、多孔質ビーズ、翼状繊維または多孔質繊維、モノリスが挙げられるが、これらに限定されない。適切な膜としては、表面修飾または非修飾ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルスルホン（ＰＥＥＳ）、セルロース、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な多孔質ビーズとしては、シリカ、セラミック、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、アガロースおよびセルロースなどの多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。適当な翼状繊維または多孔質繊維には、ナイロン、セルロース、ＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。適切なモノリスとしては、シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリレート、およびポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンドは、例えば、多孔質ビーズなどのクロマトグラフィ媒体上に固定され、これは次いで使用のためにクロマトグラフィカラムに充填される。

用語「ロード密度」または「ローディング密度」は、クロマトグラフィ媒体の体積当たりのクロマトグラフィカラムにロードしたＦｃ含有タンパク質を含む試料の量である。ローディング密度はｇ／Ｌで測定される。いくつかの実施形態では、試料は、５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌ、または１２ｇ／Ｌ、または１５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ、または３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌまたはそれ以上のローディング密度でロードされる。

「バッファ」は、その酸−塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液である。例えば、バッファの所望のｐＨに応じて使用できる様々なバッファが、Ｂｕｆｆｅｒｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇｕｅｆｆｒｏｙ， Ｄ．， Ｅｄ． Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （１９７５）に記載されている。

本明細書中「平衡バッファ」は、標的タンパク質をロードする（固定化タンパク質Ａを有する）固体支持体を調製するために使用されるものである。

「洗浄バッファ」は、ロード後標的タンパク質の溶離前に（固定化タンパク質Ａを有する）固体支持体上を通過させるバッファを指すために本明細書中で使用される。

ＩＩ．タンパク質Ａクロマトグラフィ
タンパク質Ａクロマトグラフィは、例えば、免疫グロブリンまたは抗体のようなＦｃ含有タンパク質の精製に最も一般的に使用される親和性クロマトグラフィの形態である。一般的に、標的タンパク質（例えば、Ｆｃ含有タンパク質）は適切な細胞培養中で発現され、細胞培養フィードは、清澄化されたフィードを、例えば、クロマトグラフィカラムに充填されたタンパク質Ａクロマトグラフィ媒体にロードする前に清澄化に供される。

タンパク質Ａクロマトグラフィは、その上に固定化された適切なタンパク質Ａリガンドを有する、例えば、多孔質ビーズや樹脂などの固体支持体を一般に使用する。タンパク質Ａに結合した固体支持体は、その後、クロマトグラフィカラムに充填される。カラムは最初に適切な平衡バッファで平衡化することができる。標的タンパク質（例えば、Ｆｃ含有タンパク質）を含む清澄化フィードは、Ｆｃ含有タンパク質を含む試料（例えば、清澄化した細胞培養フィード）でカラムをロードすることによって、カラム内の固体支持体にその後接触される。典型的には、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡのような可溶性不純物はタンパク質Ａに結合せず、従ってフロースルー中で除去され、廃棄物に分流される。続いて、結合したＦｃ含有タンパク質は、適切な溶離バッファへの暴露によってタンパク質Ａクロマトグラフィカラムから溶離される。溶離のための典型的な流速は１時間当たり６０カラム体積（ＣＶ）から１時間当たり５ＣＶの範囲である。勾配溶離の場合、典型的には溶離は５から６０カラム体積にわたって行われる。

本明細書に記載されているように、Ｆｃ含有タンパク質の溶離は２つの異なる方法を使用して行うことができる。いくつかの実施形態において、高ｐＨバッファ、低ｐＨバッファが、ｐＨが７．０から３．０の範囲のｐＨ勾配を生成するために混合される。いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配は７．０、または約６．８、または約６．６、または約６．４、または約６．２、または約６．０、または約５．８、または約５．６、または約５．４、または約５．２、または約５．０、または約４．８、または約４．６、または約４．４、または約４．２、または約４．０で開始し、ｐＨ勾配は３．０、または約３．２、または約３．４、または約３．６、または約３．８で終了する。

溶離したタンパク質は、凝集体含有量に対する単量体のさらなる分析のために一定体積の画分に回収される。

いくつかの実施形態では、異なるｐＨ値の２以上のバッファが、タンパク質Ａに結合したＦｃ含有タンパク質を溶離するために、ｐＨ値の高い順から連続して使用される。いくつかの実施形態では、ステップ溶離に用いられる第１のバッファは、４．４、または約４．２、また約４．０、または約３．８、または約３．６のｐＨを有し、ステップ溶離に用いられる第２のバッファは、３．５、または約３．４、または約３．３、または約３．２、または約３．１、または約３．０のｐＨを有する。

特定の実施形態では、第１のバッファは、約３．７５のｐＨを有し、第２のバッファは約３．０のｐＨを有する。溶離したタンパク質は、凝集体含有量に対する単量体のさらなる分析のために一定体積の画分に回収される。

いくつかの実施形態では、ステップ溶離は、タンパク質Ａに結合したＦｃ含有タンパク質を溶離するために使用され、そこではｐＨの小さな変化が時間と共に複数の段階でタンパク質の溶離のために使用される。続いて、複数の溶離プールはＦｃ含有タンパク質を回収するために組み合わせることができる。

いくつかの実施形態では、ステップ溶離はｐＨの大きい順に一連の小さいｐＨ変化のステップを使用しており、各ｐＨステップは前のステップから約０．１から約０．５のｐＨ値分異なる。例えば、いくつかの実施形態では、ｐＨの高点は約５．０であり、これは０．１から０．５の範囲のｐＨ値分段階的に減少し、ｐＨの低点は約３．０である。特定の実施形態では、一連の小さいｐＨ変化のステップは、５．０；４．８；４．６；４．４；４．２；４．０；３．８；３．６；３．４；３．２および３．０の順のｐＨ値を含む。

追加のバッファもタンパク質のタンパク質Ａリガンドへの結合を容易にする方法に使用できる。このようなバッファは、典型的には、ステップ溶離法に使用されるバッファよりも高いｐＨを有する。

ＩＩＩ．本明細書に記載された方法に使用される典型的なバッファ
上述のように、タンパク質Ａクロマトグラフィカラムは、典型的には、Ｆｃ含有タンパク質を含む試料でカラムをロードする前に平衡化される。いくつかの実施形態では、使用される平衡バッファは等張性であり、６．０から８．０の範囲のｐＨを有する。典型的な平衡バッファは、ｐＨ７．１で、２５ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含む。

タンパク質Ａクロマトグラフィの間に典型的に使用される別のバッファは、ローディングバッファである。ローディングバッファは、タンパク質Ａを固定化した固体支持体上にＦｃ含有タンパク質およびタンパク質凝集体の混合物をロードするために使用される。しばしば、平衡バッファとローディングバッファは同じである。

タンパク質Ａに結合したＦｃ含有タンパク質は、続いて、溶離バッファで溶離される。本明細書に記載されたいくつかの実施形態において、溶離バッファは、高ｐＨバッファと低ｐＨバッファを含み、それによって、溶離バッファ中の高ｐＨバッファと低ｐＨバッファの割合を調整することによって形成されるｐＨ勾配を生じる。いくつかの実施形態において、溶離バッファは、７．０から３．０の範囲または６．０から３．０の範囲のｐＨを有する。本明細書で使用されるｐＨ値はあらゆるタンパク質の存在なしに測定される。使用できるｐＨバッファの例として、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ギ酸、およびアンモニウムバッファー、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいバッファは、クエン酸塩、酢酸塩およびギ酸バッファである。

いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配の高点はｐＨ５．１から６．０の範囲であり、ｐＨ勾配の低点はｐＨ３．０から３．７の範囲である。

ステップ溶離の場合および一連の小さいｐＨ変化のステップが使用される場合、これらのステップを生じるために、ｐＨの高い順に２以上のバッファが連続して使用される。これらのバッファは、クロマトグラフィシステムを使用してｐＨを維持しながら、前述の類似バッファを使用して事前に調製または混合できる。

理論によって縛られることを望まないが、いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配溶離法はｐＨステップ溶離法と組み合わせて使用することができることが期待され、例えば、一方が他方の後に使用される。

ＩＶ．本明細書に記載される方法に使用される典型的なリガンド
本発明による方法はタンパク質ＡのＣドメインに基づくタンパク質Ａリガンドを使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるリガンドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるリガンドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。Ｆｃ含有タンパク質に結合するこれらの配列の変異体、断片、および誘導体も同様に本発明に包含され、本明細書に記載されたように、ｐＨ勾配またはｐＨステップ溶離法に供された場合、Ｆｃ含有タンパク質の溶離前にタンパク質凝集体の少なくとも３０％が溶離される。

Ｖ．Ｆｃ含有タンパク質を含む溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルを測定する方法
タンパク質は凝集し、またはミスフォールドになり得る。親和性クロマトグラフィ、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィを使用する場合、所望の標的タンパク質（即ち、単量体）は、多くの場合タンパク質凝集体と共精製される。従って、タンパク質凝集体は、しばしば標的タンパク質を含む溶離プールに含まれ、溶離プールは典型的には、そのような凝集体を除去するための１以上のその後の工程に供される。このような追加のステップは、それらの電荷、疎水性の程度、または大きさに基づいて凝集体を分離するクロマトグラフィ技術を含み得る。典型的な技術としては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、またはサイズ排除クロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術は、典型的には、タンパク質Ａステップ後にタンパク質凝集体を除去する。しかし、これらの方法の各々はより長い処理時間とより高いコストをもたらすさらなる精製のための追加のバッファ、樹脂または吸着剤を必要とする。

本明細書に記載された方法は、タンパク質Ａの溶離ステップの間標的タンパク質の前後でタンパク質凝集体の除去をもたらし、それによって全体的な生成物の純度を増加させ、および典型的にタンパク質凝集体を除去するために必要な追加のステップの数を減少させ、または１以上の追加のステップを使用する必要性を回避する。

本明細書において示されるように、標的タンパク質を含む溶離プール中のタンパク質凝集体のレベルは、標的タンパク質の溶離後にのみタンパク質凝集体を除去する従来技術に記載された方法に対しかなり低い。結果として、全タンパク質に対するタンパク質単量体の比率として測定される、溶離プール中の標的タンパク質の純度は増加する。

タンパク質凝集体のレベルは、当技術分野で公知の多数の方法および本明細書に記載された方法を用いて種々の溶離画分中で測定することができる。例えば、タンパク質凝集体は、動的光散乱、高圧サイズ排除クロマトグラフィ、非対称流動場フローフラクショネーション、ゲル電気泳動、蛍光、または蛍光色素検出を用いて測定することができる。

サイズ排除クロマトグラフィは簡単に利用しやすく、多くの場合に選択されるツールである。サイズ排除クロマトグラフィは、分子量に基づいて化学種を分離するものであり、単量体、凝集体、及び断片種の相対量を定量化するためにＵＶクロマトグラム下の面積が使用される。

本発明は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。本出願を通して引用されたすべての文献、特許および公開特許出願の内容並びに図面は参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：タンパク質Ａリガンドの発生
Ｃドメインに基づく２つのタンパク質Ａリガンドをコード化する合成遺伝子はＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）から得られる。これらのリガンドのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４に記載されている。

各合成遺伝子の５’末端はメチオニンを開始するコドンを含む。それぞれ遺伝子の５’および３’末端はそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含む。これらの合成遺伝子、並びに使用される発現ベクター、即ち、ｐＥＴｌｌａを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）によって消化し、ＤＮＡ断片を０．７％アガロースＴＡＥゲル上で分離し、適切なＤＮＡ断片を切除し、ＱＩＡＧＥＮ（バレンシア、カリフォルニア州）からのゲル抽出キットを用いて精製する。精製したインサートをＴ４ ＤＮＡ リガーゼ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を使用してｐＥＴｌｌａまたは任意の他の適切な発現ベクターの主鎖に結合させる。

製造者の指示に従って，結合反応をＤＨ５αコンピテント大腸菌（ＩＮＶ１ＴＲＯＧＥＮ、カールスバッド、カリフォルニア州）に形質転換し，１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴｅｃｈｎｏｖａ ＬＢプレート上に置き、３７℃で一晩増殖させる。精製されたＤＮＡを得るために、個々のコロニーを取り出し１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ中で一晩培養する。ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（バレンシア、カリフォルニア州）からのスピンミニプレップキットを用いて精製する。組換えプラスミドの同一性をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いて制限消化分析により確認する。

実施例２：タンパク質Ａリガンドの発現および精製
実施例１に記載したタンパク質ＡリガンドをｐＥＴｌｌａなどのｐＥＴベクターを使用して、株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＰＲＯＭＥＧＡ、マディソン、ウィスコンシン州）などの大腸菌株中で発現させる。

単一コロニーをプレートから選択し、１００ ｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で一晩増殖させる。一晩培養物を１００ ｇ／ｍＬアンピシリンを含む新しいＬＢ培地に１００倍希釈して、６００ｎｍでの光学密度がおよそ０．８であるような細胞密度まで増殖させる。１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加後、細胞をさらに２時間増殖させる。発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロッティングにより確認する。

細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、５分）により回収し、２０ｍＭイミダゾールを含有する３ｍＬのリン酸塩緩衝化生理食塩水に再懸濁させる。細胞を超音波処理によって溶解し、細胞片を遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃、３０分）によりペレット化する。およそ５００ｍＬの細胞溶解物を適用し、５０ｍＬのＩｇＧ親和性樹脂（孔制御ガラスの上に固定したポリクローナルｈＩｇＧ）を用いて、タンパク質Ａリガンドを精製する。カラムを３０ｍＬのリン酸塩緩衝化生理食塩水で洗浄し、タンパク質ＡリガンドをｐＨ３の０．１Ｍクエン酸中で溶離する。リガンドを１８メガオームＭｉｌｉｉ−Ｑ（Ｒ）水（ＥＭＤ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ビレリカ、マサチューセッツ州）で一晩透析する。タンパク質濃度を、理論的な減衰係数（Ｐａｃｅ氏ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ４：２４１１（１９９５））に基づいてＵＶ分光計を用いて確認する。

実施例３：固体支持体へのタンパク質Ａリガンドの付着
実施例１および２に記載されたような種々のリガンドの発生および発現に続いて、それらを固体支持体に多点付着を介して固定化する。

典型的な実験では、タンパク質Ａリガンド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０〜２０ｍｇ／ｍＬ）を米国特許第７９５１８８５号明細書（本明細書に参照により援用される）に記載の架橋ポリビニルアルコールベースのマトリックス上に、一晩、１〜１．１ＭのＮａ_２ＳＯ_４の存在下、樹脂表面上のエポキシ基とリガンド上の多数のアミノ基の反応を介して固定する。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ氏ら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９２，１１８頁を参照されたい。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のリガンドのカップリングの方法は上記の方法と同様である。

実施例４：凝集体を有するｍＡｂフィードの発生
２つの異なるＦｃ含有タンパク質ｍＡｂ−１およびｍＡｂ−２を異なるタンパク質Ａクロマトグラフィ樹脂上でｐＨ勾配溶離法を用いて精製する。

ｍＡｂ−１とｍＡｂ−２ローディング材料を意図的に凝集させて溶離プール中の異なる種の分析を容易にする。凝集体の発生を、以前に開発された方法（例えば、ＡＣＳ全国大会２０１２、Ｃａｔａｌｄｏ氏ら）を使用して達成する。具体的には、ｐＨ循環法を使用して非可逆的および溶液安定凝集体を生成する。精製されたｍＡｂを遠心濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５、１０，０００ＮＭＷＬ）を用いて濃縮する。穏やかに撹拌しながら１０Ｎと１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨをｐＨ１１．０に上げ、次いで室温で１時間放置する。続いて、穏やかに攪拌しながら、６Ｍと１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを（約２０分かけて）ｐＨ５．０まで徐々に低下させる。クロマトグラフ実験を実行する前に、この手順を３回繰り返し、その後溶液を０．２２μｍのシリンジフィルタを用いて濾過し、平衡バッファに透析する。

実施例５：ｐＨ勾配溶離タンパク質Ａクロマトグラフィ
クロマトグラフィの実験をＵｎｉｃｏｒｎ６．１ソフトウェアで制御されたＡＫＴＡ Ａｖａｎｔプラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行する。タンパク質Ａカラムを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ） Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４のリガンドをそれぞれ有する樹脂ＡおよびＢ、並びに樹脂Ｃを用いて製造者のガイドラインに従って充填する。本明細書に記載の実施例で使用される種々のクロマトグラフィ樹脂の説明は、表１に記載される。実験を０．６６ｃｍ（内径）×１４ｃｍ（ベッド高さ）のカラムを用いて行う。

溶離について、Ｆｃ含有タンパク質を高いｐＨでタンパク質Ａリガンドに結合させ、溶離の間ｐＨを徐々に低下させるｐＨ勾配を使用する。Ａｖａｎｔクロマトグラフィシステムは、流量が維持され、経時的にポンプのそれぞれが提供する流量の割合が変化する２つのポンプシステムを使用して、変化する割合で２つのバッファを混合することによりこのｐＨ勾配を生成する。０．１Ｍクエン酸、ｐＨ６．０の初期バッファで５カラム体積（ＣＶ）についてカラムを平衡化する。Ｆｃ含有タンパク質（例えば、抗体）をカラムに充填し、次いで４ＣＶについて平衡バッファで洗浄する。次いで、バッファが２０ＣＶを通して０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０に遷移する直線勾配を使用して抗体を溶離する。５ＣＶの勾配遅延が使用される。

次いで、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、樹脂Ｃ、樹脂Ａおよび樹脂Ｂ）または６ＭグアニジンＨＣｌ（ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ） Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ）を用いてカラムを洗浄する。カラムをその後再平衡化する。０．８ｍＬ／分（６分の滞留時間）の流量を有するタンパク質ローディングステップを除いてすべてのステップに対し流量は１．６ｍＬ／分（３分の滞留時間）である。各方法の溶離部分の間画分を０．５ＣＶ毎に集める。各画分中の抗体濃度を、寸法２．１ｍｍ×３０ｍｍ（ＡＢＩ １−５０２４−１２、Ｓ／Ｎ３３５０４）のＰＯＲＯＳ（Ｒ）Ａ／２０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質Ａカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを使用して決定する。これらの画分を、以下に記載の分析アッセイを用いて、凝集体を表す高分子量（ＨＭＷ）種についてさらに特徴付ける。１２ｍｇ／ｍＬの樹脂から４０ｍｇ／ｍＬの樹脂の範囲の異なるローディング密度でも実験を行う。

実施例６：サイズ排除クロマトグラフィを使用する溶離プール中の高分子量種の決定
異なる試料中の高分子量（ＨＭＷ）種、単量体、および低分子量（ＬＭＷ）種の相対レベルを決定するためのＳＥＣ実験を行うために、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを使用する。４μｍの粒子サイズを有する寸法３．６ｍｍ（内径）×３０ｃｍ（ベッド高）のＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃０８５４１）カラムをガードカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃０８５４３）と一緒に使用する。使用されるバッファ系は、０．３５ｍＬ／分の流量で０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。試料注入を、約１０μｇの抗体が試料毎にロードされるように調整する（注入体積は、１から１００μＬの範囲であった）。バックグラウンドバッファを含むブランクを各試料セットと共に流す。ゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１５１−１９０１）も分析してカラムの性能を確認する。ＨＰＬＣクロマトグラムを２３０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって監視する。吸光度曲線をピーク積分のためにＡｇｉｌｉｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析する。この分析から得たパーセント値を画分の濃度（ｍｇ／ｍＬ）にかけて、試料中の各サイズ変異種についての実際の濃度または量を得る（例えば、ＳＥＣの結果４％ＨＭＷ、９２％の単量体、４％ＬＭＷ；試料濃度：２ｇ／Ｌ；試料体積：１０ｍＬ；１．８４ｇＬ単量体、試料中１８．４ｍｇの単量体合計）。クロマトグラムを、試料オーバーレイに示すように、単量体の溶離プールに基づいて位置合わせし、標準化する。

ｍＡｂ−１（１２ｍｇ／ｍＬのローディング密度）を用いたｐＨ勾配からのクロマトグラムの溶離部分のＵＶトレースは図１Ａにおいて実線で示す。ＳＥＣから得られた対応する凝集体含有量を連結された正方形で示す。５００ｍＡＵでピークをカットした場合の、対応する溶離プール純度と収率データは図２に示す。図１ＢはＭａｂＳｅｌｅｅｔ Ｓｕｒｅ（商標）と樹脂ＡおよびＢに関する単量体純度に対する収率を示す。

溶離プロファイル内の異なる画分のＳＥＣクロマトグラムは、樹脂ＡとＢのプロファイルの開始と終わりからの画分がプレピークにおいて除去される全凝集体の大きな割合（３０％超過）を含むことを示す。５００ｍＡＵでプロファイルをカットした後、これらの凝集体種が除去され、得られた溶離プール中の高純度レベルを生じる。表２にまとめたように、樹脂Ａと樹脂Ｂの両方は、高い溶離プール純度を示す。表２は３種の樹脂からのｍＡｂ−１ ｐＨ勾配溶離についての収率および純度データを含む。溶離ピークを５００ｍＡＵより大きいＵＶ２８０吸光度を有する部分を含むようにカットする。プール内の純度を、ピークをカットした後に決定し、プール中の総タンパク質量と比較したプール中の単量体の合計量として計算する。全収率を、ピークをカットした後に決定し、全体の溶離プロファイルから溶離画分に回収されたタンパク質の合計量に対する溶離プール中のｍＡｂの合計量として計算する。

ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）と樹脂Ａに対する溶離プロファイルの開始、中間、終わりからの代表的なＳＥＣクロマトグラムを図２に示す。このプロファイルは、単量体ピーク（８〜９分）に基づいて標準化され、位置合わせされた。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）に関し、大きな凝集体ピークはプロファイルの終わりに向けて溶離する画分で観察された。一方、樹脂Ａに関しては、大きな凝集体ピークは初期および後期の溶離画分の両方で観察された。

図３は、ｍＡｂ−２（１２ｍｇ／ｍＬのローディング密度）を用いたｐＨ勾配からのクロマトグラムの関連の溶離部分のＵＶトレースを示す。ＳＥＣから得られた対応する凝集体含有量を連結された正方形で示す。５００ｍＡＵでのピークをカットした場合の、対応する溶離プール純度と収率データは図３に示す。結果はｍＡｂ−１で得られたものと同様である。

表３は、５種の樹脂からのｍＡｂ−２のｐＨ勾配溶離についての収率および純度データを含む。溶離プロファイルを５００ｍＡＵより大きいＵＶ２８０吸光度を有する部分を含むようにカットした。プール内の純度を、プロファイルをカットした後に決定し、プール中の全タンパク質と比較したプール中の単量体の合計量として計算する。全収率を、ピークをカットした後に決定し、全体の溶離プロファイルから溶離画分に回収された合計量に対するプール中の合計量として計算する。

最も高いプール純度は樹脂Ａを用いて得られる。樹脂ＡとＢからのプレピークおよびポストピークからの画分は、ＨＭＷ種の大きな割合を含む。ＰｒｏＳｅｐ（Ｒ） Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓと樹脂ＣについてのＳＥＣデータは、従来技術で報告されているように、凝集体種は、主にこれらの樹脂についての溶離プロファイルのテール部分にあることを示す。以下の表３に要約するように、樹脂ＡおよびＢは、プレピークで除去される全凝集体の９０％超過を除去する。

図４は、より高いローディング密度、樹脂１ｍＬあたり４０ｍｇ、に対して得られた結果を示す。表２のより低いローディング密度の結果と同様に、樹脂ＡおよびＢは、溶離プロファイルの開始と終わりで多量の凝集体種を示す。

表４は、４０ｍｇ／ｍＬのローディング密度での３種の樹脂からのｍＡｂ−２のｐＨ勾配溶離についての収率および純度データを示す。溶離プロファイルを５００ｍＡＵより大きいＵＶ２８０吸光度を有する部分を含むようにカットした。プール内の純度を、プロファイルをカットした後に決定し、プール中の全質量と比較したプール中の単量体の合計量として計算する。全収率を、プロファイルをカットした後に決定し、全体の溶離プロファイルから溶離画分に回収された合計量と比較したプール中のタンパク質の合計量として計算する。以下に示すように、樹脂ＡおよびＢは、プレピークにおけるこのステップで全凝集体の４８％超過を除去する。

実施例７：タンパク質Ａクロマトグラフィに対するｐＨステップ溶離
以下に説明するように、Ｆｃ含有タンパク質、即ち、ｍＡｂ−２をｐＨステップ溶離法を使用して精製する。

クロマトグラフィの実験をＵｎｉｃｏｒｎ６．１ソフトウェアで制御されたＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行する。タンパク質Ａカラムを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）、樹脂ＡまたはＢを用いて充填する。実験は０．６６ｃｍ（内径）×１４ｃｍ（ベッド高さ）のカラムを用いて行われる。カラムを非対称のテストを使用して修正した。

溶離について、タンパク質を高いｐＨで結合させ、溶離の間ｐＨを段階的に低下させるｐＨステップを使用する。Ａｖａｎｔクロマトグラフィシステムは、２つのポンプシステムを使用して、指定された割合で２つのバッファを混合することによりこのｐＨステップを生成する。０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５でカラムを平衡化する。抗体をカラムにロードし、次いで９ＣＶについて平衡バッファで洗浄する。この方法は、１０ＣＶについて０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．７５の濃度を達成するようにバッファを混合するようプログラムされ、次いで１０ＣＶについて０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３まで低下させる。カラムをその後０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて洗浄し、再平衡化する。０．８ｍＬ／分（６分の滞留時間）の流量を有していたタンパク質ローディングステップを除いてすべてのステップに対し流量は１．６ｍＬ／分（３分の滞留時間）である。この方法の溶離部分の間画分を１ＣＶ毎集める。これらの画分を、前述の分析アッセイを用いて特徴付ける。

ｍＡｂ−２を用いたｐＨステップ溶離結果は図５に示される。最初の２つの画分を除外するためにプロファイルをカットした場合の、対応する溶離プールの純度と収率のデータは表５に示される。表５は３種の樹脂からのｍＡｂ−２ ｐＨステップ溶離についての収率および純度データを含む。溶離プロフィールは最初の２つの画分を除外するためにカットされる。プール内の純度をプロファイルをカットした後に決定し、プール内のタンパク質の合計量と比較したプール内の単量体の合計量として算出する。全収率をプロファイルをカットした後に決定し、全体の溶離プロファイルから溶離画分に回収された合計量と比較したプール内の合計量として算出する。

樹脂Ａは、また最も高い単量体純度（８８．３％）をもたらす一方で最も高い合計のｍＡｂ収率を提供する。樹脂Ｂは、中程度の全収率と共に最も高い単量体純度（９２．１％）を提供する。これは、ｐＨステップ溶離の戦略は、最終生成物プール内の凝集体レベルを低下させるのに有用であり得ることを示す。

実施例８：タンパク質Ａクロマトグラフィに対する一連の小さいｐＨ変化のステップを使用するステップ溶離
この典型的な実験では、Ｆｃ含有タンパク質、即ちｍＡｂ−３を、以下のように一連の小さいｐＨ変化のステップを使用して精製する。

クロマトグラフィの実験をＵｎｉｃｏｒｎ６．１ソフトウェアで制御されたＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行する。タンパク質Ａカラムを樹脂Ａを用いて充填する。実験を０．６６ｃｍ（内径）×１４ｃｍ（ベッド高さ）のカラムを用いて行う。カラムを非対称のテストを使用して修正する。

溶離について、タンパク質を高いｐＨで結合させ、溶離の間ｐＨを段階的に低下させる一連の小さいｐＨ変化のステップを使用する。Ａｖａｎｔクロマトグラフィシステムは、２つのポンプシステムを使用して、指定された割合で２つのバッファを混合することによりこのｐＨステップを生成できる。抗体フィードは、最初に１０．５％の凝集体を含んでいる。５ＣＶについて０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５でタンパク質Ａカラムを平衡化する。５ＣＶについて抗体フィードをカラムにロードし、次いで平衡バッファで洗浄する。抗体の溶離のために、この方法は、ｐＨ５．０、４．８、４．６、４．４、４．２、４．０、３．８、３．６、３．４、３．２および３．０の溶液を得るように、０．１Ｍクエン酸、即ちｐＨ５バッファを０．１Ｍクエン酸、即ちｐＨ３バッファと混合するようプログラムされる。次のステップに移動する前に、各ｐＨステップを３ＣＶについて保持する。カラムを３ＣＶについてその後０．１Ｍの水酸化ナトリウムを用いて洗浄し、５ＣＶについて０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５で再平衡化する。０．８ｍＬ／分（６分の滞留時間）の流量を有していたタンパク質ローディングステップを除いてすべてのステップに対し流量は１．６ｍＬ／分（３分の滞留時間）である。この方法の溶離部分の間画分をＣＶ毎に集める。これらの画分を前述の分析アッセイを用いて特徴付ける。

ｍＡｂ−３を用いた小ｐＨステップ溶離結果を図６に示す。純度と収率のレベルは溶離ピークのどの画分をプールのために選択するかに依存する。いくつかの状況が表６に示される。高純度画分のみをプールすることにより、より高い純度レベルを達成できる一方で、これは収率に悪影響を及ぼし得る。２２〜３４ＣＶからの画分をプールしたとき、抗体のほぼ完全な回収が達成される。その結果の純度は９３％である。高純度を含む画分のみを選択することによりプールの純度を向上させることができる。９５％の純度レベルは、２６〜２９ＣＶからの画分をプールしたときに達成され、約７０％の収率が得られる。２７〜２９ＣＶからの画分をプールしたときに純度レベルは約９６％であり、収率は約５７％である。プール内の純度を、所望の画分をプールした後決定し、プール中のタンパク質の合計量と比較したプール中の単量体の合計量として算出する。全収率は、該画分をプールした後決定し、全体の溶離プロファイルから溶離画分に回収された合計量と比較したプール中の合計量として算出する。

これは一連の小さいｐＨ変化のステップは樹脂Ａからの最終生成物プールの凝集体レベルを低下させるのに有用であり得ることを示す。小さいｐＨ変化のステップを使用することにより、純度および収率を最適化するために所望のｐＨカットオフレベルを特定することができる。実施例７で上述したように、簡略化されたｐＨステップ溶離方法の開発を導くために、このアプローチを使用することができる。簡略化された方法はより少ないｐＨステップ変化を含み得、該変化は与えられた方法に対し純度および収率を最適化するために戦略的に選択される。

明細書は、明細書内に引用された参考文献（参照により援用する）の教示に照らして最も完全に理解される。明細書中の実施形態は本発明における実施形態の説明を提供するものであり、その範囲を限定するよう理解されるべきでない。当業者は多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。全ての刊行物と発明はその全体が参照により援用される。参照により援用される資料が本明細書と矛盾するか一致しない範囲において、本明細書はあらゆるそのような資料に優先する。任意の参考文献の引用は、このような文献が本発明の従来技術であることを認めるものではない。

特に断らない限り、特許請求の範囲を含む明細書で使用される、成分、細胞培養、処理条件等の量を表す全ての数は、すべての例において用語「約」によって修飾されるものとして理解すべきである。従って、それとは反対に特に断らない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明によって得ようとする所望の特性に依存して変化し得る。特に断らない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は本明細書に記載した発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。そのような等価物は以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図される。

当業者には明らかなように、本発明の多くの改変および変更はその精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は例としてのみ提供され、いかなる方法においても制限的であることを意味しない。明細書および実施例は例示としてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (15)

1. Ｆｃ含有単量体タンパク質の溶離の前にアフィニティークロマトグラフィーから少なくとも３０％のタンパク質凝集体を溶離する方法であって、
   （ａ）Ｆｃ含有単量体タンパク質およびそのタンパク質の凝集体を含む試料を提供するステップ、
   （ｂ）Ｆｃ含有タンパク質およびその凝集体がクロマトグラフィーカラム中でタンパク質Ａリガンドに結合するように、固体支持相に固定化されたタンパク質Ａリガンドを含有するクロマトグラフィーカラムを試料と接触させるステップであって、該タンパク質Ａリガンドはタンパク質ＡのＣドメインに基づくステップ、ならびに
   （ｃ）ｐＨ勾配法を使用して結合したＦｃ含有単量体タンパク質をクロマトグラフィーカラムから溶離させるステップであって、該ｐＨ勾配法はｐＨ６．０の高ｐＨバッファおよびｐＨ３．０の低ｐＨバッファを使用するステップ
   を含み、
   ステップ（ｃ）が、クロマトグラフィーカラムからのＦｃ含有単量体タンパク質の溶離の前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体の溶出をもたらす、方法。
2. Ｆｃ含有単量体タンパク質の溶離の前にアフィニティークロマトグラフィーから少なくとも３０％のタンパク質凝集体を溶離する方法であって、
   （ｄ）Ｆｃ含有単量体タンパク質およびそのタンパク質の凝集体を含む試料を提供するステップ、
   （ｅ）Ｆｃ含有タンパク質およびその凝集体がクロマトグラフィーカラム中でタンパク質Ａリガンドに結合するように、固体支持相に固定化されたタンパク質Ａリガンドを含有するクロマトグラフィーカラムを試料と接触させるステップであって、該タンパク質Ａリガンドはタンパク質ＡのＣドメインに基づくステップ、ならびに
   （ｆ）ｐＨステップ法を使用してＦここで該ｐＨステップは、ｐＨ値の高い順に連続して使用される２以上のバッファを使用するｐＨステップ法を用い、ステップ溶離法に使用されるバッファの少なくとも１つが３．６から４．４の範囲のｐＨを有するステップ
   を含み、
   ステップ（ｆ）が、クロマトグラフィーカラムからのＦｃ含有単量体タンパク質の溶離の前に少なくとも３０％のタンパク質凝集体の溶出をもたらす、方法。
3. ステップ（ｆ）が２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上の小さいｐＨ変化のステップを含み、ｐＨが５．０から３．０の範囲である、請求項２に記載の方法。
4. Ｆｃ含有タンパク質が抗体またはＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２に記載の方法。
6. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
7. Ｆｃ含有タンパク質が抗体またはＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
8. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
9. ｐＨ勾配が５カラム体積から３０カラム体積に及ぶ、請求項１に記載の方法。
10. 固体支持体が、孔制御ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレン並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
11. 固体支持体が、孔制御ガラス、シリカ、酸化ジルコニウム、酸化チタン、アガロース、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびポリスチレン並びにそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
12. タンパク質ＡリガンドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
13. タンパク質ＡリガンドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の方法。
14. 固体支持体がポリビニルアルコールまたはポリビニルエーテルである、請求項１に記載の方法。
15. 固体支持体がポリビニルアルコールまたはポリビニルエーテルである、請求項２に記載の方法。

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