JP6401712B2

JP6401712B2 - ウシ初乳酵素処理物、その製造方法、組成物および飲食品

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Publication number: JP6401712B2
Application number: JP2015552518A
Authority: JP
Inventors: 義浩宇都; 均堀; 利夫乾; 健太郎久保
Original assignee: Saisei Pharma Co Ltd
Current assignee: Saisei Pharma Co Ltd
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2018-10-10
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: AU2020201700A1; AU2020201700B2; EP3081221A4; KR20160096089A; PL3081221T3; LT3081221T; US10322147B2; EP3081221A1; KR102309707B1; AU2014362132A1; WO2015087981A1; US20160296566A1; ES2891149T3; JPWO2015087981A1; EP3081221B1

Description

本発明は、癌および感染症などの疾病の治療や予防に有用な、ウシ初乳酵素処理物を含んでなる医薬組成物およびその製造方法に関する。

マクロファージは体内の老廃物の処理や、微生物、ウイルスなどの病原体や腫瘍細胞に対する防御機能を担っている。また、Ｔ細胞への抗原の提示とインターロイキン１の産生を介し、細胞性免疫のエフェクターとしての機能も有している。したがって、癌や感染症などの治療や予防にはマクロファージを活性化させることが重要であり、マクロファージの活性化により、癌や感染症の治療や予防を行うことが可能である。

マクロファージを活性化する因子としては、例えばインターフェロンが挙げられ、その臨床応用も試みられている。また、ある種の多糖類が免疫賦活活性を有することが知られており、これらの一部は抗ウイルス剤や抗ガン剤としての開発が期待されるものである（特許文献１または２）。

ヒト血清の酵素処理物（β−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼとシアリダーゼ）がマクロファージ活性化作用を有することは、特許文献３に記載がある。

特開平０５−０９７６９５号公報特公平０６−０９９３１４号公報国際公開第２０１３／０３８９９７号

本発明は、癌および感染症などの疾病の治療、予防、改善、寛解の維持などに有用な、ウシ初乳酵素処理物、その製造方法、それを含んでなる組成物および各種製品を提供しようとするものである。

本発明者らは、鋭意検討した結果、ウシ初乳を特定の酵素、すなわち、β−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと接触させ、酵素処理すると、優れたマクロファージ活性化作用を示すことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
［１］ウシ初乳を、β−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、ウシ初乳酵素処理物の製造方法、
［２］ウシ初乳を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、上記［１］記載の製造方法、
［３］上記［１］または［２］記載の製造方法により得られる、ウシ初乳酵素処理物、
［４］１回の投与用として、０．０２μｇ〜４０ｍｇ、好ましくは０．０２μｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは０．２μｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは２μｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは２０μｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは２００μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは２００μｇ〜２ｍｇの範囲のタンパク質を含む上記［３］記載のウシ初乳酵素処理物、
［５］上記［３］または［４］記載のウシ初乳酵素処理物を含んでなる医薬組成物、
［６］抗癌用または抗感染症用である、上記［５］記載の医薬組成物、
［７］上記［３］または［４］記載のウシ初乳酵素処理物を含んでなる飲食品用組成物、
［８］上記［７］記載の飲食品用組成物を含んでなる飲食品、
に関する。

本発明の、ウシ初乳酵素処理物は、優れたマクロファージ活性化作用、特に腸管マクロファージの活性化作用を有するので、癌や感染症などの疾病の治療や予防に有用であり、抗癌剤、抗感染症剤などとして用いることができる。

また、該ウシ初乳酵素処理物を用いれば、上記疾病の予防、改善、寛解の維持などに有用な医薬部外品、並びに、飲食品用組成物および飲食品を提供することができる。

さらに、本発明に係るウシ初乳酵素処理物は、ウシ初乳をβ−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼで処理することによって調製できるため、簡便かつ低コストであるという利点を有する。

ギムザ染色したマクロファージの様子を示す図面代用写真である。各検体の、０．５％オプソニン化ＳＲＢＣを用いたマクロファージ貪食能活性についての結果を示すグラフである。電気泳動の結果を示す図面代用写真である。

＜ウシ初乳＞
本発明で使用するウシ初乳とは、子牛の分娩後、母牛が１０日目までに分泌する乳汁をいい、好ましくは７日目まで、より好ましくは５日目までに分泌する乳汁である。本発明において、ウシ初乳は、ホルスタイン種、黒毛和種などのウシの種類にかかわらず、いずれの種のものをも使用することができる。

＜酵素＞
本発明で使用するβ−ガラクトシダーゼは、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの、ウシ肝臓（bovine liver）由来のものなどがあげられる。市販されたものとしては、例えば、和光純薬工業（株）のカタログＮｏ．０７２−０４１４１、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社のＧ１８７５などが挙げられる。
本発明において、β−ガラクトシダーゼは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明で使用するシアリダーゼは、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringenes）由来のもの、レンサ球菌（Streptococcus 6646K）由来のもの、コレラ菌（Vibrio cholerae）由来のもの、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のものなどがあげられる。市販されたものとしては、例えば、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Sigma Prod. Nos.）Ｎ２８７６、Ｎ２１３３、Ｎ２９０４、Ｎ３００１、Ｎ５６３１、生化学バイオビジネス社のコード番号（Code Number）１２００５２、ＢｉｏＬａｂｓ社のカタログ番号（Catalog#）Ｐ０７２０Ｌ、Ｐ０７２０Ｓなどがあげられる。
本発明において、シアリダーゼは、単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

＜酵素処理＞
本発明において、ウシ初乳と、β−ガラクトシダーゼ若しくはシアリダーゼとの接触（酵素処理）は、それぞれ、十分な量の酵素を用いて十分な時間接触させることにより、それ以上実質的に酵素反応が進行しない程度まで行うのが好ましい。このような目的には、酵素の種類にもよるが、例えば、β−ガラクトシダーゼとして和光純薬工業（株）のカタログＮｏ．０７２−０４１４１を用いる場合、ウシ初乳１００μｌに対して、酵素を６５ｍＵ使用すれば十分である。また、例えば、シアリダーゼとしてＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Ｎ２８７６）を用いる場合、ウシ初乳１００μｌに対して、酵素を６５ｍＵ使用すれば十分である。この場合の酵素処理の時間としては、３時間行えば十分である。

酵素処理は、任意の容器中で、これら酵素を、ウシ初乳に添加して実施することができるが、所望により、ウシ初乳中の総タンパク質濃度を調整するために、この分野で通常用いられる緩衝液を加えてもよい。そのような緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＳＰＢ）、リンゲル液などが挙げられる。
酵素処理の温度は、酵素が活性を示す温度であれば特に限定はないが、通常酵素が高い活性を示す３７℃付近の温度である。

酵素処理は、加熱（熱処理）により、酵素を失活させることにより終了する。かかる熱処理は、酵素を失活させることができる限り特に限定されないが、例えば、６０℃付近の温度で、約１０分間加熱することにより、実施することができる。
熱処理後の検体は、所望により、濃縮してもよい。当該濃縮は、市販の機器、例えば遠心濃縮器（例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製の１００００ＭＷＣＯＹＭ−１０）を用いて行うことができる。

また、酵素処理は、固相に固定した酵素（固定化酵素）を用いて行うこともできる。酵素を固相に固定させる方法は、当業者に知られており、例えば、β−ガラクトシダーゼおよび／またはシアリダーゼを、シアンブロマイドの如きカップリング剤により、アガロースビーズに固定することができる。そのような固定化酵素としては、例えば、イモビライズド β−ガラクトシダーゼＧ３Ｍ（ＭｏＢｉＴｅｃ社、＃Ａ３１０２）、ノイラミニダーゼアガロースＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ウェルシュ菌）由来（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、製品番号（Product Number)：Ｎ５２５４）などが市販されている。固定化酵素を用いる利点は、酵素処理後、酵素を熱処理により失活させることなく回収することが可能なこと、および、そのような回収により夾雑物（熱処理により失活した酵素などのタンパク質等）の存在を減じることができることである。

＜ウシ初乳酵素処理物＞
こうして得られる本発明のウシ初乳酵素処理物は、さらに、凍結乾燥して、固体ないし粉体状としてもよい。このようなウシ初乳酵素処理物は、癌や感染症などの疾病の治療、予防、改善、寛解の維持などに有用な、新規組成物である。

＜医薬組成物、医薬品＞
本発明のウシ初乳酵素処理物は、そのまま、もしくは、適宜、薬学的に許容しうる補助剤（担体）を配合することにより、医薬組成物として調製することができる。このような薬学的に許容し得る補助剤としては、この分野で通常用いられるものをいずれも好適に使用することができ、具体例としては、例えば、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤等が挙げられる。これら補助剤は、医薬組成物の剤型に応じて、適宜配合される。

本発明の医薬組成物は、適当な剤型に製剤化して、医薬品とすることができる。そのような剤型としては特に制限されず、経口製剤であっても非経口製剤であってもよい。非経口製剤としては、注射剤、輸液剤、点鼻剤、点耳剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。例えば、注射剤としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などの投与形態のものが挙げられ、このうち、筋肉内注射が好ましい。一方、経口製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤（舌下錠などを含む）、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、内用液剤（懸濁剤、乳剤、シロップ剤などを含む）、吸入剤などが挙げられる。

本発明のウシ初乳酵素処理物の投与量は、投与対象の年齢、性別、体重および症状、投与方法などにより異なるが、典型的な例としては、例えば、本ウシ初乳酵素処理物に含まれるタンパク質の総量として、１回の投与あたり、体重１ｋｇあたり、約０．０２μｇ以上、好ましくは約０．２μｇ以上、より好ましくは約２μｇ以上、より好ましくは約２０μｇ以上、より好ましくは約２００μｇ以上であり、かつ、約４０ｍｇ以下、好ましくは約２０ｍｇ以下、より好ましくは約１３ｍｇ以下、より好ましくは約１０ｍｇ以下、より好ましくは２ｍｇ以下である。好ましい投与量の範囲としては、例えば、約０．０２μｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは約０．０２μｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．２μｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは約２μｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは約２０μｇ〜約２０ｍｇ、より好ましくは約２００μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約２００μｇ〜約２ｍｇである。他の好ましい範囲としては、約１ｍｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは約２ｍｇ〜約２０ｍｇ、さらに好ましくは約３ｍｇ〜約１３ｍｇの範囲にあるのがよい。なお、本明細書において、タンパク質の量は、波長５７０ｎｍでの吸光度により決定したタンパク質濃度をもとに、算定するものである。

本発明の医薬組成物を、上記の如き１回あたりの投与量で投与する場合の、典型的な投与間隔および投与回数としては、１〜２回／日である。なお、投与量および投与間隔は、医薬組成物中に含まれるタンパク質の総量を指標として、投与されるタンパク質の総量が同等となるような範囲内で、適宜変更することができる。

本発明の医薬組成物は、マクロファージ活性化作用を有する。したがって、本発明の医薬組成物は、これら作用によって治療または予防しうる疾病の治療剤または予防剤として使用することができる。このような疾病としては、癌や感染症があげられる。

癌としては、癌腫（carcinoma）、肉腫（sarcoma）、その他の悪性腫瘍（malignant tumor）のいずれをも含むものであり、例えば、皮膚癌、気管支癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、舌癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵臓癌、腎臓癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、ウィルムス腫瘍、悪性黒色腫、髄膜腫、神経芽腫、骨肉腫、カポジ肉腫、リンパ腫、白血病などが挙げられる。なお、本明細書において、用語「癌」は、これら悪性腫瘍の他、その転移をも含むものである。

また、感染症としては、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症などが挙げられ、具体的には、ＨＩＶ感染症、エイズの他、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、肺炎、結核、ＥＢウイルス感染症などが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、他の抗癌剤や抗感染症剤とともに併用することができる。併用する場合には、当該他の薬剤の効能、効果、投与量を考慮の上、本発明の医薬組成物の投与量を適宜調節する。

＜医薬部外品＞
本発明のウシ初乳酵素処理物は、上記の如き医薬品としてだけでなく、医薬部外品として調製することもできる。当該医薬部外品には、必要に応じて、上記補助剤等を配合することができる。また、医薬部外品は、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ベースト状、ゼリー状等の種々の形態をとり得るものであり、必要に応じ、所望の形状に成形することもできる。医薬部外品として使用する場合のウシ初乳酵素処理物の使用量は、特に限定されるものではないが、上記医薬品の場合の投与量を参考にして、適宜、設定することができる。

＜飲食品用組成物、飲食品＞
本発明のウシ初乳酵素処理物は、必要に応じて、上記補助剤や、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの飲食品に通常用いられる各種添加剤を適宜配合することにより飲食品用組成物とすることができ、さらには、該飲食品用組成物をさらに加工して、これを含んでなる飲食品とすることができる。該飲食品用組成物または飲食品は、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ベースト状、ゼリー状等の種々の形態をとり得るものであり、必要に応じ、所望の形状に成形することもできる。また、該飲食品は、パン、麺、菓子、飲料、スープ、加工食品など様々な形態をとることができる。飲食品用組成物および飲食品の調製はいずれも常法にのっとり実施することができる。

本発明のウシ初乳酵素処理物は、上記の如き疾病に効果を奏するものであるので、本発明の飲食品用組成物や飲食品は、このような疾病の予防、改善、寛解の維持などに効果を発揮し得る。この場合において、本発明の飲食品用組成物または飲食品におけるウシ初乳酵素処理物の使用量は、特に限定されるものではないが、上記医薬品の場合の投与量を参考にして、適宜、設定することができる。ウシ初乳酵素処理物の使用量の好ましい具体例としては、例えば、１回の飲食あたり、体重１ｋｇあたり、約１ｍｇ〜約４０ｍｇ、好ましくは約２ｍｇ〜約２０ｍｇ、さらに好ましくは約３ｍｇ〜約１３ｍｇの範囲である。

かかる本発明の飲食品は、いわゆる健康食品、健康飲料、特定保健用食品、機能性食品、栄養補助食品（サプリメント）であったり、その他人以外の動物に対する飼料であり得る。

このような本発明の医薬品、医薬部外品、および飲食品は、活性成分であるウシ初乳酵素処理物を、消化管内、好ましくは口腔内または腸管内から吸収させる形態（例えば、上述の舌下錠や腸溶剤の形態）であることが好ましい。口腔内または腸管内のマクロファージを直接活性化する効果が期待できるからである。特に、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ：ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｙｍｐｈｏｉｄｔｉｓｓｕｅ）には、そのパイエル板に、体内最大と言われる豊富な数のマクロファージが存在することが知られている。

実施例にもとづいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

１．ウシ初乳酵素処理物の調製（１）
固体のウシ初乳（ＮｏｗＦｏｏｄｓの「ＣｏｌｏｓｔｒｕｍＰｏｗｄｅｒ」）１ｍｇを、１ｍｌの１×ＰＢＳで溶解し、その初乳液１００μｌにβ−ガラクトシダーゼ（和光純薬工業（株）製、カタログＮｏ．０７２−０４１４１，１０ｍＵ／μｌ）６．５μｌ、シアリダーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製，Ｎ２８７６，１０ｍＵ／μｌ）６．５μｌ、および１００ｍＭＳＰＢ（１５．６０１ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏおよび３５．８１４ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏを、５００ｍｌの蒸留水に溶解して、２００ｍＭＳＰＢ（ｐＨ７．０）を調製し、これを希釈して、１００ｍＭＳＰＢとした。）８７μｌを加え、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１００ｍＭＳＰＢをさらに２００μｌ加え、６０℃で１０分間、熱処理した。熱処理後、マイクロコン（１００００ＭＷＣＯＹＭ−１０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）で濃縮し、タンパク質濃度を、波長５７０ｎｍでの吸光度測定により決定したところ（ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ、ＳＩＧＭＡ，Ａ４５０３）について作成した検量線を使用）、１．０８μｇ／μｌであった（検体１）。

かかる検体１を、１００ｍＭＳＰＢを用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、１ｎｇ／１０μｌ（検体１−１）、１０ｎｇ／１０μｌ（検体１−２）、１００ｎｇ／１０μｌ（検体１−３）である各検体を調製した。

一方、酵素処理する前の初乳について、タンパク質濃度を同様に決定したところ、１４．４１μｇ／μｌであった（比較検体１）。該比較検体１を、１００ｍＭＳＰＢを用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、１ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−１）、１０ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−２）、１００ｎｇ／１０μｌ（比較検体１−３）である各検体を調製した。

２．マクロファージ貪食能活性（１）
マウス（８週齢、ＩＣＲ系雌性、日本エスエルシー（株））を頸椎脱臼し、腹部の外皮を剥ぎ、内臓を傷つけないようにして、腹腔にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．９％のＮａＣｌおよび５単位／ｍｌのヘパリンを含有する）を１０ｍｌを注入した。腹部を１分程度タッピングした後、腹腔液を回収し、腹膜細胞を収集した。回収した腹腔液を遠心（１５００ｒｐｍ，４℃，１５分）した後、上清を破棄しＲＰＭＩ培地を加え、ピペッティングした。Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算盤で細胞数を計測し、１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、さらにＲＰＭＩ培地を加えて調整した。なお、ＲＰＭＩ培地は以下の操作にて調製した。すなわち、クリーンベンチ内で、粉末培地（ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：８５６８４６）を精製水９００ｍｌに溶解した後、さらに２ｇのＮａＨＣＯ₃を溶解した。混合物を、１ＮＨＣｌでｐＨ７．２に調整した後、精製水を用いて全量を１０００ｍｌとした。こうして得た溶液をフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＳＬＧＶＪ１３ＳＬ）にて濾過したものをＲＰＭＩ培地とし、使用時まで、４℃で保管した。

滅菌したカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，ｍｉｃｒｏｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ，Ｎｏ．１）をウェル毎に３枚ずつ入れた２４穴プレート（ＴＰＰ，９２０２４）に、上記で得たマクロファージ溶液を、５００μｌ／ｗｅｌｌ（５．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）分注し、各ウェルにさらにＲＰＭＩ培地５００μｌ／ｗｅｌｌを加え、全体として１ｍｌ／ｗｅｌｌになるようにした。かかるプレートを、３７℃で、１時間インキュベーションした後、各ウェル内の液を破棄し、ＲＰＭＩ培地１ｍｌで、各ウェルを２回洗浄した。洗浄後、さらにＲＰＭＩ培地１ｍｌを各ウェルに加え、３７℃で、１５時間インキュベートした。

インキュベート後、各ウェルに、上記で調製した検体１−１〜１−３、および、比較検体１−１〜１−３を、それぞれ１０μｌ加えた。３７℃で、３時間インキュベートして、マクロファージを刺激した。インキュベート後、各ウェルの溶液部分を破棄し、０．５％オプソニン化ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球，（株）日本生物材料センター）１ｍｌを加え、３７℃で、９０分間インキュベートし、マクロファージに貪食させた。貪食後、順次１／５×ＰＢＳ，１×ＰＢＳ，１×ＰＢＳを用いて、カバーガラスを洗浄し、約３０分間風乾した。風乾後、各カバーガラスを、メタノール（関東化学（株），２５１８３−２Ｂ）に１分程度浸し、メタノール固定した。該固定後、再び約３０分間風乾し、ＰＢＳで２０倍希釈したギムザ液（ＳＩＧＭＡ，Ａ１３２７）で、１時間染色した。染色後、水道水でカバーガラスの裏側から洗浄し、一晩風乾した。

風乾後、スライドガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ，ｍｉｃｒｏｓｌｉｄｅｇｌａｓｓ，Ｓ２２１５）にカバーガラスを裏返して貼り付けた。光学顕微鏡（ＮｉｋｏｎＥＣＬＩＰＳＥＥ２００）にてカバーガラス１枚につき９点写真を撮り、観察される全マクロファージ数、貪食されたＳＲＢＣ数、貪食したマクロファージ数をカウントし、９点分の計測値を合計し、計測された全マクロファージのうちＳＲＢＣを貪食したマクロファージの割合に、１つのマクロファージの平均貪食数を掛けたものを摂食指数（ingestion index）として算出した。なお、参考までに、図１に、「貪食しているマクロファージ」および「貪食されているＳＲＢＣ」の様子を表す、ギムザ染色後の写真を示す。ギムザ染色によってマクロファージは紫色の球体として、ＳＲＢＣは透明の球体として観察されている。マクロファージに接触しているＳＲＢＣを貪食されたＳＲＢＣ、ＳＲＢＣに接触しているマクロファージを貪食したマクロファージとして、摂食指数を算出した。

各検体について、それぞれのカバーガラスごとに、２ないし３の摂食指数を算出し、その平均値を求めた。コントロールとして、検体若しくは比較検体の代わりにＲＰＭＩ培地を用いて、上記と同様の操作を行った。なお、２つの摂食指数を求めたのは比較検体１−１および同１−２であり、残りについては３つの摂食指数を算出した。

結果を表１（オプソニン化ＳＲＢＣを用いた、マウス腹腔マクロファージ貪食能活性）および図２に示す。

３．腸管マクロファージの貪食能活性
（各サンプルの調製）

ＬＰＳサンプルは、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ, ｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（ＳＩＧＭＡ社製、Ｌ２７５５）を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１００μｇ／ｍｌに希釈して調製した。該ＬＰＳサンプルは、文献（ＳｅｍｉｎａｒｓＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３１（２），１７８−８４，２００９）に記載のとおり腸管マクロファージを活性化するものである。

血清サンプルは、未処理ヒト血清を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１００μｇ／ｍｌに希釈して調製した。

ヒト血清酵素処理物サンプルは、特許文献３（国際公開第２０１３／０３８９９７号）の方法に従って、ヒト血清を上記ウシ初乳についての方法と同様の方法で処理して得たヒト血清酵素処理物を、１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１００μｇ／ｍｌに希釈して調製した。

初乳サンプルは、未処理ウシ初乳を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１００μｇ／ｍｌに希釈して調製した。

ウシ初乳酵素処理物サンプルは、ウシ初乳酵素処理物を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１００μｇ／ｍｌに希釈して調製した。

（培地の調製）
ＲＰＭＩ培地１７ｍｌに、コラゲナーゼＤ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＤ）（Ｒｏｃｈｅ，１１０８８８５８００１）２ｍｌとディーエヌエースＩ（ＤＮａｓｅＩ）（Ｒｏｃｈｅ，１１２８４９３２００１）１ｍｌを溶かし、３７℃に温め、コラゲナーゼ培地（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｍｅｄｉｕｍ）を調製した。

（貪食能活性の測定）
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（７週齢）に２０ｍｇ／ｍｌの抱水クロラール（ｓｉｇｍａ、Ａ２３７４）４００μｌを腹腔投与し、麻酔をかけた。マウスの右腹部を切り裂き、腸を露出させ各サンプル（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した後、腹部を閉じた。投与１時間後、再度腹部を切り裂いて腸を露出させ、非標識ＯＶＡプロテイン（ＳＩＧＭＡ，Ａ５５０３−１Ｇ）およびＡＦ４８８標識ＯＶＡプロテイン（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏ３４７８１）を投与し、腹部を閉じた。投与１時間後、マウスを頸椎脱臼させ、腸を取り出した。取り出した腸を傷つけないようにして脂肪およびパイエル板を除去し、ＰＢＳで洗浄した。腸を２ｃｍ程度に切断して、３７℃に温めたＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、０．９％のＮａＣｌおよび５単位／ｍｌのヘパリンを含有する）４１．９８ｍｌに、ＦＢＳ（非動化済み）（ＧＩＢＣＯ社製、１０４３７）５ｍｌと、ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製、１５１１１−４５、５００ｍＭ）１ｍｌと、ＨＥＰＥＳ（ＭＰ社製、１６８８４４９、１Ｍ）１ｍｌと、ピルビン酸ナトリウム（ＧＩＭＣＯ社製、１１３６０−０７０、１００ｍＭ）５００μｌと、硫酸ポリネキシンＢ（ＧＩＭＣＯ社製、２１８５０−０２９、２５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌと、ペニシリン・ストレプトマイシン（ＧＩＭＣＯ社製、１５１４０−１２２、１０，０００Ｕ／ｍｌ）５００μｌ）５０ｍｌに入れ、３７℃のインキュベーター中にて、スターラーで、２０分間攪拌した（２５０ｒｐｍ程度）。

攪拌後、腸を取り出し、ＰＢＳ３０ｍｌで３回洗浄した。１０％ＦＢＳ・ＲＰＭＩ培地を入れた直径１０ｃｍの皿に、腸を移した。コラゲナーゼ培地４ｍｌを入れ、腸を切断した。コラゲナーゼ培地１１ｍｌを追加し、静置した。浮いてきた泡や脂肪をアスピレーターで除去した。バイアル中の組織片をフラスコに移し、コラゲナーゼ培地５ｍｌでバイアルを洗浄し、洗浄液をフラスコに移した。フラスコを、３７℃のインキュベーターに入れ、内容物を、１時間攪拌した。攪拌後、フラスコに、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０、ＰＢＳで作製）４００μｌ加え、さらに５分間攪拌した。攪拌後、セルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ、３５２３６０）を乗せたチューブに上清を移した。一方、組織片に、３７℃に温めたＦＡＣＳ緩衝液１０ｍｌを加え、懸濁した。懸濁液全体をセルストレーナーに通し、上に残ったデブリス（debris）を絞り切った。濾過液を、２０℃、１８００ｒｐｍで、１０分間遠心分離にかけた。遠心後、上清を取り除き、細胞を分散させた。細胞を４０％パーコール（percoll）１０ｍｌで懸濁し、懸濁液をチューブに移し、キャピラリーを用いて７５％パーコール５ｍｌを下部に入れ、２０℃、２０００ｒｐｍで、チューブを２０分間遠心分離にかけた。遠心後、チューブの上部から４０％パーコールをアスピレーターで７ｍｌ程度除去した。除去後、６ｍｌ程度を、ＦＡＣＳ緩衝液５ｍｌの入ったチューブに加え、更にＦＡＣＳ緩衝液を全量が１４ｍｌになるよう加え、２０℃、１８００ｒｐｍで、チューブを１０分間遠心分離にかけた。遠心後、上清を除き、ＦＡＣＳ緩衝液２ｍｌを入れて懸濁し、１ｍｌを別のチューブに移した。チューブを、２０℃、１５００ｒｐｍで、３分間遠心分離にかけた。

遠心後、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液２ｍｌを加えたのち、さらにパシフィック（Ｐａｃｉｆｉｃ^TM）抗マウスＦ４／８０抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＦ４／８０Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，１２３１２４）、ＰＥ／ｃｙ７抗マウス／ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ＰＥ／ｃｙ７ａｎｒｉ−ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎＣＤ１１ｂＡｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，１０１２１６）、ＣＤ１６／３２抗体（ＣＤ１６／３２Ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ）（ＢＤ、５５３１４１）を加え、４℃で反応させた。１５分後、上清を除去し、洗浄用バッファー（ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ）２ｍｌを加え、２０℃、１５００ｒｐｍで、３分間遠心分離した。遠心後、１μｇ／ｍｌの７−アミノアクチノマイシンＤ（ｓｉｇｍａ、Ａ９４００）溶液２００μｌを加え、フローサイトメトリーで、腸管マクロファージの貪食活性を測定した。

（結果）
結果は表２のとおりである。初乳酵素処理物は、血清酵素処理物に比べ、腸管における卵白アルブミン（ＯＶＡ）陽性マクロファージの貪食能活性を、より増加させた。

４．初乳酵素処理物と血清酵素処理物における活性タンパク質（ＨＰＡ陽性）の分子量
（検体の調製）
マーカー１は、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＳｈａｒｐＰｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^TM，７４５０６５）を用いた。

血清は、未処理ヒト血清を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１ｍｇ／ｍｌに希釈して用いた。

血清酵素処理物は、上記と同様にして得たヒト血清酵素処理物を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１ｍｇ／ｍｌに希釈して用いた。

マーカー２はＷＩＤＥ−ＶＩＥＷＰｒｅｓｔａｉｎｅｄＰｒｏｔｅｉｎＳｉｚｅＭａｒｋｅｒ III（Ｗａｋｏ社製、２３０−０２４６１）を用いた。

初乳は、未処理ウシ初乳を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１ｍｇ／ｍｌに希釈して用いた。

初乳酵素処理物は、ウシ初乳酵素処理物を１００ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．０）で１ｍｇ／ｍｌに希釈して用いた。

上記各検体を蒸留水で１μｇ／μｌに調製し、各検体５μｌと、Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（９５０μｌのＬａｅｍｍｌｉＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１６１−０７３７）に５０μｌの２−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ社製、Ａ２０２９）を加える）５μｌを混合し、１００℃で１０分間熱処理し、泳動用サンプルを得た。

泳動ゲル（ＸＶＰＡＮＴＥＲＡＧＥＬ，ＤＲＣ，ＮＸＶ−３８１Ｄ２０）を泳動槽（ＥＲＩＣＡ−ＭＰ，ＤＲＣ，ＸＶＥ−０ＭＰＣ）にセットし、泳動バッファー（高速ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファー（ＤＲＣ社製、ＮＸＶ−ＢＵＦＰＴＧ）を１０００ｍｌの蒸留水で溶解して調製）で泳動槽内を満たした。セットしたゲルの各ｗｅｌｌに各泳動用サンプルをアプライし、３００Ｖで泳動した。各泳動サンプルのアプライ量は、レーン１が１０μｌ、レーン２と３が１μｌ、レーン４、５、６が５μｌであった。泳動終了後、ゲル上部を切り捨て、転写装置（ＭＩＮＩＣＡ−ＭＰ，ＤＲＣ，ＸＶＥ−０ＭＰＢ）にセットした。メタノール（関東化学（株）、２５１８３−２Ｂ）に１分間浸したＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ，１６２−０１７７）をゲル上に乗せ、４７Ｖで、１時間転写を行った。

転写後、膜をＴＢＳ−Ｔ（８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣＬおよび３．０ｇのＨ₂ＮＣ（ＣＨ₂ＯＨ）₃を、１０００ｍｌの蒸留水で溶解してｐＨ７．４に調整し、これに１ｍｌのポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＷＡＫＯ社製、１６７−１１５１５）を加えて調製）で１０分間、３回洗浄した。膜をブロッキング液（１００ｍｇのＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ、ＳＩＧＭＡ，Ａ４５０３）を１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔで溶解して調製）に浸し、１時間室温で振盪した。膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、一次抗体ＨＰＡ（１０μｌのＨＰＡレクチン（ＬｅｃｔｉｎｆｒｏｍＨｅｌｉｘＰｏｍａｔｉａｂｉｏｔｉｎｃｏｎｊｙｕｇａｔｅ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄｐｏｗｄｅｒ、ＳＩＧＭＡ社製、Ｌ６５１２）１ｍｇを１ｍｌの１００ｍＭＳＰＢ（ｐＨ７．０）で溶解）を１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔで希釈して調製）に浸し、１時間室温で振盪した。膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、二次抗体ストレプトアビジン（２μｌのストレプトアビジン（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＲＰＮ−１２３１）を１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔで希釈して調製）に浸し、１時間室温で振盪した。膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄した。

プラスチック容器内で膜とＥＣＬ液（１ｍｌの検出試薬１（ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＲＰＮ２１０６Ｖ１）に１ｍｌの検出試薬２（ＥＣＬＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、ＲＰＮ２１０６Ｖ２）を加えて調製）を１分間反応させ、Ｌｕｍｉｃｕｂｅ（リポニクス（株）、５００３）により撮影した。撮影後、膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、ＣＢＢ染色液（ＰＡＧＥＢｌｕｅ８３、コスモバイオ（株）、４２３４０６）に１０分間浸し、タンパク質のバンドを観察した（図３）。該結果から、血清酵素処理物における活性タンパク質（ＨＰＡ陽性）の分子量は７０、５５、５１、１７ｋＤａと同定されたのに対し、初乳酵素処理物における活性タンパク質（ＨＰＡ陽性）の分子量は２４５、８２ｋＤａと同定された。

５．ウシ初乳酵素処理物の調製（２）
シアリダーゼを使用しなかったこと以外は、ウシ初乳酵素処理物の調製（１）と同様に処理して、タンパク質濃度がそれぞれ、１０ｎｇ／１０μｌ（検体２−１）、１００ｎｇ／１０μｌ（検体２−２）である各検体を調製した。ポジティブコントロールとして、ＬＰＳが１μｇ／１０μｌの検体を調製した。

６．マクロファージ貪食能活性（２）
上記検体を用いて、マクロファージ貪食能活性（１）と同様にして、摂食指数を求めた。結果を表３（オプソニン化ＳＲＢＣを用いた、マウス腹腔マクロファージ貪食能活性）に示す。

本発明によれば、癌および感染症などの疾病の治療、予防、改善、寛解の維持などに有用な、ウシ初乳酵素処理物およびその製造方法を提供することができる。

１貪食しているマクロファージ
２貪食されているＳＲＢＣ
３マクロファージ

Claims

ウシ初乳を、ウシ初乳中の総タンパク質濃度を調整するに必要な量の緩衝液の存在下にβ−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、１回の投与用として、０．０２μｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲のタンパク質を含むマクロファージ活性化作用を示すウシ初乳酵素処理物の製造方法。
ウシ初乳を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、請求項１記載の製造方法。
ウシ初乳を、ウシ初乳中の総タンパク質濃度を調整するに必要な量の緩衝液の存在下にβ−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなり、１回の投与用として、０．０２μｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲のタンパク質を含むマクロファージ活性化作用を示すウシ初乳酵素処理物を含有することを特徴とする医薬組成物の製造方法。
ウシ初乳を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、請求項３記載の医薬組成物の製造方法。
抗癌用または抗感染症用である、請求項３または４に記載の医薬組成物の製造方法。
ウシ初乳を、ウシ初乳中の総タンパク質濃度を調整するに必要な量の緩衝液の存在下にβ−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなり、１回の投与用として、０．０２μｇ〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲のタンパク質を含むマクロファージ活性化作用を示すウシ初乳酵素処理物を含有することを特徴とする飲食品用組成物の製造方法。
ウシ初乳を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、請求項６記載の飲食品用組成物の製造方法。