JP6448818B2 - 乳酸菌用培養デバイス - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

「関連出願の相互参照」
本出願は、その開示が参照によってその全体が本明細書に援用される、２０１５年４月２９日出願の米国仮特許出願第６２／１５４，３１２号の優先権を主張するものである。

（背景）
多くの細菌は酸素に対して感受性があり、酸素存在下では生育しない。このような嫌気性微生物の生存能を測定することは、種々の環境において有用であり得る。例えば、嫌気性微生物が食品及び飲料加工施設及び／又は包装施設に存在するかどうかを測定することが重要であり得る。医療環境にて嫌気性微生物の存在を測定すること、例えば、診断検査で病原菌の存在を測定することもまた重要であり得る。別の例として、水処理施設では試料水を検査し、このような微生物の存在を測定している。

微生物培養に利用できる種々のデバイスが提供されている。例えば、微生物は長きにわたりペトリ皿を使用して培養されてきた。当技術分野において既知のとおり、ペトリ皿とは寒天及び栄養成分などといった微生物の生育に好適な培地を入れた浅い平底の円形皿である。しかし、寒天培地の使用には手間と時間を要することがある。例えば、寒天培地は試料の添加前に殺菌、溶解、及び冷却を必要とする。

加えて、ペトリ皿を使用した、嫌気性乳酸産生菌などといった嫌気性微生物の培養に好適な環境を得ることが困難な場合がある。嫌気性微生物は酸素存在下では繁殖しないため、このような微生物を生育させるには物理的かつ化学的に煩雑な手法が必要となることがある。典型的には、酸素透過に対する物理的障壁を付与するため、このようなデバイスを調整、すなわち成形又は構成する必要がある。

それ以外に、嫌気性培養デバイスに組み込んだ化学薬剤を使用して酸素を除去する手法が開発されている。一般に、このようなデバイスは、ゲル又は栄養培地に組み込まれた還元剤又は無菌膜片を含む。加えて、米国特許第３，３３８，７９４号は、酸素不透過性フィルム層とそのフィルム間にある栄養培地とから形成され、還元性化合物を含む嫌気性菌培養デバイスについて記載している。

しかし、これらのデバイス及びその他のデバイスは高額であり、簡単に使い捨てすることができない。また、これらのデバイスは組み立て及び／又は使用に手間がかかる場合がある。好気性環境において嫌気性微生物を培養するための簡易なデバイスの製造が試みられているが、依然として嫌気性培養デバイスの改善が必要とされている。

（概要）
広くは、本開示は試料中の微生物の検出、及び所望により計数に関する。特に、本開示は、微耐気性（microaerotolerant）微生物、微好気性微生物、又は偏性嫌気性微生物の生育及び検出に関する。現在では、この生育及び検出を、内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスを使用して実施できることが知られている。

本明細書に開示される本発明の培養デバイス及び方法は、酸素を含有する（例えば、通常の大気中酸素を含有する）環境で微生物をインキュベートする場合であっても、微耐気性微生物及び偏性嫌気性乳酸菌（ＬＡＢ）の生育、検出、及び鑑別を提供する。このデバイスでは、嫌気性微生物の培養に典型的に必要とされる、特別な培養設備及び試薬（例えば、嫌気ジャー、使い捨て嫌気菌用袋、パラジウム触媒、嫌気性グローブボックス）を不要とする点で有利である。加えて、本方法は、個々のコロニーから産生される二酸化炭素ガスの検出を可能にし、純粋培養の単離に要する追加的なインキュベート（incubation）時間と、ガス産生を検出するための発酵管の使用とを不要にすることにより、細菌の鑑別を提供する。更に本開示は、試料中の微耐気性又は偏性嫌気性乳酸菌の計数に関する。微耐気性及び偏性嫌気性微生物は、生育及び増殖時に低酸素環境を要するという共通の性質を有する。

本開示のデバイスの更なる利点は、緩衝能である。この緩衝能により、食品試料のｐＨを調整する必要、及び／又はデバイスの培養培地を長時間にわたって至適ｐＨに維持する必要がなくなる。

一態様では、本開示は、微生物コロニーを計数するための培養デバイスを提供する。デバイスは、反対面となる内側表面及び外側表面を有するベース材と、反対面となる内側表面及び外側表面を有するカバーシートと、並びにベース材とカバーシートとの間に配置された非多孔性スペーサー部材と、を含み得る。スペーサー部材は、生育区画の形状及び深さを画定する開口部を含む。スペーサー部材及び生育区画は、ベース材の内側表面とカバーシートの内側表面との間に配置される。デバイスは、生育区画に配置された、第１の有効量の乾燥状態の脱酸素剤、生育区画が所定量の脱イオン水で水和されたときに６．３５以下のｐＨを有する水性混合物を形成する、生育区画内に配置された乾燥状態の緩衝系、並びに第２の有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤、を更に含み得る。ゲル化剤を、生育区画においてベース材又はカバーシートに付着し得る。

上記の実施形態のうち任意のものでは、脱酸素剤は、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成され得る。上記の実施形態のうち任意のものでは、二酸化炭素発生剤は本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成され得る。上記の実施形態のうち任意のものでは、培養デバイスは、生育区画に配置された栄養成分、指示薬、選択剤、又は還元剤を更に含み得る。上記の実施形態のうち任意のものでは、生育区画に存在する場合、栄養成分、指示薬、選択剤、又は還元剤は、ベース材又はカバーシートに付着させることができる。上記の実施形態のうち任意のものでは、脱酸素剤は、二価鉄イオン若しくはその塩、又はアスコルビン酸若しくはその塩からなる群から選択され得る。上記の実施形態のうち任意のものでは、二酸化炭素発生剤は、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムからなる群から選択され得る。

別の態様において、本開示は、試料中の乳酸菌を検出する方法を提供する。かかる方法は、上記の実施形態のいずれか一態様に記載の培養デバイスを、その内部の生育区画へのアクセスを提供するように開くことと、所定量の水性液体を生育区画に配置することと、試料を生育区画に配置することと、培養デバイスを閉じることと、培養培地において微生物にコロニーを形成させるのに十分な一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることと、並びに、微生物コロニーを検出することと、を含み得る。水性液体及び試料を生育区画に配置すること、並びに、培養デバイスを閉じることは、培養デバイスのベース材と、カバーシートと、及びスペーサーにより取り囲まれた半固体の微生物培養培地を形成することと、を含み得る。培養培地は４．０〜６．３５のｐＨを有し得る。

上記の任意の実施形態において、一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることは、好気性雰囲気下で一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることを含む。方法についての上記実施形態のいずれかにおいて、微生物コロニーを検出することは、培養デバイスにおいて光学的に検出可能な１つ以上のコロニーを計数することを更に含む。上記の方法についての実施形態のいずれかにおいて、１つ以上の微生物コロニーを計数することは、二酸化炭素産生コロニーを非二酸化炭素産生コロニーから鑑別することを更に含む。

「好ましい」及び「好ましくは」という語は、特定の状況下で特定の利益をもたらすことができる本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じ又は他の状況下で他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲内から排除することを意図するものではない。

用語「備える」及びその変化形は、これらの用語が本説明及び請求項内で現れる場合に、限定的な意味を有するものではない。

本明細書において使用するとき、「１つ（a、an）」、「その（the）」、「少なくとも１つ（at least one）」及び「１つ以上（one or more）」は、互換的に使用される。したがって、例えば、栄養成分は、「１つ又は２つ以上の」栄養成分を意味するように、解釈され得る。

「及び／又は」という用語は、列挙される要素のうちの１つ若しくはすべて、又は列挙される要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

また本明細書において、端点による数値範囲の記載は、その範囲内に含まれるすべての数が含まれる（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。

本発明の上記の概要は、本発明のそれぞれの開示される実施形態又はすべての実施を説明することを目的とするものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願を通していくつかの箇所において、例のリストによって指針が示されるが、それらの例は様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合にも、記載された列挙は、代表的な群としての役割のみを果たすものであり、排他的な列挙として解釈されるべきではない。

これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細を、添付の図面及び以下の説明文に記載する。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

本開示による培養デバイスの一実施形態の平面図である。

図１の培養デバイスの線２−２に沿った側面断面図である。

図１の培養デバイスの分解側面断面図である。

（詳細な説明）
本開示のいずれかの実施形態について詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載し又は以下の図面に図示する構成要素の構造及び配置の詳細にその用途が限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行することができる。更に、本明細書で使用される専門用語及び用語は、説明目的のためであり、制限とみなされるべきではないと理解されている。本明細書における「含む（including）」、「備える（comprising）」又は「有する（having）」、及びこれらの変形の使用は、以下に挙げる品目及びその等価物、並びに付加的な品目を包含するものである。別段の指定又は制限のない限り、用語「接続される」及び「連結される」並びにその変化形は、幅広く使用され、直接的及び間接的な接続と連結の双方を包含する。更に、「連結された」及び「結合された」とは、物理的又は機械的な連結又は結合に限定されない。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、構造上又は論理上の変更を加えることもできることを理解されたい。更に、「前」、「後」、「上」、及び「下」といった用語は、各要素の互いに対する関係を説明するためにのみ用いられるものであり、装置の特定の向きを説明すること、装置に必要とされる若しくは求められる向きを指示又は示唆すること、あるいは本明細書に記載される発明が、使用時にどのように使用、装着、表示、又は配置されるかを特定することを目的とするものでは決してない。

本開示は、一般に、試料中の微生物の検出及び所望により計数に関する。例えば、本開示は、乳酸菌（以下、「ＬＡＢ」）として総称される広範な微生物群の生育及び検出に関する。ＬＡＢは、グルコースを主に乳酸に発酵する能力（「ホモ型」乳酸菌）、あるいは主に乳酸、二酸化炭素、及びエタノールに発酵する能力（「ヘテロ型」乳酸菌）により特性評価される。現在では、ＬＡＢ微生物の生育及び検出は、内蔵型嫌気性環境生成培養デバイス及び高濃度二酸化炭素環境生成培養デバイスを使用して実施され得ることが知られている。

ある種の微生物は嫌気的に生育する。加えて、ＬＡＢなどの他の微生物は、酸素の存在下で生育し得る（すなわち、それらは「耐気性」である）。ある種の食品（例えば、ヨーグルト、チーズ、ザワークラウト）の製造には発酵代謝が用いられるものの、発酵代謝は、例えば、加工肉、ビール、及びワインにおける食品腐敗を引き起こす原因としても知られる。

現在では、乾燥状態の再水和可能な内蔵型嫌気性環境生成培養デバイス及び高濃度二酸化炭素環境生成培養デバイスを作製できることが知られている。培養デバイスは、培養デバイスの生育帯に配置され、所定量の水溶液により再水和可能である、有効量の実質的に乾燥状態の脱酸素剤を含み、脱酸素剤は再水和時に酸素を消費する反応に関与できる。更に、現在では、酸素消費反応は、嫌気性乳酸菌微生物の生育を促進するのに十分に酸素を消費し得ることが知られている。更に、上述の微生物の生育を促進するため、培養デバイスが少なくとも約８日間は酸素還元環境を維持できる好気性環境下に培養デバイスが保持されることができる。

本明細書で開示される、乾燥状態の再水和可能な培養デバイスは、当該技術分野において数多くの利点を提供する。例えば、嫌気性微生物を計数及び同定する殆どの手法は、使用前にオートクレーブ処理されている液体培養培地（例えば、ブロス又は寒天）の使用を伴う。滅菌時の高温により、液体培地に含まれる酸素の殆どは放出される傾向がある。滅菌、撹拌及び／又は大気への暴露後に、培地には酸素が再導入され得る。一方、本開示のデバイスは、嫌気性微生物又は微好気性微生物を培養するにあたって望ましい嫌気性環境を生成する原料を含有する。

対象となる細菌種を、例えば、血液、唾液、接眼レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿汁、汗、浸出液、尿、粘液、粘膜組織（例えば、頬、歯肉、鼻、眼球、気管、気管支、胃腸、直腸、尿道、尿管、膣、子宮頸管（cervical）、及び子宮粘膜）、母乳、又は糞便等の生体液のような任意の源に由来することができる検査試料において分析することができる。更に、検査試料は、例えば、傷、皮膚、前鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前鼻前庭、頭皮、爪、外耳、中耳、口、直腸、膣、腋窩、会陰、肛門、又は他の同様の身体部位に由来するものであってよい。

生体液に加えて、他の検査試料には、他の液体並びに液体媒体中に溶解又は懸濁した固体が含まれてもよい。対象となる試料としては、プロセス流、水、食品、食材、飲料、土壌、植物又はその他の植生、空気、及び表面（例えば、製造工場、病院、診療所、又は家庭内の壁、床、設備、器具）などが挙げられ得る。

本開示のデバイス及び方法において検出及び計数され得る乳酸菌属の非限定例としては、ラクトバシラス目に含まれる属が挙げられる。これらの属としては、例えば、ラクトバシラス、ロイコノストック、ペディオコッカス、ラクトコッカス、及びストレプトコッカスが挙げられる。本開示のデバイス及び方法において検出及び計数され得るその他のＬＡＢ属としては、例えば、カルノバクテリウム、エンテロコッカス、オエノコッカス、テトラジェノコッカス、バゴコッカス（Vagococcus）、及びワイセラが挙げられる。

一態様では、本開示は、乳酸菌（ＬＡＢ）を培養及び検出するための培養デバイスを提供する。図１〜３に関して、本開示の培養デバイス１００は、耐水性のベース材１０、耐水性のカバーシート２０、及びベース材１０とカバーシート２０との間に配置されるスペーサー部材３０を含む。ベース材１０は、内側表面１０ｂ及び内側表面の反対面となる外側表面１０ａを有する。カバーシート２０は、内側表面２０ｂ及び内側表面の反対面となる外側表面２０ａを有する。任意の実施形態において、ベース材１０の内側表面１０ｂは、カバーシート２０の内側表面２０ｂと向かい合わせの関係となるよう配置される。

ベース材１０は、好ましくは、水を吸収しない又は水による悪影響を受けない材料（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン）製の比較的剛性の耐水性フィルムである。ベース材１０は、実質的に気体状酸素を透過しない材料を使用して作製されることが好ましい。ベース材１０の好適な材料の非限定的例は、少なくとも厚さ約１５μｍ〜少なくとも約１８０μｍのポリエステルフィルム、少なくとも厚さ約１００μｍ〜少なくとも約２００μｍのポリプロピレンフィルム、及び、少なくとも厚さ約３００μｍ〜約３８０μｍのポリスチレンフィルムが挙げられる。その他の好適なベース材としては、エチレンビニルアルコール共重合フィルム、ポリビニルアルコールフィルム、及びポリ塩化ビニリデンフィルムが挙げられる。ベース材１０は、ベース材を通してコロニーを観察することが望ましい場合には透明とすることができる。

カバーシート２０は、ベース材１０の内側表面１０ｂを覆い、生育区画６０の範囲を限定し、所望により輸送、保管、インキュベート、及び／又はコロニー計数中に生育区画を観察するために使用される。カバーシート２０は、好ましくは、水を吸収しない又は水による悪影響を受けない材料（例えば、ポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン）製の比較的剛性の耐水性フィルムである。カバーシート２０は、培養デバイス１０を開口しなくても容易にコロニーを計数するために透明であることが好ましく、微生物及び水蒸気を実質的に浸透させないことが好ましい。

概して、カバーシートは、ベース材１０の作製に使用される材料から作製することができる。カバーシート２０は、実質的に気体状酸素を透過しない材料を使用して作製されることが好ましい。ベース材１０の好適な材料の非限定的例は、少なくとも厚さ約１５μｍ〜少なくとも約１８０μｍのポリエステルフィルム、少なくとも厚さ約１００μｍ〜少なくとも約２００μｍのポリプロピレンフィルム、及び、少なくとも厚さ約３００μｍ〜約３８０μｍのポリスチレンフィルムが挙げられる。その他の好適なベース材としては、エチレンビニルアルコール共重合フィルム、ポリビニルアルコールフィルム、及びポリ塩化ビニリデンフィルムが挙げられる。図１に示すように、カバーシート２０は、ベース材１０及びカバーシート２０のそれぞれの内側表面の片端部に沿ってヒンジ様式で（例えば、両面接着テープを使用して）接着してヒンジ領域７０を形成し得る。所望により、任意の実施形態において、カバーシート２０は、ベース材１０を越えて延びるタブ領域７５を含み得る。タブ領域７５は、生育区画６０に試料を接種するためにデバイス１００を開けるときに都合よくつかむことができるものである。

当業者であれば、所定の種類のポリマーフィルムを通る酸素ガスの透過性を、ポリマーフィルムの厚さを増加させることにより低減させ得ることが理解されよう。任意の実施形態において、本開示のベース材及びカバーシートは、気体状酸素を実質的に透過しない好適な厚さを有するポリマーフィルムである。

スペーサー部材３０は、開口部３６を含む。開口部３６は、培養デバイス１００の生育区画６０の位置と厚みの両方を画定する役目をするウェルを形成する。スペーサー部材３０は、ベース材１０及びカバーシート２０とともに生育区画６０の境界を画定する。スペーサー部材３０は、培養デバイス１００の接種中に、水性試料（図示せず）を生育区画６０内に閉じ込めるよう機能する。

図１に示すとおり、開口部３６は、円形状を画定する。しかしながら、開口部３６は、他の形状（例えば、正方形、長方形、楕円形）を画定してもよいことが想到される。開口部３６の壁は、所定の大きさ及び形状のウェルを提供し、培養デバイス１００の生育区画６０の厚みを画定する。

スペーサー部材３０は、生育区画６０の大きさ及び培養デバイスに配置される試料の大きさに応じ、所定の容量、例えば、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、５ｍＬ、又は１０ｍＬを有するウェルを形成するのに十分な厚みでなければならない。任意の実施形態において、スペーサー部材３０は、疎水性（非湿潤性）であり、微生物に対し不活性であり、所望により滅菌可能ななんらかの非多孔性材料から作製される。任意の実施形態において、スペーサー部材３０を、（例えば、感圧接着剤を介して）ベース材１０又はカバーシート２０に直接結合することができる。付加的に又は代替的に、スペーサー部材３０を、（例えば、接着テープ５０により）ベース材又はカバーシートに間接的に結合することができる（例えば、ベース材又はカバーシート上に各々コーティングされる第１又は第２のドライコーティングにスペーサー部材を結合できる）。

生育区画６０は、培養デバイス１００内の、ベース材１０とカバーシート２０との間の任意のアクセス可能な位置に存在し得る。好ましくは、生育区画６０は、デバイス１００の周辺端部８０から離れた位置にあることが好ましい。

好ましくは、スペーサー部材３０は、微生物の生育を実質的に阻害せず、スペーサー部材に接触しているヒドロゲルから水又は肉眼で観察可能な二酸化炭素の気泡を実質的に吸収しない、非多孔性材料（例えば、金属、ガラス、ポリマー樹脂）から構成される。スペーサー部材３０を作製することのできる好適な材料の非限定例としては、例えば、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、及びポリプロピレンなど）、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリメチルメタクリレート、フッ化ポリビニリデン又は他のポリマーフィルムが挙げられる。

本開示のデバイスは、生育区画に配置された乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤を含む。好ましくは、ゲル化剤は、デバイス１００のベース材１０及び／又はカバーシート２０に対し直接的に又は間接的に付着される。任意の実施形態において、ゲル化剤は、デバイス１００の生育区画６０において、ベース材１０の内側表面１０ｂ及び／又はカバーシート２０の内側表面２０ｂに対し均一に分配され得る。

第１のドライコーティング２４に使用するのに好適なゲル化剤としては、冷水溶解性の天然及び合成ゲル化剤が挙げられる。アルギン、カルボキシメチルセルロース、タラガム、ヒドロキシエチルセルロース、グアーガム、ローカストビーンガム、キサンタンガムなどの天然ゲル化剤、並びにポリアクリルアミド、ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、及びこれらの組み合わせなどの合成ゲル化剤が概して好適である。適切なゲル化剤は、本開示並びに米国特許第４，５６５，７８３号、第５，０８９，４１３号、及び第５，２３２，８３８号の開示で教示される内容に従って選択することができる。好ましいゲル化剤としては、グアーガム、ローカストビーンガム、及びキサンタンガムが挙げられ、これらのゲル化剤は、それぞれ単独で有用であり、又は好ましくは互いの組み合わせが有用である。

したがって、任意の実施形態において、本開示のデバイス１００は、所望により、生育区画６０のベース材１０の内側表面１０ｂの少なくとも一部又は全部に付着した第１のドライコーティング１４を含み得る。存在する場合、第１のドライコーティング１４は、乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤を含み得る。所望により、第１の接着剤層１２をベース材１０に接着し、第１のドライコーティングの少なくとも一部を生育区画６０の第１の接着剤層に付着させる。

カバーシート２０は、コーティングを何ら含まなくてもよい（図示せず）。あるいは、デバイス１００が、生育区画６０において、ベース材１０の内側表面１０ｂに付着した第１のドライコーティング１４を有しない場合、カバーシート２０は、生育区画において、カバーシート２０に付着した第２のドライコーティング２４を含み得る。存在する場合、第２のドライコーティング２４は、乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤を含み得る。所望により、第２の接着剤層２２をカバーシート２０に接着し、第２のドライコーティング２４の少なくとも一部を生育区画６０において第２の接着剤層に接着する。任意の実施形態において、第２の接着剤層２２の層の一部を使用して、カバーシート２０をスペーサー部材３０の少なくとも一部に対し容易に密着させることができる。

第１及び第２のドライコーティングに関しては、冷水復元性があり、ゲル化剤の冷水ゲル化特性を実質的に妨害せず、嫌気性微生物の生育をサポートする任意の栄養成分又は栄養培地を所望によりコーティングに含むことができる。培養デバイスに使用するのに好適な具体的な栄養成分（複数可）は、デバイス内で生育させる微生物によって異なるが、当業者であれば選択は容易である。概して、このような栄養成分は冷水溶解性である。細菌の生育をサポートする好適な栄養成分は当業者に既知であり、酵母エキス、ペプトン、糖類、及び好適な塩などが挙げられるが、これらに限定されない。任意の実施形態において、第１の及び／又は第２のドライコーティングは、別の微生物又は微生物群よりも、特定の嫌気性微生物又は微生物群の生育を促進する選択剤（例えば、栄養成分、抗生物質、及びこれらの組み合わせ）を更に含み得る。当業者は、それ以外の種々の配合物が使用可能であり、それによって本発明の範囲が損なわれないことを理解されるであろう。

好ましくは、第１のドライコーティング１４が乾燥粉体及び乾燥粉体凝集体を主成分とする場合、第１のドライコーティング１４は、ベース材１０の内側表面１０ｂの少なくとも一部分上に配置される第１の接着剤層１２上に配置される。第１のドライコーティング１４は、例えば参照によりその全体が本願に援用される米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号で説明される配合プロセス、接着剤コーティングプロセス、及び液体コーティングプロセス、並びに／あるいは、ドライコーティングプロセスを使用して、ベース材１０上に、又は任意選択的な第１の接着剤層１２上に堆積させることができる。

好ましくは、第２のドライコーティング２４が乾燥粉体又は乾燥粉体凝集体を主成分とする場合、第２のコーティング２４は、カバーシート２０の内側表面２０ｂの少なくとも一部分上に配置される第２の接着剤層２２上に配置される。第２のドライコーティング２４は、例えば参照によりその全体が本願に援用される米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号で説明される配合プロセス、接着剤コーティングプロセス、及び液体コーティングプロセス、並びに／あるいは、液体コーティングプロセス及び／又はドライコーティングプロセスを使用して、カバーシート２０上に、又は任意選択的な第２の接着剤層２２上に堆積させることができる。

生育区画６０は、ベース材１０の内側表面とカバーシート２０の内側表面と（それぞれ内側表面１０ｂ及び２０ｂ）の間に配置される体積として画定され、体積は、第１のドライコーティング１４及び／又は第２のドライコーティング２４の少なくとも一部分を含む。したがって、水性液体が生育区画に分布するとき、水性液体は、存在する場合第１のドライコーティング１４の少なくとも一部、及び／又は存在する場合第２のドライコーティング２４の少なくとも一部と流体接触する。生育区画６０の厚さは、例えば、培養デバイスに堆積した水性液体（図示せず）の体積、試料（図示せず）に付随する固体（例えば、浮遊微粒子及び／若しくはメンブレンフィルタ）の有無、並びに／又は培養デバイス１０内のスペーサー部材３０に応じ変更してよい。

本開示の培養デバイスは、有効量の乾燥状態の脱酸素剤、乾燥状態の緩衝系、及び有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤を更に含み得る。脱酸素剤、緩衝系、及び二酸化炭素発生剤のそれぞれは生育区画に配置される。本明細書で使用するとき、「乾燥状態／乾燥」は、試薬が実質的に水を含まないことを意味する。「実質的に水を含まない」という表現は、試薬を周囲環境と平衡することを可能にした後、材料（例えば、粉末として、又は脱水された水性コーティングとして提供された材料）のおよその含水量を超えない含水量を有する試薬を意味する。

少なくとも１つの乾燥状態の成分（例えば、ゲル化剤）は、試料材料の、本明細書で記載の培養デバイスの生育区画への導入（例えば、接種）の前、間、又は後に水性液体で水和される。通常、試料材料及び／又は水性液体は、周囲条件（すなわち好気性気体環境）にて培養デバイスの生育区画に導入される。よって、好気的状況下で生育区画に試料が接種された後、培養デバイスの生育区画内の水性液体は、第１の溶存酸素濃度を含む。培養デバイスにおいて、脱酸素剤は、生育区画内の水性液体中の第１の溶存酸素濃度を、第１の溶存酸素濃度よりも実質的に低い第２の溶存酸素濃度へと低減させるように機能する。このように接種後の培養デバイスの生育区画内の溶存酸素濃度が低減されることで、培養デバイス中の偏性嫌気性ＬＡＢ又は微好気性ＬＡＢの生育が促進される。

いくつかの実施形態において、有効量の脱酸素剤は、培養デバイスの生育区画において、脱酸素剤を所定量の水性液体と流体接触させた後、約１２０分以内に第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度に低減させるよう選択される。いくつかの実施形態において、有効量の脱酸素剤は、培養デバイスの生育区画において、脱酸素剤を所定量の水性液体と流体接触させた後、約６０分以内に第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度に低減させるよう選択される。いくつかの実施形態において、有効量の脱酸素剤は、培養デバイスの生育区画において、脱酸素剤を所定量の水性液体と流体接触させた後、約３０分以内に第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度に低減させるよう選択される。

任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度から第２の溶存酸素濃度への低減は、周囲温度（例えば約２３℃）から約４２℃までの温度（両端の値を含む）で生じる。よって、本開示による方法の任意の実施形態において、培養デバイスの生育区画において、脱酸素剤を所定量の水性液体と流体接触させて、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度に低減させることを目的として、培養デバイスを高温（すなわち周囲温度より高い）でインキュベートする必要がない。

当業者であれば、微生物を培養するのに好適な一定時間内に本開示の培養デバイスの生育区画から除去される酸素量は、特に、培養デバイスの生育区画における脱酸素剤の量に依存すると認識されるであろう。したがって、本開示による生育区画における脱酸素剤の量を調整することにより、培養デバイスは、微好気性ＬＡＢの培養用又は偏性嫌気性ＬＡＢの培養用に構成することができる。

例えば、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）及びそれらの塩、二価鉄の塩、亜硫酸、重亜硫酸、及びメタ重亜硫酸の金属塩などといった数多くの脱酸素剤が知られている。本開示による好適な脱酸素剤は、低酸素又は嫌気性局所環境を生成するのに十分な酸素を消費し、ＬＡＢの生育を実質的に阻害せずにＬＡＢと流体連通し得る反応量及び種類の反応生成物を生成する。任意の実施形態において、脱酸素剤は、約１．５マイクロモル／１０ｃｍ^２〜約１５マイクロモル／１０ｃｍ^２の量で生育区画に配置される。

好ましくは、任意の実施形態において、脱酸素剤は、乾燥粉体の形態で提供される。より好ましくは、任意の実施形態において、脱酸素剤は、粉砕及び分級されて、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成する粒度分布を有する粒子集団を形成する乾燥粉体として提供される。有利に、デバイスに所定量の水性液体を接種し、閉じたときに、生育区画において嫌気性環境を生成し、維持する（例えば、最長約２４時間のインキュベート、最長約４８時間のインキュベート、最長約７２時間のインキュベート、最長４日間のインキュベート、最長５日間のインキュベート、最長７日間のインキュベート、少なくとも２４時間のインキュベート、少なくとも４８時間のインキュベート、少なくとも７２時間のインキュベート、少なくとも４日間のインキュベート、少なくとも５日間のインキュベート、少なくとも７日間のインキュベート）のに有効な量で、１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子として提供される脱酸素剤をベース材又はカバーシートに付着（例えば、ベース材又はカバーシート上にコーティングされた接着剤層に付着）させることができる。

カバーシート２０上に配置される任意選択的な接着剤層２２に使用される接着剤は、ベース材１０上に配置される任意選択的な接着剤層１２に使用される接着剤と同じもの又は異なるものであってよい。加えて、カバーシート２０上に配置される第２のドライコーティング２４は、ベース材１０上に配置された第１のドライコーティング１４と同一であっても異なっていてもよい。カバーシート２０上のコーティングは、ベース材と対面する表面全体を覆うことができるが、培養デバイス１００の生育区画６０のうち少なくとも一部分を画定する、内側表面２０ｂの少なくとも一部を覆うことが好ましい。

任意の実施形態において、選択剤は、デバイスのドライコーティング中に配置されてよく、又は所望により、生育区画内の接着剤層に溶解され得る。

所望により、本開示の培養デバイスは、培養デバイス中の酸素を示す手段を更に含む。好ましくは、この手段は、デバイス中に存在する酸素の量（例えば、所定の閾値量又は相対量のどちらか）を示すことができる。有利に、この手段は、脱酸素剤が、培養デバイスの生育区画において微耐気性ＬＡＢ又は偏性−嫌気性ＬＡＢの生育を促進させる濃度にまで酸素を好適に消費したか、あるいは消費したときを示し得る。培養デバイス内の酸素検出手段は、当技術分野において既知であり、例えば、酸化還元色素（例えば、メチレンブルー）及び酸素消光性蛍光色素が挙げられる。

この手段は、デバイス内部の酸素の不存在を示す発光化合物であり得る。好適な酸素指示薬は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８９，４３８号（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。本開示の培養デバイス用の指示薬として適切な発光化合物は、酸素によって消光される発光を呈する。より正確には、指示薬は、酸素濃度と反比例する放出によって、励起周波数（excitation frequency）に晒されると発光する。指示薬はコーティング、ラミネート加工、又はデバイス内の別の層若しくは別の層の一部分と押出成形されていてよい。このような層は、生育区画内に配置されてよく、所望により、１つ以上の他の酸素透過層によって生育区画と分離される。酸素を示す好適な化合物としては、オクタエチルポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、テトラベンゾポルフィリン、クロリン、又はバクテリオクロリンの金属誘導体が挙げられる。その他の好適な化合物としては、パラジウムコプロポルフィリン（ＰｄＣＰＰ）、白金及びパラジウムのオクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ、ＰｄＯＥＰ）、白金及びパラジウムのテトラフェニルポルフィリン（ＰｔＴＰＰ、ＰｄＴＰＰ）、カンファーキノン（ＣＱ）、並びにエリトロシンＢ（ＥＢ）などのキサンテン系色素が挙げられる。その他の好適な化合物としては、２，２′−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、及び４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンなどの配位子を有するルテニウム、オスミウム、及びイリジウム錯体が挙げられる。これらの好適な例としては、トリ（４，７，−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレート、トリ（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレート、及びトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）パークロレートなどが挙げられる。

本開示の培養デバイスは、生育区画に配置された有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤を含む。二酸化炭素発生剤は、生育区画において水性液体と接触させて活性化させたときに、次の溶存分子種：炭酸塩、炭酸、及び二酸化炭素の１種以上の塩の平衡を確立する。有利に、有効量の二酸化炭素発生剤は、溶存二酸化炭素濃度を、ＬＡＢの生育を促進させる濃度にまで上昇させるのに十分である。本明細書において示す実験結果は、生育区画において、水性ヒドロゲルの二酸化炭素発生剤の量と、二酸化炭素濃度の増加との間に関係があることを示す。

好ましくは、任意の実施形態において、二酸化炭素発生剤は、乾燥粉体の形態で提供される。より好ましくは、任意の実施形態において、二酸化炭素発生剤は、粉砕及び分級されて、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成する粒度分布を有する粒子集団を形成する乾燥粉体として提供される。有利に、デバイスに所定量の水性液体を接種し、閉じたときに、生育区画において高濃度ＣＯ_２環境を生成し、維持する（例えば、最長約２４時間のインキュベート、最長約４８時間のインキュベート、最長約７２時間のインキュベート、最長４日間のインキュベート、最長５日間のインキュベート、最長７日間のインキュベート、少なくとも２４時間のインキュベート、少なくとも４８時間のインキュベート、少なくとも７２時間のインキュベート、少なくとも４日間のインキュベート、少なくとも５日間のインキュベート、少なくとも７日間のインキュベート）のに有効な量で、１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子をベース材又はカバーシートに付着（例えば、ベース材又はカバーシート上にコーティングされた接着剤層に付着）させることができる。

本開示の培養デバイスは、脱イオン水で水和されたときにかかる水のｐＨを６．３５以下にする、生育区画に配置された乾燥状態の緩衝系を含む。この酸性のｐＨは、ｉ）かかる酸性環境の選択性は、試料中に存在し得るその他の微生物よりも耐酸性微生物（例えば、ＬＡＢ）を生育させるのに望ましい、及びｉｉ）酸性環境は炭素生成剤（carbon generating reagent）の平衡をシフトし、溶存ＣＯ_２の割合を高くすることができる、といういくつかの利点を提供する。これらの利点の両方が、培養デバイスにおいてＬＡＢの生育を促進する。

本開示のデバイスにおいて使用される緩衝系は、ｐＫ_ａが約７．０以下、好ましくは、約６．５以下である、任意の微生物学的に適した緩衝剤を含む。緩衝系の酸性成分及び塩基性成分は、培養デバイスにおいて、所定量の脱イオン水を緩衝系と接触させたときに、生育区画のｐＨが６．３５未満になるような比で存在する。好適な緩衝系としては、例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム、並びにコハク酸及びコハク酸ナトリウムが挙げられる。当業者であれば、所定量の水性液体（例えば、試料を含む）を生育区画内に配置し、デバイスを閉じたときに、形成される水性混合物の所望されるｐＨを達成する目的で、緩衝系の酸成分及び塩基成分の比を調整できることを認識するであろう。

本開示の培養デバイスは、所望により指示薬を含む。好適な指示薬は、ＬＡＢの検出に有用である。所望により、指示薬は、ある種のＬＡＢを他のＬＡＢ又はＬＡＢではない微生物から鑑別することができる。好適な指示薬としては、例えば、ｐＨ指示薬、酸化還元指示薬、発色性酵素基質、及び微生物の存在を検出するための蛍光性酵素基質が挙げられる。当業者であれば、ＬＡＢの検出に有用な指示薬を認識されるであろう。指示薬は、脱酸素剤を実質的に妨害するものであってはならない。任意の実施形態において、指示薬は、デバイスのドライコーティング中に配置されてよく、又は所望により生育区画内の接着剤層に溶解され得る。

本開示の培養デバイスは、所望により還元剤である。好適な還元剤は、生育培地の酸化還元電位を低減させて、これにより嫌気性ＬＡＢの生育を促進するのに有用である。好適な還元剤としては、例えば、チオグリコール酸ナトリウム、Ｌ−システイン、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

任意の実施形態において、生育区画を、水性液体量１ｍＬで水和されるように寸法設定することができる。水は、１ミリリットルあたり約０．５４マイクロモルの溶存酸素を含む。μしたがって、第１のドライコーティング及び／又は第２のドライコーティングは、好ましくは、約２２℃〜約４２℃、１２０分間で少なくとも０．５４マイクロモルの酸素を消費するのに十分な脱酸素剤を含む。より好ましくは、第１のドライコーティング及び／又は第２のドライコーティングは、好ましくは、約２２℃〜約４２℃、１２０分間で少なくとも０．５４マイクロモルの酸素を消費するのに十分な脱酸素剤を含む。

任意の実施形態において、第１のドライコーティング及び／又は第２のドライコーティングは、任意の数の他の成分、例えば、色素（例えば、ｐＨ指示薬）、架橋剤、試薬（例えば、発色性若しくは蛍光性の酵素基質などの選択的試薬若しくは指示薬）、又は上述の成分の２種以上の組み合わせを含み得る。例えば、一部の用途では、微生物の生育についての指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、酸化還元色素）を第１の及び／若しくは第２のドライコーティング中、又は第１の及び／若しくは第２のドライコーティングに付着させる接着剤中に組み込むことが望ましい。好適な色素には、微生物の生育により代謝され又は微生物の生育により反応して、コロニーを着色し又は蛍光させて可視化を容易にするものが挙げられる。このような色素として、トリフェニルテトラゾリウムクロライド、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー及び関連する色素、並びに５−ブロモ−４−クロロインドリルホスフェート二ナトリウム塩が挙げられる。その他の好適な色素としては、微生物の生育中にｐＨの変化を感知するもの、例えばニュートラルレッドが挙げられる。

一部の用途では、水性液体を用いて再溶解したときに画線接種が可能な硬さのヒドロゲルが生じるように、ドライコーティングを形成することが好ましい。画線接種可能な培地を形成させるため、ゲル化剤を含有する１種以上のドライコーティングに有効量の好適な架橋剤を組み込むことができる。好適な架橋剤は、意図される微生物の生育に実質的な影響を与えない。架橋剤の好適な種類及び量は、当業者により容易に選択される。例えば、グアーガムについては、四ホウ酸カリウム、アルミニウム塩、又はカルシウム塩などの架橋剤が好適であり、有効量、例えば、ドライコーティングの約１．０重量％未満を添加することができる。

少なくとも１つのドライコーティングは、ある種の微生物学的検査を行うために必要な試薬を所望により含み得る。例えば、抗生物質感受性検査を実施するため、抗生物質を含有させることができる。微生物を同定するため、特定の種の微生物が存在すると色が変化する鑑別試薬を含有させることができる。

任意の実施形態において、乾燥状態の緩衝系、還元剤、二酸化炭素発生剤、及び／又は指示薬は、第１又は第２の接着剤層に付着していない乾燥粉体（例えば、図２及び３の乾燥粉体４０）として生育区画に配置され得る。あるいは、乾燥状態の緩衝系、還元剤、二酸化炭素発生剤、及び／又は指示薬は、本明細書に記載のとおり、第１及び／又は第２のコーティングに含まれ得る。

本発明の培養デバイスは、種々の技術を使用して作製することができる。一般的に、デバイスは、手作業によって、あるいは、例えば本明細書並びに米国特許第４，５６５，７８３号、同第５，０８９，４１３号、及び同第５，２３２，８３８号で説明されるように、通常の実験室設備を使用して、作製することができる。

第１の接着剤層及び／又は第２の接着剤層に使用できる好適な感圧接着剤の非限定例は、モル比９０／１０の２−メチルブチルアクリレート／アクリル酸のコポリマーである。使用することができる他の好ましい感圧接着剤としては、モル比９５／５又は９４／６のイソオクチルアクリレート／アクリル酸、及びシリコーンゴムが挙げられる。水への暴露時に白化（例えば、不透明化）する接着剤はあまり好ましくないが、不透明なベース材と組み合わせて使用してもよく、又はコロニーの視認が必要とされない場合には使用することができる。高溶融性基剤上に低溶融性基剤がコーティングされた熱活性接着剤、及び／又は粘着液などの水活性接着剤も知られており、本発明で使用することができる。コロニーの視認を容易にする目的で上記のとおり指示薬を組み込むとき、概して、粉末よりも接着剤又はブロスコーティング混合物内に指示薬を組み込むことが好ましい。

第１の接着剤層又は第２の接着剤層を（例えば、ナイフコータを使用して）ベース材又はカバーシートの上面にコーティングして接着剤層を形成する。その厚みは、接着剤に付着した乾燥粉体又は乾燥凝集粉末の平均粒径未満であることが好ましい。概して、粒子を基材（例えば、本明細書に記載する第１又はカバーシート）に付着させるのに十分な接着剤をコーティングするのだが、粒子が接着剤に完全に埋没しない程度の接着剤をコーティングする。概して、厚さ約５μｍ〜約１２μｍの接着剤層が好適である。

好ましくは、第１のドライコーティング及び／又は第２のドライコーティング内にゲル化剤を含有させるとき、ゲル化剤は、所定量の、例えば１〜３ｍＬの水又は水性試料が生育区画に配置されると、好適な粘度、例えば、ブルックフィールドモデルのＬ ＶＦ粘度計を使用して２５℃にて６０ｒｐｍで測定したときに約１５００ｃｐｓ以上を有する、ヒドロゲルを形成するような量で含まれる。この粘度のヒドロゲルは、インキュベート中の培養デバイスの簡便な取り扱い及び積み重ねを可能にし、その培地に鑑別可能なコロニー形成をもたらす。例えば、０．０２５ｇ〜０．０５０ｇの粉末グアーガムを、２０．３ｃｍ^２の表面領域上に実質的に均一に広げることで、１〜３ｍＬの水性試料により溶解させたときに十分な粘性の培地がもたらされる。単位面積当たりのコーティング重量を制御するために、粉末の粒径を使用できる。例えば、１００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０５ｇ／２０．３ｃｍ^２になるようコーティングされ、４００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０２５ｇ／２０．３ｃｍ^２になるようコーティングされる。

任意の実施形態において、第１のドライコーティング又は第２のドライコーティングは、微生物の生育を促進する１種以上の栄養成分を含み得る。コーティングが粉末又は粉末凝集体から本質的に構成されるとき、ゲル化剤と、付着した粉末培地中の栄養成分との好ましい比は、デバイスで生育させる具体的な微生物により決定される。しかしながら、汎用目的では、約４：１〜約５：１（重量を基準とした合計栄養成分に対する合計ゲル化剤）の比率が好ましい。付着した粉末培地における粉末を、実質的に均一な層の適用に好適な任意の手段によって、接着剤層（例えば、第１の接着剤層１２及び／又は第２の接着剤層２２）に適用することができる。粉末の層を適用するための好適な方法として、シェーカー型デバイスの使用、又は粉末コータの使用が挙げられる。

本開示のデバイスに使用するのに好適な栄養成分としては、ＬＡＢの生育及び検出用の培養培地に見られるものが挙げられる。好適な栄養成分の非限定例としては、ペプトン供給源（例えば、肉エキス、肉ペプトン）、酵母エキス、カゼインの酵素消化物、並びに炭水化物（例えば、マルトース、グルコース、トレハロース、スクロース）が挙げられる。好ましくは、炭水化物は、ＬＡＢの生育（バイオマス産生）を促進するのに十分多量にデバイスに存在し、ＬＡＢにより発酵されて、ＬＡＢコロニーの検出に使用され得る乳酸又はその他の代謝産物（例えば、ＣＯ_２）を生成する。

本開示の培養デバイスを使用する場合、存在する微生物コロニーの正確な計数が望まれる場合がある。したがって、任意の実施形態において、本開示の培養デバイスは、ベース材上、又は代わりにカバーシート上にグリッドパターンを含んでよい。グリッドパターンは正方形のグリッドパターン、例えば米国特許第４，５６５，７８３号に開示されるような正方形のグリッドパターンを含んでよい。例えば印刷手段のような任意の好適な処理によって、第１又はカバーシート上にグリッドパターンを形成してもよい。

別の態様において、本開示は、内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスを作製する方法を提供する。方法は、冷水溶解性ゲル化剤をベース材の一部上に付着させることを含む。ゲル化剤は、ベース材に付着させるときに乾燥状態であってよく（例えば、実質的に水を含まない粒子の形態）、あるいはゲル化剤は、液体コーティング（例えば、水性液体コーティング）としてベース材に付着させた後、実質的に水を含まない状態にまで乾燥させることができる。方法は、ベース材をカバーシートと隣接させて配置することと、それらの間にスペーサー部材を配置することと、を更に含み、スペーサー部材は、本明細書に記載のとおりの生育区画を画定する開口部を含む。任意の実施形態において、スペーサー部材は、ベース材又はカバーシートに付着され得る（例えば、接着剤により）。

ベース材は、付着したゲル化剤の少なくとも一部が、ベース材とカバーシートとの間に配置された生育区画に面するよう、カバーシートに隣接させて配置される。所望により、任意の実施形態において、第１の接着剤層をベース材に適用してよく（例えば、当該技術分野で既知のコーティングプロセスを使用して）、冷水溶解性ゲル化剤を第１の接着剤層に付着させてよい。

代替的な実施形態では、ゲル化剤のベース材への付着について記載したプロセスのいずかにより冷水溶解性ゲル化剤をカバーシートに付着させてよい。ゲル化剤が液体コーティングされる場合、付着したゲル化剤の乾燥は、当該技術分野で既知の数多くのプロセスにより実施できる。コーティングは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０１，９９８号に記載のプロセスに従って、オーブン（例えば、重力式オーブン、対流式オーブン）で乾燥させることができる。好ましくは、付着したゲル化剤を、実質的に水を含まなくなるまで乾燥させる。本明細書で使用される「実質的に乾燥」、及び「実質的に水を含まない」などのフレーズは、周囲環境との平衡が可能になった時点で、およそ、乾燥したコーティングの含水量以下の含水量を有するコーティングを指す。

方法は、脱酸素剤、緩衝系、及び二酸化炭素発生剤を培養デバイスの生育区画に配置することを更に含む。任意の実施形態において、脱酸素剤のいずれか１種又はすべて、緩衝系、及び二酸化炭素発生剤は、乾燥粉体として生育区画に配置され得る。所望により、脱酸素剤のいずれか１種又はすべて、緩衝系、及び二酸化炭素発生剤は、生育区画において、接着剤（例えば、本明細書に記載のとおりの第１の接着剤層又は第２の接着剤層）に付着させることができる。その他の任意選択的な成分（例えば、指示薬、選択剤、栄養成分）も生育区画に配置され、所望により、接着剤層に付着される。

付着したゲル化剤がベース材とカバーシートとの間の生育区画に面するようベース材をカバーシートに隣接させて配置することは、様々な方法により実施することができる。ゲル化剤の部分が生育区画に重なり合うようにベース材及びカバーシートを互いに隣接させて配置する代表例を図１〜３に示す。この重なり合った配置では、操作者がベース材とカバーシート間に水性液体を載せることにより、ゲル化剤、脱酸素剤、緩衝系、及び二酸化炭素発生剤が流体連通下に置かれることがわかる。

更に別の態様では、本開示は、微生物を検出する方法を提供する。方法は、上記の実施形態の本開示の培養デバイスの任意の実施形態を使用する。培養デバイスは、ベース材と、カバーシートと、ベース材の内側表面とカバーシートの内側表面との間に配置されたスペーサー部材であって、生育区画の形状及び深さを画定する開口部を含む、スペーサー部材と、生育区画においてベース材又はカバーシートに付着した乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤と、それぞれ本明細書で記載のとおりの生育区画に配置された有効量の乾燥状態の脱酸素剤、乾燥状態の緩衝系、及び有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤と、を含む。

任意の実施形態において、方法は、その内部の生育区画へのアクセスを提供する培養デバイスを開くことと、所定量の水性液体を生育区画に配置することと、試料を生育区画に配置することと、培養デバイスを閉じることと、培養培地において微生物にコロニーを形成させるのに十分な一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることと、微生物コロニーを検出するステップことと、を含み、水性液体及び試料を生育区画に配置することと、培養デバイスを閉じることが、培養デバイスのベース材、カバーシート、及びスペーサーにより取り囲まれた半固体微生物培養培地を形成することを含み、培養培地は４．０〜６．３５のｐＨを有する。

任意の実施形態において、培養デバイスの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約０．１ミリリットル〜約１０ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約１ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約２ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約３ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約４ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約５ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスでの水和及び／又は接種に使用される所定量の水性液体は、約１０ミリリットルである。任意の実施形態において、培養デバイスの生育領域の水和に使用される水性液体は領域全体に分布し、結果的に生育領域の２０．３ｃｍ^２あたり約１ミリリットルの液体となる。

方法のいずれかの実施形態では、所定量を生育区画に配置することは、同時に試料を生育区画に配置することを含む。例えば、試料は液体（例えば、微生物による汚染について検査される水試料又は飲料試料）であってよく、あるいは試料は液体担体又は希釈剤に懸濁された固体又は半固体試料であってよい。

あるいは、任意の実施形態において、所定量を生育区画に配置することは、同時に試料を生育区画に配置することを含まない。例えば、試料は、所定量の（好ましくは無菌）液体担体又は希釈剤を培養デバイスの生育区画に配置する前又は後に生育区画に配置された液体、固体、又は半固体の材料を含み得る。

通常、培養デバイスは、略水平面（generally−level surface）に配置され、かつベース材及びカバーシートを分離する（例えば、カバーシートを引き上げる）ことにより、培養デバイスの生育区画へのアクセスを提供することが可能となり、その間に、生育区画は水和及び／又は接種される。本培養デバイスは、好気性環境（すなわち、空気中）で水和及び／接種が可能である点で有利である。通常、デバイスの水和に使用される水性液体（検査する試料材料を含む場合がある）は、ベース材とカバーシートとの間の生育区画上にピペットにより接種される。所定量の水性液体の生育区画への配置後、培養デバイスを閉じる（例えば、カバーシートをスペーサー部材に接触するまで下げることにより）。所望により、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ培養デバイスの接種に使用されるものと類似した、平坦な又は凹状のスプレッダを使用して、培養デバイス内の所定領域全体に水性液体を分布させることができる。

方法のいずれかの実施形態では、所定量を生育区画に配置することは、同時に試料を生育区画に配置することを含んでもよい。これらの実施形態では、試料は、水性液体を含んでよく、及び／又は試料は、水性液体に希釈又は懸濁され得る。

あるいは、任意の実施形態において、所定量を生育区画に配置することは、同時に試料を生育区画に配置することを含まない。これらの実施形態では、所定量の水性液体は、試料を生育区画に配置する前又は後に（例えば、ピペットにより）生育区画に配置され得る。例えば、試料は、ゲル化剤を水性液体で水和する前又は後に生育区画に配置されるメンブレンフィルタ上に捕捉できる。

方法のいずれかの実施形態では、試料を生育区画に配置することは、１種以上の添加剤を生育区画に配置することを含む。１種以上の添加剤は、試料と一緒に、又は別個に生育区画に配置され得る。１種以上の添加剤は、本方法の種々の機能を実現することができる。例えば、任意の実施形態において、１種以上の添加剤が、デバイスにおける、ＬＡＢの生育を促進する栄養成分（例えば、乾燥状態の栄養成分）又は栄養培地（例えば、乾燥状態の栄養培地）を含んでよい。このような栄養成分及び栄養培地は当該技術分野で周知されており、培養する具体的な微生物に応じて選択してよい。栄養成分及び栄養培地は、脱酸素剤を実質的に妨害するものであってはならない。妨害については、参照によりその全体が本明細書に援用される国際出願ＰＣＴ／ＷＯ２０１５／０６１２１３号の実施例２〜３に記載のとおりの酸素センサ（例えば、Ｐｌａｎａｒ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｅｎｓｏｒ，直径５ｍｍ，部品番号２００００００２３；Ｐｒｅｓｅｎｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ＧｍｎＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＤＥ）から入手）を使用して容易に試験できる。

代替的に又は付加的に、任意の実施形態において、添加剤は、少なくとも１種の他の微生物よりも１種の微生物の生育に有利となる１種以上の選択剤（例えば、抗生物質、塩）を含む。一実施形態において、選択剤は、ＬＡＢ以外の微生物よりもＬＡＢを生育させるのに望ましい。代替的に又は付加的に、任意の実施形態において、添加剤は、微生物の存在を検出するための指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、酸化還元指示薬、発色性酵素基質、蛍光性酵素基質）を含む。ＬＡＢの検出に有用である選択剤及び指示薬を当業者は理解されるであろう。選択剤及び／又は指示薬は、脱酸素剤を実質的に妨害するものであってはならない。これは、上記のような酸素センサを使用して容易に検査することができる。

任意の実施形態では、有効量の選択剤が、培養デバイスにおいて乳酸菌を実質的に発芽及び生育させ、かつ有効量の選択剤が、大腸菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・スポロゲネス、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラジリス、プレボテラ・メラニノゲニカ、及び／又はフソバクテリウムの種の生育を実質的に阻害する。

生育区画において水性液体と接触したとき、乾燥状態の成分（例えば、脱酸素剤、緩衝系、二酸化炭素発生剤、栄養成分、指示薬、還元剤、及び／又は選択剤）と、水性液体とは、第１の溶存酸素濃度と、第１の溶存酸素濃度とを含む混合物を形成する。

任意の実施形態において、生育区画における水性混合物中の第１の溶存酸素濃度は、偏性嫌気性微生物、微好気性微生物、及び／又は微耐気性微生物の生育を実質的に阻害する濃度であってよい。これらの実施形態では、それらの成分を水性流体連通させると酸素消去反応が開始され、これにより、生育区画内の水性液体中での第１の溶存酸素の濃度は、その第１の濃度よりも低い（例えば、第１の濃度よりも、少なくとも約２５％低い、少なくとも約５０％低い、少なくとも約６０％低い、少なくとも約７０％低い、少なくとも約８０％低い、少なくとも約９０％低い、少なくとも約９５％低い、少なくとも約９８％低い、少なくとも約９９％低い、又は９９％超で低い）第２の濃度まで低減される。

任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、ＬＡＢ（例えば、耐気性ＬＡＢ又は偏性嫌気性ＬＡＢ）の生育を補助するのに十分な低さの第２の濃度にまで低減させることを含み得る。

任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、混合物の形成後、約１２０分以内に第２の濃度まで低減させることを含み得る。任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、混合物の形成後、約９０分以内に第２の濃度まで低減させることを含み得る。任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、混合物の形成後、約６０分以内に第２の濃度まで低減させることを含み得る。任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、混合物の形成後、約４５分以内に第２の濃度まで低減させることを含み得る。任意の実施形態において、第１の溶存酸素濃度を第２の溶存酸素濃度まで低減させることは、生育区画における水性混合物中の溶存酸素を、混合物の形成後、約３０分以内に第２の濃度まで低減させることを含み得る。

任意の実施形態において、生育区画における水性混合物中の第１の溶存二酸化炭素濃度は、微生物の生育を補助する濃度であってよい。これらの実施形態では、構成成分を水性流体連通させて配置し、これにより生育区画における水性混合物中の利用可能な二酸化炭素の第１の濃度を、第１の濃度よりも高濃度である（例えば、第１の濃度の約２倍、第１の濃度の約４倍、第１の濃度の約５倍、第１の濃度の約９．４倍）第２の濃度に上昇させて（例えば、９０分以内、６０分以内、又は３０分以内）、二酸化炭素生成反応を開始する。本開示の培養デバイスが接種を受けインキュベートされたとき、追加の利用可能な二酸化炭素は、生育区画で形成されたヒドロゲル中で視認され得る程度（すなわち、直径１ｍｍ以上の気泡）に形成される。

試料材料をデバイス内に配置する前に培養デバイスを水和させる場合は、デバイスを再度開いて培養材料を接種する前に、所望により冷水溶解性ゲル化剤を水和させ、数分間〜約３０分以上かけて（例えば、室温で）ゲルを形成することができる。ゲル化剤が水和されゲルを形成するまでの期間、脱酸素剤は、本明細書に記載したように、水和されたゲル化剤中の溶存酸素の濃度を、第１の濃度から微耐気性ＬＡＢ又は偏性嫌気性ＬＡＢの生育を促進する第２の濃度へと低減する。

培養デバイスの生育区画の水和の前又は後に、当該技術分野で知られる様々な方法で試料材料を生育区画と接触させることができる。任意の実施形態において、試料材料は生育領域内に試料材料を堆積させることにより生育領域と接触される。例えば、これは、ピペットによる操作、生育区画への試料材料の採取に用いたスワブの接触（例えば、スワブによる表面塗抹）、生育区画への白金耳又はニードルの接触（例えば、画線平板法の使用）、あるいは生育区画への試料採取具（例えば、スワブ、スポンジ、又はメンブレンフィルタ）の直接配置と、培養デバイスの閉め直しにより行うことができる。試料を載せ、（培養デバイス中に目視可能な気泡が混入しないように注意して）培養デバイスを再び閉じた後、脱酸素剤が生育区画の溶存酸素の低減を再開する。

任意の実施形態において、培養デバイスの生育区画における乾燥状態の成分が水和され、ゲル化剤がゲルを形成した後は、培養デバイスをコンタクトプレート（例えば、ロダックプレート）として使用することができる。このようにしてゲルが形成された後、培養デバイスのベース材とカバーシートとを分離して、水和ゲルを露出させる。水和ゲルを試料となる表面と接触させ、培養デバイス中に目視可能な気泡が混入しないように注意して培養デバイスを再度閉じる。デバイスを再度閉じ、水和ゲルを培養デバイス内側の生育区画に戻す。コンタクトプレート操作を好気性環境内で実施でき、かつ培養デバイスを再度閉じた後は、脱酸素剤によって培養デバイス中に低酸素環境を再構築できる点は有利である。

本方法の任意の実施形態において、試料を生育区画に配置して閉じた後、培養デバイスを一定時間（例えば、所定の期間）インキュベートする。当業者により知られるとおり、インキュベート条件（例えば、インキュベート温度）は、ＬＡＢの生育速度に作用し得る。例えば、低温でのインキュベート（例えば、約２５℃）では、耐冷性ＬＡＢが検出されやすくなる。高温でのインキュベート（例えば、約３０℃、約３２℃、約３５℃、約３７℃）では、ある種の中温性ＬＡＢの急速な生育を促す場合がある。

いくつかの実施形態では、接種後、培養デバイスは、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、又は少なくとも約４８時間の間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、培養デバイスは、約２４時間以下、約４８時間以下、又は約７２時間以下の間培養され得る。ある種の実施形態では、培養デバイスは、約２４時間〜約４８時間培養される。任意の実施形態において、培養デバイスは、生育区画内で生育するＬＡＢコロニーを検出又は計数する前に、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、約７日間、又は約８日間の間インキュベートでき、その間、内部で低酸素環境を維持することができる。任意の実施形態において、微生物にコロニーを形成させるのに十分な一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることは、好気性雰囲気下で一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることを含む（すなわち、インキュベートの際に培養デバイスが低酸素容器又はグローブボックス内に配置されることはない）。

本方法では、接種後の培養デバイスをインキュベートした後、微生物コロニーを検出することを更に含む。微生物コロニーは、当技術分野において既知である種々の手法によって培養デバイス内で検出することができる。好適なインキュベート期間後、観察可能なコロニーの不在、生育指示薬（例えば、ｐＨ指示薬、発色性酵素基質、ＴＴＣなどの酸化還元指示薬、蛍光性酵素基質）の変化がないこと、及び生育培地中の発酵性炭水化物の代謝に伴う気泡がないことによって、培養デバイスにおいて微生物の不在を検出できる。

微生物コロニー近傍の酸性域は、目視及び／又は撮像装置の使用により検出することができる。例えば、培養培地がｐＨ指示薬としてブロムクレゾールパープルを含む方法では、培地はほぼ中性ｐＨ時には紫色又は灰色の外観を示す。微生物が生育して、培養培地内の炭水化物（例えば、グルコース）を発酵させるにつれ、ブロムクレゾールパープル指示薬は、生育している細菌コロニー近傍で黄変する。例えば、培養培地がｐＨ指示薬としてクロロフェノールレッドを含む方法では、培養培地はほぼ中性ｐＨ時には赤色又は紫色の外観を示す。微生物が培養培地内の炭化水素を発酵させるにつれ、クロロフェノールレッド指示薬は、生育している微生物コロニー近傍で黄変する。

生育区画において微生物コロニー近傍に気泡が存在する場合（例えば、コロニーに触れている、又はコロニーから約１ｍｍ以内の距離）、肉眼により、及び／又はイメージングシステムを使用することにより検出できる。目視可能なコロニー及び／又は微生物コロニー近傍の領域内でｐＨ指示薬の色変化により検出可能である酸性域に、気泡を伴う場合がある。気泡は、例えば、炭水化物の嫌気発酵により生成される二酸化炭素を含む場合がある。

上記実施形態のいずれにおいても、本方法は、培養デバイスの画像を得ることを更に含み得る。これらの実施形態では、ＬＡＢの存在を検出することは、培養デバイスの画像を表示する、印刷する、又は分析することを含む。撮像システムは撮像装置を含み、また、プロセッサを含んでもよい。いくつかの実施形態において、撮像装置は、ラインスキャナ又はエリアスキャナ（例えば、カメラ）を含み得る。撮像装置は、単色の（例えば、白黒）又は多色の（例えば、色付き）スキャナを含み得る。有利には、単色の撮像システムは、より解像度の高い画像を準備することができ、結果の精度を向上させる及び／又は培養デバイスの微生物の存在を検出するのに必要な時間を低減することが可能である。

いくつかの実施形態において、撮像システムは、照明システムを更に含む。照明システムは、少なくとも１つの広域スペクトル可視光（例えば、「白色」光）源を含み得る。いくつかの実施形態において、照明システムは、少なくとも１つの狭スペクトル可視光源（例えば、例えば、赤色光、緑色光、又は青色光といった比較的狭帯域幅の可視光を放射する発光ダイオード）を含み得る。特定の実施形態において、照明システムは、発光ピークが事前選択された波長（例えば、約５２５ｎｍ）である狭スペクトル可視光源（例えば、発光ダイオード）を含み得る。

画像は、培養デバイスの生育区画内の成分（例えば、微生物コロニー、生育培地、及び指示薬）によって反射された光から得ることができ、あるいは画像は培養デバイスの生育区画内の成分を透過した光から得ることができる。好適な撮像システム、及び対応する照明システムは、例えば、国際公開第２００５／０２４０４７号、並びに米国特許出願公開第２００４／０１０１９５４号及び同第２００４／０１０２９０３号で説明されており、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。好適な画像システムの非限定例としては、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰＰＲ）、Ｓｐｉｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）から入手可能なＰＥＴＲＩＳＣＡＮ Ｃｏｌｏｎｙ Ｃｏｕｎｔｅｒ、並びに、Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）から入手可能なＰＲＯＴＯＣＯＬ及びＡＣＯＬＹＴＥプレートスキャナが挙げられる。

いくつかの実施形態において、画像を得ることは、波長バイアス画像（wavelength−biased image）を得ることを含む。例えば、撮像システムは、撮像装置が収集した光にバイアスをかけるバイアス・フィルタを含み得る。フィルタエレメントは当該技術分野において既知であり、「カットオフ」フィルタ（即ち、ある特定の波長より大きい又は小さい光波長のいずれかを通すことができるフィルタ）及び「バンドパス」フィルタ（即ち、ある特定の上限値と下限値との間の光波長を通すことができるフィルタ）の両方を包含する。バイアス・フィルタは、照明光源と培養デバイスとの間に配置することができる。代替的に又は付加的に、バイアス・フィルタは、培養デバイスと撮像装置との間に配置することができる。
例示的な実施形態

実施形態Ａは、対象とする微生物コロニーを計数するための培養デバイスであって、
反対面となる内側表面及び外側表面を有する第１のベース材と、
反対面となる内側表面及び外側表面を有するカバーシートと、
ベース材とカバーシートとの間に配置された非多孔性スペーサー部材であって、ベース材又はカバーシートに結合されており、生育区画の形状及び深さを画定する開口部を含み、スペーサー部材及び生育区画が、ベース材の内側表面とカバーシートの内側表面との間に配置されている、非多孔性スペーサー部材と、
生育区画に配置された、有効量の乾燥状態の脱酸素剤であって、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成される脱酸素剤と、
生育区画に配置された、乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤であって、生育区画においてベース材又はカバーシートに付着している、ゲル化剤と、
生育区画が所定量の脱イオン水で水和されたときに６．３５以下のｐＨを有する水性混合物を形成する、生育区画内に配置された乾燥状態の緩衝系と、
生育区画に配置された有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤であって、本質的１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成される、二酸化炭素発生剤と、を備える、デバイス。

実施形態Ｂは、脱酸素剤が、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成される、実施形態Ａに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｃは、二酸化炭素発生剤が、本質的に１０６マイクロメートル未満の直径を有する粒子から構成される、実施形態Ａ又は実施形態Ｂのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｄは、対象とする微生物の生育を促進するよう選択され、かつ生育区画に配置された、乾燥状態の栄養成分を更に含む、実施形態Ａ〜Ｃのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｅは、栄養成分が発酵性炭水化物を含む、実施形態Ｄに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｆは、炭水化物がグルコース、マルトース、スクロース、及びトレハロースからなる群から選択される、実施形態Ｅに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｇは、対象とする微生物の生育を検出するよう選択され、かつ生育区画に配置された、第１の指示薬を更に含む、実施形態Ａ〜Ｆのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｈは、対象としない微生物の生育を阻害するよう選択され、かつ生育区画に配置された、有効量の選択剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｇのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｉは、選択剤が、シクロヘキシミド、ポリエンマクロライド、アンホテリシンＢ、ナタマイシン、及びフィリピンからなる群から選択される、実施形態Ｈに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｊは、生育区画内に配置された、有効量の還元剤を更に含む、実施形態Ａ〜Ｉのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｋは、還元剤が、チオグリコール酸ナトリウム、ジチオスレイトール、及びジチオエリトリトールからなる群から選択される、実施形態Ｊに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｌは、脱酸素剤が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｍは、緩衝系の成分が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ａ〜Ｌのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｎは、緩衝系が、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム、並びにコハク酸及びコハク酸ナトリウムからなる群から選択される成分を含む、実施形態Ａ〜Ｍのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｏは、二酸化炭素発生剤が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ａ〜Ｎのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｐは、二酸化炭素発生剤が金属炭酸塩を含む、実施形態Ａ〜Ｏのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｑは、金属炭酸塩が、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウムからなる群から選択される、実施形態Ｐに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｒは、栄養成分が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ｄ〜Ｋのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｓは、第１の指示薬が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ｇ〜Ｒのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｔは、選択剤が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ａ〜Ｓのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｕは、還元剤が、生育区画において、ベース材又はカバーシートに付着している、実施形態Ｉ〜Ｔのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｖは、
ベース材の内側表面が、該内側表面に接着している第１の接着剤を有しており、
生育区画に配置された１つ以上の第１の成分が、第１の接着剤に付着しており、
第１の成分が、ゲル化剤、脱酸素剤、緩衝系、栄養成分、指示薬、選択剤、還元剤、及び前述の第１の成分のいずれ２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ａ〜Ｕのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｗは、
第２の成分が、第１の接着剤に配置され、
第２の成分が、指示薬、選択剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｖに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｘは、
カバーシートの内側表面が、該内側表面に接着している第２の接着剤を有しており、
生育区画に配置された１つ以上の第３の成分が、第２の接着剤に付着しており、
第３の成分が、ゲル化剤、脱酸素剤、緩衝系、栄養成分、指示薬、選択剤、還元剤、及び前述の第３の成分のいずれか２つ以上の組み合わせなる群から選択される、実施形態Ａ〜Ｖのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｙは、
第４の成分が、第２の接着剤に配置され、
第４の成分が、指示薬、選択剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態Ｘに記載の培養デバイスである。

実施形態Ｚは、二酸化炭素発生剤が炭酸塩を含む、実施形態Ａ〜Ｙのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態ＡＡは、脱酸素剤が、二価鉄イオン若しくはその塩、又はアスコルビン酸若しくはその塩を含む、実施形態Ａ〜Ｚのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態ＡＢは、生育区画と流体連通させて配置された第２の指示薬を更に含み、第２の指示薬が、対象としない微生物及び対象とする微生物の存在を示す、実施形態Ａ〜ＡＡのいずれか１つに記載の培養デバイス。

実施形態ＡＣは、脱酸素剤が、生育区画におけるベース材又はカバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１．５マイクロモル〜約１５マイクロモルの量で生育区画に配置されている、実施形態Ａ〜ＡＢのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態ＡＤは、二酸化炭素発生剤が、生育区画におけるベース材又はカバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１マイクロモル〜約１５マイクロモルの量で生育区画に配置されている、実施形態Ａ〜ＡＣのいずれか１つに記載の培養デバイスである。

実施形態ＡＥは、試料中の微生物を検出する方法であって、
実施形態Ａ〜ＡＤのいずれか１つに記載の培養デバイスを、その内部の生育区画へのアクセスを提供するように開くことと、
所定量の水性液体を生育区画に配置することと、
試料を生育区画に配置することと、
培養デバイスを閉じることと、
培養培地において微生物にコロニーを形成させるのに十分な一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることと、
微生物コロニーを検出することと、を含み、水性液体及び試料を生育区画に配置すること、並びに、培養デバイスを閉じることが、培養デバイスのベース材、カバーシート、及びスペーサーにより取り囲まれた半固体の微生物培養培地を形成することを含み、培養培地が４．０〜６．３５のｐＨを有する、方法。

実施形態ＡＦは、所定量を生育区画に配置することが、同時に試料を生育区画に配置することを含む、実施形態ＡＥに記載の方法である。

実施形態ＡＧは、所定量を生育区画に配置することが、同時に試料を生育区画に配置することを含まない、実施形態ＡＥに記載の方法である。

実施形態ＡＨは、試料を生育区画に配置することが、所定量を生育区画に配置することの後に生じる、実施形態ＡＧに記載の方法である。

実施形態ＡＩは、試料を生育区画に配置することが、所定量を生育区画に配置することの前に生じる、実施形態ＡＧに記載の方法である。

実施形態ＡＪは、試料を生育区画に配置することが添加剤を生育区画に配置することを含む、実施形態ＡＥ〜ＡＩのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＫは、添加剤を生育区画に配置することが、有効量の選択剤又は指示薬を配置することを含む、実施形態ＡＥ〜ＡＪのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＬは、有効量の選択剤が、培養デバイスにおいて乳酸菌を実質的に生育させ、かつ有効量の選択剤が、大腸菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・スポロゲネス、ウェルシュ菌、バクテロイデス・フラジリス、プレボテラ・メラニノゲニカ、及び／又はフソバクテリウムの種の生育を実質的に阻害する、実施形態ＡＫに記載の方法である。

実施形態ＡＭは、一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることが、好気性雰囲気下で一定時間にわたり培養デバイスをインキュベートすることを含む、実施形態ＡＥ〜ＡＬのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＮは、培養デバイスのインキュベート後、微生物コロニーを検出することが、培養デバイスにおいて光学的に検出可能な１つ以上のコロニーを計数することを更に含む、実施形態ＡＥ〜ＡＭのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＯは、培養デバイスが、生育区画に配置された指示薬を含み、微生物コロニーを検出することが、指示薬に関連付けられる光学的変化を検出することを含み、光学的変化が、微生物コロニー近傍に検出される、実施形態ＡＥ〜ＡＮのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＰは、光学的変化が色変化を含む、実施形態ＡＯに記載の方法である。

実施形態ＡＱは、微生物コロニーを検出することが、生育区画においてコロニーに近接した気泡を光学的に検出することを含む、実施形態ＡＥ〜ＡＰのいずれか１つに記載の方法である。

実施形態ＡＲは、１つ以上の微生物コロニーを計数することが、二酸化炭素産生コロニーを非二酸化炭素産生コロニーから鑑別することを更に含む、実施形態ＡＮ〜ＡＱのいずれか１つに記載の方法である。

本発明の目的及び利点を以下の実施例によって更に示すが、これらの実施例に示す特定の材料及び量並びに他の条件及び詳細は、本発明を不当に限定すると解釈されるべきでない。

実施例１．内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスの作製

図１の培養デバイスに従う内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスを作製した。ベース材は、厚さ５ｍｉｌ（０．１２７ｍｍ）のポリエステルフィルム（ＭＥＬＩＮＥＸ等級３７７二軸延伸ポリエステル（ＰＥＴ）フィルム、ＤｕＰｏｎｔ Ｔｅｉｊｉｎ（Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）から入手）から構成された。粉末栄養成分配合物（表１に掲載）及びグアーガム（１６ｇ／Ｌ）を脱イオン水中で撹拌し、実質的に均一な混合物とした。混合物のｐＨは、５．８＋／−０．５を目標とし、目標値に合わせる必要がある場合には、酸又は塩基により調整した。本混合物を米国特許第４，５６５，７８３号に記載されているようにベース材上にナイフコーティングし、対流式オーブン内で２１０°Ｆ（９８．９℃）で８分の間、乾燥させた。栄養成分層を、０．５６ｇ／２４ｉｎ^２（３．６ｍｇ／ｃｍ^２）の目標コーティング重量（乾燥後）が得られる厚さにコーティングした。乾燥後、厚さ約２０ｍｉｌ（０．５０８ｍｍ）のポリエチレンフィルムのスペーサー（Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｂｌｏｏｍｅｒ，ＷＩ）を、ベース材上の乾燥したコーティングに、感圧接着剤（９８重量％のイソオクチルアクリレートと２重量％のアクリル酸との共重合体）の薄層を介して接着された。スペーサーは、図１に示すスペーサーにおけるホールを画定する直径２ ３／８インチ（６．０３ｃｍ）の円型の開口部を含んだ。円型の開口部は、デバイスの生育区画の境界を画定している。

アスコルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））及び炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をそれぞれ粉砕した後、１４０番のメッシュシーブでふるいにかけた（１０６マイクロメートル未満の粒径が得られる）。グアーガム（８９．７５重量％、ＤｕＰｏｎｔ Ｄａｎｉｓｃｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能）、ふるいにかけたアスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及びふるいにかけた炭酸水素ナトリウム（０．２５重量％）の均質な混合物を調製した。カバーシートは、コーティング量が０．２ｇ／２４ｉｎ^２（１．３ｍｇ／ｃｍ^２）になるよう第２の感圧接着剤（４％のアクリルアミドと共重合させた９６重量％のイソオクチルアクリレート）を片面にコーティングした透明なポリエステル（ＰＥＴ）フィルム（厚さ０．０７３ｍｍ）から構成された。グアーガム、ふるいにかけたアスコルビン酸ナトリウム、及びふるいにかけた炭酸水素ナトリウムの均質な混合物を、次にカバーシートの接着剤上にパウダーコーティング（powder coat）した。両面接着テープを使用して、片端部に沿ってカバーシートをベース材に貼り合わせ、このデバイスを図１に示すものと同様の約３”（７．６ｃｍ）×４”（１０．１ｃｍ）の長方形に切り取った。カバーシートのコーティング面をスペーサー及び生育区画に向けた。

実施例２

実施例１に記載の粉体混合物によりコーティングする代わりに、カバーシートの接着剤をグアーガム（８９．７重量％）、アスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及び炭酸水素ナトリウム（０．３重量％）の粉体混合物でコーティングしたことを除き、実施例１の記載に従って内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスが作製された。

実施例３

実施例１に記載の粉体混合物によりコーティングする代わりに、カバーシートの接着剤をグアーガム（８９．５重量％）、アスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及び炭酸水素ナトリウム（０．５重量％）の粉体混合物でコーティングしたことを除き、実施例１の記載に従って内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスが作製された。

実施例４

実施例１に記載の粉体混合物によりコーティングする代わりに、カバーシートの接着剤をグアーガム（８９．０重量％）、アスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及び炭酸水素ナトリウム（１．０重量％）の粉体混合物でコーティングしたことを除き、実施例１の記載に従って内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスが作製された。

実施例５

実施例１に記載の粉体混合物によりコーティングする代わりに、カバーシートの接着剤をグアーガム（８８．０重量％）、アスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及び炭酸水素ナトリウム（２．０重量％）の粉体混合物でコーティングしたことを除き、実施例１の記載に従って内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスが作製された。

実施例６．実施例１〜５に記載のデバイスにおけるＣＯ_２濃度測定

実施例１〜５に記載の内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスを、ｐＣＯ_２ ｍｉｎｉ ｖ２ ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ（ＰｒｅＳｅｎｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ＤＥ ｃａｔ＃ ２００００１２０７）を使用し、供給元より提供されたＣＯ_２分圧を測定するソフトウェアを用い、ＣＯ_２生成についてモニターした。カバーシートを持ちあげ、各デバイスを開き、生育区画の生育領域を露出させた。１ミリリットルの無菌のバターフィールド緩衝液を各プレートの生育区画に配置した。薄型ＣＯ_２センサ（直径５ｍｍ及び厚さ２００マイクロメートル）（Ｐｌａｎａｒ ｐＣＯ_２ Ｍｉｎｉｓｅｎｓｏｒ Ｓｐｏｔ，ＰｒｅＳｅｎｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ＧｍｂＨ，ｃａｔ＃２００００１１７８）を、水和した生育区画に直接配置し、カバーシートを、水和した生育領域及びスペーサーと接触するまで静かに下ろした。閉じたデバイスに対し平らなプラスチック製スプレッダを押し付け、生育区画全体に液体を広げた。デバイスを閉じた後、ポリマー光ファイバを使用して、センサからの蛍光をモニターした。デバイスを閉じた直後及び９０分後に、水和した生育区画におけるＣＯ_２濃度の測定値を記録した。表２では、９０分後に測定されたＣＯ_２濃度の平均な上昇倍率を報告する（ｎ＝５）。

実施例７．内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスの作製及び使用

図１の培養デバイスに従う内蔵型嫌気性環境生成培養デバイスを作製した。グアーガム（１４ｇ／Ｌ）を表１の配合物の代わりに表３の栄養成分配合物と組み合わせたことのみを除き、実施例１に記載の手順に従ってベース材をコーティングし、作製した。

アスコルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））及び炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をそれぞれ粉砕した後、１４０番のメッシュシーブでふるいにかけた（１０６マイクロメートル未満の粒径が得られる）。グアーガム（８９．７重量％、ＤｕＰｏｎｔ Ｄａｎｉｓｃｏ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能）、ふるいにかけたアスコルビン酸ナトリウム（１０重量％）、及びふるいにかけた炭酸水素ナトリウム（０．３重量％）の均質な混合物を調製した。カバーシートは、コーティング量が０．２ｇ／２４ｉｎ^２（１．３ｍｇ／ｃｍ^２）になるよう第２の感圧接着剤（４％のアクリルアミドと共重合させた９６重量％のイソオクチルアクリレート）を片面にコーティングした透明なポリエステル（ＰＥＴ）フィルム（厚さ０．０７３ｍｍ）から構成された。微量のトリフェニルトリフェニルテトラゾリウムクロリド（約０．４８ｍｇ／２４ｉｎ^２（０．００３ｍｇ／ｃｍ^２））を接着剤に組み入れた。グアーガム、ふるいにかけたアスコルビン酸ナトリウム、及びふるいにかけた炭酸水素ナトリウムの均質な混合物を、次にカバーシートの接着剤上にパウダーコーティングした。両面接着テープを使用して、片端部に沿ってカバーシートをベース材に貼り合わせ、このデバイスを図１に示すものと同様の約３”（７．６ｃｍ）×４”（１０．１ｃｍ）の長方形に切り取った。カバーシートのコーティング面をスペーサー及び生育区画に向けた。

細菌株の、ラクトバシラス種、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種メセンテロイデス、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種デキストラニクム（dextranicum）、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・プランタルム、ラクトバシラス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbruekii）、ストレプトコッカス・アラクトリチクス（Streptococcus alactolyticus）、ラクトコッカス・ガルビエ、及びペディオコッカス・アシディラクティシの各試料を食品試料及び飲料試料から天然単離物として得た。バターフィールド緩衝液で各懸濁物を調製し、段階希釈して、約１００のＣＦＵ数となる（各微生物）濃度を有する最終懸濁物を得た。１ミリリットルの各懸濁液を使用して、本実施例に従って作製された個々の培養デバイスに接種した。培養デバイスは、カバーシートを持ち上げて生育区画の生育領域を露出させ、生育領域に１ミリリットルの懸濁液を滴下し、カバーシートを懸濁液及びスペーサーと接触するまで静かに下ろし、閉じたデバイス上で平坦なプラスチック製スプレッダを静かに押して生育区画全体に懸濁液を広げることにより接種した。

接種後、培養デバイスを３２℃の好気性インキュベータで４８時間インキュベートした。インキュベート後、各培養デバイスの赤色のコロニーを目視検査により計数した。各細菌の平均のコロニー数（ｎ＝２）を求めた。

比較対照として、寒天プレートには、本実施例の培養デバイスについて上記で使用したものと同じ希釈度及び用量で各懸濁物も接種した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＮＪ））を使用して寒天プレートを作製した。寒天（７０ｇ）を１Ｌの純水に段階的に懸濁し、１分間沸騰させて粉末を溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、４５〜５０℃に冷却した。次に、放冷した培地（ディッシュあたり１５〜２０ｍＬ）を、１ｍＬの各試料懸濁物を入れた無菌ペトリ皿に注ぎ入れた。プレートを一方向に旋回させ、次に逆方向に旋回させて接種菌液を培地全体に広げさせた。接種したディッシュを、インキュベート期間を通じて嫌気性雰囲気を与えるガス生成サシェ（ＧＡＳＰＡＫ ＥＺ Ａｎａｅｒｏｂｅ Ｓａｃｈｅｔ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｒｐ．）と共に嫌気性チャンバ内に置いた。寒天プレートを３２℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、プレート上のコロニーを目視検査により計数した。各細菌の平均のコロニー数（ｎ＝２）を求めた。

表４では、実施例の培養デバイスを使用して求められた平均のコロニー数と、対照寒天プレートを使用して求められた平均のコロニー数とを比較した比を、検査した微生物ごとに示す［すなわち、比＝（実施例の培養デバイスを使用した平均のコロニー数）／（対照寒天プレートを使用した平均のコロニー数）］。

本明細書に引用するすべての特許、特許出願及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を、参照により援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されたいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、理解しやすいように示したものにすぎない。それによって不要な限定がなされるものではない。本発明は図示及び記載された細部そのものに限定されず、当業者に明白な変形形態は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれる。

すべての見出しは読者の便宜のためのものであり、明記しない限り、見出しに続く文の意味を限定するために使用されるものではない。

本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことが可能である。これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれるものである。

Claims (10)

1. 乳酸菌コロニーを計数するための培養デバイスであって、
   反対面となる内側表面及び外側表面を有するベース材と、
   反対面となる内側表面及び外側表面を有するカバーシートと、
   前記ベース材と前記カバーシートとの間に配置された非多孔性スペーサー部材であって、前記ベース材又は前記カバーシートに結合されており、生育区画の形状及び深さを画定する開口部を含み、前記スペーサー部材及び前記生育区画が、前記ベース材の前記内側表面と前記カバーシートの前記内側表面との間に配置されている、非多孔性スペーサー部材と、
   前記生育区画内に配置された、有効量の乾燥状態の脱酸素剤と、
   前記生育区画に配置された、乾燥状態の冷水溶解性ゲル化剤であって、前記生育区画において前記ベース材又は前記カバーシートに付着している、ゲル化剤と、
   前記生育区画が所定量の脱イオン水で水和されたときに６．３５以下のｐＨを有する水性混合物を形成する、前記生育区画内に配置された乾燥状態の緩衝系と、
   前記生育区画内に配置された、有効量の乾燥状態の二酸化炭素発生剤と、を備え、前記乾燥状態の脱酸素剤はアスコルビン酸またはアスコルビン酸塩である、培養デバイス。
2. 前記乳酸菌の生育を促進するよう選択され、かつ前記生育区画に配置された、乾燥状態の栄養成分を更に含む、請求項１に記載の培養デバイス。
3. 前記乳酸菌の生育を検出するよう選択され、かつ前記生育区画に配置された、第１の指示薬を更に含む、請求項１又は２に記載の培養デバイス。
4. 対象としない微生物の生育を阻害するよう選択され、かつ前記生育区画に配置された、有効量の選択剤を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養デバイス。
5. 前記生育区画内に配置された、有効量の乾燥状態の還元剤を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養デバイス。
6. 前記脱酸素剤が、前記生育区画における前記ベース材又は前記カバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１．５マイクロモルから、前記生育区画における前記ベース材又は前記カバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１５マイクロモルの量で前記生育区画に配置されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の培養デバイス。
7. 前記二酸化炭素発生剤が、前記生育区画における前記ベース材又は前記カバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１マイクロモルから、前記生育区画における前記ベース材又は前記カバーシートの表面積１０ｃｍ^２あたり約１５マイクロモルの量で前記生育区画に配置されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養デバイス。
8. 試料中の乳酸菌を検出する方法であって、
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養デバイスを、その内部の前記生育区画へのアクセスを提供するように開くことと、
   所定量の水性液体を前記生育区画に配置することと、
   試料を前記生育区画に配置することと、
   前記培養デバイスを閉じることと、
   培養培地において乳酸菌コロニーを形成させるのに十分な一定時間にわたり前記培養デバイスをインキュベートすることと、
   前記乳酸菌コロニーを検出することと、を含み、
   前記水性液体及び前記試料を前記生育区画に配置すること、並びに、前記培養デバイスを閉じることが、前記培養デバイスの前記ベース材、前記カバーシート、及び前記スペーサーにより取り囲まれた半固体の微生物培養培地を形成することを含み、前記培養培地が４．０〜６．３５のｐＨを有する、方法。
9. 一定時間にわたり前記培養デバイスをインキュベートすることが、好気性雰囲気下で前記一定時間にわたり前記培養デバイスをインキュベートすることを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記乳酸菌コロニーを検出することが、前記生育区画において前記コロニーに近接した気泡を光学的に検出することを含む、請求項９に記載の方法。

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