JPS5856679A - 嫌気性菌培養方法及び雰囲気調整剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は嫌気性細菌等→を培養するための無酸素でかつ
１０％の炭酸ガスを含む雰囲気を作り出丁方法及びその
ための雰囲気調整剤Ｃ；関する。

本発明【−おいて嫌気性菌とは酸素の存在が何らかの方
法で毒性Ｃ２働らくような細菌を称する。

近年各種の嫌気性菌を培養することＣ−より、その存在
を検出することが各種の細菌検査の手段として有用なも
のとされ、従来多くの方法が開発されている。特Ｃ医療
上は、嫌気性菌培養のための雰囲気を簡易な方法で作り
出すことが要求され、各種の脱酸素剤や炭酸ガス発生剤
が開発されており、炭酸ガス濃度を３〜５％とした無酸
累算囲気中で培養する方法が実用化されている。

しかし、細菌の検査方法として要求される簡易性、及び
一つの培養（−よって検出されうる菌種の制限等の問題
がなお従来法（二あり、その改善が望まれていた。特Ｃ
−１検査の簡易性Ｃ２関し、脱酸素剤と炭酸ガス発生剤
とを各々の培養器の容量Ｃ−あわせて秤量し密閉封入す
る方法では、現実（＝は医療の現場で多量の検体をその
都度必要に応じて個々（−培養する必要があるため、そ
の際、個々の検体Ｃ一ついて従来のような方法をとるこ
とは困難であった。

本発明は、上述の従来法の欠点を解消し、簡易でかつ、
一つの検査Ｃ−よりできるだけ多種の代表的菌種の培養
検出を可能とする、嫌気性菌の培養方法及びそのための
雰囲気調整剤を提供することを目的とする。また、本発
明はあらかじめ配合された薬剤組成物を培養器中（二装
置するだけで、雰囲気を無酸素でかつ１（ｌの炭酸ガス
量（＝いたらしめる簡易な方法を提供することを目的と
する。

即ち、本発明は、酸素濃度０．１容量チ以下、炭酸ガス
濃度１０±２容量チの雰囲気内（−おいて嫌気性菌を培
養する方法を提供する。また、本発明は、密閉された培
養器中（−配した通気性内装袋中ｌ−説酸素作用と炭酸
ガス発生作用をもち酸素除去量が炭酸ガス発生量のほぼ
２倍の体積比となるよう（−配合した組成物を配し、嫌
気性ず囲気を調整する方法を提供する。代表的な種類の
嫌気性細菌をできるだけ多数種良好な条件で培養するた
め（―は、その雰囲気が単に無酸素というだけでなく、
ｌＯ％程度炭酸ガスを含んでいることが望ましいことが
本発明により確められ、本発明はこれＣ−基づいて成さ
れたものである。

従来脱酸素剤Ｃ；炭酸ガス発生剤を併用するものとして
炭酸ガス濃度を約５％とするものが知られているが、こ
の場合、代表的な８種の嫌気性菌のうち紡錘菌（ｆｕｓ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）が培養検
査ｌユよりできなかった。これｆ二対し、炭酸ガスを１
０％とすることにより、紡錘菌Ｃ一ついても確実Ｃ二検
出可能となる。このため、紡錘菌を検出するための他の
検査をする必要が省略される。上述の８種を含む代表的
３０種の検出に対して、本発明の培養方法Ｃ−よれば完
全な検出ができる。なお、培地は固定培地でよいが他の
公知の培地も当然利用できる。

本発明Ｃ−より確実に検出される嫌気性菌の代表的８種
はバクテロイデス、フンバクテリウム、クロストリディ
ウム、プロピオニバクテジウム、ラクトバチルス、ペブ
トコッカス、ペブトストレプトコッカス、及びベーヨネ
ラの諸属であり、これらのうち、クロストリディウム及
びラクトバチルスを除く６種は病原的観点から臨床的＋
−特＋−重要とされている。

本発明の方法では、さら（−これらを含む３０種の嫌気
性菌Ｃ；ついて検出可能であることが確められており、
実験の継続（−よりさら（；多種のもの（−も応用され
うろことが期待されている。

培養は接種の後少くとも２４〜４８時間の間、好ましく
は６〜４８時間の間、酸素０．１チ以下（体積チ、以下
同じ）、炭酸ガス１０±２チの濃度Ｃ二保持することＣ
−より行う。本発明Ｃ二おいて脱酸素−炭酸ガス発生組
成糊の好菫しいものを用いる場合Ｃ；は、約３時間抜酸
素０．１％以下、炭素ガス１０％に到達できる。但しも
う少しゆっくりした反応速度の脱酸素−炭酸ガス発生組
成物を用いることも可能である。

不発明Ｃ−用いる脱酸素−炭酸ガス発生組成物としては
例えばアスコルビン酸又はその塩／炭酸アルカリ及び又
は炭酸水素アルカリ／反応促進剤の系統のものがある。

アスコルビン酸としてはＬ−アスコルビン酸又はＤ　−
１ｓｏ−アスコルビン酸がある。炭酸アルカリ又は炭酸
水素アルカリのアルカリ塩としては、ナトリウム、カリ
ウム、リチウム、等の塩及びこれらとアルカリ土類金属
（マグはアルカリ土類金属の水酸化物を添加することも
できる。

また塩化カルシウム等の潮解性の塩も場合により含有で
きる。反応促進剤としＣは第１鉄化合物と活性炭の混合
物がありその配合量は所要反応速度に応じて選ぶ。その
うち、第一鉄化合物は、硫酸第１鉄、塩化第１鉄、水酸
化・Ｂ１鉄、炭酸第１鉄、酸化第１鉄の無水塩又は含水
塩であり、硫酸第１鉄含水塩が好ましい。伸性炭は微粉
状の公知のものであり、水蒸気、■２．空気、塩素、減
圧加熱その他の公知の方法で活性処理したものである。

上述の脱酸素−炭酸ガス発生組成物の基本的配合は。た
とえば次のようなものである。

（ＡＩ　　　　　　　　　　　　　　Ａ−Ｉ　　　　Ａ
−２Ｌ−アスコルビン酸　　　　１４重量部　１４重量
部活性炭　　　　１４１２ 硫酸第一鉄・７水塩　　　３ｏ〜５ｏ５８塩化カルシウ
ム２水塩　　　ｏ６ 水酸化カルシウム　　　　　ｏ３ 炭酸水素ナトリウム　　　　７６ 炭酸ナトリウム・１ｏ水塩　７６ その他下記の（Ｂ）に例示される如く、脱酸素成分とし
て鉄分を用いたのもある。

（Ｂ）　　鉄　　　粉　　　　　　　　　　　１０重量
部硫酸第一鉄７水塩　　　　　　　５６ 水酸化カルシウム　　　　　　　　１゜亜硫酸ナトリウ
５に塩 炭酸水素ナトリウム　　　　　　　１゜塩化カルシウム
２水塩　　　　　　　７活性炭　　　　　１．５ 上掲の配合（二よれば一方で酸素を吸収除去しつつ、同
時Ｃ−炭酸ガスを発生させ、密閉後２４〜４８時間の後
炭酸ガス濃度を１０％とすることができる。実際の使用
Ｃ−当っては湿度、温度等の条件によって前記配合以外
の脱酸素剤や炭酸ガス発生剤を使用したい場合も考えら
れる。その時は他の剤を併用しつつ、前記配合の各化合
物の割合をそれに合わせて調整することもできる。いず
れＣ二しても酸素除去量は、炭酸ガス発生量のほぼ２倍
（体積比）であることが必要である。

また、この組成物は２個の部分組成分の組合せとするこ
ともできる。即ち、一方は炭酸ガス発生作用を併わない
純粋の脱酸素剤であって、他方は脱酸素機能と炭酸ガス
発生機能を備えた部分組成物の組合せとし、後者は例え
ば体積比で酸素除去量（吸収量）と炭酸ガス発１生量が
約１対１のものを用い、前者と後者との酸素除去速度が
等しいものを用いることＣ−より可能である。このよう
な。

部分組成物の組合せ（−よる方法はその他酸素除去量と
炭酸ガス発生量との体積比が異なるものく一ついても、
対応して部分組成物の間の酸素除去速度を定めることＣ
−より可能である。

脱酸素剤としては公知の鉄系のものがあり１例えば特公
昭５４−４３８．５４−４３９．５４−４７１．５４−
４７２．５４−４７６等に開示のものは本発明の目的Ｃ
２用いることができる。その他アスコルビン酸又はその
塩／水酸化アルカリ／反応促進剤の系のものがある。こ
れは、前述の炭酸ガス発生を併う脱酸素−炭酸ガス発生
組成物中のアルカリの炭酸塩及び／又は炭酸水素塩に代
わり水酸化アルカリ（好ましくは水酸化カルシウム等）
を用いたものでよい。

この場合脱酸素−炭酸ガス発生部分組成物としては、前
述の通り、脱酸素量と炭酸ガス発生量とが１対ｌのもの
を用いることができる。その−例としては、重量部６−
てＬ−アスコルビン酸ナトリウム６部、炭酸水素す。ト
リウム６部、炭酸ナトリウム・１０水塩６部、硫酸！１
！７水塩２部、及び活性炭６部から成るものがある。

一般（；炭酸ガス発生剤としては炭酸塩と水に溶解する
際（−炭酸ガスを生成し酸性（ｐＨ６未満）のｐＨを与
えるものとの組合せがあり、前者としては、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、又はセスキ
炭酸ナトリウム等がある。

後者としては、アスコルビン酸、酒石酸、コノ１す酸、
リンゴ酸、フマール酸、乳酸等があり、アスコルビン酸
を用いたものが好ましい。

その他の方法として、培養器の容器容積が一定である場
合には、酸素を１０チまで吸収する脱酸剤（部分組成物
）と、酸素除去量と炭酸ガス発生量の体積比が１対１の
部分組成物との組合せＣ二よっても、本発明の目的は達
成される。

なお、本発明の脱酸素−炭酸ガス発生組成物（雰囲気調
整剤）はこの上う（二世養器Ｃ−あわせてそれぞれの薬
剤を秤量する必要もなく、全酸素を捕捉できる最低量さ
え下まわらぬ量であれば適当量を培養器中Ｃ−封入する
だけでよい。従って、実際の使用Ｃ−際して極めて簡便
である。

実際の使用をさらに簡便なものとするためには。

本発明の脱酸素−炭酸ガス発生組成物を２重の袋≦二封
入しておくことが有用である。

この袋は、非通気性のプラスチックフィルムからなる外
装袋と、この外装袋内に収納されたそれ自体通気性のあ
る布または和紙等の袋か、通気性のあるプラスチックフ
ィルム製の内装袋とＣ−より二重に包装されている。保
存のためＣ−１さら（；外側Ｃニアルミ箔等の金属箔又
はこれとの積層フィルムでおおってもよい。

一般に使用時Ｃは外装袋を切断し内装袋を培養器中Ｃ−
装入して密閉する。

培養器としては、本発明の場合、必ずしも従来のような
真空容器（真空耐圧力を備えたもの）を用いる必要がな
く、炭酸ガス濃度１０％のためわずかな減圧状態（−保
たれるので、培養器として酸素等のガス不透過性の袋を
用いることができる。

このような条件（−適合しさえすれば、空気中の約２１
％を占める酸素がほぼ全量捕捉された時、その１重２体
積量の炭酸ガスが発生していることＣ−なり、理論的Ｃ
二は炭酸ガスの含有量は１１７％Ｃ−おちつくことにな
る。本発明では、実用上１０％±２チの炭酸ガス濃度を
達成することができる。

その結果順次必要に応じてかつ個々Ｃ−炭酸ガス濃度１
０％ｌ−で嫌気性培養することが可能となる。

本発明の方法（−よる嫌気性雰囲気の調整実験結果は次
の通りである。

容量２５０ＣＣの密封された培養器中Ｃ−装入の１スコ
ルビン酸系の脱酸素−炭酸ガス発生組成物（８）を規定
量封入して酸素と炭酸ガス濃度を測定した。

２４時間後（−は酸素０．１％以下、炭酸ガス１０．２
俤であった。４８時間後（−は酸素０．１％以下炭酸ガ
ス１０，４チであった。

第２（−１市販の脱酸素剤５−５０．８−３０各１個、
脱酸素兼炭酸ガス発生剤Ｃ−５００２＠を容量２５０ω
の培養器中Ｃ；封入３７℃Ｃ；保持した結果では、３時
間後の酸素は０．１以下、炭酸ガス９８％であり２４時
間後の酸素濃度０．１％以下（以後４８時間も同じ）、
炭酸ガス濃度１０．１　％　（４８時間後９．２％）で
あった。

また第２の実験例において、培養器容積を２００〜５０
０ＣＣとして同様の測定を行った結果いずれもは一同様
な結果を得た。

即ち、本発明の方法は無酸素状態への到達が早く、かつ
炭酸ガス濃度をそれＣ一対応して約１０％（二保持でき
、また持続性Ｃ；もすぐれている。

次Ｃ−簡易な嫌気性珀養方法Ｃ二ついて使用状態を示す
図面を基（二説明する。

外装袋１はガス不透過性の透明プラスチックフィルムの
酸素透過度５０　Ｃ４−Ｘｒｔｔ’　＊　ａｔｍ　ａ　
ｄｒｙ以下以下上くは２０　ｃｃ／　ｍ”　＊　ａｔｍ
　＠ｄｒｙ以下のもの（例えば滴品名ＫＯＰ／ＣＰ、　
ＫＯＰ／ＩＰＥ、　ＫＯＮ／′ＰＥ、　　エバール、サ
ラネックス、０■、バリアロン、ボブロン。

ナイロン／ＰＥ、　　トリプルナイロン、キャズフイル
ム、ダイヤミロン等）でできており、その端１ｂは密封
されている。培地７（二検体を接種したシャーレ６を外
装袋１の中Ｃ二人れると共Ｃ−１脱酸素−炭酸ガス発生
組成物４，５の入った通気性の内装袋２，３を外装袋１
内Ｃ−人れ、さら（−脱酸素状態の公知のインディケー
タ−９（色（二より酸素濃度を示すもの）を入れた後、
開端１ａをクリップ８（−より封止する。

内装袋２．３は、図示では２個であるが、必要（二応じ
１個ないし２個以上用いることができる。

封止方法は、クリップ８に代り、熱圧着等信の封止手段
によることもできる。

炭酸ガスが１０％程度発生するので脱酸素状態Ｃ−おい
ても、外装袋１は強く圧しつぶされることなく、通常の
シャーレで十分安全（二位相でき、さら（二個々のシャ
ーレを外部から観察できるので、個々の検体について培
養の進行状態を観察するの（二好適である。また培養器
１容器を気密性フィルムとしたので培養器内部の温度制
御が容易である。

さらＣ−１本発明Ｃ；よれば、発熱又は吸熱のない反応
Ｃ−より所定の嫌気性雰囲気を調整できるので。

培養時の温度調節もさらＣ−容易であり、反応（二よる
水分の放出、吸収もなく温度の調節も容易である。

実施例１゜ 脱酸素−炭酸ガス発生剤として前掲Ａ−１の組成物を用
い接種後６〜４８時間の雰囲気を酸素０１チ以下炭酸ガ
ス濃度１０±２チに保持し、ＣＡＭ寒天培地を用い、　
３７℃の温度条件下（二で４８時間下記の臨床分離株を
培養し、集落の大きさを比較し検出菌種を観察した。

バクテロイデス、フンバクテリウム、クロストリディウ
ム、プロピオニバクテリウム、ラクトバチルス、ペブト
コッカス、ペブトストレプトコッカス、及びヘイロネラ
。

その結果これら全菌種は十分な集落の大きさを示し確実
Ｃ二検出された。その他同様にして３０種類の嫌気性菌
（二ついて、培養検査を行ったところいずれも良好な結
果をえた。

比較例１゜ 炭酸ガス濃度５％としその他実施例１と同様にして培養
実験を行ったところ、１種（フンバクテリウム）（一つ
いて検出できなかった。

比較例２ 炭酸ガス濃度２０％、酸素濃度０１％以下として同様の
培養実験を行った結果では、極めて発育が悪く、検出で
きない菌種が多かった。

以上の結果から、炭酸ガス１０％を含む嫌気性雰囲気に
よる培養検査Ｃ二より、検体に含まれる実際の新菌の存
在の検出可能な範囲が拡大するので、培養検査方法とし
て本発明は極めて有用であることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明（二相いる嫌気性培養装置の一実施例の
縦断面図を示す。 １°°゛外装袋　　　　　　？’ａ・・・開端ｌｂ−，
開−。　　　　　　２，３・・・内装袋４．５・・・脱
酸素−炭酸ガス発生組成物６・・・シャーレ　　　　　
　７・・・培地８・・・クリップ。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸素濃度０．１容量−以下、炭酸ガス濃度１０±
   ２容量チの雰囲気内Ｃ二おいて嫌気性菌を培養すること
   を特徴とする嫌気性菌の培養方法。
2. （２）密閉された培養器中Ｃ−配した通気性内装袋中（
   ユ脱酸素作用と炭酸ガス発生作用をもち酸素除去量が炭
   酸ガス発生量の体積比はぼ２倍となるようＣ−配合して
   成る組成物を配することを特徴とする嫌気性菌培養方法
   。
3. （３）　　前記脱酸素−炭酸ガス発生組成物を培養型中
   雰囲気が実質上無酸素状態に達する≦二十分な量配し、
   到達無酸素状態（−おいて炭酸ガス濃度を１０±２％≦
   −保持する特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）前記の密閉された培養器は、酸素不透過性でかつ
   透明な袋の開口端を密封したものである特許請求の範囲
   第２項又は第３項ｌ二記載の方法。
5. （５）脱酸素作用と炭酸ガス発生作用をもち、酸素除去
   量が炭酸ガス発生量の体積比はぼ２倍となるように配合
   して成る嫌気性菌培養のための雰囲気調整剤。
6. （６）前記脱酸素−炭酸ガス発生址μ物は、アスコルビ
   ン酸又はその塩／アルカリの炭酸塩及び・又は炭酸水素
   基７及応促進剤の系から成る特許請求の範囲第５項記載
   の雰囲気調整剤。
7. （７）前記脱酸素−炭酸ガス発生組成物は、鉄／硫酸第
   １鉄／アルカリの炭酸塩及び・又は炭酸水素塩の系から
   成る特許請求の範囲第５項記載の雰囲気調整剤。
8. （８）　　前記脱酸素−炭酸ガス発生組成物は、脱酸素
   速度がほぼ等しい第１の脱酸素剤部分組成物と脱酸素−
   炭酸ガス発生第２部分組成物との組合せから成り、第２
   部分組成物の脱酸素量と炭酸ガス発生量は体積比で約１
   対１である特許請求の範囲第５項記載の雰囲気調整剤。
9. （９）前記第１及び第２の部分組成物を夫々酸素不透過
   性の外装袋中（−分封保存する特許請求の範囲第８項記
   載の雰囲気調整剤。