JP6464277B2 - ネクロックスを有効成分として含有する粘膜炎予防又は治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ネクロックスを有効成分として含有する粘膜炎予防又は治療用組成物に関する。

粘膜炎は、主に癌患者を対象とする放射線療法及び化学療法により発生する副作用であって、粘膜又は消化管を覆っている粘膜内層に炎症が発生した状態を意味する。

粘膜炎の症状は、細胞致死により粘膜内層が薄くなり、剥がれ、炎症が生じ、潰ようが発生するものである。このよう病変は、極めて苦しくて、食道、胃、小腸、大腸及び直腸を含んで、口腔から肛門までの消化管内の部位で発生し得る。粘膜炎の発生は、患者の生活の質を低下させる。粘膜炎による口腔内の深刻な痛みは、不十分な栄養摂取につながり、免疫機能の低下を誘発する。甚だしくは、癌治療を中断しなければならない深刻な状況に至る。しかしながら、現在使用されている治療方法は、粘膜炎を効果的に予防し、克服可能な接近方法が不足な実情である。

ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）は、ＬＧ生命科学で開発したミトコンドリアに特異的な細胞壊死抑制剤であって、毒素やストレスによる細胞死の抑制効果、細胞生存能力の増大効果、抗酸化効果を同時に示す革新的な物質として注目されている。ネクロックスは、ヒト肺線維芽細胞（ＬＢ−ＨＥＬ ｃｅｌｌ）に低温損傷を２４時間加えた後、ネクロックスを処理した場合、低温損傷により誘発される細胞死に対して保護効果があり、ｔ−ＢＨＰ（ｔｅｒｔｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）により誘導される細胞壊死を防止する効果があると報告されている［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１０ Ｎｏｖ；３３（１１）１８１３−２３；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２０１０ Ｎｏｖ；４２（９）３４１４−２１］。特に、ネクロックス−７は、酸化的ストレスとアセトアミノフェンにより誘導された細胞壊死に対して保護作用があり、マウスモデルで四塩化炭素により誘発された肝損傷を予防する効果があり、虚血性再潅流による肝損傷を効果的に抑制すると報告されている［Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３ Ｍａｙ １０；１８（１４）１７１３−２２］。

また、ネクロックスは、癌転移抑制効果も立証されている［韓国特許公開第２０１３−００８８７２０号公報］。

韓国特許公開第２０１３−００８８７２０号公報

Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１０ Ｎｏｖ；３３（１１）１８１３−２３ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２０１０ Ｎｏｖ；４２（９）３４１４−２１ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３ Ｍａｙ １０；１８（１４）１７１３−２２

これより、本発明者は、放射線療法又は化学療法により誘発される粘膜炎モデルでネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）の処理による粘膜保護効果、口腔及び腸粘膜の破壊抑制効果、腸に存在する細胞増殖効果を確認することによって、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防及び治療用組成物を提供することにある。

前記課題を解決するための手段として、本発明は、ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防及び治療用組成物を提供する。

前記課題を解決するための他の手段として、本発明は、ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する抗癌補助剤を提供する。

前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明はネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防及び治療用食品組成物を提供する。

本発明は、放射線療法又は化学療法により誘発される粘膜炎モデルでネクロックスの処理による粘膜保護効果を確認した結果、放射線療法又は化学療法による疾病の死亡率をネクロックス投与グループにおいて減少させ、体重減少を減らすのに効能があった。また、腸の機能を確認した結果、大便の生成率が正常グループと同様な程度に保護されており、放射線による腸粘膜の破壊を抑制し、腸に存在する細胞の増殖率にも寄与していた。

図１のＡは、放射線誘発粘膜炎動物モデルを設立するための実験デザインを示す図表であり、Ｂは、放射線誘発粘膜炎動物モデルにＮｅｃｒｏＸ−７を投与した後、生存率と体重を示すグラフである。 図２は、粘膜炎動物モデルにＮｅｃｒｏＸ−７を投与した後、腸機能保護効果を示す写真である。 図３は、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎動物モデル及びＮｅｃｒｏＸ−７を処理した粘膜炎マウスの各腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織のＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｃｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色結果を示すものである。 図４は、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎動物モデル及びＮｅｃｒｏＸ−７を処理した粘膜炎マウスの各腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織を摘出し、免疫組織化学検査（ＩＨＣ：ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて細胞増殖（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を確認した写真である。 図５は、ＮｅｃｒｏＸ−７が放射線の照射による正常細胞と癌細胞に及ぶ影響を確認したものである。 図６は、ＮｅｃｒｏＸ−７が放射線の照射後に細胞の増殖能力に及ぶ影響をＭＴＳ分析法とＣＭ−Ｈ２ＲＯＳ染色を用いたミトコンドリア内における活性酸素を測定した結果を示すものである。 図７は、抗癌剤誘発粘膜炎動物モデルを設立するための実験デザインを示す図表及び抗癌剤誘発粘膜炎動物モデルにＮｅｃｒｏＸ−７を投与した後、生存率と体重を示すグラフである。 図８は、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎動物モデル及びＮｅｃｒｏＸ−７を処理した粘膜炎マウスの各舌組織のＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｃｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色結果を示すものである。 図９は、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎動物モデル及びＮｅｃｒｏＸ−７を処理した粘膜炎マウスの各腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）組織のＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｃｙｌｉｎ ＆ ｅｏｓｉｎ）染色結果を示すものである。 図１０は、ヒト腫瘍細胞においてＮｅｃｒｏＸの抗癌補助剤としての効果を示すものであって、ＮｅｃｒｏＸ−７を濃度別に単独処理時、抗癌剤５−ＦＵ（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）を単独処理時、及び５−ＦＵとＮｅｃｏｒｏＸ−７を併合処理時、腫瘍細胞の生存細胞数を分析した結果である。

本発明は、ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防及び治療用組成物に関する。

前記ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）は、韓国特許公開第１０−２００９−００１８５９３号に開示された化合物であって、その種類において特に限定されるものではないが、好ましくは、ネクロックス−１（ＮｅｃｒｏＸ−１）、ネクロックス−２（ＮｅｃｒｏＸ−２、［５−（１、１−ジオキソ−チオモルフォリン−４−イルメチル）−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（１−メタンスルホニル−ピペリジン−４−イル）−アミン）、ネクロックス−５（ＮｅｃｒｏＸ−５、［５−（１、１−ジオキソ−チオモルフォリン−４−イルメチル）−２−フェニル−１Ｈ−インドール−７−イル］−（テトラヒドロ−ピラン−４−イルメチル）−アミン）、ネクロックス−７（ＮｅｃｒｏＸ−７、テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１、１−ジオキソ−チオモルフォリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン）及びネクロックス−１８（ＮｅｃｒｏＸ−１８）よりなる群から選択された一つ以上を含むことができる。

本明細書において「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容される陰イオンを含有する無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等のような無機酸；タルタル酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、卜リクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、ベンゾイン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸等のような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸等のようなスルホン酸等により形成された酸付加塩が含まれる。また、薬学的に許容される塩基付加塩、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等により形成されたアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩；リシン、アルギニン、グアニジン等のアミノ酸塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン、トリエチルアミン等のような有機塩等が含まれる。本発明による化合物（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１、１−ジオキソ−チオモルフォリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミンは、当業界に公知された通常の方法によりその塩に転換され得、塩の製造は、別途の説明がなくても、当業者により容易に行われることができる。

本明細書において「異性体（ｉｓｏｍｅｒ）」は、同一の化学式又は分子式を有するが、光学的又は立体的に異なる化合物又はその塩を意味する。本発明によるネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）は、非対称炭素中心を有することができるので、光学異性体（Ｒ又はＳ異性体）、ラセミ体、部分立体異性体混合物、個々の部分立体異性体等で存在し得、幾何異性体（トランス、シス型異性体）も存在し得る。これらすべての異性体及びその混合物も、本発明の範囲に含まれる。

以下では、別途の説明がない限り、本発明による化合物ネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）の薬学的に許容されるその塩及び／又はその異性体は、すべて本発明の範疇に含まれる。

本発明では、放射線及び／又は抗癌治療により誘発される粘膜炎モデルでネクロックスの処理による粘膜保護効果を確認した。その結果、放射線による疾病の死亡率をネクロックス投与グループにおいて減少させ、体重減少を減らすのに効能があった。また、腸の機能を確認した結果、大便の生成率が正常グループと同様な程度に保護されており、放射線による腸粘膜の破壊を抑制し、腸に存在する細胞の増殖率にも寄与していた。

したがって、本発明のネクロックスは、放射線療法又は化学療法により誘発される粘膜炎を治療できる。

本発明において粘膜炎は、治療対象の消化管（ＧＩ）の粘膜の薄膜化と潰よう化の概念を含み、例えば、紅斑性火傷型病変として、又は不規則的で且つ集中性乃至散在性である潰よう性病変として現われることを含む。例えば、紅斑性粘膜炎は、化学療法又は放射線療法に露出した後、わずか３日ぶりに、より一般的には、５日〜７日内に現われ、潰よう性粘膜炎への進行は、通常、化学療法を始めてから７日内に起こり、場合によっては、薬物治療を中断しなければならないほどにひどくなる。

本願に使用された用語「粘膜炎」は、口腔と口腔咽頭部はもちろん、口から肛門に至るまでの胃腸管を含めた消化器粘膜炎（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）及び膣の粘膜炎を含むものであって、消化器粘膜炎は、口腔粘膜炎及び／又は腸炎（腸の炎症、特に小腸の炎症）を含み、消化管粘膜炎は、食道炎（食道の炎症）、咽頭粘膜炎、口内炎（胃の炎症）及び／又は直腸炎（直腸の炎症）を含む。

本発明の一具現例として、粘膜炎を保有するか、又は粘膜炎が発生する危険がある対象に対して、本発明の化合物を治療学的有効量で一つ以上の消化管領域に投与することを含む。

本発明は、抗癌療法（放射線療法又は化学療法）により体重減少がある場合、所望しない体重減少を防止するために、「体重減少の防止及び／又は予防」のために使用され得る。

したがって、本発明は、放射線療法及び／又は化学療法を受ける対象の粘膜炎及び／又は体重減少予防まで拡張される。

本発明において、粘膜炎及び／又は体重減少は、化学的損傷、生物学的損傷、放射線又はこれらの混合に露出した対象で発生し得、放射線露出は、抗癌治療のための放射線療法等から発生し得、又は偶然な放射線露出又はテロリスト攻撃による放射線露出により発生することもできる。また、本発明の組成物、方法及び用途は、宇宙旅行の前又は後、粘膜炎及び／又は体重減少を予防、治療又は改善するために対象に投与することに関連する。

対象が粘膜炎及び／又は体重の減少の進行を誘発又は招来できる損傷を被る前に、投与され得、対象が損傷を被った後、粘膜炎及び／又は対象の体重減少の開始及び発生の前に投与され得る。

本発明において、「粘膜炎の予防及び治療」は、粘膜炎発病の抑制や予防、治療、以外にも、胃腸管粘膜炎を有しないが、発病の危険がある（例えば放射線及び／又は抗癌療法で以前に治療を受けたか、現在受けているか、及び受ける予定がある癌患者及び他の患者）症状の治療又は予防、その他の癌治療から起因する粘膜炎の悪化の軽減等を含む。

したがって、本発明は、ネクロックス、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防及び治療用薬学組成物を提供する。

前記薬学組成物の適用対象は、特に限定されるものではないが、好ましくは、家畜、人間等を含む哺乳動物であることができる。

前記薬学組成物は、人間等を含む哺乳動物に摂取させることによって、粘膜炎を予防でき、また、粘膜炎を治療できる。

本発明の有効成分は、組成物の全重量に対して０．１〜９９重量％で含むことができ、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。

本発明による薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤又は希釈剤を含むことができ、当業界において通常製造されるいずれの剤形にも製造され得る（例：文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）。

本発明による薬学組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用され得る。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を使用して調剤される。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記化合物は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を交ぜて調剤する。また。単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当し、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれることができる。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が使用され得る。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用され得る。

前記薬学組成物は、鼠、マウス、家畜、人間等の哺乳動物に多様な経路で投与され得る。投与のすべての方式は、予想され得るが、一例として、経口、皮膚外用又は腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射注入方式等を選択できる。

また、本発明の組成物は、粘膜炎予防及び／又は治療のために、単独で、又は手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用し得る。

また、本発明は、治療上の有効量のネクロックス（ＮｅｃｒｏＸ）、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を対象体に投与することを含む粘膜炎予防又は治療方法を含む。

ここで使用された用語「対象体」は、治療、観察又は実験の対象である哺乳動物を言い、好ましくは、人間を言う。

ここで使用された用語「治療上有効量」は、研究者、獣医、医者又はその他臨床医により考えられる組織系、動物又は人間において生物学的又は医学的反応を誘導する有効成分又は薬学的組成物の量を意味するものであって、これは、治療される疾患又は障害の症状の緩和を誘導する量を含む。本発明の有効成分に対する治療上有効量及び投与回数は、所望の効果によって変化することは、当業者に自明である。したがって、投与される最適の投与量は、当業者により容易に決定され得、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率等によってその範囲が多様である。本発明の治療方法において、大人の場合、本発明のネクロックスを１日１回〜数回投与時、約０．３〜３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３〜３０ｍｇ／ｋｇの容量で投与することが好ましい。

本発明の治療方法において本発明のネクロックス、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含む組成物は、目的する方法によって経口投与するか、又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用）できる。

また、本発明は、粘膜炎予防又は治療用組成物の製造のためのネクロックス、薬学的に許容されるその塩又はその異性体の用途を提供する。

また、本発明による薬学組成物は、抗癌治療のために、放射線処理又は化学的処理のような抗癌治療中に発生し得る粘膜炎を予防及び／又は治療可能なので、抗癌剤と併用して抗癌補助剤としても使用できる。

本発明において、「抗癌補助剤」は、抗癌剤に対する敏感性を増進させ、抗癌治療により発生する副作用、例えば、粘膜炎の予防及び／又は治療だけでなく、抗癌治療による活性を増加させるものであって、抗癌活性補助剤としての役目をすることができる。

本発明において言及される抗癌剤は、アルキル化剤、抗代謝薬物、抗生剤、植物アルカロイド、分子標的薬物、ホルモン、白金錯体、アンチセンス、抗体及びＲＮＡｉよりなる群から選択される。

抗癌剤の例示は、アルキル化剤、例えばシクロホスファミド及びブスルファン；抗代謝薬物、例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、アザチオプリン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール及びシトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ）；抗生剤、例えばブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、アドリアマイシン及びアクチノマイシンＤ；植物アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド及びイリノテカン；分子標的薬物、例えばイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ オゾガマイシン、ベバシズマブ及びセツキシマブ；ホルモン、例えばプレドニゾロン、ジエチルスチルベストロール及びタモキシフェン；白金錯体、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン；アンチセンス、例えばｂｃｌ−２アンチセンス、例えばＧ３１３９、ｈｓｐ２７アンチセンス、例えばＯＧＸ４２７、ＸＩＡＰアンチセンス、例えばＡＥＧ３５１５６、ＰＫＣ−アルファアンチセンス、例えばＬＹ９００００３、低酸素症誘導性因子アンチセンス、例えばＥＺＮ−２９６８；抗体、例えばＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ、Ｈｅｒ２抗体、例えばトラスツズマブ、ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ、ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ：ＲＮＡｉ、例えばＲＮＡｉ標的化リボヌクレオチドレダクターゼ、例えばＣＡＬＡＡ−０１である。抗癌剤の好ましい例示は、５−ＦＵ、テガフール及びシスプラチンを含む。

本発明の組成物とともに使用するに適切な化学治療剤は、例えばビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）のような類似分裂抑制剤；シスプラチン、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）及びシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）のようなアルキル化剤；パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はその他タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）のような微小管アセンブリ抑制剤；５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）及びヒドロキシウレアのような代謝拮抗剤；アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）及びブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）のようなインターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）抗生剤；トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のような免疫刺激剤；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）のようなＤＮＡ合成抑制剤；アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）のような酵素；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）のようなトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）抑制剤；インターフェロンのような生体反応調節物質；及び抗ホルモン剤、例えばタモキシフェンのようなアンチエストロゲン（ａｎｔｉｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）、又は（４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）−プロピオンアニリドのようなアンチアンドロゲン（ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎｓ）及びその他治療剤及び例えば［ＤｅＶｉｔａ、Ｖ．Ｔ．，Ｊｒ．，Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．；ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９７）］に記載されている主要成分物質から選択される一つ以上のその他抗癌物質を含む。

また、本発明は、前記組合医薬の投与方法を提供する。実施例において、本発明の化合物及び化学治療剤を連続的に、同時に又は異なる投与ルートを介して各々提供される。また、前記化合物及び化学治療剤は、例えば固体及び液体形態のように同一又は相異な形態であることができる。前記方法は、本発明の化合物を化学治療剤とともに同時に投与することを含むことができる。実施例において、本発明の化合物は、化学治療剤と連続的に対象に投与され得るる。同時に投与される場合、一実施例において、本発明の化合物は、化学治療剤より先に投与され得る。また、他の実施例において、本発明の化合物は、化学治療剤より後で投与され得る。一実施例において、化学治療剤は、本発明の化合物と分離して提供される。

本発明の一具現例として、化学治療剤及び本発明の化合物は、併用投与される。併用投与は、これら成分が組成物として、又は同一の単一投与分の一部として一緒に投与されることを意味する。本願において使用される用語「併用投与」は、また、前記成分が分離されて投与されるが、治療療法又は治療プログラムの一部として投与されることをも意味する。一実施例において、前記成分は、同時に対象に投与される。しかし、成分は、分離された投薬又は投薬剤形として分離されて投与されてもよい。成分が分離されて投与される場合、成分の併用投与が、時間、頻度、投薬、又は成分の投与手順に制限を加えない。

本発明において抗癌補助剤投与対象の癌腫は、頭頚部癌、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）及び大腸癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）等であることができるが、これに制限されない。
また、本発明は、ネクロックス、薬学的に許容されるその塩又はその異性体を有効成分として含有する粘膜炎予防又は改善用食品組成物を提供する。

前記食品組成物の適用対象は、特に限定されるものではないが、好ましくは、家畜、人間等を含む哺乳動物であることができる。

前記有効成分を添加できる食品としては、一例として、各種食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類等がある。

食品又は飲料中の前記ネクロックスの量は、全体食品重量の０．０１〜５０重量％で加えることができ、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準に０．０１〜５０ｇの比率で加えることができるが、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。

本発明の健康機能性飲料組成物は、有効成分を含有すること以外には、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように、さまざまな香味剤又は天然炭水化物等を追加成分として含有できる。前記以外に、本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド性増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含有できる。

前記食品組成物には、人間が摂取する食品だけでなく、動物の飼料組成物を含むことができる。

前記飼料添加剤は、さらに、家擒類及び家畜等に許容される担体を含有できる。本発明においては、前記飼料添加剤をそのまま、又は公知の担体、安定剤等を添加でき、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸類、ミネラル等の各種養分、抗酸化剤、抗生物質、抗菌剤及びその他の添加剤等を添加することもでき、その形状としては、粉体、顆粒、ペレット、懸濁液等の適当な状態であることができる。

本発明の飼料添加剤を供給する場合は、家擒類及び家畜等に対して単独で又は飼料に混合して供給し得る。

以下、本発明に係る実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明の範囲が下記提示された実施例によって制限されるものではない。

実施例１：粘膜炎マウスモデル設立及びＮｅｃｒｏＸ治療効果
ＮｅｃｒｏＸ−７（（テトラヒドロピラン−４−イル）−［２−フェニル−５−（１、１−ジオキソ−チオモルフォリン−４−イル）メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アミン）をＬＧ生命科学から入手した。動物モデルとしては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋ）マウス７〜９週齢を使用し、１１００ｃＧｙで全身放射線を照射し、腸粘膜の損傷を起こす粘膜炎モデルを設立した。このような粘膜炎モデルにＮｅｃｒｏＸ−７投与による効果を生存率、体重、腸機能に関して比較分析した。

本実験では、放射線誘発粘膜炎マウスモデルを用いてＮｅｃｒｏＸによる粘膜炎の抑制効果を観察した。

（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋ）マウスを使用して粘膜炎を誘導するために、１Ｇｙ／ｍｉｎ線量率で１１００ｃＧｙ（放射線ソース：Ｘ−ｒａｙ Ｍｅｖａｔｒｏｎ ＭＸＥ−２）の強力な放射線の照射を実施した。また、ＮｅｃｒｏＸ−７を０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの容量で５回投与して比較した。このような実験結果より、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理したグループが、そうでないグループに比べて生存率が増加し、体重減少を抑制したことが分かる［図１］。

放射線による腸粘膜炎の誘導は、腸出血及び大便生成障害という副作用が発生する。したがって、本実験では、高線量の１１００ｃＧｙの放射線を照射し、粘膜炎モデルを設立し、ＮｅｃｒｏＸ−７を容量別に総５回処理し、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しないグループと比較した。ＮｅｃｒｏＸ−７による放射線誘導腸粘膜炎に対する保護効果を確認した。

その結果、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理せず、放射線の照射（粘膜炎）を受けたグループでは、腸の長さが減少し、大便の生成が大きく減少することを確認した。これに対し、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理したグループでは、正常腸と同様な程度に腸が保護されていることを確認した［図２］。

実施例２：組織学的腸機能保護効果確認
パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で３回処理し、パラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノールで段階的に含水した。０．５％過酸化水素で内因性過酸化酵素（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去した後、正常ヤギの血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に製造会社の指示に基づいて希釈し、１時間反応させた。前記研究で発現の差異を示す遺伝子に対して発現蛋白に対する一次抗体反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、３％ＢＳＡに希釈した５μｇ／ｍｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧに３０分間反応させ、３回ＴＢＳで洗浄した。３μｇ／ｍｌ ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、ＤＡＢと過酸化水素を利用して発色した後、マイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）や１％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対比染色した。

放射線の照射による粘膜炎は、腸組織の絨毛破壊を誘発する。組織学的所見でも、腸組織のＨ＆Ｅ染色（パラフィン包埋組織を３μｍの切片に薄切し、スライドに付着した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）に５分ずつ２回漬ける脱パラフィン過程後、１００％エタノールに５分間２回、９０％、８０％、７０％エタノールに５分ずつ漬けた後、流水中で水洗した。マイヤーのヘマトキシリン溶液で８分間染色し、流水中で水洗したあと、７０％、８０％、９０％、１００％エタノールに漬けた後、１００％エタノールに５分、キシレンに５分ずつ２回漬けた後、封入し、顕微鏡で観察）結果、Ｎｅｃｒｏｘを処理しない粘膜炎グループでは、腸の絨毛及び粘膜破壊所見（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ染色を実施し、光学顕微鏡で観察した結果、放射線の照射後、腸で絨毛（ｖｉｌｌｉｓ）が破壊され、陰窩（ｃｒｙｐｔ）部位内の細胞においての核萎縮、染色質の凝縮と細胞性分節等の形態学的変化を示す）を示したが、Ｎｅｃｒｏｘ−７３０ｍｇ／ｋｇを処理したグループでは、正常な腸組織所見と同様であることを観察した［図３］。

実施例３：放射線による細胞増殖抑制に対するＮｅｃｒｏＸの効果
ＩＨＣ染色を用いて細胞増殖（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を確認した。マウス組織を得る前に、マウスにＢｒＤＵ標識試薬（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ５−ｆｌｕｒｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）をｍｉｃｅ当たり２０ｇ注射した後、２時間以内に腸組織を摘出し、パラフィンブロックを製作した。パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で３回処理してパラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノールで段階的に含水する。０．３％過酸化水素で内因性過酸化酵素（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去した後、正常ヤギの血清で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に製造会社の指示に基づいて希釈し、１時間反応させた。前記研究で発現の差異を示す遺伝子に対して発現蛋白に対する一次抗体反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、３％ＢＳＡに希釈した５μｇ／ｍｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧに３０分間反応させ、３回ＴＢＳで洗浄した。３μｇ／ｍｌ ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、ＤＡＢと過酸化水素を利用して発色した後、ヘマトキシリンや１％メチルグリーンで対比染色した。その結果、対照群と異なって、ＮｅｃｒｏＸ−７ ３０ｍｇ／ｋｇで細胞増殖が円滑に行われていることを確認した［図４］。

実施例４：生体外で放射線の照射による正常細胞及び腫瘍細胞に及ぶ影響
粘膜炎は、腫瘍治療のための放射線又は抗癌治療により誘発される一般的な副作用である。そのため、粘膜炎治療剤の有効性を確認するためには、腫瘍の増殖に及ぶ影響を評価しなければならない。正常細胞、腫瘍細胞を、それぞれ８００ｃＧｙ放射線照射をした後、ＮｅｃｒｏＸ−７を容量別に処理し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接種した後、３７℃、５％ＣＯ_２で３日間培養した後、細胞の増殖をＭＴＴ分析を用いて確認した。３日培養後、ＭＴＴ溶液を入れ、３時間反応し、５４０ｎＭ吸光度で測定した

その結果、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理したとき、大部分の癌細胞株においては、腫瘍細胞の増殖が抑制されるか又は減少するが、正常細胞においては、放射線誘導−細胞死を保護することを確認した［図５］。

実施例５：ＮｅｃｒｏＸ−７によるミトコンドリア内での酸化的ストレス調節
活性酸素（ＲＯＳ）は、一般的に細胞内ミトコンドリア呼吸過程中に酸素の不完全燃焼により生じるが、放射線又は抗癌治療を受ける場合、ＲＯＳが大きく増加する。これより、本研究者は、放射線治療により増加したＲＯＳにＮｅｃｒｏＸ−７が及ぶ影響を腸上皮細胞（ＩＥＣ−６）で確認した。

ＮｅｃｒｏＸ−７が正常環境でＩＥＣ−６細胞増殖能力に及ぶ影響を把握するために、ＩＥＣ−６細胞を各濃度（５ｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ）で３０分間ＮｅｃｒｏＸ−７を処理した後、培地を交替し、２日後、生存細胞数をＭＴＳ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）分析法で測定した。ＮｅｃｒｏＸ−７の濃度によって細胞の増殖にほとんど影響がなかった。

ＮｅｃｒｏＸ−７が、放射線の照射後、細胞の増殖能力に及ぶ影響を照射するために、ＮｅｃｒｏＸ−７を濃度別に３０分間処理した後、培地を交替し、放射線を照射した２日後、ＭＴＳ分析法で測定した結果、ＮｅｃｒｏＸ−７ ２０ｕＭ、４０ｕＭで生存細胞の数が有意に増加した。ＣＭ−Ｈ２ＲＯＳ染色を用いたミトコンドリア内における活性酸素を測定した結果、放射線により増加したミトコンドリア内における活性酸素をＮｅｃｒｏＸ−７が大きく抑制していることを確認した［図６］。

実施例６：抗癌治療による粘膜炎マウスモデル設立及びＮｅｃｒｏＸ治療効果
動物モデルとしては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋ）マウス７〜９週齢を使用し、５−ＦＵ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）５０ｍｇ／ｋｇを５日間毎日腹腔内注射し、口腔及び腸粘膜の損傷を起こす粘膜炎モデルを設立した。このような粘膜炎モデルにＮｅｃｒｏＸ−７投与による効果を生存率、体重、腸機能に関して比較分析した。

本実験では、抗癌剤誘発粘膜炎マウスモデルを用いてＮｅｃｒｏＸ−７による粘膜炎の抑制効果を観察した。

Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｋ）マウスを使用して口腔及び腸粘膜炎を誘導するために、５−ＦＵを５０ｍｇ／ｋｇの容量で５回腹腔内注射した。また、ＮｅｃｒｏＸ−７を０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの容量で５回静脈投与して比較した。このような実験結果より、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理したグループが、そうでないグループに比べて生存率が増加し、体重減少を抑制したことが分かる［図７］。

実施例７：組織学的口腔及び腸保護効果確認
パラフィンに包埋された組織から４μｍの連続切片を得て、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で３回処理してパラフィンを除去し、９５％、９０％、７０％エタノールで段階的に含水した。０．５％過酸化水素で内因性過酸化酵素（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を除去した後、正常ヤギの血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で３０分間処理し、一次抗体を３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）に製造会社の指示に基づいて希釈し、１時間反応させた。前記研究で発現の差異を示す遺伝子に対して発現蛋白に対する一次抗体反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、３％ＢＳＡに希釈した５μｇ／ｍｌ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧに３０分間反応させ、３回ＴＢＳで洗浄した。３μｇ／ｍｌ ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ）で３０分間放置させ、ＤＡＢと過酸化水素を利用して発色した後、マイヤー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）や１％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対比染色した。

抗癌剤による粘膜炎は、舌と口腔粘膜の表皮層を萎縮させ、炎症細胞及び壊死細胞の浸潤を示す。また、腸出血及び腸組織の絨毛破壊を誘発する。組織学的所見でも、舌と腸組織のＨ＆Ｅ染色（パラフィン包埋組織を３μｍの切片に薄切し、スライドに付着した後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）に５分ずつ２回漬ける脱パラピン過程後、１００％エタノールに５分間２回、９０％、８０％、７０％エタノールに５分ずつ漬けた後、流水中で水洗した。マイヤーのヘマトキシリン溶液で８分間染色し、流水中で水洗後、７０％、８０％、９０％、１００％エタノールに漬けた後、１００％エタノールに５分、キシレンに５分ずつ２回漬けた後、封入し、顕微鏡で観察）結果、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎グループでは、舌と口腔粘膜の表皮層が萎縮され、炎症細胞及び壊死細胞の浸潤が現われたが、ＮｅｃｒｏＸ−７ ３０ｍｇ／ｋｇを処理したグループでは、正常な組織と同様な所見を観察した。また、ＮｅｃｒｏＸ−７を処理しない粘膜炎グループでは、腸の絨毛及び粘膜破壊所見を示したが、Ｎｅｃｒｏｘ−７を処理したグループでは、正常な舌及び腸組織所見と同様であることを観察した［図８、図９］。

実施例８；ＮｅｃｒｏＸ−７と化学治療剤との併用投与効果確認
ヒト腫瘍細胞を各濃度（５ｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ）で３０分間ＮｅｃｒｏＸ−７を処理した後、化学治療剤である５−ＦＵ（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）が含まれているか、又は含まれない培地に交替し、９６−ウェル（ｗｅｌｌ）型プレートに敷設し、３日後、生存細胞数をＭＴＳ（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）分析法で測定した。

その結果、図１０に示されたように、ＮｅｃｒｏＸ−７単独処理時、濃度依存的に抗癌効果が現われた。また、５−ＦＵ単独で処理した腫瘍細胞株よりＮｅｃｒｏＸ−７と５−ＦＵを併合処理した腫瘍細胞株において単独よりさらに高い細胞死滅効果を示している。

Claims (5)

1. ネクロックス−７（ＮｅｃｒｏＸ−７）、薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有する粘膜炎予防又は治療用薬学組成物。
2. 前記粘膜炎は、放射線療法により誘発されるものである、請求項１に記載の粘膜炎予防又は治療用薬学組成物。
3. 前記粘膜炎は、化学療法により誘発されるものである、請求項１に記載の粘膜炎予防又は治療用薬学組成物。
4. ネクロックス−７（ＮｅｃｒｏＸ−７）、薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有する粘膜炎予防又は改善用食品組成物。
5. 前記粘膜炎は、放射線療法又は化学療法により誘発されるものである、請求項４に記載の粘膜炎予防又は改善用食品組成物。