KR20160052409A

KR20160052409A - 네크록스를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160052409A
Application number: KR1020150152916A
Authority: KR
Inventors: 조석구; 임건일; 임정연; 김나연; 남영선; 이은솔
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2016-05-12
Anticipated expiration: 2035-11-02
Also published as: KR101718380B1; US10272092B2; ES2842431T3; PL3216452T3; CN107073009B; EP3216452A2; US20170319592A1; EP3216452A4; JP2017535604A; JP6464277B2; CN107073009A; EP3216452B1

Abstract

본 발명은 네크록스를 함유하는 점막염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 네크록스는 방사선 또는 화학 치료 요법에 의한 질병의 사망률을 네크록스 투여 그룹에서 연장시켰으며, 장 기능을 보호하는 효과를 나타내고, 방사선 또는 항암 치료에 의한 장점막의 파괴를 억제하였으며, 장에 존재하는 세포 증식 효과도 확인함으로써 상기 네크록스를 함유하는 점막염 예방 및 치료용 약학 조성물, 항암보조제 또는 식품 조성물로 활용할 수 있다.

Description

네크록스를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 또는 치료용 조성물{Pharmaceutical composition comprising NecroX for preventing or treating mucositis}

본 발명은 네크록스를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

점막염은 주로 암환자를 대상으로 하는 방사선 및 화학 치료 요법에 의해 발생되는 부작용으로, 점막 또는 소화관을 덮고 있는 점막내층에 염증이 발생한 상태를 의미한다.

점막염의 증상은 세포치사에 의해 점막내층이 얇아지고, 벗겨져 염증이 생겨 궤양이 발생하는 것이다. 이러한 병변은 극히 고통스러우며, 식도, 위, 소장, 대장 및 직장을 포함하여, 구강에서부터 항문까지의 소화관 내의 부위에서 발생할 수 있다. 점막염 발생은 환자의 삶의 질을 떨어뜨린다. 점막염에 의한 구강 내 심각한 통증은 불충분한 영양섭취로 이어지고 면역기능 저하를 유발한다. 심지어 암치료를 중단해야 하는 심각한 상황에 이르게 할 수 있다. 하지만, 현재 사용되고 있는 치료방법들은 점막염을 효과적으로 예방하고 극복 가능한 접근 방법이 부족한 실정이다.

네크록스(necroxX)는 LG 생명과학에서 개발한 미토콘드리아에 특이적인 세포괴사 억제제로서, 독소나 스트레스로 인한 세포사의 억제 효과, 세포 생존능력의 증대 효과, 항산화 효과를 동시에 나타내는 혁신적인 물질로 주목받고 있다. 네크록스는 인간 폐섬유아세포(LB-HEL cell)에 저온 손상을 24시간 동안 가한 다음 네크록스를 처리한 경우 저온 손상에 의해 유발되는 세포사에 대해 보호 효과가 있으며, t-BHP(tertbutylhydroperoxide)에 의해 유도되는 세포괴사를 막는 효과가 있다고 보고되어 있다[비특허문헌 1, 2]. 특히, 네크록스-7은 산화적 스트레스와 아세트아미노펜에 의해 유도된 세포괴사에 대해 보호작용이 있고, 마우스 모델에서 사염화탄소에 의하여 유발된 간 손상을 예방하는 효과가 있으며, 허혈성 재관류로 인한 간 손상을 효과적으로 억제한다고 보고되어 있다[비특허문헌 3].

또한, 네크록스는 암 전이 억제 효과도 입증된 바 있다[특허문헌 1].

국내 특허 공개 제 2013-0088720호

Kim et al., Arch Pharm Res. 2010 Nov; 33(11) 1813-23 Choi et al., Transplant Proc. 2010 Nov; 42(9) 3414-21 Park et al., Antioxid Redox Signal. 2013 May 10;18(14) 1713-22

이에, 본 발명자들은 방사선 또는 화학 치료 요법에 의해 유발되는 점막염 모델에서 네크록스(NecroX)의 처리에 따른 점막 보호 효과 구강 및 장점막의 파괴 억제 효과, 장에 존재하는 세포 증식 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 방사선 또는 화학 치료 요법에 의해 유발되는 점막염 모델에서 네크록스의 처리에 따른 점막 보호 효과를 확인한 결과, 방사선 또는 화학 치료 요법에 의한 질병의 사망률을 네크록스 투여 그룹에서 연장시켰으며, 체중 감소를 줄이는데 효능이 있었다. 또한, 장의 기능을 확인한 결과, 대변 생성률이 정상 그룹과 유사할 정도로 보호되고 있었고, 방사선에 의한 장점막의 파괴를 억제하였으며, 장에 존재하는 세포의 증식률에도 기여를 하고 있었다.

도 1의 A는 방사선 유발 점막염 동물모델을 설립하기 위한 실험 디자인을 보여주는 도표이고, B는 방사선 유발 점막염 동물 모델에 NecroX-7을 투여 후, 생존율과 체중을 나타낸 그래프이다.
도 2는 점막염 동물 모델에 NecroX-7을 투여 후, 장기능 보호 효과를 나타낸 사진이다.
도 3은 NecroX-7을 처리하지 않은 점막염 동물모델 및 NecroX-7을 처리한 점막염 마우스의 각 장(intestine) 조직의 H&E(hematocylin & eosin) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 NecroX-7을 처리하지 않은 점막염 동물모델 및 NecroX-7을 처리한 점막염 마우스의 각 장(intestine) 조직을 적출하고 면역조직 화학 검사(IHC:immunohistochemistry)를 통해 세포 증식(Bromodeoxyuridine)을 확인한 사진이다.
도 5는 NecroX-7이 방사선 조사에 의한 정상 세포와 암 세포에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 6은 NecroX-7이 방사선 조사 후 세포의 증식능력에 미치는 영향을 MTS 분석법과 CM-H2ROS 염색을 통한 미토콘드리아 내 활성산소를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 항암제 유발 점막염 동물모델을 설립하기 위한 실험 디자인을 보여주는 도표 및 항암제 유발 점막염 동물 모델에 NecroX-7을 투여 후, 생존율과 체중을 나타낸 그래프이다.
도 8은 NecroX-7을 처리하지 않은 점막염 동물모델 및 NecroX-7을 처리한 점막염 마우스의 각 혀 조직의 H&E(hematocylin & eosin) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 NecroX-7을 처리하지 않은 점막염 동물모델 및 NecroX-7을 처리한 점막염 마우스의 각 장(intestine) 조직의 H&E(hematocylin & eosin) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 인간 종양세포에서 NecroX의 항암보조제로서의 효과를 나타낸 것으로, NecroX-7을 농도별 단독 처리 시, 항암제 5-FU(fluorouracil) 단독 처리 시 그리고 5-FU와 NecoroX-7을 병합 처리 시 종양세포의 생존 세포수를 분석한 결과이다.

본 발명은 네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 네크록스(NecroX)는 한국특허공개 제10-2009-0018593호에 개시된 화합물로, 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 네크록스-1(NecroX-1), 네크록스-2(NecroX-2, [5-(1,1-다이옥소-티오모르포린-4-일메틸)-2-페닐-1H-인돌-7-일]-(1-메탄설포닐-피페리딘-4-일)-아민), 네크록스-5(NecroX-5, [5-(1,1-다이옥소-티오모르포린-4-일메틸)-2-페닐-1H-인돌-7-일]-(테트라하이드로-피란-4-일메틸)-아민), 네크록스-7(NecroX-7, 테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민) 및 네크록스-18(NecroX-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "약학적으로 허용되는 염"은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염이 포함된다. 또한, 약학적으로 허용되는 염기 부가염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화합물 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 이의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

본 명세서에서 '이성체(isomer)'는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 화합물 또는 그의 염을 의미한다. 본 발명에 따른 네크록스(NecroX)는 비대칭 탄소중심을 가질 수 있으므로, 광학 이성체(R 또는 S 이성체), 라세미체, 부분 입체 이성체 혼합물, 개개 부분 입체 이성체 등으로 존재할 수 있으며, 기하 이성체(트랜스, 시스형 이성체)도 존재할 수 있다. 이들 모든 이성체 및 그의 혼합물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 본 발명에 따른 화합물 네크록스(NecroX)의 약학적으로 허용되는 이의 염 및/또는 이의 이성체는 모두 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서는 방사선 및/또는 항암 치료에 의해 유발되는 점막염 모델에서 네크록스의 처리에 따른 점막 보호 효과를 확인하였다. 그 결과, 방사선에 의한 질병의 사망률을 네크록스 투여 그룹에서 연장시켰으며, 체중 감소를 줄이는데 효능이 있었다. 또한, 장의 기능을 확인한 결과 대변 생성률이 정상 그룹과 유사할 정도로 보호되고 있었고, 방사선에 의한 장점막의 파괴를 억제하였으며, 장에 존재하는 세포의 증식률에도 기여를 하고 있었다.

따라서, 본 발명의 네크록스는 방사선 또는 화학 치료 요법에 의해 유발되는 점막염을 치료할 수 있다.

본 발명에서 점막염은 치료 대상의 소화관(GI)의 점막의 박막화와 궤양화의 개념을 포함하며, 예컨대, 홍반성 화상형 병변으로서 또는 불규칙적이고 집중성 내지 산재성인 궤양성 병변으로 나타나는 것을 포함한다. 예를 들어, 홍반성 점막염은 화학 치료 요법 또는 방사선 치료에 노출된 후 불과 3일 만에, 보다 일반적으로는 5일 내지 7일 내에 나타나며, 궤양성 점막염으로의 진행은 통상은 화학 치료 요법을 시작한 지 7일 내에 일어나며 경우에 따라서는 약물 치료를 중단해야 할 정도로 심해진다.

본원에 사용된 용어 "점막염"은 구강과 구강 인두부는 물론 입에서 항문에 이르기까지의 위장관을 비롯한 소화기 점막염(alimentary mucositis) 및 질의 점막염을 포함하는 것으로, 소화기 점막염은 구강 점막염 및/또는 장염(장의 염증, 특히 소장의 염증)을 포함하며, 소화관 점막염은 식도염(식도의 염증), 인두 점막염, 구내염(위의 염증) 및/또는 직장염(직장의 염증)을 포함한다.

본 발명은 또한 점막염을 보유하거나 점막염이 발생할 위험이 있는 대상에 대해, 본 발명의 화합물을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 소화관 영역에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 항암 요법(방사선 또는 화학 치료 요법)에 의하여 체중 감소가 있는 경우, 원치 않는 체중 감소를 막기 위하여, "체중 감소의 방지 및/또는 예방"을 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 방사선 및/또는 화학 치료 요법을 받을 대상의 점막염 및/또는 체중 감소 예방까지 확장된다.

본 발명에 있어서, 점막염 및/또는 체중 감소는 화학적 손상, 생물학적 손상, 방사선 또는 이들의 혼합에 노출된 대상에서 발생할 수 있으며, 방사선 노출은 항암 치료를 위한 방사선 치료 요법 등으로부터 발생할 수 있고, 또는 우연한 방사선 노출 또는 테러리스트 공격에 의한 방사선 노출에 의해서 발생할 수도 있다. 또한, 본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 우주 여행 전 또는 후, 점막염 및/또는 체중 감소를 예방, 치료 또는 개선하기 위하여 대상에게 투여하는 것과 관련할 수도 있다.

대상이 점막염 및/또는 체중의 감소의 진행을 유발 또는 야기할 수 있는 손상을 입기 전에, 투여될 수 있으며, 대상이 손상을 입은 후, 점막염 및/또는 대상의 체중 감소의 개시 및 발생 전에 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, “점막염의 예방 및 치료”는 점막염 발병의 억제나 예방, 치료, 이외에도, 위장관 점막염을 갖지 않지만 발병의 위험이 있는 (예를 들면 방사선 및/또는 항암 요법으로 예전에 치료받았거나, 현재 받고 있거나, 및 받을 예정이 있는 암환자 및 다른 환자들) 증상의 치료 또는 예방, 그 외의 암 치료로부터 기인하는 점막염의 악화의 경감 등을 포함한다.

따라서, 본 발명은 네크록스, 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 약학 조성물은 인간 등을 포함한 포유동물에게 섭취하게 함으로써 점막염을 예방할 수 있으며, 또한, 점막염을 치료할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다 (예: 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA).

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 일례로, 경구, 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등을 선택할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 점막염 예방 및/또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법 등과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 네크록스의 일일 투여량은 약 0.3~30㎎/㎏, 바람직하게는 약 3~30㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 항암 치료를 위해 방사선 처리 또는 화학적 처리와 같은 항암 치료 중에 발생할 수 있는 점막염을 예방 및/또는 치료 가능하므로, 항암제와 병용하여 항암보조제로도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, ‘항암 보조제’는 항암제에 대한 민감성을 증진시키고, 항암치료에 의해 발생하는 부작용, 예컨대, 점막염의 예방 및/또는 치료 뿐만 아니라, 항암 치료에 의한 활성을 증가시키는 것으로, 항암 활성 보조제로서 역할을 할 수 있다.

본 발명에서 언급되는 항암제는 알킬화제, 항대사약물, 항생제, 식물 알칼로이드, 분자 표적 약물, 호르몬, 백금 착물, 안티센스, 항체 및 RNAi 로 이루어진 군으로부터 선택된다.

항암제의 예시는, 알킬화제, 예컨대 시클로포스파미드 및 부술판; 항대사약물, 예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 아자티오프린, 플루오로우라실 (5-FU), 테가푸르 및 싸이토신 아라비노시드 (ara-C); 항생제, 예컨대 블레오마이신, 미토마이신 C, 다우노루비신, 아드리아마이신 및 액티마이신 D; 식물 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포사이드 및 이리노테칸; 분자 표적 약물, 예컨대 이마티닙, 게피니팁, 엘로티닙, 소라페닙, 수니티닙, 트라스투주마브, 리툭시마브, 겜투주마브-오조가미신, 베바시주마브 및 세툭시마브; 호르몬, 예컨대 프레드니솔론, 디에틸스틸베스트롤 및 타목시펜; 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴 및 옥살리플라틴; 안티센스, 예컨대 bcl-2 안티센스, 예컨대 G3139, hsp27 안티센스, 예컨대 OGX427, XIAP 안티센스, 예컨대 AEG35156, PKC-알파 안티센스, 예컨대 LY900003, 저산소증 유도성 인자 안티센스, 예컨대 EZN-2968; 항체, 예컨대 CD20 항체, 예컨대 리툭시마브, Her2 항체, 예컨대 트라스투주마브, VEGF 항체, 예컨대 베바시주마브, EGFR 항체, 예컨대 세툭시마브: RNAi, 예컨대 RNAi 표적화 리보뉴클레오티드 리덕타아제, 예컨대 CALAA-01 이다. 항암제의 바람직한 예시는 5-FU, 테가푸르 및 시스플라틴을 포함한다.

본 발명의 조성물과 함께 사용하기 적절한 화학 치료제는, 예를 들면 빈블라스틴(vinblastine)과 같은 유사분열 억제제; 시스플라틴, 카르보플라틴(carboplatin) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 알킬화제; 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 기타 탁산(taxanes)과 같은 미세소관 어셈블리 억제제; 5-플루오로우라실, 카페시타빈(capecitabine), 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside) 및 하이드록시우레아와 같은 대사 길항제; 아드리아마이신(adriamycin) 및 블레오마이신(bleomycin)과 같은 인터컬레이팅(intercalating) 항생제; 트라스투주맙(trastuzumab)과 같은 면역자극제; 젬시타빈(gemcitabine)과 같은 DNA 합성 억제제; 아스파라기나아제(asparaginase)와 같은 효소; 에토포사이드(etoposide)와 같은 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제; 인터페론과 같은 생체 반응 조절물질; 및 항호르몬제, 예를 들면 타목시펜과 같은 안티오에스트로젠(antioestrogen), 또는 (4'-시아노-3-(4-플루오로페닐설포닐)-2-하이드록시-2-메틸-3'-(트리플루오로메틸)-프로피온아닐라이드와 같은 안티안드로겐(antiandrogens) 및 기타 치료제 및 예를 들면 [DeVita, V. T., Jr., Hellmann, S., Rosenberg, S. A.; in: Cancer: Principles &Practice of Oncology, 5th ed., Lippincott-Raven Publishers (1997)]에 기재되어 있는 주요 성분물질로부터 선택되는 하나 이상의 기타 항암 물질을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 조합 의약의 투여 방법을 제공한다. 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물 및 화학 치료제를 연속적으로, 동시에 또는 상이한 투여 루트를 통하여 각각 제공된다. 또한, 상기 화합물 및 화학 치료제는 예를 들면 고체 및 액체 형태와 같이 동일하거나 상이한 형태일 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 화합물을 화학 치료제와 함께 동시에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학 치료제와 연속적으로 대상에 투여될 수 있다. 동시에 투여되는 경우, 일 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학 치료제보다 먼저 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 화학 치료제보다 나중에 투여될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 화학 치료제는 본 발명의 화합물과 분리되어 제공된다.

본 발명의 일 구현예로서, 화학 치료제 및 본 발명의 화합물은 병용 투여된다. 병용투여는 이들 성분이 조성물로서 또는 동일한 단일 투여분의 일부로서 함께 투여되는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "병용 투여"는 또한, 상기 성분이 분리되어 투여되지만 치료 요법 또는 치료 프로그램의 일부로서 투여되는 것도 의미한다. 일 실시예에 있어서, 상기 성분들은 동시에 대상에게 투여된다. 그러나, 성분들은 분리된 투약 또는 투약 제형으로서 분리되어 투여될 수도 있다. 성분이 분리되어 투여되는 경우, 성분의 병용 투여가 시간, 빈도, 투약, 또는 성분의 투여 순서에 제한을 가하지 않는다.

본 발명의 항암 보조제 투여 대상의 암종은, 두경부암, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma), 백혈병(leukemia), 대장암(colon cancer), 방광암(bladder cancer), 난소암(ovarian cancer), 위암(gastric cancer), 폐암(lung cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer) 및 대장직장 암(colorectal cancer), 비호지킨림프종, 백혈병 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 네크록스, 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물의 적용대상은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 가축, 인간 등을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품으로는, 일례로 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

식품 또는 음료 중의 상기 네크록스의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.01 내지 50g의 비율로 가할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

상기 식품 조성물에는 인간이 섭취하는 식품뿐 아니라, 동물의 사료 조성물을 포함할 수 있다.

상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.

본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 점막염 마우스 모델 설립 및 NecroX 치료 효과

NecroX-7((테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민)을 엘지생명과학으로부터 입수하였다. 동물 모델로는 C57BL/6(H-2k) 마우스 7~9 주령을 사용하였으며, 1100cGy로 전신 방사선을 조사하여 장점막 손상을 일으키는 점막염 모델을 설립하였다. 이러한 점막염 모델에 NecroX-7 투여에 의한 효과를 생존율, 체중, 장 기능에 관하여 비교 분석하였다.

본 실험에서는 방사선 유발 점막염 마우스 모델을 통하여 NecroX에 의한 점막염의 억제 효과를 관찰하고자 하였다.

(A) C57BL/6(H-2k) 마우스를 사용하여 점막염을 유도하기 위해 1 Gy/min 선량률로 1100 cGy(방사선 소스: X-ray Mevatron MXE-2)의 강력한 방사선을 조사를 실시하였다. 그리고, NecroX-7을 0.3 mg/kg 또는 3 mg/kg 또는 30 mg/kg 용량으로 5번 투여하여 비교하였다. 이러한 실험 결과로, NecroX-7을 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비해 생존율이 증가하였고 체중 감소를 억제하였다[도 1].

방사선에 의한 장 점막염의 유도는 장 출혈 및 대변 생성 장애라는 부작용이 일어난다. 그러므로 본 실험에서는 고선량의 1100 cGy의 방사선을 조사하여 점막염 모델을 설립하였고, NecroX-7을 용량별로 총 5회 처리하여 NecroX-7을 처리하지 않은 그룹과 비교하였다. NecroX-7에 의한 방사선 유도 장 점막염에 대한 보호 효과를 확인하였다.

그 결과, NecroX-7을 처리하지 않고 방사선 조사(점막염)를 받은 그룹에서는 장의 길이가 줄고 대변 생성이 크게 감소됨을 확인하였다. 반면에, NecroX-7을 처리한 그룹에서는 정상 장과 유사할 정도로 장이 보호되고 있음을 확인하였다[도 2].

실시예 2: 조직학적 장 기능 보호 효과 확인

파라핀에 포매된 조직으로부터 4 ㎛의 연속 절편을 얻어 자일렌(xylene)에서 3회 처리하여 파라핀을 제거하고 95%, 90%, 70% 에탄올에서 단계적으로 함수하였다. 0.5% 과산화수소에서 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 제거한 후 정상 염소의 혈청(goat serum)으로 30분간 처리하고 일차 항체를 3% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS(phosphate buffer saline)에 제조 회사의 지시대로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 위의 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자에 대하여 발현 단백에 대한 일차항체 반응 후 TBS(Tris-buffer saline)에서 3번 세척하고 3% BSA에 희석한 5 ㎍/ml biotinylated anti-mouse/anti-rabbit IgG에 30분간 반응시키고 3회 TBS에서 세척하였다. 3 ㎍/ml HRP(horseradish peroxidase) 스트렙토아비딘(streptoavidin)에서 30분간 방치시키고, DAB와 과산화수소를 이용하여 발색한 후 Meyer's 헤마톡실린(hematoxylin) 이나 1% 메틸 그린(methyl green)에서 대조 염색하였다.

방사선 조사에 의한 점막염은 장 조직의 융모 파괴를 유발한다. 조직학적 소견에서도 장 조직의 H&E 염색(파라핀 포매 조직을 3㎛ 절편을 만들고 슬라이드에 부착한 뒤, 자일렌(xylene)에 5분씩 2번 거치는 탈파라핀 과정 후, 100% 에탄올에 5분간 2번, 90%, 80%, 70% 에탄올에 5분씩 거친 후 흐르는 물에서 세척하였다. Mayer's 헤마톡실린용액에서 8분간 염색하고 흐르는 물에 세척 후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올에 거친 후, 100% 에탄올에서 5분, 자일렌에 5분씩 2번을 거친 뒤 봉입하여 현미경에서 관찰) 결과, Necrox를 처리하지 않은 점막염 그룹에서는 장의 융모 및 점막 파괴 소견(Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰한 결과 방사선 조사 후 장에서 융모(villis)가 파괴되고, 음와(crypy) 부위 내 세포에서의 핵 위축, 염색질의 응축과 세포성 분절 등의 형태학적 변화를 보인다.)을 보였으나, Necrox-7 30 mg/kg을 처리한 그룹에서는 정상적인 장 조직 소견과 비슷함을 관찰하였다[도 3].

실시예 3: 방사선에 의한 세포증식 억제에 대한 NecroX의 효과

IHC 염색을 통해 세포증식(Bromodeoxyuridine)을 확인하였다. 마우스 조직을 얻기 전에 마우스에게 BrDU 표지 시약(5-bromo-2'-deoxyuridine and 5-fluro-2'-deoxyuridine)를 mice당 20 g 주사 후, 2시간 이내에 장 조직을 적출하여 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀에 포매된 조직으로부터 4 ㎛의 연속 절편을 얻어 자일렌(xylene)에서 3회 처리하여 파라핀을 제거하고 95%, 90%, 70% 에탄올에서 단계적으로 함수한다. 0.3% 과산화수소에서 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 제거한 후 정상 염소의 혈청으로 30분간 처리하고 일차 항체를 3% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS(phosphate buffer saline)에 제조 회사의 지시대로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 위의 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자에 대하여 발현 단백에 대한 일차항체 반응 후, TBS(Tris-buffer saline)에서 3번 세척하고 3% BSA에 희석한 5 ㎍/ml biotinylated anti-mouse/anti-rabbit IgG에 30분간 반응시키고 3회 TBS에서 세척하였다. 3 ㎍/ml HRP(horseradish peroxidase) 스트렙토아비딘(streptoavidin)에서 30분간 방치시키고 DAB와 과산화수소를 이용하여 발색한 후, 헤마톡실린이나 1% 메틸그린에서 대조 염색하였다. 그 결과, 대조군과 달리 NecroX-7 30 mg/kg에서 세포 증식이 원활하게 이루어지고 있는 것을 확인하였다[도 4].

실시예 4: 생체 외에서 방사선 조사에 의한 정상세포 및 종양세포에 미치는 영향

점막염은 종양 치료를 위한 방사선 또는 항암 치료에 의해 유발되는 일반적인 부작용이다. 그렇기 때문에 점막염 치료제의 유효성을 확인하기 위해서는 종양의 증식에 미치는 영향을 평가해야 한다. 정상 세포, 종양세포를 각각 800 cGy 방사선 조사를 한 후, NecroX-7을 용량별로 처리하고 96-well plate에 접종 후 37도, 5% CO₂에서 3일 동안 배양한 후 세포의 증식을 MTT 분석을 통해 확인하였다. 3일 배양 후 MTT 용액을 널고 3시간 반응하여 540nM 흡광도로 측정하였다

그 결과, NecroX-7을 처리했을 때 대부분의 암 세포주에서 종양 세포의 증식이 억제되거나 감소하는 반면 정상세포는 방사선 유도-세포 죽음을 보호하는 것을 확인하였다[도 5].

실시예 5: NecroX -7에 의한 미토콘드리아 내 산화적 스트레스 조절

활성산소(ROS)는 일반적으로 세포 내 미토콘드리아 호흡과정 중 산소의 불완전 연소에 의해 생겨나지만, 방사선 또는 항암 치료를 받는 경우 ROS가 크게 증가된다. 이에, 본 연구자들은 방사선 치료에 의해 증가된 ROS에 NecroX-7이 미치는 영향을 장상피세포(IEC-6)에서 확인하였다.

NecroX-7가 정상 환경에서 IEC-6 세포 증식능력에 미치는 영향을 파악하기 위하여, IEC-6 세포를 각 농도(5uM, 10uM, 20uM, 40uM)로 30분 NecroX-7을 처리한 후 배지를 교체하고 2일 후 생존 세포수를 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석법으로 측정하였다. NecroX-7의 농도에 따라 세포의 증식에 거의 영향이 없었다.

NecroX-7가 방사선 조사 후 세포의 증식능력에 미치는 영향을 조사하기 위해, NecroX-7을 농도별로 30분 처리한 후 배지를 교체하고 방사선 조사한 2일 후 MTS분석법으로 측정한 결과, NecroX-7 20uM, 40uM에서 생존세포의 수가 유의하게 증가되었다. CM-H2ROS 염색을 통한 미토콘드리아 내 활성산소를 측정한 결과, 방사선에 의해 증가된 미토콘드리아 내 활성산소를 NecroX-7가 크게 억제하고 있음을 확인하였다[도 6].

실시예 6: 항암 치료에 의한 점막염 마우스 모델 설립 및 NecroX 치료 효과

동물 모델로는 C57BL/6(H-2k) 마우스 7~9 주령을 사용하였으며, 5-FU(5-fluorouracil) 50 mg/kg를 5일 동안 매일 복강 내 주사하여 구강 및 장점막 손상을 일으키는 점막염 모델을 설립하였다. 이러한 점막염 모델에 NecroX-7 투여에 의한 효과를 생존율, 체중, 장 기능에 관하여 비교 분석하였다.

본 실험에서는 항암제 유발 점막염 마우스 모델을 통하여 NecroX-7에 의한 점막염의 억제 효과를 관찰하고자 하였다.

C57BL/6(H-2k) 마우스를 사용하여 구강 및 장 점막염을 유도하기 위해 5-FU를 50mg/kg 용량으로 다섯 번 복강 내 주사를 하였다. 그리고, NecroX-7을 0.3 mg/kg 또는 3 mg/kg 또는 30 mg/kg 용량으로 5번 정맥 투여하여 비교하였다. 이러한 실험 결과로, NecroX-7을 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹에 비해 생존율이 증가하였고 체중 감소를 억제하였다[도 7].

실시예 7: 조직학적 구강 및 장 보호 효과 확인

파라핀에 포매된 조직으로부터 4 ㎛의 연속 절편을 얻어 자일렌(xylene)에서 3회 처리하여 파라핀을 제거하고 95%, 90%, 70% 에탄올에서 단계적으로 함수하였다. 0.5% 과산화수소에서 내인성 과산화효소(endogenous peroxidase)를 제거한 후 정상 염소의 혈청(goat serum)으로 30분간 처리하고 일차 항체를 3% BSA(bovine serum albumin)가 포함된 PBS(phosphate buffer saline)에 제조 회사의 지시대로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 위의 연구에서 발현의 차이를 보이는 유전자에 대하여 발현 단백에 대한 일차항체 반응 후 TBS(Tris-buffer saline)에서 3번 세척하고 3% BSA에 희석한 5 μg/ml biotinylated anti-mouse/anti-rabbit IgG에 30분간 반응시키고 3회 TBS에서 세척하였다. 3 μg/ml HRP(horseradish peroxidase) 스트렙토아비딘(streptoavidin)에서 30분간 방치시키고, DAB와 과산화수소를 이용하여 발색한 후 Meyer's 헤마톡실린(hematoxylin)이나 1% 메틸 그린(methyl green)에서 대조 염색하였다.

항암제에 의한 점막염은 혀와 구강점막의 표피층을 위축시키고 염증세포 및 괴사세포의 침윤을 나타낸다. 또한, 장 출혈 및 장 조직의 융모 파괴를 유발한다. 조직학적 소견에서도 혀와 장 조직의 H&E 염색(파라핀 포매 조직을 3㎛ 절편을 만들고 슬라이드에 부착한 뒤, 자일렌(xylene)에 5분씩 2번 거치는 탈파라핀 과정 후, 100% 에탄올에 5분간 2번, 90%, 80%, 70% 에탄올에 5분씩 거친 후 흐르는 물에서 세척하였다. Mayer's 헤마톡실린 용액에서 8분간 염색하고 흐르는 물에 세척 후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올에 거친 후, 100% 에탄올에서 5분, 자일렌에 5분씩 2번을 거친 뒤 봉입하여 현미경에서 관찰) 결과, NecroX-7을 처리하지 않은 점막염 그룹에서는 혀와 구강 점막의 표피층이 위축되고 염증세포 및 괴사세포의 침윤이 나타났지만, NecroX-7 30 mg/kg을 처리한 그룹에서는 정상적인 조직과 유사한 소견을 관찰하였다. 또한, NecroX-7을 처리하지 않는 점막염 그룹에서는 장의 융모 및 점막 파괴 소견을 보였으나, Necrox-7를 처리한 그룹에서는 정상적인 혀 및 장 조직 소견과 비슷함을 관찰하였다[도 8, 9].

실시예 8; NecroX -7과 화학 치료제와의 병용 투여 효과 확인

인간 종양세포를 각 농도(5uM, 10uM, 20uM, 40uM)로 30분 NecroX-7을 처리한 후 화학 치료제인 5-FU(fluorouracil)가 포함되어 있거나 포함되지 않은 배지로 교체하여 96-웰(well)형 플레이트에 깔고 3일 후 생존 세포수를 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 분석법으로 측정하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 NecroX-7 단독 처리 시 농도 의존적으로 항암 효과가 나타났다. 또한, 5-FU 단독으로 처리한 종양세포주 보다 NecroX-7과 5-FU를 병합 처리한 종양 세포주에서 단독 보다 더 높은 세포사멸 효과를 보여 주고 있다.

Claims

네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 네크록스는 네크록스-1(NecroX-1), 네크록스-2(NecroX-2), 네크록스-5(NecroX-5), 네크록스-7(NecroX-7) 및 네크록스-18(NecroX-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 점막염 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 점막염은 방사선 요법에 의해 유발되는 것인 점막염 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 점막염은 화학 치료 요법에 의해 유발되는 것인 점막염 예방 및 치료용 조성물.
네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이성체를 유효성분으로 함유하는 항암보조제.
제 5 항에 있어서,
상기 네크록스는 네크록스-1(NecroX-1), 네크록스-2(NecroX-2), 네크록스-5(NecroX-5), 네크록스-7(NecroX-7) 및 네크록스-18(NecroX-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 항암보조제.
네크록스(NecroX), 약학적으로 허용되는 이의 염 또는 이의 이성체를 유효성분으로 함유하는 점막염 예방 및 치료용 식품 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 네크록스는 네크록스-1(NecroX-1), 네크록스-2(NecroX-2), 네크록스-5(NecroX-5), 네크록스-7(NecroX-7) 및 네크록스-18(NecroX-18)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 점막염 예방 및 치료용 식품 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 점막염은 방사선 또는 화학 치료 요법에 의해 유발되는 것인 점막염 예방 및 치료용 식품 조성물.