JP6479663B2 - Ｌａｌ反応性物質を試験するための予充填試験基板、使用方法及び作製方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を求める分野に関する。より特定すれば、本発明は、米国、欧州及び日本国の薬局方のエンドトキシン試験法（「ＢＥＴ」）並びに世界的に同等の薬局方のＢＥＴ基準に適合する、予充填試験基板及び新規な測定法に関する。

グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母及び真菌などの微生物による汚染は、ヒトにおいて深刻な病気、さらには死を引き起こし得る。人々がグラム陰性菌に感染した場合、細菌は、発熱性の細菌エンドトキシンを生成し得る。エンドトキシンは、ヒトに対して危険であり、致命的にさえなり得る。グラム陰性菌の細胞壁のリポ多糖成分であるエンドトキシン分子は、微生物による汚染とは無関係に、製剤及び医療機器の表面に存在し得る。エンドトキシンによる汚染は、システムが無菌試験に合格した場合でさえ起こり得るので、独立したエンドトキシン試験が必要とされる。

これまで、カブトガニからの血球溶解物を使用して試験される試料中又は試料上のエンドトキシンの存在を検出するために、様々な試験が開発されてきた。血球溶解物がエンドトキシンに暴露されると、凝固が発生することになる。血球溶解物は、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ）、及びマルオカブトガニ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ）種を含めた多様なカブトガニ種の血リンパから生成される血球抽出成分である。一般に使用される血球抽出成分は、カブトガニ又はミナミカブトガニ種の血リンパから生成され、カブトガニ血球抽出成分（「ＬＡＬ」）と称される。ＬＡＬを試験試薬として使用する慣例の試験として、ゲルクロットアッセイ、エンドポイント比濁アッセイ、カイネティック比濁アッセイ、エンドポイント比色アッセイ及びカイネティック比色アッセイが挙げられる。ＬＡＬ試薬を使用する試験は、真菌汚染のマーカーであるグルカンに対して試験するために使用することもできる。

ＬＡＬアッセイ及び使用される標準品のさらなる情報は、米国薬局方（「ＵＳＰ」）第８５章「エンドトキシン試験法」（「ＢＥＴ」）、日本国薬局方４．０１「エンドトキシン試験法」、欧州薬局方２．６．１４「細菌エンドトキシン」及びその他の同等の国内薬局方で見ることができる。上で列挙した薬局方の多くは、統一されている。国際的に統一されたさらなる薬局方情報は、ＩＣＨ Ｑ４Ｂ付属書１４「Bacterial Endotoxin Test General Chapter」で見ることができる。医療機器において試験するエンドトキシンに関して、情報は、ＵＳＰ第１６１章「Transfusion and Infusion Assemblies and Similar Medical Devices」及びＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ ＳＴ７２「Bacterial Endotoxins - Test methods, routine monitoring, and alternatives to batch testing」で見ることができる。これらの基準及び手順を、コンペンディアと総称することがある。

医薬、医療機器及び食品産業の製造業者は、一定の基準を満たし、その製品が微生物又はエンドトキシンによる汚染を含有していないことを確実にしなければならない。これらの産業は、米国食品医薬品局又は環境保護局によって設定されたものなどの多様な安全基準を満たすために、エンドトキシンの存在について、高頻度で正確で精密な試験を行うことを必要とする。これらの機関は、コンペンディアの手順の基準の多くを承認している。したがって、製造業者が、市場に対して新規な製品を発表するための政府の承認を得ることを望む場合、上で列挙したコンペンディアにおける方法及び基準にその製品が適合している場合に、ＦＤＡの要件の多くを満たすことができる。これによって、製造業者は、新規な製品のＦＤＡの承認を得るための費用を実質的に削減することができる。

多様なコンペンディアのこれらのアッセイは、「標準品」として使用するための公知の濃度のエンドトキシンを含む水溶液を必要とする。これらの水溶液は、典型的には不安定であり、したがって、これらの水溶液は、通常、試験を行う直前に、試験場所で粉末状毒素から作製される。ＬＡＬ試薬も、通常、粉末形態であり、使用前に水溶液にもどさなければならない。

典型的には、わずか数ミリグラムのエンドトキシン及びＬＡＬ粉末が必要とされ、したがって、これらの粉末の正確な測定は、手間がかかることがある。これらの微粒子径によって、これらの粉末は、容器及びへらの表面に付着することが多く、試験手順中に容器中に留めておくことが困難であるので、取り扱いのさらなる問題を引き起こす。従来の試験方法を使用する場合、熟練の作業者は必ず、実験装置によって又は環境との接触を介して試薬溶液が汚染されないうちに、エンドトキシン及びＬＡＬ粉末を、手動で、エンドトキシンを含まない水にもどす。

エンドトキシン及びＬＡＬ粉末の調製は、重要な生体分子の溶媒和が遅く、混合中に表面に付着し、その後表面上で凝結する傾向があるため、困難である。ＬＡＬ試薬も、もどす際にゆっくりと反応を開始し、保存期間が非常に短い。最良の実地操作は、これらを使用直前に混合することであるが、ワークフローは、典型的に、プロセスの開始時にこれらを混合することを指示している。さらに、調製のプロセスは、環境中に偏在するエンドトキシンによって汚染されやすい。

機関は、使用される設備及び試薬が適正に機能していることを確実にするために、一連の較正試験も要請している。較正試験及び試料測定も、２回以上行われなければならない。ＢＥＴ及びその他のコンペンディアに適合する現在の実験室法は、非常に詳細であり、汚染なしでの、マイクロプレートの多数の注入口への分配などの液量の繰り返しの高精密な測定を必要とする。

ＬＡＬ分析を実行するための最も一般的な方法は、マイクロウェルプレート及びリーダーの使用である。上部が開口し、底部に透明な窓を備える反応ウェルの行列は、多数の同時アッセイに使用される加熱した分光光度リーダーに配置される。プレートを準備するのに非常に長い時間がかかること、その費用が高いこと、間違い及び汚染の可能性、並びにそのために特に訓練され、この職務に専念している技術者によってこの作業を行う必要性を含めた、多くの欠点がある。

高度に熟練した作業者は、適正な技術並びに測定及び試験の正確さを確実にするために継続的に監視され、作業者は、繰り返しの動作の正確さを確実にするために、必要に応じて再訓練される。典型的な方法は、ゆっくりとした時間のかかる２４８ものピペット操作段階を有し得るので、その複雑さ並びにその長さ及び操作の回数による汚染の起きやすさによって、この方法をエラーの起こりやすい方法にしている。

エンドトキシン試験における段階の量を低減するため及び段階のいくつか又はすべてを自動化するための方法及び機器が、開発されてきた。いくつかの方法は、１以上のピペット操作又は一定分量取得段階を自動化すること、試料の自動混合、又は非常に限られた回数のみでの試験を可能にする試験基板に試薬を予充填することを含む。

その他の自動化された方法は、マイクロプレート中の試料及び試薬を測定し、分配するために、ロボティクスに頼っている。準備ができると、プレートは、手で、又は別のロボットを使用して、リーダーに載せられる。ロボットは、典型的に、試料及び試薬をバイアルラックからプレートに正確に移し、二次汚染を防ぐためにピペットチップを置き換える、ピペット式分注システムである。これは、そのロボットによる作業を頻繁に検証する必要がある高価なシステムであり、多数の使い捨ての、ピペット、チップ、マルチウェルプレート、希釈チューブ、ピペット充填トレイ、サンプリングバイアルなどを、各実行に使用し得る。このシステムも、ウェルを順に調製するので、手動の調製のように、反応のすべてを同時に開始することはできない。汚染は、依然として問題であり、プロセスは、典型的に、監視されないので、汚染された試料を正当な理由で拒絶する合理的な手法はない。

しかし、開発された方法及び機器のすべては、以下の側面、基板に設計された低コストの自動化、清潔度を保証するための使い捨ての清潔な基板、各基板に対する公定試験適合性、組込み済みの個別の試験測定検証、及び測定作業の簡潔さの１以上を欠いている。したがって、コンペンディアに適合する、作業者の潜在的なエラーの量を低減する又はエラーを解消する、流体試料中のエンドトキシン濃度を試験及び分析するための、さらなる半自動試験法又は手順の必要性が存在している。

米国特許第２００５／０４８６５５号

したがって、段階の数が著しく低減され、それによって汚染、時間遅延及び不整合が最小限に抑えられて、正確性が向上する試験基板及び方法が、開示される。この方法は、ＦＤＡに認可されたＬＡＬと共に使用するのに適している。開示された試験基板及び測定法は、医薬及び生物医薬の製造で使用するのに適しており、米国、欧州及び日本国の薬局方のエンドトキシン試験法並びに世界的に同等の薬局方のＢＥＴ基準に適合している。医療機器製造にとって、開示された実施形態は、国際薬局方及び合意基準機構並びに世界的に同等の基準で見られるエンドトキシンの規制及び基準に適合している。

この発明は、（試験基板上に予充填されたエンドトキシンの検出試薬及び／又はＬＡＬ反応性標準品であってよい）検出試薬を使用した特化した試験基板の創出によって、標準のエンドトキシン試験法（「ＢＥＴ」）を向上させる。一実施形態では、１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されている、予充填試験基板が開示される。これらの予充填試験基板は、水性試料中のＬＡＬ反応性物質の濃度を求めるための試験で使用することができる。本明細書で使用する、ＬＡＬ反応性物質は、検出試薬と反応する物質を意味する。ＬＡＬ反応性物質の例として、エンドトキシン、又はラミナリン及びカードランなどの１，３−β−Ｄ−グルカンが挙げられる。ＬＡＬ反応性標準品は、ＬＡＬ反応性物質を含む。本発明は、いずれかの商業的供給源の検出試薬と共に使用することもできる。ＬＡＬ反応性物質を検出するための適した検出試薬として、アメーバ様細胞溶解物（アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）又はＬＡＬ、及びカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ Ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）又はＴＡＬ）、組み換えカブトガニ因子Ｃ又はｒＦｃ、単球活性化型発熱性物質試薬、組み換え因子Ｃ及びＬＡＬの混合物、及びスシペプチド、スシペプチド断片、スシペプチド二量体を含む調製物、バクテリオファージから由来する抗体及び受容体結合タンパク質などのその他の特異性結合タンパク質、並びにリピドＡと反応して、測定可能な応答を生成することができる任意のその他の試薬を挙げることができる。

本発明は、使用者が、較正基準及び試料の両方の調製及び測定で実行しなければならない段階の数を低減することができる。このことは、高水準の技能、経験及び訓練の必要性を低減することができ、費用、時間及びヒューマンエラーの可能性を低減する。加えて、本発明は、コンペンディアの要件及びＦＤＡの規則に適合するように、構成する又は利用することができる。

本発明は、１）光吸収が特定量の変化をするまでの時間が濃度に関連している、カイネティック比色、２）定められた時間にわたる光吸収の変化が濃度に関連している、エンドポイント比色、３）濁度が特定量の変化をするまでの時間（通常光吸収によって測定される）が濃度に関連している、カイネティック比濁、及び４）定められた時間にわたる濁度の変化が濃度に関連している、エンドポイント比濁を含めた、反応の進行をエンドトキシンレベルに関連させるすべての定量的なコンペンディアの測光方法と共に使用するのにも適している。

別の実施形態では、予充填試験基板の少なくとも１つの部分は、修飾表面を有することができる。表面は、プラズマエッチングを使用して修飾することができる。別法として、表面は、１以上のコーティングを使用して修飾することができる。コーティングは、静的コーティング、動的コーティング、又はこれらの組合せとすることができる。適した静的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。適した動的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デオキシコール酸ナトリウム、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。

さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、１以上の部分の間に１以上の機械的バリアを有することができる。機械的バリアは、可溶性とすることができる。予充填試験基板は、トレーサーなどの、部分識別機構をさらに含むことができる。別の実施形態では、予充填試験基板は、マイクロプレートとすることができる。さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するための、バリア材料を有することができる。

別の実施形態では、試料中のＬＡＬ反応性物質を測定するための方法が、開示される。方法は、その少なくとも１つの部分が１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されている、予充填試験基板に、試料を接触させて、それによって調製試料を作製することを含む。次いで、試料の吸光度を測定することができる。

別の方法の実施形態では、予充填試験基板の少なくとも１つの部分は、修飾表面を有することができる。表面は、プラズマエッチングを使用して修飾することができる。別法として、表面は、１以上のコーティングを使用して修飾することができる。コーティングは、静的コーティング、動的コーティング、又はこれらの組合せとすることができる。適した静的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。適した動的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デオキシコール酸ナトリウム、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。

さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、マイクロプレートとすることができる。さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するための、バリア材料を有することができる。

別の実施形態では、マイクロプレート上に１以上の試験試薬を堆積させるための方法が、開示される。試験試薬は、試料を試験するのに役立つ任意の試薬とすることができる。適した試験試薬として、検出試薬及びＬＡＬ反応性標準品が挙げられるが、これらのみには限らない。適した検出試薬は、上述されており、アメーバ様細胞溶解物を含むことができる。ＬＡＬ反応性標準品も、上述されており、エンドトキシンに対する現在の世界保健機関の国際基準に較正されているＵＳＰエンドトキシン参照標準品（ＲＳＥ）を含む。方法は、複数のウェルを含むウェルアレイを有し、各ウェルが、１以上の光学窓表面及び複数の非光学窓表面を有する試験基板を準備することを含むことができる。１以上の検出試薬を有する第１の液体溶液は、１以上のウェルの第１の非光学窓表面上に配置することができる。第１の液体溶液は、第１の非光学窓表面上で乾燥させ、それによって第１の非光学表面上に検出試薬を堆積させて、予充填試験基板を形成することができる。

別の実施形態では、試験基板上に１以上の試験試薬を堆積させるための方法は、第２の非光学窓表面上に、１以上のＬＡＬ反応性標準品を有する第２の溶液を配置することをさらに含むことができる。第２の液体溶液は、第２の非光学窓表面上で乾燥させ、それによって第２の非光学窓表面上にＬＡＬ反応性標準品を堆積させることができる。

別の実施形態では、試験基板は、マイクロプレートとすることができる。さらに別の実施形態では、方法は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するための乾燥段階の後、予充填試験基板をバリア材料で被覆することをさらに含むことができる。

試験試薬が、マイクロプレートの側壁上に堆積し得る、本発明の実施形態を示す図である。

一実施形態では、１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されている予充填試験基板が、開示される。予充填試験基板は、試料中のＢＥＴを測定するために設計される。予充填試験基板は、ＬＡＬ反応性標準品を使用する公知のスパイクから較正データを提供するために使用することもできる。予充填試験基板は、現在のＢＥＴの医薬規則要件のすべてを満たすように設計することができ、比濁法、比色法、及びゲル−クロットＢＥＴ法と共に使用することができる。ＬＡＬ反応性標準品は、関連する規制当局による主なエンドトキシン（ＣＳＥ）及び規制当局による主なエンドトキシン標準品（ＲＳＥ）に較正されているエンドトキシンとすることができる。その他の方法は、許容できる、又は規制機関に相当する若しくは許容できると認証されている場合、過去のデータに基づいて保存された較正を、個別の基準からの結果の代わりに使用することができる。

したがって、試験段階の数が著しく低減され、それによって汚染、時間遅延及び不整合を最小限に抑えることによって、正確性を向上させる、予充填試験基板及び方法が、開示される。方法は、ＦＤＡに認可された検出試薬と共に使用するのに適している。方法は、標準吸光度又は組込み済みの熱制御、ミキサー、及び光学リーダーを備えたマイクロプレートリーダーと共に使用して、ＢＥＴの結果を求めることができる。

別の実施形態では、ＬＡＬ反応性標準品は、予充填試験基板の３以上の異なる部分に予充填することができる。これらの３つの異なる部分は、較正部分を形成することができる。各部分中のＬＡＬ反応性標準品の濃度は、同じ又は異なっていてもよい。エンドトキシンが使用される場合、第１の部分は、水性試料（又はブランク水）がその部分中に存在する場合、試料中のエンドトキシン濃度が０．００５〜０．５ＥＵ／ｍＬの範囲になるような量を有する。同様に、第２の部分は、０．０５〜５．０ＥＵ／ｍＬの範囲の濃度に相当する量を有することができ、第３の部分は、０．５〜５０ＥＵ／ｍＬの範囲の濃度に相当する量を有することができる。

別の実施形態では、予充填試験基板の２以上の部分は、試料測定部分を形成することができる。２つの部分は、ＬＡＬ反応性標準品で充填され、スパイクを形成することができる。

検出試薬及び／又はＬＡＬ反応性標準品は、試料のブランク測定を可能にするために、マイクロプレートウェルの側壁上、マイクロプレートウェルの光学窓上、可溶性のコーティング上、又は光学的に半透明若しくは反射性の不溶性フィルム上などの、多様な試験基板上に堆積させることができる。別法として、試験試薬は、乾燥ビーズ又は粗粒子として添加することができ、又は試験基板に添加される担体媒体に堆積させることができる。

別の実施形態では、予充填試験基板の少なくとも１つの部分は、修飾表面を有することができる。表面は、プラズマエッチングを使用して修飾することができる。別法として、表面は、１以上のコーティングを使用して修飾することができる。コーティングは、静的コーティング、動的コーティング、又はこれらの組合せとすることができる。適した静的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。適した動的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デオキシコール酸ナトリウム、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。

さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、１以上の部分の間に１以上の機械的バリアを有し得る。機械的バリアは、可溶性とすることができる。

試薬が予充填試験基板は、水分、細菌及びエンドトキシン剤が予充填された試薬を汚染することを防ぐバリア材料を使用することによって、環境から遮断されるように梱包することができる。したがって、さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するためのバリア材料を有することができる。別の実施形態では、予充填試験基板は、マイクロプレートとすることができる。

試料導入のエラーは、試験基板中の試料を読み取る又は測定するように構成された、予充填試験基板上又はリーダー中の複数の任意選択の識別機構によって、さらに低減することができる。識別機構は、追加的な試薬が必要とされる場合に、使用者に試料を識別させる又は使用者に知らせることができる。適した識別手段として、カラーマーカー、英数字マーカー又は発光ダイオードなどの光学マーカーを挙げることができる。一実施形態では、識別機構は、トレーサーとすることができる。トレーサーは、流体に添加され、容積、流体の位置及び動き（流体運動）を求めるのに役立つ不活性化合物である。トレーサーは、測定データを認証するのに役立つように使用することもできる。適したトレーサーとして、染料を挙げることができるが、これのみには限らない。

別の実施形態では、試料中のエンドトキシンを測定するための方法が、開示される。本明細書で使用する、用語「試料」は、分析される試料のみでなく、検出限界で用いられる検出試薬又はライセートとの反応を示さない水も含むことができる。非反応性水の試料は、「ＬＡＬ試薬水」、「ＢＥＴ用水」又は「注入用水」と称することもできる。

方法は、試料を、その少なくとも１つの部分が１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されている予充填試験基板と接触させ、それによって調製試料を作製することを含むことができる。次いで、試料の吸光度を測定することができる。

試料は、試験基板の２以上の部分に接触することができる。予充填試験基板に接触する調製試料は、試験試薬と接触し得る又は接触しなくともよい。例えば、調製試料は、「ブランク」又は陰性コントロールとすることができ、いずれの試験試薬にも接触しない又は検出試薬のみと接触する。別の方法において、基板の１つの部分は、１以上のＬＡＬ反応性標準品でさらに予充填することができる。ＬＡＬ反応性標準品が、エンドトキシン標準品である場合、複数の濃度で存在することができ、ここで各濃度は、上述の基板の異なる部分上に存在する。エンドトキシンは、「標準曲線」がＵＳＰ８５で要求されるとおりに作り出すことができるように、基板上に予充填することができる。別の実施形態では、複数のエンドトキシン標準品濃度は、標準曲線を作り出すように使用することができる。

別の方法の実施形態では、予充填試験基板の少なくとも１つの部分は、修飾表面を有することができる。表面は、プラズマエッチングを使用して修飾することができる。別法として、表面は、１以上のコーティングを使用して修飾することができる。コーティングは、静的コーティング、動的コーティング、又はこれらの組合せとすることができる。適した静的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。適した動的コーティングとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デオキシコール酸ナトリウム、及びこれらの組合せが挙げられるが、これらのみには限らない。

さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、マイクロプレートとすることができる。さらに別の実施形態では、予充填試験基板は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するための、バリア材料を有することができる。

別の実施形態では、マイクロプレート上に１以上の試験試薬を堆積させるための方法が、開示される。試験試薬は、試料を試験するのに役立つ任意の試薬とすることができる。適した試験試薬として、検出試薬及びＬＡＬ反応性標準品が挙げられるが、これらのみには限らない。適した検出試薬は、上述されており、アメーバ様細胞溶解物を含むことができる。ＬＡＬ反応性標準品も、上述されており、エンドトキシンに対する現在の世界保健機関の国際基準に較正されているＵＳＰエンドトキシン参照標準品（ＲＳＥ）を含む。方法は、複数のウェルを含むウェルアレイを有し、各ウェルが、１以上の光学窓表面及び複数の非光学窓表面を有する試験基板を準備することを含むことができる。１以上の検出試薬を有する第１の液体溶液は、１以上のウェルの第１の非光学窓表面上に配置することができる。第１の液体溶液は、第１の非光学窓表面で乾燥させて、それによって第１の非光学表面上に検出試薬を堆積させ、予充填試験基板を形成させることができる。ＬＡＬ反応性標準品は、複数の濃度で存在することができ、ここで、各濃度は、試験基板の別々のウェル中に存在する。

別の実施形態では、試験基板上に１以上の試験試薬を堆積させるための方法は、第２の非光学窓表面上に、１以上のＬＡＬ反応性標準品を有する第２の溶液を配置することをさらに含むことができる。第２の液体溶液は、第２の非光学窓表面上で乾燥させて、それによって第２の非光学窓表面上にＬＡＬ反応性標準品を堆積させることができる。

別の実施形態では、試験基板は、マイクロプレートとすることができる。さらに別の実施形態では、方法は、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するための乾燥段階の後、予充填試験基板をバリア材料で被覆することをさらに含むことができる。適した試験基板として、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能なマイクロプレート、又はマイクロタイタープレートなどの、試料を評価又は試験するのに役立つ任意の試験基板が挙げられる。図１に示すように、マイクロプレート（１００）は、２×３の長方形の行列に並んだ多数の試料ウェル（１０２）を有することができる。マイクロプレートは、典型的に、６、２４、９６、３８４又は１５３６のウェルを有する。一実施形態では、マイクロプレート（１００）は、９６ウェル（１０２）を有することができる。１つのマイクロプレート内の個々のウェルの収容力は、通常、同じであるが、ウェルの収容力は、マイクロプレートによって異なっていてもよい。ウェル（１０２）の側壁（１０４）及び底部（１０６）は、ウェルが、半球状、円筒形又は長方形の形状となるように、カーブしていても、まっすぐでもよい。プレートは、マイクロプレートが作業面に平らに置かれるように、実質的に平面の底面（１０８）を含むこともできる。作業面として、地面、実験室用ベンチトップ、マイクロプレートリーダー及び加熱板、並びにテーブル、コンベヤー及びローラーなどの製造面を挙げることができるが、これらのみには限らない。マイクロプレートは、作業面上にまったく置かれず、例えばフック、クリップなどの吊下げ手段を介して作業面の上に吊り下げることも可能である。マイクロプレートは、ポリスチレン及びポリプロピレン又はポリカーボネートを含めた様々な材料から作製することができる。光学検出マイクロプレートは、試験試薬の試料との化学的性能を妨げない、ポリスチレン又はその他の適したポリマーを使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、二酸化チタンは、光吸収法に役立つように、ポリスチレンを白色化するために添加することができる。

試験基板の１以上の部分は、修飾表面を有することができる。修飾表面を有する部分として、側壁及びウェルを挙げることができるが、これらのみには限らない。表面及び試薬又は試料の相互作用が、標準マイクロプレート分析の相互作用を再現するように、表面は、これらのみには限らないが、コーティング、放射、プラズマエッチング、ＵＶ光及びオゾン、又は表面を動的に被覆することができる溶解した試薬を適用することを含めた当業者に既知の任意の手段によって、修飾することができるので、分析に対する製造業者の仕様書又はコンペンディアの基準が満たされる。

一実施形態では、試験基板の表面は、修飾して、生化学的ＬＡＬ及びＬＡＬ反応性物質の相互作用を制御する、又は表面エネルギーを制御することができる。反応化学による表面の化学的相互作用のレベルの制御によって、生化学的性能の再現性及び正確性が向上し得る。例えば、試験基板を製造するのに適した材料は、ＬＡＬ又はＬＡＬ反応性物質の反応化学を生化学的に阻害又は強化することもできる。材料表面及び反応化学の間のこの生化学的な相互作用は、コーティングの適用によって又は表面の化学修飾を介して、制御又は低減することができる。追加的に、試験基板の未修飾表面は、試験基板上に存在するミクロ流体に対して望ましくない表面エネルギーを有し得る。表面エネルギーは、化学修飾又はコーティングの添加を通して、望ましい値に変更されて、表面エネルギーをより親水性若しくはより疎水性にすることができる、又はこれらの状態の間のその他のいずれかの表面エネルギーを獲得することもできる。表面エネルギーを最適化することによって、試験基板上に存在するミクロ流体も、最適化することができる。

試験基板の表面を修飾するための別の手段として、表面が特定の最終的な表面の化学的構造に影響を及ぼすように、表面をプラズマに暴露することによって修飾される、プラズマエッチングが挙げられる。表面化学を修飾するために、異なる元素、例えば酸素又はアンモニアが、プラズマに添加され得る。さらなる手段として、永続的な静的又は動的な表面コーティングの使用が挙げられる。静的表面コーティングは、試験基板の表面上に層を形成させて、表面の性質を変化させるために、添加することができる。静的表面コーティングは、溶媒を含む溶液として適用され、コーティングが表面に化学的に結合している表面グラフトによって乾燥又は適用することができる。コーティングとしてグラフト化又は適用することができる静的コーティングの例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びコラーゲンが挙げられるが、これらのみには限らない。動的表面コーティングは、試薬、試料又は標準品に添加され、流体が試験基板上又は試料ウェル中を移動するように、インサイチュで表面を被覆することができる。動的コーティングの例として、ＰＥＧ及びデオキシコール酸ナトリウムなどの界面活性剤が挙げられるが、これらのみには限らない。

一実施形態では、方法は、複数のウェルを含むウェルアレイを有し、各ウェルが、１以上の光学窓表面及び複数の非光学窓表面を有するマイクロプレートを準備すること、１以上の試験試薬を有する液体溶液を準備すること、１以上のウェルの第１の非光学窓表面上に液体溶液を配置すること、及び第１の非光学窓表面上で液体溶液を乾燥させて、それによって第１の非光学窓表面上に試験試薬を堆積させることを含むことができる。別の実施形態では、堆積段階は、追加的な試験試薬が次の側壁部分上に堆積するように、次の非光学窓表面上で繰り返すことができる。

試験試薬は、試験試薬が混合の機会を得る前に試料の最初の光学的測定を可能にするように、ウェルの非光学窓表面に添加することができる。このことは、光学ゼロを求めるのに有用である。加えて、各試験試薬は、反応の開始前に、正しいレベルの試験試薬が添加されることを確認するために使用できる光学的サインを有する。別の実施形態では、各試験試薬は、エンドトキシン試験反応に不活性な光学材料によってタグ付けすることができる。使用者が、反応が起こる前に（反応ラグ相期間）、予定のレベルの試験試薬が誤ったレベルであることを発見した場合、次いで、使用者は、その試料に対する測定試験を拒絶することができる。このことは、任意の仕様外（ＯＯＳ）試験を評価し説明しなければならないので、医薬の使用者には大きな価値がある。

別の方法の実施形態では、方法は、１以上の試験試薬を有する液体溶液を提供すること、実質的に平面の底面、複数の端部（１１０）及びウェルアレイを有するマイクロプレートであって、底面が水平な作業面（１１２）に対して実質的に平行であり、ウェルアレイが複数の側壁を有する複数のウェルを含むマイクロプレートを準備することを含むことができる。第１の複数の端部（１１０）は、第１の端部が水平な作業面に対して概して垂直な配向に傾斜する（１１４）ように、底面が作業面に対してもはや実質的に平行にならないように、作業面に最も近い側壁部分が、作業面に対して概して平行な配向になるように、傾けることができる。液体溶液は、側壁部分上に配置され（１１６）、次いで乾燥され、それによって、側壁部分上に試験試薬を堆積させることができる。液体を移動するのに適した任意の手段が適しており、ピペット又はスプレーノズルが挙げられるが、これらのみには限らない。

いかなる乾燥プロセスも、その乾燥プロセスが試験試薬の反応性を変えない限り、本発明に適している。これらの乾燥プロセスとして、周囲温度での真空乾燥プロセス又はフリーズドライプロセス（凍結乾燥）が挙げられるが、これらのみには限らない。さらに別の実施形態では、液体溶液は、周囲温度で乾燥する又はフリーズドライすることができる。液体溶液は、完全に乾燥している必要はなく、とりわけ非水性溶媒が使用される場合、部分的に乾燥していてもよいことが、理解されるべきである。試験試薬は、所定の場所に残るように堆積した後、物理的に固定化されれば十分である。例えばある種の医薬及び安定保存のために調製されたその他の材料においてグリセリンペーストが使用される場合、試験試薬が固定された後、まだいくらかの液体が存在し得る。丸い壁及び平らな壁のウェルの両方で、同じプロセスが使用できる。マイクロプレートの傾斜位置は、堆積段階中、スタンド又は留め具などの支持手段の使用を介して維持することができる。

別の実施形態では、マイクロプレートは、回転させることができ、追加的な試験試薬が、次の側壁部分上に堆積するように、マイクロプレートの次の端部で堆積段階を繰り返すことができる。別の方法の実施形態では、エンドトキシンの検出試薬を含む１以上の試験試薬は、すべてのウェル中に存在し得る。別の方法の実施形態では、１以上の試験試薬は、エンドトキシン標準品を損なう。さらに別の方法の実施形態では、エンドトキシン標準品は、複数の濃度で存在することができ、各濃度は、異なるウェル中に存在する。さらに別の方法の実施形態では、マイクロプレートは、ウェル識別機構をさらに含むことができる。

試験試薬の堆積への多くの取り組みが、製造のしやすさ及び検出感度のために、混合時間、気泡形成、再溶解時間を低減するべく使用することができる。この取り組みは、望ましい結果をもたらすための化学的及び物理的な手段の両方を包含することができる。化学的な手段として、化学添加剤の使用を挙げることができる。化学添加剤の例として、糖類であるスクロース、グルコース及びマンニトールなどの溶解性強化剤、並びにポリ（エチレンオキシド）、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むポリマー水溶液などの抗剥離剤、又はデキストラン並びにラクトース及びトレハロースなどの多様な糖類などの分解を防ぐために設計された薬剤が挙げられる。物理的な手段として、堆積プロセス中の多様なコーティング、噴霧又は乾燥技術を挙げることができる。

いくつかの実施形態では、検出試薬は、すべてのウェル中に堆積させることができる。別法として、いずれのウェルにも検出試薬がなく、使用者が好ましい供給業者からの検出試薬を添加することができる。一実施形態では、検出試薬は、アメーバ様細胞溶解物とすることができる。ＬＡＬの自然吸光の使用、又はＬＡＬ及びエンドトキシンへの比濁又は比色の非ＬＡＬ反応性トレーサーの添加も、試験エラーを低減するために使用することができる。

ＬＡＬ反応性標準品は、ウェルの１つの部分のみに堆積させることができる。加えて、使用者が試験される試料をウェルに単に添加すればよいように、異なる濃度のＬＡＬ反応性物質を有するＬＡＬ反応性標準品で、多様なウェルを予充填させる又は予め堆積させることができる。一実施形態では、検出試薬及びＬＡＬ反応性物質は、ＵＳＰ８５で要求される試験及び複製のすべてが、単に試料に添加することによって実行できるように、ウェルに堆積させることができる。このような実施形態では、各ウェルは、別々の所与の試験、又は所与の試験の複製を含む。一実施形態では、最低濃度は、４つの複製において確認することができ、ここで、９６のウェルのうち４つはそれぞれ、１つの複製を含む。別法として、複製を含めた、阻害／強化試験（又は「スパイク」）が、実行できるように、ウェルは、ＬＡＬ反応性標準品で予充填することができる。別法として、所与の試料中の細菌エンドトキシンの濃度が定量化される定量試験が実行できるように、ウェルは、予充填することができる。さらに別の実施形態では、ライセート感受性、阻害／強化及び定量試験を含めた、ＵＳＰ８５で要求される試験及び複製のすべてが、同じマイクロプレート上で実行できるように、ウェルは、予充填することができる。同様の概念が、任意の試験基板又は試験基板の任意の部分で用いることができ、ウェルを有するマイクロプレートに限定されない。

一実施形態では、ウェルは、ウェル開口部の外側のラベルの部分上のみに接着剤を有する接着ラベルなどの密封手段によって被覆することができる。密封手段は、水及び酸素の通過を防ぐバリア材料から作製することができ、これによって、ウェルは、湿度レベルを約５％未満に乾燥させたままにすることができる。

開示した方法は、予洗浄した（エンドトキシンを含まない）９６又は３８４−ウェルのマイクロプレート中に、ＬＡＬ試薬、比色試薬及びエンドトキシンを予め堆積させるために使用することができる。液体溶液における試験試薬は、ウェルの壁上、又は光学ウェルの光学窓表面上に、配置することができる。液体溶液は、溶解性強化剤及び抗剥離剤などの化学添加剤を含むこともできる。開示した方法は、光学窓又は光学経路による干渉がなく、標準の９６又は３８４−ウェルのマイクロプレートの壁上に試薬を堆積させることができ、それによって最初の試料吸光測定を可能にする。

別の実施形態では、試験基板の少なくとも１つの部分が、１以上の試験試薬で予充填されている試験基板が、開示される。試験基板は、液体の光学的監視及びエンドトキシン又はグルカンのＬＡＬアッセイの実行における使用に適している。

ＬＡＬアッセイのための試薬は、試験基板の区分において単離することができる。試験基板は、使い捨てとすることができる。試験基板は、典型的なマイクロプレート形状を含めた様々な形態、構造及び形状を有することができる。その他の適した形態として、カード、カートリッジ又はディスクが挙げられるが、これらのみには限らない。試験基板は、試料及び流体が、試験基板に添加することができるように、構成されていてもよい。試験基板は、試験基板を、振動、旋回、スピン又は回転させて、試料を混合することも可能にする。試験基板は、液体の光学的監視も可能にする。

試験基板は、エンドトキシン又はグルカンのスパイク、水ブランク（エンドトキシン又はＬＡＬ試薬を含まない）の測定、一連の３以上の較正溶液の測定である、添加された陽性コントロールによる試料の測定を含めた解析関数を実行するためにも使用することができるが、これらのみには限らない。さらに、試験基板は、列挙された解析関数のすべてを２以上の複製品で実行するために使用することができる。

試験基板は、光吸収状態の間の時間又は時間の間の光吸収変化を測定する、光学装置又はリーダーと共に使用することができる。予充填試験基板は、試薬及び分析器が、仕様書、試料中のエンドトキシン又はグルカン濃度に変換するための較正、性能の検証又は適合するコンペンディア若しくは光学装置製造業者の仕様書、及び分析される試料の測定を満たしていることの確認に使用することもできる。

試験基板は、任意の適した材料から作製することができる。別の実施形態では、試験基板の部分は、コンペンディア又は試験試薬製造業者の仕様書を満たすように、ポリマー材料、表面処理、又はコーティングで被覆することができる。さらに別の実施形態では、試験基板の１つの部分は、ＬＡＬ試薬又は標準品の損失を低減するように、静的コーティングで被覆することができる。試験基板の別の部分は、マイクロプレートウェルの動的コーティングによって被覆して、ＬＡＬ試薬又は標準品の損失を低減することができる。動的コーティングは、標準品又は試薬と混合することもできる。

試験基板の１つの部分は、試験試薬又は試料材料の適切な分析及び相互作用を助ける又は調整するための添加剤で被覆することもできる。例示的な添加剤として、溶解補助剤、輸送補助剤及び安定剤が挙げられるが、これらのみには限らない。

さらに別の実施形態では、試験基板は、試験基板中で単離されている又は長期間保存されている時の相互作用を防ぐために試薬を分離するための機械的バリアを含むことができる。バリアは、不溶性とすることができ、光学的測定を妨げないように位置づけることができる。その他のバリアは、バリアが測定中に溶解し、測定を妨げないように、ある程度可溶性とすることができる。

さらに別の実施形態では、試験基板は、標準品及びコントロール標準エンドトキシン（ＣＳＥ）又は参照標準エンドトキシンから作製されるスパイクで予充填することができる。スパイクは、スパイクされる試料を希釈しない又は妨げないが、正しい濃度であるように、乾燥材料として保存することができる。
実施例
以下の実施例は、エンドトキシン標準品が試験基板上に予充填される実施形態を実証する。エンドトキシン標準品の範囲を、表１に示す。しかし、エンドトキシン標準品の範囲は、その他の実施形態では異なっていてもよい。

表２は、９６の部分を有する予充填試験基板の説明である。列１は、試験基板の部分を指示している。列２は、作業者が試験基板に添加しなければならない試料を指示している。試験基板の各部分は、列３で示すように、異なるエンドトキシン標準品濃度で、予充填されていてもよい。列４は、各部分で完了しなければならないＢＥＴ試験の説明である。エンドトキシン検出試薬は、９６の部分が同じ量のエンドトキシン検出試薬で予充填されていてもよいので、表２には示していない。別法として、試験基板は、任意のエンドトキシン検出試薬を有さなくてもよいので、作業者は、好ましい供給業者からのエンドトキシン検出試薬を添加することができる、

この明細書は、最良の形態を含めた本発明を開示するために、さらに、いかなる当業者も、任意の機器又はシステムを作製及び使用すること並びに任意の組み込まれた方法を実行することを含めた本発明の実施を可能にするために、実施例を使用している。特許を受け得る本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到するその他の実施例を含むことができる。例えば、ＬＡＬ及びエンドトキシンを混ぜること及び尚早な反応を起こすことのない、試薬を堆積させるその他の多くの取り組みが存在する。このようなその他の取り組みは、特許請求の範囲の文言とは異ならない構造的な要素を有する場合、又はその取り組みが特許請求の範囲の文言とのごく僅かな違いを有する均等の構造的な要素を含む場合、特許請求の範囲内であることを意図している。

１００ マイクロプレート
１０２ ウェル
１０４ 側壁
１０６ 底部
１０８ 底面
１１０ 端部
１１２ 作業面
１１４ 傾斜
１１６ 液体溶液

Claims (13)

1. ＬＡＬ反応性物質を検出するための予充填試験基板であって、予充填試験基板の少なくとも１つの部分が、１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されており、ＬＡＬ反応性標準品が、複数の濃度で存在し、各濃度が、予充填試験基板の別々の部分上に存在しており、予充填試験基板が、較正部分と試料測定部分とを備え、較正部分が、ＬＡＬ反応性標準品が予充填された予充填試験基板の３以上の異なる部分で形成される、予充填試験基板。
2. 試料測定部分が予充填試験基板の２以上の部分をなす、請求項１記載の予充填試験基板。
3. 予充填試験基板の少なくとも１つの部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のコーティングで被覆された表面を有する、請求項１記載の予充填試験基板。
4. １以上の部分の間に１以上のバリアをさらに含む、請求項１記載の予充填試験基板。
5. １以上のバリアが可溶性である、請求項４記載の予充填試験基板。
6. 試料中のＬＡＬ反応性物質を測定するための方法であって、
   （ａ）その少なくとも１つの部分が、１以上の検出試薬及び／又は１以上のＬＡＬ反応性標準品で予充填されており、ＬＡＬ反応性標準品が、複数の濃度で存在し、各濃度が、試験基板の別々の部分上に存在し、予充填試験基板が、較正部分と試料測定部分とを備え、較正部分が、ＬＡＬ反応性標準品が予充填された予充填試験基板の３以上の異なる部分で形成される、予充填試験基板に、試料を接触させて、それによって調製試料を作製すること、及び
   （ｂ）試料中のＢＥＴを測定するとともに、ＬＡＬ反応性標準品を用いた既知のスパイクから較正データを得るために、予充填試験基材を使用し、調製試料の吸光度を測定すること、及び
   （ｃ）複数のＬＡＬ反応性標準品の濃度を使用して標準曲線を作り出すことによって較正データを得ること
   を含む、方法。
7. 予充填試験基板の少なくとも１つの部分が、修飾表面を有する、請求項６記載の方法。
8. 修飾され表面が、プラズマエッチングを使用して修飾されている、請求項７記載の方法。
9. 修飾表面が、１以上のコーティングを使用して修飾され、コーティングが、静的コーティング、動的コーティング又はこれらの組合せである、請求項７記載の方法。
10. １以上の静的コーティングが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
11. １以上の動的コーティングが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デオキシコール酸ナトリウム及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
12. 予充填試験基板がマイクロプレートである、請求項６記載の方法。
13. 予充填試験基板が、予充填試験基板を環境暴露及び表面の汚染から保護するためのバリア材料をさらに含む、請求項６記載の方法。