JP6482005B2

JP6482005B2 - 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るための方法

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Publication number: JP6482005B2
Application number: JP2016509595A
Authority: JP
Inventors: ライヒマン、サーシャ; ゴウロー、オリヴィエ; − アランサーエル、ジョゼ
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2019-03-13
Anticipated expiration: 2034-04-25
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Description

光受容体細胞又は支持性の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の機能の障害又は完全な喪失は、網膜疾患、例えば遺伝性網膜変性症及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）における不可逆的な失明の主要な原因である。緑内障における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死もまた、不可逆的な視力喪失を生じる。変性した網膜をレスキューすることは大きな課題であり、細胞置換が最も有望なアプローチの１つである（Ｐｅａｒｓｏｎら、２０１２；Ｂａｒｂｅｒら、２０１３）。ヒト多能性幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の使用により、ヒト網膜変性疾患に関する新たな道が開かれる。多能性状態を保持しつつ、培養物中で無制限に拡大増殖される能力を有するヒトＥＳ（ｈＥＳ）及びｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞を、組織移植のための網膜細胞（光受容体、ＲＰＥ及びＲＧＣ）の無制限の供給源として使用することができた（総説は以下：Ｃｏｍｙｎら、２０１０；Ｄａｈｌｍａｎｎ−Ｎｏｏｒら、２０１０、Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅら、２０１１）。しかし、この新たな技術は、多くの困難になおも直面している。特に、現行の分化手順は、効率及び安全性を保証するのに十分には洗練されていない。いくつかの刊行物は、ｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞が、細胞培養物中でのコロニーの自発的分化によって（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、２００９；Ｖａａｊａｓａａｒｉら、２０１１；Ｚａｈａｂｉら、２０１２）、又は異なる浮遊凝集塊法によって（Ｉｄｅｌｓｏｎら、２００９；Ｌｕら、２００９；Ｋｏｋｋｉｎａｋｉら、２０１１）、ＲＰＥ細胞へと比較的容易に分化され得ることを示した。増加している収束性のデータにより、ｈＥＳ又はｈｉＰＳが胚様体形成後に神経網膜系列へと傾倒（committed）する能力、及び光受容体マーカーを発現する細胞へとさらに分化する能力が実証された（Ｌａｍｂａら、２００６、２００９；Ｏｓａｋａｄａら、２００８、２００９；Ｍｅｙｅｒら、２００９、Ｍｅｌｌｏｕｇｈら、２０１２）。異なる方法が以前に開発され、実際に進歩しているものの、高度に特殊化した細胞型への多能性幹細胞の分化と一般に関連する欠点になおも悩まされている。ｈＥＳ細胞又はｈｉＰＳ細胞の光受容体指向性の分化のためのこれらのプロトコールは、いくつかのステップ、いくつかの分子の添加を必要とし、また幾分不十分なものである。最近、他のグループは、ｈＥＳ細胞又はｈｉＰＳ細胞の胚様体から眼胞様構造の３Ｄ構造を得るためのさらなる試みを行った（Ｍｅｙｅｒら、２０１１；Ｎａｋａｎｏら、２０１２）。分化方法に、胚様体周囲の複雑な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を再形成するためにマトリゲルが使用されて、神経上皮の自己形成及び光受容体細胞系列への多少迅速な分化が可能となった（Ｍｅｙｅｒら、２０１１；Ｎａｋａｎｏら、２０１２；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅら、２０１３；Ｚｈｕら、２０１３）。

従って、ｉｎｖｉｔｒｏの分化及び発生を正確にモデル化する、網膜前駆体細胞、ＲＰＥ細胞及び神経網膜細胞を含む特定のヒト神経上皮系列細胞の実質的に純粋な培養物を得るための、単純で効率的且つ信頼性のある方法が、当該分野で必要とされている。

以下の実験の部に開示されるように、本発明者らは、ここで、２Ｄ及び３Ｄの培養系を組み合わせる新たな網膜分化プロトコールにｉＰＳ細胞を供した。このプロトコールは、胚様体又は細胞凝集塊の形成を回避し、マトリゲル又は血清の非存在下で実施され得る。本発明者らは、神経促進培地中で培養したコンフルエントなｈｉＰＳ細胞が、２週間以内に、眼野識別性（eye field identity）を有する神経上皮様構造を生成し得、この神経上皮様構造は、３Ｄ培養に切り替えると、主要な網膜細胞型へと分化し得ることを実証した。これらの条件下で、ｈｉＰＳ細胞は、発生的に適切な時間枠において網膜マーカーの迅速な発現を伴って、神経網膜様組織へと自己組織化し；これらはＲＧＣ及び光受容体などの異なる網膜細胞型を生じた。

従って、本発明の第１の目的は、ヒト網膜前駆体をｉｎｖｉｔｒｏで得るための方法であり、
（ｉ）神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ；並びに
（ｉｉ）色素細胞（pigmented cell）及び／又は神経上皮様構造の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ、
を含む。

本テキストでは、「網膜前駆体」は、「網膜前駆体細胞」とも呼ばれ、光受容体の先駆体、並びにＲＰＥへと分化し得る細胞を含む、神経網膜の全ての細胞型を生成する能力がある細胞を包含する。

「ヒト多能性幹細胞」には、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞及びヒト誘導多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞が含まれる。上記方法は、有利には、ヒト誘導多能性幹細胞を用いて実施される。

「神経促進培地」は、本明細書では、ニューロン細胞の維持及び／又は増殖に好都合な任意の培養培地を指定する。このような培地の非限定的例は、栄養培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））から構成される任意の培地であり、前記栄養培地には、以下の要素のうちの少なくとも一部を含む培地サプリメントが補充される：炭素供給源、ビタミン、無機塩、アミノ酸及びタンパク質消化物。神経促進培地を得るために適切なサプリメントの非限定的な例は、Ｎ２、Ｂ２７、Ｇ５及びＢＩＴ９５００サプリメント、並びにこれらから誘導される任意のサプリメントである。これらのサプリメント中に存在する成分を、以下の表１中にまとめる。

上述において、「神経上皮様構造」は、以下の実験の部において「神経網膜様構造」とも命名され、神経促進培地中での数日間の培養後に出現し始めるフェーズ−ブライト（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）構造を指定する。これらの構造は、ＯＣＴ４などの多能性関連遺伝子を顕著には発現しない細胞、並びにＬＨＸ２、ＲＡＸ、ＰＡＸ６及びＳＩＸ３などの眼野特定化と関連する転写因子を発現する細胞から、本質的に作られる。実験の部に開示されるように、上記方法を実施する場合、色素細胞が最初に出現し、神経上皮様構造は、色素細胞のパッチの近傍において出現する場合が最も多い。

当然、本発明による方法を実施する場合、当業者は、種々のマーカーの発現を検出できる（それらの発現、若しくはそれらがもはや発現されないという事実のいずれかをチェックするため、及び／又はそれらの発現レベルを定量的に測定するため）。当該分野で公知の任意の技術、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びイムノアッセイなどが、この目的のために使用され得る。多能性についてのマーカーの例は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧである；眼野についてのマーカーの例は、ＲＡＸ、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２及びＳＩＸ３であり、２つの最初のものが好ましい。

有利には、上記方法は、複雑で高価な培地を使用せずに実施され得る。実際、非常に単純な培地が、多能性幹細胞の接着性培養物からヒト網膜前駆体を得るために使用され得る。特に、分化因子は必要とされない。上記方法の好ましい一実施形態によれば、培養ステップにおいて使用される神経促進培地は、分化因子ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｋｋ−１及びＩＧＦ−１、のうちの少なくとも１つを欠く。特に、この神経促進培地は、これら３つの因子を欠き得る。

ステップ（ｉ）において使用されるヒト多能性幹細胞は、任意の種類の接着性培養系において培養され得る。この培養のために使用され得る表面の非限定的な例は、以下である：ガラス、プラスチック（場合により処理される）、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ポリ−Ｌ−リシン、栄養細胞（ｎｕｔｒｉｅｎｔｃｅｌｌ）又は市販の任意の合成表面、例えばＣｏｒｎｉｎｇＳｙｎｔｈｅｍａｘ（商標）。好ましい一実施形態では、上記方法のステップ（ｉ）において使用される接着性培養物は、少なくとも８０％コンフルエンスに達するコロニー型単層の形態である。当業者は、接着性細胞に関するコンフルエンスの観念に精通しており、このコンフルエンスを評価することができ、コンフルエンスは、特にコンフルエンスが培養物表面全体上で均一でない場合には、局所的に、即ち、レシピエントの１つの領域のみにおいて評価され得る。コロニー型単層の場合、「８０％コンフルエンス」は、必要に応じて、一部のコロニーが他のコロニーときっちりと接触するが、これらのコロニー間に幾分かの自由空間（表面の１０から３０％の間を示す）が残存する状況として規定され得る。

実験の部に記載されるように、これは義務的ではないが、本発明による方法は、ステップ（ｉ）の前に、１〜４日間の間、好ましくは２日間の間、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２）を欠くように改変された、多能性幹細胞の維持のための培養培地中で、前記多能性幹細胞の接着性培養物のステップが行われるように、実施され得る。このさらなるステップに適切な培地の非限定的な例は、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬの霊長類ＥＳ細胞培地及びＲｅｐｒｏＳｔｅｍ培地である。

上記方法の特定の一実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、十分な量の神経上皮様構造が出現するように、少なくとも７日間の間、好ましくは１０〜１４日間の間、実施される。当然、培養の方法は、ステップ（ｉｉ）が短縮され得るように発達し得る。上で既に言及したように、神経上皮様構造は、ＯＣＴ４などの多能性関連遺伝子を顕著には発現しない細胞、及び眼野特定化と関連する転写因子を発現する細胞から、本質的に作られる。従って、培養系に依存して、当業者は、ステップ（ｉｉ）の最後を、少なくとも一部の細胞がＯＣＴ４の発現を停止する時点、並びに／又はＲＡＸ及びＰＡＸ６の発現を開始する時点として規定することを選択できる。既に言及したように、この特徴付けは、ｑＲＴ−ＰＣＲ又は免疫染色などの任意の公知の技術によって実施され得る。

別の態様によれば、本発明は、ＲＰＥ細胞を得るための方法に関し、前記方法は、
（ｉ）神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ；
（ｉｉ）色素細胞の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ；
（ｉｉｉ_ＲＰＥ）ステップ（ｉｉ）において得られた培養物から、少なくとも１つの色素細胞を収集するステップ；及び
（ｉｖ_ＲＰＥ）ステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）において得られた色素細胞（単数又は複数）を培養するステップ、
を含む。

この方法を実施する場合、当業者は、ステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）において収集された細胞が、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）及び／又はＺＯ−１を発現することをチェックできる。既に言及したように、当該分野で公知の任意の技術（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ及び免疫染色）が、この目的のために使用され得る。

ＲＰＥ細胞を得るための上記方法の好ましい一実施形態によれば、ステップ（ｉｖ_ＲＰＥ）における培養は、接着性培養系において実施される。任意の接着性培養系が、上に既に言及したように使用され得る。

ＲＰＥ細胞を得るための本発明の方法を実施する場合、細胞は、少なくとも５日間の間、ステップ（ｉｖ_ＲＰＥ）において増幅される。有利には、ステップ（ｉｖ_ＲＰＥ）の培養物は、大量のＲＰＥ細胞を得るために、数週間の間維持及び増幅され得る：例えば、約１０パッチの色素細胞がステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）において収集され、３ｃｍ^２の新たな皿中に一緒にプレートされる場合、ＲＰＥ細胞の実質的に純粋な（９９％）コンフルエントな接着性培養物が、３〜４週間後に得られ、又はＦＧＦ２が培養培地に添加される場合（２〜３日毎に１０ｎｇ／ｍｌ）、１０〜１４日後に得られる。

本発明の別の態様は、神経網膜細胞を得るための方法であり、前記方法は、
（ｉ）神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ；
（ｉｉ）神経上皮様構造の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ；
（ｉｉｉ_ＮＲ）ステップ（ｉｉ）において得られた培養物から、少なくとも１つの神経上皮様構造由来の細胞を収集するステップ；及び
（ｉｖ_ＮＲ）ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において得られた細胞を培養するステップ、
を含む。

「神経網膜細胞」には、本明細書で、ＲＧＣ、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、光受容体細胞（桿体及び錐体）、ミュラーグリア細胞、並びにこれらの細胞型のいずれかの先駆体が含まれる。

重要なことに、種々の神経網膜細胞が、培養細胞が分化するステップ（ｉｖ_ＮＲ）の間の同じ時点では出現しない。従って、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）の持続時間に依存して、異なる細胞型が形成する。出現の順序は以下のとおりである：神経節細胞が最初に出現し、その後アマクリン細胞及び水平細胞が出現し、光受容体が後に出現する。従って、必要とされる細胞型に依存して、当業者は、２１〜４２日間の間、培養するステップ（ｉｖ_ＮＲ）を実施する。

以下の実験の部に例示されるように、本発明のこの態様に従う方法は、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において、少なくとも１つの神経上皮様構造を収集することによって実施され得る。これは、例えば、接着性細胞の層からこの構造を機械的に分離することによって実施され得る。次いで、この構造は、例えば、マルチウェルプレートのウェル、ペトリ皿、フラスコなどの別の培養物レシピエント中で、単独で、又は他の神経上皮様構造と一緒に、配置され得る。

この方法を実施する場合、当業者は、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において収集された細胞が、眼野細胞に特徴的なＰＡＸ６及びＲＡＸを同時発現することを、有利にチェックできる。或いは又はさらに、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において収集された細胞による細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現が測定され得る。

特に有利な一態様によれば、本発明は、上記ステップ（ｉ）〜（ｉｖ_ＮＲ）を含む、光受容体先駆体を得るための方法に関し、このステップ（ｉｖ_ＮＲ）は、少なくとも２１日間の間、好ましくは少なくとも２８日間の間、実施される。当然、培養条件の将来的な発展に依存して、このステップは、さらに短縮され得る。

ステップ（ｉｖ_ＮＲ）の間のいずれかの時点で、当業者は、培養細胞におけるＮＲＬ及び／又はＣＲＸの発現を、例えばｑＲＴ−ＰＣＲによって測定することによって、光受容体系列への分化をチェックできる。或いは又はさらに、光受容体先駆体は、以下の実験の部に開示されるように、リカバリン免疫染色で同定され得る。本発明者らは、光受容体先駆体の細胞ソーティングのための細胞表面マーカーとして使用され得るＣＤ７３が、リカバリンと同時発現されることもまた実証した。これは、例えば、抗ＣＤ７３抗体を使用することによって、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）後に光受容体先駆体を細胞ソーティングするさらなるステップを追加することによって、有利に使用され得る。光受容体先駆体が富化された得られた細胞集団は、例えば、細胞移植又はスクリーニングアプローチに使用され得る。

任意選択で、Ｎｏｔｃｈインヒビター、例えばＤＡＰＴは、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）において、少なくとも１日間の間、好ましくは５日間又はそれ以上の間、培養培地に添加され得る。ＤＡＰＴは、γ−セクレターゼインヒビターであり、間接的にＮｏｔｃｈのインヒビターであり、本発明者らは、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）における数日間の間のその添加が、光受容体先駆体の生成に好都合であることを示している（以下の例２及び図５を参照のこと）。

上に開示された神経網膜細胞を得るための方法の好ましい一実施形態によれば、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）における培養は、非接着性培養系において実施される。例えば、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において収集された神経上皮様構造は、浮遊構造として培養される。特定の一実施形態によれば、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において収集された各神経上皮様構造は、浮遊構造として、個々のレシピエント／ウェルにおいて培養される。

非接着性の系の非限定的な例には、細胞が培地中に積極的に懸濁して維持される、磁気回転スピナーフラスコ又は振盪フラスコ又は皿、並びに細胞が撹拌されて維持されはしないものの、基材にしっかりと付着することはできない、静置培養容器又はＴ−フラスコ及びビンが含まれる。

実験の部に記載されるように、細胞又は神経上皮様構造は、有利には、振盪条件下でステップ（ｉｖ_ＮＲ）を実施することによって、培地中に積極的に懸濁されて維持され得る。任意の振盪機、例えば、培養物を３次元で撹拌するローターなどが、この目的のために使用され得る。

神経網膜細胞を得るための本発明の方法の別の好ましい一実施形態によれば、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）において使用される培養培地には、少なくとも５日間の間、ＦＧＦ２が補充される。この培養培地は、好ましくは、上記のようなニューロン促進培地である。

本発明の１つの利点は、最初の接着性培養物から、ＲＰＥ細胞（第１の培養、好ましくは接着性）及び神経網膜の先駆体（第２の培養、好ましくは非接着性）の両方を得るために、２つの異なる培養が並行して実施され得ることである。従って、本発明は、ＲＰＥ細胞、及び神経網膜の先駆体の両方を得るための方法に関し、この方法は、上で規定されたステップ（ｉ）及び（ｉｉ）と、その後の、これもまた上で開示されたステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）及び（ｉｖ_ＮＲ）と並行して実施される、上で規定されたステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）及び（ｉｖ_ＲＰＥ）とを含む。

最も重要なことには、本発明は、高い程度の純度で、主要な型（ＲＰＥ、ＲＧＣ、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞及び光受容体）のいずれかの大量の網膜細胞を容易且つ迅速に得るための信頼性のある方法を提供する。例えば、７５％を上回る光受容体先駆体を含む培養物が、１ヵ月未満で得られ得る。

これらの方法、及びこれらの方法によって得られた実質的に純粋な細胞培養物は、以下の領域において有用であることが想定される。
・移植／細胞治療：非限定的な例には、以前に失われた視力の回復を補助するための、失われた細胞の置換治療における、ＲＰＥ細胞及び／又は網膜前駆体細胞若しくはそれらから分化した細胞の使用が含まれる。方法及び培養物は、全組織置換治療における使用のための組織を発生させるためにも使用され得る。
・ＲＧＣ、桿体、錐体及びＲＰＥ細胞を含む全ての細胞の機能を保護又は増強することができる薬剤を同定するための薬物スクリーニング。「薬剤」は、本明細書で、任意の種類の分子又は組成物を意味するが、非化学的薬剤、例えば、任意の電磁放射線又は粒子線（ＵＶ、可視光、電離放射線など）もまた意味する。
・多能性細胞から、特にｈｉＰＳ細胞から、病態生理学を研究するために、及び幹細胞又はその誘導体を使用した薬物スクリーニング又はカスタム化治療のためにも使用され得るヒト網膜疾患モデルを作ること。
・網膜発生、組織形成及びシナプス形成が含まれるがこれらに限定されない種々のプロセスを研究するための有用なリソースである、ヒト神経発生の独自のモデルとして。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに示される。

［図１］組込みフリーのｈｉＰＳ細胞の誘導及び特徴付けを示す図である。（Ａ）ＡＨＤＦの再プログラミングに関与するステップを示す模式図。（Ｂ）線維芽細胞上での不均一ｈｉＰＳコロニーの出現。（Ｃ）十分樹立されたｈｉＰＳ細胞の陽性アルカリホスファターゼ染色。（Ｄ、Ｅ）ｈｉＰＳ細胞（サブクローン２）における免疫組織化学による多能性マーカーの発現。（Ｆ）ｈｉＰＳ細胞、ＡＨＤＦ及びｈＥＳ細胞における多能性及び自己再生マーカーのｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３実験）。データは、ｈＥＳ細胞に対して標準化される。（Ｇ）２週間後の、ｈｉＰＳ細胞から誘導された胚様体におけるいくつかの胚葉マーカーのｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３実験）。データは、未分化ｈｉＰＳ細胞に対して標準化される。（Ｈ〜Ｊ）内胚葉（ＳＯＸ１７）、中胚葉（ＳＭＡ）及び外胚葉のマーカー（ＰＡＸ６、ＴＵＪＩ−１）についての、２週間後の、ｈｉＰＳ細胞（サブクローン２）から誘導された胚様体の免疫染色。（Ｋ）ｈｉＰＳサブクローン２の核型分析。（Ｌ）５（ＡＨＤＦｃ２ｐ５）又は１５継代後（ＡＨＤＦｃ２ｐ１５）の、及び対照としてのネイティブＡＨＤＦからの、ｈｉＰＳサブクローン２のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）画分及びエピソーム画分（Ｅｐｉ抽出物）におけるｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターの検出のためのｏｒｉＰを標的化するプライマーを使用するＰＣＲスクリーニング。スケールバー＝１００μｍ。
［図２］組込みフリーのｈｉＰＳ細胞由来の網膜前駆体の効率的な生成を示す図である。（Ａ）分化プロトコールの異なる段階を示す模式図。（Ｂ、Ｃ）７及び１４日後の、神経促進培地中で分化しているｈｉＰＳ細胞の形態。（Ｄ）１４日目の神経上皮様構造における、眼野転写因子（ＳＩＸ３、ＬＨＸ２、ＲＡＸ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ及びＶＳＸ２）、ＮＲＬ、ＣＲＸ及び多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３実験）。データは、０日目のｈｉＰＳ細胞に対して標準化される。（Ｅ〜Ｏ）ＰＡＸ６及びＲＡＸ（Ｅ〜Ｇ）、Ｋｉ６７及びＬＨＸ２（Ｈ〜Ｊ）、又はＭＩＴＦ及びＶＳＸ２（Ｋ〜Ｏ）についての、１４日目の神経上皮様構造の免疫蛍光染色。スケールバー＝１００μｍ（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈ及びＫ）；５０μｍ（Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｌ〜Ｏ）。（Ｐ）０日目、７日目及び１４日目における、ｈｉＰＳＣ−２中のノギン（ｎｏｇｇｉｎ）及びＤＫＫ１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、ｈｉＰＳＣ−２単一のコロニーに対して標準化される。
［図３］浮遊神経網膜（ＮＲ）様構造からの複数の網膜細胞型の分化を示す図である。（Ａ）網膜細胞を生成するための分化プロトコールを概説する模式図

（Ｂ〜Ｄ）単離後の異なる時点における浮遊ＮＲ様構造の形態。（Ｅ、Ｆ）異なる時点における、ＮＲ様構造における眼野及び光受容体特異的転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｎ＝３実験）。データは、１４日目のＮＲ様構造の細胞に対して標準化される。（Ｇ〜Ｉ）ＭＩＴＦ（Ｇ）、ＶＳＸ２（Ｇ、Ｈ）、ＰＡＸ６（Ｈ）、ＯＴＸ２（Ｉ）及びＢＲＮ３Ａ（Ｉ）についての、２１日目のＮＲ様構造の免疫染色。（Ｊ〜Ｌ）１４日目（Ｊ）、２１日目（Ｋ）及び２８日目（Ｌ）における、ＣＲＸについてのＮＲ様構造の免疫染色。（Ｍ〜Ｎ）カルレチニン（Ｍ）及びＬＩＭ１（Ｎ）についての、２１日目のＮＲ様構造の免疫染色。（Ｏ）リカバリンについての、２８日目のＮＲ様構造の免疫染色。スケールバー＝１００μｍ（Ｂ〜Ｄ、Ｇ〜Ｌ）、５０μｍ（Ｍ〜Ｏ）。
［図４］組込みフリーのｈｉＰＳ細胞からのＲＰＥ細胞の生成及び増幅を示す図である。（Ａ）実験の模式図。（Ｂ、Ｃ）３０日後の、ｈｉｐｓ細胞由来ＲＰＥ細胞単層の位相差顕微鏡。（Ｄ）ＺＯ−１及びＭＩＴＦについての、３０日後の、ｈｉｐｓ細胞由来ＲＰＥ細胞単層の免疫染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）継代０（Ｐ０）、Ｐ１及びＰ２における、ｈｉＲＰＥ細胞における成熟ＲＰＥマーカーのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、ヒト成人ＲＰＥ細胞から単離された対照ＲＮＡに対して標準化される。（Ｆ）ＲＰＥ細胞食作用活性の評価；ＦＩＴＣ標識ＰＯＳとの３時間のインキュベーション後の、Ｐ１におけるｈｉＲＰＥ細胞培養物及び対照ＲＰＥ−Ｊ細胞系におけるＦＩＴＣ／ＤＡＰＩ蛍光の比率。ＰＯＳの結合及び取り込みを、材料及び方法に記載したようにアッセイした（例１）。
［図５］Ｎｏｔｃｈ阻害による、浮遊ＮＲ様構造からの光受容体先駆体生成の加速を示す図である。（Ａ）２１日目から２８日目まで又は２８日目から３５日目までのいずれかのＤＡＰＴの添加を用いた実験の模式図

（Ｂ）ＤＡＰＴの存在下又は非存在下（対照）における、ＣＲＸ及びリカバリンについての、２８日目又は３５日目におけるＮＲ様構造の免疫染色。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ及びＤ）ＤＡＰＴあり又はなし（対照）での、２８日目及び３５日目における光受容体先駆体（ＣＲＸ、リカバリン）及び有糸分裂前駆体（Ｋｉ６７）の定量。値は、陽性細胞の平均百分率±ＳＥＭを示す（ｎ＝４、^＊Ｐ＜０．０５）。（Ｅ）ＤＡＰＴで処理した３５日目のＮＲ様構造における、成熟中の光受容体のマーカー及びＧＬＡＳＴ（ミュラーグリア細胞についてのマーカー）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、ＤＡＰＴ処理なしの３５日目におけるＮＲ様構造に対して標準化される。スケールバー＝１００μｍ。
［図６］ＮＲ様構造における光受容体先駆体の初期分化を示す図である。（Ａ）分化中のＮＲ様構造におけるＮＲＬ及びＣＲＸ転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、０日目におけるｈｉＰＳＣ−２と比較した、ＰＣＲ発現レベルにおけるサイクル変化として表される。（Ｂ）ＣＲＸについての、１４日目における凍結切片化ＮＲ様構造の免疫蛍光染色。（Ｃ〜Ｈ）ＣＲＸ及びＯＴＸ２についての、２１日目及び３５日目における凍結切片化ＮＲ様構造の免疫蛍光染色。２１日目（Ｃ〜Ｅ）及び３５日目（Ｆ〜Ｈ）における、ＮＲ様構造の切片におけるＯＴＸ２及びＣＲＸの共局在を実証する共焦点画像。（Ｍ〜Ｎ）Ｋｉ６７（Ｍ）、ＰＡＸ６（Ｎ）、ＯＴＸ２（Ｎ）、ＣＲＸ（Ｍ）についての、２８日目における凍結切片化ＮＲ様構造の免疫組織化学分析。スケールバー＝１００μｍ（Ｂ）；５０μｍ（Ｃ〜Ｈ及びＭ〜Ｎ）。
［図７］ｈｉＰＳＣ−２由来ＮＲ様構造の厚さ分析を示す図である。（Ａ〜Ｃ）１７日目から２４日目までの、１つの代表的ＮＲ様構造の厚さの発達（黒色線）。（Ｄ）１３個の独立したＮＲ様構造の厚さの発達のグラフ表現。各線は、１つのＮＲ様構造に対応する。（Ｅ）１７日目から２４日目の間での８０．６±１０．２％の増加を示す、１３個の別々のＮＲ様構造の厚さ（平均±ＳＥＭ；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）を示すヒストグラム。スケールバー＝１００μｍ。
［図８］異なるｈｉＰＳＣクローンを用いた網膜分化プロトコールの再現性を示す図である。（Ａ〜Ｃ）１７日目、２１日目及び２４日目における、ｈｉＰＳＣ−１から誘導された浮遊ＮＲ様構造の形態。（Ｄ〜Ｆ）１７日目、２１日目及び２４日目おける、ｈｉＰＳＣ−２から誘導された浮遊ＮＲ様構造の形態。（Ｇ及びＨ）ｈｉＰＳＣ−１又はｈｉＰＳＣ−２から誘導されたＮＲ様構造における、１７日目及び３５日目における眼野転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｉ及びＪ）ｈｉＰＳＣ−１又はｈｉＰＳＣ−２から誘導されたＮＲ様構造における、１７日目及び３５日目における光受容体特異的転写因子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、各遺伝子について、１４日目に対して相対的である。スケールバー＝１００μｍ。
［図９］浮遊ＮＲ様構造からの全ての網膜細胞型の分化。（Ａ〜Ｅ）異なる時点における、ＮＲ様構造における選択された神経網膜細胞型のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。データは、Ｒ／Ｇ及びブルーオプシンの両方について、１４日目及び３５日目のＮＲ様構造に対して標準化される。（Ｆ〜Ｑ）ＲＧＣ（ＢＲＮ３Ａ、ＰＡＸ６、カルレチニン）、アマクリン細胞（ＰＡＸ６、ＡＰ２、カルレチニン）、水平細胞（ＬＩＭ、ＰＡＸ６、カルレチニン）、光受容体（ＯＴＸ２、リカバリン、ＣＲＸ、ＣＤ７３、錐体アレスチン、ロドプシン、ブルー及びＲ／Ｇオプシン）、双極細胞（ＰＫＣα）、ミュラーグリア細胞（ＧＳ、ＳＯＸ９）並びに有糸分裂前駆体についてのマーカー（Ｋｉ６７）を使用した、分化の異なる段階における凍結切片化ＮＲ様構造の免疫組織化学的分析。スケールバー＝５０μｍ（Ｆ〜Ｎ）、２５μｍ（Ｏ〜Ｑ）。
［図１０］長期培養後の、ＮＲ様構造における成熟光受容体の存在を示す図である。リカバリン（Ａ〜Ｄ）、ロドプシン（Ａ〜Ｂ）及びアセチルチューブリン（Ｃ〜Ｄ）についての１１２日目における凍結切片化ＮＲ様構造の免疫蛍光染色。免疫組織化学的分析により、内部ロゼットにおける光受容体の優勢な存在が確認され、ロゼットの管腔帯におけるアセチル化チューブリン陽性構造の出現が確認された（Ｄ中の矢印）。スケールバー＝２５μｍ（Ａ〜Ｃ）及び１０μｍ（Ｄ）。

（例１）
網膜ニューロン及び網膜色素上皮細胞へのヒト組込みフリーの誘導多能性幹細胞の、信頼性のある効率的な分化
１．１実験手順
ヒト線維芽細胞及びｉＰＳ細胞の培養
８歳の男児由来の成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＨＤＦ）（Ｒｕｓｔｉｎ博士からの贈与、ＩＮＳＥＲＭＵ６７６、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、標準的な５％ＣＯ_２／９５％空気インキュベータ中で、３７℃で、１０％ＦＢＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース、ＧｌｕｔａｍａｘＩＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。この培地を「線維芽細胞培地」と呼んだ。樹立されたヒトｉＰＳ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むＲｅｐｒｏＳｔｅｍ培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）中で、マイトマイシン−Ｃ不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層（Ｚｅｎｉｔｈ）上で維持した。細胞を、標準的な５％ＣＯ_２／９５％空気インキュベータ中で、３７℃で慣用的にインキュベートした。この培地を「ｉＰＳ培地」と呼んだ。細胞を、実体顕微鏡（ＶｉｓｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬｔｄ）下で１週間に１回手動で継代した。

ヒト線維芽細胞の再プログラミング
再プログラミングを、記載されたようにエピソームアプローチを用いて実施した（Ｙｕら、２００９）。簡潔に述べると、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベースのエピソームベクターｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＮ２Ｋ（プラスミド２０９２５、Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＥＰ４ＥＯ２ＳＥＴ２Ｋ（プラスミド２０９２７、Ａｄｄｇｅｎｅ）及びｐＣＥＰ４−Ｍ２Ｌ（プラスミド２０９２６、Ａｄｄｇｅｎｅ）を、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ４Ｄ、Ｖ４ＸＰ、ＤＴ−１３０プログラムを用いる、Ｌｏｎｚａ）を介して、ＡＨＤＦ中に共トランスフェクトした。トランスフェクトした線維芽細胞（ヌクレオフェクション１回当たり１０^６細胞）を、「線維芽細胞培地」中に、３×１０ｃｍＭＥＦ播種皿（５．１０^６細胞／ｃｍ^２）に直接プレートした。トランスフェクションの４日後に、「線維芽細胞培地」を、再プログラミング効率を増加させることが記載された以下の分子（Ｚｈａｎｇら２０１３）を補充した「ｉＰＳ培地」で置換した：５００μＭのバルプロ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）、０．５μＭのＰＤ−０３２５９０１（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）及び２μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋ）。１４日後に、細胞を、「ｉＰＳ培地」単独中で培養した。３０〜４０日の間に、コンパクトな細胞クラスターを切り取り、６０ｍｍＯｒｇａｎＳｔｙｌｅ細胞培養皿（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）中に移した。出現したｈｉＰＳコロニーを、そのヒトＥＳ細胞様のコロニー形態に従って実体顕微鏡下で選別した。これらを、引き続く特徴付けのために、上記のようにマイトマイシン−Ｃ不活化ＭＥＦフィーダー層上で拡大増殖させた。エピソームベクターの完全な喪失及び再プログラミング性遺伝子の非組込みを、以下に記載するようにＰＣＲによって達成した。

エピソームベクターのＰＣＲ分析
ｈｉＰＳ細胞からのエピソームＤＮＡの精製を、製造者のプロトコールに従って、ＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＱｕｉｃｋＰｕｒｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施した。ゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出法を使用して単離した。精製方法の性質に起因して、Ｙｕら（２００９）によって明確に報告されたように、ゲノム精製ＤＮＡには、同じ細胞由来の残存量のエピソームＤＮＡが混入する可能性が高く、同様に、精製されたエピソームＤＮＡには、少量のゲノムＤＮＡが混入した。ＰＣＲ反応を、ＧｏＴａｑｆｌｅｘｉポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施した。各ＰＣＲ反応について、１００ｎｇを含むことと同等の１０^４細胞から抽出した１０μｌのゲノムＤＮＡ又はエピソームＤＮＡを、鋳型として添加した。ＰＣＲミックスは１×ＧｏＴａｑＦｌｅｘｉ緩衝液、２ｍＭＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、０．５μＭの各プライマー及び１．２５Ｕのポリメラーゼを含み：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で４５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３５サイクル、及びその後７２℃で５分間のプログラムを用いた。ネイティブ線維芽細胞由来のエピソーム及びゲノムＤＮＡを、陰性対照として使用し、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベースのエピソームベクター（上記、Ｙｕら２００９を参照のこと）を、陽性対照として使用した。

核型分析
活発に増殖しているｈｉＰＳ細胞コロニー（８０％コンフルエンシー）を、３７℃で９０分間、コルヒチン（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）で処理した。細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで解離させ、次いで、３７℃で１０〜１４分間にわたって７５ｍＭＫＣｌ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中でインキュベートし、その後、３：１メチルアルコール／氷酢酸で固定した。ｍＦＩＳＨ核型分析のために、固定した細胞を、変性した「カクテルペインティング（ｃｏｃｋｔａｉｌｐａｉｎｔｉｎｇ）ｍＦＩＳＨ」プローブ（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ、Ａｌｔｕｓｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、１×ＳＳＣ及び０．４×ＳＳＣの連続浴中で洗浄し、核を、２５０ｎｇ／ｍｌのジアミジノ−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ビオチン化プローブを、Ｃｙ５ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓＢ−ｔｅｃｔ検出キット（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して明らかにした。１０〜２０個の分裂中期を、ＡｘｉｏＣａｍカメラ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、Ｆｒａｎｃｅ）に連結されたＵＶＨＢＯ１００−Ｗランプを備えたＺｅｉｓｓＺ１蛍光顕微鏡を使用して捕捉した。分析した全ての分裂中期を、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓＩｓｉｓソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して核型分析した。

アルカリホスファターゼ（ＡｌｃａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＡＰ）染色
ＭＥＦ上の培養物中のヒトｉＰＳ細胞を、室温で１０分間９５％エタノールで固定した。次いで、細胞を、ＰＢＳでリンスし、５ｍＭＭｇＣｌ_２及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．５中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｆｒａｎｃｅ）の混合物と共に室温で５〜１０分間インキュベートした。染色後、細胞をＰＢＳでリンスし、その後明視野顕微鏡下で可視化した。

胚様体の形成及び分析
ヒトｉＰＳ細胞コロニーを、実体顕微鏡（ＶｉｓｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬｔｄ．）下でＭＥＦ層から機械的に剥離し、次いで、ＲｅｐｒｏＳｔｅｍ培地中で超低付着培養皿（Ｎｕｎｃ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）中に、懸濁物中で培養した。培地を２日毎に交換し、ＥＢを２週間培養し、その後、ＲＮＡ抽出又は免疫組織化学分析を行った。

網膜分化
ヒトｉＰＳ細胞を、ｉＰＳ培地中で、マイトマイシン−Ｃ不活化マウスＭＥＦフィーダー層上に、コンフルエンスになるまで拡大増殖させた。０日目として規定されるこの時点で、コンフルエントなｈｉＰＳ細胞を、ＦＧＦ２なしのｉＰＳ培地中で培養した。２日後、この培地を、ダルベッコ改変イーグル培地：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１、Ｌ−グルタミン）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸及び１％Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって構成される「神経促進培地」に切り替えた。この培地を、２〜３日毎に交換した。１４日目に、色素細胞によって取り囲まれた同定された神経上皮様構造を単離し、最初の２日間の間、３ＤＮｕｔａｔｏｒ振盪機（ＶＷＲ、Ｆｒａｎｃｅ）上に乗せた２４ウェルプレート中で、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を補充した「神経促進培地」を用いて、浮遊構造（３Ｄ）として個々に培養し、培地を、２〜３日毎に交換した。単離された構造は、振盪機プラットフォーム上で培養した場合、培地中で懸濁されたままであり、通常は、培養プレートの底に付着できなかった。１９日目、２０日目又は２１日目に、ＦＧＦ２を除去し、「神経促進培地」の半分を、次の数週間にわたって２〜３日毎に交換した。

ＲＰＥ細胞培養物について、非色素性出芽構造なしの同定された色素性パッチを、７日目から１４日目の間で切り取り、０．１％ゼラチン被覆プレート上に移した（Ｐ０として示される）。ＲＰＥ細胞を、「神経促進」培地（上記を参照のこと）中で拡大増殖させ、培地を、２〜３日毎にコンフルエンシーまで交換し、細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ中で解離させ、新たなゼラチン被覆プレート上に播種した（継代Ｐ１とみなす）。

ＲＮＡ抽出及びＴａｑｍａｎアッセイ
総ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎＲＮＡＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ｎａｇｅｌ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して抽出し、ＲＮＡの収量及び品質を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてチェックした。ｃＤＮＡを、製造者の推奨に従ってＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５００ｎｇの総ＲＮＡから合成した。次いで、合成したｃＤＮＡを、ＤＮａｓｅを含まない水中で１／２０で希釈し、その後定量的ＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲ分析を、製造者の指示に従って、カスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｒｒａｙ９６−ＷｅｌｌＦａｓｔプレート及びＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲシステムズ（７５００ＦａｓｔＳｙｓｔｅｍ）で実施した。増幅のための、全てのプライマー及びＦＡＭで標識したＭＧＢプローブを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。結果を、１８Ｓに対して標準化し、遺伝子発現の定量は、３回の独立した実験におけるΔＣｔ法に基づいた。ヒト成人ＲＰＥ細胞由来の対照ＲＮＡは、中心窩レベルにおいて切り出された眼杯から単離されたＲＰＥ細胞に対応する。

凍結切片、免疫染色及び画像獲得
凍結切片のために、網膜様構造を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で４℃で１５分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄した。構造を、最低２時間の間、ＰＢＳ／３０％スクロース（Ｓｉｇｍａ）溶液中で４℃でインキュベートした。構造を、ＰＢＳ、７．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）、１０％スクロース溶液中に包埋し、−５０℃でイソペンタン中で凍結させ、１０μｍ厚の凍結切片を収集した。

切片の免疫蛍光染色を、以前に記載されたように実施した（Ｒｏｇｅｒら２００６）。簡潔に述べると、スライドを、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．２％ゼラチン及び０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共に、室温で１時間インキュベートし、次いで、一次抗体（表２を参照のこと）と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドを、Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＴ）を含むＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、１：１００００ＤＡＰＩを有するブロッキング緩衝液中で１：６００に希釈した、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８又は５９４（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とコンジュゲート化した適切な二次抗体と共に１時間インキュベートした。蛍光染色シグナルを、ＣＣＤＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱカメラ（ＲｏｐｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＤＭ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて、又は４０５、４８８及び５４３ｎｍのレーザーを備えたＯｌｙｍｐｕｓＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用して、捕捉した。共焦点画像を、１．５５又は０．４６μｍの刻み幅を使用して獲得し、各獲得は、２〜４のスタック又は４〜８の光学切片の投影であった。

奇形腫形成アッセイ
奇形腫形成アッセイを、僅かな改変を伴って、以前に記載されたように（Ｇｒｉｓｃｅｌｌｉら、２０１２）実施した。簡潔に述べると、１×１０^６〜２×１０^６細胞を、６週齢ＮＯＤＳｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の後肢筋肉中に注射した。９〜１０週間後、奇形腫を切り出し、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。次いで、サンプルを、パラフィン中に包埋し、切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

食作用アッセイ
光受容体外節（ＰＯＳ）を、ブタの眼から精製し、確立された手順（２）に従って、０．１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ（異性体−１）とのインキュベーションによって、蛍光色素で共有結合的に標識した。継代３におけるＲＰＥ−Ｊ（不死化ラットＲＰＥ細胞系）及び継代１におけるｈｉＲＰＥ細胞を、９６ウェル組織培養プレートの個々のウェル中に配置した。各ウェルを、１×１０６のＰＯＳ粒子を含む１００μＬのＤＭＥＭで層状化し、３２℃（ＲＰＥ−Ｊ）又は３７℃（ｈｉＲＰＥ）で３時間インキュベートし、その後、１ｍＭＭｇＣｌ_２及び０．２ｍＭＣａＣｌ_２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＭ）でフィルターウェルを３回リンスした。内在化された粒子の排他的な検出のために、表面結合ＦＩＴＣ−ＰＯＳの蛍光を、ＰＢＳ−ＣＭ中０．２％トリパンブルー中での１０分間のインキュベーションによって選択的にクエンチし、その後細胞を固定した。細胞を、氷冷メタノール中で５分間のインキュベーションによって固定し、その後、再水和し、室温で１０分間ＤＡＰＩとインキュベーションした。蛍光シグナルを、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを用いて定量した。ＲＰＥ−Ｊ細胞系を、食作用活性についての陽性対照として使用し、ＰＯＳの非存在下のｈｉＲＰＥ細胞を、陰性対照として使用した。

統計分析
分散の分析を、全てのペアワイズ分析のために、ノンパラメトリックＦｒｉｅｄｍａｎ検定とその後のＤｕｎｎの多重比較検定、又はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｐｒｉｓｍ６、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）のいずれかを用いて実現した。Ｐ＜０．０５の値を、統計的に有意とみなした。

１．２結果
ヒト組込みフリーのｉＰＳ細胞の生成及び特徴付け
成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＨＤＦ）を、Ｙｕら（２００９）によって以前に記載されたプラスミドベクターに対応する、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及びｃＭＹＣをコードする３つのプラスミドと共に共トランスフェクトした。トランスフェクトした線維芽細胞を、再プログラミングプロセスを加速し、エピソームベクターの喪失を低減させると以前に記載された小分子（Ｚｈａｎｇら２０１２）（図１Ａ）の存在下で「ｉＰＳ培地」中で培養した。ＥＳ様コロニーが、最初に、密集したドーム様構造を伴って、トランスフェクションのおよそ３０から４０日後の間に、可視的になった（図１Ｂ）。選別及び拡大増殖した時点で、これらのｈｉＰＳ細胞コロニーは、典型的なヒトＥＳ細胞の形態を示した。これらのｈｉＰＳ細胞の分析は、クローンが、多能性マーカーＮａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ４及びＳＳＥＡ４の発現と共に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を発達させたことを実証した（図１Ｃ〜Ｅ）。ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくＴａｑＭａｎプローブにより、多能性遺伝子の発現が、それぞれの線維芽細胞集団を超えて顕著に増加し、ヒトＥＳ細胞において見られたものと匹敵したことが明らかになった（図１Ｉ）。ｉＰＳコロニーは、培養物中で２週間後の胚様体に対する、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくＴａｑＭａｎプローブ（図１Ｊ）及び免疫組織化学（図１Ｆ〜Ｈ）によって観察されるように、３つ全ての胚葉の誘導体へとｉｎｖｉｔｒｏで分化できた。さらに、ヒトｉＰＳ細胞系は、正常な核型を示した（図１Ｋ）。ｈｉＰＳ細胞は、導入遺伝子のゲノム組込みを示さず、エピソーム中のＯｒｉＰ部位に対するＲＴ−ＰＣＲ分析によって実証されるように、１５継代後にエピソームベクターを完全に喪失した（図１Ｌ）。ヒトｉＰＳＣ系の多能性は、奇形腫形成アッセイによって検証した。

眼野識別性を有する神経上皮様構造へのｈｉＰＳ細胞の分化
ｉＰＳ細胞分化のための必要条件は、自己再生機構のシャットダウンであるので、ＦＧＦ２を培地から除去して、コンフルエントなｉＰＳ細胞の自発的分化を促進した。培養培地からのＦＧＦ２の中止（withdrawal）は、ヒトＥＳ細胞においてＧｒｅｂｅｒら（２０１１）によって申し分なく実証されたように、神経外胚葉誘導もまた促進し得る。神経外胚葉系列へのｈｉＰＳ細胞のこの分化に都合がいいように、コロニーを、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸及び１％Ｎ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む神経促進培地中で培養した（図２Ａ）。これは、４日以内の色素性コロニーの出現をもたらした。７日後、フェーズ−ブライト構造は、色素細胞のパッチの半分よりも多くに近接するようになり始めた（図２Ｂ）。２週間以内に、全てのこれらの構造は、１ｃｍ^２当たり１〜２個の構造に対応する、色素細胞のパッチで部分的に取り囲まれた神経上皮様構造へと組織化された（図２Ｃ）。他の色素性コロニーは、神経上皮様構造を発生させず、これらの構造の形成は、非色素性領域ではめったに観察されなかった。１４日目に、ｑＲＴ−ＰＣＲに基づくＴａｑＭａｎプローブにより、全ての形成された神経上皮様構造が、多能性関連遺伝子ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）の発現を喪失し、眼野特定化と関連する転写因子、例えばＬＨＸ２、ＲＡＸ、ＰＡＸ６、ＳＩＸ３の発現を獲得したことが明らかになった（図２Ｄ）。神経上皮（ｎｅｕｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）様構造の免疫染色により、全ての細胞が、眼野細胞に特徴的なＰＡＸ６及びＲＡＸ（Ｍａｔｈｅｒｓ及びＪａｍｒｉｃｈ２０００）を同時発現したことが実証された（図２Ｅ〜Ｇ）。ほぼ全ての細胞がＬＨＸ２陽性であり（図２Ｈ、２Ｊ）、それらの前駆体状態が、細胞増殖マーカーＫｉ６７を使用して確認された（図２Ｈ〜Ｊ）。ｑＲＴ−ＰＣＲにより、眼胞／眼杯形成の間の網膜特定化に関与する２つの転写因子ＭＩＴＦ及びＶＳＸ２（Ｈｏｒｓｆｏｒｄら２００５）の発現が、１４日目においてそれぞれ１０及び１００倍増加されることがさらに実証された（図２Ｄ）。免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により、ＶＳＸ２及びＭＩＴＦ発現の正反対の勾配が明らかになり、ＶＳＸ２について最も強力な染色が、神経上皮様構造において明らかになり、一方で、最も強いＭＩＴＦ発現が、構造の周辺の色素性部分に見出された（図１Ｋ〜Ｏ）。合わせると、これらの知見により、神経上皮様構造が神経網膜前駆体に典型的なマーカー発現プロフィールを有し、神経網膜（ＮＲ）様構造と改名され得ることが実証される。興味深いことに、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、光受容体先駆体の転写因子、例えばＮＲＬ及びＣＲＸの発現が、培養物中での早くも１４日後に、ＮＲ様構造において５倍増加することが明らかになり（図２Ｄ）、これは、一部の網膜前駆体が、光受容体系列において既に関与していた可能性があることを示唆する。

遺伝子発現分析により、コンフルエントなｈｉＰＳＣ培養物中で、Ｗｎｔ及びＢＭＰアンタゴニスト、ＤＫＫ１及びノギン（ｎｏｇｇｉｎ）の内因性発現が明らかになり、両方の遺伝子が、神経上皮様構造の形成の間に上方調節された（図２Ｐ）。

ｈｉＰＳ細胞から誘導された網膜前駆体は、網膜ニューロンへと効率的に分化する
細胞の周囲の色素性パッチを伴うＮＲ様構造に対応する構造全体（図２Ｃ）を、１４日目に機械的に単離し、３Ｄ撹拌下で浮遊構造としてさらに培養した（図３Ａ）。浮遊構造を、ＲＰＥ系列への分化ではなく神経網膜分化に都合がよいように、ＦＧＦ２の存在下で培養した（Ｆｕｈｒｍａｎｎ２０１０；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓら２００４）。単離の１日後（１５日目）に、このＮＲ様構造は、培養の間にサイズが増加し続けた中空球を形成した（図３Ｂ〜Ｄ）。定量的分析により、１７日目から２４日目の間に、１３９±１９μｍから２５１±４１μｍまでの、神経上皮の厚さにおける増加が示された（図７）。本発明者らは、成長中の球からＲＮＡを単離することによるｑＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学の両方を使用して、特異的網膜表現型の時間過程及び獲得を分析した。１４日目から４２日目までの分化プロセスを通じて、網膜の特定化及び分化に関与する転写因子、例えばＬＨＸ２、ＲＡＸ、ＳＩＸ３、ＰＡＸ６、ＶＳＸ２及びＭＩＴＦが、なおも発現された（図３Ｅ）。２１日目に、ＶＳＸ２を発現している細胞は、ＮＲ様構造の発生中の神経上皮（ｎｅｕｒｏｅｐｔｉｔｈｅｌｉｕｍ）中に位置し、ＭＩＴＦ陽性細胞は、構造の周辺におけるＲＰＥ細胞中で排他的に見出された（図３Ｇ）。ＲＰＥ細胞におけるＭＩＴＦ発現の制限が、ＮＲ様構造におけるそのｍＲＮＡ発現の減少によって確認された（図１Ｅ）。ＶＳＸ２陽性細胞は、神経上皮の外側部分に沿って優勢に位置し、ＰＡＸ６もまた発現する（図３Ｈ）。ＰＡＸ６陽性／ＶＳＸ２陰性細胞は、神経上皮の内側部分において集合し、これは、最初の分化している網膜ニューロンに対応し得、増殖マーカーＫｉ６７を有さなかった。実際、早くも２１日目に、神経節細胞及びアマクリン細胞が、ＢＲＮ３Ａ（図３Ｉ）又はカルレチニン（図３Ｍ）に対する抗体を用いた、同じ内部位置における免疫組織化学によって同定された。分化している水平細胞に対応するＬＩＭ１陽性細胞もまた、発生中の神経上皮において見出された（図３Ｎ）。光受容体などの網膜細胞の分化に関与する転写因子をコードする２つの遺伝子ＯＴＸ２及びＮＥＵＲＯＤ１（Ｂａｓｓｅｔ及びＷａｌｌａｃｅ２０１２）の発現は、浮遊培養の間に大きく増加した（図３Ｅ）。免疫組織化学的分析により、構造の周辺におけるＲＰＥ細胞中のＯＴＸ２の発現、及び光受容体の傾倒した先駆体（Ｎｉｓｈｉｄａら、２００３）に対応する神経上皮中へのＯＴＸ２陽性細胞の出現が示された（図３Ｉ）。光受容体系列への分化は、１４日目から４２日目までの、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＮＲＬ及びＣＲＸ発現の大きな増加によって確認される（図３Ｆ及び図６Ａ）。ＣＲＸ陽性細胞は、２１日目及び２８日目における数の進行性の増加（図３Ｋ、Ｌ）を伴って、早くも１４日目に、神経上皮において同定可能であった（図３Ｊ）。この段階で、光受容体先駆体が、リカバリン免疫染色を用いて同定された（図３Ｏ）。

２１日目に、ＣＲＸ^＋細胞は、神経上皮においてＯＴＸ２と同時発現した（図６Ｃ〜Ｈ）。２８日目に、ＣＲＸは、有糸分裂後のＫｉ６７−細胞において、本質的に発現された（図６Ｍ）。予測されたように（Ｎｉｓｈｉｄａら、２００３）、ＯＴＸ２^＋傾倒した光受容体先駆体は、ＰＡＸ６を発現しなかった（図６Ｎ）。これらのデータは全て、これらの培養条件が、網膜細胞の主要な型（神経節細胞、アマクリン／水平細胞及び光受容体）へのｈｉＰＳ細胞の分化を３週間で可能にすることを実証している。さらに、本明細書で開発したプロトコールは、２つの個別の非組込みｈｉＰＳＣ系（ｈｉＰＳＣ−１及びｈｉＰＳＣ−２）を比較したときに、良好な再現性を示した（図８）。

ｈｉＰＳ細胞からのＲＰＥ細胞の生成
神経促進培地中で培養したコンフルエントなｈｉＰＳ細胞由来の細胞の色素性パッチの迅速な出現を考慮して、本発明者らは、これらを単離し、ＲＰＥ細胞に分化させようとした。７日目から１４日目の間に、細胞の色素性パッチを、機械的に選択し、拡大増殖のためにゼラチン被覆プレート上に再プレートした（図４Ａ）。３週間〜１ヵ月後に、これらは、ＲＰＥ細胞の古典的な敷石状形態を示すコンフルエントな細胞単層を形成した（図４Ｂ〜Ｃ）。ほとんどの細胞は、重要なＲＰＥ特異的転写因子ＭＩＴＦについて免疫反応性であり、細胞−細胞界面は、網膜色素上皮のタイトジャンクションマーカーＺＯ−１によってラインがひかれていた（図４Ｄ）。成人ヒトＲＰＥ細胞に対して標準化したｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ｈｉＲＰＥ細胞が、数継代の後、成熟ＲＰＥ関連マーカー、例えばＭＥＲＴＫ、ＲＰＥ６５、ＢＥＳＴ１及びＰＥＤＦの発現を保持したことが実証された（図４Ｅ）。ｈｉＲＰＥ細胞が機能的かどうか決定するために、ＦＩＴＣ標識光受容体外節（ＰＯＳ）の食作用を実施するそれらの能力を試験した。３時間以内に、３０％内在化ＰＯＳの平均で、対照ＲＰＥ−Ｊ細胞系に対してと同程度に効率的な、顕著な食作用活性が検出された（図４Ｆ）。

（例２）
後期に生じる網膜細胞型への網膜前駆体細胞の分化
浮遊培養における単離されたＮＲ様構造の長期維持により、ｑＲＴ−ＰＣＲによって実証されるように、後期に生じる網膜細胞型へのＲＰＣのさらなる分化が可能になった（図９Ａ〜Ｅ）。実際、成熟中のＲＧＣ（ＢＲＮ３Ａ及びＢ）、アマクリン（カルレチニン及びＧＡＤ２）、及び水平細胞（ＬＩＭ）の、初期に生じる網膜マーカーの最初の発現（図９Ａ及びＢ）の後、錐体（Ｒ／Ｇオプシン、ブルーオプシン及び錐体アレスチン）及び桿体光受容体（ロドプシン及びリカバリン）（図９Ｃ及びＤ）、双極（ＰＫＣα）及びミュラーグリア細胞（ＧＬＡＳＴ１）（図９Ｅ）に対応する、後期に生じる網膜細胞型のマーカーの出現が観察された。２１日目（図９Ｆ）から４２日目（図９Ｇ）の間に、ＮＲ様構造のほとんどが、その層状の外観を喪失し、ＲＧＣ（ＢＲＮ３Ａ及びカルレチニン）、アマクリン（カルレチニン及びＡＰ２）及び水平細胞（ＬＩＭ）（図９Ｇ〜Ｊ）の異なるマーカーを発現した細胞によって取り囲まれた、分化している光受容体に対応する、ＯＴＸ２^＋、ＣＲＸ^＋及びリカバリン^＋細胞を含んだ内部ロゼットを発達させた（図９Ｇ、Ｊ〜Ｌ及び図６Ｆ〜Ｈ）。興味深いことに、４２日目に、リカバリン^＋細胞は、移植のための光受容体先駆体の細胞ソーティングに使用されるマーカー（Ｅｂｅｒｌｅら、２０１１）、細胞表面マーカーＣＤ７３（図９Ｌ）を発現した。７７日目に、ＰＡＸ６は、ＲＧＣ、アマクリン及び水平細胞におけるその発現（図９Ｍ）と一致して、有糸分裂後細胞（ＫＩ６７⁻）において、ロゼットの外側にのみ存在した。１１２日目までに、ロドプシン及びＲ／Ｇオプシンが、ＮＲ様構造中に出現し、これは、桿体及び錐体の両方の成熟化を反映している（図９Ｎ、Ｏ）。リカバリン^＋及びロドプシン^＋細胞は、共通して、１１２日目において、残留ロゼットの最も内側部分において局在化した（図１０Ａ及びＢ）。興味深いことに、連結性の繊毛マーカーアセチル化チューブリンを使用する免疫組織化学により、リカバリン^＋細胞に隣接するロゼットの管腔帯における非常に薄い構造の存在が明らかになり、これは、潜在的な繊毛及び光受容体外節の形成を示唆している（図１０Ｃ及びＤ）。２つの他の後期に生じる網膜細胞型、双極及びミュラーグリア細胞の分化は、ＰＫＣα染色（図９Ｐ）によって、並びにグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）及びＳＯＸ９の同時発現（図９Ｑ）によってそれぞれ検出されるまで、培養により長い時間（１１２日目）もまた必要とした。それによって、これらの細胞培養条件は、連続的な様式での、ＮＲ様構造中に存在するＲＰＣからの全ての網膜細胞型の生成を可能にした。

（例３）
Ｎｏｔｃｈ阻害による光受容体先駆体生成の加速
ＣＲＸ及びリカバリンに対する抗体を用いた免疫組織化学的分析により、光受容体先駆体の数が、１４日目（図３Ｊ）から２８日目（図３Ｌ、図５Ｂ）の間に徐々に増加したことが実証された。２１日目から３５日目の間に、これらのＮＲ様構造は、その層状構造を喪失し、ＣＲＸ及びリカバリン（ＲＥＣＯＶＲＩＮ）陽性細胞を含む内部ロゼットを発達させた（図５Ｂ）。興味深いことに、７日間にわたる２１日目におけるＮｏｔｃｈインヒビターＤＡＰＴの添加は、ＣＲＸ及びリカバリン陽性細胞の両方の数を劇的に増加させるのに十分である（図５Ｂ）。２８日目から３５日目までのＤＡＰＴによる後の処理もまた、ＣＲＸ及びリカバリンを発現する細胞の数における大きな増加をもたらした（図５Ｂ）。２１日目から２８日目の間のＤＡＰＴによる１週間の処理は、光受容体先駆体の増強された生成を可能にしたが、これは、２８日目に、ＣＲＸ^＋及びリカバリン^＋細胞の数が、対照と比較して、それぞれ２．２倍及び２．６倍増加したからである（図５Ｃ）。付随して、Ｋｉ６７染色によって２８日目に評価した有糸分裂前駆体の集団は、２８日目の処理の後に、大きく減少した（３分の１）（図５Ｃ）。Ｎｏｔｃｈ阻害の効果はまた、２８日目から３５日目の間に評価されたが、これは、ＤＡＰＴへの長期曝露ではなく、いくつかのＲＰＣが、ＤＡＰＴ処理後の２８日目に残存したからである。これらの条件下で、Ｎｏｔｃｈ阻害は、ＮＲ様構造内の光受容体先駆体の数における増加、即ち、それぞれ、ＣＲＸ^＋及びリカバリン^＋細胞の数における３５日目における１．７倍及び４．１倍の増加もまたもたらした（図５Ｄ）。興味深いことに、３５日目には通常は検出されない錐体−アレスチン^＋細胞が、ＤＡＰＴ処理後の時点で明確に同定できた（示さず）。さらに、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＤＡＰＴ処理後の３５日目における錐体−アレスチン発現の増加が確認されたが、ロドプシン、ブルーオプシン及びＧ／Ｒオプシンの遺伝子発現における顕著な変化は観察されなかった（図５Ｅ）。ＧＬＡＳＴ１発現は、ＤＡＰＴ処理後に減少した（図５Ｅ）。

これらの知見は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、ｈＥＳ細胞について最近示唆されたように（Ｎａｋａｎｏら２０１２）、ｈｉＰＳ細胞からの光受容体分化を減速させ、従って、その阻害が、光受容体分化に好都合であり、多分化能性ＲＰＣからの光受容体先駆体の生成を加速することを実証している。

（例４）
考察
この研究は、無血清神経促進培地中でのコンフルエントなｈｉＰＳＣの単純な培養が、２週間でＮＲ様構造及びＲＰＥ細胞を生成するのに十分であるという新規知見を示している。本明細書に記載されるプロセスは、ＥＢの形成及び選択、ＤＫＫ１、ノギン（ＮＯＧＧＩＮ）及びＷＮＴ並びに／又はＭａｔｒｉｇｅｌなどの誘導分子の添加、並びに接着性基材上のＥＢ被覆のステップを回避する。初期に生成される構造は、ＰＡＸ６及びＲＡＸの同時発現によって明らかなＯＶ表現型、並びに神経上皮とＲＰＥとの間でのＶＳＸ２及びＭＩＴＦの正反対の勾配を示す。この効率は、コンフルエントなｈｉＰＳＣによる、ｈＥＳＣＳ又はｈｉＰＳＣの網膜分化のために一般的に添加される神経及び網膜特定化の２つの誘導因子ＤＫＫ１及びノギン（ＮＯＧＧＩＮ）の漸増する内因性の生成に一部起因する可能性が高い（Ｍｅｙｅｒら、２０１１；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅら、２０１３）。それにもかかわらず、以前の研究は、培養培地に添加された又はＭａｔｒｉｇｅｌ中に存在するＩＧＦ−Ｉが、網膜前駆体識別性にｈＥＳＣを指向させ得ることを報告しており（Ｌａｍｂａら、２００６；Ｚｈｕら、２０１３）、これは、Ｎ２サプリメント中に既に存在しているインスリンが、上記条件における類似の役割を果たすのに十分であることを示唆している。

単離されたｈｉＰＳＣ由来ＮＲ様構造の浮遊培養により、ｉｎｖｉｖｏの脊椎動物網膜形成と一致する連続的な様式での、全ての網膜細胞型へのＲＰＣの分化が可能になり、これは、ｈｉＰＳＣ由来ＲＰＣの多分化能性を実証している。興味深いことに、本発明者らは、ＲＰＣが光受容体系列に傾倒するときのＮｏｔｃｈ経路の阻害が、ＣＲＸ^＋細胞における２倍の増加で、ＮＲ様構造中の光受容体先駆体の割合を明らかに増強することもまた報告している。ＮｏｔｃｈインヒビターＤＡＰＴによる１週間の処理は、実際に、ＲＰＣの大部分が細胞周期を出るように誘導するのに十分であり、錐体先駆体マーカーもまた発現するＣＲＸ＋光受容体先駆体の約４０％の、３５日後の生成を可能にする。この戦略は、治療適用での細胞の効率的な生成に有利である。ＮＲ様構造は、Ｎａｋａｎｏら（２０１２）により、ｈＥＳＣを使用するＥＢ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ依存的プロトコールに洗練されて報告されているように、二層化杯を形成するように陥入することはなかった。その代り、ｈｉＰＳＣ由来の構造は、２１日目まで層状の組織化を維持し、引き続いて、網膜内顆粒層特異的識別性を有する細胞及びＲＧＣの両方によって取り囲まれた中心領域において、光受容体様細胞を含むロゼットを発達させた。しかし、成熟した重層化ＮＲ組織を生成することは、精製された光受容体先駆体又は他の網膜由来細胞に基づく将来的な細胞治療戦略のために不可欠なわけではない。これに関して、本発明のプロトコールは、４２日間での、移植のための有望な候補、即ち、ＣＤ７３^＋光受容体先駆体の生成を可能にする。このような先駆体は、以前に精製されており、マウス網膜において首尾よく移植されている（Ｅｂｅｒｌｅら、２０１１）。ＮＯＴＣＨ阻害及びＣＤ７３選択を組み合わせることの可能性は、多数の移植可能な細胞の単離を可能にし、網膜ジストロフィーにおける変性した光受容体の置換の大きな期待が見込める。ＮＲ様構造からＲＧＣを生成する能力は、緑内障の処置にとって重要な意味を有する。網膜ニューロンの生成に加えて、本発明のプロトコールは、付随して、そのｉｎｖｉｖｏ状態に近い表現型を保持したままで、容易に継代及び増幅され得るＲＰＥ細胞（ｈｉＲＰＥ）の生成を可能にする。本発明のプロトコールは、本明細書で、ＡＭＤ及び他のＲＰＥ関連疾患の将来的な処置のために意図されたｈｉＲＰＥ細胞のバンクを迅速に生成する大きな潜在力を有する。

臨床グレードを維持する目的で、本発明者らは、エピソーム再プログラミングによってｈｉＰＳＣを生成したが、これは、レンチウイルスベクターの使用が、遺伝子毒性の危険性を有するからである。自家フィーダーは、ｈｉＰＳＣの維持のために使用され得る；異物フリー及びフィーダーフリーの系は、再生治療に好ましい。薬理学的展望から、ｈｉＰＳＣは、薬物発見の最初のプロセスにおいて新たな化合物をプロファイリングする価値ある潜在力を提供する。ｈｉＰＳ由来のＲＰＣ及びＲＰＥ細胞の増殖能は、網膜ジストロフィーの将来的な処置のための特定の活性化合物を同定することを目的とした、表現型ベース及び標的ベースのハイスループットスクリーニングのための新たな細胞性ツールの開発を確実にするはずである。

特定の網膜系列へとｈｉＰＳＣを分化させるために通常必要とされる時間のこのような労働集約性の手動ステップの必要性を排除するこの新たなプロトコールは、多数のＲＰＥ細胞及び多分化能性ＲＰＣの両方を生成するための、容易に拡大縮小可能なアプローチを提供する。従って、比較的短い期間で、本明細書に記載される方法は、再生医療及び医薬的試験／薬物スクリーニングへの新規アプローチの期待が見込める光受容体先駆体又はＲＧＣの供給源を提供する。ｈｉＰＳＣを使用するこの戦略は、ヒト網膜発生の基礎となる分子及び細胞機構を研究する機会もまた提供し、ヒト網膜変性疾患のｉｎｖｉｔｒｏモデルの開発を進展させるはずである。

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Ｍｅｌｌｏｕｇｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｓｅｒｎａｇｏｒ，Ｅ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｇｉｍｅｎｏ，．Ｉ，Ｓｔｅｅｌ，Ｄ．Ｈ．，ａｎｄＬａｋｏ，Ｍ．（２０１２）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｏｗａｒｄｒｅｔｉｎａｌｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ３０，６７３−６８６．
Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｃａｐｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｅ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌ．Ｓ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｋ．Ａ．，ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．，ａｎｄＧａｍｍ，Ｄ．Ｍ．（２００９）Ｍｏｄｅｌｉｎｇｅａｒｌｙｒｅｔｉｎａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｗｉｔｈｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６，１６６９８−１６７０３．
Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｏｗｄｅｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｋ．Ａ．，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ，Ａ．Ｄ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌ．Ｓ．，Ｃａｐｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｅ．，Ｐｉｎｉｌｌａ，Ｉ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｉａｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．，Ｐａｔｔｎａｉｋ，Ｂ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄＧａｍｍ，Ｄ．Ｍ．（２０１１）Ｏｐｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅ−ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆａｃｉｌｉｔａｔｅａｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄａｐｐｒｏａｃｈｔｏｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２９，１２０６−１２１８．
Ｎａｋａｎｏ，Ｔ．，Ａｎｄｏ，Ｓ．，Ｔａｋａｔａ，Ｎ．，Ｋａｗａｄａ，Ｍ．，Ｍｕｇｕｒｕｍａ，Ｋ．，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ｋ．，Ｙｏｎｅｍｕｒａ，Ｓ．，Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ．，ａｎｄＳａｓａｉ，Ｙ．（２０１２）Ｓｅｌｆ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｏｐｔｉｃｃｕｐｓａｎｄｓｔｏｒａｂｌｅｓｔｒａｔｉｆｉｅｄｎｅｕｒａｌｒｅｔｉｎａｆｒｏｍｈｕｍａｎＥＳＣｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１０，７７１−７８５．
Ｎｉｓｈｉｄａ，Ａ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ａ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｃ．，Ｔａｎｏ，Ｙ．，Ａｉｚａｗａ，Ｓ．，Ｍａｔｓｕｏ，Ｉ．，ａｎｄＦｕｒｕｋａｗａ，Ｔ．（２００３）Ｏｔｘ２ｈｏｍｅｏｂｏｘｇｅｎｅｃｏｎｔｒｏｌｓｒｅｔｉｎａｌｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｆａｔｅａｎｄｐｉｎｅａｌｇｌａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２，１２５５−１２６３．
Ｏｓａｋａｄａ，Ｆ．，Ｉｋｅｄａ，Ｈ．，Ｍａｎｄａｉ，Ｍ．，Ｗａｔａｙａ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｎ．，Ａｋａｉｋｅ，Ａ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．，ａｎｄＴａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．（２００８）Ｔｏｗａｒｄｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｏｄａｎｄｃｏｎｅｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅ，ｍｏｎｋｅｙａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，２１５−２２４．
Ｏｓａｋａｄａ，Ｆ．，Ｊｉｎ，Ｚ．Ｂ．，Ｈｉｒａｍｉ，Ｙ．，Ｉｋｅｄａ，Ｈ．，Ｄａｎｊｙｏ，Ｔ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．，ａｎｄＴａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．（２００９）Ｉｎｖｉｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｔｉｎａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１２２，３１６９−３１７９．
Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ，Ｓ．，Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．，Ｂａｂａｉ，Ｎ．，Ｑｉｕ，Ｆ．，Ｅｕｄｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｈｏｒｅｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．，ａｎｄＡｈｍａｄ，Ｉ．（２０１０）Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｇｅｎｅｒａｔｅｂｏｔｈｒｅｔｉｎａｌｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓａｎｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｇｌａｕｃｏｍａａｎｄａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄｍａｃｕｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ４，６９５−７０３．
Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｒｉｚｚｉ，Ｍ．，Ｈｉｐｐｅｒｔ，Ｃ．，Ｘｕｅ，Ｔ．，Ｗｅｓｔ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｕｒａｎ，Ｙ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｚ．，Ａｚａｍ，Ｓ．Ａ．，Ｌｕｈｍａｎｎ，Ｕ．Ｆ．，Ｂｅｎｕｃｃｉ，Ａ．，Ｓｕｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｒａｎｄｉｎｉ，Ｍ．，Ｙａｕ，Ｋ．Ｗ．，Ｓｏｗｄｅｎ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄＡｌｉ，Ｒ．Ｒ．（２０１２）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎｏｆｖｉｓｉｏｎａｆｔｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ４８５，９９−１０３．
Ｒｏｇｅｒ，Ｊ．，Ｂｒａｊｅｕｌ，Ｖ．，Ｔｈｏｍａｓｓｅａｕ，Ｓ．，Ｈｉｅｎｏｌａ，Ａ．，Ｓａｈｅｌ，Ｊ−Ａ．，Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ，Ｘ．，ａｎｄＧｏｕｒｅａｕ，Ｏ．（２００６）ＩｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＰｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎｉｎＣＮＴＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌａｔｅｒｅｔｉｎａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９８，５２７−５３９．
Ｔｕｃｋｅｒ，Ｂ．Ａ．，Ａｎｆｉｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．，Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｒ．Ｆ．，Ｓｔｏｎｅ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄＹｏｕｎｇ，Ｍ．Ｊ．（２０１３）Ｕｓｅｏｆａｓｙｎｔｈｅｔｉｃｘｅｎｏ−ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｔｉｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１，１６−２４．
Ｚａｈａｂｉ，Ａ．，Ｓｈａｈｂａｚｉ，Ｅ．，Ａｈｍａｄｉｅｈ，Ｈ．，Ｈａｓｓａｎｉ，Ｓ．Ｎ．，Ｔｏｔｏｎｃｈｉ，Ｍ．，Ｔａｅｉ，Ａ．，Ｍａｓｏｕｄｉ，Ｎ．，Ｅｂｒａｈｉｍｉ，Ｍ．，Ａｇｈｄａｍｉ，Ｎ．，Ｓｅｉｆｉｎｅｊａｄ，Ａ．，Ｍｅｈｒｎｅｊａｄ，Ｆ．，Ｄａｆｔａｒｉａｎ，Ｎ．，Ｓａｌｅｋｄｅｈ，Ｇ．Ｈ．，ａｎｄＢａｈａｒｖａｎｄ，Ｈ．（２０１２）Ａｎｅｗｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｄｉｒｅｃｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍｎｏｒｍａｌａｎｄｒｅｔｉｎａｌｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ．２１，２２６２−２２７２．
Ｖａａｊａｓａａｒｉ，Ｈ．，Ｉｌｍａｒｉｎｅｎ，Ｔ．，Ｊｕｕｔｉ−Ｕｕｓｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｒａｊａｌａ，Ｋ．，Ｏｎｎｅｌａ，Ｎ．，Ｎａｒｋｉｌａｈｔｉ，Ｓ．，Ｓｕｕｒｏｎｅｎ，Ｒ．，Ｈｙｔｔｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｕｕｓｉｔａｌｏ，Ｈ．，ａｎｄＳｋｏｔｔｍａｎ，Ｈ．（２０１１）Ｔｏｗａｒｄｔｈｅｄｅｆｉｎｅｄａｎｄｘｅｎｏ−ｆｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１７，５５８−５７５
Ｙｕ，Ｊ．，Ｈｕ，Ｋ．，Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ，Ｋ．，Ｔｉａｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．，Ｓｌｕｋｖｉｎ，Ｉ．Ｉ．，ａｎｄＴｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．（２００９）Ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｅｅｏｆｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４，７９７−８０１．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｔ．，ａｎｄＤｉｎｇ，Ｓ．（２０１２）Ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｂｉｇｒｏｌｅｓ − ｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｔｅａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１２５，５６０９−５６２０．
Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｃａｒｉｄｏ，Ｍ．，Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，Ａ．，Ｋｕｒｔｈ，Ｔ．，Ｋａｒｌ，Ｍ．Ｏ．，Ａｄｅｒ，Ｍ．，ａｎｄＴａｎａｋａ，Ｅ．Ｍ．（２０１３）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｕｌｔｕｒｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｕｓｅｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｔｏｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３；８（１）：ｅ５４５５２．

Claims

ヒト網膜前駆体をｉｎｖｉｔｒｏで得るための方法であって、
（ｉ）マイトマイシン−Ｃ不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層からなる接着性培養系においてコロニー型単層を形成しているヒト多能性幹細胞の接着性培養物を神経促進培地中に配置するステップであって、該神経促進培地は、トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン及び亜セレン酸ナトリウムを含む培地サプリメントが補充されている、ステップ；並びに
（ｉｉ）色素細胞及び／又は神経上皮様構造の出現まで少なくとも７日間、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ、
を含む、上記方法。
前記神経促進培地が、分化因子ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｋｋ−１及びＩＧＦ−１、のうちの少なくとも１つを欠く、請求項１に記載の方法。
前記神経促進培地が、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｋｋ−１及びＩＧＦ−１を欠く、請求項２に記載の方法。
ステップ（ｉ）において、前記コロニー型単層が、少なくとも８０％コンフルエンスに達する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）を得るための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉｉｉ_ＲＰＥ）ステップ（ｉｉ）において得られた培養物から、少なくとも１つの色素細胞を収集するステップ；及び
（ｉｖ_ＲＰＥ）ステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）において得られた色素細胞（単数又は複数）を培養するステップ、
をさらに含む、上記方法。
ステップ（ｉｖ_ＲＰＥ）における培養が、接着性培養系において実施される、請求項５に記載の方法。
神経網膜細胞を得るための、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉｉｉ_ＮＲ）ステップ（ｉｉ）において得られた培養物から、少なくとも１つの神経上皮様構造由来の細胞を収集するステップ；及び
（ｉｖ_ＮＲ）ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において得られた細胞を培養するステップ、
をさらに含む、上記方法。
少なくとも１つの神経上皮様構造が、ステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）において収集される、請求項７に記載の方法。
ステップ（ｉｖ_ＮＲ）における培養が、非接着性培養系において実施される、請求項７又は請求項８に記載の方法。
ステップ（ｉｖ_ＮＲ）において、培養培地に、少なくとも５日間の間、ＦＧＦ２が補充される、請求項７から９までのいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｉｖ_ＮＲ）における培養が、振盪条件下で実施される、請求項７から１０までのいずれか一項に記載の方法。
光受容体先駆体を得るための、請求項７から１１までのいずれか一項に記載の方法であって、ステップ（ｉｖ_ＮＲ）が、少なくとも２１日間の間実施される、上記方法。
ステップ（ｉｖ_ＮＲ）において、Ｎｏｔｃｈインヒビターが、少なくとも１〜５日間の間、培養培地に添加される、請求項１２に記載の方法。
細胞表面マーカーＣＤ７３の結合を介して、光受容体先駆体を細胞ソーティングするステップをさらに含む、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
ＲＰＥ細胞、及び神経網膜の先駆体の両方を得るための、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法であって、請求項５又は請求項６において規定されるステップ（ｉｉｉ_ＲＰＥ）及び（ｉｖ_ＲＰＥ）が、請求項７から１３までのいずれか一項において規定されるステップ（ｉｉｉ_ＮＲ）及び（ｉｖ_ＮＲ）と並行して実施される、上記方法。