JP6637100B2 - ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中検体から核酸を単離する方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年２月２８日出願の米国特許仮出願第６１／９４６，６３７号の非仮出願であり、全ての目的においてその全体が参照として組み込まれる。
（発明の分野）
本発明はバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤中で固定されたサンプルから核酸を単離する方法に関し、単離されたＲＮＡは、核酸増幅法における鋳型として用いるのに好適である。

ホルムアルデヒドで固定したサンプルから単離された核酸の分子解析に従事する実験者は、この種のサンプルの使用にはある種の制限が適用されることを理解している。これは、ホルムアルデヒド及びその他特定の化学固定剤が、タンパク質及び核酸を化学修飾するためである。この修飾により、その後の解析における、核酸の有用性が損なわれることが知られている。
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の周知の化学修飾によって、様々な問題が生じる。実際に、Ｍａｓｕｄａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：４４３６〜４４４３（１９９９））は、ホルマリンで固定したサンプルが分子生物学的用途に不十分な材料である理由を調査した。筆者らは、プロテイナーゼＫによる処理で固定した組織を可溶化し、ＲＮＡ抽出を可能にしたが、抽出されたＲＮＡはＰＣＲの鋳型としての使用が限定されることを示した。更なる研究では、４つの塩基全てに対するモノ−メチロール基（−ＣＨ_２ＯＨ）の化学付加、並びに、メチレン架橋によるアデニン二量体形成の証拠が明らかとなった。特定の修飾は、ホルマリンを含まない緩衝液中で温度を上げることによって、リバースすることができた。しかしながら、ＲＮＡの不安定性により、高温条件の使用が望ましくなくなる場合がある。

ホルムアルデヒドで固定したサンプルを処理する初期の試みは、ある程度成功している。例えば、Ｋｈｒｐｉｎらは、米国特許出願公開第２０１１／０１９６１４６ Ａ１号において、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に入れられた細胞材料から核酸を単離している間の、ヒドラジン及びヒドラジドを含有するホルムアルデヒド除去化合物（例えば、セミカルバジド；チオセミカルバジド；カルバジド；チオカルバジド；Ｎ−アミノグアニジン及び塩酸塩などのその塩；Ｎ，Ｎ−ジアミノグアニジン及び二塩酸塩などのその塩；アセチルヒドラジド；アジピン酸ジヒドラジド；コハク酸ジヒドラジド；ギ酸ヒドラジド；マレイン酸ジヒドラジド；マロン酸ジヒドラジド；ベンゼンスルホニルヒドラジド；トシルヒドラジド；メチルスルホニルヒドラジド）の使用について記載している。この発明者らは、核酸の完全性の指標として核酸増幅を使用するよりも、ＲＮＡプローブ混合物を単離された核酸にハイブリダイズさせる、ハイブリッド捕捉法を使用した。この後、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへの抗体結合と、続くシグナル増幅法によって、ＤＮＡ標的核酸の存在を判定した。実際に、Ｋｈｒｐｉｎらは、核酸検出の教示に米国特許第６，２２８，５７８号を参照しており、この文献は、強アルカリかつ高温の条件下（ＲＮＡを加水分解する条件として知られる）での核酸サンプルの処理について記載している。したがって、Ｋｈｒｐｉｎらは、核酸増幅反応中の鋳型としての使用に好適な核酸にすることに取り組んでおらず、ホルムアルデヒドで固定した検体からＲＮＡ標的の検出を可能にするための十分な開示を示していない。

米国特許出願公開第２０１１／０１９６１４６号明細書 米国特許第６，２２８，５７８号明細書

Ｍａｓｕｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：４４３６〜４４４３（１９９９）

本明細書に開示される手技は、ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤中で保存された検体から、無傷の核酸、例えばＲＮＡの迅速かつ効率的な単離への必要性に取り組むものである。

一態様では、本発明は、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に入れられた臨床サンプルを含む検体を、処理する方法に関する。この方法は、検体をプロテアーゼ酵素及び２−イミダゾリドン又は他のホルムアルデヒドスカベンジャーと混合し、反応混合物を作る工程から始める。その後、検体中に含有され得る核酸へのホルムアルデヒドによる化学修飾をリバースするのに十分な時間、高温にて反応混合物をインキュベートする。この工程により、ホルムアルデヒドと核酸又はタンパク質との間の反応による化学修飾の少なくとも一部がリバースされる。例えば、化学架橋が切断され得る。次に、インキュベート工程後に反応混合物から核酸を単離する工程がある。最後に、単離工程からの核酸を鋳型として用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応を実施する工程がある。

一部の方法では、リバースにより、検体中のポリペプチドへのホルムアルデヒド誘発性架橋から、検体中の核酸が放出される。一部の方法では、プロテアーゼは、核酸をホルムアルデヒド誘発性架橋から解放し、２−イミダゾリドンは、サンプル中の核酸とポリペプチドとの間への新たな架橋の誘発を阻害する。

一部の方法では、サンプルは、工程（ａ）の実施前に７〜１２０日間、液体系細胞診用保存剤中に入れられている。

一部の方法では、インキュベート工程は３０分以下であり、又は、インキュベート工程は約５分〜３０分であり、又は、インキュベート工程は、１５分以下である。

一部の方法では、工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量は、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた対照増幅よりも高い。一部の方法では、工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量は、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた対照増幅よりも少なくとも１０％高い。一部の方法では、サンプル中の核酸分子の少なくとも９０％は、インキュベート工程後に架橋を含まない。

一部の方法では、インキュベート工程前の２−イミダゾリドンの最終濃度は、ホルムアルデヒドの最終最高濃度よりも、モルで１〜５又は２〜５倍高い。一部の方法では、プロテイナーゼは、４．３〜４３Ｕ／ｍＬの濃度で存在するプロテイナーゼＫである。一部の方法では、インキュベート工程の温度は、約６０〜１００℃である。一部の方法では、インキュベート工程の温度は、８５〜９５℃である。一部の方法では、インキュベート工程の温度は、９１〜９５℃である。一部の方法では、インキュベート工程の温度は、９０℃である。

一部の方法では、プロテイナーゼ及びホルムアルデヒドスカベンジャーは、検体と同時に混合される。一部の方法では、プロテイナーゼは、ホルムアルデヒドスカベンジャーより前に検体と混合される。一部の方法では、ホルムアルデヒドスカベンジャーは、プロテイナーゼより前に検体と混合される。

一部の方法では、増幅は、転写増幅、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベース増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、又はＤＮＡリガーゼ連鎖反応である。一部の方法では、核酸はＤＮＡを含み、一部の方法ではＲＮＡを含む。一部の方法では、単離された核酸はＤＮＡであり、一部の方法ではＲＮＡである。

一部の方法では、核酸は、単離される核酸及び固定化プローブにハイブリダイズする、捕捉プローブを用いる捕捉アッセイにより単離される。一部の方法では、固定化プローブは、磁気ビーズに固定化される。

一部の方法では、増幅された核酸のアッセイ陽性度は、プロテイナーゼ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度よりも高い。一部の方法では、増幅された核酸のアッセイ陽性度は、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度よりも少なくとも約１２％高い。一部の方法では、工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度は、２１日後で約９５％である。

一部の方法では、単離された核酸は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＲＮＡ標的核酸である。一部の方法では、検体は、子宮頚部細胞検体である。

別の態様では、本発明は、次の構成成分、すなわち、２−イミダゾリドン、プロテイナーゼＫ、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含む、組成物に関する。

別の態様では、本発明は、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中で保存された検体を処理するためのキットに関する。このキットは、凍結乾燥されたプロテイナーゼＫ酵素を含有する第１バイアルを含む。同様に、キットは、凍結乾燥されたプロテイナーゼＫ酵素を再構成するための、再構成用緩衝液を含有する第２バイアルを含む。この再構成用緩衝液は、一定量のｐＨ緩衝液と、一定量のＥＤＴＡと、一定量の２−イミダゾリドンと、を含む。

別の態様では、本発明は、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中で保存された核酸含有サンプルを処理するためのシステムに関する。このシステムの構成要素は、プログラム可能なコントローラと、プログラム可能なコントローラと通信するピペット装置と、反応バイアル用第１ホルダーと、試薬バイアル用第２ホルダーと、を備える。本発明のこの態様に従って、プログラム可能なコントローラは、ソフトウェアの命令により、試薬バイアルが、２−イミダゾリドン、プロテイナーゼＫ、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含む溶液を含有するとき、ピペット装置によって、試薬バイアルから部分量の液体を反応バイアルに移動させるように構成される。これらの構成成分に加えて、反応バイアルは、その他の構成成分の導入前又は後に、以下に更に記載するようにホルムアルデヒド中に保存された検体を含んでいてよい。反応バイアル内に検体を導入するのに、所望によりソフトウェアによってかかるピペット装置を操作させるように構成されているプログラム可能なコントローラと共に、同じ又は他のピペット装置を使用してよい。このシステムは、所望により、好適なソフトウェアによって構成されるプログラム可能なコントローラの制御を受けている、反応バイアル及びその内容物を制御した時間加熱するためのヒーターを備えてもよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤に入れられた臨床サンプルを含む検体を処理する方法であって、
（ａ）前記検体をプロテアーゼ酵素及びホルムアルデヒドスカベンジャーと混合して反応混合物を作る工程と、
（ｂ）前記液体系細胞診用保存剤中のホルムアルデヒドにより、前記検体中に含有され得る核酸の化学修飾をリバースするのに十分な時間にわたり、高温にて前記反応混合物をインキュベートする工程と、
（ｃ）前記インキュベートする工程後に前記反応混合物から核酸を単離する工程と、
（ｄ）前記単離する工程の前記核酸を鋳型として用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応を実施する工程と、を含む、方法。
（項目２）
前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが２−イミダゾリドンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記リバースにより、前記検体中のポリペプチドへのホルムアルデヒド誘発性架橋から、前記検体中の核酸が放出される、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記プロテアーゼが、前記核酸を前記ホルムアルデヒド誘発性架橋から解放し、２−イミダゾリドンが、前記サンプル中の核酸とポリペプチドとの間への新たな架橋の誘発を阻害する、項目２又は３に記載の方法。
（項目５）
前記サンプルが、工程（ａ）の実施前に７〜１２０日間、前記液体系細胞診用保存剤中に入れられている、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記インキュベートする工程が３０分以下にわたる、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記インキュベートする工程が約５分〜３０分である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記インキュベートする工程が１５分以下にわたる、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量が、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた対照増幅よりも高い、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量が、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた対照増幅よりも少なくとも１０％高い、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記サンプル中の核酸分子の少なくとも９０％が、前記インキュベートする工程後に架橋を含まない、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記インキュベートする工程前の２−イミダゾリドンの最終濃度が、前記ホルムアルデヒドの最終最高濃度よりも、モルで１〜５倍高い、項目２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記インキュベートする工程前の２−イミダゾリドンの最終濃度が、前記ホルムアルデヒドの最終最高濃度よりも、モルで２〜５倍高い、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記プロテイナーゼが、４．３〜４３Ｕ／ｍＬの濃度で存在するプロテイナーゼＫである、項目１２又は１３に記載の方法。
（項目１５）
前記インキュベートする工程の温度が約６０〜１００℃である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記インキュベートする工程の温度が８５〜９５℃である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記インキュベートする工程の温度が９１〜９５℃である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記温度が約９０℃である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記プロテイナーゼ及び前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、前記検体と同時に混合される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記プロテイナーゼが、ホルムアルデヒドスカベンジャーより前に前記検体と混合される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、前記プロテイナーゼより前に前記検体と混合される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記増幅が、転写増幅、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベース増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、又はＤＮＡリガーゼ連鎖反応である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記核酸がＤＮＡを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸がＲＮＡを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記単離された核酸がＤＮＡである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記単離された核酸がＲＮＡである、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記核酸が、単離される前記核酸及び固定化プローブにハイブリダイズする、捕捉プローブを用いる捕捉アッセイにより単離される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記固定化プローブが磁気ビーズに固定化されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、プロテイナーゼ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度よりも高い、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、プロテイナーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度より少なくとも約１２％高い、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、２１日後に約９５％である、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記単離された核酸がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＲＮＡ標的核酸である、項目２４に記載の方法。
（項目３３）
前記検体が子宮頚部細胞検体である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
組成物であって、
（ａ）２−イミダゾリドンと、
（ｂ）プロテイナーゼＫと、
（ｃ）ＥＤＴＡと、
（ｄ）ｐＨ緩衝液と、を含む、組成物。
（項目３５）
ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤中で保存された検体を処理するためのキットであって、
（ａ）凍結乾燥されたプロテイナーゼＫ酵素を含有する第１バイアルと、
（ｂ）前記凍結乾燥されたプロテイナーゼＫ酵素を再構成するための、再構成用緩衝液を含有する第２バイアルであって、
前記再構成用緩衝液が、一定量のｐＨ緩衝液と、一定量のＥＤＴＡと、一定量の２−イミダゾリドンと、を含む、第２バイアルと、を含む、キット。
（項目３６）
ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤中で保存された核酸含有サンプルを処理するためのシステムであって、前記システムの構成要素が、
プログラム可能なコントローラと、
前記プログラム可能なコントローラと通信するピペット装置と、
反応バイアル用第１ホルダーと、
試薬バイアル用第２ホルダーと、
加熱要素と、を備え、
前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記試薬バイアルが、ホルムアルデヒドスカベンジャー、プロテイナーゼＫ、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含む溶液を含有するとき、前記ピペット装置によって、前記試薬バイアルから部分量の液体を前記反応バイアルに移動させるように構成されており、
前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを６５℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されている、システム。
（項目３７）
前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを８５℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されている、項目３６に記載のシステム。
（項目３８）
前記反応バイアル中の前記試薬が、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーとして２−イミダゾリドンを含む、項目３７に記載のシステム。
（項目３９）
前記反応バイアル中の前記試薬が、４２〜４５Ｕの濃度のプロテイナーゼＫを含む、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを９０℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されている、項目３６に記載のシステム。
（項目４１）
前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを、１５分〜３０分間、９０℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されている、項目４０に記載のシステム。
（項目４２）
前記反応バイアル中の前記試薬が、４２〜４５Ｕの濃度のプロテイナーゼＫを含む、項目４１に記載のシステム。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を用いて行われたＨＰＶ ＲＮＡ増幅及び検出アッセイにおける、陽性度％を示す棒グラフである。この手順で使用された３つの条件は、（１）ＴＨＩＮＰＲＥＰ液体系細胞診用保存剤中に保存された検体（黒色）、（２）ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中に保存され、プロテイナーゼＫ酵素で処理された検体（斜線）、並びに（３）ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中に保存され、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫ酵素の組み合わせで高温にて処理された検体（白色）であった。 異なるＨＰＶ種を含むヒト細胞株を用いて行われたＨＰＶ ＲＮＡ増幅及び検出アッセイにおける、陽性度％を示す棒グラフである。図２Ａは、ＨＰＶ１６を含むＳｉＨａ細胞を用いて得られた結果を示す。図２Ａ〜２Ｃそれぞれにおいて、白色棒は陽性度％を示し（左軸）、濃い横線は平均シグナル／カットオフ比を示す（右軸）。 異なるＨＰＶ種を含むヒト細胞株を用いて行われたＨＰＶ ＲＮＡ増幅及び検出アッセイにおける、陽性度％を示す棒グラフである。図２Ｂは、ＨＰＶ１８を含むＨｅＬａ細胞を用いて得られた結果を示す。図２Ａ〜２Ｃそれぞれにおいて、白色棒は陽性度％を示し（左軸）、濃い横線は平均シグナル／カットオフ比を示す（右軸）。 異なるＨＰＶ種を含むヒト細胞株を用いて行われたＨＰＶ ＲＮＡ増幅及び検出アッセイにおける、陽性度％を示す棒グラフである。図２Ｃは、ＨＰＶ４５を含むＭＳ７５１細胞を用いて得られた結果を示す。図２Ａ〜２Ｃそれぞれにおいて、白色棒は陽性度％を示し（左軸）、濃い横線は平均シグナル／カットオフ比を示す（右軸）。 時間（ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中で保存された日数）に対する陽性反応％（縦軸）を示す折れ線グラフである。どちらのグラフも、１反応当たり細胞３０個を用いて行われた手順により得られた結果を示す。図３Ａは、ＳｉＨａ細胞を用いて得られた結果を示す。異なる線は、プロテイナーゼＫのみ（■）、及び２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせ（◆）での処理を示す。 時間（ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中で保存された日数）に対する陽性反応％（縦軸）を示す折れ線グラフである。どちらのグラフも、１反応当たり細胞３０個を用いて行われた手順により得られた結果を示す。図３Ｂは、ＨｅＬａ細胞を用いて得られた結果を示す。異なる線は、プロテイナーゼＫのみ（■）、及び２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせ（◆）での処理を示す。 ２〜８℃における保存期間に対する陽性度％を示す折れ線グラフである。線は、１：１０（◆）、１：１００（■）で希釈した臨床検体の結果を示す。 例示的な作業の流れの主要素を示す図である。 ホルムアルデヒド、プロテイナーゼＫ及び２−イミダゾリドンの考えられる反応メカニズムを示す。

（定義）
特に明記しない限り、本明細書で用いられる科学的及び技術的用語は、技術文献、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、又は、その他周知の分子生物学に関する技術刊行物に基づいて、分子生物学分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。特に明記しない限り、本明細書で利用され、又は想到される手技は、分子生物学の技術分野において周知の標準的な方法である。

本明細書で引用される全ての特許、出願公開、及びその他の刊行物は、その全体が参照によって組み込まれる。この項に記載される定義が、参照により本明細書に援用される特許、出願、出願公開、及びその他の刊行物に記載される定義と相反するか又は矛盾する場合には、この項に記載される定義が、参照により本明細書に援用される定義に優先するものとする。

本明細書において使用するところの「ａ」又は「ａｎ」とは、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味する。

明細書及び特許請求の範囲にわたってここで使用される近似に関する用語は、関連する基本的な働きに変化をもたらすことなく許容範囲内で変更し得る、任意の定量的又は定性的表現を修飾するために適用してよい。したがって、「約」又は「およそ」などの用語で修飾される値は、特定される正確な値に制限されず、特定される値とは異なる値を含む場合がある。

明確にするため、基本形（ＣＨ_２Ｏ）である「ホルムアルデヒド」は、気体である。「ホルマリン」と呼ばれる液体は、実際は、ホルムアルデヒドガスと水の混合物である。しかしながら、本明細書で使用されるとき、「ホルムアルデヒド」は、水溶液に溶解されている分子（ＣＨ_２Ｏ）を指し得る。

本明細書で使用されるとき、「液体系細胞診」は、液体系婦人科検体採取を指し、ここでは、頚腟部検査用のサンプルが、ブラシ用具の１つを用いて従来法で採取されるが、スライドガラスに広げる代わりに、液体保存剤、つまり「固定剤」が入ったサンプルに移される。保存検体は、顕微鏡検査又は分子解析に使用できる。

本明細書で使用されるとき、「検体」は、特定物の例として採取されるものである。生物検体として、核酸分析物などの分析物を含有し得る、生きた生物又は死んだ生物由来の任意の組織又は材料が挙げられる。好ましい生物検体として、呼吸組織、滲出物（例えば、気管支肺胞洗浄）、生検材料、痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、又はその他の流体、組織、若しくは材料が挙げられる。特に好ましい生物検体として、パップ検査に関連して得られ得るような、子宮頚部の外部開口部から採取される細胞が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、用語「サンプル」は、検査で使用するための材料の一部又は一定量を指し、この一部は、それが採取されたものに関する情報を与え得る。サンプルは、任意の供給源、例えば生物検体又は環境供給源由来であってよい。

本明細書で使用されるとき、用語「核酸」は、標準的なホスホジエステル結合又は他の結合により共有結合された、窒素複素環式塩基又は塩基類似体を有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド化合物を指す。核酸として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、キメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、又はこれらの類似体が挙げられる。

「核酸分析物」は、検出又は定量の対象となるポリヌクレオチドを意味する。特定のウイルスのゲノムは、核酸分析物の例となるであろう。

本明細書で使用されるとき、「検査サンプル」は、特定の核酸分析物の存在について検査される任意のサンプルである。

本明細書で使用されるとき、「高」温条件は、室温よりも高い温度を指す。好ましくは、高温は６０℃〜１００℃の範囲であり、より好ましくは、６５℃〜９５℃の範囲であり、ときには８０℃〜９０℃の範囲であり、ときには、８１〜９８℃、８５〜９８℃、８５〜９５℃、９０〜９５℃、９１〜９５℃、又は９１〜９９℃の範囲であり、ときには、約９０℃である。８０℃を超える、例えば、８５〜９８℃、９０℃、又は９１〜９５℃の温度の使用は、以下に更に定義されるアッセイ感度を上げる結果となり得るが、温度が６５℃を超えて上昇すると、プロテイナーゼＫの変性度が上がり、過度の変性のために８５℃又は９０℃を超える温度での使用は通常は推奨されないため、驚くべきことである。本発明の実践は、高温によるこの予想外の効果のメカニズムを識別することに左右されないが、この結果は、高温での２−イミダゾリドンによるホルムアルデヒドの除去促進が、プロテイナーゼＫ活性のある程度の低下を補うだけではなくそれを上回ることを示し得る。好ましくは、これら全ての場合において、液体系細胞診用保存剤中の臨床サンプル、２−イミダゾリドン、プロテアーゼ、ＥＤＴＡ及びｐＨ緩衝液を含む反応混合物を、１０分〜３０分、好ましくは１０分から２０分以下、ときには最長１５分、つまり約１５分の間、高温に曝露する。

「増幅産物」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応のポリヌクレオチド産物であり、ここでは標的核酸配列が、コピー、つまり増幅産物の合成の鋳型としての機能を果たした。

「標的」又は「標的核酸」は、増幅、検出、及び／又は定量される配列を含む核酸を意味する。増幅される標的核酸配列は、好ましくは、２つの反対方向に配置されるオリゴヌクレオチド間に位置し、それぞれのオリゴヌクレオチドに相補的な標的核酸の一部を含む。

「増幅」又は「核酸増幅」又は「ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅」及び同種のものは、標的核酸配列のＲＮＡ及びＤＮＡ等価物、又はこれらの相補物若しくはフラグメントを可能にする複数のコピーを得るための任意の既知の手順を意味する。

本明細書に開示されるいくつかの実施形態の理解を助けるため、以前詳細に述べられたＴＭＡ法（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、及び同第５，８２４，５１８号）を簡単にまとめる。ＴＭＡでは、増幅される配列を含む標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ又はｓｓＤＮＡ）として提供される。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸に変換する任意の従来方法を使用してよい。プロモータープライマーは、その標的配列において標的核酸に特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を伸長してｃＤＮＡコピーをもたらし、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖が得られる。ＲＮａｓｅ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮａｓｅ Ｈ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のうちＲＮＡを消化し、第２のプライマーが、プロモーター−プライマー末端の下流にあるｃＤＮＡ中の標的配列に特異的に結合する。続いて、ＲＴが、ｃＤＮＡを鋳型として用いて第２のプライマーの３’末端を伸長することによって新たなＤＮＡ鎖を合成し、機能性プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡがもたらされる。機能性プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始し、初期の標的鎖に相補的なＲＮＡ転写物（増幅されたコピー、つまり増幅産物）が、約１００〜１０００個生じる。第２のプライマーは、各増幅産物中の標的配列に特異的に結合し、ＲＴは、増幅産物であるＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作り、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖が生じる。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖から増幅産物ＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列は、新たに合成されたＤＮＡ中の相補配列に結合し、ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端、並びにｃＤＮＡの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、標的鎖に相補的な更なる増幅産物を転写する、機能性プロモーターを含むｄｓＤＮＡをもたらす。反応中のこれらの工程を繰り返し使用する自己触媒的サイクルによって、初期標的配列の約１０億倍もの増幅が得られる。増幅産物は、増幅中に（リアルタイム検出）、又は、反応終了時に（エンドポイント検出）、増幅産物中に含まれる配列に特異的に結合するプローブを用いて検出できる。結合したプローブによって生じるシグナルの検出は、サンプル中の標的核酸の存在を示す。

本明細書で使用されるとき、増幅産物の「検出」を、任意の既知の方法を用いて達成してよい。例えば、増幅された核酸は、検出可能な物理的変化（例えば、電気的変化）をもたらす表面と結合し得る。増幅された核酸は、溶液相中で、又は、マトリックス中若しくは上に濃縮し、これらと結合したラベル（例えば、臭化エチジウムなどの挿入剤）を検出することによって検出できる。その他の検出法では、増幅産物中の配列に相補的なプローブを使用し、プローブ：生成物複合体の存在を検出する、又は、プローブ複合体を使用して、増幅産物から検出されるシグナルを増幅する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、及び同第５，８４９，４８１号）。その他の検出法では、ラベル化プローブが増幅産物に結合するときのみに、分子標識、分子トーチ、又はハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのシグナルの変化が起因するため、シグナル生成が標的配列の存在と関連するプローブを用いる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，３６１，９４５号、同第６，５３４，２７４号、同第６，８３５，５４２号、同第６，８４９，４１２号、及び同第８，０３４，５５４号、並びに、米国特許出願公開第２００６／０１９４２４０Ａ１号）。かかるプローブは、典型的には、プローブの一方の末端に付着されたラベル（例えば、フルオロフォア）、及び、プローブが、増幅産物とハイブリダイズされていないことを示す一方のコンフォメーション（「閉鎖」）にあるとき、ラベルからのシグナル生成を阻害するが、プローブが、増幅産物とハイブリダイズしてコンフォメーションが変わる（「開放」に）と検出可能なシグナルが生成される、プローブの別の位置に付着された相互作用化合物（例えば、クエンチャー）を使用する。増幅産物と特異的に結合するラベル化プローブから直接的又は間接的に生じるシグナルの検出は、増幅された標的核酸の存在を示す。

本明細書で使用されるとき、「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進し、検出可能なハイブリッドを形成する条件下で、核酸中、好ましくは増幅された核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。

本明細書で使用されるとき、用語「接触すること」は、２つ又はそれ以上の構成成分を一つにすることを意味する。接触することは、全ての構成成分を流体又は半流体混合物中で混合することによって達成できる。また接触することは、１つ又は２つ以上の構成成分を、固形の組織切片又は基材などの固形表面上で、１つ又は２つ以上の他の構成成分と物理的に接触させるときに達成することもできる。

本明細書で使用されるとき、用語「標的捕捉」は、細胞フラグメント、細胞小器官、タンパク質、脂質、炭水化物、又は他の核酸などのサンプル混合物の他の構成成分より、標的核酸を選択的に分離することを指す。標的捕捉システムは、所定の標的核酸を他のサンプル成分から特異的かつ選択的に分離でき（例えば、目的とする標的核酸に特異的な核酸配列の使用による）又は、標的の他の特徴（例えば、非特異的核酸へのハイブリダイゼーション、多孔性ガラスビーズへの結合、シリカ充填カラムへの捕捉及び溶出など、その物理的特徴を呈示しない他のサンプル成分と区別する標的核酸の物理的特性）の使用によって、他のサンプル成分から標的核酸を非特異的かつ選択的に分離できる。好ましい核酸ハイブリダイゼーション標的捕捉法及び組成物は、以前に詳細に述べられている（米国特許第５，７５０，３３８号、同第６，０６０，２４６号、同第６，１１０，６７８号、同第６，５３４，２７３号、及び同第７９９３，８５３号、並びに、米国特許出願公開第２００８／０２８６７７５ Ａ１号）。好ましい標的捕捉の実施形態は、溶液相中の標的捕捉オリゴヌクレオチド、及び担体に付着された固定化捕捉プローブを用いて、標的核酸との複合体を形成し、捕捉された標的を他の構成成分から分離する。

本明細書で使用されるとき、用語「標的捕捉オリゴヌクレオチド」は、相補的核酸配列、又はビオチン及びストレプトアビジンなどの結合対メンバーを用いて、標的核酸と固定化捕捉プローブを架橋する、つまり結合する、少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを指す。ある方法では、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、非特異的に標的核酸に結合し、標的核酸を固形担体に固定化する。異なる方法では、標的捕捉オリゴヌクレオチドの標的特異的（ＴＳ）配列は、標的核酸中の配列に特異的に結合する。どちらの方法でも、標的捕捉オリゴヌクレオチドは、固定化捕捉プローブに結合する（例えば、特異的結合対相互作用により）固定化捕捉プローブ結合領域を含む。ＴＳ配列及び固定化捕捉プローブ結合領域が共に核酸配列である実施形態では、これらは互いに共有結合されてよく、又は、１つ又は２つ以上のリンカーによって結合される異なるオリゴヌクレオチド上にあってよい。

「固定化捕捉プローブ」は、標的捕捉オリゴヌクレオチドを固形担体に結合するための手段を提供する。固定化捕捉プローブは、固形担体に結合された塩基配列認識分子であり、結合した標的ポリヌクレオチドの未結合物質からの分離を促進する。溶液中に遊離しているマトリックス及び粒子などの任意の既知の固形担体を使用してよい。例えば、固形担体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレンであってよく、好ましくは、磁気的に誘引可能な粒子であってよい。特に好ましい担体は、単分散（すなわち、±約５％の寸法で均一）の磁気球体であり、これによって、自動化アッセイでの使用に特に有利な、一貫した結果をもたらす。固定化捕捉プローブは、直接的に（例えば、共有結合又はイオン相互作用を介して）、又は間接的に固形担体に結合されてよい。有用な固形担体の一般的な例として、磁気粒子又はビーズが挙げられる。

本明細書で使用されるとき、用語「分離すること」又は「精製すること」は、一般に、混合物（例えば、サンプル）の１つ又は２つ以上の構成成分を、混合物中の１つ又は２つ以上の他の構成成分から取り出すことを指す。サンプル成分として、一般には水溶液相中の核酸が挙げられ、細胞フラグメント、タンパク質、炭水化物、脂質、及びその他化合物を挙げてもよい。好ましい実施形態は、少なくとも７０％〜８０％、より好ましくは約９５％の標的核酸を、混合物中の他の構成成分から分離する、つまり取り出す。

「キット」は、典型的には、互いに同時に使用することを意図した、材料のパッケージ化された組み合わせを意味する。本発明によるキットは、「有形」形態（例えば、印刷された情報、コンピュータ読み取り可能な媒体に電子的に記録されたもの、又は、数値を保存するためのバーコードなど、機械による読み取り可能な媒体に別の方法で記録されたもの）中の、指示又はその他情報を含んでよい。

「本質的になる」は、本発明の基本的かつ新規な特徴を実質的に変えない、追加の構成成分、組成物、又は方法の工程が本発明に含まれ得ることを意味する。本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響する、任意の構成成分、組成物、又は方法の工程は、この用語の範囲外である。

文脈から明らかでない限り、「約」は、値を測定する場合の精度において潜在するばらつきを示す。

ＤＮＡの修飾を「リバースすること」とは、ホルムアルデヒドによって誘発された修飾、特にポリペプチドへの架橋から、ＤＮＡを解放することを意味する。リバースは、部分的なもの又は完全なものであってよく、その結果、ホルムアルデヒド誘発性修飾が起こる前の正しい状況にＤＮＡを回復しても、しなくてもよい。

詳細な説明
本明細書に開示されるのは、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に保存された検体から核酸を単離するための、方法、システム、組成物、及びキットである。簡潔に言えば、開示される方法は、部分量のサンプル、つまり、液体保存剤中に入れられた細胞サンプルを、２−イミダゾリドン及びプロテアーゼ酵素の組み合わせと接触させることに基づく。特に好ましい実施形態では、プロテアーゼはプロテイナーゼＫ酵素である。続いて、混合物を高熱条件下でインキュベートすると、遊離のホルムアルデヒドを不活化し、ホルムアルデヒドに起因する核酸の化学修飾の少なくとも一部をリバースできる。この方法は、有利には、以前の方法と比べて迅速であり、効率的に単離され（例えば、捕捉プローブハイブリダイゼーションにより）、逆転写され（所望により）、かつｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅され得る、ＲＮＡなどの核酸をもたらす。

導入及び概要
本明細書に開示される手法は、ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤中に含まれる生体サンプル中に存在し得る、核酸標的の検出を促進する。かかる生体サンプルは、分析を行う前にかなりの期間（例えば、少なくとも１、２、７、１４、３０、５０、又は１００日間、又は７〜１２０日間）保存できる。保存中、ホルムアルデヒドは、サンプル中の核酸の修飾、特に、サンプル中に存在するポリペプチドとの架橋生成を誘発する場合がある。これらの修飾は、ハイブリダイズする能力（例えば、捕捉プローブへの）、又は増幅能などの、ＤＮＡの後続処理を阻害する。架橋などの修飾は、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼで処理することによって切断できる。プロテアーゼでの処理により、捕捉及び／又は増幅に利用できる核酸分子が増加し、最終的に、増幅産物をより得る、及び／又は、特定の標的の検出閾値を下げることができる。プロテアーゼのこれら有益な効果は、サンプルを２−イミダゾリドンで同時処理することによって増強される。２−イミダゾリドンは、ホルムアルデヒドスカベンジャーとして作用し、すなわち、核酸とポリペプチドとの間の架橋を誘発できなくするか、又は少なくとも誘発する能力を実質的に減少させるように、ホルムアルデヒドと反応する。２−イミダゾリドンを、後続の説明の大半で例示的かつ好ましいホルムアルデヒドスカベンジャーとして用いたが、文脈が他のものを必要とする場合を除き、特に８５℃以上の温度で実施される実施形態では、背景技術において説明したものなど他のホルムアルデヒドスカベンジャーを代わりに使用できる。反応性ホルムアルデヒドを除去することによって、２−イミダゾリドンは、プロテアーゼの作用によって放出されたポリペプチドなどのポリペプチドが、サンプル中の核酸と架橋を形成又は再形成するのを阻害することができる。また２−イミダゾリドンは、ホルムアルデヒドを除去することによって、プロテアーゼの不活化を防ぐこともできる。２−イミダゾリドンは以前よりホルムアルデヒドスカベンジャーであることが報告されているが、プロテアーゼ及び２−イミダゾリドンが供給される前に、サンプルが保存され、架橋が形成され得る長い期間を考慮すると、短時間のインキュベーションでの新たな架橋形成に対する潜在的阻害によって、捕捉、増幅、及び後続の処理に対する核酸の利用能が改善された材料が得られることは、驚くべきことである。一部のイミダゾリンが既知の核酸変性剤であるため、２−イミダゾリドンの存在自体が、捕捉、増幅、又はその他核酸ハイブリダイゼーションを受ける核酸の能力を損なわないことは、更に驚くべきことである。

この方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む任意の形態の核酸において使用できる。特に、ＤＮＡはゲノム又はｃＤＮＡであってよい。特に、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はウイルスＲＮＡであってよい。ＤＮＡは所望の分析物であり得るが、ＲＮＡは、高温での不安定性など、その化学的不安定性のせいで、サンプル処理への要件がよりストリンジェントである。したがって、ＲＮＡを単離する手順について、最も厳密な条件下での新規サンプル調製法の実証が探求された。

ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤を用いる婦人科検体採取のモデル系を使用し、核酸単離手法を説明した。実際の応用では、この系は、最初に子宮頚部細胞のスワブを得ることと、得た細胞サンプルをＳＵＲＥＰＡＴＨ（ＴｒｉＰａｔｈ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．の登録商標）液体系細胞診用保存剤に移すことと、続いて、保存した細胞を後続の分子検査用に処理することと、を含む。この場合の分子検査は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＲＮＡ標的核酸の検出を必要とする。

ＨＰＶは、子宮頚がんの発症に関連し、発現されたＨＰＶ ＲＮＡの検出は、診断的及び監視的アッセイとして特に価値がある。実際に、細胞診と併せたＨＰＶ分子検査は、今では子宮頚がんスクリーニング及び患者管理に推奨されている。したがって、液体パップ検査は、ホルマリン、又はホルムアルデヒドを含有する他の液体系細胞診用保存剤に保存されたサンプルの処理を改善することによる、増幅可能なＲＮＡの回収向上の恩恵を受ける、アッセイシステムの一例であると考えられた。更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅核酸と、続くＨＰＶ特異的増幅産物の検出に基づく自動検査手順も同様に利益をもたらすであろう。

ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイは、１４種類の高リスクＨＰＶ遺伝子型のＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡを検出する、市販の多重核酸検査である（例えば、カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））。検出される遺伝子型の中には、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、及びＨＰＶ４５がある。このアッセイは、核酸ハイブリダイゼーション法を用いる標的捕捉に基づき、ホルムアルデヒドを含まないＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）液体系細胞診用保存剤中に保存された子宮頚部検体を用いた使用について実証されている。遺伝子プローブアッセイは、最初に検体輸送培地（ＳＴＭ）と混合し、次に比較的高レベルのプロテイナーゼＫ酵素（１８０Ｕ／１反応）を含む試薬で処理した後、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）液体系細胞診用試薬中で保存された検体を用いた使用について実証されている。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）液体系細胞診用保存剤は、ホルムアルデヒド、エタノール、メタノール、及びイソプロパノールを含有する。ＴＨＩＮＰＲＥＰ中で保存された検体は、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイによる検査のために迅速に処理できるのに対して、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）中で保存された検体は、６５℃で２時間のプロテイナーゼＫによる消化を必要とする。この要件により、後者の保存剤の有用性が損なわれている。以下に説明する改善法によって、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）液体系細胞診用試薬中で保存された検体を、より少ない酵素試薬を用いて、かつたった１５分間のインキュベート時間で処理できる。

好ましい試薬組成物
開示される、ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤から核酸を調製する手法は、プロテアーゼ酵素及び２−イミダゾリドンを組み合わせて使用することに基づいている。開示される手法は更に、プロテアーゼ酵素を高温で使用することに基づく。好ましい方法では、プロテアーゼ酵素は、最初は、２−イミダゾリドンを含む緩衝化溶液を用いて再構成される、凍結乾燥された形態である。好ましくは、再構成用緩衝液は更にＥＤＴＡを含む。一つの特に好ましい実施形態では、プロテアーゼ酵素はプロテイナーゼＫ酵素であり、ｐＨ４．０〜ｐＨ１２．０の幅広い範囲内で活性を維持することが知られている。しかしながら、プロテアーゼ酵素の再構成に用いられる緩衝液のｐＨは、好ましくは、約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．５の範囲内に入る。この範囲によって、強アルカリ条件下で起こる加水分解性開裂から依然としてＲＮＡを保護しながらも、至適酵素活性を可能にする。更により好ましくは、再構成用緩衝液中で使用される緩衝液として、約ｐＨ８．０のトリス緩衝液が挙げられる。

任意の希釈剤及びホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤と混合するとき、主な試薬構成成分の最終濃度は、好ましい範囲内にある。任意の希釈剤は、細胞膜を溶解する界面活性剤を含む、緩衝化溶液であってよい。例示的な界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）などのアニオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤などの他の界面活性剤も有用な場合がある。有利には、強力なイオン性界面活性剤はタンパク質を変性することによって、これらをプロテイナーゼＫ酵素によるタンパク質分解のより良い標的にすることができる。反応混合物中の２−イミダゾリドン（imidazolidine）の最終濃度（モル濃度で）は、好ましくは、ホルムアルデヒドの最終最高濃度の１倍〜５倍、又はより好ましくは２倍〜５倍の範囲内に入るように選択される。２−イミダゾリドン（imdazolidone）の最終濃度は、全ての試薬が添加された後の反応混合物の体積に対する添加されたモルで決定される。ホルムアルデヒドの最終濃度は、検体調製に用いられた保存剤中に存在するモル量を、全ての試薬が添加された後の反応混合物の体積で除したものである。換言すれば、加熱によるインキュベート前の、架橋誘発で消費されたホルムアルデヒドを差し引かない。例えば、１ｍＬの液体系細胞診用保存剤（例えば、細胞検体を含む）、２．９ｍＬの希釈剤、及び０．３ｍＬの、２−イミダゾリドン、プロテイナーゼＫ酵素、ＥＤＴＡ、及び緩衝液を含む試薬を混合して調製された反応混合物の最終ホルムアルデヒド濃度が約２８ｍＭだった場合、約２倍過剰量の２−イミダゾリドンの最終濃度は、約５０ｍＭ〜約６０ｍＭである。プロテイナーゼＫ酵素の最終濃度は、有利には、２−イミダゾリドンを含まずに使用される量と比較して、本発明の配合物中では減らすことができる。本発明の実践は、任意の特定の作用メカニズムを理解することに左右されないが、プロテイナーゼＫは、タンパク質をメチル架橋に結合しているアミン結合を消化することによって、核酸を放出し、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）アッセイのハイブリダイゼーション依存性標的捕捉工程において、標的捕捉に利用できるようにする働きをし得ると考えられる。プロテイナーゼＫ酵素の最終濃度は、好ましくは約４３Ｕ／ｍＬ〜約４．３Ｕ／ｍＬな範囲内にあり、約１０〜１１Ｕ／ｍＬの濃度が特に好ましい。したがって、４．２ｍＬの反応体積は、好ましくは約４０〜５０Ｕ、又は４３ＵのプロテイナーゼＫ酵素を含む。ＥＤＴＡの最終濃度は、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内、更により好ましくは３０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲内にある。緩衝化剤の最終濃度は、その剤の構造に基づいて様々であるが、サンプル中に含まれるＲＮＡがアルカリ加水分解によって実質的に分解されないことを確実にする、十分な緩衝能をもたらすのに十分なものである。この要件は、少なくとも１０ｍＭから、最大約５００ｍＭ、より好ましくは最大約２５０ｍＭ、更により好ましくは最大約１００ｍＭ、及びなお更により好ましくは最大約５０ｍＭの範囲内の最終緩衝液濃度を使用することによって満たされ得る。高温でのインキュベーション前の、反応混合物中緩衝液についての特に好ましい最終濃度範囲は１０ｍＭ〜５０ｍＭである。

検体は、プロテアーゼ及び２−イミダゾリドンと任意の順で混合されてよい。例えば、プロテアーゼ及び２−イミダゾリドンを検体と同時に混合してよい。あるいは、プロテアーゼをまず検体と、続いて２−イミダゾリドンと混合してよく、又は逆も同様である。

再構成用緩衝液及び凍結乾燥されたプロテアーゼの両方が、キットの構成成分であってよく、使用直前に混合されて良い。つまり、キットのエンドユーザーは、凍結乾燥された酵素を再構成して、例えば、２−イミダゾリドン、プロテイナーゼＫ酵素、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含む酵素試薬を調製できる。好ましくは、試薬キットの１つの溶液は、２−イミダゾリドン、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含むが、プロテイナーゼＫ酵素を含まない。プロテイナーゼＫ酵素は、好ましくはキットの別個のバイアル中に包装され、ここでは酵素は凍結乾燥物の形態である。

好ましい標的濃縮法
増幅反応を開始する前に、まず標的捕捉手法を用いて、標的核酸を濃縮又は単離することが望ましい場合がある。好ましい方法では、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫ酵素を含む試薬を加えた後に高温でインキュベートされる反応混合物の核酸は、上面に固定化プローブが配置された固形担体と接触する。一実施形態によると、ＥＤＴＡ及びｐＨ緩衝液の存在下で高温条件において、２−イミダゾリドン及びプロテアーゼ酵素の組み合わせで処理されている標的核酸は、配列特異的に、固定化捕捉プローブに直接ハイブリダイズする。異なる実施形態では、「標的捕捉プローブ」は、固形担体−固定化捕捉プローブと増幅される標的核酸を架橋する働きをする。この方法の一般的特徴は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇらによって、米国特許第６，５３４，２７３号に開示されており、この開示は参照することによって本明細書に組み込まれる。選択する方法にかかわらず、増幅される標的核酸を含むハイブリダイゼーションは、この手順の本質的な特徴であることは明らかである。

本明細書に開示される手法と関連して使用され得、増幅される標的への非特異的ハイブリダイゼーションに依存する変異型標的捕捉法は、米国特許出願公開第２００８／０２８６７７５ Ａ１に詳述されており、この開示は参照することによって本明細書に組み込まれる。非特異的ハイブリダイゼーション法に従うと、捕捉プローブは、標準的な塩基対合（すなわち、Ｇ：Ｃ及びＡ：Ｔ／Ｕ結合）と比較して、標的核酸に対する別の塩基対合特性を呈する、少なくとも１つの配列を含む。この非特異的ハイブリダイゼーション法によって精製される標的核酸は、少なくとも部分的に一本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。ここでも、この配列非依存性標的捕捉法は、依然として核酸ハイブリダイゼーションに依存していることは明らかである。

このデータは、標的捕捉が２−イミダゾリドンの存在にもかかわらず起こり得ることを示し、一部のイミダゾリンが核酸の変性を引き起こすことが報告される。

好ましい核酸増幅方法
本発明と関連して有用な増幅方法の例として、転写増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ＤＮＡリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及び、自己複製ポリヌクレオチド分子及び複製酵素、例えばＭＤＶ−１ ＲＮＡ及びＱβ酵素を用いる増幅方法が挙げられるが、これらに限定されない。これら様々な増幅手法を行う方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許出願第１１／２１３，５１９号、欧州特許出願公開第０ ５２５ ８８２号、米国特許第４，９６５，１８８号、同第第５，４５５，１６６号、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４〜１８７８（１９９０）、国際公開第８９／０９８３５号、米国特許第５，４７２，８４０号、及びＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：５３〜５８（１９９１）に記載されている。核酸増幅反応の実施方法について記載しているこれらの文献の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。

反応メカニズム
本発明の方法の実践はメカニズムを理解することに依存しないが、図６は、本方法の基礎となる考えられる反応メカニズムを示す。酸性条件下では、検体中のホルムアルデヒド２は、ヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかの求核性官能基と反応できる。次に、水の脱離により反応性イミン４が生じる。続いて、第２のヌクレオチドがイミンと反応し、二量体５を形成できる。セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼＫは、窒素−メチレンリンカーを加水分解し、開裂する。この開裂により、出発物質であるヌクレオチド及びホルムアルデヒドを再生成できる。ホルムアルデヒドスカベンジャーである２−イミダゾリドンは、２分子のホルムアルデヒドと反応し、イミダゾリドン−メタノール化合物７を生成できる。この反応により、ホルムアルデヒドが、放出されたヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかと再度反応するのを効果的に防ぐ。

感度
今記載したような検体のプロテアーゼ及び２−イミダゾリドンによる処理により、サンプル中の核酸上の修飾、特に架橋がより多くリバースされ、より多くの核酸が架橋ポリペプチドから解放され、捕捉された核酸の収量がより高くなり、増幅された核酸の収量がより高くなり、改善されたアッセイ感度（すなわち、標的について存在することが必要とされる標的ＤＮＡの閾値が低くなる）をもたらすことができる。かかる改善は、プロテアーゼ又は２−イミダゾリドン又はその両方を除いたこと以外は同等の対照に対して、測定できる。好ましくは、プロテアーゼを除いた対照、及び２イミダゾリドンを除いた対照の両方と比較して、改善が示される。改善とは、典型的な実験的変動（ｐ＜０．０５）を超える、十分な規模の改善を意味する。例えば、一部の方法では、処理は、架橋から解放された核酸、又は捕捉された核酸、又は増幅された核酸の収量について、少なくとも５％、１０％、２０％、又は３０％の改善をもたらし得る。分子量によって分離するアッセイ、例えば、ゲル電気泳動又は様々な形態のカラムクロマトグラフィーにより、架橋の存在を評価できる。一部の方法では、処理の結果、ハイブリダイゼーション捕捉アッセイ又は増幅に潜在的に供するため、少なくとも５０、６０、７０、８０又は９０％の核酸分子が、ポリペプチドへの架橋を含まない。一部の方法では、処理の結果、本発明の方法に従って処理した後に、プロテアーゼ又は２−イミダゾリドンのうちいずれかを除いた対照処理よりも、一部のサンプルが陽性の結果（標的核酸が存在する）をもたらすことを意味する、より高いアッセイ陽性度（又はより低い検出閾値）が得られる。

好ましい実施形態
以下の実施例は、ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤中の検体を、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫ酵素の組み合わせを用いて高温にて処理することの有益性を示すために行われた、実験手順を開示する。好ましい実施形態では、この組み合わせを、トリス緩衝液及びＥＤＴＡの存在下で使用する。全ての場合において、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤は、ホルムアルデヒドを含有するモデル液体系保存剤として働いた。以下の説明において、「脱修飾溶液」は、ＥＤＴＡ（５００ｍＭ）及び２−イミダゾリドン（７４０ｍＭ〜７５０ｍＭの範囲内）を含むｐＨ緩衝化溶液（ｐＨ８．０）を指す。脱修飾溶液中で使用するのに好ましい緩衝液として、トリス緩衝液が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「検体輸送培地」（ＳＴＭ）は、細胞の溶解に加えて、検査を受けるサンプル中で活性であり得るＲＮａｓｅ活性を阻害することにより、放出されたＲＮＡを保護する、リン酸緩衝界面活性剤溶液を指す。ＳＴＭ中で使用できる好ましい界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）が挙げられ、ＬＬＳがわずかにより好ましい。ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤のサンプルが、脱修飾溶液及びプロテイナーゼＫ酵素と混合されるとき、凍結乾燥された酵素を脱修飾溶液で再構成するのが都合が良い場合があり、部分量の再構成した酵素溶液を液体系細胞診用保存剤を含む反応容器に加えてもよい。

実施例１は、１４種類の高リスクＨＰＶ遺伝子型のそれぞれについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を含む試験パネルによる、実験系の分析感度を評価するのに用いた手順を記載する。高温条件下での２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫによる処理を伴う核酸処理法の成功は、市販のアッセイを使用したＨＰＶ ＲＮＡの検出によって測定した。以下に示すように、結果は、この処理条件により、ＨＰＶ ＲＮＡの増幅及び検出が損なわれないことを示した。

（実施例１）
合成転写物を用いるＨＰＶアッセイの分析感度の確立
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成転写物を、ＨＰＶ ＲＮＡの増幅及び検出のための、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイを用いて行われた従来のＴＭＡ反応中の増幅の鋳型として使用した。異なるＨＰＶ型それぞれについて用いた転写物のコピー数は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ液体系細胞診用保存剤（すなわち、ホルムアルデヒドを含有しないモデル保存剤）中に保存された検体を用いる予備手順において確立されていた、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイの検出限界（ＬＯＤ）に対応した。ＬＯＤは、検査した検体全てについて、少なくとも９５％の最小陽性度をもたらすコピーレベルである。この場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を全て、必要に応じて２０〜６００コピー／１反応で使用した。

３種類の異なるサンプル処理条件を試験した。第１には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を、ＳＴＭ中のＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）液体系細胞診用サンプル（１ｍＬのサンプル＋２．９ｍＬのＳＴＭ）に加え、続いて、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイの製造業者の指示に従って処理した。第２には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を、ＳＴＭ中の臨床的ＨＰＶ陰性残留ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤検体（１ｍＬのサンプル＋２．９ｍＬのＳＴＭ）に加えた。混合物の部分量（各３．９ｍＬ）を、１００μＬのプロテイナーゼＫ試薬（トリス緩衝液（ｐＨ８．０）中、１．８Ｕ／μＬプロテイナーゼＫ、アジ化ナトリウム、及びＣａＣｌ_２）と混合し、続いて、２時間６５℃にてインキュベートした。酵素消化工程の後、混合物を、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイの製造業者の指示に従って処理した。最後に、２番目の場合のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を、ＳＴＭ中の臨床ＨＰＶ陰性残留ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤検体に加えた。この場合、各サンプルＳＴＭ混合物の部分量３．９ｍＬを、０．３ｍＬの、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に２−イミダゾリドンを含むプロテイナーゼＫ酵素試薬と混合した。この試薬は、脱修飾溶液を用いて凍結乾燥されたプロテイナーゼＫを再構成することによって、調製されていた。最終混合物は、３６ｍＭ ＥＤＴＡ、３６ｍＭトリス−ＨＣｌ、約５３ｍＭ ２−イミダゾリドン、及び４３ＵのプロテイナーゼＫ酵素を含んでいた。混合物を９０℃で１５分間インキュベートし、次に、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイの製造業者の指示に従って処理した。ＨＰＶ ＲＮＡの増幅及び検出後、ＨＰＶ検出陽性の頻度を複製間で比較した。

図１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を用いて実施した分析感度評価の結果を示す。ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中に保存されたサンプルのアッセイ陽性度は、１４種類のＨＰＶ遺伝子型のうち１１種類について少なくとも９５％であり、３種類の遺伝子型、ＨＰＶ５６、５８及び５９は、それぞれ９３．３、９１．７、及び９０％陽性度をもたらした。これらの結果は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ液体系細胞診用保存剤中で保存されたサンプルについて得られたものと類似しており、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中に保存された後、プロテイナーゼＫ酵素単独で処理されたサンプルと類似しており、又はそれよりも良好であった。これによって、ＨＰＶ試験系の有用性が確立され、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫ酵素を組み合わせて高温条件下で使用すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅及び検出反応を実質的に阻害しないことが示された。

実施例２は、ＨＰＶを含むヒト細胞パネルの検査による、ＨＰＶアッセイの分析感度を評価するために使用される手順について記載する。手順は一般に、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物の代わりにＨＰＶ発現細胞株を使用したこと、及び、（２）サンプルを、ホルムアルデヒド含有保存剤の存在下で長時間インキュベートしたこと以外は、実施例１に記載されるものとした。

（実施例２）
ＨＰＶを含むヒト細胞株を用いるＨＰＶアッセイの分析感度の確立
ＨＰＶを含むヒト細胞株を、２５℃で７日間保存された、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤の検体プールに添加し、続いて、脱修飾溶液及びプロテイナーゼＫの組み合わせで９０℃ １５分間、又は、プロテイナーゼＫ単独で６５℃ ２時間処理した後、ハーフログ希釈（３〜３０細胞／１反応）で検査した。実施例１のように、脱修飾溶液及びプロテイナーゼＫの組み合わせは、凍結乾燥されたプロテイナーゼＫを脱修飾溶液で再構成することによって、１回の部分量として便利に送達できた。当然のことながら、試薬をこのように混合するのに要件はない。この手順で使用した細胞は、（１）ＳｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６を発現）、（２）ＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ１８を発現）、及び（３）ＭＳ７５１細胞（ＨＰＶ４５を発現）とした。ここでも、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイを製造業者の指示に従って用いて、ＨＰＶ核酸を捕捉し、増幅し、検出した。２つの条件下で処理されたサンプルについて、陽性度を比較した。

図２Ａ〜２Ｃは、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中で２５℃ ７日間保存された細胞株を用いて得られた、分析感度の結果を示す。脱修飾溶液及びプロテイナーゼＫ酵素の組み合わせで処理されたサンプル中の３種類全てのＨＰＶ陽性細胞株について、アッセイ陽性度は、ＳｉＨａ、ＨｅＬａ及びＭＳ７５１細胞それぞれについて、細胞３０、１０及び３０個／１反応の濃度で少なくとも９５％であった。これらの結果は、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中で２５℃にて７日間保存され、その後プロテイナーゼＫ酵素単独で処理されたサンプルを用いて得られた結果と類似しており、又はそれよりも良好であった。ＨｅＬａ細胞を最低導入細胞数で用いた検査において、最も劇的な違いが観察された。プロテイナーゼＫと組み合わせた２−イミダゾリドンおよび高温を使用するサンプル処理に対して、明らかに統計的に有意な利点があった。

実施例３は、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫを高温条件下で組み合わせて使用することによる、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に長期間保存されたサンプルからの、増幅可能な核酸の回収を改善する方法を示した手順について記載する。以下に記載するように、プロテイナーゼＫ単独で処理した検査に対するＲＮＡ回収の差は、長時間において最も顕著であった。

（実施例３）
ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に保存された細胞検体からの、増幅可能なｍＲＮＡ回収の強化
臨床検体を模倣するため、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイを用いて、予めＨＰＶ陰性と判定されたＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中の残留検体プール１０個を半分に分け、ＳｉＨａ又はＨｅＬａ細胞を添加した。全てのチューブを、そのまま２５℃で最大４２日間保存した。各プールの部分量を、検査各日において、１：２．９のＳＵＲＥＰＡＴＨ：ＳＴＭマトリックスで希釈して最終細胞濃度を細胞３０および１００個／１反応にした。サンプルを、プロテイナーゼＫ単独で６５℃ ２時間、又は、脱修飾溶液及びプロテイナーゼＫの組み合わせ（この組み合わせは、脱修飾溶液で再構成されたプロテイナーゼＫの１回部分量として送達される）で９０℃ １５分間でのいずれかによって処理した。ここでも、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイを製造業者の指示に従って用いて、ＨＰＶ核酸を捕捉し、増幅し、検出した。

図３Ａ〜３Ｂは、高温条件下での２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせでの処理を含んだサンプル処理は、プロテイナーゼＫ単独での処理よりも、有利であることを支持する結果を示す。この試験中の結果は全て有効であった。１反応当たり３０個の細胞では、２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせ（例えば、脱修飾溶液で再構成されたプロテイナーゼＫ）で処理されたＳｉＨａ及びＨｅＬａ細胞はいずれも、１４日目まで１００％陽性度を維持した。この保存期間を超えると、組み合わせ処理は、プロテイナーゼＫ単独での処理よりも大きな程度まで増幅可能なＲＮＡの回収を増強した。細胞１００個／１反応では、ＨｅＬａ細胞は２８日目まで１００％陽性度を維持し、一方ＳｉＨａ細胞は、２１日目まで１００％陽性のままであった（データ示さず）。

実施例４は、ホルムアルデヒド含有液体系細胞診用保存剤中に保存された臨床サンプルが、高温条件下において２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせで処理され、続いて、臨床サンプルが保存された期間の長さにかかわらず、実質的に一定量のＲＮＡをもたらすように処理されることを示すのに用いられた手順を説明する。

（実施例４）
組み合わせ処理は、長い保存期間にわたり臨床サンプルのＲＮＡの効率的な回収を可能にする
参照集団から入手した、ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤中の３０種類の検証済みＨＰＶ陽性臨床検体をこの試験で評価した。各検体の部分量（０．５ｍＬ）を２．９ｍＬのＳＴＭに加え、次に、０．５：２．９のＳＰ：ＳＴＭマトリックスで１：１０及び１：１００に希釈した。希釈液を４℃で保存し、続いて、１２０日間の様々なタイムポイントにおいて、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイにて検査した（各サンプルＮ＝４、タイムポイント当たりの総複製数１２０）。検査各日に、１ｍＬ部分量のサンプルを、２．９ｍＬのＳＴＭ及び０．３ｍＬの試薬（脱修飾溶液中に再構成され、プロテイナーゼＫの最終濃度を１４３Ｕ／ｍＬとしたプロテイナーゼＫを含む）と混合した。混合物を９０℃にて１５分間インキュベートし、標的捕捉法によって核酸を単離するように処理し、自動検査装置でのＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子プローブアッセイによって試験した。

図４は、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中で保存された臨床検体が、高温条件下において２−イミダゾリドン及びプロテイナーゼＫの組み合わせと短時間処理されると、実質的に一定のＲＮＡ回収率をもたらし得ることを示す結果を表す。１：１０で希釈された全ての検体は、４℃で１２０日間保存した後、少なくとも９７．５％陽性度を維持していた。１：１００で希釈した３０種類全ての検体の陽性度は、この試験の過程にわたって７４．２％〜８７．５％の範囲であり、陽性度の一貫した減少は見られなかった。

（実施例５）
温度依存性
標的調製：ＨＰＶ１８を感染させたＨｅＬａ細胞を含むチューブを３７℃で解凍し、１本のチューブに貯蔵した。リン酸緩衝生理食塩水をチューブに加え、チューブを１１００ｒｃｆにて遠心分離器中で回転させ、細胞ペレットを形成させた。ピペッティングによって上清を除去した。細胞ペレット由来のＨＰＶ陰性ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）臨床検体のプール（ＮＣＰＰ）を加え、ＳｕｒｅＰａｔｈ臨床検体をシミュレートした。ＨｅＬａ細胞及びＮＣＰＰを含むチューブを反転してペレットをバラバラにし、２５℃でインキュベートした（濃度：細胞１０００個／ｍＬ）。０、７、及び１４日後、チューブから部分量を取り出し、ＳＴＭを加え、希釈を行って、最終濃度を細胞１０個／１反応とした（ＮＣＰＰ：ＳＴＭの最終比は１：２．９）。チューブを処理し（次段参照）、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶキットを製造業者の指示に従って用いて検査した。

処理方法：２５℃でのインキュベーション及びＳＴＭ添加（前段参照）後、チューブを３群に分けた。加熱：３００μＬのＴＥ（チューブ中濃度：３６ｍＭトリス、３６ｍＭ ＥＤＴＡ）を反応チューブに加えた。チューブに蓋をして、９０℃の水浴中に１５分間置き、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶで検査した。ＰＫ：５０ｍｇのプロテイナーゼＫを１ｍＬのＦａｓｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ希釈剤で希釈した。１００μＬのＰＫ溶液を反応チューブに加えた（チューブ当たりプロテイナーゼＫ１８０単位）。チューブに蓋をして、６５℃の水浴中に２時間置き、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶで検査した。加熱＋ＰＫ：５０ｍｇのプロテイナーゼＫを１２ｍＬのＴＥに溶解した。３００μＬのＴＥ＋ＰＫ溶液を反応チューブに加えた（チューブ中濃度：３６ｍＭトリス、３６ｍＭ ＥＤＴＡ、ＰＫ４５単位）。チューブに蓋をして、９０℃の水浴中に１５分間置き、ＡＰＴＩＭＡ（登録商標）ＨＰＶキットを製造業者の指示に従って用いて検査した。結果を表１に示す。

Ｎ＝２０

これらのデータは、最長の保存を経たサンプルに対して、組み合わせ処理が最も効果的であったことを示す。更に、高温にてプロテイナーゼＫで処理されたサンプルは、低温にてプロテイナーゼＫで処理されたもの、又は、高温のみで処理されたものよりも回収率が高かった。

（実施例６）
ホルムアルデヒドスカベンジャー、プロテイナーゼＫ、及び高温
上記実施例５に実質的に記載されるように、標的を調製した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ−１８＋）、ＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ−１６＋）、ＭＳ７５１細胞株（ＨＰＶ−４５＋）及びトリコモナス細胞株（トリコモナス＋）を、７日間ＳｕｒｅＰａｔｈ溶液中でインキュベートした。７日後、部分量の各ＳｕｒｅＰａｔｈ細胞サンプルを、続いて、表２に示す条件で混合した。

^＊ ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞を、１８０ＵプロテイナーゼＫの存在下で、及び、４５ＵプロテイナーゼＫの存在下でインキュベートした。
^＊＊ １×及び２×は、溶液中の２−イミダゾリドンのモル濃度を指す。１×は、モル濃度が、溶液中のホルムアルデヒドとほぼ等量であることを意味し、２×は、ホルムアルデヒドの濃度の２倍を意味する。

続いて、組み合わせた溶液を、１５分間又は２時間のいずれか、かつ６５℃又は９０℃のいずれかの温度にてインキュベートした。インキュベーション条件を表３に示す。

インキュベーション後、サンプルをアッセイし、様々な処理による核酸回収率を判定した。第１のアッセイでは、条件１〜４の細胞３個／１反応のＨｅＬａ細胞、及び、条件１〜４の細胞１０個／１反応のＳｉＨａ細胞（表３参照）を、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶキット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を通常は製造業者の指示に従って用いてアッセイした。第２のアッセイでは、条件１、２＆４の細胞０．０５個／１反応のトリコモナス細胞（表３参照）を、ＡＰＴＩＭＡ膣トリコモナスアッセイ（カタログ番号３０３５６３、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を通常は製造業者の指示に従って用いてアッセイした。第３のアッセイでは、条件１、２＆５の細胞３個／１反応の各ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、及びＭＳ７５１細胞（表３参照）を、それぞれ４５ＵのプロテイナーゼＫとインキュベートし、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶキット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を通常は製造業者の指示に従って用いてアッセイした。第４のアッセイでは、条件１、２＆５の細胞３個／１反応の各ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、及びＭＳ７５１細胞（表３参照）を、それぞれ４５ＵのプロテイナーゼＫとインキュベートし、ＡＰＴＩＭＡ ＨＰＶ遺伝子型同定キット（カタログ番号３０３２３４、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を通常は製造業者の指示に従って用いてアッセイした。結果を表４〜７に示す。

これらのデータは、ホルムアルデヒドを含有する液体系細胞診用保存剤中に保存された検体を、ホルムアルデヒドスカベンジャー、プロテイナーゼＫ、及び高温の組み合わせで短時間処理すると、実質的に一定のＲＮＡ回収率をもたらし得たことを示す。これらのデータは更に、プロテイナーゼＫを含む配合物は、プロテイナーゼＫを変性し、不活化することが知られており、更にはＲＮＡを破壊することが知られている高温において有用であり、更に低温での回収率と比較して、優れた核酸回収率をもたらすことを示す。これらのデータは更に、低濃度のプロテアーゼを用いて、ホルマリン含有溶液から核酸の回収が可能な配合物を示す。

（実施例７）
以下のアッセイを行って、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）試薬で７日間処理されたサンプルからのＲＮＡの回収率を測定したが、このサンプルは、プロテイナーゼＫによって１５分間、色々な高温において処理された。実施例６に実質的に記載されるように、サンプルを調製した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ−１８＋）及びＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ−１６＋）を、７日間２５℃においてＳｕｒｅｐａｔｈ（登録商標）中でインキュベートした。７日後、部分量の各ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）細胞サンプルを、続いて、上記表２に示す条件３で混合した。次に、表８に示されるように、混合した溶液を色々な温度で１５分間インキュベートし、ＨＰＶ検出キット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてアッセイした。

以下のアッセイを行って、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）試薬で７日間処理されたサンプルからのＲＮＡの回収率を測定したが、このサンプルは、プロテイナーゼＫによって９０℃にて、色々な短いインキュベーション時間で処理された。実施例６に実質的に記載されるように、サンプルを調製した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ−１８＋）及びＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ−１６＋）を、７日間２５℃においてＳｕｒｅｐａｔｈ（登録商標）中でインキュベートした。７日後、部分量の各ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）細胞サンプルを、続いて、上記表２に示す条件３で混合した。次に、表９に示されるように、混合した溶液を９０℃で色々な分にわたりインキュベートし、続いて、ＨＰＶ検出キット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてアッセイした。

以下のアッセイを行って、ＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）試薬で７日間処理されたサンプルからのＲＮＡの回収率を測定したが、このサンプルは、色々な濃度のプロテイナーゼＫによって、９０℃にて１５分のインキュベーション時間で処理された。実施例６に実質的に記載されるように、サンプルを調製した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ−１８＋）及びＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ−１６＋）を、７日間２℃においてＳｕｒｅｐａｔｈ（登録商標）中でインキュベートした。７日後、部分量の各ＳｕｒｅＰａｔｈ細胞サンプルを、続いて、プロテイナーゼＫ濃度が表Ｃに挙げられる以外は、実質的に上記表２に示す条件３に類似する条件で混合した。次に、表１０に示されるように、混合した溶液を９０℃で１５分間インキュベートし、続いて、ＨＰＶ検出キット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてアッセイした。

以下のアッセイを行って、ＳｕｒｅＰａｔｈ試薬で７日間処理されたサンプルからのＲＮＡの回収率を測定したが、このサンプルは、色々な濃度の２−イミダゾリドンによって、９０℃にて１５分のインキュベーション時間で処理された。実施例６に実質的に記載されるように、サンプルを調製した。簡潔に言えば、ＨｅＬａ細胞株（ＨＰＶ−１８＋）及びＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ−１６＋）を、７日間２５℃においてＳｕｒｅｐａｔｈ中でインキュベートした。７日後、部分量の各ＳｕｒｅＰａｔｈ細胞サンプルを、続いて、２−イミダゾリドン濃度が表Ｄに挙げられる以外は、実質的に上記表２に示す条件３に類似する条件で混合した。次に、表１１に示されるように、混合した溶液を９０℃で１５分間インキュベートし、続いて、ＨＰＶ検出キット（カタログ番号３０３５８５、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてアッセイした。

全てのアッセイにおいて、複製数は４０である。

（実施例８）
ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤中に保存された検体の処理を含む作業の流れ
実施例８は、臨床サンプル処理における典型的な作業の流れについて記載する。スワブデバイスを用いて得られた臨床サンプルを、ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤を含有するバイアルに導入し、バイアルの蓋をしっかりと閉める。ＳＵＲＥＰＡＴＨ液体系細胞診用保存剤を、液体系細胞診用保存剤として使用してよい。バイアルの液体内容物中に分散された細胞材料を、核酸の分子解析などの検査のために、臨床検査室に移す。臨床検査室において、バイアルの部分量を、緩衝化界面活性剤溶液などの希釈剤の部分量と混合する。リン酸緩衝界面活性剤溶液は、好ましい希釈剤の一例である。この用途で使用される界面活性剤は、好ましくは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）などのアニオン性界面活性剤である。この混合物を更に、２−イミダゾリドン及びプロテアーゼと混合する。この目的で使用されるプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ酵素であってよい。簡略化法では、凍結乾燥されたプロテイナーゼＫを、ｐＨ緩衝液、ＥＤＴＡ、及び２−イミダゾリドンを含む溶液中に再構成する。ｐＨ緩衝液はトリス緩衝液であってよく、再構成された酵素溶液は約８．０のｐＨを有していてよい。希釈臨床サンプル、２−イミダゾリドン、及びプロテアーゼ酵素を含む最終混合物を、次に高温まで５分〜３０分間加熱する。混合物は、好ましくは約９０℃まで約１５分間加熱される。サンプル中の核酸は、精製およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応における鋳型としての使用に好適となる。例えば、ＲＮＡは、例えば固定化核酸鎖への配列特異的ハイブリダイゼーションを用いて、固形担体上に捕捉されることによって精製され、続いて、核酸増幅反応において増幅される。核酸増幅反応は転写増幅（ＴＭＡ）反応であってよい。増幅産物を、配列特異的ハイブリダイゼーションプローブと接触させ、特定の標的配列の有無を判定する。特定の標的配列は、ＨＰＶ標的配列であってよい。この作業の流れを図５に示す。

本発明を、それらの多くの具体的な実施例及び実施形態を参照して説明してきた。当然のことながら、上記の詳細な説明の概観によって、本発明の多くの異なる実施形態それ自体が当業者に示唆される。したがって、添付の特許請求の範囲を参照することによって、本発明の真の範囲が定められる。文脈から明らかでない限り、本発明の任意の実施形態、態様、工程、又は特徴は、任意の他のものと共に使用できる。

Claims (39)

1. ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤に入れられた臨床サンプルを含む検体を処理する方法であって、
   （ａ）前記検体をプロテイナーゼＫ酵素及びホルムアルデヒドスカベンジャーと混合して反応混合物を作る工程であって、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、２−イミダゾリドンまたはコハク酸ジヒドラジドである、工程と、
   （ｂ）前記液体系細胞診用保存剤中のホルムアルデヒドにより、前記検体中に含有され得る核酸の化学修飾をリバースするのに十分な時間にわたり、８５〜１００℃の間で前記反応混合物をインキュベートする工程と、
   （ｃ）前記インキュベートする工程後に前記反応混合物から核酸を単離する工程と、
   （ｄ）前記単離する工程の前記核酸を鋳型として用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅反応を実施する工程と、を含む、方法。
2. 前記インキュベートする工程において、前記反応混合物が８５〜９８℃の間でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
3. 前記インキュベートする工程において、前記反応混合物が８５〜９５℃の間でインキュベートされ、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、コハク酸ジヒドラジドである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記インキュベートする工程において、前記反応混合物が９１〜９５℃の間でインキュベートされ、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、コハク酸ジヒドラジドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記インキュベートする工程において、前記反応混合物が９５℃でインキュベートされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが２−イミダゾリドンである、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記リバースにより、前記検体中のポリペプチドへのホルムアルデヒド誘発性架橋から、前記検体中の核酸が放出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記プロテイナーゼＫが、前記核酸を前記ホルムアルデヒド誘発性架橋から解放し、ホルムアルデヒドスカベンジャーが、前記サンプル中の核酸とポリペプチドとの間への新たな架橋の誘発を阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記サンプルが、工程（ａ）の実施前に７〜１２０日間、前記液体系細胞診用保存剤中に入れられている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記インキュベートする工程が３０分以下にわたる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記インキュベートする工程が５分〜３０分である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記インキュベートする工程が１５分以下にわたる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量が、プロテイナーゼＫ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた対照増幅よりも高い、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 工程（ｄ）後の増幅された核酸の収量が、プロテイナーゼＫ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた対照増幅よりも少なくとも１０％高い、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記サンプル中の核酸分子の少なくとも９０％が、前記インキュベートする工程後に架橋を含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記インキュベートする工程前の２−イミダゾリドンの最終濃度が、前記ホルムアルデヒドの最終最高濃度よりも、モルで１〜５倍高い、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記インキュベートする工程前の２−イミダゾリドンの最終濃度が、前記ホルムアルデヒドの最終最高濃度よりも、モルで２〜５倍高い、請求項１６に記載の方法。
18. 前記プロテイナーゼＫが、４．３〜４３Ｕ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１又は１７に記載の方法。
19. 前記プロテイナーゼＫ及び前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、前記検体と同時に混合される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記プロテイナーゼＫが、ホルムアルデヒドスカベンジャーより前に前記検体と混合される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、前記プロテイナーゼＫより前に前記検体と混合される、請求項１に記載の方法。
22. 前記増幅が、転写増幅、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベース増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自家持続配列複製、又はＤＮＡリガーゼ連鎖反応である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記核酸がＤＮＡを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記単離された核酸がＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記核酸が、単離される前記核酸及び固定化プローブにハイブリダイズする、捕捉プローブを用いる捕捉アッセイにより単離される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記固定化プローブが磁気ビーズに固定化されている、請求項２５に記載の方法。
27. 工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、プロテイナーゼＫ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度よりも高い、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、プロテイナーゼＫ又はホルムアルデヒドスカベンジャーのうちいずれかを除いた反応混合物から得られた増幅された核酸のアッセイ陽性度より少なくとも１２％高い、請求項２７に記載の方法。
29. 工程（ｄ）後の増幅された核酸のアッセイ陽性度が、２１日後に９５％である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記検体が子宮頚部細胞検体である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
31. ホルムアルデヒドを含む液体系細胞診用保存剤中で保存された核酸含有サンプルを処理するためのシステムであって、前記システムの構成要素が、
    プログラム可能なコントローラと、
    前記プログラム可能なコントローラと通信するピペット装置と、
    反応バイアル用第１ホルダーと、
    試薬バイアル用第２ホルダーと、
    加熱要素と、を備え、
    前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記試薬バイアルが、ホルムアルデヒドスカベンジャー、プロテイナーゼＫ、ＥＤＴＡ、及びｐＨ緩衝液を含む溶液を含有するとき、前記ピペット装置によって、前記試薬バイアルから部分量の液体を前記反応バイアルに移動させるように構成されており、
    前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを８５℃〜１００℃の温度まで加熱させるように構成されており、
    前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、２−イミダゾリドンまたはコハク酸ジヒドラジドである、
    システム。
32. 前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを８５℃〜９８℃の温度まで加熱させるように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
33. 前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを８５℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されており、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、コハク酸ジヒドラジドである、請求項３１又は３２に記載のシステム。
34. 前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを９１℃〜９５℃の温度まで加熱させるように構成されており、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーが、コハク酸ジヒドラジドである、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
35. 前記プログラム可能なコントローラが、ソフトウェアの命令により、前記加熱要素によって、前記反応バイアルを９５℃の温度まで加熱させるように構成されている、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
36. 前記反応バイアル中の前記試薬が、前記ホルムアルデヒドスカベンジャーとして２−イミダゾリドンを含む、請求項３１又は３２に記載のシステム。
37. 前記反応バイアル中の前記試薬が、４２〜４５Ｕの濃度のプロテイナーゼＫを含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
38. 前記臨床サンプルが子宮頚部細胞検体である、請求項１に記載の方法。
39. 前記核酸含有サンプルが子宮頚部細胞検体である、請求項３１に記載のシステム。