JP6779558B2 - 凍結させる生物学的試料における氷核形成を制御する装置 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、氷形成を制御するための装置、方法およびシステムに関する。

生物学的材料（例えば、細胞、ワクチン、およびタンパク質）は、多くの場合、保存される必要がある。例えば、生物学的材料は、後の時点での科学的実験で研究できるまたは使用できるように保存する必要があるかもしれない。別の例では、ヒト卵母細胞または受精した胚は、インビトロ受精（ＩＶＦ）プロセスの一部として保存されるかもしれない。これらの例では、生物学的材料の損傷または分解が最小限に抑えられるように生物学的材料が保存されることが重要である。凍結技術は、生物学的材料を保存するためにしばしば用いられる。生物学的材料を凍らせて保存するには、さまざまな方法がある。例えば、凍結保存は、生物学的材料を凍結させた後に凍結状態で保存するプロセスであり、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）は生物学的試料を凍結させ、凍結工程に続いて水を試料から除去し、試料を乾燥した状態で保存するプロセスである。

凍結保存は、医学、バイオテクノロジーおよび獣医学においてその後の適用のために生物学的試料の長期にわたる生存率を維持するために使用される広く採用されている技術である。解凍時に高い生存率を得るためには、凍結防止添加剤としても知られている保護化合物を添加し、制御された速度で試料を冷却することが必要である。多くの細胞の種類では、自発的な氷核形成を許容するよりはむしろ、制御された核形成によって氷の形成を誘導することも必要である。凍結保存のための試料は、一般に次のような専門の冷凍容器に入れられる：
・ストロー（典型的には直径２ｍｍ〜４ｍｍ、長さ１４０ｍｍまでの薄壁チューブであり、容量は０．２ｍｌ〜０．５ｍｌである）；
・クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）（より広い直径（典型的に直径１２．５ｍｍ）の短いチューブであり、容量は０．５ｍｌ〜５．０ｍｌである）；
・バッグ（５ｍｌ〜１０００ｍｌの容量を備えた、種々の可撓性バッグは、大容量の凍結保存に利用できる）；そして
・マルチウェルプレート、マトリックスチューブ、およびロボット工学、ハイスループットスクリーニング等にて使用されるその他のＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）フォーマット。

冷凍容器中の試料の制御された速度での凍結を可能にする種々の装置が存在する。これらのデバイスは、液体窒素を低温流体（ｃｒｙｏｇｅｎ）として使用してもよいし、機械的冷凍によって冷却されてもよい。さらに、多くの受動的冷却デバイスが存在する。制御された速度での凍結後、試料は低温、通常は液体窒素の温度（−１９６℃）で凍結保持される。この温度では、細胞生存率は、それらが冷却段階から生存した場合の貯蔵期間とは無関係である。使用のために必要とされる場合、試料は一般に３７℃に維持された水浴中で迅速に解凍され、凍結保存剤は除去される。

凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）は、細胞、ワクチン、タンパク質および他の生物活性化合物の長期安定化のために、バイオテクノロジー、医学および獣医学において広く使用されている。凍結乾燥プロセスはまた、再生医学および新規なセラミックスの製造に適用するための骨格およびマトリックスなどの構造化材料を生成するためにも使用される。凍結乾燥プロセスでは、水性試料を専門の容器、通常はガラスバイアルに入れ、凍結させる。通常、凍結乾燥機内の冷却された棚で凍結が行われる。凍結後、局所的なガス圧を低下させると、凍結試料内の氷が昇華する。試料から全ての水を除去した後、バイアルを真空下で加温し、密封する。試料は周囲温度で分配され、水を加えることによって再構成される。

安定した氷核形成は凍結保存における最大の課題の１つである。液体がその融点まで冷却されると、氷核形成は直ぐには起こらない。試料は、氷核形成が起こることなくその融点よりも２０℃以上低い温度に低下し、「過冷却（ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉｎｇ）」または「過冷却（ｕｎｄｅｒｃｏｏｌｉｎｇ）」として知られている状態になる。試料の温度が低下すると、ある時点で自発的な氷核形成が起こり、氷が試料全体に広がる。

いくつかの細胞の種類は強固であり、過冷却によって悪影響を受けない。しかしながら、多くの細胞の種類は過度の過冷却によって損傷を受け、それは解凍後の細胞生存率を低下させる可能性がある。氷核形成の可変的な性質のために、試料の生存率の間には幅広い変動があり得る。これは様々な有害な商業的影響を与える：
１．凍結および解凍後の試料中の一定数の生存細胞を保証する企業は、生存率の範囲を補償するために試料を過剰充填しなければならない。仮に細胞のばらつきを減少させることができる場合、より少ない細胞量を必要とすることになり、それでも生存可能な最小数が保証される。これにより、コストが大幅に削減される。

２．細胞のばらつきは別として、仮に全体的な生存率を高めることができれば、同じ生産コストで総収量が高くなる。
３．凍結および解凍された接着細胞でのマルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレートおよび３８４ウェルプレート）を使用するハイスループットスクリーニングは、関心のある細胞の種類（肝細胞、筋細胞、幹細胞株など）の多くでは不可能である。細胞のバックグラウンドでのばらつきは、有意な試験結果を同定するにはあまりにも多くの「ノイズ」を引き起こす。これにより、企業は、接着細胞で調製された「新鮮な」（すなわち、凍結されていない）マルチウェルプレートを使用するか、単一の凍結した供給源からマルチウェルプレートをシーディングすることを強いられる。いずれの選択肢も、マルチウェルテストのロジスティクスを複雑にすると同時に、時間とコストが大幅に増加する。

過冷却された水溶液中の氷核形成は、２つの異なるプロセスによって起こり得る：
１）均質な氷核形成は、水体（ｂｏｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ）内のランダムな密度変動によって簡単に生じ、そのような分子クラスターの成長および崩壊の動力学および氷の結晶化のための核として作用する同分子クラスターの能力については十分に記載されている。

２）不均質な氷核形成または促進された氷核形成は、水と接触している固体または液体の基質によって触媒され、吸着された水分子のグループが氷形成を促進することができる形態をとることを可能にする。実際には、凍結保存試料中の氷核形成は不均質なメカニズムによって起こる。

凍結保存の間に経験される氷核形成温度の範囲を減少させるために、試料内で氷核形成を誘発するために多数の物理的方法が用いられてきた。
１）「シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）」。哺乳動物組織培養の基本的な低温生物学の初期の研究において、細胞およびのちのＩＶＦ試料は、過冷却された試料への小さな氷結晶の物理的導入によってシーディングされていた。この手順に伴う汚染の可能性を取り除くために、閉じた冷凍容器の外側にコールドスポットを手動で生成することによって試料中に氷核形成を誘発することが現在では一般的に行われており、これはいまでも誤って「シーディング」と呼ばれている。

２）エレクトロフリージング（Ｅｌｅｃｔｒｏｆｒｅｅｚｉｎｇ）。金属電極に印加される高電圧は、過冷却水中での氷形成を誘導することが示されており、これは凍結保存に適用されている。

３）機械的方法。振盪、テーピング（ｔａｐｉｎｇ）、超音波の適用は、過冷却された試料中で氷を誘導するのに非常に有効であり得る。実験的な凍結乾燥装置では、超音波氷核形成が実施されている。

４）「衝撃冷却」。従来のゆっくりとした冷却に続いて、試料を急速に冷却し、その後さらに温度勾配の複合セットにさらす。試料の壁に「コールドスポット（ｃｏｌｄ ｓｐｏｔ）」が形成され、局所的な氷核形成をもたらす可能性がある。速度の制御を備えた凍結装置の数多くの供給業者が、同供給業者の装置に衝撃冷却機能を組み込んでいる。

５）圧力シフト。この方法は、圧力を制御することができるチャンバ内に試料を収容する凍結乾燥に適用されている。試料をアルゴンで２８ｐｓｉｇ（１９３ｋＰａ）まで加圧し、次いで所望の核形成温度に冷却し、その後、圧力を１ｐｓｉｇ（６．９ｋＰａ）に下げて核形成を誘発する。

これらの物理的方法は、標準化することが困難であり、従来の冷却速度装置に組み込むことが困難であり、多数の試料またはすべての試料容器との互換性がない。別のアプローチは、氷の不均一核形成剤を使用し、これらを試料容器または懸濁液に組み込むことである。凍結保存中の氷核形成は、懸濁媒体中に特定の氷核形成触媒を含めることによって実証されている。検討された氷核剤には、細菌シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀および長石が含まれる。これらの材料は、効率的な氷核形成剤であるが、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）適合材料とすることが困難であるか、または生体適合性でなく、従って多くの用途で使用することができない。また、凍結および融解後に、そうでなければ細胞の生存率および機能を妨害する可能性がある氷核剤を除去する必要がある。現在のところ、これらの問題を回避するデバイスであって、試料への氷核形成剤の提示を可能にするデバイスは存在していない。

したがって、本出願人は、氷形成および氷核形成を制御するための改良された装置の必要性を認識している。

本発明の第１の態様によれば、氷核形成を実施するための装置が提供され、同装置は、キャビティと少なくとも１つの透過性ハウジング壁とを含む少なくとも１つのハウジングと、キャビティ内に封入された氷核形成材料とを含む。

実施形態では、ハウジングは、第１の透過性ハウジング壁と第２の透過性ハウジング壁とを含む。２つの透過性ハウジング壁を有する利点は、液体が氷核形成材料に接触する機会が増加し、氷結晶の形成を加速させる可能性があるという点にある。特に氷核形成材料が粉体の形態で提供される実施形態では、キャビティ内に空気が存在する可能性がある。透過性ハウジング壁は、キャビティが液体および氷核形成材料で実質的に満たされるように、液体がキャビティに入ることを可能にし、空気がキャビティから逃げることを可能にする。これにより、キャビティ内の圧力の蓄積が減少し、氷核形成材料と相互作用することができる液体の量が増加する（それによって氷形成が加速される）。

実施形態では、第１の透過性ハウジング壁は第１の層で形成され、第２の透過性ハウジング壁は第２の層で形成され、キャビティは第１の層と第２の層の間に設けられる。
好ましくは、第１の層および第２の層は、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、ハウジングの縁部であってキャビティを囲む縁部にて少なくとも互いに結合される。

付随的または代替的に、ハウジングは、第１の部分および第２の部分を有する透過性材料層から形成されてもよく、第１の透過性ハウジング壁は透過性材料層の第１の部分から形成され、第２の透過性ハウジング壁は透過性材料層の第２の部分から形成され、かつキャビティは、透過性材料層の第１の部分と第２の部分との間に設けられている。

好ましくは、透過性材料層は、透過性材料層の第１の部分と第２の部分との間にキャビティを形成するように折り畳まれ、第１の部分と第２の部分は、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、ハウジングの縁部であってキャビティを囲む縁部にて少なくとも互いに結合される。

付随的または代替的に、ハウジングは、ハウジング本体および透過性ハウジング壁を含み、キャビティは、ハウジング本体と透過性ハウジング壁との間に設けられる。
好ましくは、ハウジング本体は、同ハウジング本体の表面に凹部を備え、凹部はキャビティを形成し、透過性ハウジング壁は凹部を覆って設けられ、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、ハウジング本体の表面に結合される。

代替的な実施形態では、ハウジングは、ハウジング本体と、第１の透過性ハウジング壁と、第２の透過性ハウジング壁とを備え、ハウジング本体は貫通穴を含むディスクであり、貫通穴はキャビティを形成し、キャビティ内に氷核形成材料を封入するために、第１の透過性ハウジング壁が貫通穴を覆って設けられ、ハウジング本体の第１の表面に結合され、第２の透過性ハウジング壁が貫通穴を覆って設けられ、ハウジング本体の第２の表面に結合される。

上記実施形態のいずれかにおいて、装置は、ハウジングに結合されたステムをさらに備えていてもよい。ステムの利点は、ステムが容器内の装置の位置を制御するために使用できる点にある。さらに、ステムは、解凍後に容器から装置を取り外すことの容易さを改善する。

上記の実施形態のいずれかにおいて、装置は、第１の端部および第２の端部を有するステムをさらに備えていてもよく、第１の端部はハウジングに連結され、第２の端部は容器の蓋に連結される。有利なことに、これは、装置を各容器内の所定の一貫した位置に配置することを可能にし、さらに、解凍後に容器から装置を取り外すことの容易さを改善することができる。

いくつかの実施形態では、装置は、複数のウェルと、複数の一体化ハウジングとを含むマルチウェルプレートを含み、複数の一体化ハウジングのうちの１つの一体化ハウジングは複数のウェルのうちの１つのウェルに一体化される。

好ましくは、一体化ハウジングは、一体化ハウジング壁と、一体化透過性ハウジング壁と、一体化ハウジング壁と一体化透過性ハウジング壁との間の一体化キャビティとを含み、一体化キャビティは、氷核形成材料を含有する。

実施形態では、一体化ハウジング壁は、ウェルの側壁の少なくとも一部から形成される。付随的または代替的に、一体化ハウジング壁は、少なくともウェルの底壁から形成される。ウェルの底壁は、内面に凹部を備え、凹部は一体化キャビティを形成し、一体化透過性ハウジング壁は凹部を覆って設けられ、氷結核材料をキャビティ内に封入するために、底壁の内面に結合される。

好ましい実施形態では、装置は、複数のウェルを有するマルチウェルプレートのための挿入プレートを含み、挿入プレートは、アレイにて配置されている複数の脚部と、複数の足部とを含み、各脚部は、前記挿入プレートに結合されるとともに同挿入プレートの表面から延びる第１の近位端部を有し、各足部は脚部の第２の遠位端部に連結されている。

挿入プレートはマルチウェルプレートに結合可能であり、マルチウェルプレートの複数のウェルに複数の足部を提供し、それにより氷核形成材料を各ウェルに送達することができる。

実施形態では、挿入プレートは、アレイに配置された複数の穴をさらに含み、各脚部は、穴に近接して挿入プレートに結合される。
少なくとも１つのハウジングは複数のハウジングからなり、各ハウジングは足部内に設けられ、各ハウジングはキャビティと少なくとも１つの透過性ハウジング壁とを含む。

好ましくは、各ハウジングは、第１の透過性ハウジング壁と第２の透過性ハウジング壁とを含み、キャビティは、第１の透過性ハウジング壁と第２の透過性ハウジング壁との間に設けられる。

上記した実施形態のいずれかにおいて、ハウジングは少なくとも１つの換気穴を含み、水が透過性ハウジング壁を通ってキャビティに入ると、キャビティ内の空気を逃がし、それによりキャビティ内の圧力を減少させる。

実施形態では、挿入プレートは、マルチウェルプレート上にスナップ嵌めすることができる。実施形態では、挿入プレートの各脚部の長さは、マルチウェルプレートの各ウェルの深さよりも短い。実施形態では、脚部と足部とを合わせた長さは、マルチウェルプレートの各ウェルの深さよりも小さい。いずれの場合も、この配置は、ウェルの底部（冷却が適用され、氷形成がより起こりやすい）の近くに足部（したがって氷核形成材料）を設けることを可能にする。この配置は、そうでなければ生物学的材料に損傷を与える可能性のある、ウェルの底部またはその近くに存在する任意の生物学的物質（例えば、細胞）に足部が接触するのを妨げることができる。

透過性ハウジング壁若しくは各透過性ハウジング壁または本明細書に記載の各実施形態は、透過性材料、１つまたは複数の穴を含む材料、スポンジ材料、スポンジ材料を含む材料、ウィッキング材料、フィルタプレート、フィルタ材料、メッシュ材料、透過性膜、親水性フィルタおよび親水性膜材料のうちの任意の１つから形成されてもよい。

本明細書に記載された実施形態のいずれにおいても、氷核形成材料は、グラム陰性菌、シュードモナス・シリンガエ、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀、および長石のいずれかであってもよい。

本発明の第２の態様によれば、容器内に氷を核形成するために、本明細書に記載の装置の使用が提供され、容器は、試験管、バイアル、ストロー、マルチウェルプレートのウェル、マルチウェルプレート、およびバッグのうちの任意の１つを含む。

本発明の第３の態様によれば、マルチウェルプレート内の氷を核形成するために、本明細書に記載の装置の使用が提供される。
本発明の第４の態様によれば、氷を核形成する方法が提供され、同方法は凍結させる生物学的試料を含む容器に本明細書に記載の装置を挿入するステップを含む。

本発明の第５の態様によれば、氷を核形成する方法が提供され、同方法は凍結させる生物学的試料をそれぞれ含む複数のウェルを有するマルチウェルプレートに本明細書に記載の装置を挿入するステップを含む。好ましくは、装置はマルチウェルプレートと互換性がある。したがって、好ましくは、マルチウェルプレートに挿入された装置はＮ個ｘＭ個のアレイの脚部を含み、マルチウェルプレートの複数のウェルはＮ個ｘＭ個のアレイに配置されている。

本発明の第６の態様によれば、凍結されるべき試料を収容するための容器と、本明細書に記載の装置と、を含む氷核形成を実施するためのシステムが提供される。容器は、試験管、バイアル、ストロー、マルチウェルプレートのウェル、マルチウェルプレート、およびバッグのうちの任意の１つであってもよい。

一実施形態による、氷核形成を実施するための装置の側方からの断面図である。 さらなる実施形態による、氷核形成を実施するための装置の側方からの断面図である。 さらなる実施形態による氷核形成を実施するための装置の側方からの断面図である。 さらなる実施形態による氷核形成を実施するための装置の側方からの断面図である。 氷核形成装置を含むシステムを示す。 氷核形成装置を含むシステム（左）および氷核形成装置の斜視図（右）を示す。 ステムを有する氷核形成装置を含むシステムを示す。 ステムを有する氷核形成装置を含むシステム（左）および氷核形成装置の斜視図（右）を示す。 容器の蓋に結合されたステムを有する氷核形成装置を含むシステムを示す。 容器の蓋に結合されたステムを有する氷核形成装置を含むシステム（左）および氷核形成装置の斜視図（右）を示す。 典型的なマルチウェルプレートのウェルの断面図を示す。 装置がマルチウェルプレートの形態をとる実施形態における、氷核形成装置の一部の断面図を示す。 装置がマルチウェルプレートの形態をとる更なる実施形態における、氷核形成装置の一部の断面図を示す。 装置がマルチウェルプレートの形態をとる更なる実施形態における、氷核形成装置の一部の断面図を示す。 装置がマルチウェルプレート用の挿入プレートの形態をとる実施形態における氷核形成装置の一部の側方からの断面図を示す。 マルチウェルプレートのウェル内の図８ａの氷核形成装置の一部の断面図を示す。 図８ａの氷核形成装置の一部に氷核形成材料を封入するステップを示す概略図である。 氷核形成装置の一実施形態における氷核形成材料を封入するステップを示す概略図である。 マルチウェルプレートのための挿入プレートの形態をとる氷核形成装置の斜視図および氷核形成装置の一部の拡大図を示す。 図９ａの氷核形成装置の底面の斜視図を示す。 （ａ）氷核形成材料を含まない複数の別個の試料、および（ｂ）氷核形成材料を添加した同じ試料についての、溶液の温度対時間を示すグラフである。

これらの技法は、例として、添付の図面に図式的に示されている。
概して言えば、本技法の実施形態は、凍結保存および凍結乾燥のプロセス時等において、氷形成を制御するための装置を提供する。特に、同装置は、氷核形成剤が試料内の生物学的物質に接触することなく、または生物学的物質を汚染することなく、保存されるべき生物学的試料に氷核形成材料を送達するための機構を提供する。有利なことに、装置の実施形態は、バイアル、チューブ、マルチウェルプレートなどの既存の広く使用される実験装置との互換性を備えて製造されてもよい。装置のさらなる利点は、試料の凍結および引き続く解凍の後の細胞生存率の増加である。

本願の装置は、試料が同試料の融点に近い温度で凍結するように、凍結保存および凍結乾燥における凍結プロセスを制御すること（および特に氷形成の制御）を可能にする。少量の液体は、その液体の融点より低い温度で凍結することがある。例えば、１０リットルの水が（１気圧の大気で）凍結する温度は約０℃であるが、より少量の水、例えば、数マイクロリットルの水は、典型的には非常に低い温度、例えば−３０℃（１気圧の大気で）で凍結する。さらに、少量の水が凍結する正確な温度にはかなりのばらつきがある。凍結試料が生物学的物質（例えば、細胞）を含む場合、生物学的物質の生存率は、凍結および解凍プロセスに依存する。典型的には、生物学的試料は少量で凍結され、したがって生物学的材料が含まれる試料／液体の融点よりも低い温度で凍結する。しかしながら、生物学的試料が同試料の融点よりも遥かに低い温度で凍結した場合、凍結および解凍プロセスの間に損傷を受けるまたは変性する可能性が大きい。したがって、凍結中に生物学的試料に損傷を与えるリスクを低減するために、試料に氷核形成材料を添加するなどして、試料が凍結する温度を上昇させる技術が使用される。

氷核形成装置は、凍結される試料に氷核形成材料を有利に送達し、氷核形成材料が試料を透過して同試料中の生物学的物質と接触するのを防止する。以下でより詳細に説明するように、氷核形成装置は異なる形態をとってもよく、即ち、試料を含む容器に添加することができる装置であってもよく、マルチウェルプレートの形態であってもよく、および／またはマルチウェルプレートのための挿入プレートの形態であってもよい。各実施形態において、氷核形成装置は、キャビティと少なくとも１つの透過性ハウジング壁とを有するハウジングと、キャビティ内に封入された氷核形成材料とを含む。透過性ハウジング壁は、液体分子（例えば水）に対して透過性であるが、任意の生物学的物質（例えば、細胞、タンパク質、ワクチンなど）に対して透過性でなくてもよく、氷核形成材料に対して透過性でなくてもよい。したがって、凍結させる試料を装置に接触させると、試料中の液体が透過性ハウジング壁を透過して、試料が冷却されている間に装置によって液体氷結晶の形成が誘発される。試料の温度が充分に低い温度に達すると、氷核形成材料が氷結晶の形成を開始する（ｓｅｅｄ）。氷結晶は液体試料中を広がる。氷核形成装置は凍結試料内に留まり、凍結試料が解凍された後に除去されてもよい。実施形態では、氷核形成装置は再使用可能であってもよい。あるいは、氷核形成装置は単回使用のための装置であり、すなわち使い捨て可能である。

実施形態では、透過性ハウジング壁の孔径は、氷核形成材料の粒子のサイズより大きくてもよいが、氷核形成材料が粉体の形態であるとき、粒子は互いに結合して流れなくなる傾向になる。氷核形成材料が濡れると、それは多くの場合、さらに流動することを嫌う。従って、氷核形成材料が孔を通ってキャビティから逃げる可能性が減少する。実施形態では、透過性ハウジング壁の孔径は、容器内の生物学的物質（例えば、細胞）のサイズより大きくてもよい。しかしながら、生物学的物質は、生物学的物質が装置に直接接触して透過性ハウジング壁を透過することが起こり得ないように、典型的には、容器の基部上に堆積されるか、または容器の基部に配置されるか、多くの場合基部に実質的に固定され得る。

用語「装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）」は、本明細書では、用語「氷核形成装置」、「デバイス」および「物質を含有するデバイス」と互換的に使用される。
用語「氷核形成材料」は、本明細書では、用語「氷核剤」、「核形成剤」、および「凍結剤」と互換的に使用される。

用語「試料」は、本明細書では、用語「生物学的試料」、「生物学的物質」、「生物学的材料」、「生物学的媒体」、「液体」および「流体」と互換的に使用される。
「試料」は、以下でより詳細に説明するように、容器内に含まれていてもよい。「容器」という用語は、本明細書では、用語「容器（ｖｅｓｓｅｌ）」、「試料容器」、「試験管」、「バイアル」、「ストロー」、「マルチウェルプレート」、「ウェル」、「バッグ」と互換的に使用される。

用語「透過性ハウジング壁」は、本明細書では、用語「分割バリア」、「バリア」「透過性膜」、「膜」、「膜材料」および「膜層」と互換的に使用される。しかしながら、透過性ハウジング壁は、任意の適切な透過性材料または物質で形成されてもよく、「膜」は単に例示的な材料であることが理解される。透過性ハウジング壁または各透過性ハウジング壁は、透過性材料、１つまたは複数の穴を含む材料、スポンジ材料、スポンジ材料を含む材料、ウィッキング材料、フィルタプレート、フィルタ材料、メッシュ材料、透過性膜、親水性フィルタ、親水性膜材料等のうちの任意の１つから形成され得る。

図１ａは、一実施形態による氷核形成を実施するための装置１０の側方からの断面図を示す。この実施形態では、装置１０は、ハウジング部／ハウジング１２（破線で示す）を含む。ハウジング１２は壁１４および壁１８を含み、そしてキャビティ２０を含む。キャビティ２０は、壁１４と壁１６との間に配置されている（または壁１４と壁１６との間に形成されている）。壁１４および１６は、図示したようにハウジング１２を越えて延在してもよい。装置１０は、キャビティ２０内に封入された氷核形成材料（図示しない）を含む。ハウジング１２は、少なくとも１つの縁部１８を含む。壁１４および１６は、キャビティ２０を形成し、かつキャビティ内の氷核形成材料を封入するために縁部１８にて互いに結合されている。

装置１０は、（図４ａおよび図４ｂに示すように）凍結されるべき試料を含有する容器に加えられ得るデバイスである。したがって、壁１４および壁１６の少なくとも一方は、試料中の液体がキャビティ２０内に封入された氷核形成材料と接触することを可能にする透過性ハウジング壁である。実施形態では、壁１４および壁１６の両方が透過性ハウジング壁であり、同じ材料または異なる材料で形成されていてもよい。図１ａに示すように、壁１４および１６は別個の層から形成されてもよく、すなわち、壁１４は第１の層で形成され、壁１６は第２の層で形成されている。第１の層および第２の層は、キャビティ内の氷核形成材料を封入するために、ハウジング１２の少なくとも縁部１８で互いに結合されてもよい。代替的な実施形態（図示しない）では、ハウジング１２は、第１の部分および第２の部分を有する透過性層から形成されてもよく、ハウジング１２の第１の透過性ハウジング壁１４は、透過性材料層の第１の部分から形成され、第２の透過性ハウジング壁１６は、透過性材料層の第２の部分から形成される。すなわち、単一の透過性材料層を折り畳んで、ハウジング１２の壁１４および壁１６を設けることができる。このような構成では、キャビティ２０は、透過性材料層の第１の部分と第２の部分との間に設けられる。透過性材料層の第１の部分および第２の部分は、ハウジング１２の少なくとも縁部１８で互いに結合されて、キャビティ２０内の氷核形成材料を封入し、この構成では、縁部１８がキャビティ２０を取り囲んでいる。

壁１４および１６（または単一の透過性層の第１の部分および第２の部分）を結合するための任意の適切な技術を使用して、キャビティ２０内の氷核形成材料を封入することができる。例えば、壁１４および１６は、縁部１８にて一緒にヒートシールされてもよく、または接着剤または機械的結合技術を用いて結合されてもよい。

図１ａに示す実施形態では、キャビティは、ハウジング１２の壁の１つ、すなわち壁１４を成形することによって形成される。この場合、キャビティ２０は実質的に半球形状を有するが、他の任意の形状を採用することもできる。代替的な実施形態では、図１ｂに示すように、ハウジング壁１４および１６の両方を成形することによってキャビティ２０を形成することができる。図１ｂは、さらなる実施形態による氷核形成を実施するための装置の側方からの断面図を示す。ここでは、装置２０は、ハウジング部／ハウジング２２（破線で示す）を含む。ハウジング２２は、壁２４および壁２６を含み、壁２４と壁２６との間に配置された（または壁２４と壁２６との間に形成された）キャビティ３０を含む。装置２０はキャビティ３０内に封入された氷核形成材料（図示しない）を含む。ハウジング２２は、少なくとも１つの縁部２８を含む。壁２４および２６は、縁部２８にて一緒に結合されてキャビティ３０を形成し、氷核形成材料をキャビティ内に封入する。この実施形態では、壁２４および壁２６の両方が、キャビティ３０を形成するために成形されている。図示されているように、キャビティ３０は、実質的に球形の形状を有することができるが、他の任意の形状が採用されてもよく、壁２４および壁２６の各々は、異なる形状／形態を有していてもよい。

図１ｂの装置２０を形成するために使用される技術および材料は、図１ａの装置１０に関して上で説明したものと同様である。特に、ハウジング壁１４および１６、およびハウジング壁２４および２６の少なくとも一方は、液体（例えば水）に対して透過性である。実施形態では、ハウジング壁１４および１６の両方、ならびにハウジング壁２４および２６の両方は、水／液体に対して透過性である。透過性ハウジング壁は、上記したように、水および空気を透過するが、試料内に存在する生物学的材料に対して透過性でなくてもよく、氷核形成装置内に封入された氷核形成材料に対して透過性でなくてもよい１つまたは複数の孔／穴を有する材料から構成されていてもよい。ハウジング壁のいずれも、透過性材料、１つまたは複数の穴を含む材料、スポンジ材料、スポンジ材料を含む材料、ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）材料、フィルタプレート、透過性膜、親水性フィルタ、および親水性膜材料を含む種々の材料から作製することができる。

透過性ハウジング壁の１つまたは複数の孔の典型的な孔径（例えば直径）は、０．１μｍ〜１０μｍの範囲であり得るが、孔は、凍結されるべき試料中の液体が透過性ハウジング壁を透過できるが、氷核形成材料がキャビティから透過して出ていくことを防止する（またはその可能性を低減する）ことを可能にする任意の適切な直径であってもよい。実施形態では、透過性ハウジング壁または各透過性ハウジング壁は、広範囲の孔サイズを備えて利用可能な標準的な実験用濾紙から構成することができる。

氷核形成装置のキャビティ（例えば、キャビティ２０およびキャビティ３０）は、約１ｍｍ^３のキャビティ容量を有していてもよい。好ましくは、キャビティは、キャビティ内に十分な量の氷核形成材料を封入して、試料内の氷核形成を容易にする、または試料中の氷形成プロセスを最適化するのに適した容積を有する。実施形態では、キャビティ容積は、０．１ｍｍ^３〜１００ｍｍ^３の範囲にある。

氷核形成物質は、グラム陰性菌、シュードモナス・シリンガエ、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀、および長石のようなある範囲の材料からなり、粒子形態を含む任意の物理的形態であり得る。バルク形態であるよりも粒状形態である利点は、バルク形態と比較して粒状形態が比較的高い表面積を含み、そのことにより氷核形成材料の氷核形成活性を増加させることである。好ましくは、試料を凍結するために使用される氷核形成材料は、試料を汚染しないものである。例えば、生物学的試料の凍結を開始するために使用される場合、氷核形成材料は有毒であるべきではなく、過度に酸性若しくはアルカリ性であるべきではなく、または生物学的に活性であるべきではない。

ここで図２を参照すると、これは、さらなる実施形態に従って氷核形成を実施するための装置４０の側方からの断面図を示す。この実施形態では、装置４０はハウジング４４を含む。ハウジング４４（破線で示す）は、ハウジング本体４２の全部または一部、透過性ハウジング壁４８の全部または一部、およびキャビティ４６を含む。キャビティ４６は、ハウジング本体４２と透過性ハウジング壁４８との間に設けられている。装置４０は、（図４ａおよび図４ｂに示すように）凍結されるべき試料を含有する容器に加えられるデバイスである。したがって、透過性ハウジング壁４８は、試料中の液体がキャビティ４６内に封入された氷核形成材料（図示しない）と接触することを可能にする。実施形態では、ハウジング本体４２は、不透過性材料で形成され得るが、特定の実施形態では、ハウジング本体４２は、透過性材料で形成されてもよい。ハウジング本体４２および透過性ハウジング壁４８は、同じ材料から形成されてもよく、同材料は、透過性ハウジング壁４８を形成するべく透過可能となるように適合されてもよい（例えば、同材料内に孔／穴を形成することによって、または他の方法で）。

ハウジング本体４２は、任意の適切な材料、例えば低温に耐えることができるポリマー、から構成することができる。実施形態では、ハウジング本体４２はポリプロピレンで形成されてもよく、その理由は、ポリプロピレンは低温用途に十分に適しており、（例えば、透過性ハウジング壁４８をハウジング本体４２に結合するために）装置４０を製造するために典型的に使用されるヒートシールプロセスと適合しているからである。透過性ハウジング壁４８は、上述したもののような任意の透過性材料から形成することができる。

ハウジング壁４８は、ヒートシールなどの任意の適切な結合技術によって、接着剤を使用して、またはハウジング４４の縁部５０にて機械的固定を使用して、少なくともハウジング４４の縁部５０でハウジング本体４２に結合される。キャビティ４６は、上述したもののような任意の適切な氷核形成材料で充填されてもよい。

図３は、さらなる実施形態に従って氷核形成を実施するための装置６０の側方からの断面図を示す。この実施形態では、装置６０はハウジング６２を含む。ハウジング６２は、ハウジング本体６８と、第１の透過性ハウジング壁６４と、第２の透過性ハウジング壁６６とを含む。ハウジング本体６８は、貫通穴を含むディスクであってもよく、同貫通穴はキャビティ７２を形成する。第１の透過性ハウジング壁６４は、貫通穴を覆って設けられ、ハウジング本体６８の第１の表面に結合され、第２の透過性ハウジング壁６６は、貫通穴を覆って設けられ、キャビティ７２内に氷核形成材料を封入するために、ハウジング本体６８の第２の表面に結合されている。

この実施形態では、ハウジング壁６４および６６は、（図示されるように）別個の材料層から形成されてもよく、またはハウジング本体６８（変形例は図示しない）の周りに巻かれた材料の単一層から形成されてもよい。両方のハウジング壁６４および６６は好ましくは水に対して透過性であるが、実施形態では、ハウジング壁６４および６６の一方は不透過性であってもよい。ハウジング壁６４および６６は、水および空気を透過させるが、試料中に存在する生物学的材料に対して透過性でなくてもよく、かつ上述したように氷核形成物質に対して透過性でない細孔を有する材料で形成されてもよい。（すなわち、氷核形成材料の粉体粒子は、細孔を通過する可能性が低く、流動しにくいクラスターまたは塊に共に結合する傾向がある。生物学的物質は、典型的には、同生物学的材料が装置に直接接触して透過性ハウジング壁を透過することが起こり得ないように、試料容器の底部に堆積されるか、或いは実質的に固定される）。ハウジング壁６４および６６は、それぞれ、ヒートシール技術、接着剤のいずれかによって、ハウジング６２の少なくとも縁部７０にて機械的に固定することによって、ハウジング本体６８の第１の表面および第２の表面に結合されてもよい。縁部７０は、キャビティ７２を取り囲んでいる。氷核形成材料はキャビティ７２内に設けられている。キャビティ７２は、試料内の氷核形成を容易にするために、または試料中の氷形成プロセスを最適化するために、キャビティ内に十分な量の氷核形成物質を封入するのに適した容積を有する。実施形態では、キャビティ容積は、０．１ｍｍ^３〜１００ｍｍ^３の範囲にある。

図４ａは、氷核形成装置８２および容器８４を含むシステム８０を示す。容器８４は、凍結保存容器のような凍結試料を保存するために一般的に使用される容器であり得る。容器８４は、バイアル、ストロー、マルチウェルプレート、およびバッグなどであるがこれらに限定されない、凍結され、後で解凍される試料を保持および保管するための、一般的には任意の適切な容器である。氷核形成装置８２は、例えば、図１ａ、１ｂ、２および３を参照して上述した氷核形成装置のいずれかであってもよい。図示の実施形態では、氷核形成装置は図２の装置４０に類似するが、これはシステムの単なる例示である。容器８４は、蓋８６および本体８８（「本体」または「本体部分」とも呼ばれる）を含む。蓋８６は、キャップ、ストッパ、ねじ山付き蓋、または容器８４を閉鎖／密封するのに適した任意の他の蓋であってもよい。

試料を凍結するために、まず試料が容器８４に入れられる。試料は、細胞またはタンパク質のような生物学的物質を含有する液体であってもよい。（図４ａでは、試料の存在を単に示すために充填ライン８９が示されている）。氷核形成装置８２は、試料の内部にあるように（すなわち、充填ライン８９の下にあるように）容器の本体８８内に配置される。容器８４は冷却機構または装置（図示しない）によって冷却され、典型的には図示されているように容器８４の下方から冷却される。試料中の液体は、既に説明したように、透過性ハウジング壁、または各透過性ハウジング壁を通過することによって、装置８２内に収容された氷核形成材料と接触することができる。氷核形成材料と接触する液体は、氷結晶を形成し、この結晶は、冷却が適用されるときに試料中を伝播して成長し、それによって試料を凍結させる。装置８２は、試料中で凍結し、試料中（および容器８４中）に残る。装置８２は、試料が解凍されたときに試料（および容器８４）から取り出されてもよい。

図４ｂは、図４ａのシステム８０の画像（左）と、氷核形成装置の画像（右）と、を示す（同じ縮尺ではない）。この例では、容器８４はねじ山付き蓋８６を含んでいてもよい。図示されているように、氷核形成装置８２は、好ましくは、氷核形成および凍結の速度を増加させるべく同氷核形成装置８２がシステム８０に冷却を付与する冷却機構に最も近くなるように容器８４の本体８８の底部に挿入される。

図５ａは、容器９６および氷核形成装置９２を含むシステム９０を示す。氷核形成装置９２は、ステム９４（「アーム（ａｒｍ）」または「棒（Ｗａｎｄ）」とも呼ばれる）を備える。容器９６は、蓋９８と本体１００とを備え、図４ａに示され、上述された容器と類似している。氷核形成装置９２は、例えば、図１ａ、１ｂ、２および３を参照して上述した氷核形成装置のいずれかであってもよい。図示された実施形態では、氷核形成装置９２は、図２の装置４０に類似し、ステム９４が加えられたものであるが、これはシステムの単なる例示である。

上述したように、試料を凍結するために、まず試料が容器９６に入れられる。試料は、細胞またはタンパク質のような生物学的物質を含有する液体であってもよい。図５ａでは、試料の存在を単に示すために充填ライン９９が示されている。氷核形成装置９２は、試料の内部にあるように（すなわち、充填ライン９９の下にあるように）容器９６の本体１００内に配置される。容器８４は、図４ａを参照して上述したように、冷却機構または冷却装置によって冷却される。装置９２は、試料中で凍結し、試料中（および容器中９６）に残る。装置９２は、試料が解凍されたときに試料（および容器９６）から取り出されてもよい。図５ａに示す氷核形成装置９２の実施形態の利点は、装置９２のステム９４が、容器９６内の装置９２の位置を制御することを可能にする点にある。この実施形態では、解凍時にステム９４を引っ張ることにより、装置を容易にかつ手動にて取り出すことができる。

図５ｂは、図５ａのシステム９０の画像（左）と、氷核形成装置９２の画像（右）とを示す（同じ縮尺ではない）。この例では、容器９６はねじ山付き蓋９８を含んでいてもよい。図示されているように、氷核形成装置９２は、好ましくは、氷核形成および凍結の速度を増加させるべく同氷核形成装置９２がシステム９０に冷却を付与する冷却機構に最も近くなるように容器９６の本体１００の底部に挿入される。

図６ａは、容器１１６と、容器１１６の蓋１１８に結合されたステム１１４を有する氷核形成装置１１２と、を含むシステム１１０を示す。氷核形成装置１１２は、ステム１１４（「アーム（ａｒｍ）」または「棒（Ｗａｎｄ）」とも呼ばれる）を備える。容器１１６は、蓋１１８と本体１１１とを備え、上述の図４ａおよび図５ａに示された容器と類似している。氷核形成装置１１２は、例えば、図１ａ、１ｂ、２および３を参照して上述した氷核形成装置のいずれかであってもよい。図示された実施形態では、氷核形成装置１１２は、図２の装置４０に類似し、蓋１１８に連結されたステム１１４が加えられたものであるが、これはシステムの単なる例示である。ステム１１４は、容器１１６（「クライオバイアル」または「凍結保存用容器」とも呼ばれる）の蓋１１８（「キャップ」とも称される）の内面に取り付けられる。

図６ａに示される氷核形成装置の実施形態の利点は、蓋１１８に取り付けられたステム１１４が、容器１１６に対する氷核形成装置１１２の位置を、反復可能かつ正確な方法で制御できることである。この改善された制御の結果は、凍結および解凍プロセス後において、一貫した、かつより大きな試料の生存率をもたらす。この実施形態のさらなる利点は、冷却中に最低温度にあることが予想されるクライオバイアル１１６内の同じ位置に装置１１２が保持されることである。これは、バイアル内の氷核形成を最適化し、同時にすべてのバイアルで同じ熱履歴を保証する。解凍時に、キャップ１１８が緩められたときに、デバイス１１２は試料から取り外される。

図６ｂは、図６ａのシステム１１０の画像（左）と、氷核形成装置１１２の画像（右）と、を示す（同じ縮尺ではない）。この例では、容器１１６はねじ山付き蓋１１８を含んでいてもよい。図示されているように、氷核形成装置１１２は、好ましくは、氷核形成および凍結の速度を増加させるべく同氷核形成装置１１２がシステム１００に冷却を付与する冷却機構に最も近くなるように容器１１６の本体１１１の底部に挿入される。

図７ａは、典型的なマルチウェルプレートのウェルの断面図を参照用に示す。図７ｂは、装置がマルチウェルプレートの形態をとる実施形態において、氷核形成装置の部分１３０の断面図を示す。マルチウェルプレート（図示しない）はウェルのアレイを含み、一般的に利用可能なマルチウェルプレートは６、１２、２４、４８、９６、３８４および１５３６のウェルを有する。装置がマルチウェルプレートの形態である実施形態では、装置は複数のウェルおよび複数の一体化ハウジングを備え、一体化ハウジングはウェル内に一体化される。図７ｂは、そのような氷核形成装置の部分１３０（すなわち、ウェル）を示す。図７ｂにおいて、ウェル１３０は本体１３２を備え、本体１３２は氷核形成材料を封入するためのキャビティ１３４を含む。本体１３２は、ウェル１３０の基部に底壁１３６を備える。ウェル１３２の底壁１３６の一部分内に配置された凹部は、キャビティ１３４を形成する。凹部は、底壁１３６の内面にある。透過性ハウジング壁１３８は、キャビティ１３４の上に配置され、キャビティ１３４を囲む底壁の縁部１４０で結合されている。キャビティ１３４および氷核形成材料を底壁１３６に有する利点は、ウェル１３２内の試料の最も冷たい部分および冷却機構（これはしばしばウェル１３２の下にある）に近接して配置される点にある。

透過性ハウジング壁１３８を底壁１４０の縁部に結合するプロセスは、上述した結合プロセスと同様であり、例えば、ヒートシール、接着剤および／または機械的結合が挙げられる。

実施形態では、凍結剤は、単一部品（例えばマルチウェルプレート）に成形された複数のチャンバ（例えばウェル）に添加され、その後、多孔質膜で適所に封止される。各チャンバは、マルチウェルプレート上の単一ウェルの底部に近接して配置され、付着細胞の一貫して低い過冷却を伴う高スループット凍結保存を可能にする。

図７ｃおよび図７ｄは、装置がマルチウェルプレートの形態をとる更なる実施形態における氷核形成装置の部分１５０の断面図を示す。部分１５０は、氷核形成材料を封入するためのウェル１５２およびキャビティ１５４を含む。図７ｃにおいて、キャビティ１５４は、ウェル１５２の内側側壁に沿って（全部または一部）形成される。キャビティ１５４は、ウェル１５２の内側側壁（の全部または一部）と透過性ハウジング壁１５８との間に形成される。透過性ハウジング壁は、結合点１６０でウェル１５２の内側側壁に結合されてもよい。

図７ｄにおいて、部分１５０は、氷核形成材料を封入するためのウェル１５２およびキャビティ１５４を含む。キャビティ１５４は、少なくとも２つの方法で形成することができる。例えば、ウェル１５２の側壁１５２の凹部がキャビティ１５４を形成していてもよい。凹部１５４は、側壁１５２の内面にある。透過性ハウジング壁１５８は、キャビティ１５４を覆って配置され、側壁１５２の縁部１６０であってキャビティ１５４を包囲する縁部１６０にて少なくとも結合されている。別の例では、キャビティ１５４は、リップ１５６と底壁１５７の一部との間に形成されてもよい。この例では、部分１５０は、図示されるように、部分的にウェル１５２内に延びるリップ１５６を有する。ウェル１５２は、少なくとも１つの側壁１５２と底壁１５７とを含む。底壁１５７は段部１５９を有する。キャビティ１５４は、段部１５９とリップ１５６との間に形成される。透過性ハウジング壁１５８は、キャビティ１５４を覆って設けられ、位置１６０において、段部１５９およびリップ１５６の表面に結合される。

図７ｄの実施形態は、図７ｃの実施形態よりも好ましい。その理由は、図７ｄの実施形態におけるウェル１５２の構造が、図７ｃの実施形態の場合よりも、透過性ハウジング壁１５８がより効率的におよび／またはより確実に、そして、より大きな表面積にて結合されることを可能にするからである。

図８ａは、装置がマルチウェルプレートのための挿入プレートを含む実施形態における氷核形成装置の部分１７０の側面からの断面図を示す。図９ａは、マルチウェルプレート（図示しない）用の挿入プレート１９２を含む氷核形成装置１９０の斜視図と、氷核形成装置１９０の断面の拡大図とを示す。図９ｂは、図９ａの氷核形成装置の底面の斜視図を示す。

図９ａおよび図９ｂに示す氷核形成装置１９０は、穴１９８のアレイを備える。アレイにおける穴１９８の数および穴の配置は、氷核形成装置１９０がマルチウェルプレートと共に使用されるときに、穴１９８がマルチウェルプレートのウェルと位置合わせされるように、マルチウェルプレートにおけるウェルの数および配置に一致／適合するように変更することができる。例えば、マルチウェルプレートはウェルのＮ個×Ｍ個アレイを含むことができ、氷核形成装置１９０は、同装置１９０がマルチウェルプレートと適合するように、穴のＮ個×Ｍ個アレイを含むことができる。氷核形成装置１９０は、任意のサイズおよびタイプの一般的に利用可能なマルチウェルプレート、例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、および１５３６ウェルを有するマルチウェルプレートに適合するように製造され得る。従って、有利には、氷核形成装置１９０は、市販のマルチウェルプレートと互換性があり、マルチウェルプレートを適合させる必要はない。実施形態では、氷核形成装置１９０は、マルチウェルプレートにスナップ嵌めして、マルチウェルプレートに装置１９０を固定させてもよい。付随的または代替的に、氷核形成はマルチウェルプレート上に位置していてもよく、および／または任意の適切な技術を用いてマルチウェルプレートに固定してもよい。

装置１９０は、複数の足部（ｆｅｅｔ）および複数の脚部（ｌｅｇｓ）を備える。複数の脚部の脚部１９６は、第１の端部（または近位端部）において、穴１９８に近接して挿入プレート１９２に結合される。各脚部１９６は、同各脚部１９６が挿入プレート１９２の同じ側に位置決めされるように挿入プレート１９２の表面からほぼ垂直に延びている。各脚部１９６は、第２の端部（または遠位端部）において、複数の足部の足部１９４に結合されている。足部１９４は、キャビティと少なくとも１つの透過性ハウジング壁とを有するハウジングを含む。氷核形成材料はキャビティ内に封入される。複数の脚部の各脚部１９６の長さは、装置１９０がマルチウェルプレートに結合されたときに各足部１９４がウェル内の実質的に同一の深さに配置されるように、実質的に同一である。これにより、氷核形成材料を、マルチウェルプレートの各ウェル内の同じ位置に提供することができ、氷形成の一貫性および改善された制御が可能となる。脚部１９６の長さは、各足部１９４がウェルの底部からある量だけ分離されるように、マルチウェルプレートのウェルの長さ（または深さ）よりも短くてもよい。各足部１９４とウェルの底部との間の分離は、以下により詳細に記載されるように、試料が透過性ハウジング壁を透過し、氷核形成材料に接触することを可能にする。

装置１９０の穴１９８は、装置１９０がマルチウェルプレートに結合されると、試料をマルチウェルプレートに加えることを可能にする。実施形態では、試料をマルチウェルプレートのウェルに添加した後、装置１９０をマルチウェルプレートに結合することができる。

装置１９０の一部（挿入プレート１９２、脚部１９６および足部１９８など）は、単一の材料片から作製することができる。実施形態では、装置１９０の一部は、生体材料を収容し、凍結保存／凍結乾燥に使用するのに適したポリマーまたは任意の材料から形成することができる。装置１９０の部品を製造するために、射出成形および３Ｄ印刷などの技術を使用することができる。装置１９０のいくつかの部品は、以下の図８ｃおよび８ｄに関して説明したプロセスを使用して製造することができる。

図８ａに戻ると、図９ａおよび図９ｂに示される氷核形成装置がより詳細に記載されている。図８ａは、挿入プレートと、複数の脚部と、複数の脚部とを含む氷核形成装置（例えば、図９ａに示す装置１９０）の部分１７０を示す。部分１７０は、第１の端部で挿入プレート（図示しない）に結合された脚部１７１を有し、第２の端部で足部１７８に結合する。足部１７８はハウジング１７２を含む。ハウジング１７２は、キャビティ１８２と、第１のハウジング壁１７４と、第２のハウジング壁１７６と、を含む。キャビティ１８２は、第１のキャビティ開口部が足部１７８の上面に設けられ、第２のキャビティ開口部が足部１７８の底面に設けられるように、足部１７８の断面を貫通して延びていてもよい。第１のキャビティ開口部および第２のキャビティ開口部は、第１のハウジング壁１７４および第２のハウジング壁１７６によってそれぞれ覆われている。第１のハウジング壁１７４および第２のハウジング壁１７６の一方または両方は、透過性ハウジング壁であってもよい。好ましくは、第１のハウジング壁１７４および第２のハウジング壁１７６の両方が、透過性ハウジング壁である。これにより、キャビティ１８２内に封入された氷核形成材料と接触することができる液体の量が増大し、氷核形成による氷結晶形成の速度または効率が増加し得る。

ハウジング１７２は、足部１７８の表面から突出し、第１のキャビティ開口部および第２のキャビティ開口部に近接して（および、実施形態においては、周囲に）配置されたシーリングリップ１８０および１８８を備える。シーリングリップ１８０および１８８は、好ましくは、足部１７８を形成するために使用される材料と同じ材料で形成される。好ましい実施形態では、足部１７８およびシーリングリップ１８０、１８８は、ヒートシールプロセスにおける使用に適したポリマー材料から形成される。以下でより詳細に説明するように、ハウジング壁１７４および１７６は、好ましくはヒートシールプロセスを介して、キャビティ１８２内の氷核形成材料を封入するために足部１７８に結合される。シーリングリップ１８０、１８８は、足部１７８の犠牲部分であり、ヒートシールプロセスにおいて溶融して、ハウジング壁１７４、１７６を足部１７８／ハウジング１７２に結合する。シーリングリップ１８０、１８８を溶融することによって、壁１７４、１７６とハウジング１７２／足部１７８との間の結合が改善される。ハウジング１７２は、試料中の液体がハウジング壁１７６を通って透過するときに、氷核形成材料内の空気をハウジング１７２から逃がすことを可能にする換気口１８４を含む（それにより、キャビティ１８２内における圧力増加が回避される）。

各ハウジング壁１７４および１７６は、別個の材料片で形成される。実施形態では、各ハウジング壁１７４、１７６は、透過性材料の別個の片から形成される。別個の材料片は、同じ種類の材料であってもよく、異なる種類の材料であってもよい。各ハウジング壁１７４および１７６は、各ハウジング壁１７４および１７６を足部１７８に結合するために使用されるシールリップ１８０または１８８と接触している。

図８ｂは、マルチウェルプレート（図示しない）のウェル１８６内の図８ａの氷核形成装置の部分１７０の断面図を示す。試料を凍結するために、氷核形成装置の挿入プレートはマルチウェルプレートに結合されて、装置の各脚部がマルチウェルプレートのウェルに挿入される。試料は、挿入プレートの穴を通してウェルに添加することができる（図９ａ参照）。試料は、細胞またはタンパク質などの生物学的物質を含有する液体であってもよい。図８ｂは、試料の存在を単に示すために充填ライン１７９を示す。ウェルに添加される試料の量は、試料が少なくとも下部透過性ハウジング壁１７６と接触するが、好ましくは上部透過性ハウジング壁１７４とも接触するようなものである必要があり得る。

図８ａのハウジング１７２内に氷核形成材料を封入するために、以下の製造工程が行われてもよい。まず、第１のハウジング壁１７４をハウジング１７２に結合して、キャビティ１８２の第１の開口部をシールする。上述したように、ヒートシール技術を用いて第１のハウジング壁１７４をハウジング１７２に結合し、その間にリップ１８０は第１のハウジング壁１７４を定位置に固定するために溶融される。次いで、氷核形成装置を逆さまにして（すなわち、足部が上を向くようにして）、キャビティの第２の開口部を通って氷核形成材料をキャビティ１８２に加えることができるようにする。第２のハウジング壁１７６は、キャビティ１８２の第２の開口部をシールするために、ハウジング１７２／足部１７８に結合される。ヒートシール技術を使用して、第２のハウジング壁１７６をハウジング１７２に結合することができ、その間にリップ１８８が溶融されて第２のハウジング壁１７６を定位置に固定する。

図８ｃは、図８ａの氷核形成装置のハウジング内に氷核形成材料を封入するステップを示す概略図である。図８ｃに示されるハウジングは、図８ａに示されるハウジングからわずかに変更されている。具体的には、第１のハウジング壁は、図８ａの実施形態に対して図８ｃの実施形態では異なる場所に配置されている。図８ｃの実施形態では、第１のハウジング壁１８０’は、足部１７８の外面ではなく、足部１７８内に配置されている。シールリップ１７４’は、（図８ａによるような）足部１７８の外面ではなく足部１７８内に配置されている。これは、氷核形成材料を封入するキャビティ１８２’が足部１７８を通って延びていないためである（第１のキャビティ開口部は、足部１７８の上面に設けられるのではなく、換気口１８４上に開口し、一方、第２のキャビティ開口部は足部１７８の底面に設けられている）。図８ｃの構成の利点は、キャビティ１８２’を氷核形成材料で充填するために、第１のハウジング壁１８０’をハウジング１７２に結合した後に装置を回す（回転させる）必要がないので、キャビティ１８２’内に氷核形成材料を封入するための単純化されたプロセスになるという点である。

したがって、図８ｃの実施形態では、氷核形成材料をハウジング１７２’内に封入するために、以下の製造ステップに従うことができる。第１に、第１のハウジング壁１７４’は、キャビティ１８２’の第１の開口部をシールするためにハウジング１７２に結合される。上述したように、第１のハウジング壁１７４をハウジング１７２に結合するためにヒートシール技術を使用することができ、その間に第１のハウジング壁１７４’を所定の位置に固定するためにリップ１８０’が溶融される。氷核形成材料は、（装置を回す必要なしに）キャビティの第２の開口部を通ってキャビティ１８２’内に加えることができる。第２のハウジング壁１７６は、キャビティ１８２の第２の開口部をシールするために、ハウジング１７２／足部１７８に結合される。ヒートシール技術を使用して、第２のハウジング壁１７６をハウジング１７２に結合することができ、その間に第２のハウジング壁１７６を定位置に固定するためにリップ１８８が溶融される。図８ｃに示すように足部１７８の内側にハウジング壁１７４’を有する利点は、氷核形成材料を封入するステップ中に装置を回転させる必要がなく、製造の容易さと効率を改善することができる（そして、処理ステップを低減できる）点にある。

図８ｄは、氷核形成装置の一実施形態における氷核形成材料を封入するための例示的なステップを示す概略図である。最初に、挿入プレートが図８ｄに示すように、装置の複数の足部が上向きになる状態にてアライメントジグ２００上に配置されるように装置１９０が配向される。次いで、装置１９０はアライメントジグ２００上に配置される。アライメントジグ２００は、ペグ（ｐｅｇ）２０２のアレイと、１つまたは複数のアライメントピン２０４と、を備える。装置は、図示された結合方向にて、アライメントピン２０４とともに／アライメントピン２０４に対して挿入プレートを位置合わせし、そしてジグ２００のペグ２０２を装置１９０の挿入プレートの穴と位置合わせすることによって、ジグ上に差し込まれる。アライメントピン１９４を使用して装置１９０をジグ１９２に位置合わせするとともに、装置１９０の組み立てに使用される他の部品を位置合わせすることができる。次に、第１のハウジング壁前駆体２０６が装置１９０上に配置され、ハウジング壁前駆体２０６内の１つまたは複数の穴２０８を使用してジグ２００と位置合わせされ、ここで、位置合わせされたときに穴２０８または各穴２０８をアライメントジグ２００の各ピン２０４とかみ合わせる。第１のハウジング壁前駆体２０６は、ハウジング壁材料のシートを含む。第１のハウジング壁前駆体２０６は貫通孔２１８を含む。装置１９０に熱を付与して第１のハウジング壁材料と接触しているシーリングリップを溶融させるべくヒートシールツール（図示しない）を使用し、それによりハウジング壁材料をハウジングと結合する。ハウジング壁材料が装置１９０の各足部にヒートシールされると、ハウジング材料を装置１９０から引きはがすことによって（貫通孔２１８によって容易にできる）、余分な未使用のハウジング材料が装置１９０から除去される。

粉体マスク２１０を装置１９０の頂部に置き、アライメントジグ２００のピン２０４と、または各ピン２０４と、かみ合うことができる１つまたは複数の穴２１２を使用して位置合わせさせる。次いで、粉体マスク２１０の穴２１３を介して氷核形成材料を散布することによって、氷核形成材料が装置１９０の各足部にあるキャビティ内に加えられる。粉体マスク２１０は装置１９０から除去される。実施形態において、氷核形成材料の密度は、バルク形態で約２．６ｇｃｍ^−３、粉体形態で約１．０ｇｃｍ^−３であってもよい。

第２の透過性ハウジング壁前駆体２１４が、装置１９０上に配置され、上述のヒートシールを使用して装置１９０にシールされる。第２の透過性ハウジング壁前駆体２１４は、ヒートシールプロセス後に前駆体２１４の未使用部分が容易に除去できるように穿孔２１６を含む。過剰な膜材料は、装置１９０に密封された後に除去される。

先に述べたように、透過性ハウジング壁または各透過性ハウジング壁は、以下の機能および特性の一部または全部を有することが好ましい：即ち、キャビティ内に氷核形成材料を保持すること、キャビティから空気を逃がすこと（そしてキャビティ内の圧力の増加を回避すること）、および流体試料がハウジング壁を通過して氷核形成材料と接触することを可能にすること。

透過性ハウジング壁は、氷核形成材料の粒子サイズに近い適切な孔サイズを有していてもよい。典型的には、０．１μｍ〜１０μｍの孔サイズ（直径）が適している。実施形態によっては、孔サイズは、氷核形成材料の粒子サイズより大きくてもよいが、氷核形成材料が粉体の形態であるとき、粒子は互いに結合し、流動しない傾向がある。氷核形成材料が濡れると、多くの場合、同氷核形成材料ば流動することを嫌う。従って、氷核形成材料が孔を通ってキャビティから逃げる可能性が減少する。

好ましくは、透過性ハウジング壁は、水を吸収し、流体試料が透過することを可能にする親水性材料から形成され、同流体が氷核形成材料と係合／接触することができる。標準的な実験室用の濾紙は、透過性ハウジング壁を提供するのに適した材料であり、広範囲の孔サイズで利用可能である。標準的な実験室用の濾紙は、通常、繊維状セルロース材料から製造される。

透過性ハウジング壁の繊維は、特にハウジングがポリマー材料で形成されている場合、ヒートシールプロセス中にハウジングと結合することができる。
第１のハウジング壁前駆体および第２のハウジング壁前駆体（挿入プレートの足部に氷核形成材料を封入するために使用される）は、好ましくは、複数のハウジング壁セグメントを含むシート材料であり、同セグメントは正しい位置に配置され、同セグメントが打ち抜かれ、レーザ切断され、そうでなければシートから除去されて足部に適用されることを可能にするサイズを有する。有利なことに、これにより、複数の足部の第１のハウジング壁を、単一の製造ステップで各足部に結合することが可能になる（そして、各足部の第２のハウジング壁に対しても同様に）。ハウジング壁セグメントは、ヒートシールされる前にハウジング壁セグメントを各足部に位置合わせさせるのに役立つ特定のパターンの穿孔によって取り囲まれてもよい。

図１０は、（ａ）氷核形成材料を含まない複数の別個の試料、および（ｂ）氷核形成材料を含む複数の別個の試料についての溶液の温度対時間を示すグラフである。（ａ）に見られるように、試料の温度における自然発生的なスパイク（ｓｐｉｋｅ）は変化する時間にて生じ、同スパイクは、典型的には１０〜１５℃のオーダーである。このような試料の温度における急激な移行は、凍結および解凍後の試料の生存率を低くすることが知られている。

（ｂ）と表示されたトレースは、本発明の氷核形成装置を用いて達成された結果を表す。図からわかるように、冷却段階中に観察された温度のスパイクの振幅は、氷核形成装置が使用されない場合に比べて低い。これは、氷核形成を誘導するために氷核形成装置を使用するときに、試料生存率がなぜ向上するかを説明している。

製造後、上記の実施形態のいずれかの氷核形成装置は、密閉された適切な容器に包装される。特に装置が生物学的材料を凍結するために使用されることがあるため、包装全体および氷核形成装置は滅菌される（そして滅菌によって汚染を防止する）。ガンマ滅菌が好ましい。その理由は一度に大量の製品の滅菌に適しているからである。氷核形成材料が長石材料である実施形態では、長石がガンマ滅菌によって悪影響を受けないので、ガンマ滅菌が適している。

氷核形成装置の有効性を最大にするためには、適切な凍結、解凍および回収プロセスが必要である。
生物学的試料では、凍結プロセス中に細胞を保護するためにＤＭＳＯまたはグリセロールなどの凍結保護剤がしばしば使用される。凍結保護剤は、典型的には凍結される試料の５％を構成するであろう。

試料を含有する容器（例えば、容器、バイアル、またはウェル）内で、氷核形成材料を依然としてカバーしながら、可能な最小容量を使用することが推奨される。例えば、９６ウェルプレートでは、１つのウェルの体積は４００マイクロリットルであるが、試料を氷核形成装置に接触させ、氷核形成材料を実質的に飽和させる（すなわち、装置のキャビティを氷核形成材料および試料からの流体で実質的に満たす）ためには、例えば７０マイクロリットルを充填することが必要とされる。氷核形成材料を試料からの流体によって実質的に飽和させることを可能にする任意の充填容積を使用することができ、これは一般的に言うとウェルの容積よりも小さいことは理解されるであろう。

凍結および解凍プロセスの後、凍結保護剤は軽度の毒性作用を有するので、生物学的試料は多くの場合「洗浄」される。凍結保護剤は希釈して除去される。凍結前に可能な限り小さな容量で容器を充填することにより、毒性の凍結保護剤は、試料に対して高い比率の水を用いて迅速に希釈することができる。次いで、希釈された液体は除去され、そして、必要に応じてこの「希釈および除去」のステップが繰り返される。

生物学的試料が容器（例えば、バイアルまたはマルチウェルプレートのウェル）に添加されると、氷核形成装置を加えることができる。同氷核形成装置は、凍結プロセス中および凍結プロセス後には適所にとどまる。同氷核形成装置は、数日または数年後であり得る解凍の後にのみ除去されかつ廃棄される。実施形態では、氷核形成デバイスは、単回使用のデバイスである。

氷核形成デバイスは、アシンプトートリミテッド（Ａｓｙｍｐｔｏｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）が製造する「ＶＩＡ Ｆｒｅｅｚｅ（登録商標）」装置で最も効果的に機能する。従来の凍結装置は試料上に冷たいガスを吹き込み、外側の試料をより速く冷却させる。ＶＩＡ Ｆｒｅｅｚｅ（登録商標）システムは、試料の下面の伝導によって冷却し、すべての試料は同じ冷却プロファイルを経験する。

ＶＩＡ Ｆｒｅｅｚｅシステム内でプログラムされた凍結プロトコルは、氷核形成装置の有効性を最大にするためにいくつかの特徴を有する：
・融解潜熱からのエネルギー放出を吸収するために、理論凝固点より数度低い保持時間。例えば、理論凝固点が−３℃の場合、−１０℃で８分間の保持期間が凍結プログラムに含まれることがある。

・凍結移行を超える冷却速度は重要であり、凍結される試料の性質に依存する。これは、たとえば、一部の細胞では０．３℃／分であり、他のものでは２℃／分である。凍結後の冷却速度が過度に速いか遅い場合、試料を安全に凍結保存するためには氷核形成の制御が重要であるが、試料はまだ壊れている可能性がある。

・例えば−８０℃または−１００℃に一度凍結すると、試料はＶＩＡ Ｆｒｅｅｚｅシステムから取り出して長期間冷凍保存することができる。
試料は、好ましくは、生物学的試料を保護するのに十分な速度で解凍する。典型的には、凍結試料は１０分以内に完全に解凍されるべきである。

本発明のさらなる実施形態は、以下の番号が付与された項に記載されている。
１．容器内に収容された氷を核形成する材料を含有するデバイスであって、容器のいくつかの壁は水に対して透過性である。デバイス内の氷核剤は、細胞を取り囲む溶液と接触しているが、生物学的材料が粒子で汚染されることを回避する。

２．氷核形成材料が、細菌シュードモナス・シリンガエ、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀および長石を任意の物理的形態で含むが、これに限定されない、項１に記載のデバイス。

３．核形成剤が、限定されるものではないが、試料溶液内の生物学的培地（ｍｅｄｉａ）を汚染することなく、
ａ．その中に穴を有する分割バリア
ｂ．その中に一連の穴を有する分割バリア
ｃ．ウィッキング材料またはスポンジ材料から全体的または部分的に作製される分割バリア
ｄ．フィルタまたは膜材料から全体的にまたは部分的に作製される分割バリア
ｅ．親水性フィルタまたは膜材料から全体的にまたは部分的に作製される分割バリア、によって試料溶液と接触して保持される項１に記載のデバイス。

４．凍結剤が恒久的に試料容器の一部である項１に記載のデバイス。
５．凍結剤を試料容器から分離することができる項１に記載のデバイス。
６．試料容器が試験管、バイアル、ストロー、マルチウェルプレートまたはバッグであり得る、項１に記載のデバイス。

７．複数の独立した用量の凍結剤を１つの部分のように扱い、複数の試料を並行して、例えば、９６マルチウェルプレートにて処理することができる項１に記載のデバイス。
８．試料の最も冷却している部分の近くに氷核剤が保持される項７に記載のデバイス。

９．一実施形態では、凍結剤は粉体であり、同粉体は、同粉末を捕捉しながら液体および気体の交換を可能にする膜材料を組み込んだチャンバ内に保持されている。
１０．チャンバが試料容器とは別個の部分であり、取り出すことができる上記した項に記載されたデバイス。

１１．複数の用量の凍結剤が１つの部分で連結され、並行して複数の試料と共に使用され得る、上記した項に記載のデバイス。
上述の記載は、最良の態様であると考えられるもの、および本技術を実施するための他の適切な態様を記載しているが、本技術は、好ましい実施形態のこの記載に開示された特定の構成および方法に限定されるべきではないことを当業者であれば理解するであろう。当業者であれば、本技術は広範囲の用途を有し、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の概念から逸脱することなく実施形態が広範囲の変更をとることができることを認識するであろう。

Claims (6)

1. 氷核形成を実施するための装置であって、前記装置はマルチウェルプレートを含み、前記マルチウェルプレートは、
   複数のウェルと、
   複数の一体化ハウジングと、
   を含み、前記複数の一体化ハウジングのうちの１つの一体化ハウジングは複数のウェルのうちの１つのウェルに一体化され、
   前記一体化ハウジングは、
   一体化ハウジング壁と、
   一体化透過性ハウジング壁と、
   前記一体化ハウジング壁と前記一体化透過性ハウジング壁との間の一体化キャビティと、
   を含み、氷核形成材料が前記一体化キャビティ内に封入されている、装置。
2. 前記一体化ハウジング壁は、前記ウェルの側壁の少なくとも一部から形成されている請求項１に記載の装置。
3. 前記一体化ハウジング壁は、前記ウェルの少なくとも底壁から形成されている請求項１に記載の装置。
4. 前記ウェルの底壁は内面に一体化キャビティを形成する凹部を含み、前記一体化透過性ハウジング壁は前記凹部を覆って設けられるとともに前記一体化キャビティ内に氷核形成材料を封入するべく前記底壁の前記内面に結合されている請求項３に記載の装置。
5. 前記一体化透過性ハウジング壁は、透過性材料、１つまたは複数の穴を含む材料、スポンジ材料、スポンジ材料を含む材料、ウィッキング材料、フィルタプレート、フィルタ材料、メッシュ材料、透過性膜、親水性フィルタおよび親水性膜材料のうちのいずれか１つから形成される請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
6. 前記氷核形成材料は、グラム陰性菌、シュードモナス・シリンガエ、結晶コレステロール、封入されたヨウ化銀、および長石のうちのいずれか１つである請求項１乃至５のいずれか一項に記載の装置。