JP6779785B2 - ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用 - Google Patents

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Description

本出願は、２０１３年１２月１９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０８９９７９号、２０１４年７月２１日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２６１０号および２０１４年１１月６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５０９号に基づく優先権を主張し、これらの出願の各々の全内容を引用により本明細書に包含させる。
発明の分野
本発明は、一般に、メソテリンの発現と関係する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作されたＴ細胞に関する。
発明の背景
メソテリンは、元々Pastanらにより、正常組織では発現が限られており、腫瘍上で過発現するために、腫瘍関連抗原として同定された。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186およびChang K, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(1):136-140。メソテリン遺伝子は前駆体７１kDaタンパク質をコードし、後者が処理されて、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合により細胞膜に固定される４０kDaタンパク質であるメソテリンおよび巨核球増強因子(ＭＰＦ)と呼ばれるアミノ末端３１kDa脱落フラグメントを生じる。いずれのフラグメントもＮ−グリコシル化部位を含む。“可溶性メソテリン／ＭＰＦ関連”と呼ばれる４０kDaカルボキシル末端フラグメントの可溶性スプライスバリアントが膵管腺癌(ＰＤＡ)患者の血清で発見されている。Johnston, F, et al. Clinical Cancer Research. 2009;15(21):6511。メソテリンは、治療標的ならびに疾患活動性および治療応答のバイオマーカーの両者として現在研究されている。Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868。
メソテリンは、正常組織上にも存在する分化抗原である。Pastanのグループにより開発されたマウス抗ヒトメソテリン抗体Ｋ１を使用して、悪性組織で通常見られるより低いレベルであるが、強いＫ１反応性が腹腔、胸膜腔および囲心腔を覆う中皮細胞内で検出されている。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186。弱いＫ１反応性がファロピウス管上皮、気管基底上皮および扁桃上皮内で検出されている。メソテリンはまた角膜の全ての層でも発見されている。Jirsova K, et al. Experimental eye research. 2010;91(5):623-629。しかしながら、Ｋ１反応性は、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、リンパ節、胸腺、心筋、舌、骨格筋、皮膚、脳皮質、小脳、脊髄、末梢神経、下垂体、副腎、唾液腺、乳腺、甲状腺、副甲状腺、精巣、前立腺、精巣上体、子宮頸部上皮、肺実質、食道、小腸上皮、結腸上皮、膀胱上皮、胆嚢上皮を含む正常組織の大部分で検出されていない。Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186。
メソテリンは原発性膵臓腺癌の大部分で過発現しており、良性膵臓組織での発現は稀であり、かつ弱い。Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868。上皮性悪性胸膜中皮腫(ＭＰＭ)は、例外なくメソテリンを発現するが、肉腫様ＭＰＭはメソテリンを発現しない。大部分の漿液性上皮性卵巣癌および関連する原発性腹膜癌はメソテリンを発現する。
メソテリンは、卵巣癌における自然免疫応答の標的であり、癌免疫療法の標的として提案されている。Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(2 Pt 1):644-653; Moschella F, et al. Cancer Res. 2011;71(10):3528-3539; Gross G, et al. FASEB J. 1992;6(15):3370-3378; Sadelain M, et al. NatRevCancer. 2003;3(1):35-45; Muul LM, et al. Blood. 2003;101(7):2563-2569; Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(25):16168-16173。膵臓癌を有する患者におけるメソテリン特異的ＣＴＬの存在は、全体的生存と相関する。Thomas AM, et al. J Exp Med. 2004;200:297-306。さらに、Pastanおよび共同研究者は、メソテリン陽性腫瘍を有する癌患者の処置のために、免疫毒素に接合した抗メソテリン抗体の可溶性抗体フラグメントを使用した。この試みは、膵臓癌における十分な安全性とある程度の臨床活性を示した。Hassan R, et al. Cancer Immun. 2007;7:20 and Hassan R, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(17):5144-5149。卵巣癌において、この治療戦略は、RECIST基準で一名の患者でやや有効(minor response)および二番目の患者で安定(stable disease)の結果と腹水の完全な消失も生じた。
Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186 Chang K, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(1):136-140 Johnston, F, et al. Clinical Cancer Research. 2009;15(21):6511 Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868 Jirsova K, et al. Experimental eye research. 2010;91(5):623-629 Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(2 Pt 1):644-653 Moschella F, et al. Cancer Res. 2011;71(10):3528-3539 Gross G, et al. FASEB J. 1992;6(15):3370-3378 Sadelain M, et al. NatRevCancer. 2003;3(1):35-45 Muul LM, et al. Blood. 2003;101(7):2563-2569 Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(25):16168-16173 Thomas AM, et al. J Exp Med. 2004;200:297-306 Hassan R, et al. Cancer Immun. 2007;7:20 Hassan R, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(17):5144-5149
発明の要約
本発明は、例えば、メソテリンを特異的に標的とする抗体(例えば、ｓｃＦｖ)を含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された免疫エフェクター細胞を投与することによる、患者における免疫応答を提供する方法に係る。特に、本発明は、メソテリン(またはＭＳＬＮ)の発現と関係する癌を処置するための、抗体、例えばその抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを発現するように操作した、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のような免疫エフェクター細胞の使用に関する。特に、本発明は、例えば、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫、肺癌(例えば、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌)、膵臓癌(例えば、膵管腺癌、転移性膵臓癌)、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせのようなメソテリン発現癌を有する患者に特に適し得る養子細胞移入に関する。
したがって、一つの面において、本発明は、抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ヒト抗メソテリン結合ドメイン)、膜貫通型ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関する。一つの態様において、コードされる抗メソテリン結合ドメインは、ここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)ならびにここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)を含む。一つの態様において、コードされるヒト抗メソテリン結合ドメインは、ここに(例えば、表２、４または５に)記載する軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表２、４または５に)記載する重鎖可変領域を含むまたはこれらからなる。一つの態様において、コードされる抗メソテリン結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むか、またはこれからなるｓｃＦｖである。ある態様において、抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ｓｃＦＶ)は、表２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる重鎖可変領域を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、単離核酸は、さらに、膜貫通型ドメイン、例えば、ここに記載する膜貫通型ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、コードされる膜貫通型ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメインを含むか、またはこれからなる。一つの態様において、コードされる膜貫通型ドメインは、配列番号１２の配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、膜貫通型ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号１２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、コードされるＣＡＲは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域により膜貫通型ドメインに接続した抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを含む。一つの態様において、ヒンジ領域は、配列番号６または配列番号８を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質から得た機能的シグナル伝達ドメインである。一つの態様において、コードされる共刺激ドメインは、配列番号１４の配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、共刺激ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号１４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、単離核酸は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、単離核酸は、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインをコードする。一つの態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９または配列番号１０の配列を含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含むか、またはこれからなり、ここで、該細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
他の面において、本発明は、例えば、配列番号１のリーダー配列；例えば、表２のアミノ酸配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を有するここに記載する抗メソテリン結合ドメイン；例えば、配列番号２のヒンジ領域；例えば、配列番号６の配列を有する膜貫通型ドメイン；共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン；および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９または１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。一つの態様において、単離核酸分子は、表２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む(例えば、これからなる)。一つの態様において、単離核酸分子は、表２のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を有するポリペプチドをコードする核酸を含む(例えば、これからなる)。
他の面において、本発明は、核酸配列、例えば、ここに記載する核酸によりコードされる単離ポリペプチド分子に関する。
他の面において、本発明は、表２からなる群から選択される配列、表２に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる単離ポリペプチド分子に関する。一つの態様において、単離ポリペプチドは、ここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)ならびにここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)を含む。
他の面において、本発明は、ここに記載する抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子に関する。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号２７９を含む配列を含む抗原結合ドメインとヒトメソテリンへの結合について競合しない。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号４３または配列番号４９から選択される抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３ならびに配列番号４３または配列番号４９から選択される抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインとヒトメソテリンへの結合について競合する。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号４３または配列番号４９を含む抗原結合ドメインとヒトメソテリンへの結合について競合する。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号２７９を含む配列を含む抗原結合ドメインにより標的とされるヒトメソテリンのエピトープと異なるヒトメソテリンのエピトープに結合する。ある態様において、エピトープは、配列番号２７８のアミノ酸３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９および３６９〜３７５から選択されるアミノ酸の配列またはこれらの任意の組み合わせを含む。ある態様において、エピトープは、配列番号２７８のアミノ酸３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９および３６９〜３７５またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上のアミノ酸を含む。
ある態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインは、配列番号２７８に示すメソテリンのＮ末端に結合しない。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ヒトメソテリンのＣ末端に結合する。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号２７８のアミノ酸４５０〜５８８内のエピトープと結合する。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインにより結合されるエピトープは、配列番号２７８のアミノ酸４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７および５４５〜５７２から選択される配列またはこれらの組み合わせを含む。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインにより結合されるエピトープは、配列番号２７８のアミノ酸４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７および５４５〜５７２またはこれらの任意の組み合わせから選択される１個以上のアミノ酸を含む。これらの態様において、配列番号２７８は、ヒトメソテリンのアミノ酸２９６〜５８８を表し、例えば、配列番号２７８の最初のアミノ酸はアミノ酸２９６であり、配列番号２７８の最後のアミノ酸はアミノ酸５８８である。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)ならびにここに記載するヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)を含む。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインは、ここに(例えば、表２に)記載する軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表２に)記載する重鎖可変領域を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むか、またはこれからなるｓｃＦｖである。ある態様において、抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ｓｃＦＶ)は、表２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、膜貫通型ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメインである。一つの態様において、膜貫通型ドメインは、例えば、配列番号６の配列、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を有するここに記載する膜貫通型ドメインを含む。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通型ドメインに接続される。一つの態様において、ヒンジ領域はここに記載するヒンジ領域、例えば、配列番号２のヒンジ領域を含む。
一つの態様において、単離ＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインを含む。一つの態様において、共刺激ドメインはＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントである。一つの態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる。
一つの態様において、単離ＣＡＲ分子は、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９または配列番号１０の配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が２０個、１０個または５個を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号９の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含むか、またはこれからなり、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
他の面において、本発明は、例えば、配列番号１のリーダー配列；例えば、表２のアミノ酸配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を有するここに記載する抗メソテリン結合ドメイン；例えば、配列番号２のヒンジ領域；例えば、配列番号６の配列を有する膜貫通型ドメイン；共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン；および一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離ＣＡＲ分子に関する。一つの態様において、単離ＣＡＲ分子は、表２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む(例えば、これからなる)。一つの態様において、単離ＣＡＲ分子は、表２のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を有するポリペプチドを含む(これからなる)。一つの態様において、単離ＣＡＲ分子は、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる。
他の面において、本発明は、ここに記載する核酸配列を含むベクターに関する。一つの態様において、核酸配列は、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする。一つの態様において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
一つの態様において、ベクターは、レンチウイルスベクター、例えば、ここに記載するレンチウイルスベクターである。一つの態様において、ベクターは、さらにプロモーターを含む。一つの態様において、プロモーターは、ＥＦ−１αプロモーターである。一つの態様において、ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号１１の配列を含む。
一つの態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一つの態様において、ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから転写され、ここで、ベクターはｐＤ−Ａ.抗メソＢＤ ＯＦ.２ｂｇ.１５０Ａであり、ここで、抗メソＢＤはここに記載する抗メソテリン結合ドメインである。一つの態様において、ベクター内の核酸配列はさらにポリ(Ａ)テイル、例えば、約１５０個のアデノシン塩基(配列番号２７１)を含む、例えば、ここに記載のポリＡテイルを含む。一つの態様において、ベクター内の核酸配列は、さらに３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも一反復を含む、例えば、ここに記載の３’ＵＴＲを含む。
他の面において、本発明は、ベクターを含む細胞に関する。細胞は、例えば、ここに記載する細胞であり得る。一つの態様において、細胞は、ヒトＴ細胞、例えば、ここに記載するＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載するヒトＮＫ細胞である。一つの態様において、ヒトＴ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。一つの態様において、細胞は自己Ｔ細胞である。一つの態様において、細胞は同種Ｔ細胞である。一つの態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。一つの態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はＩｋａｒｏｓ欠損である。一つの態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓの両者が欠損している。
一つの面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(メソテリン)または異なる標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)への、例えば、異なる抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲを含み得る。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲおよびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞または卵巣癌細胞上に発現される抗原)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲおよびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞または卵巣癌細胞上に発現される抗原)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞はここに記載するメソテリンＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、またメソテリンを発現する正常細胞上に見られるが、癌細胞には見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
他の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤を発現できる。例えば、一つの態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する分子は、阻害分子である。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。いくつかの態様において、薬剤、例えば、ここに記載する、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたは、例えば、阻害タンパク質もしくは阻害系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害できる。ある態様において、薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば阻害する薬剤を、ＣＡＲ発現細胞内で阻害する。例えば、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と結合する。
一つの態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一つの態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータおよびＴＩＧＩＴのような阻害分子の、例えば、第一ポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの少なくとも細胞外ドメインの一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメインである(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)第二ポリペプチドを含む。一つの態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの一部)である第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。
他の面において、本発明は、ここに記載する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含むベクターを形質導入することを含む、細胞の製造法を提供する。一つの態様において、ベクターは、ここに記載するレンチウイルスベクターである。
本発明はまた、外来ＲＮＡを一過性に発現するＲＮＡ操作細胞、例えば、ここに記載する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団を産生する方法も提供する。本方法は、細胞にインビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを導入することを含み、ここで、該ＲＮＡはここに記載するＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。
他の面において、本発明は、対象にＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、ここに記載する細胞である、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を投与することを含む、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。一つの態様において、細胞は自己Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一つの態様において、細胞は同種Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一つの態様において、対象はヒトである。
他の面において、本発明は、対象に、例えば、ここに記載する、ＣＡＲ分子を含む細胞の有効量を投与することを含む、メソテリンの発現と関係する疾患(例えば、メソテリンの発現と関係する増殖性疾患、前癌状態および非癌関連適応症)を有する対象の処置法に関する。
一つの態様において、メソテリンと関係する疾患は癌、例えば、ここに記載する癌である。一つの態様において、メソテリンと関係する疾患は中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)、肺癌(例えば、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌)、膵臓癌(例えば、膵管腺癌)、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一つの態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの先の標準治療で進行した対象における、膵臓癌、例えば、転移性膵管腺癌(ＰＤＡ)である。一つの態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの先の標準治療で進行した対象における、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。一つの態様において、疾患は、例えば、少なくとも一つの先の標準治療レジメン後に進行した対象における卵巣癌、例えば、漿液性上皮性卵巣癌である。
一つの態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を先にメルファランを投与されていた対象に投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の活性または適応度を増強する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。理論に縛られることを望まないが、低い、免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能の改善には十分である用量)での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞を、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により消耗させ得る。
一つの態様において、この方法を使用して、対象におけるここに記載するＣＡＲ細胞の性能を最適化できる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能が改善されると考えられる。理論に縛られることを望まないが、ある態様において、メソテリンＣＡＲ発現細胞の性能が改善されると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたはこれから操作される細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、エクスビボで、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるかまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより処理できる。
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与前に開始する。ある態様において、ＣＡＲ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞のレベル、例えば、Ｔ細胞またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、ｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な投薬の後に投与する。
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、対象中のまたは対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞のレベル、例えば、Ｔ細胞またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な時間または十分な投薬の後に採取する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する副作用の一つ以上を軽減するための薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、メソテリン発現と関係する疾患を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ここに記載する用量および／または投薬スケジュールで投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第一選択処置として投与する。他の態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌の第二、第三、第四選択処置として投与する。
一つの態様において、ここに記載する細胞の集団を投与する。
一つの態様において、ＣＡＲ分子を、例えば、インビトロ転写を使用してＴ細胞またはＮＫ細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)はＣＡＲ分子を含む細胞の最初の投与と、続く１回以上のＣＡＲ分子を含む細胞の投与を受け、ここで、続く１回以上の投与は、前回の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に実施する。一つの態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞の１週間あたり１回を越える投与を対象(例えば、ヒト)に実施し、例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞を１週間あたり２回、３回または４回投与する。一つの態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ分子を含む細胞の１週間あたり１回を超える投与(例えば、１週間あたり２回、３回または４回の投与)(ここではサイクルとも称す)を受け、その後１週間はＣＡＲ分子を含む細胞を投与せず、続いて対象にＣＡＲ分子を含む細胞の１回以上の投与(例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の１週間あたり１回を越える投与)を実施する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回を超えるサイクルを受け、各サイクル間の間隔は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。一つの態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、１週間あたり３回隔日で投与する。一つの態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
一つの面において、本発明は、例えば、ここに記載する、メソテリン−ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクターを遺伝子導入されたまたは形質導入された自己または同種異系間細胞の集団を含む。一つの態様において、ベクターはレトロウイルスベクターである。一つの態様において、ベクターは、本明細書の他の場所に記載する自己不活性化レンチウイルスベクターである。一つの態様において、ベクターを細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に送達し(例えば、遺伝子導入またはエレクトロポレーションによる)、ここで、該ベクターは、ここに記載するメソテリンＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含み、これがｍＲＮＡ分子として転写され、メソテリンＣＡＲ分子がＲＮＡ分子から翻訳され、細胞表面に発現される。
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一つの態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗メソテリン結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおける抗メソテリン結合ドメインと異なるここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載する、抗メソテリン結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびメソテリン以外の標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
他の面において、本発明は、集団中の少なくとも１個の細胞がここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または機能を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、一つの態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する分子は阻害分子、例えば、ここに記載する薬剤である。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。いくつかの態様において、薬剤、例えば、ここに記載する、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ；または例えば、阻害タンパク質または阻害系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害できる。ある態様において、薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば阻害する薬剤を、ＣＡＲ発現細胞内で阻害する。例えば、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と結合する。
一つの態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一つの態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータおよびＴＩＧＩＴのような阻害分子の第一ポリペプチドの、例えば、第一ポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。一つの態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
一つの態様において、例えば、ここに記載する、メソテリンＣＡＲ分子をコードする核酸分子を、ｍＲＮＡ分子として発現させる。一つの態様において、遺伝子修飾したメソテリンＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、細胞に所望のＣＡＲ(例えば、ベクター配列不含)をコードするＲＮＡ分子を遺伝子導入またはエレクトロポレーションすることにより産生できる。一つの態様において、メソテリンＣＡＲ分子は、取り込まれたら、ＲＮＡ分子から翻訳され、組み換え細胞の表面に発現する。
他の面において、本発明は、医薬として使用するための、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする単離核酸分子、ここに記載するＣＡＲ分子を含むベクターおよび／またはここに記載するＣＡＲ分子を含む細胞に関する。
他の面において、本発明は、例えば、ここに記載する、メソテリンを発現する疾患の処置に使用するための、ここに記載するＣＡＲ分子、ここに記載するＣＡＲ分子をコードする単離核酸分子、ここに記載するＣＡＲ分子を含むベクターおよび／またはここに記載するＣＡＲ分子を含む細胞に関する。
図１はｐＤ−Ａ.抗メソＢＤ.ＯＦ.ＢＢＺ.２ｂｇ.１５０Ａプラスミドの模式図である。本図は配列番号２７１を“１５０Ａ”として記載する。
図２は使用できる細胞製造および処置スケジュールを示す。(Ａ)自己細胞を白血球アフェレシスにより得て、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ被覆磁気ビーズを用いる増殖により富化する。細胞を８〜１２日増殖する。培養最終日、磁場を使用してビーズを除去し、細胞を洗浄し、ヒトメソＣＡＲ ｍＲＮＡ構築物を用いてエレクトロポレーションし、不溶解性媒体で凍結保存する。(Ｂ)３種の処置注入スケジュールを記載する。スケジュール１では、患者は１×１０８個のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を、０日目に静脈内(ｉ.ｖ.)注入により投与され、１週間後に１×１０９個のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を投与される。安全性を最低１ヶ月モニターし、その後患者をスケジュール２に適格とし得る。スケジュール２では、患者は、１×１０８個のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を１週間、週に３回ｉ.ｖ.注入により投与され、１週間の休薬の後、１×１０９個のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を１週間、週に３回投与される。スケジュール３では、患者は、３×１０８／ｍ２のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を、３週間、週に３回ｉ.ｖ.注入により投与され、その後、＋３５日目および＋５７日目に、２×１０８個のヒトメソ担持ＣＡＲ Ｔ細胞を原発病巣に腫瘍内注射される。
図３Ａおよび３ＢはマウスＳＳ１ ＣＡＲまたは本発明の抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｍ１〜Ｍ１２を形質導入され、図３Ａに示すＭＳＬＮを発現しない対照Ｋ５６２細胞または図３Ｂに示すＭＳＬＮを発現するように形質導入されたＫ５６２細胞(Ｋ５６２−メソ)と培養したドナー２(健常ドナー)Ｔ細胞でアッセイした細胞毒性の代表的グラフである。
図４Ａおよび４ＢはＭＳＬＮ＋細胞での刺激後のマウスＳＳ１およびＣＤ１９ ＣＡＲＴおよび抗ＭＳＬＮ ＣＡＲＴのＩＦＮ−γ分泌を示すグラフである。図４Ａは、形質導入細胞株Ｋ５６２−メソおよびそのＭＳＬＮ陰性親株Ｋ５６２に対する反応性を示す。図４Ｂは、天然にＭＳＬＮを発現する癌細胞、卵巣癌株Ｏｖｃａｒ８および膵臓癌株ＳＷ１９９０およびＰａｎｃ０２０３に対する反応性を示す。
図５はＣＡＲ構築物をレンチウイルスベクターを用いて形質導入することにより製造したメソテリンＣＡＲＴの臨床試験デザインを示す。
図６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６ＤはＣＡＲＴメソ細胞の抗腫瘍活性を示す。
図７Ａ、７Ｂおよび７ＣはＣＡＲＴメソ細胞のインビボ残留性ならびに原発および転移腫瘍部位への輸送を示す。
図８はＣＡＲＴメソ細胞注入後の血清におけるサイトカインおよびケモカインを示す。
図９Ａおよび９Ｂは抗腫瘍抗体のＣＡＲＴメソ細胞誘導を示す。血清をＭＰＭ患者(図９Ａ)および膵臓癌患者(図９Ｂ)から得た。
図１０はＥＭＭＥＳＯ腫瘍細胞を注射したＮＳＧマウスにおける腫瘍増殖を示す。腫瘍が約２００mm３サイズに増殖後、メソＣＡＲＴ細胞を尾静脈から注射し、注射３９日後に測定した。
図１１Ａおよび１１Ｂは注射時(図１１Ａ)または異種移植腫瘍から採取した４０日後のフローサイトメトリー解析によるメソＣＡＲの発現を示す。
図１２は３９日後のＮＳＧマウスの側腹部から単離したとき、または形質導入後凍結保存した、メソＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ致死に関する機能的能力を示す。
図１３は一夜休ませたＴＩＬと比較した、ＥＭＭＥＳＯ側腹部腫瘍から単離したＴＩＬにおける阻害酵素ＤＧＫおよびＳＨＰ１を示す。
図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄ、１４Ｅおよび１４Ｆは腫瘍細胞致死(図１４Ａ、１４Ｃおよび１４Ｅ)およびＩＦＮ−γサイトカイン分泌(図１４Ｂ、１４Ｃおよび１４Ｆ)に対するメソＣＡＲＴ機能を下方制御する阻害機序の阻害剤(抗ＰＤＬ１、ＤＧＫ阻害剤およびＳＳＧ)での処置の効果を示す。
図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは種々の腫瘍細胞株で刺激後の、ヒトＣＡＲＴ−ＭＳＬＮの小パネルからのサイトカイン分泌を示す。図１５ＡはＩＦＮ−γ分泌を示す。図１５ＢはＴＮＦを示す。図１５ＣはＩＬ−２を示す。図１５ＤはＩＬ−４を示す。
図１６Ａおよび１６ＢはＯｖｃａｒ３(図１６Ａ)およびＵ８７ｍｇ(図１６Ｂ)腫瘍細胞に対するＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ−５、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ−１１、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ１７およびマウスＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ−ＳＳ１の致死アッセイの結果を示す。
図１７Ａおよび１７ＢはＯｖｃａｒ３腫瘍細胞に対するＣＡＲＴ−ＭＳＬＮのパネルの致死アッセイの結果を示す。
図１８はＯｖｃａｒ８異種移植モデルにおける第一セットのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ(Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１７およびＭ２１を含む)の抗腫瘍活性を示す。
図１９はＯｖｃａｒ８異種移植モデルにおける第二セットのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ(Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６およびＭ２３を含む)の抗腫瘍活性を示す。
図２０Ａ、２０Ｂおよび２０Ｃは新鮮または解凍メソＣＡＲ Ｔ細胞と比較した、腫瘍微小環境(ＴＩＬ)におけるメソＣＡＲ Ｔ細胞の経時的機能喪失を示す。Ａ)細胞毒性アッセイ；Ｂ)ＩＦＮ−γ放出アッセイ；およびＣ)ＥＲＫシグナル伝達のウェスタンブロット解析(リン酸化を介する)。
図２１はメソＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性に対するＤＧＫ欠失の効果を示す。標的細胞致死パーセントを種々のエフェクター：標的比で評価する。
図２２はＩＦＮ−γ産生およびメソＣＡＲ Ｔ細胞からの放出に対するＤＧＫ欠失の効果を示す。ＩＦＮ−γの濃度を種々のエフェクター：標的比で評価する。
図２３はＥＲＫシグナル伝達またはＴ細胞活性化、メソＣＡＲ Ｔ細胞に対するＤＧＫ欠失の効果を示す。Ｂ：アルブミン、Ｍ：メソテリン、３／２８：ＣＤ３／ＣＤ２８刺激細胞。
図２４は細胞毒性活性に関するメソＣＡＲ Ｔ細胞のＴＧＦ−β感受性に対するＤＧＫ欠失の効果を記載する。
図２５Ａおよび２５Ｂは腫瘍マウスモデルにおけるメソＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性に対するＤＧＫ欠失の効果を示す。Ａ)抗腫瘍活性に対する効果を、経時的腫瘍体積により示す。Ｂ)腫瘍浸潤性細胞の持続および増殖。
図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｅおよび２６ＦはＩｋａｒｏｓのレベルが減少したＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞毒性メディエーター放出を示す。図２６Ａは、フローサイトメトリー(左パネル)およびウェスタンブロット(右パネル)で測定した野生型およびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓ発現を示す。メソテリン被覆ビーズ、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)またはＢＳＡ被覆ビーズ(対照)で刺激後、ＩＦＮ−γ(図２６Ｂ)、ＴＮＦ−α(図２６Ｃ)およびＩＬ−２(図２６Ｄ)、細胞毒性メディエーターグランザイムＢ(図２６Ｅ)およびＣＤ１０７ａ発現(図２６Ｆ)を産生する細胞のパーセンテージを決定した。
図２７Ａ、２７Ｂおよび２７ＣはＩｋａｒｏｓのドミナントネガティブアレル(ＩｋＤＮ)を有するＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞毒性メディエーター放出を示す。メソテリン被覆ビーズ、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)またはＢＳＡ被覆ビーズ(対照)で刺激後、ＩＦＮ−γ(図２７Ａ)、ＩＬ−２(図２７Ｂ)およびＣＤ１０７ａ発現(図２７Ｃ)を産生する細胞のパーセンテージを決定した。
図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃ、２８Ｄおよび２８ＥはＩｋａｒｏｓの欠失が抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞の活性化およびシグナル伝達を増強しなかったことを示す。ＣＤ６９(図２８Ａ)、ＣＤ２５(図２８Ｂ)および４−１ＢＢ(図２８Ｃ)のレベルを、記載した時点で、Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞においてフローサイトメトリーで決定した。図２８Ｄにおいて、ＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達経路を、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でＴＣＲ刺激後に野生型(ＷＴ)およびＩｋａｒｏｓドミナントネガティブ細胞(ＩｋＤＮ)で試験した。リン酸化ＰＬＣγ、リン酸化Ｌｃｋ、リン酸化ＪＮＫ、リン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＩＫＫαおよびＩκＢαのようなリン酸化ＴＣＲシグナル伝達タンパク質のレベルをウェスタンブロットで評価した。図２８Ｅにおいて、メソＣＡＲを形質導入したＷＴおよびＩｋＤＮ細胞をＢＳＡまたはメソテリン被覆ビーズで刺激し、下流シグナル伝達経路を、リン酸化ＥＲＫおよびリン酸化ＰＬＣγのレベルの評価によりウェスタンブロットにより試験した。
図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄおよび２９ＥはＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓの減少は、インビトロで標的細胞ＡＥ１７またはメソテリン発現ＡＥ１７(ＡＥ１７メソ)に対する応答を増強させることを示す。図２９Ａは、記載するエフェクター：標的細胞比での、ＷＴおよびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を示す。メソＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１±(図２９Ｂ)およびＩｋＤＮ(図２９Ｃ)の細胞溶解を、記載するエフェクター：標的細胞比で測定した。ＦＡＰ−ＣＡＲを形質導入したＷＴおよびＩｋｚｆ１±のＩＦＮ−γ産生(図２９Ｄ)および細胞溶解(図２９Ｅ)を、記載するエフェクター：標的細胞比で測定し、ここで、標的細胞はＦＡＰ発現３Ｔ３細胞であった。
図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃはインビボでの確立された腫瘍に対するＩｋａｒｏｓが枯渇したＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞を、確立されたメソテリン発現ＡＥ１７腫瘍を担持するマウスに投与した。メソＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１±(図３０Ａ)またはＩｋＤＮ(図３０Ｂ)の投与後、腫瘍体積を測定した。ＦＡＰ−ＣＡＲ発現ＷＴおよびＩｋｚｆ１±(図３０Ｃ)投与後腫瘍体積を測定した。
図３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、３１Ｄ、３１Ｅおよび３１ＦはＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、免疫抑制性腫瘍微小環境におけるＩｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞の持続および抵抗性の増加を示す。ＣＡＲ発現ＷＴまたはＩｋｚｆ１±細胞(ＧＦＰ陽性)のパーセンテージを、脾臓(図３１Ａ)および腫瘍(図３１Ｂ)から採取したフローサイトメトリーに基づいて決定した。注入３日後脾臓または腫瘍から採取したＣＡＲ Ｔ細胞の機能的能力を、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体(図３１Ｃ)またはＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)(図３１Ｄ)で刺激後のＩＦＮ−γ産生の測定により評価した。制御性Ｔ細胞(ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋発現)およびマクロファージ(ＣＤ２０６発現)を、注入９日後脾臓または腫瘍から採取したＣＡＲ Ｔ細胞上のＴｒｅｇまたはマクロファージマーカーの発現の測定により評価した。
図３２Ａおよび３２ＢはＩｋａｒｏｓレベルが減少したＴ細胞が、可溶性阻害因子ＴＧＦ−βおよびアデノシンに対する感受性が低いことを示す。メソＣＡＲ発現ＷＴ、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ細胞を、ＴＧＦ−βまたはアデノシンに応答してＩＦＮ−γ(図３２Ａ)および細胞毒性(図３２Ｂ)を産生する能力について試験した。
図３３Ａおよび３３Ｂは、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株に対する力価の増加を示すグラフである。図３３Ａにおいて、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投与コホートの各々について、ワクチン接種４週間後プラセボコホートの増加と比較して、３種のインフルエンザワクチン株(Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８)の各々に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える上昇が示される。太黒線は、本治験の主要評価項目を満たすための３種のインフルエンザワクチン株中２種で満たすべき基準である、プラセボに比した力価の１.２倍増加を示す。星印“＊”は、プラセボに対するＧＭＴ力価が１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。図３３Ｂは、ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０を有する対象のサブセットでの図３３Ａと同じデータのグラフである。
図３４はワクチン接種４週間後のＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する幾何平均力価の増加倍率の散布図を示す。ＲＡＤ００１濃度(投与１時間後)を、対象が４週間投与を受けた後に測定した。薬物動態測定を受けた全対象を解析対象集団に入れた。ベースラインと比較したワクチン接種４週間後の幾何平均力価の増加倍率をｙ軸に示す。
図３５はプラセボと比較した、異種インフルエンザ株に対する力価の増加を示すグラフである。ワクチン接種４週間後、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投与コホートの各々について、プラセボコホートにおける増加に対して、インフルエンザワクチンに含まれない２種の異種インフルエンザ株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対するインフルエンザ幾何平均力価のベースラインを超える上昇が示される。＊はプラセボに対する力価が１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。
図３６Ａおよび３６Ｂはインフルエンザワクチン接種前後のＩｇＧおよびＩｇＭレベルのグラフである。抗Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、インフルエンザワクチン接種前および４週間後に対象から得た血清で測定した。ＲＡＤ００１およびプラセボコホートで、抗Ｈ１Ｎ１インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭレベルのベースラインからワクチン接種４週間後の変化の有意差は検出されなかった(クラスカル・ウォリス順位和検定で全ｐ値＞０.０５)。
図３７Ａ、３７Ｂおよび３７ＣはＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８の減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の増加を示すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントを、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後でかつインフルエンザワクチン接種４種間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ解析により決定した。図３７Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１を投与されたコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の有意な減少(−３７.１〜−２８.５％)があり、それぞれｐ＝０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であることを示す。図３７Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を投与されたコホートにおいて、１２週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な減少(−４３.３〜−３８.５％)があることを示し、それぞれ、ｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)であることを示す。図３７Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)の用量レベルでＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を投与されたコホートで１２週目にＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の有意な増加(３.０〜４.９％)があり、それぞれｐ＝０.０００７(ｑ＝０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)であることを示す。
図３８Ａおよび３８ＢはベースラインＰＤ−１発現の差異で調節したＲＡＤ００１処置後のＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の増加を示すグラフである。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントは、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後でかつインフルエンザワクチン接種４種間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ解析により決定した。図３８Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)において６週目でＰＤ−１＋ＣＤ４ Ｔ細胞の３０.２％の有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であることを示す。プラセボコホートと比較したプールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図３８Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)において６週目でＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の３７.４％の有意な減少があり、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)であることを示す。プラセボコホートと比較したプールしたＲＡＤ００１における１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。図３８Ａおよび３８Ｂは、図３７Ａ、３７Ｂおよび３７Ｃのデータを示すが、図３７Ａ、３７Ｂおよび３７Ｃの異なるＲＡＤ００１用量群を、図３８Ａおよび３８Ｂにおいて単一ＲＡＤ００１処置群にプールした。
図３９はＲＡＤ００１に応答した高齢対象における運動およびエネルギーの増加を示す。
図４０Ａおよび４０Ｂは細胞におけるＰ７０ Ｓ６Ｋ活性に対するＲＡＤ００１の予測効果を示す。図４０ＡはＲＡＤ００１の毎週および連日の高用量で阻害したＰ７０ Ｓ６キナーゼを示し、図４０ＢはＲＡＤ００１の毎週の低用量で阻害したＰ７０ Ｓ６キナーゼを示す。
図４１Ａ、４１Ｂおよび４１ＣはｓｃＦｖ ＳＳ１(図４１Ａ)、Ｍ５(図４１Ｂ)およびＭ１１(図４１Ｃ)についてのＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ＳＰＲセンサーグラムを示す。
図４２Ａ、４２Ｂおよび４２ＣはマウスＳＳ１ ｓｃＦｖと比較した抗ヒトメソテリンｓｃＦｖのエピトープビニングＳＰＲセンサーグラムを示す。競合的結合がｓｃＦｖ Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１およびＭ２３(図４２Ａ)で観察された。ＳｃＦｖ Ｍ５(図４２Ｂ)およびＭ１１(図４２Ｃ)はＳＳ１と異なるエピトープに結合する。
図４３はＯＶＣＡＲ８腫瘍モデルにおける種々のメソテリンＣＡＲＴ処置後の腫瘍増殖を示す。腫瘍移植６２日後までの平均腫瘍体積±ＳＥＭ。Ｔ細胞を１４日目および１９日目に投与した。小丸：外側尾静脈から１００μlのＰＢＳで処置されたマウス；黒四角：アイソタイプ対照Ｔ細胞で処置されたマウス；灰色三角：ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞単回投与で処置されたマウス；逆三角：ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞二回投与で処置されたマウス；菱形：Ｍ５ ＣＡＲ Ｔ細胞単回用量で処置されたマウス；大丸：Ｍ５ ＣＡＲ Ｔ細胞二回投与で処置されたマウス；灰色四角：Ｍ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞単回用量で処置されたマウス；および黒三角：Ｍ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞二回投与で処置されたマウス。
図４４は水素重水素交換マススペクトロメトリー解析におけるヒトメソテリンペプチド適用範囲の模式図である。各黒棒がペプチドを表す。
図４５Ａおよび４５ＢはＳＳ１(黒色棒)およびＭ５(灰色棒)と複合体化したときのヒトメソテリンの重水素取り込みの差異を示すグラフである。抗体結合による重水素取り込みの差異(ｙ軸に示す)を、検出した各ペプチドフラグメント(ｘ軸に示す)について示し、図４５Ａにおいてアミノ酸２９７〜４６４のペプチドおよび図４５Ｂにおいてアミノ酸４５８〜５８６のペプチドを示す。全ての差異は、未結合メソテリン(対照)の重水素取り込みに対する。＊は、０.７５Da未満の差のペプチドについてテューキー検定を使用して統計的有意の領域を示す。
図４６は抗原ヒトメソテリンの一次配列(アミノ酸２９６〜５８８)ならびにＳＳ１およびＭ５により保護された領域を示す模式図である。黒色棒はＳＳ１(アミノ酸３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９および３６９〜３７５)と複合体化したとき保護されるアミノ酸を示す。灰色棒はＭ５(アミノ酸４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７および５４５〜５７２)と複合体化したときに保護されるアミノ酸を示す。
図４７はＣＡＲおよびｓｈＲＮＡの共発現のための、ＣＡＲとｓｈＲＮＡをコードする構築物の異なる配置を示す一般的地図である。図４７Ａ〜４７Ｄは、例えば、Ｕ６制御ｓｈＲＮＡがＥＦ１アルファ制御ＣＡＲコード化成分の上流または下流にある、単一ベクター上の種々の配置を示す。図４７Ａおよび４７Ｂに示す代表的構築物において、転写は、Ｕ６およびＥＦ１アルファプロモーターを介し、同じ方向で起こる。図４７Ｃおよび４７Ｄに記載する代表的構築物において、転写は、Ｕ６およびＥＦ１アルファプロモーターを介し異なる方向で起こる。図４７Ｅにおいて、ｓｈＲＮＡ(および対応するＵ６プロモーター)は第一ベクター上にあり、ＣＡＲ(および対応するＥＦ１アルファプロモーター)は第二ベクター上にある(図１６Ｅ)。
図４８は、二個の代表的ＲＣＡＲ配置の構造を示す。抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーはスイッチドメイン、共刺激性シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２個の配置は、ここに記載する第一および第二スイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに対して異なる配向であり得ることを示す。他のＲＣＡＲ配置をここにさらに記載する。
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。
単数表現は、不定冠詞の文法的目的である１個または１個を超えること(すなわち、少なくとも１個)を意味する。例として、“成分”は１個の成分または１個を超える成分を意味する。
用語“約”は、量、期間などのような測定可能な値に言及するとき、特定値からの±２０％またはいくつかの例においては±１０％またはいくつかの例においては±５％またはいくつかの例においては±１％またはいくつかの例においては±０.１％の変動を、このような変動が開示する方法の実施に適切である限り、包含することを意図する。
用語“キメラ抗原受容体”あるいはまた“ＣＡＲ”は、概して最も単純な態様においては２個の、ポリペプチドのセットをいい、これは、免疫エフェクター細胞中にあるとき、該細胞に標的細胞、概して癌細胞への特異性および細胞内シグナル産生を提供する。ある態様において、ＣＡＲは少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインならびに下記のような刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。いくつかの面において、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。ある態様において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。一つの面において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関係するゼータ鎖である。一つの面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、下記のような少なくとも１個の共刺激分子由来の１個以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一つの面において、共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。一つの面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一つの面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一つの面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインならびに１個以上の共刺激分子由来の２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一つの面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインならびに１個以上の共刺激分子由来の少なくとも２個の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一つの面において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意的なリーダー配列を含む。一つの面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、ここで、該リーダー配列は、所望により細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から切断されてよい。
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーを産生することによりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御するために細胞内で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分である。
ここで使用する用語“メソテリン”は、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)結合および巨核球増強因子(ＭＰＦ)と呼ばれるアミノ末端３１kDa脱落フラグメントにより細胞膜に固定されている、４０kDaタンパク質であるメソテリンをいう。いずれのフラグメントもＮ−グリコシル化部位を含む。本用語はまた、“可溶性メソテリン／ＭＰＦ関連”とも呼ばれる、４０kDaカルボキシル末端フラグメントの可溶性スプライスバリアントもいう。好ましくは、本用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ０３５１２.１のヒトメソテリンおよび、例えば、細胞膜、例えば、癌細胞膜上に発現される、その天然に切断される部分をいう。
ここで使用する用語“抗体”は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル、多鎖または単鎖または完全な免疫グロブリンであってよく、天然起源または組み換え起源に由来し得る。抗体は免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間的分布により)特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一つの部分をいう。抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異性抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドに移植もできる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１個の抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも１個の抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーを介して連続的に結合し、単一鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、該ｓｃＦｖはそれが由来する完全な抗体の特異性を保持する。特に断らない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関していずれかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を含んでよく、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでよく、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでよい。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、単一鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二重特異性抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在し得る(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。一つの面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲはｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
用語“抗体重鎖”は、天然に生じる高次構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、これは通常該抗体が属するクラスを決定する。
用語“抗体軽鎖”は、天然に生じる高次構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２個の主要な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生されている抗体も意味すると解釈すべきであり、該ＤＮＡ分子は抗体タンパク質または該抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここで、該ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり、周知である組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して得られている。
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特定の免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両者に関与し得る。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、あらゆる巨大分子が抗原として働き得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、“抗原”を、当該用語が本明細書で使用される限り、コードすることを理解する。さらに、当業者は、抗原がもっぱら遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によりコードされる必要がないことを理解する。本発明が、１個を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることは容易に明らかとなる。さらに、当業者は、抗原が“遺伝子”によりコードされる必要は全くないことを理解する。抗原が合成により製造できまたは生物学的サンプルに由来できまたはポリペプチド以外の巨大分子であるかもしれないことは容易に明らかである。このような生物学的サンプルは組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生体成分を伴う体液を含むが、これらに限定されない。
用語“競合”は、他の抗原結合ドメイン、例えば、ここに提供する抗原結合ドメイン、例えば、ここに提供する抗体またはそのフラグメントが、標的、例えば、メソテリンに直接的または間接的に結合するのを妨害する、抗原結合ドメイン、例えば、抗体またはそのフラグメントの能力をいう。抗原結合ドメイン、例えば、抗体またはそのフラグメントが他の抗原結合ドメイン、例えば、抗体またはそのフラグメントの標的への結合を妨害する程度、それゆえに、競合と言えるか否かは、競合結合アッセイを使用して決定できる。ある態様において、競合結合アッセイは定量的競合アッセイである。例えば、ある特に適当な定量的競合アッセイは、固定化標的への結合に対するある抗体またはそのフラグメントと他の抗体またはそのフラグメントの間の結合、例えば、競合の測定に、表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)ベースの手法を使用する。代表的ＳＰＲベースの競合アッセイは、ここの実施例２に記載する。他の適当な定量的競合アッセイは、標的への結合に対する標識(例えば、とりわけ、Ｈｉｓタグ付加、ビオチニル化または放射活性物質で標識した)抗体またはそのフラグメントと他の抗体またはそのフラグメントの間の競合を測定するためにＦＡＣＳベースの手法を使用する。
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少または癌状態に付随する種々の生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化し得る、生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまたそもそも癌の発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても顕在化され得る。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少または腫瘍細胞生存の減少を含むが、これらに限定されない種々の手段により顕在化し得る、生物学的効果をいう。
用語“自己”は、後に個体に再導入するのと同じ個体に由来する何らかの物質をいう。
用語“同種”は、物質を導入する個体と同じ種の異なる動物由来の何らかの物質をいう。一箇所以上の座位の遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は互いに同種であるというべきである。いくつかの面において、同じ種の個体由来の同種物質は、抗原性に相互作用するには、遺伝的に十分に異なっている可能性がある。
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
用語“癌”は、異常細胞の無制御の増殖により特徴づけられる疾患である。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。多様な癌の例がここに記載され、中皮腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳の癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。
用語“メソテリンの発現と関係する疾患”は、例えば、癌または悪性腫瘍のような増殖性疾患または中皮過形成のような前癌状態を含む、メソテリンを発現する細胞と関係するメソテリンの発現と関係する疾患または状態；またはメソテリンを発現する細胞と関係する非癌関連適応症を含むが、これらに限定されない。メソテリンを発現する多様な癌の例は、中皮腫、肺癌、卵巣癌、膵臓癌などを含むが、これらに限定されない。
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特徴に顕著に影響しないまたは変えないアミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準法により、本発明の抗体または抗体フラグメントに修飾を導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１個以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置き換えてよく、改変ＣＡＲを、例えば、ここに記載する機能的アッセイを使用してメソテリンと結合する能力について試験し得る。
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)とその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)の結合により誘発され、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達または適切なＮＫ受容体によるもしくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインによるシグナル伝達のような、しかし、これに限定されない、シグナル伝達事象を仲介する、一次応答をいう。刺激は、ある分子の発現の改変を仲介できる。
用語“刺激分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある面について刺激性の方法で免疫細胞の活性化を制御する、細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。一つの面において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを搭載したＭＨＣ分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の媒介に至る、一次シグナルである。刺激性様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)は、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用である細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２に由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１個以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９に提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０に提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、主要組織適合抗原複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来性抗原をその表面に示すアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞に提示する。
ここで使用する用語としての“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を増強するシグナルを産生する。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存性刺激を担う分子由来のものを含み得る。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。代表的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激を担う分子由来のものを含み得る。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含みえて、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
用語“ゼータ”あるいはまた“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲ−ゼータ”は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義され、“ゼータ刺激ドメイン”あるいはまた“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”または“ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、ゼータ鎖の細胞質ドメイン由来のアミノ酸残基またはその機能的誘導体として定義される。一つの面において、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を含む。一つの面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は、配列番号９として提供される配列である。一つの面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は配列番号１０として提供される配列である。
用語“共刺激分子”は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、Ｔ細胞による、増殖のような、しかし、これに限定されない共刺激応答を仲介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的免疫応答に貢献する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣＩ型分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含むが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／ＣｂｐおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)および活性化ＮＫ細胞受容体のタンパク質ファミリーで表すことができる。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子の全細胞内部分または全天然細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含み得る。
用語“４−１ＢＢ”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供されるアミノ酸配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーをいう。一つの面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義される。一つの面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの等価な残基である。
ここで使用する“抗原提示細胞”は、表面上で主要組織適合抗原複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来性抗原を提示する、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは抗原を処理し、それをＴ細胞に提示する。
用語“コードする”は、生物学的過程における、ヌクレオチドの定義された配列(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の定義された配列のいずれかならびにそれに由来する生物学的特性を有する他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の特性をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、該遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として使用される非コード鎖の両者を、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの変性バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。用語タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンにおいてイントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
用語“有効量”または“治療有効量”は、ここでは交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載する化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系由来のまたはその中で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたはこれらの外で産生されたあらゆる物質をいう。
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
用語“導入ベクター”は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するのに使用できる組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関係するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むが、これらに限定されない。それゆえに、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞内への導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
用語“発現ベクター”は、発現すべきヌクレオチド配列に操作可能に結合した発現制御配列を含む、組み換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、他の発現用領域は宿主細胞またはインビトロ発現系により供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド(例えば、裸のまたはリポソームに包含された)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てを含む。
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーのある属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点で、レトロウイルスの中で独特であり、相当量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、遺伝子送達ベクターの最も効率的方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。用語“レンチウイルスベクター”は、Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)に提供されるような特に自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターである。診療所で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenのLENTIMAXTMベクターシステムなどを含むが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られる。
用語“相同”または“同一性”は、２個の重合体分子、例えば、２個のＤＮＡ分子もしくは２個のＲＮＡ分子のような２個の核酸分子または２個のポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性をいう。２個の分子の両者のサブユニット位置が同じ単量体サブユニットで占拠されているならば、例えば、２個のＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンで占拠されているならば、それらは、その位置について相同または同一である。２個の配列間の相同性は、マッチングまたは相同位置の関数であり、例えば、２個の配列の半分の位置(例えば、１０サブユニット長ポリマーにおける５箇所)が相同であるならば、２個の配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)がマッチしているかまたは相同であるならば、２個の配列は９０％相同である。
用語“ヒト化”は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である、非ヒト(例えば、マウス)抗体の形である。ほとんどの部分、ヒト化抗体および抗体そのフラグメントはヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)であり、その中で、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲ由来の残基と置き換えられている。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメント性能をさらに洗練し、最適化し得る。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１個、概して２個の可変ドメインのかなりの部分を含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントは、また、概してヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細について、Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992を参照のこと。
用語“完全にヒト”は、分子全体がヒト起源であるかまたは抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる、抗体または抗体フラグメントのような免疫グロブリンをいう。
用語“単離”は、天然状態から変えられたまたは除かれたことを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態の共存物質から一部または完全に分離されている同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在でき、または、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存在できる。
本発明の文脈において、普通に存在する核酸塩基についての以下の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンをいい、“Ｃ”はシトシンをいい、“Ｇ”はグアノシンをいい、“Ｔ”はチミジンおよび“Ｕ”はウリジンをいう。
用語“操作可能に結合”または“転写制御”は、制御配列と異種核酸配列の間の、異種核酸配列の発現を生じる機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的相関で配置されているとき、第一核酸配列は第二核酸配列と操作可能に結合する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、プロモーターは該コード配列と操作可能に結合する。操作可能に結合したＤＮＡ配列は、互いに隣接していてよく、２個のタンパク質コード領域を合わせることが必要であれば、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、腫瘍内または胸骨内注射あるいは注入法を含む。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似する方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知類似体を含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列は、その保存的修飾変異体(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列ならびに明示的に表示された配列も暗に包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１個以上の選択した(または全)コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている、配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”は交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基を含む化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合により結合した２個以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。ここで使用する本用語は、当分野では通常、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとしても呼ばれる短鎖および当分野で一般にタンパク質と呼ばれる多くのタイプが存在する長鎖の両方をいう。“ポリペプチド”は、例えば、とりわけ、生物活性フラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは天然のペプチド、組み換えペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写に必要な、細胞の合成機構により認識されるまたは合成機構に導入されるＤＮＡ配列をいう。
用語“プロモーター／制御配列”は、該プロモーター／制御配列に操作可能に結合した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列である。ある例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまた遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的様式で発現するものである。
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、細胞のほとんどのまたは全ての生理学的条件下で、該細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列である。
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在するときのみ、該細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列である。
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子によりコードされるまたは特定されるポリヌクレオチドと操作可能に結合したとき、実質的に細胞が該プロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、該細胞に遺伝子産物を産生させる、ヌクレオチド配列である。
ｓｃＦｖの文脈で使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”は、可変重鎖および可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせて使用する、グリシン残基および／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。一つの態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(配列番号３８)(ここで、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０。一つの態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号２９)の複数反復を含む。本発明の範囲にまた含まれるのは、ＷＯ２０１２／１３８４７５号(引用により本明細書に包含させる)に記載されるリンカーである。
ここで使用する５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ぶ)は、転写の開始の直ぐ後に真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに結合した末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は、転写と結びつき、互いに影響し合うように共転写的に起こる。転写の開始の直ぐ後、合成されたｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合するキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャップ形成に必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャップ形成部分を修飾して、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能性を調節できる。
ここで使用する“インビトロで転写されたＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロで転写されたＲＮＡはインビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡの産生に使用される鋳型を含む。
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号３０)、好ましくは６４を超え、より好ましくは１００を超え、最も好ましくは３００または４００を超える。ポリ(Ａ)配列は、化学的または酵素的に修飾して、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡ機能性を調節できる。
ここで使用する“ポリアデニル化”は、ポリアデニリル部分またはその修飾変異体のメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合をいう。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は３’末端でアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合するタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終止、ｍＲＮＡの核からの排出および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写直後に核で起こるが、さらに細胞質でも後に生じ得る。転写が終了した後、ｍＲＮＡ鎖はＲＮＡポリメラーゼを付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は、通常切断部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴づけられる。ｍＲＮＡが切断されたら、アデノシン残基を切断部位の遊離３’末端に付加する。
ここで使用する“一過性”は、数時間、数日または数週の期間の非統合導入遺伝子の発現をいい、ここで、発現の期間は、ゲノムに統合されたまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合の遺伝子の発現期間より短い。
ここで使用する用語“処置”および“処置する”は、１種以上の治療剤(例えば、本発明のＣＡＲのような１種以上の治療剤)の投与によりもたらされる、増殖性障害の進行、重症度および／または期間の減少または改善または増殖性障害の症状の１つ以上(好ましくは、認識できる症状の１つ以上)の改善をいう。特定の態様において、用語“処置”および“処置する”は、必ずしも患者により認識できるものではない、腫瘍の増殖のような増殖性障害の測定可能な物理的パラメータの少なくとも１個の改善をいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、例えば、認識できる症状の安定化により、身体的に、例えば、物理的パラメータの安定化により、生理学的にまたはその両者により増殖性障害進行を阻止することをいう。他の態様において、用語“処置”および“処置する”は、腫瘍サイズまたは癌性細胞数の減少または安定化をいう。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナルの伝達に役割を有する多様なシグナル伝達分子間の生化学的関連性をいう。用語“細胞表面受容体”は、細胞の膜を通してシグナルを受け取り、シグナルを伝達できる分子および分子の複合体をいう。
用語“対象”は、免疫応答を惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
用語“実質的に精製された”細胞は、本質的に他の細胞型を含まない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態では通常関係する他の細胞型と分離されている細胞もいう。ある例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種集団をいう。他の例において、この用語は、単に天然状態では必然的に関係している細胞から分離されている細胞をいう。いくつかの面において、細胞をインビトロで培養する。他の面において、細胞をインビトロで培養しない。
ここで使用する用語“治療”は処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または根絶により得られる。
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の予防または保護的処置を意味する。
用語“癌関連抗原”または“腫瘍抗原”は、完全にまたはフラグメントとして(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)癌細胞の表面上に発現され、癌細胞への薬物の優先的ターゲティングに有用である分子(概してタンパク質、炭水化物または脂質)を交換可能にいう。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と癌細胞の両者により発現されるマーカー、例えば、細胞系譜マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある態様において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較して癌細胞で過発現している、例えば、正常細胞と比較して、１倍過発現、２倍過発現、３倍またはそれ以上過発現している、細胞表面分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、癌細胞において適切に合成されない細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現される分子と比較して欠失、付加または変異を含む分子である。ある態様において、腫瘍抗原は、完全にまたはフラグメント(例えば、ＭＨＣ／ペプチド)として、癌細胞の細胞表面に排他的に合成され、正常細胞の表面に合成または発現されない。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドに結合する抗原結合ドメイン(例えば、抗体または抗体フラグメント)を含むＣＡＲを含む。通常、内在性タンパク質由来ペプチドが主要組織適合抗原複合体(ＭＨＣ)Ｉ型分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)により認識される。ＭＨＣＩ型複合体は、全有核細胞により構成的に発現される。癌において、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の独特なクラスを表す。ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況でのウイルスまたは腫瘍抗原に由来するＴＣＲ様抗体ターゲティングペプチドが記載されている(例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100参照)。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのようなライブラリーのスクリーニングにより同定できる。
用語“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”は、外来核酸を宿主細胞に伝達または導入する過程をいう。“遺伝子導入”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来核酸を遺伝子導入、形質転換または形質導入するものである。細胞は初代対象細胞およびその子孫を含む。
用語“特異的に結合”は、サンプル中に存在する結合パートナー(例えば、腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいい、その抗体またはリガンドはサンプル中の他の分子を実質的に認識しまたは結合しない。
“制御可能キメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、該用語がここで使用される限り、ＲＣＡＲＸ細胞にあるとき、標的細胞、概して癌細胞に特異性を有し、かつ制御可能細胞内シグナル産生または増殖を有するＲＣＡＲＸ細胞を提供し、これがＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる、最も単純な態様においては概して２個の、ポリペプチドのセットをいう。ＲＣＡＲＸ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインに依存して、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞への特異性を提供する。ある態様において、ＲＣＡＲは二量体化スイッチを含み、これは、二量体化分子の存在により、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに連結できる。
“膜アンカー”または“膜係留ドメイン”は、該用語がここで使用される限り、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に固定するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
“スイッチドメイン”は、該用語がここで使用される限り、例えば、ＲＣＡＲに言及するとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合するもの、概してポリペプチドベースのものをいう。該結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合した第一のものおよび第二スイッチドメインに結合、例えば融合した第二のものの機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインを集合的に二量体化スイッチという。いくつかの態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに同一であり、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ばれる。いくつかの態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ばれる。いくつかの態様において、スイッチは細胞内である。いくつかの態様において、スイッチは細胞外である。いくつかの態様において、スイッチドメインはポリペプチドベース、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースのものであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。いくつかの態様において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、ｍｙｃリガンドまたは１個以上のｍｙｃ ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドの多量体である。いくつかの態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
“二量体化分子”は、該用語がここで使用される限り、例えば、ＲＣＡＲに言及するとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。いくつかの態様において、二量体化分子は対象に天然に存在しないか、または顕著な二量体化を生じる濃度で存在しない。いくつかの態様において、二量体化分子は小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
用語“生物学的同等性”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により生じる効果と同等の効果を生じるのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量である。ある態様において、効果は、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価される、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定される、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害により測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定値である。ある態様において、効果は、細胞選別により測定した、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的同等量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同レベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更を達成する量または用量である。
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するとき、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を、完全にではないが、一部阻害する、ｍＴＯＲ阻害剤の用量である。例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害により、ｍＴＯＲ活性を評価する方法をここに記載する。本用量は、完全な免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強には十分である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数の減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加を生じる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、ナイーブＴ細胞数増加を生じる。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の低い、免疫増強用量は、次の１個以上を生じる。
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカー、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１個以上の発現の増加；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
範囲：本開示をとおして、本発明の種々の面を範囲の形式で表し得る。範囲の形式の記載は、単なる便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲の確定的制限と解釈してはならないことは理解すべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲ならびに該範囲内の個々の数値を具体的に開示すると解釈すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６が具体的に開示されていると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分的範囲を含む。これは、範囲の幅と無関係に適用される。
記載
ここに提供されるのは、抗メソテリンキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、例えば、ヒトメソテリンＣＡＲを使用する、癌のような疾患の処置に使用するための組成物および方法である。
一つの面において、本発明は、メソテリンタンパク質への特異的結合のために操作された抗体または抗体フラグメントを含む、多数のキメラ抗原受容体を提供する。一つの面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作された細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、例えば、ここで、ＣＡＲ Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ”)が抗癌特性を示す。一つの面において、細胞はＣＡＲで形質転換されており、ＣＡＲを細胞表面上に発現する。ある態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)はＣＡＲをコードするウイルスベクターを形質導入されている。ある態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)はＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡを遺伝子導入されている。あるこのような態様において、細胞はＣＡＲを一過性に発現し得る。
一つの面において、ＣＡＲのメソテリンタンパク質結合部分はｓｃＦｖ抗体フラグメントである。一つの面において、このような抗体フラグメントは、それが由来するＩｇＧ抗体と等価の結合親和性を保持する、すなわち同等の親和性で同じ抗原と結合する点で機能的ある。一つの面において、このような抗体フラグメントは、当業者により理解される、免疫応答の活性化、その標的抗原から起こるシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性阻害などを含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的ある。一つの面において、ＣＡＲのメソテリン抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントであり、これはヒトであるかまたはそれが由来するｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されている。一つの態様において、ヒト抗メソテリンｓｃＦｖ抗体フラグメントは、表２に提供する軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域またはそれと相当な同一性、例えば、９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
いくつかの面において、本発明の抗体はキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に取り込まれる。一つの面において、ＣＡＲは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２としてここに提供するポリペプチド配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
一つの面において、ＣＡＲのヒトｓｃＦｖ部分は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。一つの面において、本発明のＣＡＲ構築物全体が、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義的コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、異なる種で偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、同一ポリペプチドが多様なヌクレオチド配列によりコードされることを可能とする。多様なコドン最適化方法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示の方法を含む。
一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号３９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４０に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４３に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４４に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４５に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４６に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４７に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４８に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号４９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５０に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５３に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５４に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５５に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５６に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５７に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５８に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号５９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号６０に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号６１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。一つの面において、ヒトメソテリンＣＡＲ分子は、配列番号６２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。
一つの面において、ここに開示されるＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子を合わせる。例えば、いくつかの面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。一つの面において、抗原結合ドメインはメソテリンと結合する。一つの面において、メソテリンＣＡＲは表２に提供される配列を含む。
一つの面において、メソテリンＣＡＲは、ＣＡＲは、配列番号６３〜８６の１個以上に提供される配列から選択される。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６３に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６４に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６５に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６６に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６７に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６８に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号６９に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７０に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７１に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７２に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７３に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７４に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７５に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７６に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７７に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７８に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号７９に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８０に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８１に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８２に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８３に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８４に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８５に提供される配列を含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、配列番号８６に提供される配列を含む。
さらに、本発明は、メソテリンＣＡＲ組成物および、数ある疾患の中でも、癌またはメソテリンを発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍もしくは自己免疫性疾患の処置のための医薬または方法におけるそれらの使用を提供する。
一つの面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作された細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、ここで、ＣＡＲ Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ”)は抗腫瘍特性を示す。好ましい抗原はメソテリンである。一つの面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインはヒト抗メソテリン抗体フラグメントを含む。一つの面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒト抗メソテリン抗体フラグメントを含む。したがって、本発明は、ヒト抗メソテリン結合ドメインを含み、Ｔ細胞またはＮＫ細胞内に設計されるメソテリンＣＡＲおよび養子療法のためのその使用方法を提供する。
一つの面において、メソテリンＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせ以外の１個以上の共刺激分子の少なくとも１個の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
さらに、本発明は、メソテリンＣＡＲ組成物および、数ある疾患の中でも、癌またはメソテリンを発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍もしくは自己免疫性疾患を処置するための医薬または方法におけるそれらの使用を提供する。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、該ＣＡＲはメソテリンに特異的に結合する抗体、例えば、メソテリンに特異的に結合するヒト抗体フラグメンを含む。一つの面において、メソテリンはヒトメソテリンであり、抗体フラグメントの配列は細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含むＣＡＲの一部をいう。
特定の面において、本発明のＣＡＲ構築物は、配列番号３９〜６２からなる群から選択されるｓｃＦｖドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に配列番号１に提供されるような任意的なリーダー配列があってよく、そのあとに配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５に提供されるような任意的なヒンジ配列、配列番号６に提供されるような膜貫通型領域、配列番号７または配列番号８を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、ここで、これらのドメインは単一融合タンパク質を形成するように隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある。また本発明に包含されるのは、配列番号８７；配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。また本発明に包含されるのは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択されるｓｃＦｖフラグメントの各々および配列番号１、２および６〜９のドメインの各々のポリペプチドと、それに加えてコードされる本発明のメソテリンＣＡＲ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。一つの面において、代表的メソテリンＣＡＲ構築物は、任意的なリーダー配列、細胞外メソテリン結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通型ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。一つの面において、メソテリンＣＡＲ構築物は任意的なリーダー配列、メソテリン結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通型ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。ヒトｓｃＦｖドメインを含む具体的メソテリンＣＡＲ構築物は配列番号８７〜１１０として提供される。
完全長ＣＡＲ配列は、ここでは、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５または配列番号８６としても提供される。代表的リーダー配列は配列番号１として提供される。代表的ヒンジ／スペーサー配列は配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５として提供される。代表的膜貫通型ドメイン配列は配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号８として提供される。代表的ＣＤ３ゼータドメイン配列は配列番号９または配列番号１０として提供される。
一つの面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を提供し、ここで、核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある、例えば、ここに記載の抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸配列を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号８７〜１１０の１個以上から選択される。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号８７を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号８８を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号８９を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９０を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９１を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９２を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９３を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９４を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９５を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９６を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９７を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９８を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号９９を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１００を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０１を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０２を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０３を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０４を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０５を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０６を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０７を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０８を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１０９を含む。一つの面において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号１１０を含む。一つの面において、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組み換えＤＮＡ構築物を提供し、ここで、導入遺伝子は、ここに記載する抗メソテリン結合ドメイン、例えば、配列番号８７〜１１０の１個以上から選択されるヒト抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用できる代表的細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの、１個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。一つの面において、本発明のＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１１〜１３４の１個以上から選択される。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１１である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１２である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１３である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１４である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１５である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１６である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１７である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１８である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１１９である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２０である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２１である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２２である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２３である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２４である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２５である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２６である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２７である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２８である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１２９である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１３０である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１３１である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１３２である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１３３である。一つの面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は配列番号１３４である。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準法を使用する、例えば該遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の抽出またはそれを含む細胞および組織からの直接単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、所望の核酸をクローン化よりむしろ合成により製造できる。
本発明は、細胞に直接形質導入できるＣＡＲを発現する、レトロウイルス構築物およびレンチウイルスベクター構築物を含む。本発明はまた、細胞に直接遺伝子導入できる、ＲＮＡ構築物も含む。遺伝子導入において使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、概して５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現すべき核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生する(配列番号３５)。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的に遺伝子導入する。一つの態様において、鋳型は、ＣＡＲのための配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入される。
抗原結合ドメイン
一つの面において、本発明のＣＡＲは、別に抗原結合ドメインとも称す、標的特異的結合エレメントを含む。抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定する抗原のタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識するように選択し得る。
一つの面において、ＣＡＲ介在免疫エフェクター細胞応答は、所望の抗原を発現する細胞に指向でき、ここで、ＣＡＲは該所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一つの面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、メソテリンを標的とする抗原結合ドメインを含む。一つの面において、抗原結合ドメインはヒトメソテリンを標的とする。
抗原結合ドメインは、ラクダ類由来ナノボディの重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)および可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびその機能的フラグメント、および組み換えフィブロネクチンドメインなどのような抗原結合ドメインとして機能することが当分野で知られる代替スキャフォールドを含むが、これらに限定されない抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。ある例において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種に由来するのが有益である。例えば、ヒトで使用するために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を含むのが有益であり得る。それゆえに、一つの面において、抗原結合ドメインはヒト抗体または抗体フラグメントを含む。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、例えば、ここに記載する競合アッセイにおいて、配列番号２７９を含むアミノ酸配列を含む抗原結合ドメイン、例えば、マウスＳＳ１ ｓｃＦｖとヒトメソテリンへの結合について競合しないか、または競合が乏しい。
マウスＳＳ１ ｓｃＦｖのアミノ酸配列を下に示す(配列番号２７９)
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、例えば、ここに記載する競合アッセイにおいて、配列番号４３または配列番号４９から選択される抗メソテリン軽鎖アミノ酸配列のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３ならびに配列番号４３または配列番号４９から選択される抗メソテリン重鎖アミノ酸配列のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインとヒトメソテリンへの結合について競合する。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、例えば、ここに記載する競合アッセイにおいて、配列番号２０３または配列番号２０９から選択されるＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２２７または配列番号２３３から選択されるＬＣ ＣＤＲ２および配列番号２５１または配列番号２５７から選択されるＬＣ ＣＤＲ３；および配列番号１３８または配列番号１４４から選択されるＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１５６または配列番号１６２から選択されるＨＣ ＣＤＲ２および配列番号１７９または配列番号１８５から選択されるＨＣ ＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインと、ヒトメソテリンへの結合について競合する。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、例えば、ここに記載する競合アッセイにおいて、配列番号４３または配列番号４９から選択される配列を含む抗原結合ドメインと、ヒトメソテリンへの結合について競合する。
いくつかの態様において、競合アッセイはＳＰＲベースのアッセイである。概説すると、抗原、例えば、ヒトメソテリンを表面上に固定化する。微小流動系を介して、対照抗体を抗原層上から注入する。対照抗体の抗原への結合により、概して応答単位(ＲＵ)で表すシグナルの増加、例えば、対照シグナルを検出する。所望の時間の後、試験抗体を抗原層上から注入する。試験抗体が抗原上の異なる領域またはエピトープに結合するならば、対照抗体の結合により検出された最高シグナル、例えば、対照シグナルと比較して、さらなるシグナルの増加、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上のシグナル、例えば、ＲＵの増加が検出される。試験抗体が抗原の同じ領域またはエピトープに結合するならば、シグナルの増加はわずかであるか増加はなく、例えば、ＲＵは、対照抗体の結合により検出された最高シグナル、例えば、対照シグナルと比較して、シグナル、例えば、例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満のＲＵの増加が検出される。このＳＰＲベースの競合アッセイを使用したとき、対照抗体の抗原への結合により検出された対照シグナルと比較して、シグナル、例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満のＲＵの増加が検出されたとき、抗体は対照抗体と競合すると言える。対照抗体の抗原への結合により検出された対照シグナルと比較して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上のシグナル、例えば、ＲＵの増加が検出されたとき、抗体は、対照抗体と競合しないかまたは競合が乏しいと言える。
ここに記載する抗原結合ドメインにが結合するエピトープの同定は、当分野で知られる種々の方法によりなされる。例えば、抗原と結合したまたは複合体化した抗原結合ドメインを含む結晶構造が解明され得る。他の例において、抗原のエピトープに貢献する領域を同定するかまたはエピトープを同定するために、アッセイ、例えば、保護アッセイを実施できる。代表的保護アッセイである水素／重水素交換(ＨＤＸ)マススペクトロメトリーアッセイを実施例１８にさらに記載する。ＨＤＸマススペクトロメトリーを実施して、マウスＳＳ１、例えば、配列番号２７９およびここに記載するＭ５ ｓｃＦｖ、例えば、配列番号４３に対する、ヒトＭＳＬＮ上の推定エピトープ、例えば、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８、例えば、配列番号２７８を同定した。ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８、例えば、配列番号２７８は、ヒトメソテリンのアミノ酸２９６〜５８８を表し、例えば、配列番号２７８の最初のアミノ酸はアミノ酸２９６であり、配列番号２７８の最後のアミノ酸はアミノ酸５８８である。ヒトメソテリンのアミノ酸配列、アミノ酸２９６〜５８８を下に提供する(配列番号２７８)：
ＨＤＸマススペクトロメトリーアッセイの結果は、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８の３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９および３６９〜３７５の１個以上のアミノ酸、例えば、配列番号２７８がＳＳ１により認識されるエピトープに貢献することを示した。ＨＤＸマススペクトロメトリーアッセイの結果は、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８の４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７または５４５〜５７２の１個以上のアミノ酸、例えば、配列番号２７８が、ここに記載する抗メソテリン抗原結合ドメイン、例えば、Ｍ５ ｓｃＦｖ、例えば、配列番号４３により認識されるエピトープに貢献することを示した。
一つの態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインは、配列番号２７９を含む配列を含む抗原結合ドメイン、例えば、マウスＳＳ１により標的とされるヒトメソテリンのエピトープと異なるヒトメソテリンのエピトープ、例えば、配列番号２７８に結合する。
一つの態様において、ＳＳ１により認識されるエピトープは、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８のアミノ酸３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９または３６９〜３７５、例えば、配列番号２７８またはこれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む。一つの態様において、ＳＳ１により認識されるエピトープは、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８のアミノ酸３１４〜３１５、３１７〜３１８、３４６〜３４９または３６９〜３７５から選択される１個以上のアミノ酸、例えば、配列番号２７８を含む。
一つの態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインはヒトメソテリンのＣ末端に結合する。一つの態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインは配列番号２７８のアミノ酸４５０〜５８８内のエピトープと結合し、例えば、ここで、エピトープは、一部または全体で、配列番号２７８のアミノ酸４５０〜５８８内、アミノ酸４８０〜５８０内またはアミノ酸４８５〜５７２内に見られる。一つの態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインにより認識されるエピトープは、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８のアミノ酸４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７または５４５〜５７２から選択される配列、例えば、配列番号２７８またはこれらの任意の組み合わせを含む。一つの態様において、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインにより認識されるエピトープは、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８の４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７または５４５〜５７２から選択される１個以上のアミノ酸、例えば、配列番号２７８またはこれらの任意の組み合わせを含む。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、配列番号３９〜６２から選択されるヒト抗メソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)および配列番号３９〜６２から選択されるヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１個以上(例えば、全３個)を含む。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインは、ここに(例えば、表２に)記載する軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、表２に)記載する重鎖可変領域を含む。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、表２のアミノ酸配列の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むｓｃＦｖを含む。ある態様において、抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ｓｃＦＶ)は、表２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１個、２個または３個の修飾(例えば、置換)を有するが、修飾(例えば、置換)が３０個、２０個または１０個を超えないアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインは、配列番号３９〜６２からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号８７〜１１０からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、ヒト抗メソテリン結合ドメインはｓｃＦｖであり、そしてここに、例えば、表２または３に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表２または３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合している。一つの態様において、ヒト化抗メソテリン結合ドメインは(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(配列番号２６)(ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である)を含む。ＳｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域の配向のいずれかであり得る。
一つの面において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号３９〜６２から選択される１個以上の配列を含む。一つの面において、ＣＡＲは配列番号６３〜８６から選択される１個以上の配列である。
一つの面において、本発明の抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、線状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成された多特異性抗体および単離ＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含む、多様な他の形態で存在し得る。一つの面において、ここに提供する抗体フラグメントはｓｃＦｖである。ある例において、ヒトｓｃＦｖは酵母ディスプレイライブラリーに由来してもよい。
ディスプレイライブラリーはコレクションであり、コレクションされているものは、アクセス可能なポリペプチド成分および該ポリペプチド成分をコードするまたは同定する取得可能な成分を含む。ポリペプチド成分は、種々のアミノ酸配列が表されるように変化する。ポリペプチド成分は任意の長さ、例えば３個のアミノ酸〜３００を超えるアミノ酸までであり得る。一つのディスプレイライブラリーは１個を越えるポリペプチド成分、例えば、Ｆａｂの２個のポリペプチド鎖を含み得る。一つの代表的態様において、ディスプレイライブラリーを使用して、抗メソテリン結合ドメインを同定できる。選択において、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド成分をメソテリンまたはそのフラグメントでプローブし、該ポリペプチド成分がメソテリンと結合したならば、ディスプレイライブラリーメンバーを、一般に支持体上に保持させることにより同定する。
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを支持体から取得し、分析する。分析は、増幅と続く類似または相違条件下の選択を含む。例えば、陽性選択と陰性選択が交互であり得る。分析はまたポリペプチド成分、すなわち、抗メソテリン結合ドメインのアミノ酸配列の決定およびさらなる特徴づけのためのポリペプチド成分の精製を含む。
多様な形態をディスプレイライブラリーのために使用できる。例は、ファージディスプレイである。ファージディスプレイにおいて、タンパク質成分は、一般にバクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。該結合は、コートタンパク質に融合したタンパク質成分をコードする核酸の翻訳に由来する。結合は可動性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位または終止コドンの抑制の結果として取り込まれたアミノ酸を含む。ファージディスプレイは、例えば、米国５,２２３,４０９号；Smith (1985) Science 228:1315-1317；ＷＯ９２／１８６１９号；ＷＯ９１／１７２７１号；ＷＯ９２／２０７９１号；ＷＯ９２／１５６７９号；ＷＯ９３／０１２８８号；ＷＯ９２／０１０４７号；ＷＯ９２／０９６９０号；ＷＯ９０／０２８０９号；de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8およびHoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8に記載されている。タンパク質成分をディスプレイするバクテリオファージを、標準ファージ調製法、例えば増殖培地からのＰＥＧ沈殿を使用して、増幅し、取得できる。個々のディスプレイファージ選択後、選択したタンパク質成分をコードする核酸を、選択したファージを感染させた細胞またはファージ自体から、増幅後単離できる。個々のコロニーまたはプラークを選別し、核酸を単離し、配列決定できる。
他のディスプレイ形式は、細胞ベースのディスプレイ(例えば、ＷＯ０３／０２９４５６号参照)、タンパク質−核酸融合体(例えば、米国６,２０７,４４６号参照)、リボソームディスプレイ(例えば、Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30；およびSchaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35)および大腸菌ペリプラズムディスプレイ(J Immunol Methods. 2005 Nov 22;PMID: 16337958)を含む。
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、他の方法を使用して、抗メソテリン結合ドメインを得ることができる。例えば、メソテリンまたはそのフラグメントを、非ヒト動物、例えば、齧歯類における抗原として使用できる。
一つの態様において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ座位の大フラグメントを有する、マウス抗体産生を欠損するマウス株を操作することが可能である。ハイブリドーマテクノロジーを使用して、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体(Ｍａｂ)を産生し、選択し得る。例えば、XENOMOUSETM、Green et al., 1994, Nat. Gen. 7:13-21;米国２００３−００７０１８５号、ＷＯ９６／３４０９６号(１９９６年１０月３１日公開)およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号(１９９６年４月２９日出願)を参照のこと。
ある例において、ｓｃＦｖを、当分野で知られる方法により製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子を、例えば、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を連結することにより製造できる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成のリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含み得る。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカー(例えば、５〜１０アミノ酸)を用いたとき、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、２個の可変領域が一緒になって機能的エピトープ結合部位を形成することを必要とする。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号を参照し、ＷＯ２００７／０２４７１５号を引用により本明細書に包含させる。
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列はアミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)のような、グリシンおよびセリン反復のセットを含む(配列番号１３５)。一つの態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)であり得る。リンカー長の変動は、活性を保持または増強し、活性試験において優れた有効性をもたらし得る。
安定性および変異
抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を対照して評価できる。一つの態様において、ヒトｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて、対照結合分子(例えば従来のｓｃＦｖ分子)より約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃を超えて大きい熱安定性を有する。
抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの改善した熱安定性はその後の全メソテリンＣＡＲ構築物に貢献し、メソテリンＣＡＲ構築物の治療特性を改善させる。抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃改善できる。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して１℃改善した熱安定性を有する。他の態様において、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して２℃改善した熱安定性を有する。他の態様において、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃改善した熱安定性を有する。例えば、ここに開示するｓｃＦｖ分子とｓｃＦｖ ＶＨおよびＶＬの由来となった抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂフラグメントの間で比較できる。熱安定性を当分野で知られる方法を使用して測定できる。例えば、一つの態様において、Ｔｍを測定できる。Ｔｍを測定する方法およびタンパク質安定性を決定する他の方法は下にさらに詳述する。
ｓｃＦｖにおける変異(可溶性ｓｃＦｖの直接変異誘発により発生)は、ｓｃＦｖの安定性を改変し、ｓｃＦｖおよびＣＡＲＴ構築物の全般的安定性を改善する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性を、Ｔｍ、変性温度および凝集温度のような測定を使用してマウスｓｃＦｖと比較する。
一つの態様において、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異した抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖが抗メソテリン構築物の安定性の改善に貢献するように、少なくとも１個の変異を有する。他の態様において、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異した抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖが抗メソテリン構築物の安定性の改善に貢献するように、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の変異を有する。変異体ｓｃＦｖの結合能力は、実施例に記載するアッセイを使用して決定できる。
結合親和性
結合親和性を決定するための多種多様な方法が当分野で知られる。結合親和性を決定する代表的方法は、例えばBIAcore system(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を使用する、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の改変の検出により実時間生体分子特異的相互作用の解析を可能とする、表面プラズモン共鳴を用いる。表面プラズモン共鳴法は、光学的現象である。さらなる記載については、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照のこと。
一つの面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体またはそのフラグメントを含む部分は、ここに記載するアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、ここで、該抗体またはそのフラグメントは、本発明の抗メソテリン抗体フラグメントの所望の機能的特性を保持する。一つの具体的面において、本発明のＣＡＲ組成物は抗体フラグメントを含む。さらなる面において、該抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
種々の面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗体または抗体フラグメントを含む部分は、可変領域の一方または両方(すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１個以上のＣＤＲ領域内および／または１個以上のフレームワーク領域内の１個以上のアミノ酸の修飾により操作される。一つの具体的面において、本発明のＣＡＲ組成物は抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。
本発明の抗体または抗体フラグメントは、アミノ酸配列が異なるように(例えば、野生型から)、しかし、所望の活性は異ならないようにさらに修飾し得ることは当業者には理解される。例えば、“非必須”アミノ酸残基でのアミノ酸置換に至るさらなるヌクレオチド置換を、タンパク質に行ってよい。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換してよい。他の態様において、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順番および／または組成が異なる構造的に類似する鎖で置き換えてよく、すなわち、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている保存的置換を行い得る。
類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
２個以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈での同一性パーセントは、同じである２個以上の配列をいう。２個の配列が、次の配列比較アルゴリズムの一つを使用して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたり比較し、最大一致のために配列したとき、または手動アラインメントおよび目視検査により、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定のパーセンテージ(すなわち、特定の領域、または、特定されていないとき、全配列をとおして６０％同一性、所望により７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性)有するならば、２個の配列は“実質的に同一”である。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長である領域にわたりまたはより好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長である領域にわたり存在する。
配列比較のために、概して一つの配列が対照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できまたは代替パラメータを指定できる。配列比較アルゴリズムは、その後、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のために配列をアラインメントする方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター制御履行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視検査により(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)、実施できる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適するアルゴリズムの二つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２.０アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に利用可能である。
２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定できる。さらに、２個のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comから利用可能)におけるＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して、Blossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用しても決定できる。
一つの面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＣＡＲに含まれる抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬを、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、全ＣＡＲ構築物の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物の種々のドメインの１個以上のアミノ酸配列における修飾を企図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物と少なくとも約７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。
膜貫通型ドメイン
膜貫通型ドメインに関して、種々の態様において、ＣＡＲの細胞外ドメインと結合する膜貫通型ドメインを含むように、ＣＡＲを設計できる。膜貫通型ドメインは、膜貫通型領域に隣接する１個以上の付加的アミノ酸、例えば、膜貫通型ドメインが由来したタンパク質の細胞外領域と関係する１個以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個から最大１５個のアミノ酸)および／または膜貫通型タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域と関係する１個以上の付加的アミノ酸(例えば、細胞内領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個から最大１５個のアミノ酸)を含み得る。一つの面において、膜貫通型ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの一つと関係するものを使用するものであり、例えば、一つの態様において、膜貫通型ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来するのと同じタンパク質由来であり得る。他の面において、膜貫通型ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのいずれかが由来するのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通型ドメインは、このようなドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通型ドメインへの結合を避けるように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択できまたはアミノ酸置換により修飾できる。一つの面において、膜貫通型ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通型ドメインのアミノ酸配列を、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または置換してよい。
膜貫通型ドメインは天然由来または組み換え起源由来であり得る。起源が天然であるとき、ドメインは任意の膜結合または膜貫通型タンパク質から由来し得る。一つの面において、膜貫通型ドメインは、ＣＡＲが標的に結合しているときは常に細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明における特定の用途の膜貫通型ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の、少なくとも膜貫通型ドメインを含み得る。ある態様において、膜貫通型ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃの、少なくとも膜貫通型領域を含み得る。
ある例において、膜貫通型ドメインを、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合できる。例えば、一つの態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ(例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ここに記載するＧＳリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。一つの態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、これからなる)。一つの面において、膜貫通型ドメインは、配列番号６の膜貫通型ドメインを含む(例えば、これからなる)。
一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一つの態様において、ヒンジまたはスペーサーは、次のアミノ酸配列のヒンジを含む。
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、次のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
一つの面において、ヒンジまたはスペーサーはＩｇＤヒンジを含む。例えば、一つの態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。
ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
一つの面において、膜貫通型ドメインを組み換えてよく、この場合、優勢にロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。一つの面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットを、組み換え膜貫通型ドメインの各末端に見ることができる。
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴ−またはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通型ドメインと細胞質シグナル伝達領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは特に適当なリンカーを提供する。例えば、一つの面において、リンカーは
のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、
のヌクレオチド配列によりコードされる。
一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジおよびその一部を含む。
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般にＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１個の活性化を担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の特殊化機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカイン分泌を含む、細胞溶解性活性またはヘルパー活性であり得る。それゆえに用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化機能の実行を指示する、タンパク質の部分をいう。通常全ての細胞内シグナル伝達ドメインを用いることができるが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断型部分が使用される範囲で、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、このような切断型部分を完全な鎖の代わりに使用してよい。それゆえに、用語細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断型部分を含むことを意図する。
本発明のＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体契合後にシグナル伝達を開始するために協力して作用するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列のあらゆる誘導体またはバリアントおよびあらゆる組み換え配列を含む。
ＴＣＲ単独により産生されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を介して抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存的様式で作用するものの、２個の異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列が介在すると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害方向でＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のものを含む。一つの態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一つの態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭドメインと比較して改変された(例えば、増加したまたは減少した)活性を有する修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。一つの態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断型ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１個、２個、３個、４個またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
本発明において特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含んでよく、または本発明のＣＡＲの状況において有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部をいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要である抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１(別名ＰＤ１)、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞残留性および抗腫瘍活性を増強することが証明されている(Song et al. Blood. 2012;119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達ドメインを、無作為のまたは特定の順序で互いに連結してよい。所望により、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の短オリゴ−またはポリペプチドリンカーを、細胞内シグナル伝達ドメイン間に形成し得る。一つの態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。一つの態様において、一アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２個以上の、例えば、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の、共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計する。ある態様において、２個以上の、例えば、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の、共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離されている。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは２個の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計する。一つの面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１６のシグナル伝達ドメインである。一つの面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７のシグナル伝達ドメインである。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計する。一つの面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
のアミノ酸配列を含む。一つの面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
の核酸配列によりコードされる。
一つの面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(メソテリン)または異なる標的への、例えば、異なる抗原結合ドメインを含む第二ＣＡＲ(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を含み得る。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞は、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲおよび第二の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の第一ＣＡＲ上へのおよび一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの第二ＣＡＲ上の配置は、両者の標的が発言される細胞に対するＣＡＲ活性を制限し得る。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲならびにメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。他の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲならびにメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲを含む。
一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞はここに記載するメソテリンＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、またメソテリンを発現する正常細胞上に見られるが、癌細胞には見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインはＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞が２個以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲを発現する細胞は、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと会合を形成しない、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとしての、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを有し得る。
ある態様において、抗原結合ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を含む、単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含む。例は、重鎖可変ドメイン、自然に軽鎖を欠く結合分子、従来の４鎖抗体由来の単一ドメイン、操作ドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメインスキャフォールドを含むが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は当分野のいずれかまたは将来の単一ドメイン分子のいずれかであり得る。ＳＤＡＢ分子はマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されないあらゆる種由来であり得る。この用語はまたラクダ科およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含む。
一つの面において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清で発見された新規抗原受容体(ＮＡＲ)として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来のもののような、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域由来であり得る。ＮＡＲの可変領域由来の単一ドメイン分子(“ＩｇＮＡＲ”)を製造する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909に記載されている。
他の面によって、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えばＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に記載されている。明瞭化のために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子由来のこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、ここでは、ＶＨＨまたはナノボディとして知られる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコに由来し得る。ラクダ科以外の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生する可能性があり、このようなＶＨＨは本発明の範囲内である。
ＳＤＡＢ分子は、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロ産生(例えば、ファージディスプレイにより選択)され得る。
抗原結合ドメインを含む多数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞で、該受容体の複数抗原結合ドメイン間の相互作用が、例えば、１個以上の抗原結合ドメインの同族抗原に結合する能力を阻害するため、望ましくないことがあり得ることも発見されている。したがって、ここに開示されるのは、このような相互作用が最小化された、抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞である。またここに開示されるのは、このような相互作用が最小化された抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸ならびにこのような細胞および核酸の製造法である。ある態様において、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。
ある態様において、本発明は第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲを含み、ここで、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、他方はｓｃＦｖではない。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはナノボディを含む。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ類、サメまたはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はナノボディを含む。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方はラクダ類ＶＨＨドメインを含む。
ある態様において、細胞表面上に提示されるとき、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲの存在により実質的に減少しない。ある態様において、第二ＣＡＲ存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、第二ＣＡＲ非存在下の第一ＣＡＲの抗原結合ドメインのその同族抗原への結合の８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
ある態様において、細胞表面上に提示されるとき、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より低く、互いに結合している。ある態様において、第一ＣＡＲおよび第二ＣＡＲの抗原結合ドメインは、両者がｓｃＦｖ抗原結合ドメインである場合より８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低く互いに結合している。
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、一つの態様において、薬剤はＴ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する分子は阻害分子である。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させる。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。いくつかの態様において、薬剤、例えば、ここに記載する、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ；または例えば、阻害タンパク質または阻害系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害できる。ある態様において、薬剤はｓｈＲＮＡ、例えば、ここに記載するｓｈＲＮＡである。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば阻害する薬剤を、ＣＡＲ発現細胞内で阻害する。例えば、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と結合する。
一つの態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一つの態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータＴまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。一つの態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄球性細胞上に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２個のリガンドは、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により反転させ得る。
一つの態様において、薬剤は、阻害分子の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含み、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)を、膜貫通型ドメインおよび４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような細胞内シグナル伝達ドメインと融合できる(ここではＰＤ１ ＣＡＲとも呼ぶ)。一つの態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、ここに記載するメソテリンＣＡＲと組み合わせて使用するとき、Ｔ細胞の残留性を改善する。一つの態様において、ＣＡＲは、配列番号２４において下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインおよび配列番号２４のアミノ酸１〜２１であるシグナル配列を含むＰＤ１ ＣＡＲである。一つの態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
一つの態様において、Ｎ末端シグナル配列を含まないＰＤ１ ＣＡＲは、下に提供するアミノ酸配列(配列番号２２)を含む。
一つの態様において、薬剤は、Ｎ末端シグナル配列と結合したＰＤ１ ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一つの態様において、ＰＤ１ ＣＡＲの核酸配列を下に示し、下記配列番号２３でＰＤ１ ＥＣＤに下線を付す。
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一つの態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおける抗メソテリン結合ドメインと異なるここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載する、抗メソテリン結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびメソテリン以外の標的(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７、例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
他の面において、本発明は、ここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現する少なくとも１個の細胞を含む集団、および他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または機能を増強する薬剤を発現する第二の細胞集団を提供する。例えば、一つの態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する分子は、阻害分子、例えば、ここに記載する薬剤である。阻害分子は、例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少できる。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。一つの態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。一つの態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載する、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。一つの態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の少なくとも細胞外ドメインの一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。
一つの面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団、例えば、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を、他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。他の面において、本発明は、集団中の少なくとも１個の細胞がここに記載する抗メソテリン結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤を発現する細胞の集団を他の薬剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、方法を提供する。
制御可能キメラ抗原受容体
ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる制御可能ＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望まれる。ＣＡＲ活性を制御できる多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、例えば、誘導性アポトーシス(例えば、Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3;365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全性スイッチとして使用できる。ある面において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準ＣＡＲの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが別のポリペプチドまたはメンバー上に区切られている、最も単純な態様においては概して２個の、ポリペプチドのセットを含む。ある態様において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。
ある面において、ＲＣＡＲは、１)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；２)例えば、ここに記載する、メソテリンを標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーである２個のポリペプチドまたはメンバーを含む。所望により、ＲＣＡＲはここに記載する膜貫通型ドメインを含む。ある態様において、膜貫通型ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは成分がここに記載されているとき、順番は記載したとおりであり得るが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順番は本明細書に示すとおりであるが、他の態様において、順番は異なってよい。例えば、膜貫通型領域の片側上の成分の順番は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの配置は異なって、例えば、逆でよい。
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同じであるとき、ホモ二量体化スイッチであってよく、または、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるとき、ヘテロ二量体化スイッチであってよい。
いくつかの態様において、ＲＣＡＲは“マルチスイッチ”を含み得る。マルチスイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含む。マルチスイッチは、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと無関係に、多数の、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のスイッチドメインを含む。ある態様において、第一メンバーは多数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは多数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１個以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、抗原結合メンバーは１個以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１個以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは多数の、例えば、２個または３個の、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含み、いくつかの態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、次の共刺激シグナル伝達ドメインを細胞外から細胞内方向で含む：４１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４１ＢＢ；４１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４１ＢＢ；または４１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーはＣＤ３ゼータドメインを含む。一つのこのような態様において、ＲＣＡＲは、(１)例えば、ここに記載の、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび２個の共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；および(２)膜貫通型ドメインまたは膜係留ドメインおよび少なくとも１個の一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞の表面上に係留されていないＲＣＡＲを提供する。これにより、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞を、該細胞を抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換することなく、１個以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成させることが可能となる。このような態様において、ＲＣＡＲは、１)第一スイッチドメイン、膜貫通型ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)膜貫通型ドメインまたは膜係留ドメインを含まず、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、例えば、ここに記載の、抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む、抗原結合メンバーを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、３)第二抗原結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインにより結合されるのと異なる抗原と結合する第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーを含み得る。
またここに提供されるのは、抗原結合メンバーが二重特異性活性化およびターゲティング能力を有するＲＣＡＲである。この態様において、抗原結合メンバーは複数の、例えば、２個、３個、４個または５個抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各抗原結合ドメインは標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープと結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインはタンデムであり、所望により、リンカーまたはヒンジ領域を抗原結合ドメインの各々の間に配置する。適当なリンカーおよびヒンジ領域をここに記載する。
ある態様は、増殖のスイッチングを可能にする配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは、１)所望により、膜貫通型ドメインまたは膜係留ドメイン；１個以上の共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択されるおよびスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)スイッチドメインを含まないか、または細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない、例えば、ここに記載の、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含む。ある態様において、抗原結合メンバーは共刺激性シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチを含む。
またここに提供されるのは、ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞である。ＲＣＡＲを発現するように操作されたあらゆる細胞をＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲ Ｔ細胞と呼ぶ。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と呼ぶ。
またここに提供されるのは、ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターである。ＲＣＡＲの多様な成分をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列が同じ核酸、例えば、ベクター上に存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロン性転写産物(単一翻訳産物の切断によりまたは２個の別のタンパク質産物の翻訳により２個のタンパク質を産生できる)の使用により、達成できる。ある態様において、切断可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１ ＩＲＥＳをコードする配列を(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、(ｉ)および(ii)が別のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に結合し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に結合する。
あるいは、ＲＣＡＲの多様な成分をコードする配列を、異なる核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列を第一核酸、例えば、第一ベクター上に配置してよく、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸、例えば、第二ベクター上に存在してよい。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは非共有結合でも、共有結合でもよい。非共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合相互作用を促進する。共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合相互作用を促進する。
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはFK506結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤であるラパマイシンの初期細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大型ＰＩ３Ｋ相同体ＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分な、ＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
いくつかの態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を使用できる。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
いくつかの態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ＦＫＢＰのＦＲＢ結合フラグメント、例えば、次のとおりである配列番号３８２の下線部分を含み得る。
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＰＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、該用語がここで使用される限り、ＦＲＢ結合フラグメントまたはＦＫＢＰ類似体、例えば、ＲＡＤ００１を含み、配列番号３８２または３８３のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸残基を超えては異ならない第一スイッチドメイン；およびＦＫＢＰ結合フラグメントまたはＦＲＢ類似体を含み、配列番号３８４のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するか、または３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸残基を超えては異ならない第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号３８２(または配列番号３８３)に開示するアミノ酸残基を含む一つのスイッチドメインおよび配列番号３８４に開示するアミノ酸残基を含む一つのスイッチドメインを含む。
いくつかの態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１に対して変更された、例えば、増加した親和性を示す修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８での変異から選択される１個以上、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上の変異を含み、ここで、野生型アミノ酸が任意の他の天然に存在するアミノ酸に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２がフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)(例えば、配列番号３８５)またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)(例えば、配列番号３８６)に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＴ２０９８の変異を含み、ここで、Ｔ２０９８はフェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)(例えば、配列番号３８７)に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は任意のアミノ酸への変異であり、Ｔ２０９８は任意のアミノ酸への変異である(例えば、配列番号３８８)。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む(例えば、配列番号３８９)。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含む(例えば、配列番号３４０)。
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供される手引きに従い、このようなスイッチおよび適切な二量体化分子は当業者には明らかである。
二量体化分子
スイッチドメイン間の会合は、二量体化分子により促進される。二量体化分子の存在下、スイッチドメイン間の相互作用または会合は、第一スイッチドメインと結合した、例えば融合した、ポリペプチドと第二スイッチドメインと結合した、例えば融合した、ポリペプチドの間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載するシステムにおいて測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
ラパマイシンおよびラパマイシン類似体(ラパログと呼ばれることもある)、例えば、ＲＡＤ００１を、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択される。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチと使用するのに適するさらなるラパマイシン類似体は、“組み合わせ治療”なる表題の章または“代表的ｍＴＯＲ阻害剤”なる表題のサブセクションにさらに記載する。
ＲＮＡ遺伝子導入
ここに開示されるのは、インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法である。本発明はまた、細胞に直接遺伝子導入できるＣＡＲコード化ＲＮＡ構築物である。遺伝子導入に使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、概して５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現すべき核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生する(配列番号３５)。このように産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的に遺伝子導入する。一つの面において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。
一つの面において、メソテリンＣＡＲはメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。一つの面において、メソテリンＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ Ｔ細胞の産生のためにＴ細胞に導入する。
一つの態様において、インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを、一過性遺伝子導入の形態で、細胞に導入できる。ＲＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により産生した鋳型を使用するインビトロ転写により産生する。あらゆる起源からの所望のＤＮＡを、ＰＣＲにより、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換できる。ＤＮＡの起源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡのあらゆる他の適切な起源であり得る。インビトロ転写用の望ましい鋳型は本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲ用の鋳型は、抗腫瘍抗体の単一鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通型ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通型ドメイン)；および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞質領域を含む。
一つの態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列に由来し得る。一つの態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部あるいは全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。一つの態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは天然に存在する生物に通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。代表的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも、１種を超える生物由来でもよい。
ＰＣＲを使用して、遺伝子導入に使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を含む。用語“実質的に相補的”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるか、または１個以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチドの配列をいう。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される核酸の部分(オープンリーディングフレーム)を増幅するように設計できる。プライマーはまた、所望の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。一つの態様において、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計する。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含む、プライマーである。用語“上流”は、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列に対する位置５’をいう。“逆方向プライマー”は、増幅するＤＮＡ配列の下流である二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含む、プライマーをいう。用語“下流”は、コード鎖に対して増幅するＤＮＡ配列に対する位置３’をいう。
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼをここに開示する方法において使用できる。試薬およびポリメラーゼは多数の業者から商業的に入手可能である。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。一つの態様において、５’ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲ用プライマーの設計を含むが、これに限定されない、種々の方法により変えることができる。この方法を使用して、当業者は、転写されたＲＮＡの遺伝子導入後の最適翻訳効率の達成に必要な５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ長を修飾できる。
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、所望の核酸の天然に存在する、内在性５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲであり得る。あるいは、所望の核酸に内在性ではないＵＴＲ配列を、順方向および逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みによりまたは鋳型の何らかの他の修飾により付加できる。所望の核酸に内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵに富む成分は、ｍＲＮＡの安定性を低下できる。それゆえに、当分野で周知であるＵＴＲの特性に基づき、転写されたＲＮＡの安定性を高めるために３’ＵＴＲを選択または設計できる。
一つの態様において、５’ＵＴＲは、内在性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、上記のように所望の核酸に内在性ではない５’ＵＴＲをＰＣＲにより付加するとき、コンセンサスコザック配列を、５’ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を高め得るが、効率的翻訳を可能にするために全ＲＮＡで必要であるとは考えられない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の必要性は当分野で知られる。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲである。他の態様において、種々のヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲに使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害できる。
遺伝子クローニングを必要とせずに、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成することを可能とするために、転写のプロモーターを、ＤＮＡ鋳型の転写する配列の上流に結合しなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加したとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り込まれることになる。一つの好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列が当分野で知られる。
好ましい態様において、ｍＲＮＡは５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者の上のキャップを有し、これはリボソーム結合、翻訳の開始および細胞における安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない、長い鎖状体産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化したプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されても、真核細胞遺伝子導入に有効ではない正常なサイズのｍＲＮＡをもたらす。
線状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を越えて転写物の３’末端を延長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡへのポリＡ／Ｔ配列の統合は、プラスミドを不安定性とすることがあり、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常で高度に汚染されている理由である。これにより、クローニング手順が労力を要し、かつ時間がかかるだけでなく、しばしば、信頼できないものとなる。これが、ポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型のクローニングを用いない構築を可能とする方法が非常に望ましい理由である。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントを、１００Ｔテイル(配列番号３１)(サイズは５０〜５０００Ｔであり得る(配列番号３２))のようなポリＴテイル含有逆方向プライマーを使用するＰＣＲ中またはＰＣＲ後に、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されない任意の他の方法で産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡを安定性とし、その分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一つの態様において、ポリ(Ａ)テイルは１００〜５０００アデノシン(配列番号３３)である。
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼを用いてインビトロ転写後さらに伸長できる。一つの態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さを１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３４)に伸ばすと、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加となる。さらに、異なる化学基の３’末端への連結はｍＲＮＡ安定性を増加させ得る。このような連結は修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰ類似体を、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り込み得る。ＡＴＰ類似体は、さらにＲＮＡの安定性を高め得る。
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示する方法で産生されたＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当分野で知られ、ここに記載する方法を使用して提供する(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
ここに開示する方法により産生されたＲＮＡはまた配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進するあらゆるウイルス、染色体または人工的に設計した配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような細胞透過性および生存能を促進する因子を含み得る、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質を包含できる。
ＲＮＡを、多数の異なる方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、ＥＣＭ ８３０(ＢＴＸ)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在遺伝子導入、ポリマーカプセル化、ペプチド介在遺伝子導入または“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系を含むが、これらに限定されない商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に導入できる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)。
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明は、本発明のＣＡＲ構築物の１個以上をコードする核酸配列を含む、ＣＡＲ導入遺伝子を提供する。一つの面において、ＣＡＲ導入遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一つの面において、ＣＡＲ導入遺伝子はＤＮＡ構築物として提供される。
したがって、一つの面において、本発明は、抗メソテリン結合ドメイン(例えば、ヒト抗メソテリン結合ドメイン)、膜貫通型ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関する。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ここに記載する抗メソテリン結合ドメイン、例えば、配列番号８７〜１１１からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む抗メソテリン結合ドメインである。一つの態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、膜貫通型ドメインはＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメインである。一つの態様において、膜貫通型ドメインは配列番号６の配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通型ドメインに接続される。一つの態様において、ヒンジ領域は配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、単離核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６およびＰＡＧ／Ｃｂｐを含む。一つの態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列または配列番号８またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号９または配列番号１０の配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。他の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)からなる群から選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号６の配列(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通型ドメイン、配列番号７の配列(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインならびに配列番号９または配列番号１０の配列(またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離ＣＡＲをコードする核酸分子構築物に関する。
他の面において、本発明は、核酸分子によりコードされる単離ポリペプチド分子に関する。一つの態様において、単離ポリペプチド分子は、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、抗メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子に関し、ここで、抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸は配列番号１１１；配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
一つの態様において、コードされるＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。一つの態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。一つの態様において、共刺激ドメインは配列番号７の配列を含む。一つの態様において、膜貫通型ドメインはＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメインである。一つの態様において、膜貫通型ドメインは配列番号６の配列を含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。一つの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは配列番号７の配列および配列番号９の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される。一つの態様において、抗メソテリン結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通型ドメインに接続される。一つの態様において、ヒンジ領域は配列番号２を含む。一つの態様において、ヒンジ領域は配列番号３、配列番号４または配列番号５を含む。
他の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９〜６２からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５のヒンジ領域、配列番号６の配列を有する膜貫通型ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離ＣＡＲ分子に関する。一つの態様において、コードされるＣＡＲ分子は、配列番号６３〜８６からなる群から選択される配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
本発明は、さらに、ＣＡＲ導入遺伝子を含むベクターを提供する。一つの面において、ＣＡＲベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。一つの面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１個以上プラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルス構築物およびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されないベクターである。一つの面において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞またはＮＫ細胞においてＣＡＲ構築物を発現できる。一つの面において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞である。
本発明はまた細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接遺伝子導入できるＣＡＲコード化ＲＮＡ構築物も含む。遺伝子導入に使用するｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、概して５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現する遺伝子およびポリＡテイルを含む構築物を産生する。このように産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的に遺伝子導入できる。一つの面において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。
一つの面において、メソテリンＣＡＲ導入遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。一つの面において、メソテリンＣＡＲをコードするｍＲＮＡ導入遺伝子を、ＣＡＲ Ｔ細胞の産生のためにＴ細胞にまたはＮＫ細胞に導入する。
ベクター
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の、安定な組み込みと娘細胞におけるその伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成する適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような増殖していない細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点がある。低免疫原性というさらなる利点もある。
一つの態様において、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
他の態様において、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピング・ビューティーのようなトランスポゾン、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用して達成できる。例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10:704-716参照。
概要を言うと、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現を、概してＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結し、該構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成する。ベクターは真核生物での複製および組み込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
本発明の発現構築物はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する、核酸免疫化および遺伝子療法にも使用し得る。遺伝子送達のための方法は当分野で知られる。例えば、その全体を引用により本明細書に包含させる、米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
核酸を、多種多様なベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に所望のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供し得る。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１個の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位および１個以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。当分野で知られる方法を使用して、選択した遺伝子をベクターに導入し、レトロウイルス粒子に充填できる。次いで、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達する。多数のレトロウイルス系が当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当分野で知られる。一つの態様において、レンチウイルスベクターを使用する。
さらなるプロモーター成分、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。概して、これらは、開始部位の３０〜１１０bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的成分を含むことが示されている。複数プロモーター成分間の間隔は、複数成分が互いに逆の位置になるかまたは移動したときにプロモーター機能が保護されるように、しばしば柔軟である。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター成分間の間隔は、活性が低下し始める前、５０bp離れるまで増加していてよい。プロモーターによって、個々の成分が転写を活性化するのに協同的または非依存的に機能し得る。代表的プロモーターはＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子を発現できるプロモーターの例は、ＥＦ１アルファプロモーター(ＥＦ１ａまたはＥＦｌα)である。天然ＥＦ１プロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う、伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１プロモーターは哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009)参照。一つの面において、ＥＦ１プロモーターは、配列番号１１に提供される配列を含む。
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に結合したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に結合したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるとき、そのような発現を活性化し、発現が望まれないとき、そのような発現を遮断することができる、分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクターはまた、ウイルスベクターによる遺伝子導入または感染が探索されている細胞の集団から、発現細胞を同定し、選択することを容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。他の面において、選択可能マーカーは、別のＤＮＡの一部で運搬され、共遺伝子導入手順で使用され得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者とも、宿主細胞での発現を可能とするために適切な制御配列に隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、ｎｅｏなどのような、例えば、抗生物質耐性遺伝子を含む。
レポーター遺伝子を、遺伝子導入された可能性のある細胞の同定および制御配列の機能性の評価のために使用する。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在せず、またはこれらにより発現されず、ある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により発現が顕在化するポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、レシピエント細胞にＤＮＡが導入された後適当な時にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479:79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術を使用して製造できるかまたは商業的に得られる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子と連結し、プロモーター駆動転写を調節する薬剤の能力の評価に使用し得る。
一つの態様において、ベクターは、さらに第二ＣＡＲをコードする核酸を含み得る。一つの態様において、第二ＣＡＲは、例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２に対する、抗原結合ドメインを含む。一つの態様において、ベクターは、第一抗原を標的とし、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一ＣＡＲをコードする核酸配列および第二の異なる抗原を標的とし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激シグナル伝達ドメインを有しない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一つの態様において、ベクターは、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲをコードする核酸およびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。他の態様において、ベクターは、メソテリン結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第一メソテリンＣＡＲをコードする核酸およびメソテリン以外の抗原(例えば、間質細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＦＡＰ；前立腺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、アンドロゲン受容体、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤＧＲＦ−β、ＴＡＲＰ、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＡＤ−ＣＴ−１またはＭＡＤ−ＣＴ−２；卵巣癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、Ｔｎ、ＰＲＳＳ２１、ＣＤ１７１、ルイスＹ、葉酸受容体α、クローディン６、ＧｌｏｂｏＨまたは精子タンパク質１７；例えば、肺癌細胞上のメソテリン以外の標的、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＤＬＬ４またはＴｒｏｐ−２)を標的とし、該抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二ＣＡＲをコードする核酸を含む。
一つの態様において、ベクターは、ここに記載するメソテリンＣＡＲをコードする核酸および阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、ＣＬＬも発現する正常細胞上に見られるが、癌細胞には見られない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。一つの態様において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通型ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
一つの態様において、ベクターは、ここに記載するメソテリンＣＡＲをコードする核酸および阻害核酸、例えば、ここに記載する、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法が当分野で知られる。発現ベクターとの関連で、該ベクターは、当分野における任意の方法により宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的または生物学的手段により宿主細胞に導入できる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を産生する方法は当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法は、例えば、リポフェクタミン(Life Technologies)を使用する、リポフェクションである。
所望のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど由来であり得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用される代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用するとき、代表的送達媒体はリポソームである。核酸の宿主細胞(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)への導入のための脂質製剤の使用が意図される。他の面において、核酸は、脂質と結合し得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部に被包されているか、リポソームの脂質二重層に分散されているか、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両者と結合する結合分子によりリポソームに結合しているか、リポソームに封入されているか、リポソームと複合体化しているか、脂質を含む溶液に分散されているか、脂質と混合されているか、脂質と合わされているか、脂質における懸濁液として包含されているか、ミセルに含まれるかまたは複合体化しているかまたは他に脂質と結合していてよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらはミセルのように二重層構造で存在するかまたは“崩壊”構造を有し得る。また、単に溶液中に分散し、恐らくサイズまたは形が均一ではない凝集体を形成していてよい。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質で自然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を有する化合物群およびそれらの誘導体を含む。
使用に適する脂質は業者から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)はSigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Ｃｈｏｉ”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質はAvanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL.)から得られ得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の保存溶液は、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりもはるかに容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される多様な単および多重膜脂質媒体を包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を有する小胞構造を有するとして特徴づけることができる。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたとき、自然に形成される。脂質成分は、自己再編成を受け、その後閉構造を形成し、脂質二重層間に水を捕捉し、溶質を溶解する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5:505-10)。しかしながら、溶液で通常の小胞構造と異なる構造を取る組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造または単に脂質分子の不均一性凝集体として存在することが想定され得る。また考慮されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
外来核酸の宿主細胞への導入に使用するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝すために使用する方法と無関係に、宿主細胞内の組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを実施し得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ；例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)による、または本発明の範囲に入る薬剤を同定するためのここに記載するアッセイによる、特定のペプチドの存在または不在を検出する“生化学的”アッセイを含む。
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。一つの面において、ＣＡＲベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入できる。一つの面において、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクター、例えば、プラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルス構築物およびレンチウイルスベクター構築物の１個以上を含むが、これらに限定されないベクターである。一つの面において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ構築物を発現させることが可能である。一つの面において、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。一つの面において、哺乳動物細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
細胞の起源
増殖および遺伝子修飾前に、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の起源を対象から得る。用語“対象”は、免疫応答を誘発できる生存生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図する。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多数の起源から得ることができる。本発明のある面において、当分野で入手可能なＴ細胞株をいくらでも使用し得る。本発明のある面において、Ｔ細胞は、FicollTM分離のような当業者に知られる方法をいくらでも使用して、対象から採取した血液のユニットから得ることができる。一つの好ましい面において、個体の循環血からの細胞をアフェレシスにより得る。アフェレシス産物は、概してＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球および血小板を含む。一つの面において、アフェレシスにより採取した細胞を洗浄して血漿フラクションを除去し、細胞を次の処理工程のために適切な緩衝液または媒体に入れることができる。本発明の一つの面において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の面において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。カルシウム非存在下の初期活性化工程は、活性化を拡大し得る。当業者が容易に認識するとおり、洗浄工程は、製造業者の指示に従う半自動化“フロースルー”遠心分離(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような当業者に知られる方法により達成し得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇのＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは他の緩衝剤を含むもしくは含まない食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
一つの面において、Ｔ細胞を、赤血球を溶解し、単球を、例えば、PERCOLLTM勾配を介する遠心分離または向流遠心水簸により枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のようなＴ細胞の特定の亜集団を、陽性または陰性選択技術によりさらに単離できる。例えば、一つの面において、Ｔ細胞を、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３×２８)結合ビーズと、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間インキュベーションすることにより単離する。一つの面において、期間は約３０分である。さらなる面において、期間は３０分〜３６時間またはそれより長いおよびその間の全整数値である範囲である。さらなる面において、期間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の好ましい面において、期間は１０〜２４時間である。一つの面において、インキュベーション期間は２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離のために、２４時間のような長いインキュベーション時間の使用が細胞収率を上げ得る。長いインキュベーション時間を、腫瘍組織からの腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の単離または免疫無防備状態個体からの単離のような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない、あらゆる状況においてＴ細胞を単離するために使用し得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕獲効率を上げ得る。それゆえに、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと結合させる時間を単純に短くまたは長くすることによりおよび／またはビーズ対Ｔ細胞比(ここにさらに記載する)を増加または減少することにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または処理中の他の時点に優先的に選択または排除できる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少することにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時にまたは他の所望の時点で優先的に選択または排除できる。複数回の選択も本発明の状況で使用できることを、当業者は認識する。ある面において、選択手順を使用し、活性化および増殖過程において“未選択”細胞を使用することが望ましいことがある。“未選択”細胞もまたさらなる選択に付し得る。
陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性に選択した細胞に特有の表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。一つの方法は、陰性に選択した細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、陰性磁気免疫粘着またはフローサイトメトリーを介する細胞選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、概してＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。ある面において、概してＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を富化するまたは陽性に選択することが望ましいことがある。あるいは、ある面において、Ｔ制御性細胞を、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の類似選択法により枯渇させる。
一つの態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１個以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定できる。
一つの態様において、Ｔ細胞集団はジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないまたはＤＧＫ活性が減少したもしくは阻害された細胞をいう。ＤＧＫ欠損細胞は、例えば、ＤＧＫ発現を減少または阻止するためのＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与による、遺伝学的方法により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処理により産生できる。
一つの態様において、Ｔ細胞集団はＩｋａｒｏｓ欠損である。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないまたはＩｋａｒｏｓ活性が減少したもしくは阻害された細胞をいい、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、例えば、Ｉｋａｒｏｓ発現を減少または阻止するためのＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与による、遺伝学的方法により産生できる。あるいは、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処理により産生できる。
いくつかの態様において、Ｔ細胞集団はＤＧＫ欠損およびＩｋａｒｏｓ欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫ活性およびＩｋａｒｏｓ活性が減少しているかまたは阻害されている。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ欠損細胞はここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
陽性または陰性選択により所望の細胞集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃度は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズと細胞を混ぜ合わせる体積を顕著に低下させる(例えば、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、一つの面において、２０億細胞／mlの濃度を使用する。一つの面において、１０億細胞／mlを使用する。さらなる面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は細胞収率、細胞活性化および細胞増殖の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような所望の標的抗原を弱く発現し得る細胞の、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)からの細胞の、より効率的な捕獲を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高い細胞濃度の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能とする。
関連する面において、細胞の低濃度を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。粒子に結合する所望の抗原を高量発現する細胞でこれを選択する。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋ Ｔ細胞よりも効率的に捕獲される。一つの面において、使用する細胞の濃度は、５×１０ｅ６／mlである。他の面において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
他の面において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で、２〜１０℃または室温で、回転子上でインキュベートし得る。
刺激用Ｔ細胞はまた洗浄工程後凍結し得る。理論に縛られることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団中の顆粒球をおよびある程度の単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況で有用であるが、一つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロースを含む、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む、または３１.２５％Plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロースを含む、または２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、HespanおよびPlasmaLyte Aを含む、他の適当な細胞凍結媒体の使用を含み、次いで細胞を、−８０℃で１°／分の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵する。制御凍結の他の方法ならびに即時に−２０℃でのまたは液体窒素中の未制御凍結を使用できる。
ある面において、凍結保存細胞をここに記載のとおり解凍し、洗浄して、本発明の方法を使用する活性化の前に１時間、室温で休息させる。
本発明の状況においてまた意図されるのは、ここに記載した拡大させた細胞が必要となる前の時点での、対象からの血液サンプルまたはアフェレシス産物の採取である。つまり、拡大させる細胞の起源を必要なあらゆる時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を、ここに記載するようなＴ細胞療法から利益を得るであろう様々な疾患または状態のためのＴ細胞療法にその後使用するために、単離および凍結できる。一つの面において、血液サンプルまたはアフェレシスを、一般に健常な対象から採る。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスを、疾患を発症するリスクがあるが、疾患をまだ発症していない一般に健常な対象から採り、所望の細胞をその後の使用のために単離し、凍結する。ある面において、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後に使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患と診断された直ぐ後に、しかし処置前に患者から単離する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506のような免疫抑制剤、抗体または他のCAMPATH、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228および照射のような他の免疫除去剤のような手段での処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の適切な処置モダリティーの前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン(シクロスポリンおよびFK506)を阻害するか、または増殖因子誘発シグナル伝達(ラパマイシン)に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。さらなる面において、細胞を患者から単離し、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンのような化学療法剤、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドまたはOKT3またはCAMPATHのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせた(例えば、前、同時または後)その後の使用のために凍結する。一つの面において、細胞を前もって単離し、その後の、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後の処置のために凍結できる。
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。これに関して、ある種の癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直ぐ後に、患者が通常処置から回復段階にある期間に、得られたＴ細胞の品質は、恐らくエクスビボで拡大する能力が最適であるかまたは改善していることが観察された。同様に、ここに記載する方法を使用したエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着およびインビボ増殖の強化に好ましい状態であり得る。それゆえに、本発明の状況において、Ｔ細胞、樹状細胞または造血液細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期の間に採取することが意図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)および前処置レジメンを使用して、特に治療後定義された時間枠の間、対象における特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または増殖に好都合である条件を作ることができる。説明的細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
ある態様において、ＮＫ細胞を対象から得る。他の態様において、ＮＫ細胞はＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
同種ＣＡＲ
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＴＣＲを何も発現しないように操作されるか、機能的ＴＣＲを含む１個以上のサブユニットを発現しないように操作されるかまたはその表面にごくわずかな機能的ＴＣＲしか産生しないように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１個以上の変異型または切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現できる。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主に有害免疫反応を誘発しないことを意味する。
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作できる。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作される。
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１個以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、あらゆる適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用する、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
ある態様において、同種細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法により、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。いくつかの態様において、例えば、ここに記載する、阻害核酸、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
ＴＣＲの成分の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２０１２／０３２１６６７号に記載されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２００７／００３６７７３号に記載されている。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたはこのようなセットの反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の発現抑制または変異に使用できるＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系である。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％で見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来性遺伝成分に対する抵抗性を付与し、獲得免疫の一形態を提供する、原核生物免疫系の一タイプである。Barrangou et al. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322:1843-1845。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特異的遺伝子のサイレンシング、促進または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482:331-8。これは、真核細胞に、特別に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１個以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に外来性の配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは、構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質が、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝成分を発現抑制するよう導く。Horvath et al. (2010) Science 327:167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1:7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡと類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
これらが多くの異なるタイプの細菌で天然に存在するため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置ならびにＣａｓ遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は機能的複合体であるＣａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅを保持するスペーサー反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321:960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６はＣＲＩＳＰＲ転写物を処理する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２はひつようとしない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Cas RAMPモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、切断する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系はタンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖それぞれに対する２個の活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集のための系において使用できる。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、それゆえに、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の編集(塩基対の付加または除去)または未成熟終止の導入に使用でき、こうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、あるいはＲＮＡ干渉のように使用でき、可逆性様式でＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を遮断する。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬプロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断できる。
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開公報２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339:819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載された、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する、当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ切断ドメインへの融合により人為的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子の一部を含む任意の所望のＤＮＡ配列と結合するよう操作できる。操作したＴＡＬＥとＤＮＡ切断ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素が産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、ここで、それらをゲノム編集のために使用できる。Boch (2011) Nature Biotech. 29:135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326:1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326:3501。
ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、反復した、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。こうして、これらを所望のＤＮＡ配列と結合するように操作できる。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合させる。ＦｏｋＩの数個の変異がＴＡＬＥＮにおけるその使用のために行われており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、正確な配向および間隔を有する標的ゲノム内の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２個の構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基数および２個の個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8。
ＨＬＡまたはＴＣＲ ＴＡＬＥＮは、二本鎖切断(ＤＳＢ)を産生するために細胞内で使用できる。修復機構が、非相同末端連結により切断を不適切に修復するならば、切断部位に変異を導入できる。例えば、不適当な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列によって、この過程を、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子における欠損を矯正するかまたはｗｔ ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子へこのような欠損を導入し、そうしてＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させるのに使用できる。
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮを、モジュラー成分を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29:149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6:e19509。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼである。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１個以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
亜鉛フィンガーは、１個以上の亜鉛イオンにより安定化された小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含み、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)を産生する多様な選択およびモジュラー組立技術が入手可能である。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。それゆえに、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とするためにＺＦＮの対が必要である。２個の個々のＺＦＮは、適切な間隔のそれらのヌクレアーゼにより、ＤＮＡの逆鎖に結合するはずである。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-5。
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡに二本鎖切断を作ることができ、これは、不適切に修復されたらフレームシフト変異を作り、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量を減少させる。ＺＦＮはまたＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子を変異するための相同組換えと共に使用できる。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲの配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国公開公報２０１１／０１５８９５７号；米国公開公報２０１２／００６０２３０号参照。
細胞の活性化および増殖
細胞を、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国出願公開公報２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して、一般に活性化および増殖できる。
一般に、本発明のＴ細胞を、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルおよびリガンドを刺激する薬剤が結合した表面と接触させることにより、増殖させ得る。特に、Ｔ細胞集団を、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体と接触させることによるまたはカルシウムイオノフォアと合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによるように、ここに記載するように刺激し得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用する。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)を含み、通常当分野で知られる他の方法で可能なように使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激性シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるかまたは表面に結合する。表面に結合するとき、これらの薬剤は、同じ表面(すなわち、“ｃｉｓ”形態)または別の表面(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形態)に結合し得る。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液中にあってよい。一つの面において、共刺激シグナルを提供する薬剤が細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤が溶液中にあるかまたは表面に結合する。ある面において、いずれの薬剤も溶液中にあり得る。一つの面において、薬剤は可溶性形態であってよく、そうしてＦｃ受容体または抗体または薬剤に結合するであろう他の結合剤を発現する細胞のような表面と架橋する。これに関して、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖への使用が考慮される、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)について、米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照。
一つの面において、２個の薬剤は、ビーズに、同じビーズに、すなわち、“ｃｉｓ”にまたは別のビーズに、すなわち、“ｔｒａｎｓ”に固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両薬剤が、当分子量で同じビーズに共固定化される。一つの面において、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のためのビーズに結合した各抗体の１：１比を使用する。本発明のある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１：１比の使用で見られる増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増加が見られるように使用する。一つの具体的面において、１：１の比を使用して見られる増殖と比較して、約１〜約３倍の増加が観察される。一つの面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００およびその間の全整数値の範囲である。本発明の一つの面において、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。本発明のある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。一つの具体的面において、ビーズに結合した１：１００ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一つの面において、ビーズに結合した１：７５ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した１：５０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一つの面において、ビーズに結合した１：３０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一つの好ましい面において、ビーズに結合した１：１０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一つの面において、ビーズに結合した１：３ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。さらなる面において、ビーズに結合した３：１ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激できる。当業者は容易に認識できるように、粒子対細胞の比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小型ビーズは数個の細胞しか結合できないが、大型ビーズは多数結合できる。ある面において粒子対細胞の比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる面において該比は１：９〜９：１を含み、その間の任意の整数値もＴ細胞の刺激に使用できる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は、少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一つの面において、１：１以下の粒子対細胞の比を使用する。一つの具体的面において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞の比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一つの面において、粒子対細胞の比は、一日目は１：１〜１０：１であり、１：１〜１：１０の最終比まで、さらなる粒子を、その後１０日目まで連日または隔日に細胞に添加する(添加日の細胞数に基づく)。一つの具体的面において、粒子対細胞の比は、刺激一日目は１：１であり、刺激３日目および４日目に１：５に調節する。一つの面において、粒子を、刺激一日目の１：１から３日目および４日目１：５の最終比まで、連日または隔日で添加する。一つの面において、粒子対細胞の比は、刺激一日目に２：１であり、刺激３日目および４日目は１：１０である。一つの面において、粒子を、一日目の１：１から刺激３日目および４日目の１：１０の最終比まで、連日または隔日で添加する。多様な他の比が、本発明における使用に適当であり得ることを当業者は認識する。特に、比は、粒子径ならびに細胞のサイズおよびタイプに依存する。一つの面において、使用するための最も典型的な比は、一日目の１：１、２：１および３：１の付近である。
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズと細胞を続いて離し、その後細胞を培養する。別の面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を離さず、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘発する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３×２８ビーズ)をＴ細胞と接触させることにより、ライゲートさせ得る。一つの面において、細胞(例えば、１０４〜１０９個のＴ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ、１：１比)を緩衝液中、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオンを含まない)中で合わせる。再び、当業者は、任意の細胞濃度を使用し得ることを認識する。例えば、標的細胞はサンプルに非常に稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかもしれないし、全サンプル(すなわち、１００％)が所望の標的細胞で構成されているかもしれない。したがって、あらゆる細胞数が本発明の状況において含まれる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混ぜ合わせる体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を増加させる)ことが望ましいことがある。例えば、一つの面において、約２０億細胞／mlの濃度を使用する。一つの面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞の濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlの濃度を使用できる。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖の増加をもたらし得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような所望の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能とする。このような細胞の集団は治療価値を有し得て、ある面において得ることが望まれる。例えば、高細胞濃度を使用して、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能とする。
本発明の一つの面において、混合物を数時間(約３時間)〜約１４日またはその間に入る任意の整数値の時間単位、培養し得る。一つの面において、混合物を２１日培養し得る。本発明の一つの面において、ビーズおよびＴ細胞を、約８日共培養する。一つの面において、ビーズおよびＴ細胞を２〜３日一緒に培養する。Ｔ細胞の培養時間を６０日以上にできるように、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、適切な媒体(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ １５(Lonza))を含み、これは、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦ−βおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加物を含む、増殖および生存能に必要な因子を含み得る。細胞増殖のための他の添加物は、界面活性剤、プラスマネートならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−ｖｉｖｏ １５およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得て、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類が添加され、無血清であるか、または適切な量の血清(または血漿)または定義されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加されている。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養にしか添加せず、対象に注入する細胞の培養には添加しない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)に維持する。
様々な回数刺激に曝されたＴ細胞は異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きなヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目の前までは主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、大きくなり続けるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有益であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されていたら、このサブセットをよりいっそう拡大することが有益であり得る。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞増殖過程の経過中に他の表現型マーカーが顕著に、しかし大部分、再生可能に変わる。それゆえに、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を仕立てる能力を可能とする。
メソテリンＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルで、多様なアッセイを使用して、抗原刺激後Ｔ細胞を拡大させる能力、再刺激非存在下にＴ細胞増殖を持続する能力および抗癌活性のような、しかし、これらに限定されない、分子の活性を評価できる。メソテリンＣＡＲの効果を評価するためのアッセイを下にさらに詳述する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット解析を使用して、単量体および二量体の存在を検出できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。概説すると、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の１：１混合物)を、１０日を超えてインビトロで拡大させ、続いて溶解し、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内在性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合二量体形態の評価を可能とするために、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋ Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーで測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣで刺激し、続いて解析するプロモーターの制御下にＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009参照)。あるいは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物を、を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用して、ＣＡＲをｅＧＦＰと共に発現するバイシストロン性レンチウイルスベクターを使用して１日目にＣＡＲで形質導入する。培養を、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下、ｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)で再刺激し、洗浄する。外来ＩＬ−２を、１００ＩＵ／mlで隔日に培養に添加する。ＧＦＰ＋ Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数え上げる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
再刺激非存在下の持続したＣＡＲ＋ Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。概説すると、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、記載するＣＡＲを１日目に形質導入後、Coulter Multisizer III粒子カウンターを使用して培養８日目に測定する。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。概説すると、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞とメソテリンまたはＣＤ３２およびＣＤ１３７を発現するＫ５６２−メソ、Ｏｖｃａｒ３、Ｏｖｃａｒ８、ＳＷ１９９０、Ｐａｎｃ０２.０３細胞(ＫＴ３２−ＢＢＬ)のような標的細胞を、最終Ｔ細胞：標的細胞比が１：１となるように混合することにより、マイクロタイタープレートで実施する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養に添加し、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を支持するため、Ｔ細胞増殖の陽性対照として役立たせる。製造業者が記載するとおりにCountBrightTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞を培養において数え上げる。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作したＴ細胞を使用して、ＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋ Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞をビオチニル化組み換えメソテリンタンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)により同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して、再刺激２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光をFACScaliburフローサイトメーターを使用して評価し、製造業者の指示に従いデータを解析する。
ここに、例えば、実施例に記載する方法または標準５１Ｃｒ放出アッセイにより、細胞毒性を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。概説すると、標的細胞(例えば、メソテリンを発現するＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞)に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、標的細胞と、ウェル中、完全ＲＰＭＩ中で、種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらに培地のみ(自然放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００洗剤１％溶液(総放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間インキュベーション後、各ウェルからの上清を回収する。次いで、ガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して、遊離５１Ｃｒを測定する。各条件を少なくとも３回実施し、溶解パーセンテージを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出した平均５１Ｃｒである)を使用して計算する。フローベースの細胞毒性アッセイのような代替細胞毒性アッセイも使用し得る。
コメツキムシ赤色およびコメツキムシ緑色ルシフェラーゼを使用して、各々が同じルシフェリン基質を使用するが、可視光線のスペクトルの両端の光を放出するため、腫瘍進行およびＴ細胞輸送を同時に追跡できる。
ここの実施例セクションに記載するものならびに当分野で知られるものを含む他のアッセイも、本発明のメソテリンＣＡＲ構築物の評価に使用できる。
メソテリン発現疾患および障害への治療適用
本発明は、メソテリンと関係する疾患および障害の処置のための組成物および方法を提供する。メソテリンと関係する疾患または障害の例は中皮腫である。
悪性中皮腫は、中皮として知られる体内の臓器を覆う細胞の薄層に生じる癌の一タイプである。中皮腫は３タイプが認識されている。胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫またはＭＰＭ)は、該疾患の最も一般的形態であり、症例の約７０％を占め、胸膜として知られる肺の裏層に生じる。腹膜中皮腫は、腹膜として知られる腹腔の裏層に生じる。心膜中皮腫は、心臓を覆う心膜起源である。
対象がアスベストに曝されているならば、該対象は恐らく中皮腫を発症するリスクがある。アスベストへの暴露およびアスベスト粒子の吸入は中皮腫を起こし得る。大部分の症例で、中皮腫症状は、暴露が生じた後長年経過するまで、アスベストに曝された対象で生じない。
胸膜中皮腫の症状は、例えば、腰痛または側胸痛および息切れを含む。他の症状は、嚥下困難、咳嗽の持続、発熱、体重減少または疲労を含む。患者のいくらかが経験するさらなる症状は、筋肉弱化、感覚能力の喪失、喀血、顔面および腕部腫脹および嗄声である。ステージ１中皮腫のような疾患の初期段階では、症状は穏やかであり得る。患者は、通常胸の一部の治まりそうにない疼痛、体重減少および発熱を報告する。
腹膜中皮腫は、腹部に端を発し、その結果、症状はしばしば腹痛、体重減少、悪心および嘔吐を含む。水分蓄積が腹部にそして癌の結果生じる。腹膜中皮腫は腹部に端を発し、しばしば肝臓、脾臓または腸を含む領域における他の臓器に広がる。重度の腹痛が、患者が最初に経験する最も一般的な訴えである。腹部の水分蓄積による不快感レベルも同様に存在し得る。腹膜中皮腫の他の症状は、排便困難、悪心および嘔吐、発熱および足のむくみを含み得る。
心膜中皮腫は、中皮腫の最も少ない形態である。心膜中皮腫は、名前が示すとおり、心臓が関係する。この稀なタイプの中皮腫癌は、心臓を囲む嚢である心膜を侵す。癌が進行するに連れて、心臓は、体に酸素を効率的に運搬することができなくなり、さらにいっそう加速しながら健康を悪化させる。心膜中皮腫と最も一般的に関係する症状は心臓発作のものによく似ており、悪心、胸痛および息切れである。
本発明の処置により利益を受ける対象は、中皮腫を有する対象または、例えば、ここに記載する症状の１つ以上の存在および／またはアスベストへの暴露を証拠として、中皮腫を有することが疑われる対象である。具体的な態様において、中皮腫は胸膜中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫)である。他の面において、例えば、胸膜プラーク、良性中皮腫または中皮過形成のような前癌状態を有する対象を処置し得る。
メソテリンと関係する疾患または障害の他の例は膵臓癌である。ここに記載する方法で処置できる膵臓癌は、膵外分泌癌および膵内分泌癌を含むが、これらに限定されない。膵外分泌癌は、腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、膠質癌、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、肝様癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞癌、充実性偽乳頭腫瘍、膵管癌および未分化癌を含むが、これらに限定されない。ある態様において、膵外分泌癌は膵管癌である。膵内分泌癌は、インスリノーマおよびグルカゴノーマを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、膵臓癌は、あらゆる初期膵臓癌、非転移膵臓癌、原発性膵臓癌、摘出膵臓癌、進行膵臓癌、局所進行膵臓癌、転移膵臓癌、切除不能膵臓癌、寛解状態膵臓癌、再発性膵臓癌、補助療法における膵臓癌または新補助療法における膵臓癌を含む。ある態様において、膵臓癌は局所進行膵臓癌、切除不能膵臓癌または転移膵管癌である。ある態様において、膵臓癌はゲムシタビンベースの療法に耐性である。ある態様において、膵臓癌はゲムシタビンベースの療法に難治性である。
他の面において、メソテリン発現と関係する障害は卵巣癌である。卵巣癌は、腫瘍組織学により分類される。卵巣上皮性癌としても知られる表面上皮性間質腫瘍は、卵巣癌の最も一般的タイプである。漿液性腫瘍(漿液性乳頭状嚢腺癌を含む)、類内膜腫瘍および粘液性嚢胞腺腫を含む。
ここに記載する方法を使用して、多様なステージ、例えば、ステージＩ、ステージII、ステージIIIまたはステージIVの卵巣癌を処置できる。ステージ分類は、例えば、卵巣癌を摘出するとき行う。卵巣癌は次のとおりステージ分類される。
ステージＩ癌は、一方または両方の卵巣に限局する。卵巣の一方または両方が関与し、子宮および／またはファロピウス管または骨盤内の他の部位に広がっているとき、癌はステージIIである。卵巣の一方または両方が関与し、リンパ節または、腸管のように骨盤の外であるがまだ腹腔にある他の部位または肝臓表面に広がっているとき、癌はステージIII癌である。一方または両方の卵巣が関与し、癌が腹部の外または肝臓内部に広がっているとき、癌はステージIV癌である。
ある態様において、卵巣癌は１個以上の化学療法剤に耐性である。ある態様において、卵巣癌は１個以上の化学療法剤に難治性である。
ここに記載するＣＡＲ組成物で処置できる他の癌は、例えば、脳の癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、リンパ腫、白血病、肺癌(例えば、肺腺癌)、黒色腫、転移黒色腫、中皮腫、神経芽腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、皮膚癌、胸腺腫、肉腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、子宮癌およびこれらの任意の組み合わせを含む。
本発明は、メソテリン発現細胞集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現細胞を含む細胞の集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。特定の態様において、本発明は、メソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。他の態様において、本発明は、メソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、該メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。ある態様において、本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞は、細胞および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージを、中皮腫またはメソテリン発現細胞と関係する他の癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。一つの面において、対象はヒトである。
本発明はまたメソテリン発現細胞と関係する障害(例えば、中皮腫)を予防、処置および／または管理する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明の中皮腫ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一つの面において、対象はヒトである。
本発明は、メソテリン発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。他の態様において、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を有効量の他の治療剤と組み合わせて投与することを含む。
一つの面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞における発現のためのプロモーターに操作可能に結合したメソテリンＣＡＲをコードする配列を含むベクターに関する。一つの面において、本発明は、メソテリン発現腫瘍の処置に使用するためのメソテリンＣＡＲを発現する組み換え免疫エフェクター細胞を提供する。一つの面において、本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞は、メソテリンＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、ＣＡＲ発現細胞が癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように、腫瘍細胞と、その表面に発現される本発明のメソテリンＣＡＲの少なくとも１個を接触させる。
一つの面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、癌の増殖が阻害されるように腫瘍細胞とメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む、メソテリン発現癌細胞の増殖を阻止する方法を提供する。一つの面において、活性化ＣＡＲＴは癌細胞を標的とし、殺す。
一つの面において、本発明は、対象における癌の処置法を提供する。該方法は、対象に、癌が対象で処置されるように、メソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞で処置可能な癌の例は、メソテリンの発現と関係する癌である。一つの面において、メソテリンの発現と関係する癌は、中皮腫、膵臓癌、卵巣癌および肺癌から選択される。
本発明は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝的に修飾され、ＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療を提供する。注入された細胞はレシピエントの腫瘍細胞を死滅させ得る。抗体治療と異なり、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞はインビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期残留性を生じる。種々の面において、患者に投与された細胞またはその子孫は、患者への細胞投与後、患者に少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年残留する。
本発明はまた、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡにより免疫エフェクター細胞が修飾され、該ＣＡＲ発現細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療も含む。注入された細胞は、レシピエントにおける癌細胞を死滅させ得る。それゆえに、種々の面において、患者に投与された細胞は、患者への細胞投与後１ヶ月未満、例えば３週間、２週間、１週間存在する。
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞により惹起される抗癌免疫応答は、受動的または能動的免疫応答であってよく、あるいはまた直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。一つの面において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、メソテリンを発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、バイスタンダー細胞死を仲介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を仲介する。例えば、メソテリン発現腫瘍の不均一な領域内の抗原が少ない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して以前は反応していたメソテリン再指向Ｔ細胞による間接的破壊に感受性であり得る。
一つの面において、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を担持する完全ヒトｓｃＦｖは、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のためのある種のワクチンであり得る。一つの面において、哺乳動物はヒトである。
エクスビボ免疫化に関して、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで次のｉ)細胞の増殖、ii)ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存の少なくとも１つが起こる。
エクスビボ手順は当分野で周知であり、下により詳細に記載する。概説すると、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に修飾(すなわち、インビトロ形質導入または遺伝子導入)する。ＣＡＲ修飾細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに関して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種、同系または異種であり得る。
造血幹細胞および前駆細胞のエクスビボ増殖手順は、本明細書に引用により包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載され、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法が当分野で知られ、それゆえに、本発明は、細胞のエクスビボ増殖の何らかの特定の方法に限定されない。概説すると、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物からの末梢血収集物または骨髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞の回収；および(２)このような細胞のエクスビボでの増殖を含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載されている細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用できる。
エクスビボ免疫化の点で、細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者における抗原に向けられた免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
一般に、ここに記載のように活性化および増殖させた細胞を、免疫無防備状態である個体で生じる疾患の処置および予防に使用できる。特に、本発明のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、メソテリンの発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある面において、本発明の細胞を、メソテリンの発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、メソテリンの発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインもしくは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
本発明はまた、メソテリン発現細胞集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法も提供し、該方法は、メソテリン発現細胞を含む細胞の集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞(例えば、“ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ”とも呼ぶメソテリンＣＡＲＴ)を接触させることを含む。具体的面において、本発明は、メソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。一つの面において、本発明はメソテリンを発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するかまたは減少させる方法を提供し、該方法は、メソテリン発現癌細胞集団と、該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を接触させることを含む。ある面において、本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞は、中皮腫または他のメソテリン発現細胞と関係する癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、細胞および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少させる。一つの面において、対象はヒトである。
本発明はまたメソテリン発現細胞と関係する疾患(例えば、中皮腫)を予防、処置および／または管理する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一つの面において、対象はヒトである。
本発明は、メソテリン発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一つの面において、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の該メソテリン発現細胞と結合する本発明のメソテリンＣＡＲ発現細胞を有効量の他の治療剤と組み合わせて投与することを含む。
組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。ここで使用する“組み合わせて”投与するとは、対象が障害で苦しんでいる最中に、２種(またはそれ以上)の異なる処置剤を該対象に送達する、例えば、２種以上の処置剤を、対象が障害と診断された後でかつ該障害が治癒もしくは根絶されるまたは処置剤が他の理由で中断される前に送達することを意味する。ある態様において、投与の期間に重複があるように、二番目の処置剤の送達が開始されるとき一番目の処置剤の送達はまだ存在している。これは、ここでは“同時”または“併用送達”と称することがある。他の態様において、一つの処置剤の送達は、他の処置剤の送達開始前に終了している。どちらの場合にもある態様において、組み合わせ投与のために処置剤はより有効である。例えば、第二処置剤はより有効であり、例えば、少ない第二処置剤で同等の効果が見られまたは第二処置剤は、第一処置剤非存在下で第二処置剤を投与したときに見られるより大きな程度で症状を改善するまたは同様の状況が第一処置剤で見られる。ある態様において、送達は、症状または障害と関係する他のパラメータの現象が、他の処置剤非存在下で送達した一処置剤で観察されるよりも大きいようなものである。２処置剤の効果は、一部相加的、完全相加的または相加より大きいものであり得る。送達は、第一処置剤送達の効果が、第二剤送達時にまだ検出されているようなものであり得る。
ここに記載するＣＡＲ発現細胞および少なくとも１種のさらなる治療剤を、同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与し得る。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を最初に投与し、さらなる薬剤を次に投与してよく、または投与の順番は逆でよい。
さらなる面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、手術、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506のような免疫抑制性剤、CAMPATH、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療のような抗体または他の免疫除去剤、シトキサン(cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載のようなペプチドワクチンと組み合わせる処置レジメンにおいて使用し得る。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を化学療法剤と組み合わせて使用できる。代表的化学療法剤は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン(decarbazine)、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ(alemtuzamab)、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
組み合わせ治療における使用が考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Blenoxane(登録商標))、ブスルファン(ミレラン(登録商標))、ブスルファン注射(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、シスプラチン(Platinol(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはNeosar(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Cytosar-U(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(DepoCyt(登録商標))、ダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Cosmegan)、塩酸ダウノルビシン(Cerubidine(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(DaunoXome(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Adrucil(登録商標)、Efudex(登録商標))、フルタミド(Eulexin(登録商標))、テザシタビン(tezacitibine)、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(IFEX(登録商標))、イリノテカン(Camptosar(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ELSPAR(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Folex(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎｉｘ(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、タモキシフェンシトレート(ノルバデックス(登録商標))、テニポシド(Vumon(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Tirazone(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Velban(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的アルキル化剤は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン：ウラシルマスタード(Aminouracil Mustard(登録商標)、Chlorethaminacil(登録商標)、Demethyldopan(登録商標)、Desmethyldopan(登録商標)、Haemanthamine(登録商標)、Nordopan(登録商標)、Uracil nitrogen mustard(登録商標)、Uracillost(登録商標)、Uracilmostaza(登録商標)、Uramustin(登録商標)、Uramustine(登録商標))、クロルメチン(Mustargen(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Clafen(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、Procytox(登録商標)、RevimmuneTM)、イホスファミド(Mitoxana(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))、ピポブロマン(Amedel(登録商標)、Vercyte(登録商標))、トリエチレンメラミン(Hemel(登録商標)、Hexalen(登録商標)、Hexastat(登録商標))、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド(Temodar(登録商標))、チオテパ(Thioplex(登録商標))、ブスルファン(Busilvex(登録商標)、ミレラン(登録商標))、カルムスチン(BiCNU(登録商標))、ロムスチン(CeeNU(登録商標))、ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))およびダカルバジン(DTIC-Dome(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなる代表的アルキル化剤は、オキサリプラチン(Eloxatin(登録商標))；テモゾロミド(Temodar(登録商標)およびテモダール(登録商標))；ダクチノマイシン(アクチノマイシン−Ｄとしても知られる、コスメゲン(登録商標))；メルファラン(Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタードとしても知られる、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)としても知られる、Hexalen(登録商標))；カルムスチン(BiCNU(登録商標))；ベンダムスチン(トレアンダ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびミレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(ＣＣＮＵとしても知られる、CeeNU(登録商標))；シスプラチン(ＣＤＤＰとしても知られる、Platinol(登録商標)およびPlatinol(登録商標)-AQ)；クロラムブシル(ロイケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびNeosar(登録商標))；ダカルバジン(ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても知られる、DTIC-Dome(登録商標))；アルトレタミン(ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)としても知られる、Hexalen(登録商標))；イホスファミド(IFEX(登録商標))；Prednumustine；プロカルバジン(Matulane(登録商標))；メクロレタミン(窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロルエタミンとしても知られる、Mustargen(登録商標))；ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))；チオテパ(チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても知られる、Thioplex(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Neosar(登録商標)、Procytox(登録商標)、Revimmune(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(トレアンダ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
代表的ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(以前はデフォロリムスとして知られた、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、AP23573およびMK8669としても知られ、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０６４３８３号に記載)；エベロリムス(アフィニトール(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン(AY22989、シロリムス(登録商標))；セマピモド(simapimod)(CAS164301-51-3)；テムシロリムス(emsirolimus)、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(AZD8055)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(PF04691502、CAS1013101-36-4)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、内部塩(SF1126、CAS936487-67-1)およびXL765を含む。
代表的免疫調節剤は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(Neulasta(登録商標))；レナリドマイド(CC-5013、Revlimid(登録商標))；サリドマイド(Thalomid(登録商標))、アクチミド(CC4047)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、CAS 951209-71-5、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
代表的アントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびルベックス(登録商標))；ブレオマイシン(lenoxane(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Cerubidine(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、DaunoXome(登録商標))；ミトキサントロン(DHAD、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(EllenceTM)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(Mutamycin(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
代表的ビンカアルカロイドは、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Eldisine(登録商標)))；ビンブラスチン(硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても知られる、Alkaban-AQ(登録商標)およびVelban(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(PX-171-007、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(NPI-0052)；クエン酸イキサゾミブ(MLN-9708)；デランゾミブ(CEP-18770)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリナミド(ONX-0912)を含む。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて、対象に投与する。一つの態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲ抗体を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ)を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一つの態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシスの前に投与できる。代表的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスのようなラパログと組み合わせて対象に投与する。一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一つの態様において、ｍＴＯＲ阻害剤を、細胞のアフェレシスの前に投与できる。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載のＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一つの態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一つの態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシスの前に投与できる。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載のタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて対象に投与する。一つの態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムのような、例えば、ここに記載のＳＨＰ−１阻害剤である。一つの態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤、例えば、ここに記載のＳＨＰ−２阻害剤である。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用できる。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載のＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはPD0332991とも呼ぶ)のような、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載のＢＴＫ阻害剤である。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、OSI-027のような、例えば、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、PF-04695102のような、ここに記載のデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤である。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えば、DGKinh1(D5919)またはDGKinh2(D5794)のような、例えば、ここに記載するＤＧＫ阻害剤である。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはHMR-1275、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(PF-02341066)；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(P276-00)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(RAF265)；インジスラム(E7070)；ロスコビチン(CYC202)；パルボシクリブ(PD0332991)；ディナシクリブ(SCH727965)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(BMS387032)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(MLN8054)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(AG-024322)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(AZD5438)；およびXL281(BMS908662)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(PD0332991)であり、パルボシクリブを約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の１日用量で一定期間、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日連日または２１日サイクルの７〜１２日連日投与する。一つの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサイクルのパルボシクリブを投与する。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；およびLFM-A13から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を減少または阻害せず、GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；およびLFM-A13から選択される。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブを、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の１日用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。一つの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサイクルのイブルチニブを投与する。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；AP23573およびMK8669としても知られるリダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート；エベロリムス(RAD001)；ラパマイシン(AY22989)；セマピモド(simapimod)；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(AZD8055)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(PF04691502)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル Ｌ−セリン−(配列番号２７２)、内部塩(SF1126)；およびXL765から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の１日用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。一つの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサイクルのラパマイシンを投与する。一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の１日用量で一定期間、例えば、２８日サイクルで連日投与する。一つの態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサイクルのエベロリムスを投与する。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、CGP052088；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(CGP57380)；セルコスポラミド;ETC-1780445-2；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
一つの態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(PF-04691502)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(PF-05212384、PKI-587)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(BEZ-235)；アピトリシブ(GDC-0980、RG7422)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(GSK2126458)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(NVP-BGT226)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(VS-5584、SB2343)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(XL765)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびFK506)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはOKT3またはCAMPATHのような抗体と組み合わせて(例えば、前、同時または後)患者に投与できる。一つの面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤のようなＢ細胞除去療法、例えば、リツキサンの後に投与する。例えば、一つの態様において、対象を、高用量化学療法剤での標準処置に付し、続いて末梢血幹細胞移植し得る。ある態様において、移植後、対象は、増殖させた免疫本発明の細胞を注入される。さらなる態様において、増殖させた細胞を手術前または後に投与する。
一つの態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ぶ血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)である。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、摂食障害、筋肉痛、関節痛(arthalgias)、悪心、嘔吐および頭痛のような臨床構成上の徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹のような臨床的皮膚徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢のような臨床的消化器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血症のような臨床的呼吸器徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量増加(早期)および潜在的心拍出量低下(後期)のような臨床的心血管徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高ｄ−二量体、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノーゲン血症のような、臨床的凝固徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症のような臨床的腎臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症のような臨床的肝臓徴候および症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態変化、混乱、譫妄、換語困難または明らかな失語症、幻覚、振戦、測定障害(dymetria)、歩調変化および発作のような臨床的神経徴候および症状を含み得る。
したがって、ここに記載する方法は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、さらにＣＡＲ発現細胞での処置の結果としての可溶性因子レベル上昇を管理する１個以上の薬剤を投与することを含む。一つの態様において、対象で上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１個以上である。ある態様において、対象で上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカイン(fraktalkine)の１個以上である。それゆえに、この副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１個以上を中和する薬剤である。一つの態様において、これらの可溶性形態の１個以上を中和する薬剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦ−α阻害剤およびＩＬ−６阻害剤である。ＴＮＦ−α阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような抗ＴＮＦ−α抗体分子である。ＴＮＦ−α阻害剤の他の例は、エタネルセプト(entanercept)のような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦ−α阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(toc)、サリルマブ、エルシリモマブ、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301およびFM101のような抗ＩＬ−６抗体分子または抗ＩＬ−６受容体抗体分子である。一つの態様において、抗ＩＬ−６抗体分子はトシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例はアナキンラである。
ある態様において、対象に、とりわけ、例えば、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンのようなコルチコステロイドを投与する。
ある態様において、対象に、例えば、ノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシンまたはこれらの組み合わせのような昇圧剤を投与する。
ある態様において、対象に、解熱剤を投与し得る。ある態様において、対象に鎮痛剤を投与し得る。
一つの態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性または適応度を増強する薬剤を投与し得る。例えば、一つの態様において、薬剤は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子を阻害する薬剤であり得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する分子は阻害分子である。阻害分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。いくつかの態様において、薬剤、例えば、ここに記載する、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ；または例えば、阻害タンパク質または阻害系、例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害ことができる。ある態様において、薬剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば阻害する薬剤を、ＣＡＲ発現細胞内で阻害する。これらの態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と結合する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現される、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、プロモーター、例えば、Ｈ１−またはＵ６由来プロモーターに操作可能に結合する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500参照。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸分子を含む同じベクター、例えば、レンチウイルスベクターに存在する。このような態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸に対して５’または３’に位置する。Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲのある成分、例えば、全成分をコードする核酸と同じまたは異なる方向で転写され得る。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの成分、例えば、成分の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定に統合される。図４７は、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を伴う、ＣＡＲの成分、例えば成分の全てを含むベクターの例を記載する。
Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子がＰＤ−１である、Ｔ細胞機能を調節するかまたは制御する、例えば、阻害する分子の発現の阻害に有用なｄｓＲＮＡ分子の例を下に提供する。
下の表１６に示すのは、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤の名前(マウスＰＤＣＤ１遺伝子配列NM_008798.2におけるその位置由来)と、ＤＮＡ配列を表す配列番号２８０〜３２７である。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者が、この表では１９量体および２１量体配列として提供される。位置(ＰｏＳ、例えば、１７６)がマウスＰＤＣＤ１遺伝子配列NM_008798.2における位置から導かれることも注意すべきである。配列番号は、“センス１９”配列番号２８０〜２９１；“センス２１”配列番号２９２〜３０３；“アセンス２１”配列番号３０４〜３１５；“アセンス１９”配列番号３１６〜３２７に対応する１２の群で示す。
下記表１７に提供するのは、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(ヒトＰＤＣＤ１遺伝子配列におけるその位置由来)と、ＤＮＡ配列を表す配列番号３２３〜３７０である。センス(Ｓ)およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両者が、１９量体および２１量体配列として表される。配列番号は、“センス１９”配列番号３２８〜３３９；“センス２１”配列番号３４０〜３５１；“アセンス２１”配列番号３５２〜３６３；“アセンス１９”配列番号３６４〜３７５に対応する１２の群で示す。
一つの態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子に結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメント(例えば、イピリムマブ(MDX-010およびMDX-101とも呼ばれ、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、CP-675,206として知られた))であり得る。ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３と結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤はＬＡＧ３と結合する抗体または抗体フラグメントである。
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄球性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２個のリガンドが、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34;Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8;Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１はヒト癌に豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により反転させ得る。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載する本発明のＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(BMS-936558またはMDX1106とも呼ばれる；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全にヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ(クローン５Ｃ４)およびＰＤ−１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示されている。ピディリズマブ(CT-011；Cure Tech)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体はＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、MK03475とも呼ばれる；Merck)は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示されている。MEDI4736(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、リガンドとＰＤ１の相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。MDPL3280A(Genentech／Roche)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。MDPL3280Aおよび他のＰＤ−Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体は米国特許７,９４３,７４３号および米国公開公報２０１２００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤は、YW243.55.S70(重鎖および軽鎖可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および２１に示す)およびＭＤＸ−１１０５(ＢＭＳ−９３６５５９、および、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤とも呼ぶ)を含む。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体は、AMP 514(Amplimmune)、とりわけ、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ−１抗体を含む。
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン−３)も、特にＩＦＮ−ｇ分泌ＣＤ４＋ Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋ Ｔ細胞毒性１細胞におけるＴ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞疲弊に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン−９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(phosphotidylserine)(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は、免疫応答を高める。抗体、抗体フラグメントおよびＴＩＭ３およびそのリガンドの他の阻害剤が当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用できる。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、ＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合し、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ヒト化バージョンのRMT3-23(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン8B.2C12(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異的抗体は、ＵＳ２０１３０１５６７７４に開示されている。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。一つの態様において、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤は抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。代表的抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１号およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４であるか；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に記載のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−５に結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
理論に縛られることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、抗腫瘍免疫応答の阻害に、少なくとも一部、介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３のヘテロ親和性リガンドとして、かつＴＩＭ−３介在Ｔ細胞耐容性および消耗に役割を有するとして記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848参照)。いくつかの態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１とＴＩＭ−３の共遮断は、異種移植結腸直腸癌モデルにおける抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１とＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載のように、Ｔ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と共に使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載する他の癌に対する免疫応答を増強できる。
ＬＡＧ３(リンパ球活性化遺伝子−３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞消耗に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞上に発現される細胞表面分子である。抗体、抗体フラグメントおよびＬＡＧ３およびそのリガンドの他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、BMS-986016(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。IMP701(Immutep)はアンタゴニストＬＡＧ３抗体であり、IMP731(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は、枯渇型ＬＡＧ３抗体である。他のＬＡＧ３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分と、ＭＨＣクラスII分子に結合し、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩｇの組み換え融合タンパク質であるIMP321(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと関係するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載の、例えば、ＣＤ３ゼータの、一次シグナル伝達ドメインを含み得る。一つの態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、メソテリンＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
一つの態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はmiR-17-92である。
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
一つの態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが９０％を超えない、少なくとも１０％であるが９０％を超えない、少なくとも１５％であるが９０％を超えない、少なくとも２０％であるが９０％を超えない、少なくとも３０％であるが９０％を超えない、少なくとも４０％であるが９０％を超えない、少なくとも５０％であるが９０％を超えない、少なくとも６０％であるが９０％を超えないまたは少なくとも７０％であるが９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが８０％を超えない、少なくとも１０％であるが８０％を超えない、少なくとも１５％であるが８０％を超えない、少なくとも２０％であるが８０％を超えない、少なくとも３０％であるが８０％を超えない、少なくとも４０％であるが８０％を超えない、少なくとも５０％であるが８０％を超えないまたは少なくとも６０％であるが８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが７０％を超えない、少なくとも１０％であるが７０％を超えない、少なくとも１５％であるが７０％を超えない、少なくとも２０％であるが７０％を超えない、少なくとも３０％であるが７０％を超えない、少なくとも４０％であるが７０％を超えないまたは少なくとも５０％であるが７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが６０％を超えない、少なくとも１０％であるが６０％を超えない、少なくとも１５％であるが６０％を超えない、少なくとも２０％であるが６０％を超えない、少なくとも３０％であるが６０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが６０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが５０％を超えない、少なくとも１０％であるが５０％を超えない、少なくとも１５％であるが５０％を超えない、少なくとも２０％であるが５０％を超えない、少なくとも３０％であるが５０％を超えないまたは少なくとも４０％であるが５０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが４０％を超えない、少なくとも１０％であるが４０％を超えない、少なくとも１５％であるが４０％を超えない、少なくとも２０％であるが４０％を超えない、少なくとも３０％であるが４０％を超えないまたは少なくとも３５％であるが４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが３０％を超えない、少なくとも１０％であるが３０％を超えない、少なくとも１５％であるが３０％を超えない、少なくとも２０％であるが３０％を超えないまたは少なくとも２５％であるが３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、３５％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％であるが、９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するかまたはそれを提供する。
ここに記載するとおり、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６活性のレベルの低下により、例えば、Ｐ７０ Ｓ６基質のリン酸化の減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、ここに記載する方法で、例えばBoulayアッセイにより評価できる。
代表的ｍＴＯＲ阻害剤
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物もしくはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒的阻害剤である。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体(ラパログとも呼ぶ)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンに構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて多様な番号付けスキームが提唱されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体をここで名づけるとき、式Ａの番号付けスキームを使用したラパマイシンを参照して名づける。
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているＯ置換類似体であり、例えばその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載された、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシン類似体は、２６位または２８位が置換されているものを含む。ラパマイシン類似体は、上記類似体のエピマーであってよく、特に、例えば、その内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のとおり、４０位、２８位または２６位が置換され、所望によりさらに水素化されていてよい類似体のエピマー、例えばゾタロリムスとして知られるABT578またはその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシン類似体、例えばリダフォロリムスとしても知られるAP23573を含む。
ＵＳ５,６６５,７７２号の本発明における使用に適当なラパマイシン類似体の例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロプ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロプ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルベトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されている類似体を含み、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に見られるラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが知られる。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、３９番炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位メトキシ基を欠くシクロペンチル環となるものを含み、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載されている。ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されるおよび／または３２−カルボニルが還元されるように、類似体をさらに修飾できる。
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシン類似体は、１６−デメトキシ−１６−(ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブト−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペント−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシン類似体は、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
他の適当なラパマイシン類似体は、引用によりその内容を本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載されたウミロリムスである。
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、AY-22989)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはCCI-779とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(AP-23573／MK-8669)を含む。アロステリックｍＴＯＲの他の例は、ゾタロリムス(ABT578)およびウミロリムスを含む。
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが知られている。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも有効なｍＴＯＲＣ１阻害剤でもある。
触媒的阻害剤は、BEZ235または２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態(BEZ235の合成は、ＷＯ２００６／１２２８０６号に記載されている)；化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノール；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)を有するCCG168(AZD-8055としても既知、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４)；Ａ Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素を有するPKI-587(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)；化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド；；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)を有するGSK-2126458(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)；(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびKu-0063794(Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ku-0063794は、ラパマイシンの哺乳動物標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。WYE-354は、触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
本発明に有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩または類似体を含む。
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の投与量に基づき、当分野で十分確立された方法を利用して送達用に製剤し得る。特に、ＵＳ特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤に有用な製剤の例を提供する。
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲはキナーゼＰ７０ Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０ Ｓ６キナーゼを活性化し、その基質をリン酸化させる。ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度により表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少による、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性レベルの減少により決定できる。阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤投与前と、阻害剤存在下または阻害剤投与後のＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性(Ｐ７０ Ｓ６キナーゼが基質をリン酸化する能力)を測定することにより、ｍＴＯＲ阻害のレベルを決定できる。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害レベルは、ｍＴＯＲ阻害のレベルを示す。それゆえに、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼが４０％阻害されたら、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性で測定して、ｍＴＯＲ活性は４０％阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与の合間の阻害の平均レベルである。例として、阻害剤を週に１回与えるとき、阻害のレベルは、その合間の、すなわち１週間をとおした阻害の平均レベルを示す。
引用により本明細書に包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではBoulayアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与前後の生物学的サンプルからのＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルを、ｍＴＯＲ阻害剤での処置後、予め選択した時間、例えば、処置の２４時間、４８時間および７２時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からの生物学的サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降により、タンパク質抽出物からＰ７０ Ｓ６キナーゼを単離する。単離したＰ７０ Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定する。単離したキナーゼを４０Ｓリボソームサブユニット基質(Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの内在性基質である)およびガンマ−３２Ｐと、該基質のリン酸化を可能とする条件下でインキュベートできる。次いで、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分割し、３２ＰシグナルをPhosphorImagerを使用して解析する。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化された基質およびＰ７０ Ｓ６キナーゼの活性を示す。キナーゼ活性の増加または減少を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant, Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量化シグナルに割り当て、投与後の値と投与前の値または対照値を比較することにより、計算できる。例えば、キナーゼ活性阻害パーセントを次の式で計算できる：１−(投与後に得た値／投与前に得た値)×１００。上記のとおり、阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与の合間の阻害の平均レベルをいう。
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法もまた、引用により本明細書に包含させるＵＳ７,７２７,９５０号に提供されている。
ｍＴＯＲ阻害のレベルはまた、ＰＤ１陰性細胞対ＰＤ１陽性Ｔ細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性と同定できる。
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤の複数用量を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
本発明は、少なくとも一部、現在臨床の現場で使用されるよりはるかに低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答の増加に優れた効果を有し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加させるという驚くべき発見に基づく。ｍＴＯＲ活性を一部しか阻害しない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善し、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比を増加できることは、驚きであった。
これとは別にまたはこれに加えて、いかなる理論にも縛られることを望まないが、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤が、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に、ナイーブＴ細胞数を増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、また理論に縛られることを望まないが、十分な時間または十分な投与量のｍＴＯＲ阻害剤で処置後、次の１個以上を生じると考えられる。
次のマーカーの１個以上の発現の増加：例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次の特徴の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化のいずれかは、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムの初期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少および／またはＢＣＬ２増加の特徴の１個以上を有する。
ある態様において、本発明は、選択した投与レジメン、例えば、１日１回または週に１回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制には結びつかないが、免疫応答の増強に結びつくｍＴＯＲ阻害のレベルと関係する、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または投薬形態に関する。
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、徐放製剤で投与できる。ここに記載する組成物または単位投与形態のいずれも徐放製剤で提供できる。ある態様において、徐放製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、いくつかの態様において、即時放出製剤に類する治療効果を達成するために、徐放製剤は、即時放出製剤に提供される約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍量の阻害剤を有する。
ある態様において、単位投薬形態あたり０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgを有する、概して週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。ある態様において、両方の形態を週１回投与する。
ある態様において、単位投薬形態あたり０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgを有する、概して１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。
ある態様において、単位投薬形態あたり０.０１〜１.０mgを有する、概して１日１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０３〜３mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.２〜２０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。
ある態様において、単位投薬形態あたり０.５〜５.０mgを有する、概して週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する、徐放形態に対応する。
上記のとおり、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０ Ｓ６キナーゼである。それゆえに、ここに記載する方法および組成物に有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下におけるＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性と比較して、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の８０％を超えない阻害を達成するのに十分である。さらなる面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤の非存在下におけるＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性と比較して、３８％を超えないＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量である。
一つの面において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定して、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％阻害を達成するのに十分である。
対象におけるＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載する方法による、ホスホＰ７０ Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０ Ｓ６レベルの免疫ブロット解析またはインビトロキナーゼ活性アッセイのような、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。
ｍＴＯＲ阻害剤の用量と関連してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の用量の最大±１０％ばらつきをいうが、記載した用量の周辺のばらつきを含まなくてよい。
ある態様において、本発明は、対象に、目標トラフレベル内の投与量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンに関係するトラフレベルより顕著に低い。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症における使用についてＦＤＡが承認した添付文書に従い提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.１〜１０ng／ml、０.１〜０.５ng／ml、０.１〜３ｎｇ／ml、０.１〜２ng／mlまたは０.１〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.２〜１０ng／ml、０.２〜５ng／ml、０.２〜３ｎｇ／ml、０.２〜２ng／mlまたは０.２〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.３〜１０ng／ml、０.３〜５ng／ml、０.３〜３ｎｇ／ml、０.３〜２ng／mlまたは０.３〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.４〜１０ng／ml、０.４〜５ng／ml、０.４〜３ｎｇ／ml、０.４〜２ng／mlまたは０.４〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.５〜１０ng／ml、０.５〜５ng／ml、０.５〜３ｎｇ／ml、０.５〜２ng／mlまたは０.５〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、１〜１０ng／ml、１〜５ng／ml、１〜３ｎｇ／mlまたは１〜２ng／mlの目標トラフレベルを提供する量で投与することを含む。
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または２回の投与の間の最少薬物濃度をいう。
ある態様において、ＲＡＤ００１の目標トラフレベルは、約０.１〜４.９ng／mlである。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml未満、例えば、０.３ng／ml以下〜３ng／mlである。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml未満、例えば、０.３ng／ml以下〜１ng／mlである。
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１の特定した目標トラフレベルと生物学的同等である目標トラフレベルと関係する量で、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を使用できる。ある態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルは、ここに記載するＲＡＤ００１のトラフレベルと同じレベルのｍＴＯＲ阻害(例えば、ここに記載する方法で測定して、例えば、Ｐ７０ Ｓ６の阻害)を示すレベルである。
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
一つの面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載する、さらなる薬剤と組み合わせて投与するために製剤される。
一般に、本発明の化合物は、単独でまたは１種以上の治療剤と組み合わせて、当分野で知られる通常のかつ許容される方法のいずれかにより、上記の治療有効量で投与される。
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の１種以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害剤は、概して薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
本発明の化合物は、医薬組成物として、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、錠剤またはカプセル剤の形で、例えば、経口でまたは、例えば、注射溶液剤または懸濁液剤の形で、非経腸的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形で、局所的にまたは経鼻または坐薬形態で投与できる。ここに記載するようにｍＴＯＲ阻害剤を他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、一つの面において、両方の成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与する。あるいは、他の薬剤を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。
徐放
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食効減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび／または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１での患者のより安全な処置を提供することができる。
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤を提供する。
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたり、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
用語“持続放出”は用語“徐放”(ＳＲ)または“持効性放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第７版)モノグラフおよびＵＳＰの医薬投与形態についての一般的な章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、６０分以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの３０分以内の放出を意味する。
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴づけできる。３７℃でドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００mLリン酸緩衝液ｐＨ６.８で満たした溶解容器で、それぞれＵＳＰ試験モノグラフ７１１および欧州薬局方試験モノグラフ２.９.３.に従い、ＵＳＰに従い、パドル法で、７５rpmで溶解を行う。
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出明細に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０〜６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％
３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載する、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１種以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において、静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物は、処置(または予防)する疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定するが、適切な投与量は臨床試験により決定し得る。
一つの態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯蔵ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される混入物が実質的にない、例えば、検出可能レベルで存在しない。一つの態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびＡ群ストレプトコッカス・ピオゲネスからなる群から選択される少なくとも１種である。
“免疫学的有効量”、“抗癌有効量”、“癌阻止有効量”または“治療量”が示されるとき、投与すべき本発明の組成物の厳密な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態の個々の差異を考慮して、医師が決定できる。ここに記載する免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物を、範囲内の全整数値を含み、１０４〜１０９細胞／kg体重、いくつかの例においては１０５〜１０６細胞／kg体重の投与量で投与できると一般的に述べ得る。免疫エフェクター細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において通常知られる注入法を使用して投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。
ある面において、対象に活性化免疫エフェクター細胞を投与し、その後再び採血(またはアフェレシス実施)し、そこからの細胞を本発明に従い活性化し、患者にこれらの活性化および増殖させた細胞を再注入することが望ましいことがある。この過程は数週毎に複数回実施できる。ある面において、細胞は、１０cc〜４００ccの採血した血液から活性化できる。ある面において、細胞を、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化する。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植または移植を含む、任意の好都合な方法で実施できる。ここに記載する組成物を、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。一つの面において、本発明のＴ細胞組成物を、皮内または皮下注射により患者に投与する。一つの面において、本発明の免疫エフェクター細胞組成物をｉ.ｖ.注射により投与する。免疫エフェクター細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染の部位に直接投与し得る。
特に代表的な面において、対象は、白血球を回収し、エクスビボで富化または枯渇させて所望の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離する、白血球除去を受けてよい。これらのＴ細胞単離物を、当分野で知られる方法で増殖させ、本発明のＣＡＲ構築物の１個以上が導入でき、それにより本発明のＣＡＲ Ｔ細胞が産生されるように処置する。処置を必要とする対象は、その後、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準処置に付され得る。ある面において、移植後または同時に、対象は、拡大させた本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる面において、拡大させた細胞を手術の前または後に投与する。
患者に投与すべき上記処置剤の投与量は、処置する状態の厳密な性質および処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当分野の慣例に従い実施できる。CAMPATHの用量は、例えば、一般に成人患者に対して１〜約１００mgの範囲であり、通常１〜３０日の期間、連日投与する。好ましい１日用量は１日あたり１〜１０mgであるが、いくつかの例においては１日あたり最大４０mgの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
一つの態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用して免疫エフェクター細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)は本発明のＣＡＲ発現細胞の最初の投与と、本発明のＣＡＲ発現細胞の続く１回以上の投与を受け、ここで、続く１回以上の投与は、前回の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に投与する。一つの態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞の１回を超える投与を、１週間あたりに対象(例えば、ヒト)に投与し、例えば、１週あたり本発明のＣＡＲ発現細胞の２回、３回または４回投与量を投与する。一つの態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、１週間あたりＣＡＲ発現細胞の１回を超える投与(例えば、１週間あたり２回、３回または４回の投与)(ここではサイクルとも称す)を受け、その後１週間はＣＡＲ発現細胞投与を投与せず、続いてＣＡＲ発現細胞の１回以上のさらなる投与(例えば、１週間あたりＣＡＲ発現細胞の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)はＣＡＲ発現細胞の１回を超えるサイクルを受け、各サイクル間の時間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日より短い。一つの態様において、ＣＡＲ発現細胞を、１週間あたり３回隔日で投与する。一つの態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
一つの面において、メソテリンＣＡＲ発現細胞を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。この方法で産生したＣＡＲ発現細胞は、安定なＣＡＲ発現を有する。
一つの面において、ＣＡＲ発現細胞は、形質導入後、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクター送達により実施できる。一つの面において、ＣＡＲ ＲＮＡを、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入する。
一つの態様において、用量および／または投薬スケジュールは、図６に提供するものである。
一過性に発現するＣＡＲ発現細胞(特にＣＡＲ発現細胞担持マウスｓｃＦｖを伴う)を使用して処置される患者で起こり得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
理論に縛られないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発症する患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であるはずだと考えられている。抗原への暴露に１０〜１４日間中断があるとき、患者の抗体産生細胞がＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーを起こさない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを起こすと考えられる。
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により産生されるもの)の経過中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生するリスクが高いならば、ＣＡＲ発現細胞注入中断は１０〜１４日間継続してはならない。
ヒト(マウスの代わり)ｓｃＦｖを有するＣＡＲで、抗ＣＡＲ応答を有する患者の可能性および強度を軽減できる。
本発明を、次の実験的実施例を参照してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的とするものであり、特に断らない限り限定的と解釈してはならない。それゆえに、本発明は、次の実施例に限定されると決して解釈してはならず、むしろ、ここに記載する教示の結果として明らかとなるありとあらゆる多様性を包含すると解釈すべきである。
実施例１：ＣＡＲ構築物産生
最終ＣＡＲ構築物に使用するＳｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖライブラリーのパニングから導いた。
ヒトｓｃＦｖフラグメントのアミノ酸配列を上の表２に提供し、ヒトｓｃＦｖフラグメントの核酸配列を上の表３に提供する。完全ＣＡＲ構築物を、完全ＣＡＲ構築物を産生するために、表２のｓｃＦｖフラグメントと、下記配列番号１〜２、６〜７、９〜１０、１２〜１３、１７〜１８、２０〜２１および３６〜３７のさらなる配列を組み合わせて使用して産生した。
・リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１)
・リーダー(核酸配列)(配列番号１２)
・ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号２)
・ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号１３)
・ＣＤ８膜貫通型(アミノ酸配列)(配列番号６)
・ＣＤ８膜貫通型(核酸配列)(配列番号１７)
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号７)
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号１８)
・ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号９)
・ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号２０)
・ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列NM_000734.3)(配列番号１０)
・ＣＤ３ゼータ(核酸配列；ＮＣＢＩ参照配列NM_000734.3)(配列番号２１)
・ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号３６)
・ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号３７)
これらのクローンは全てＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにＱ／Ｋ残基変化を含んだ。
次いで、ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントを、単一コードフレームで完全長ＣＡＲ構築物を行動するためにレンチウイルスベクターにクローン化し、発現のためにＥＦ１アルファプロモーターを使用した(配列番号１１)。
ＥＦ１アルファプロモーター
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２５)
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２６)：この配列は、１〜６“Gly Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２７)
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２８)
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２９)
ポリＡ(配列番号３０)
この配列は５０〜５０００アデニンを含み得る。
ポリＡ(配列番号３１)
ポリＡ(配列番号３２)
この配列は５０〜５０００チミンを含み得る。
ポリＡ(配列番号３３)
この配列は１００〜５０００アデニンを含み得る。
ポリＡ(配列番号３４)
ポリＡ(配列番号３５)
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号３８)：この配列は１〜１０“Gly Gly Gly Ser”反復単位を含み得る
実施例２：ＣＡＲ治療のためのヒト抗メソテリンｓｃＦｖ構築物の発現および特徴づけ
さらなる解析、例えば、マススペクトロメトリー解析、サイズ排除クロマトグラフィーおよび表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)を実施して、ヒト抗メソテリンｓｃＦｖ構築物を特徴づけした。メソテリンの細胞外ドメインに対する結合親和性およびエピトープ結合(ＳＳ１エピトープと比較)をＳＰＲにより決定した。このアッセイおよびこの解析からの結果を下に記載する。
ｓｃＦｖ候補およびビオチニル化ヒトメソテリンの発現
ファージパニングにより同定されたヒト抗メソテリンｓｃＦｖの結合および生物物理学的特徴を評価するために、ｓｃＦｖ構築物をヒトメソテリン細胞外ドメイン(ヒトＭＳＬＮ ＥＣＤ)と共にＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一過性に産生させ、精製した。マウス抗メソテリンｓｃＦｖであるＳＳ１ ｓｃＦｖも対照として産生した。試験したヒト抗メソテリンｓｃＦｖは、Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１およびＭ２３であった(表１４参照)。Ｍ５(配列番号４３)、Ｍ１１(配列番号４９)、Ｍ１２(配列番号５０)、Ｍ１４(配列番号５２)、Ｍ１６(配列番号５４)、Ｍ１７(配列番号５５)、Ｍ２１(配列番号５９)、Ｍ２３(配列番号６１)およびＳＳ１(配列番号２７５)のｓｃＦｖ構築物およびヒトＭＳＬＮ ＥＣＤ(配列番号２７６)のアミノ酸をコードするプラスミドを外的に合成した。ＳｃＦｖを、構築物のＣ末端に７×または８×Ｈｉｓタグを有して産生した。ヒトｓｃＦｖ構築物(Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１およびＭ２３)は、ｓｃＦｖのＣ末端を、８×ＨｉｓタグのＮ末端に結合させる配列ＧＳを含む短リンカー配列、例えば、
(配列番号２７７)を有した。ヒトメソテリンＥＣＤを、インビトロでAvidity, LLCからのＢｉｒＡ酵素で選択的にビオチニル化される部位であった、Ｃ末端Ａｖｉタグ(配列番号２７６)と共に産生した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞での一過性発現および精製を、標準法により実施した。ｓｃＦｖについて、簡単にいうと、３×１０６細胞／mlの１００mlのＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、１００μgプラスミドおよび３００μgポリエチレンイミンを用いて遺伝子導入した。細胞を、３７℃で８％ＣＯ２で、８０rpmで回転させてインキュベートした。６日後、細胞を、３５００ｇで２０分の遠心分離により収集した。ＳｃＦｖを、２００μl Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ(Qiagen)に一夜４℃で結合させることにより上清を精製した。タンパク質を２００μl ３００mMイミダゾールで溶出し、リン酸緩衝化食塩水に対して透析した。
Ｈｉｓタグを有するＳＳ１ ｓｃＦｖの配列を下に提供する
Ｃ末端Ａｖｉタグを有するヒトメソテリンＥＣＤの配列を下に提供する。
マススペクトロメトリー解析
同一性を確認するために、精製ｓｃＦｖを、マススペクトロメトリーと連結した高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ−ＭＳ)で解析した。各１μgを６０℃に加熱したPoros R1/10 ２.１mm×１００mmカラム(Life Technologies)に注入した。Waters BioAcquity UPLCで分離を行った。移動相Ａは０.１％ギ酸であり、移動相Ｂは２５％アセトニトリル中０.１％ギ酸、７５％イソプロパノールであった。ｓｃＦｖを、１５分で２５〜５０％移動相Ｂの勾配を使用して０.５mL／分で溶出させた。マススペクトロメトリー検出を、２０〜５０Ｖのコーン電圧傾斜で６００〜４０００ｍ／ｚをスキャンするエレクトロスプレー陽イオンモードで操作するWaters Xevo-Tof装置で行った。得られたマススペクトルをピーク幅にわたり平均化し、WatersからのMaxEnt1アルゴリズムを使用してデコンボリューション処理して、発現ｓｃＦｖの質量を決定した。
サイズ排除クロマトグラフィー解析
サイズ排除クロマトグラフィーを、発現ｓｃＦｖのオリゴマー化状態を決定するために実施した。各２５μgを３５℃に加熱したTSKGel Super SW3000 ４.６mm×３００mmカラム(Tosoh Bioscience)に注入した。ｓｃＦｖを、７５０mMアルギニン、１mM ＥＤＴＡ、２０mM リン酸ナトリウム、２５０mM 塩化ナトリウム、ｐＨ７.２中、０.３mL／分で溶出し、ＵＶ吸光度を２８０nmでモニターした。
表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)
精製ｓｃＦｖの結合親和性を、Biacore T200系で測定した。簡単にいうと、組み換えヒトビオチニル化メソテリンＥＣＤを、１５０ＲＵ密度でストレプトアビジン(ＳＡ)センサーチップ表面に固定化した。精製ｓｃＦｖを、定常流速下のチップ上に、３倍連続希釈で注入した。タンパク質複合体の会合速度および解離速度を、それぞれ２７０秒および４００秒モニターした。二重参照をブランク固定化流動細胞および緩衝液ブランクに対して実施した。親和性を、可能であればLangmuir １：１結合モデルで決定し、速いオン・オフ速度のために正確なフィッティングが不可能であるｓｃＦＶｓについて、定常モデルを使用した。
ＳＳ１の比較におけるｓｃＦｖの各々の相対的結合エピトープを決定するために、５０nM ＳＳ１を、１８０秒の接触時間でストレプトアビジンセンサーチップ上に固定化したビオチニル化メソテリンＥＣＤにより捕獲し、７０ＲＵの相対密度を得た。１００nMの精製ｓｃＦｖ(Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１またはＭ２３)を、ＳＳ１／メソテリン複合体の解離を最小とするために直後にチップ上に注入した。二次ｓｃＦｖの結合を２７０秒モニターした。
結果
ＨＰＬＣ−ＭＳで決定したｓｃＦｖの観察された質量は、アミノ酸配列に基づく理論値と一致した。発現したｓｃＦｖは、分析的サイズ排除クロマトグラフィーに基づき、４３％単量体から＞９８％単量体の範囲であった。選択したｓｃＦｖは、メソテリンＥＣＤに対して０.１nMの見かけの親和性を有したＳＳ１対照ｓｃＦＶと比較して、０.９nMから１１４nMの広い範囲の親和性の示した(表１４)。ＳＳ１、Ｍ５およびＭ１１の代表的ＳＰＲセンサーグラムを、それぞれ図４１Ａ、ＢおよびＣに示す。
相対的エピトープビニング(図４２)は、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１、Ｍ２３がヒトメソテリンに対してＳＳ１の競合的結合剤であるが、Ｍ５およびＭ１１は、アッセイでその注入により応答が増加したことから判断して、独特なエピトープに結合すると考えられる。
１高凝集体含量／低％単量体は、潜在的アビディティー効果により、あまり正確でない親和性決定となり得る。
２親和性は、可能であれば１：１結合モデルで決定し、速いオン・オフ速度のために正確なフィッティングが不可能であるｓｃＦｖについて、定常モデルを使用した。
３測定せず、低濃度は、単量体％の正確な決定を不可能にした。
実施例３：ＣＡＲＴを担持するヒトｓｃＦｖの解析およびインビトロ活性
抗ＭＳＬＮ抗体の単一鎖可変フラグメントを、ＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢ共刺激分子と共にレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローン化し、最適構築物を、ＭＳＬＮ発現(“ＭＳＬＮ＋”)標的に対する応答におけるＭＳＬＮ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ”または“ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ Ｔ細胞”)のエフェクターＴ細胞応答の質および量に基づき選択する。エフェクターＴ細胞応答は、細胞拡大、増殖、倍増、サイトカイン産生および標的細胞致死または細胞溶解性活性(脱顆粒)を含むが、これらに限定されない。
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮの産生
ヒトｓｃＦｖコード化レンチウイルス導入ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質の産生に使用する。レンチウイルス導入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン試薬と組み合わせたＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖの３個のパッケージング成分と混合し、これらをＬｅｎｔｉ−Ｘ ２９３Ｔ細胞(Clontech)に一緒に遺伝子導入した。
３０時間後、培地を回収し、濾過し、−８０℃で保存した。治療用ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮを、ナイーブＴ細胞を、Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の陰性選択により得る、正常アフェレシスドナーからの血液から出発して産生する。これらの細胞を、１：３比のＣＤ３×２８ビーズ(Dynabeads(登録商標)Human T-Expander CD3/CD28, Invitrogen)により、ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２mM Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μM 非必須アミノ酸、１mM ピルビン酸Ｎａ、１０mM Ｈｅｐｅｓおよび５５μM ２−メルカプトエタノール中、３７℃、５％ＣＯ２で活性化した。Ｔ細胞を、２４ウェルプレートのウェルあたり、０.５mL培地中１×１０６ Ｔ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞をブラスティングし、０.５mLの非濃縮ウイルス上清または少ない体積の濃縮ウイルス上清を添加する。Ｔ細胞は、対数増殖パターンで分裂し始め、これを、１mLあたりの細胞数の測定によりモニターし、Ｔ細胞を２日毎に新鮮培地で希釈する。Ｔ細胞が約１０日後に休み始めるため、対数増殖は衰退する。増殖速度の減速と、約３００flに近づくＴ細胞サイズの組み合わせにより、Ｔ細胞の状態が、その後の解析のために凍結保存すべきであると決定する。
凍結保存前に、形質導入された(細胞表面にメソテリン特異的ＣＡＲ発現)細胞のパーセンテージおよびその発現の相対的蛍光強度を、FACS-CantoIIまたはFACS Fortessaでのフローサイトメトリー解析により決定した。そのＦＡＣＳからの相対的蛍光強度のヒストグラムプロットの比較は、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示した。ウイルス形質導入は、形質導入された細胞のパーセントである形質導入効率と相関する同等な発現レベルを示す。結果は、非形質導入Ｔ細胞(“ＵＴＤ”)およびＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮと比較したとき、正常に増殖する細胞の能力に対して、ＣＡＲ−ＭＳＬＮ担持ヒトｓｃＦｖには検出可能な負の作用がないことを示す。
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ再指向Ｔ細胞の細胞溶解性活性およびサイトカイン分泌の評価
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ Ｔ細胞が細胞を殺し、サイトカインを分泌する機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一夜回復させた。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮに加えて、マウスｓｃＦｖを担持するＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ“ＳＳ１”(ＷＯ２０１３／０４０５７７号参照)を対照として使用した。対照ＳＳ１ ｓｃＦＶ担持ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ(ＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮとも称す)を、アッセイのばらつきを比較するためおよび／または対照として働かせるために、全アッセイで使用した。ＳＳ１ ｓｃＦＶ担持ＣＡＲ Ｔ細胞、ならびに全ての他のヒトｓｃＦｖ担持ＭＳＬＮ−ＣＡＲＴをリサーチグレード(すなわち、臨床グレードではない)製造条件で産生した。ＣＤ１９−ＢＢｚまたはＩｓｏ１−ＢＢｚを、背景ＣＡＲＴ効果のための非ターゲティングＣＡＲとして使用した。
Ｔ細胞致死は、慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２に向けた。Ｋ６５２ ＭＳＬＮ＋(Ｋ５６２−メソ)細胞を形質導入により産生した。非ＭＳＬＮ発現Ｋ５６５２を対照として使用した。フローベースの細胞毒性アッセイのために、標的細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(ＣＳＦＥ)で染色し、その存在を定量する。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮの細胞溶解性活性を、１０：１、３：１および１：１のエフェクター：標的細胞比のタイトレーションで測定し、ここで、エフェクターは、抗ＭＳＬＮキメラ受容体を発現するＴ細胞として定義された。適切な数のＴ細胞と、一定数の標的細胞の混合によりアッセイを開始した。２０時間後、プレートを遠心分離し、各混合物の総量を除いた。各ウェルに残った細胞ペレットを洗浄し、細胞を生存／死マーカー７ＡＡＤで染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を予定した数のカウントビーズと共に特定の体積に再懸濁した。細胞染色データをCantoIIフローサイトメトリーで採取し、結果を定量化するためのビーズを使用してFloJoソフトウェアで解析した。
ＣＳＦＥ標識Ｋ５６２(図３Ａ、非発現ＭＳＬＮ対照)およびＫ５６２−メソ(図３Ｂ、ＭＳＬＮを発現させるために形質導入したＫ５６２細胞)を標的とするエフェクターＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞を用いるエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比のタイトレーションを使用する２０時間フローベースの致死アッセイのプロット。これらの致死曲線を比較して、エフェクター細胞の量のタイトレーションは、これらのＭＳＬＮ発現細胞が破壊されることを示す。同じドナーに由来し、ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ−ＭＳＬＮ細胞またはＳＳ１ ＣＡＲ−ＭＳＬＮ細胞で形質導入したＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋標的を選択的に死滅させることができた。全てのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞の細胞溶解性活性は類似し、マウスＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮと同等である。全てのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞が、形質導入によりメソテリン反応性となり、高レベルのメソテリンを発現する標的細胞を死滅させる能力を獲得することを示す。ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮのサイトカイン産生を測定するために、細胞を解凍し、一夜回復させた。ヒト化ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮに加えて、ＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ(マウスｓｃＦｖ)を比較目的で使用した。ＣＤ１９−ＢＢｚ ＣＡＲＴを、背景ＣＡＲ Ｔ細胞効果のための非ターゲティング対照として使用した。アッセイのばらつきを比較するために、ＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮを全アッセイで使用した。Ｔ細胞は、慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２(ＭＳＬＮ＋およびＭＳＬＮの両者)、ＭＬＳＮ発現卵巣癌細胞株Ｏｖｃａｒ８および膵臓癌株ＳＷ１９９０およびＰａｎｃ０２０３を指向した。フローサイトメトリーによりＭＳＬＮ発現を解析するとき、ＭＳＬＮ＋ Ｋ５６２細胞と比較して、Ｏｖｃａｒ８でのＭＳＬＮ発現が１０倍低く、ＳＷ１９９０の発現がＯｖｃａｒ８より１０倍低いことを検出した。Ｐａｎｃ０２０３上のＭＳＬＮ発現はフローサイトメトリーで検出不可能であったが、ＲＮＡ解析では陽性であった。さらに、ＰＭＡ／イオノマイシンを使用して、Ｔ細胞が内在性免疫学的シグナルに応答する能力を評価した。このアッセイは、１：１のエフェクター：標的比のみ試験する。このアッセイを、ヒトサイトカイン検出用ＩＦＮ−γ ＣＢＡ−Ｆｌｅｘキットを使用するサイトカイン解析のために培地を除くときである、細胞の混合後２４時間実行する。
ＭＳＬＮを発現しない対照Ｋ５６２細胞に曝した後にＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞から産生されるサイトカインの背景レベルを解析した。ＰＭＡ／イオノマイシンでのＴ細胞刺激による潜在的サイトカイン分泌は、該細胞集団がサイトカインを分泌する能力に多少可変性があることを示す。最大放出(ＰＭＡ／イオノマイシン)に対して特定のＩＦＮ−γ放出を標準化することにより差異に対処した。
データは、ＭＳＬＮを過発現するＫ５６２と培養したとき、大部分のヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮおよびマウスＳＳ１ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮがＩＦＮ−γを産生したことを示す。ＭＳＬＮを(低レベルで)内因性に発現する癌細胞と培養したとき、数個のＣＡＲＴしか応答しなかったが(Ｍ５、１１、１４、１５、１６、１７およびＳＳ１)、ＣＡＲＴ Ｍ５およびＭ１１の２個は優れたＩＦＮ−γレベルを示した。低い内在性ＭＳＬＮレベルは、腫瘍細胞上の自然に発現されるメソテリンのレベルを良好に反映しているはずであるため、これらのｓｃＦＶを有するＣＡＲＴは、ＳＳ１構築物を有するＣＡＲＴより増強された治療応答を有するはずでる。
実施例４：レンチウイルス産生ＣＡＲＴの臨床試験
重篤な上皮性卵巣癌、悪性胸膜中皮腫または膵臓癌のようなメソテリンを発現する癌を有するものから患者を選択する。
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞の製造および放出試験は、University of PennsylvaniaのClinical Cell and Vaccine Production(ＣＶＰＦ)により実施する。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ産物は、患者のアフェレシス産物から製造する。
約１０リットルアフェレシス手順を、University of Pennsylvania Apheresis centerで実施する(最初のＣＡＲ Ｔ細胞投与４週間前)。患者からのＰＢＭＣを、この手順の間にＣＡＲ Ｔ細胞のために得る。一回白血球除去から、目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するための少なくとも５×１０９個の白血球の収集である。ＦＤＡ顧視要求および治験のためのベースライン血液の白血球を得て、凍結保存する。メソテリン修飾Ｔ細胞産物は、約４週間後放出の準備ができていると予測される。
レンチウイルス産生ＣＡＲＴを、各患者から単離した細胞、すなわち、自己Ｔ細胞を使用して、実施例２に記載のように製造した。各患者Ｔ細胞から製造したＣＡＲＴ−ＭＳＬＮはヒトｓｃＦｖ(Ｍ５およびＭ１１を含む)またはＳＳ１を発現する。
細胞培養の細胞に、細胞を、バッグ内の不融性凍結保存用培地で凍結保存する。用量は、全細胞における２〜５０％形質導入細胞の範囲で計算して、コホート１について１〜５×１０７ ＣＡＲ Ｔ細胞、コホート２および３について１〜５×１０８ ＣＡＲ形質導入細胞である。自己修飾ＣＡＲ Ｔ細胞産物を含むバッグを、Hospital of University of PennsylvaniaのＣＶＰＦで、制御され、監視された冷凍庫に保存する。必要となるまで、輸液バッグを冷凍庫に保存する。
各用量を、形質導入効率の関数である総細胞数に依存する体積で、包装し、１個の輸液バッグに凍結保存し、最少体積は、バッグあたり１０mLである。各バッグは、凍結保存用培地のアリコート(体積は総細胞用量に依存)を含む。
コホート１対象(Ｎ＝３〜６)は、０日目に単一均一静脈内用量の自己１〜５×１０７ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞を受ける。コホート２対象(Ｎ＝３〜６)は、０日目に単一均一静脈内用量の自己１〜５×１０８ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞を受ける。コホート１および２の対象は、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞前にリンパ球除去化学療法剤を受けていない。コホート３(Ｎ＝６)は、１.５ｇ／ｍ２のシクロホスファミドを静脈内投与され、２日後単一均一静脈内用量の自己１〜５×１０８ ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞を受ける。
シクロホスファミドを受けた患者が、該処置の副作用として悪心および嘔吐を経験することが予測される。悪心のための制吐予防前投薬を、施設標準に従い、化学療法剤注入前に投与してよい。特定の薬剤の選択は治験医の判断に任せるが、免疫抑制性効果のためにコルチコステロイドは使用すべきではない。
Ｔ細胞注入後の副作用は、一時的な発熱、悪寒、硬直、筋肉痛／関節痛、頭痛、疲労および／または悪心を含み得る。対象に、アセトアミノフェン６５０mgを経口でおよび塩酸ジフェンヒドラミンを経口またはIVでＣＡＲ Ｔ細胞注入前に、前投薬する。ベナドリルが禁忌であるならば、ラニチジンのようなＨ２−ブロッカーを投与する。これらの薬物療法を必要に応じて６時間毎に繰り返してよい。患者の発熱が続くか、またはアセトアミノフェンで軽減されないならば、非ステロイド性抗炎症性薬物療法のコースを処方し得る。患者がヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン(ソルメドロール)またはデキサメサゾン(デカドロン)のような全身コルチコステロイドを受けないことが推奨される。コルチコステロイドが、急性輸液反応のために必要であるならば、ヒドロコルチゾン１００mgの初期用量が推奨される。
・１バッグのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞を、ＣＶＰＦからＣＴＲＣの対象のベッドサイドまで、治験コーディネーターまたはＣＶＰＦスタッフがドライアイスに乗せて運ぶ。
・遺伝子導入Ｔ細胞は、対象のベッドサイドでＣＶＰＦスタッフのメンバーが３７℃水浴で解凍する。細胞がちょうど解凍されるまで、バッグを優しく揉む。ＣＡＲ Ｔ細胞産物に傷がついたか袋から漏れているか、または他に損なわれているように見えるならば、注入せず、下記のとおりＣＶＰＦに戻すべきである。
・細胞を、冷たい間に、解凍後約１０〜１５分以内に対象に注入する。遺伝子導入Ｔ細胞を、静脈内に、３方向コックを備えた１８ゲージ無ラテックスＹタイプ輸血器具(Y-type blood set)で急速に注入する。白血球を注入時濾過しない。重力注入により投与を行う。重力による注入速度が遅すぎるならば、遺伝子導入Ｔ細胞薬物産物をコックからシリンジに抜き取り、手動で必要速度で注入する。バッグに凍結凝集塊が残ってはならない。
・注入前に、２名が個々に各バッグのラベルの情報を対象の面前で確認し、情報が参加者と正しく一致していることを確認する。
・患者は、遺伝子導入Ｔ細胞注入中および注入後モニターする。体温、血圧、心拍数、呼吸数およびパルスオキシメトリを得て、投与直前および注入完了２時間後まで１５分毎に記録する。
・対象がアレルギー性応答または重度の低血圧クライシスまたは注入に対する何らかの他の反応を有した際には、注入中の緊急事態のために救急医療機器(すなわち救急カート)が利用可能でなければならない。
・症状が生じず、対象のバイタルサインが注入２時間後に正常のままであれば、対象は、何か症状が出たら病院に戻るよう指示を与えて、家に帰す。バイタルサイン測定値が安定ではないならば、対象のバイタルサインが安定化するか医師が患者を解放するまで、約１５分毎の所得を続ける。対象は、医師が安全と見なすまで帰してはならない。
・形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞投与完了６０分(±５分)以内に、血液サンプルを、形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞数およびサイトカインレベルのベースライン決定のために得る。
・対象は、血液検査および経過観察のために、最初の注入の後２４時間以内にＣＴＲＣまたはPerelman Centerに戻るよう指示される。
ｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴについて、細胞の投与を必要に応じて繰り返し得る。
記述統計学を適用して、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞の相対的残留性および血液(および所望により腫瘍)への輸送を決定する。血液中のＣＡＲ Ｔ細胞数、ＨＡＭＡレベルおよび可溶性バイオマーカーレベルのトラッキングのデータをグラフに示す。放射線画像測定値と腫瘍負荷の他の標準測定値の相関を決定する。我々は、比率および手段の９５％信頼区間を計算する。
プロトコール特異的ＡＥ報告期間の間、全患者について有害事象を集め、評価する。ＡＥを、National Cancer Institute (NCI) Common Toxicity Criteria(v4)を使用して重症度分類する。全ての有害事象を記録し、全体的および主要なカテゴリー内両方の、有害事象率について正確な９５％信頼区間を作成する。データを、過度の毒性の証拠のために連続的にモニターする。結果を表にし、要約する。
臨床応答の割合を、正確な９５％信頼区間で要約する。無進行および全体的生存および臨床応答の期間を、カプランマイヤー曲線を使用して示す。２年生存率を表す。有効性の予備的証拠を、測定可能な疾患を有する対象の腫瘍応答率のモニタリングにより決定する。腫瘍応答を、注入後２８日目、３ヶ月目および６ヶ月目に放射線画像(すなわちＣＴ造影)および血清バイオマーカーを使用して評価する。
・放射線画像応答は、Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST 1.1)、胸膜中皮腫用改変RECIST基準およびImmune-Related Response Criteria(iRRC)に従い測定する。
・血清バイオマーカー応答は、各疾患の標準に従い評価し、さらに全対象のＳＭＲＰを測定する。例えば、膵臓癌の対象は、ＣＡＲ Ｔ細胞投与後ＣＡ１９−９、ＣＥＡおよび血清メソテリン関連タンパク質[ＳＭＲＰ])レベルのモニタリングをする。卵巣癌の対象は、ＣＡ１２５の血清レベルと、またＳＭＲＰをモニターする。中皮腫の対象は、測定するＳＭＲＰの血清レベルをモニターする。全例で、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞がこれらのバイオマーカー測定に使用するアッセイに影響し得ることを考慮して、血清バイオマーカーを腫瘍応答の唯一の測定値として使用しない。
・データを、全体的応答率、無進行生存および全体的生存について記述的に解析する。
注入後最大２年または対象が癌関連治療を開始するまで、ＰＦＳおよびＯＳを評価する。
サイトカインレベルの血液モニタリングを含む安全性評価を実施する。対象は連続的に参加する。注入は、各コホートにおける参加対象間で２８日の安全性評価を可能とするためにずらす。
実施例５：ＲＮＡ産生ＣＡＲＴの臨床試験
自己Ｔ細胞を、上記のヒト４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに加えて、膜貫通型ドメインと共にメソテリンを認識する細胞外ＳＳ１ ＣＡＲ構築物を発現するよう操作する。例えば、ＷＯ２０１３／０４０５７７号、実施例１参照。
ＣＡＲ含有核酸の産生
ＳＳ１−ＣＡＲを次のとおり構築する。ヒト抗メソテリンｓｃＦｖを含むＣＡＲも、類似の方法を使用して構築する。
２個の異なるプラスミドを利用して、ｓｓ１.ｂｂｚフラグメントをクローンした。メソテリンｓｃＦｖフラグメント(ｓｓ１)は、先に公開されたDr. Pastanの構築物(Chowdhury et al., 1998)から、Translational Research Program(TRP)ラボラトリーにより最初にクローン化された。ヒトＣＤ８αヒンジおよび膜貫通型ドメインを４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ配列と共に、先に記載されたpELNS.CD19-BB-ζプラスミド(Milone et al., 2009)からのＰＣＲによりクローン化した。ヒンジ、膜貫通型および細胞内シグナル伝達ドメインの配列をここに開示する。ss1.bbzフラグメントは、pGEM.GFP.64Aベクター(Eli Gilboaにより提供され、Boczkowsk, D et al., 2000に記載)に最初にクローン化された。このベクターを、導入遺伝子発現増強のために、２個の３’ＵＴＲベータグロビン反復および１５０bpのポリＡ配列(配列番号２７１)(pGEM.GFP.64Aの６４ポリＡ配列(配列番号２７３)を置き換え)の付加により修飾した(Holtkamp 2006)。臨床使用のためのＧＭＰ適合プラスミドを、ｐＧＥＭからのss1.bbz.2bgUTR.150AフラグメントをpDriveベクターにサブクローニングすることにより導いた。pDriveクローニングベクター(Qiagen)は、ＵＡハイブリダイゼーションによるＰＣＲ産物の高度に効率的なクローニングのために設計される。組み換えクローンのアンピシリンおよびカナマイシン両者での選択を可能とし、普遍的シークエンシングプライマー部位およびインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６プロモーターを搭載する。まず、ss1.bbz.2bgUTR.150Aを、Ｈｉｎｄ IIIおよびＮｄｅＩ(Fill-in blunt)によりｐＧＥＭベクターから切断し、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ(Fill-in blunt)により切断したpDriveにサブクローン化した。正しい配向を有するインサートの配列を確認し、pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150Aを産生した。pDriveベクターのアンピシリン耐性遺伝子を、ＡｈｄＩおよびＢｃｉVIの２重消化により欠失させた。ＣＡＲ ＯＲＦ内の内部オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)から翻訳された潜在的異常タンパク質を除去するために、６０bpサイズより大きい全内部ＯＲＦを、変異誘発ＰＣＲにより変異させ、同時にｓｓ１ ＣＡＲのＯＲＦは無傷のまま残した。得られたプラスミドは、図１に示すとおり、pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150Aと名づけた。
自己Ｔ細胞への導入のためのＣＡＲ核酸の産物を、次のとおり調製した。最終ｐＤ−Ａ.ｓｓ１.ｂｂｚ.ＯＦ.２ｂｇ.１５０Ａ構築物を、ＣＶＰＦ ＳＯＰ １１８８のように、OneShot TOP10 Chemically Competent大腸菌細胞(Invitrogen)に導入した。２個の１.２５リットルの１００μg／ml カナマイシン含有ＬＢ培地から、１バッチとして産生される１０mgまでのプラスミドＤＮＡを、ＳＯＰ １１９１のようにQIAfilter Plasmid Giga DNA単離キットを使用して産生した。その時点で１mgのＤＮＡを、ＳｐｅＩ制限酵素で一夜、３７℃で直線化した。直線化を、ゲル電気泳動で確認し、その後Ｑiagen Plasmid Maxiキットを使用して大規模精製した。
mScript mRNA系を使用して、プラスミドからＲＮＡを転写させ、RNeasy Maxiキット(Qiagen)を使用して単離した。インビトロで転写されたＲＮＡを、１mg／mL濃度で０.５mLのアリコートで凍結保存した。ＲＮＡ品質および量を、ｍＲＮＡ変性緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)で７０℃の変性１５分後に１％アガロースゲル電気泳動で解析し、ＵＶ分光光度法(ＯＤ２６０／２８０)で定量した。
ＣＡＲ Ｔ細胞産物製造
７〜１２リットルアフェレシス手順を、最初のＣＡＲ Ｔ細胞投与約４週間前に実施する。ＰＢＭＣを、この手順の間にＣＡＲ Ｔ細胞のために得る。一回白血球除去から、意図は、ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するための少なくとも５×１０９個の白血球の収集である。
ＣＤ３＋ Ｔ細胞を、単回使用閉鎖系使い捨てセットを用いるCaridianBCT Elutra上の向流遠心水簸による単球の枯渇により、白血球除去産物から富化する。０日目、Ｔ細胞製造過程を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体被覆磁気ビーズでの活性化により開始し、増殖を静的組織培養バッグで開始する。５日目、細胞を、さらなる増殖が必要であれば、ＷＡＶＥバイオリアクターに移す。培養の最後に、細胞は磁気ビーズが枯渇し、洗浄し、Haemonetics Cell Saver系を使用して濃縮する。収集後細胞を、翌朝エレクトロポレーションするために一夜、３７℃でインキュベーションする。細胞を洗浄し、エレクトロポレーション緩衝液(Maxcyte)に再懸濁し、Maxcyte処理アセンブリに充填する。細胞をｓｓ１ ＲＮＡとし、４時間回復させ、その後不融性凍結保存培地に製剤する。
パッケージング
１×１０８または１×１０９±２０％修飾ＣＡＲ Ｔ細胞を、ウェットアイス上に維持したIV輸液バッグに仕込む。各バッグは、次の不融性グレード試薬(％ｖ／ｖ)を含む凍結保存用培地のアリコート(体積は用量に依存)を含む：３１.２５ Plasmalyte-A、３１.２５ デキストロース(５％)、０.４５ ＮａＣｌ、最大７.５０ ＤＭＳＯ、１.００ デキストラン４０および５.００ ヒト血清アルブミン。バッグを−１３５℃に凍結できる。
ＣＡＲ Ｔ細胞産物安定性
ｓｓ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、エレクトロポレーション後４時間凍結保存し、解凍し、Ｔ細胞製造後３ヶ月期間内に使用する。我々は、凍結保存ｓｓ１ＣＡＲ Ｔ細胞のメソテリンｓｃＦｖ発現が、約３０日、≦−１３０℃で９７.４％であり、凍結保存時(９６.９％)とほぼ同一であり、他の凍結保存Ｔ細胞産物が少なくとも６ヶ月安定であることを証明した。トリパンブルー数に基づく解凍後生存能は、９８.７％と比較して７５.２％であった。発現データは、治験用に貯蔵中最終産物が安定であり、さらなる用量のためのセンチネルバイアルが、７０％生存能および≧２０％ＣＡＲ発現の放出基準を満たすはずであることを示唆する。ｓｓ１ ＣＡＲ Ｔ細胞のさらなるバイアルは、凍結保存後３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月および１２ヶ月に解凍し、生存能および導入遺伝子発現を試験して、さらなる産物安定性データを作成する。
臨床試験手順および結果：悪性胸膜中皮腫の患者に投与する自己メソテリン再指向Ｔ細胞の第Ｉ相臨床試験を次のとおり実施する。膵臓癌を有する患者の処置のための治験に類似の手順を利用できる。
投与量
コホート１患者(ｎ＝３)は、０日目に抗メソＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の均一用量を使用した１×１０８の一回注入と、患者が７日目の注入前のプロトコール特異的安全性評価に合うならば、７日目の１×１０９ ＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の１回注入を受ける。
コホート２患者(ｎ＝６)は、２サイクルの修飾ＣＡＲ Ｔ細胞を受ける。１サイクルは隔日の３回の注入からなる(月曜日、水曜日、金曜日)。サイクル１は、ＭＷＦ(０日目、２日目、４日目)に投与される３用量の１×１０８ ＣＡＲ Ｔ細胞からなり、サイクル２は、ＭＷＦ(７日目、９日目、１１日目)に投与される３用量の１×１０９ ＣＡＲ Ｔ細胞からなる。
注入あたりの目標用量は、１×１０８細胞(コホート１については１回投与およびコホート２については週１の投与)および１×１０９±２０％細胞(コホート１については１回投与およびコホート２については週２の投与である)。最小限許容される用量は１×１０８である。総細胞増殖が許容される総細胞用量より低いならば、患者は、より多くの細胞を増殖し、総目標用量を満たすための２回目のアフェレシスを受け得る。２回目のアフェレシスに対する禁忌があるかまたは２回目のアフェレシスおよび増殖が最小限許容される用量を産生できなかったら、その１回分は、製造不良と考える。コホート１患者について、拡張コホート１レジメンに従う場合、できるだけ多くのメソテリンＣＡＲＴ細胞を製造／凍結し、対象が二回目の白血球除去を受ける確率を減らす。
１名を超える患者が修飾ＣＡＲ Ｔ細胞注入によりＤＬＴを発症するならば、用量段階的縮小が起こる。ＤＬＴの場合、我々は、用量を１０倍段階的縮小する。それゆえに、１０８ ＣＡＲ Ｔ細胞のサイクル１中に毒性が生じたならば、全注入(１〜６回の投与)を１０７ ＣＡＲ Ｔ細胞に減少する。１０７ ＣＡＲ Ｔ細胞で管理不能な毒性の場合には、治験を停止する。
一過性に発現するＣＡＲ Ｔ細胞(特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴで)処置している患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
理論に縛られないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発症する患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であるはずだと考えられている。抗原への暴露に１０〜１４日間中断があるとき、患者の抗体産生細胞がＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーを起こさない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを起こすと考えられる。それゆえに、一過性ＣＡＲＴ(例えばＲＮＡエレクトロポレーションにより産生されるもの)について、ＣＡＲＴ注入中断は１０〜１４日を超えて継続しなければならない。
さらに、ヒト(マウスの代わり)ｓｃＦｖを有するＣＡＲの使用は、抗ＣＡＲ応答を有する患者の可能性および強度を減少する。
治験手順
治験は、１)スクリーニング相、２)アフェレシス、ＣＡＲ Ｔ細胞注入、副作用評価および任意的な腫瘍生検からなる介入相および３)フォローアップ来院からなる。
スクリーニングおよびベースライン評価
治験医は、対象に治験プロトコールの性質およびプロトコールと関連するリスクを詳細に説明しなければならない。対象は、治験参加前にインフォームド・コンセント書類に署名し、日付を入れなければならない。インフォームド・コンセント過程および日付を対象の診療記録およびＣＲＦに記録する。インフォームド・コンセントは、プロトコール手順実施前に得なければならない。スクリーニングに必要な手順がインフォームド・コンセント署名前に実施され、該手順がプロトコールの期限に間に合うならば、この手順をスクリーニング評価のために使用し得る。
スクリーニング手順(適格性の決定に必要ではない)は、ＣＡＲ Ｔ細胞の最初の投与６週間以内に完了する(ＳＯＥにおいて特に断らない限り)。さらなるＴ細胞を増殖し、目標細胞用量に到達するために２回目のアフェレシスが必要である場合、この時間枠は手順の全てをカバーしない。それゆえに、この特定の状況の場合、６〜８週間の期間がベースライン走査の実施のために許可される。
スクリーニング手順は次のものを含む：
・ インフォームド・コンセント
・ ＥＣＯＧ一般状態≦１の確認
・ 製造効率の決定(最初の２患者)：血液サンプルをＣＶＰＦに送り、Ｔ細胞製造実行可能性を決定する。約１週間で、ＣＶＰＦは、対象ＰＢＭＣが大規模ＣＡＲ Ｔ細胞製造過程に適するか否かの結果を返す。結果は、さらなる治験手順の実施前に得なければならない。
・ 完全な病歴
・ バイタルサイン、身長、体重および酸素飽和度を含む身体検査
・ 併用薬物の再調査
・ 血液学(ＷＢＣと分画、ＲＢＣ、Ｈｃｔ、Ｈｇｂおよび血小板)
・ ＰＴおよびＰＴＴ
・ 化学(ナトリウム、カリウム、クロライド、ビカーボネート、尿素窒素、クレアチニン、グルコース、総タンパク質、アルブミン、カルシウム、アルカリホスファターゼ、総ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ)
・ウイルススクリーニング：ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶおよびＣＭＶのための血清学
・ 自己抗体パネル：ＡＮＡ、ＥＳＲ
・ 尿検査
・ １２誘導心電図(ＥＣＧ)
・ 血清βＨＣＧ妊娠(妊娠可能な女性)
・スパイロメトリーおよびＤＬＣＯ
・ 造影剤使用腫瘍評価胸部ＣＴスキャン、臨床的に指示される他の放射線評価。ＰＥＴ／ＣＴは任意である。
・ プロトコール特異的病理学者による上皮性または混合型(二相性)中皮腫の病理学的確認およびメソテリンの染色。
白血球除去
７〜１２リットルアフェレシス手順を、University of Pennsylvania Apheresis centerで行う(最初のＣＡＲ Ｔ細胞投与４週間前)。ＰＢＭＣを、この手順の間にＣＡＲ Ｔ細胞のために得る。一回白血球除去から、目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞を製造するための少なくとも５×１０９個の白血球の収集である。収集に失敗したら、患者は二回目の白血球除去を受ける選択肢がある。ＦＤＡ顧視要求および治験のためのベースライン血液の白血球を得て、凍結保存する。メソテリン修飾Ｔ細胞産物は、約４週間後放出の準備ができていると予測される。全患者は、該手順前に標準白血球除去スクリーニングをする。
注入前評価(治験−３日目、最初の投与前)
この安全性評価は、身体検査(例えば、バイタルサイン、体重など)、併用薬物の再調査、一般状態、化学、ＣＢＣと分画、妊娠検査(尿)、尿検査、ＥＫＧ、ＣＸＲおよび血液検体研究を含む。
ＣＡＲ Ｔ細胞投与
各ＣＡＲ Ｔ細胞注入前に、患者は、限定的な問題志向型ＰＥ、有害事象の再評価、ＥＣＯＧ一般状態、ＣＢＣ、化学および尿検査を受ける。対象は、限定的な問題指向型ＰＥ、有害事象の再評価、併用薬物、ＥＣＯＧ一般状態、ＣＢＣおよび化学を受けるために、ＣＡＲ Ｔ細胞注入(Ｄ１、Ｄ３、Ｄ８およびＤ１０)１日後ＨＵＰに戻らなければならない。７日目、コホート１患者はまたＥＫＧを受ける。１４日目、コホート２患者もＣＸＲおよびＥＫＧを受ける。
ＣＡＲ Ｔ細胞を上記のとおり投与する。対象のバイタルサインの評価およびパルスオキシメトリを投与前、注入終了時およびその後２時間、１５分毎におよびこれらが安定するまで行う。
注入後評価
血中サイトカインレベルを、コホート１の患者について最初の注入１時間、４時間、１日および３日後および２回目の注入１時間、４時間、１日および３日、７日および１４日後にモニターする。生着解析(フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲ)のための採血を、最初の注入２１日後に採る。
コホート２(および拡張コホート１)患者について、サイトカインレベルを、各注入１時間後およびＳＯＥに従うさらなる時点でモニターする。一次安全性および生着データを、最初の(０日目)ＣＡＲ Ｔ細胞投与後３５日回収する。
ＣＡＲ Ｔ細胞注入１日後、循環ＣＡＲ Ｔ細胞を評価するためのフローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲのために採血する。末梢血液サンプルを処理して、ａ)免疫細胞表現型および機能を評価するための末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ｂ)注入ＣＡＲ Ｔ細胞の短期残留性および分布を定量するためのＲＮＡおよびｃ)免疫細胞サブセットおよび可溶性免疫および増殖因子の定量および評価、抗注入細胞免疫応答の評価および免疫エピトープ拡散による液性抗腫瘍免疫応答の発症の評価のためのProtoArray解析の実施のための血清を単離する。
最後のＣＡＲ Ｔ細胞注入後、上記のとおり安全性評価のために対象を２ヶ月目および３ヶ月目(コホート１)ならびに２ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目(コホート２および拡張コホート１)に評価する。
腫瘍生検およびミニアフェレシス
コホート２および拡張コホート１に関して：腫瘍が目に見えるほど到達可能であるまたは画像誘導生検により到達可能であるならば、適格対象は直接腫瘍生検または画像誘導下の生検に付し、ＣＡＲ Ｔ細胞およびメソテリン発現の存在を評価する。これは、コホート２対象についてＴ細胞注入１４日後に計画される。総腫瘍浸潤性リンパ球およびＴ細胞サブセットの頻度ならびにＴ細胞抗腫瘍応答分子マーカーの発現を測定する。これらを、使用可能であれば保存した外科的腫瘍検体のベースライン値と比較する。対象には、腫瘍生検を拒否する選択肢も与える。腔内液も生検として提供し得る。
ミニアフェレシス(２Ｌ)は、研究目的でおよびＦＤＡ“顧視”目的で、注入後２１日目の安全性解析のためのＣＡＲ Ｔ細胞を記録するために行い得る。血液サンプルを、白血球除去の代わりに採取してよい。
腫瘍応答評価
腫瘍応答を、コホート１について３５日目および２ヶ月目ならびにコホート２(および拡張コホート１)について最後のＣＡＲ Ｔ細胞注入後３５日目、２ヶ月目および６ヶ月目にまたは患者が代替ＭＰＭ治療を必要とするまで評価する。腫瘍評価は、胸部について造影剤を用いるＣＴ走査および臨床的に指示される他の方法により行う。
上記実施例は、例えばＣＡＲ構築物Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６およびＭ１７におけるｓｃＦｖを使用した、ｓｃＦｖ ＣＡＲＴを担持するヒトで実施できる。
実施例６：ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮは、固形悪性腫瘍に抗腫瘍活性を誘発する
本実施例は、進行中の臨床試験で報告された２例を示し、メソテリンを標的とするｍＲＮＡ ＣＡＲ Ｔ細胞(ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ)の養子移入(ＰＢＭＣをメソテリンＣＡＲ構築物と共にした)は実行可能であり、正常組織に対する腫瘍外標的上毒性の明白な証拠がなく安全であることを示唆する。これらの例はまた、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮが浸潤でき、悪性胸膜中皮腫(ＭＰＭ)および膵臓癌のような固形悪性腫瘍において抗腫瘍活性を有することも証明する。
対象１７５１０−１０５はＭＰＭを有し、ＣＡＲＴメソを３回注入された。対象２１２１１−１０１は転移性膵臓癌(ＰＤＡ)を有し、８用量のＣＡＲＴメソを静脈内注入により、および２回腫瘍内注射により投与された。いずれの患者も高齢であり、登録時、広範な腫瘍負荷の進行型化学療法剤難治性癌を有した。
ＣＡＲＴメソ細胞の抗腫瘍臨床活性
両者の例を、コンピュータ断層撮影(ＣＴ)造影により腫瘍応答を評価した。さらに、ＰＤＡ患者は、注入の前後に陽電子放出断層撮影／コンピュータ断層撮影(ＰＥＴ／ＣＴ)造影による[１８Ｆ]２−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース(ＦＤＧ)アビディティーにより評価した(図６)。ＭＰＭ患者は、ＣＡＲＴメソ注入後、疾患安定であったが、しかしながら、スケジュール２のＣＡＲＴメソ細胞の１回注入後、部分奏効が確認された(図６Ａ)。ＰＤＡ患者は、３週間の静脈内ＣＡＲＴメソ治療後疾患が安定した。ＦＤＧ ＰＥＴ／Ｃｔ造影により、標準化最大集積値(ＳＵＶｍａｘ)が疾患の全部位で見られた。この代謝応答を進めるために、各疾患部位の平均体積(mean volumetric product)(ＭＶＰ平均)を決定した(図６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄ)。ＭＶＰ平均の減少は、腹膜病変にのみ見られた。腹膜腫瘍負荷に対するＣＡＲＴメソ細胞療法の影響をさらに理解するために、腹水をフローサイトメトリーで解析した。治療開始後＋３日および＋１５日の腹水の解析は、メソテリンおよびｃ−ｍｅｔを共発現した腫瘍細胞の濃度の４０％減少を示した。(図６Ｄ)。全体として、これらの治験は、これらの患者における抗腫瘍効果誘発における、ＣＡＲＴメソ細胞注入の役割を示す。
血清学的腫瘍マーカーも両患者で評価した。血清メソテリン関連ペプチド(ＳＭＲＰ)レベルおよびＣＡ１９−９レベルを、ＣＡＲＴメソ細胞注入の前後に測定した。ＭＰＭ患者について、ＳＭＲＰレベルは、スケジュール２での最初の注入後に減少し、ＣＴ造影により見られる腫瘍負荷の減少と一致した。ＰＤＡ患者について、ＣＡ１９−９レベルは、処置の間にゆっくり増加したが、１ヶ月間安定なままであった。ＣＡＲＴメソ細胞の腫瘍内注射完了後、ＣＡ１９−９レベルは疾患進行に一致して上昇した。
ＣＡＲＴメソ細胞のインビボ残留性および輸送
ｑＰＣＲアッセイを、注入後の患者におけるＣＡＲＴメソ細胞の残留性を検出および定量するために開発した。２名の患者からの末梢血、腹水および腫瘍サンプルの解析を図７に示す。ＣＡＲＴメソ導入遺伝子は、両方の患者で、各注入直後に検出された。ＣＡＲＴメソ導入遺伝子の生分解性性質に一致して、レベルは、連日、徐々に減少することが観察された。
腫瘍組織におけるＣＡＲＴメソ細胞の輸送を、いくつかの時点で腹水採取および腫瘍生検によりＰＤＡ患者で評価した。
ＣＡＲＴメソ細胞注入後の液性エピトープ拡散の誘導
ＣＡＲＴメソ細胞が、インビボで認識に利用可能であり、原発性腫瘍細胞を溶解するならば、全身抗腫瘍免疫応答を誘発するはずであるとの仮説を試験した。ハイスループット血清学的解析を実施して、腫瘍破壊およびエピトープ拡散の結果として生じているであろうポリクローナル免疫応答の発生を検出するための抗原に応答する抗体の誘導を測定した。これらの解析は、ほぼ１０,０００種の非依存性ヒトタンパク質に対する処置誘発ＩｇＧ応答の不偏性測定を使用して達成した。ＰＤＡ患者において、１００種を超えるタンパク質に対する新規抗体応答を＋４４日に検出した。同様に、タンパク質サブセットに対する増加した抗体応答が、ＭＰＭ患者で観察された。全体として、両方の患者で見られたこれらの抗体免疫応答は、エピトープ拡散の古典的過程に交差提示される自己タンパク質の放出に至る、ＣＡＲ Ｔ細胞介在腫瘍破壊に一致する。
抗腫瘍免疫応答の誘導のための両患者の処置前後の血清を、ヒトＭＰＭまたはＰＤＡ細胞株からの精製腫瘍関連タンパク質またはタンパク質溶解物を使用するイムノブロッティングによっても試験した。抗腫瘍免疫応答は、免疫ブロット上の新規バンドの存在または既存のバンドの強度の増加と定義された(図９)。両方の患者で、例えば、同種腫瘍細胞株に存在するタンパク質を検出する抗体の増加のような、抗体パターン変化が処置中に見られた。これらの知見はProtoArray解析と共に、抗腫瘍液性免疫応答がＣＡＲＴメソ細胞注入により誘発されたことを示唆する。
実施例７：固形腫瘍におけるＣＡＲＴ機能を改善するための組み合わせ処置
養子移入した腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を使用する免疫療法は、固形腫瘍微小環境内のＴ細胞機能不活性化により制限される。この試験において、メソＣＡＲを発現するヒトＴ細胞を、大きな、確立されたヒトメソテリン発現中皮腫側腹部腫瘍を担持する免疫不全マウスに静脈内注射した。単離メソＣＡＲ Ｔ細胞(メソＣＡＲＴ)の解析は、多因子性であるように見えるエフェクター機能の急速な喪失を示した。これらの実験結果はメソＣＡＲＴの、エフェクター機能を消失させる機構の阻害剤が、インビボでメソＣＡＲＴ処置の有効性を増強するための組み合わせ治療に有用であり得ることを示す。
材料および方法
メソＣＡＲの産生およびレンチウイルスベクター調製。メソテリンＣＡＲ ｓｓ１を含むレンチウイルス構築物を先に記載のとおり調製した。ヒトメソテリンＣＡＲ構築物およびそれを発現するＴ細胞も、先に記載の方法を使用して産生できる。
細胞株。患者の腫瘍由来のヒト中皮腫細胞株を使用した − ＥＭＰ(親)。ＥＭＰは、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)メソテリンのベースライン発現を有しなかったため、ヒトメソテリンを安定に発現するようにレンチウイルスで遺伝子導入した(形質導入細胞株をＥＭＭＥＳＯと命名した)。細胞はまたホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入した(ＥＭＰｆｆｌｕｃ、ＥＭＭＥＳＯｆｆｌｕｃと呼ぶ)。
Ｔ細胞エフェクターアッセイ。エフェクターＴ細胞を、ホタルルシフェラーゼ発現腫瘍細胞と、種々の比で一定時間共培養した。共培養インキュベーション期間の最後に、上清を、ＥＬＩＳＡ(Biolegend #430106)によるＩＦＮレベルのために保存し、ウェルを洗浄し、残存腫瘍細胞を１×細胞溶解緩衝液で３０分溶解した。溶解物中のルシフェラーゼ活性を、GloMax Multi Detection System(Promega)上のルシフェラーゼアッセイ系を使用して解析した。結果を、腫瘍を含むが、Ｔ細胞を含まないウェルのルシフェラーゼ活性に基づき致死パーセントとして記録する。(致死％＝１００−((エフェクターおよび標的細胞共培養ウェルからのＲＬＵ)／(標的細胞含有ウェルからのＲＬＵ)×１００))。エフェクター対標的比は、標的細胞あたりの総Ｔ細胞を示す。
動物。全ての動物実験は、適切なInstitutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ−２ｒγ−／−(ＮＳＧ)マウスを、Animal Services Unit of Wistar Institute and Children's Hospital of Philadelphiaで繁殖させた。雌マウスを、１０〜１６週齢で実験に使用した。
インビボ異種移植実験。５×１０６ ＥＭＭＥＳＯ腫瘍細胞を、Ｘ−Ｖｉｖｏ培地(Lonza)およびマトリゲル(BD Biosciences)の溶液中、ＮＳＧマウスの側腹部に注射した。腫瘍が確立された後(１００〜２００mm３)、マウスを、無作為に３つの静脈内(尾静脈)処置群：１)２０×１０６非形質導入(ＮＴ)Ｔ細胞(Dynabeads(登録商標)活性化Ｔ細胞)、２)２０×１０６メソＣＡＲ Ｔ細胞(メソＣＡＲを形質導入したDynabeads(登録商標)活性化Ｔ細胞)、３)食塩水の一つ割り当てた。カリパスを使用して腫瘍を測定し、腫瘍体積を式(π／６)＊(長さ)＊(幅)２を使用して計算した。各群、１０匹のマウスを含んだ。インビボ実験を３回繰り返した。
結果
腫瘍浸潤性ＣＡＲＴで見られる機能低下
ヒトメソテリン発現中皮腫腫瘍細胞株ＥＭＭＥＳＯをＮＳＧマウスの側腹部に注射し、１００〜２００mm３サイズに増殖させた。その時点で、腫瘍担持マウスに２０００万Ｔ細胞(メソＣＡＲ発現は約５０％であった(データは示していない))を１回静脈内注射した。有意な腫瘍増殖緩徐化が１４日の猶予後に見られたが(図１０)、しかしながら、我々の他の中皮腫細胞株での実験(Carpenito et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106(9):3360-65 (2009), Zhao et al., Cancer Res, 70(22):9053-61 (2010))と異なり、腫瘍退縮または治癒が示されなかった。非形質導入Ｔ細胞の注射は、食塩水処置対照と比較して極微の抗腫瘍効果を有し(図１０)、Ｔ細胞発現メソＣＡＲで処置した動物で見られた腫瘍増殖の減少が、メソＣＡＲの結果であることが示された。
ＣＡＲＴ処置後になぜ腫瘍退縮が観察されなかったかを理解するために、多様な解析を行った。ＥＭＭＥＳＣＯ腫瘍を試験し、メソＣＡＲＴが多数存在することが判明したが、しかしながら、存在するＴ細胞は機能低下となっていた。ＣＡＲ ＴＩＬ上のＣＡＲ発現レベルが注射前の細胞と等しいか大きいことを考慮して(図１１Ａおよび１１Ｂ)、我々はその機能的活性を比較した。我々は注射４０日後にＥＭＭＥＳＯ腫瘍からメソＣＡＲ ＴＩＬを単離し、解析し(全試験を単離直後に開始した)、元の注射に使用し、凍らせて取っておいた同じバッチのメソＣＡＲ Ｔ細胞(“クリオメソＣＡＲ”)と比較した。これらの細胞を、解凍し、３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベート後に試験した。クリオメソＣＡＲ Ｔ細胞および側腹部メソＣＡＲ ＴＩＬを、培養したホタルルシフェラーゼ発現ＥＭＭＥＳＯ細胞(ＥＭＭＥＳＯｆｆｌｕｃ)に２０：１比で１８時間添加したとき、クリオメソＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍細胞致死に極めて効果的であり(＞９５％)、一方メソＣＡＲ ＴＩＬは、この同じ時間で腫瘍細胞の約１０％しか死滅させなかった(図１１Ｃ、ｐ＜０.００１)。
さらなる解析は、メソＣＡＲ Ｔ細胞が抗原またはＰＭＡ／イオノマイシン暴露後にＩＬ−２およびＩＦＮ−γのようなサイトカインを産生しないことも示した。対照的に、クリオメソＣＡＲ Ｔ細胞はサイトカインを産生した。メソＣＡＲ Ｔ細胞はまた抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズに２０分暴露した後のイムノブロッティングによるホスホＥＲＫ発現の減少または不在により、シグナル伝達減少も示された。対照的に、クリオメソＣＡＲ Ｔ細胞は、ビーズに暴露後ホスホＥＲＫ発現を保持した。
ヒトメソＣＡＲ ＴＩＬは増加したレベルの阻害受容体を発現する
次に、ヒトから単離した、先に機能低下的ＴＩＬにおいて記載している４種の阻害受容体(ＩＲ)の発現を、ｉ)注射に使用したクリオメソＣＡＲ Ｔ細胞、ii)ＥＭＭＥＳＯから３９日目に新たに単離したメソＣＡＲ ＴＩＬおよびiii)腫瘍から除去し、２４時間“回復”させたメソＣＡＲ ＴＩＬのフローサイトメトリーを使用して評価した(表６)。ＣＡＲ ＴＩＬは、高レベルの阻害受容体を発現した。これらのレベルは、一般に腫瘍微小環境から出して２４時間の回復後はるかに低かった。ＣＤ４ ＣＡＲ ＴＩＬについて、ＰＤ−１は７３％から５３％になり、ＬＡＧ−３は６３％から３％になり、ＴＩＭ３は２４％から１％になった。２Ｂ４発現は高く、休息後増加を続けた(６７％から８８％)。ＣＤ８ ＣＡＲ ＴＩＬについて、ＰＤ−１は２６％から２１％になり、ＬＡＧ−３は４８％から１３％になり、ＴＩＭ３は５６％から１％になった。２Ｂ４発現は高く、休息後増加を続けた(９６％から９８％)。
これらのＩＲの３個をまたＥＭＭＥＳＯマウスの脾臓から単離できたヒトＴ細胞でも評価した。興味深いことに、ＰＤ−１、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の発現レベルは全てＴＩＬと比較して脾臓Ｔ細胞で低く(表７)、ＩＲの上方制御における腫瘍微小環境の重要な役割を支持する。
ヒトメソＣＡＲ ＴＩＬは増加したレベルの細胞内阻害酵素を発現する
ＴＩＬ機能不全と結び付けられている２個のＴ細胞機能の内因性阻害剤であるＳＨＰ−１およびＤＧＫの発現レベルを、イムノブロッティングを使用して試験した(図１２)。ＤＧＫの両アイソフォーム(アルファおよびゼータ)ならびにＳＨＰ１のリン酸化形態(ｐＳＨＰ１)のレベルは、一夜休ませたＴＩＬと比較して、ＥＭＭＥＳＯ側腹部腫瘍から新たに単離したメソＣＡＲ ＴＩＬで有意に増加した。これはまたフローサイトメトリーを使用してＤＧＫでも確認され、新鮮ＥＭＭＥＳＯ ＴＩＬの２３％がＤＧＫを発現した。発現は一夜休息後検出不可能であった。
ヒトメソＣＡＲ Ｔ細胞における阻害剤の遮断はそのエクスビボ致死機能を亢進する
これらの発現データを考慮して、メソＣＡＲ ＴＩＬにおける特異的阻害経路の潜在的機能的重要性を、エクスビボ致死およびサイトカイン放出アッセイの間、利用可能な遮断剤を導入することにより試験した。抗ＰＤＬ１抗体の添加は、メソＣＡＲ ＴＩＬによる致死活性およびＩＦＮを分泌する能力を有意に回復させた(図１３Ａおよび１３Ｂ)。相対的に高用量の１０μg／ml抗ＰＤＬ１抗体は、癌免疫療法に対する先に公開された研究に基づいた。Ｉ型またはII型いずれかのＤＧＫ阻害剤の添加は、致死能を有意に増加させたが(図１３Ｃ)、腫瘍誘発ＩＦＮ分泌の有意な増加はなかった(図１３Ｄ)。ＳＨＰ１阻害剤であるスチボグルコン酸ナトリウム(ＳＳＧ)の添加はクリオメソＣＡＲ Ｔ細胞の致死能をわずかに阻害したが、メソＣＡＲ ＴＩＬの致死能は有意に増加し(図１３Ｅ)、同様にメソＣＡＲ ＴＩＬの腫瘍誘発ＩＦＮ分泌も有意に増加した(図１３Ｆ)。用量応答曲線をＤＧＫ阻害剤およびＳＳＧに対して行い、直接腫瘍細胞死を誘発しなかった最高用量を使用した。
まとめて、これらの実験からの結果は、ＣＡＲＴインビボの機能低下が可逆性であることを示す。具体的に、ＣＡＲＴ機能を低下させる阻害機構の調節はエフェクター機能を増加でき、それゆえに、治療有効性を高め得る。ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３のような阻害剤受容体の阻害剤は、有効性を高めるためにＣＡＲＴとの組み合わせ治療に有用であり得る。
実施例８：ヒトメソＣＡＲの特徴づけ
ヒトＣＡＲＴ−ＭＳＬＮの産生
正常対象からのＰＢＭＣを、血液サンプルから単離した。ＰＢＭＣを、ここに記載するヒトメソテリンＣＡＲを含むレンチウイルス構築物で形質導入した。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮを産生するための細胞の形質導入および培養は、先の実施例に記載する。産生したＣＡＲＴは、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３およびＭ２４を含むｓｃＦｖ構築物を伴うメソテリンＣＡＲＳを発現した。ＣＡＲ−ｓｓ１を発現するＣＡＲＴ(マウス抗メソテリンｓｃＦｖ)(陽性対照用)および抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ(陰性対照用)を含む、対照ＣＡＲＴも産生した。
サイトカインアッセイ
腫瘍細胞で刺激後のサイトカイン産生を評価した。Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１７、Ｍ２１、ｓｓ１およびＣＡＲ１９を発現するＣＡＲＴを、異なる腫瘍細胞株と１：１エフェクター対標的比で混合し、５０,０００細胞／ウェルで播種した。腫瘍細胞株はＫ５６２−メソ(ＣＭＬ細胞株発現メソテリン)、Ｏｖｃａｒ３(卵巣癌)、Ｏｖｃａｒ８(卵巣癌)およびＳＷ１９９０(膵臓腺癌)であった。２４時間後、ＣＢＡ解析を実施して、サイトカイン発現および／またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の分泌を決定した。
図１５Ａに示すとおり、ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ２１(Ｍ２１)は、Ｋ５６２−メソにより最強の活性化に到った。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ５およびＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ１１は、ＳＷ１９９０により刺激されて、ＩＦＮ−γを産生した。ＩＬ−２の産生／分泌は、試験したＣＡＲＴ−ＭＳＬＮに類似した(図１５Ｃ)。図１５Ｄに示すように、ＩＬ−４の産生はほとんどなかった。他の試験も、ＩＬ−１０のごくわずかな産生を示した。
致死アッセイ
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮが腫瘍細胞を標的とし、死滅させる能力を、インビトロでも評価した。ルシフェラーゼレポーターを発現する腫瘍細胞株を用いるルシフェラーゼベースのアッセイを使用した。標的細胞(腫瘍細胞)を、２０,０００標的／ウェルで播種した。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮを、１０：１、５：１、２.５：１および１：１の種々のエフェクター：標的比で添加した。細胞を２０時間培養し、各ウェルの発光を検出して、標的細胞死滅のパーセンテージを決定した。ルシフェラーゼ発現Ｏｖｃａｒ３(卵巣癌)およびＵ８７ｍｇ(神経膠芽腫)細胞株を標的細胞として使用した。
図１６Ａに示すように、Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１７およびｓｓ１を発現するＣＡＲＴは、標的腫瘍細胞の死滅に同様に良好に働いた。ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ２１で致死は観察されなかった。対照的に、神経膠芽腫細胞でＣＡＲＴ構築物のいずれでも致死は観察されなかった(図１６Ｂ)。同様の結果が一団のヒトメソＣＡＲで得られ、ここで、Ｍ１１、Ｍ５、Ｍ１７およびＳＳ１でのＯｖｃａｒ３細胞の特異的致死が最大であった(図１７Ａおよび１７Ｂ)。
インビボマウスモデル
ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮの抗腫瘍活性を、Ｏｖｃａｒ８異種移植モデルでインビボで評価した。１０×１０６ Ｏｖｃａｒ８細胞を、０日目にＮＳＧマウスに皮下にインプラントした。１４日目、１００μl用量の２×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞(Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１７、Ｍ２１、ＳＳ１およびＣＤ１９を発現するＣＡＲＴまたは非形質導入細胞；１０×１０６総Ｔ細胞)を静脈内投与した。マウスおよび腫瘍を、腫瘍細胞移植後約４０日モニターした。
この実験の結果は、Ｍ５およびＭ１１を発現するＣＡＲＴが、このモデルで最強の抗腫瘍活性を発揮することを示す(図１８)。モック処置群と比較したとき、Ｍ５およびＭ１１処置マウスは、統計的に有意な腫瘍減少を示した(ｐ＜０.０５)。
二回目のインビボ異種移植を実施して、第二セットのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ細胞の抗腫瘍活性を評価した。１０×１０６ ＯＶＣＡＲ８−ｍｃｈｅｒｒｙ細胞をＮＳＧマウスに注入した。腫瘍が１５０〜２５０mm２になったら、マウスを処置群に無作為化した。Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ２３、ｓｓ１、ＣＤ１９を発現するＣＡＲＴまたは未処置細胞を、１００μlで１０×１０６ Ｔ細胞用量で注射した。Ｔ細胞の約４０％がＣＡＲを発現し、それゆえにこの投与した用量で、約４×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞が各動物に送達された。この実験の結果は、ヒト抗ＭＳＬＮ(Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６およびＭ２３)を発現するＣＡＲＴが腫瘍増殖に効果がなかったことを示す(図１９)。これらの結果を最初のセットのＣＡＲＴ−ＭＳＬＮ評価の結果とまとめて、Ｍ５およびＭ１１が試験した他のＣＡＲＴ−ＭＳＬＮと比較して特異的抗腫瘍活性を有し、それにより癌治療に関してそれらをさらに研究する有望さを証明した。さらに、ＣＡＲＴ−ＳＳ１は、最初の異種移植または２回目の異種移植実験で抗腫瘍活性を何ら示さず、さらにＭ５およびＭ１１含有ＣＡＲＴ−ＭＳＬＮが腫瘍増殖の減少にさらに有効であることを示す。
実施例９：ＤＧＫ阻害はＣＡＲＴ有効性を増強する
先の試験、例えば、実施例６に述べた実験は、ＣＡＲ Ｔ細胞がインビボで(例えば、腫瘍微小環境において)時間とともに有効性を失うことを示唆した。具体的に、腫瘍マウスモデルに注射されたメソＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｔ細胞注入後腫瘍から単離し(例えば、３９日後、以後、腫瘍浸潤性リンパ球、ＴＩＬと呼ぶ)、新たに解凍したメソＣＡＲ Ｔ細胞と比較したその機能的活性を評価した。結果は、エクスビボ致死アッセイおよびＩＦＮ−γ放出アッセイにおいて、腫瘍から単離したメソＣＡＲ Ｔ細胞が、抗原またはＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答して腫瘍細胞を殺す能力の低下(図２０Ａ)、ＩＦＮ−γ産生の減少(図２０Ｂ)、かつＥＲＫシグナル伝達の減少(ウェスタンブロット解析におけるリン酸化で示す、図２０Ｃ)を有することが示され、Ｔ細胞活性化の減少が示された。
インビボでのＣＡＲ Ｔ細胞活性の経時的減少を恐らく説明する阻害機構は、可溶性因子(ＴＧＦｂ、ＰＧＥ２、アデノシン、ＩＬ−１０、ＲＡＧＥリガンドなど)、細胞間接触(ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０など)および内因性活性化誘発細胞内陰性フィードバック系(ジアシルグリセロールキナーゼ：αおよびζアイソフォーム、Ｅｇｒｓ(２および３)、ＳＨＰ−１、ＮＦＡＴ２、ＢＬＩＭＰ−１、Ｉｔｃｈ、ＧＲＡＩＬ、Ｃｂｌ−ｂ、Ｉｋａｒｏｓなど)を含む。Ｔ細胞活性化は、ＤＧＫのような因子を誘導できる。ＤＧＫは、次に、ＤＡＧリン酸化によるＤＡＧシグナル伝達を阻止する。これが、Ｔ細胞活性化に至るＲＡＳ−ＥＲＫ−ＡＰ１経路のＤＡＧ誘発活性化を阻止する。先の試験は、ＤＧＫαまたはＤＧＫζ欠損マウスは、シグナル伝達増強を証明するＣＤ４ Ｔ細胞で終わり、アネルギー誘発刺激により耐性であるように見えることを示している。
インビトロ細胞毒性およびサイトカイン放出アッセイ
ＣＡＲ Ｔ細胞有効性に対するＤＧＫ阻害の作用を試験するために、ＤＧＫ遺伝子ＤＧＫα、ＤＧＫζまたは両者を欠くトランスジェニックマウスを利用した。野生型およびＤＧＫ欠損マウスからの脾臓Ｔ細胞を単離し、レトロウイルスを使用してメソＣＡＲ(ＳＳ１ ＢＢＺ)を発現するよう形質導入した。ＭＩＧＲ１ ＣＡＲを対照として使用した。
細胞毒性アッセイを先の実施例に記載するのに準じる方法を使用して実施した。野生型およびＤＧＫ欠損(ＫＯ)メソＣＡＲ発現細胞を、多様なエフェクター：標的比でインキュベートし、細胞毒性(標的細胞致死％)を定量した(図２１)。図２１に示すように、ＤＧＫ欠失は、特に低エフェクター：標的比で、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を著しく増強した。
同様に、種々のエフェクター：標的比で１８時間後の標的細胞に応答したＩＦＮ−γ放出を試験した。図２２に示すように、ＤＧＫ欠失は、特に低エフェクター：標的比で、メソＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を顕著に増強することが判明した。
野生型メソＣＡＲ Ｔ細胞と比較したＤＧＫ欠損メソＣＡＲ Ｔ細胞のウェスタンブロット解析はＥＲＫリン酸化増加を示し(図２３)、ＤＧＫの存在がＥＲＫシグナル伝達を抑制するが、ＤＧＫ欠失がＥＲＫシグナル伝達の増加を起こすことを示す。ＤＧＫ欠失背景でのＥＲＫシグナル伝達増加は、ＤＧＫ阻害がＲａｓ−ＥＲＫ−ＡＰ１経路の活性化、そしてそれゆえに、Ｔ細胞活性化を起こすことを示す。
最近の試験で、ＴＧＦ−βが、ＤＧＫ欠損がＴ細胞効果の増強に貢献するのと同じシグナル伝達分子であるＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達の妨害により、腫瘍浸潤性ＣＤ８ Ｔ細胞の機能性を調節することが示されている。ＤＧＫ欠損メソＣＡＲ Ｔ細胞のＴＧＦ−βへの感受性を試験した。ＷＴおよびＤＧＫ欠損メソＣＡＲ Ｔ細胞を、１０ng／mlのＴＧＦ−β存在下または非存在下、メソテリン発現ＡＥ１７腫瘍細胞と１８時間インキュベートした。これらのＴ細胞による細胞毒性およびＩＦＮ−γ産生を測定した。図２４に示すように、ＴＧＦ−βは、ＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞において５０％致死を阻害した(矢印)。しかしながら、このＴＧＦ−β誘発阻害は、ＤＧＫ欠失を有するＣＡＲ Ｔ細胞では観察されず、ＤＧＫ欠損細胞がＴＧＦ−β調節に感受性ではなく、ＴＧＦ−βのような阻害剤刺激により抵抗性であり、これがＴ細胞活性の増加に寄与し得ることを示す。
インビボでのメソＣＡＲおよびＤＧＫ阻害の治療有効性
次に、メソＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効性を、ＤＧＫ阻害または欠損の状況で試験した。ＡＥ１７メソ腫瘍細胞(中皮腫細胞)をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射した。腫瘍が１００mm３に達したら(約１週間後)、１０００万メソＣＡＲ Ｔ細胞を、尾静脈に静脈内注射した。次いで、腫瘍体積を少なくとも１８日間追跡した。
ＤＧＫ欠損メソＣＡＲ Ｔ細胞は、野生型(ＷＴ)メソＣＡＲおよび未処置細胞と比較して、増強し、かつ延長した抗腫瘍活性を示した(図２５Ａ)。具体的に、３種のＤＧＫ欠損メソＣＡＲ Ｔ細胞の各々は、注射後最大１８日、ＷＴおよび未処置細胞と比較して腫瘍増殖(体積)を阻止することが示された。ＤＧＫｚ欠損細胞発現メソＣＡＲも残留し、マウスにおいて野生型メソＣＡＲ Ｔ細胞より良好に増殖することが示された(図２５Ｂ)。
これらの結果は、まとめて、メソＣＡＲ Ｔ細胞処置と組み合わせたＤＧＫ阻害が、治療におけるメソＣＡＲ Ｔ細胞活性化および抗腫瘍活性を改善できることを示す。
実施例１０：Ｉｋａｒｏｓの阻害はＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強する
ＣＡＲ Ｔ細胞療法の腫瘍な障害の一つは、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)のようなＴ細胞シグナル伝達の内因性の負の制御因子の上方制御である。実施例９に記載するように、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで時間とともに有効性を失うことが示されている。ＤＧＫのようなＴ細胞機能の負の制御因子の阻害は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性および機能の増強を示した。
Ｔ細胞機能の他の重要な負の制御因子は転写因子Ｉｋａｒｏｓである。主に近位ＴＣＲシグナル伝達に作用するＤＧＫと異なり、Ｉｋａｒｏｓは、Ｓｉｎ３Ａ、ＣｔＢＰおよびＨＤＡＣのようなクロマチンリモデリング複合体の動員により遺伝子発現を負に制御する亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質である。Ｉｋａｒｏｓは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞でサイトカイン産生および細胞溶解性機能の制御に役割を有する。
本実施例において、Ｉｋａｒｏｓ発現が減少した、レトロウイルスによって形質導入したＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性をインビトロおよびインビボで試験した。
材料および方法
細胞株。マウスＡＥ１７中皮腫細胞は、Jackman et al., J Immunol. 2003;171:5051-63に記載されていた。ヒトメソテリンを、レンチウイルス形質導入によりＡＥ１７細胞に導入した。３Ｔ３Ｂａｌｂ／Ｃ細胞をAmerican Type Culture Collectionから購入した。マウスＦＡＰ発現３Ｔ３ＢＡＬＢ／Ｃ(３Ｔ３.ＦＡＰ)細胞を、ＦＡＰ−３Ｔ３親株にマウスＦＡＰをレンチウイルス形質導入して作った。
動物。無病原体Ｃ５７ＢＬ／６マウスをCharles River Laboratories Inc.(Wilmington, MA)から購入した。Ｉｋａｒｏｓ ＤＮ±マウスは、１個の野生型Ｉｋａｒｏｓアレルと、１個のＤＮＡ結合ドメインの欠失を有するＩｋａｒｏｓアレルを含む(Winandy et al., Cell. 1995; 83:289-99)。Ｉｋｚｆ１±マウスは、１個の野生型Ｉｋａｒｏｓアレルと、１個のエクソン７の欠失を有するアレルを有する(Avitahl et al., Immunity. 1999; 10:333-43)。全実験で使用した動物は６〜１２週齢の雌マウスであり、無病原体動物施設で飼育した。
初代マウスＴリンパ球の単離、形質導入および増殖。初代マウス脾臓Ｔ細胞を、製造業者(Miltenyi Biotec)の指示に従い、“Pan T cell Negative Selection”キットを使用して単離し、−ＣＤ３(１μg／mL)および−ＣＤ２８(２μg／mL)で予めコーティングした２４ウェルプレート(２mLの１００Ｕ／mL ＩＬ−２添加ＲＰＭＩ−１６４０中４×１０６細胞／ウェル)で活性化した。４８時間後、細胞(１×１０６細胞／ウェル)をレトロネクチン(５０μg／mL；Clontech)でコーティングした２４ウェルプレート中、レトロウイルス(１mL粗製ウイルス上清)と混合し、室温で４５分、ブレーキをかけることなく、１２００ｇで遠心分離した。一夜インキュベーション後、細胞を、５０Ｕ／mLのＩＬ−２でさらに４８時間増殖させた。
抗原または抗体被覆ビーズ。組み換えメソテリン細胞外ドメインタンパク質、ウシ血清アルブミン(Fisher Scientific)または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体(eBioscience)を、製造業者の指示に従いトシル活性化４.５μm Dynabeads(Invitrogen, #140-13)と化学的に架橋した。
イムノブロッティング。抗メソテリン−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を、ＢＳＡ、メソテリンまたは抗ＣＤ３抗体被覆ビーズのいずれか(２：１ ビーズ対Ｔ細胞比)と、５分および２０分インキュベートした。次いで、総細胞溶解物を調製し、リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＡＫＴ、リン酸化ＩＫＫ、リン酸化ＪＮＫ、リン酸化Ｌｃｋ、リン酸化ＰＫＣ、リン酸化ＰＬＣまたはリン酸化ＺＡＰ７０について免疫ブロットした。Sigma Aldrichから購入した抗ホスホ−Ｌｃｋ以外の全ての抗ホスホ−タンパク質抗体を、Cell Signalingから購入した。Ｉｋａｒｏｓに対するＣ末端反応性ヤギ抗マウス抗体(SC-9861)およびヤギ抗マウスアクチン抗体(SC-1615)をSanta Cruzから購入した。β−アクチン発現レベルを、充填差異を標準化するために決定した。
細胞毒性およびＩＦＮ ＥＬＩＳＡ。ＡＥ１７、ＡＥ１７.メソ、３Ｔ３および３Ｔ３.ＦＡＰ細胞を、記載のようにルシフェラーゼで形質導入した(Moon et al., Clinical Cancer Research. 2011; 17:4719-30)。Ｔ細胞および標的細胞を、３個ずつ、記載した比で９６ウェル丸底プレートで共培養した。１８時間後、培養上清を、ＥＬＩＳＡ(マウスＩＦＮ、BDOpEIA)を使用するＩＦＮ解析のために回収した。形質導入Ｔ細胞の細胞毒性は、先に記載されたアッセイ(Riese et al., Cancer Res. 2013;73:3566-77)を使用する細胞溶解物からの残存ルシフェラーゼ活性の検出により決定した。
確立された腫瘍を担持するマウスへのＣＡＲ Ｔ細胞移入。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部外側側腹部に２×１０６ ＡＥ１７.メソ腫瘍細胞を皮下注射した。大きな確立された腫瘍(１００〜１５０mm３)を担持するマウスを、野生型ＣＡＲ Ｔ細胞またはＩｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞を受けるかまたは未処置のままに無作為に割り当てた(最小、群あたり５匹のマウス、各実験を少なくとも１回反復)。１×１０７ Ｔ細胞を尾静脈から注射した。腫瘍サイズを、それぞれ電子はかりおよびカリパスで測定した。
９日目Ｔ細胞活性評価について、脾臓および腫瘍を先に記載のとおり単細胞懸濁液に加工した(Moon et al., Clinical Cancer Research. 2014; 20(16):4262-73)。脾細胞および腫瘍単細胞懸濁液を、可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体(１.０μg／ml)またはホルボールエステル／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ：３０ng／ml、１μM)で、Golgi Stop(BD Biosciences、０.６６μl／ml)存在下４〜６時間再刺激し、フローサイトメトリー解析用に収集した。
フローサイトメトリーアッセイ。抗マウスＩＦＮ−γ(XMG1)、抗マウスＣＤ２５(PC61)、抗マウスＩＬ−２(JES6-1A12)、抗マウスＣＤ８(53-6.7)、抗マウスＣＤ４４(IM7)および抗マウスＣＤ４(GK1.5)に対する蛍光色素結合抗体をBiolegendから購入した。固定可能、Live/Dead Aqua stain(L34957)をInvitrogenから購入した。抗マウスグランザイムＢ(NGZB)およびＦｏｘＰ３(FJK-16s)に対する蛍光色素抗体をeBioscienceから購入した。抗マウスＴＮＦ−α(MP6-XT22)および抗マウスＣＤ６９(H1.2F3)に対する蛍光色素抗体をBD Biosciencesから購入した。細胞内サイトカイン染色について、細胞をGolgi Stop(BD Biosciences、０.６６μg／ml)で４〜６時間処理した。収集後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで３０分固定し、遠沈し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで細胞をBD Perm Wash(BD Biosciences)で２回洗浄し、サイトカイン抗体で４５分、室温で染色した。細胞をBD Perm Washで２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。転写因子染色について、細胞を、氷上、蛍光色素標識一次抗体で２０分表面染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、細胞をeBioscienceのFix/Perm緩衝液で固定した。固定後、細胞を透過処理し、ＡＰＣ抗マウスＦｏｘＰ３で染色した。Ｉｋａｒｏｓ染色について、ウサギ抗マウスＩｋａｒｏｓ(Abcam、ab26083、１：２０００)を使用し、続いてeBioscience FoxP3キットで固定化および透過処理した。Ｉｋａｒｏｓ抗体で染色後、細胞を染色し、ＰＥ標識抗ウサギ二次抗体(１：２０００)で染色した。染色完了後、細胞をフローサイトメトリー解析のためにCyanADP(Beckman Coulter)で処理した。
統計解析。全統計試験を、GraphPad Prismを用いて行った。２要因のＡＮＯＶＡを、事後検定とともに行い、＊ ｐ＜０.０５、＊＊ ｐ＜０.０１、＊＊＊ ｐ＜０.００１および＊＊＊＊ ｐ＜０.０００１であった。データを平均±ＳＥＭとして示す。
結果
Ｉｋａｒｏｓレベルが減少したＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるサイトカイン産生および細胞溶解性メディエーター放出は増強される
Ｉｋａｒｏｓが減少した細胞溶解性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)がインビトロおよびインビボで増加したエフェクター機能を有することを考慮して(O'Brien, et al., J Immunol. 2014;192:5118-29)、Ｉｋａｒｏｓ枯渇がＣＡＲＴ治療の有効性を改善できるか否かを試験する実験を行った。野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ５７ＢＬ／６背景のＩｋａｒｏｓハプロ欠損マウス(Ｉｋｚｆ１±)から単離したＴ細胞を、メソテリンＣＡＲを発現するようにレトロウイルスによって形質導入した。エクスビボ活性化、形質導入およびＩＬ−２との増殖後、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにより、野生型(ＷＴ) ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｉｋａｒｏｓタンパク質の少ない発現が継続していることが確認された(図２６Ａ)。
Ｉｋａｒｏｓが多サイトカイン遺伝子座の転写リプレッサーであるため(Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15; Bandyopadhyay et al., Blood. 2006; 109:2878-2886; Thomas et al., J of Biological Chemistry. 2010; 285:2545-53;およびO'Brien et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29)、ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩｋａｒｏｓの減少により自己分泌サイトカイン産生を生じるか、そしてＩｋａｒｏｓハプロ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞が標的抗原に対して、そのＷＴカウンターパートよりも良好に応答するか否かも次に試験した。ＷＴおよびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞の両者を、ＢＳＡ(対照)またはメソテリン(ＣＡＲ抗原)で被覆したビーズで、２：１ ビーズ：Ｔ細胞比で６時間刺激し、フローサイトメトリーによりＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βおよびＩＬ−２産生能を解析した。ベースライン(ＢＳＡ刺激)で、ＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＩＦＮ産生Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞の約３倍の増加があったが(４.３５％対１.４％、図２６Ｂ)、ＩＬ−２産生細胞％に有意な差はなかった(図２６Ｄ)。メソテリン被覆ビーズでの刺激後、ＩＦＮ−γサイトカイン産生Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞％の劇的な増加があったが(２５％)、応答はＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞でわずかであった(７％)。ＴＮＦ−α産生の増加も見られた(図２６Ｃ)。サイトカイン産生のこの増加が、種々の刺激について一般化されるのかまたはＣＡＲ抗原に限定されるのかを調べるために、ＷＴおよびＩｋｚｆ±ＣＡＲ Ｔ細胞の両者をＰＭＡおよびイオノマイシンで６時間処理した。この場合、ＷＴカウンターパートと比較して多くのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βおよびＩＬ−２サイトカイン産生細胞が、Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞で観察された(図２６Ｂ〜２６Ｄ)。これらのデータは、Ｉｋａｒｏｓが、Ｔ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞でサイトカイン産生を抑制する律速因子の一つであるとの仮説を指示する。
重要な細胞毒性メディエーターであるグランザイムＢは、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｉｋａｒｏｓ欠損ＯＴ−Ｉ細胞で情報制御され、これがＯＶＡ発現ＥＬ４腫瘍細胞に対する細胞溶解性活性を増加させたことが示された(O'Brien et al., J Immunol. 2014;192:5118-29)。グランザイムＢ産生がＣＡＲを担持するＩｋｚｆ±Ｔ細胞でも増加しているはずとの仮説が立てられた。ＷＴおよびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞の両者をＢＳＡ(ベースライン)またはメソテリン(ＣＡＲ抗原)被覆ビーズで、２：１ ビーズ：Ｔ細胞比で６時間刺激した。ＰＭＡ／イオノマイシンを、本アッセイの陽性対照として使用した。上記データに類似して、グランザイムＢレベルは、ベースラインでＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞よりＩｋｚｆ±ＣＡＲ Ｔ細胞で高かった(ＢＳＡ刺激；図２６Ｅ)。メソテリン被覆ビーズまたはＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激後、グランザイムＢレベルはＷＴおよびＩｋｚｆ±ＣＡＲ Ｔ細胞の両者で増加したが、産生はＩｋｚｆ±ＣＡＲ Ｔ細胞ではるかに高かった(図２６Ｅ)。Ｉｋａｒｏｓが減少したＣＡＲ Ｔ細胞の脱顆粒にも差異があるか否かを決定するために、抗原刺激後のＣＤ１０７ａ発現を評価した。野生型形質導入Ｔ細胞は、抗原再刺激後わずかなレベルのＣＤ１０７ａ発現を有したが、しかしながら、Ｉｋａｒｏｓが減少したＴ細胞は増強したＣＤ１０７ａ上方制御を示した(図２６Ｆ)。それゆえに、再刺激に応答して、Ｉｋａｒｏｓが減少したＣＴＬは、野生型カウンターパートと比較してより多く脱顆粒し、細胞毒性メディエーターをより多く放出する。
ドミナントネガティブアレルでのＩｋａｒｏｓ枯渇はＣＡＲ Ｔ細胞機能を増強する
Ｉｋａｒｏｓレベルが低い細胞に加えて、マウスからのＩｋａｒｏｓの一つのドミナントネガティブアレル(ＩｋＤＮ)を発現するＴ細胞を試験した。ＩｋＤＮを発現するトランスジェニックマウスのリンパ系発達は正常であるが、Ｉｋａｒｏｓ ＤＮＡ結合活性が９０％減少した末梢Ｔ細胞を有する(Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15;およびWinandy et al., Cell. 1995; 83:289-99)。ＷＴおよびＩｋＤＮマウスの脾臓から単離したＴ細胞を、プレート結合抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、メソテリンＣＡＲを形質導入し、続いてＩＬ−２で増殖させた。ＩｋＤＮ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓのノックダウンがウェスタンで確認された。ＷＴおよびＩｋＤＮ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＢＳＡまたはメソテリン被覆ビーズのいずれかで２：１ ビーズ：Ｔ細胞比で６時間再負荷し、ＣＡＲ抗原に対してＩＦＮおよびＩＬ−２を産生する能力ならびに脱顆粒する能力を解析した。上記Ｉｋｚｆ１±データに類似して、ベースラインでいくぶんかの自己分泌ＩＦＮ−γ産生が観察されたが(図２７Ａ)、ＩＬ−２は観察されなかった(ＢＳＡ刺激；図２７Ｂ)。ＣＡＲとその標的抗原であるメソテリンとのライゲーションにより、ＩｋＤＮ Ｔ細胞は、ＷＴ Ｔ細胞より多くのＩＦＮ−γを産生した(メソテリン刺激；図２７Ａ)。ＣＤ１０７ａ上方制御で測定した脱顆粒も、野生型およびＩｋＤＮ ＣＡＲ Ｔ細胞両者で同様であった(図２７Ｄ)。
Ｉｋａｒｏｓ枯渇は抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞の活性化およびシグナル伝達を増強しなかった
Ｉｋａｒｏｓの枯渇がＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出を増強し、グランザイムＢレベルおよびＣＤ１０７ａ発現を増加させることを考慮して、可能性がある機構を探索した。エフェクター機能のこれらの変化が、野生型とＩｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞の活性化の差異によるものである可能性は妥当である。それゆえに、ＣＤ６９、ＣＤ２５および４−１ＢＢ(Ｔ細胞活性化のマーカー)のレベルを、メソテリン被覆ビーズで６時間および２４時間刺激後、フローサイトメトリーで測定した。早期活性化マーカーであるＣＤ６９は、野生型およびＩｋｚｆ１±細胞の両者で同程度に上方制御された(図２８Ａ)。長い刺激で、野生型およびＩｋｚｆ１±ＣＡＲ発現Ｔ細胞は同様のレベルのＣＤ６９を発現し続けたが、Ｉｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞はＣＤ２５発現の増加を示した(図２８Ｂ)。これは、Ｔ細胞活性化の差異を直接的には示さないが、しかしながら、Ｉｋｚｆ１±細胞によるＩＬ−２が増加するに連れて(図２８Ｄ)、ＩＬ−２ＲａであるＣＤ２５のポジティブ・フィードフォワード・ループで作用し得る(Depper et al., Proc Natl Acad of Sci USA. 1985; 82:4230-4;およびNakajima et al., Immunity. 1997; 7:691-701)。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢも、活性化Ｔ細胞で発現され(Vinay et al., Seminars in Immunology. 1998; 10:481-9)、抗原刺激後ＣＡＲ形質導入野生型およびＩｋｚｆ１±Ｔ細胞で類似のレベルで発現された(図２８Ｃ)。それゆえに、我々のＷＴおよびＩｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞の間の機能的差異は、Ｔ細胞活性化の差異によるものではなかった。
実施例９およびRiese et al., Cancer Research. 2013; 73:3566-77に記載した実験は、ＣＡＲ Ｔ細胞における酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)の枯渇がＲＡＳ／ＥＲＫシグナル伝達の増加を起こし、これがＣＡＲ Ｔ細胞の活性化とよく相関したことを示す。ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でＴＣＲ刺激後のＷＴおよびＩｋａｒｏｓ欠損Ｔ細胞におけるいくつかのシグナル伝達経路を試験した。刺激Ｔ細胞からの溶解物を調製し、ＴＣＲからの近位(ＰＬＣおよびＬｃｋ)および遠位(ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ＡＫＴおよびＩＫＫａ)シグナル伝達に関係する多様なホスホ−タンパク質について免疫ブロットした。Ｉｋａｒｏｓ欠損Ｔ細胞において、Ｌｃｋ、ＥＲＫおよびＡＫＴを含むいくつかのＴＣＲシグナル伝達タンパク質の構成的な低レベルのベースライン活性化があった(図２８Ｄ)。ＴＣＲ／ＣＤ２８刺激で、試験した全タンパク質は、刺激２０分後Ｉｋａｒｏｓ欠損Ｔ細胞でわずかに高かったホスホ−ＩＫＫ以外、ＷＴおよびＩｋａｒｏｓ欠損Ｔ細胞と比較して、同じレベルまでリン酸化された。ＮＦＢ経路が、Ｉｋａｒｏｓレベルが減少したＴ細胞で増強されているかを調べるために、同じブロットを、ＩＫＫの下流標的であるＩＢに対して再プローブした。ＷＴおよびＩｋａｒｏｓ枯渇Ｔ細胞の両者でＩＢ分解に差異はなかった。ＣＡＲシグナル伝達を試験するために、ＷＴおよびＩｋＤＮメソテリンＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の両者を、メソテリン被覆ビーズで再刺激した。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激のデータと同様、ＰＬＣおよびＥＲＫのリン酸化に差異は見られなかった(図２８Ｅ)。合わせて、これらのデータは、Ｉｋａｒｏｓの枯渇がＴＣＲ／ＣＡＲ介在シグナル伝達を変えないことを示す。
ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓ減少は、その標的細胞に対する応答を増強する
Ｉｋａｒｏｓが減少したＣＡＲ Ｔ細胞によるエフェクター因子産生の増加を考慮して、インビトロでのその標的腫瘍細胞に対する有効性を試験した。野生型、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ Ｔ細胞発現メソＣＡＲを、異なる比で親腫瘍細胞株、ＡＥ１７またはメソテリン発現細胞株、ＡＥ１７メソと混合した。親細胞株と混合したとき、野生型、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ Ｔ細胞のいずれも、ＡＥ１７に応答したＩＦＮ−γ産生または細胞溶解ができなかった(図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃ)。対照的に、ＡＥ１７メソと反応させたとき、野生型Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生および細胞溶解は、Ｅ：Ｔ比が増加するに連れて増加した(図２９Ｂおよび２９Ｃ)。しかしながら、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ Ｔ細胞の両者は、最低Ｅ：Ｔ比１.３：１でも、野生型Ｔ細胞より有意に多いＩＦＮ−γを産生し、腫瘍溶解が有意に増加した(図２９Ｂおよび２９Ｃ)。
この効果の一般化可能性を試験するために、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ−ＣＡＲ)を標的とし、上で使用したメソテリンＣＡＲと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを有する異なるＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞を試験した。ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６から単離した同等に形質導入したＦＡＰ−ＣＡＲ脾臓Ｔ細胞の有効性を、Ｉｋｚｆ１±マウスのものと比較した。Ｉｋｚｆ１±ＦＡＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＷＴ ＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、インビトロでの特異性を維持して、３Ｔ３.ＦＡＰ細胞の溶解(図２９Ｄ)およびより多くのＩＦＮ分泌(図２９Ｅ)により効果的であった。
Ｉｋａｒｏｓの枯渇は確立された腫瘍に対するＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を増強する
マウスにおける確立されたＡＥ１７メソ腫瘍の増殖制御における、Ｉｋａｒｏｓが減少したメソテリン特異的Ｔ細胞(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)の能力を試験した。２００万のＡＥ１７メソ腫瘍細胞を、同質遺伝子的Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に注射し、大きな確立された腫瘍(約１００〜１５０mm３)を形成させた。ＷＴまたはＩｋａｒｏｓ欠損(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)マウスから調製した１０００万のＣＡＲ Ｔ細胞を、次いで、この腫瘍担持マウスに養子移入し、腫瘍測定を続けた。野生型形質導入メソＣＡＲ Ｔ細胞により軽度の腫瘍増殖阻害が誘発されたが、Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ形質導入メソＣＡＲ Ｔ細胞の両者は、より顕著にＡＥ１７メソ腫瘍の増殖を阻止した(図３０Ａおよび３０Ｂ)。
Ｉｋａｒｏｓの減少が、ＦＡＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞の治療可能性を増強するか否かも試験した。確立されたＡＥ１７メソ腫瘍(１００〜１５０mm３)を有するマウスに、１０００万の野生型またはＩｋｚｆ１±形質導入抗マウスＦＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入した。野生型形質導入細胞を投与されたマウスの腫瘍遅延は極微であり、ＡＥ１７メソ腫瘍は増殖を続けた(図３０Ｃ)。対照的に、Ｉｋｚｆ１±形質導入Ｔ細胞は、腫瘍増殖を有意に遅延できた。
Ｉｋｚｆ１±ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも長く残留し、免疫抑制性腫瘍微小環境により抵抗性である
Ｉｋａｒｏｓ阻害ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性の増強を考慮して、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞を使用する可能性がある機構を探索した。これらのメソＣＡＲ Ｔ細胞がインビボで免疫抑制性腫瘍微小環境中どのように作動するかをさらに試験するために、養子移入３日後および９日後の腫瘍を収集し、これらの数および機能性を評価した。これらの二つの時点は、抗腫瘍免疫応答中の早期および後期時点でのそれらの活性の特徴づけを可能にした。
移入３日目、我々は、脾臓(図３１Ａ)および腫瘍(図３１Ｂ)の両者で、野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞の頻度が類似することを観察した。これらの類似レベルは、野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞の両者が、最初に腫瘍に同様に良好に輸送されることを示す。９日の時点で、野生型メソＣＡＲ Ｔ細胞およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞両者の数は脾臓で減少した。しかしながら、腫瘍をこの時点で試験したとき、ＷＴメソＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞数の有意な増加があった(図３１Ｂ)。これらのデータは、Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞が、免疫抑制性微小環境においてＷＴメソＣＡＲ Ｔ細胞よりも良好に残留または増殖することを示す。
腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)は、免疫抑制性腫瘍微小環境内のその同族抗原に応答して機能低下となり、腫瘍進行と関連する鍵となる現象である(Prinz et al., J Immunol. 2012; 188:5990-6000;およびKerkar et al., Cancer Res. 2012; 72:3125-30)。９日目に腫瘍に多くのＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞が存在したが、腫瘍微小環境によりまだ不利な影響を受けている可能性があった。機能性を評価するために、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を使用して、移入９日後野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞から単離したＴＩＬＳを刺激し、溶解性メディエーター産生の差異を特徴付けした。移入９日後、脾臓の野生型メソＣＡＲ Ｔ細胞は、適度なレベルのＩＦＮを産生し続ける(図３１Ｃ)。予想通り、腫瘍から単離した野生型Ｔ細胞は、脾臓から単離した野生型Ｔ細胞と比較して、これらのサイトカイン産生がはるかに少ない。これは、野生型ＴＩＬが移入９日後機能低下的になり始めたことを示す。対照的に、脾臓Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞は、ベースラインでおよび刺激によりより多くのＩＦＮを産生する(図３１Ｃ)。野生型ＴＩＬと比較して、Ｉｋｚｆ１±ＴＩＬは、高量のＩＦＮ−γを産生した。これらのデータは、Ｉｋｚｆ１±ＴＩＬが免疫抑制性腫瘍微小環境に低感受性であり得ることを示す。
ＴＩＬでしばしば見られるＴＣＲシグナル伝達の近位欠損迂回(Prinz, PU et al., J. Immunol. 2012;188:5990-6000)は、ＰＭＡ／イオノマイシン(ＰＭＡ／Ｉ)の使用により達成できる(Prinz et al., J Immunol. 2012;188:5990-6000)。野生型およびＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞をＰＭＡ／Ｉで再刺激して、ＴＣＲ刺激非感受性野生型およびＩｋｚｆ１±ＴＩＬが、他の刺激に応答してなおサイトカインを産生できるかを決定した。移入９日後、野生型ＴＩＬは、ＩＦＮ−γ産生の顕著な低下を示し(図３１Ｃ)、これはＰＭＡ／Ｉでの刺激により一部回復した(図３１Ｄ)。しかしながら、脾臓および腫瘍単離Ｉｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞の刺激は、野生型移入細胞と比較してなお増加したレベルのＩＦＮ−γを生じた。ＰＭＡ／Ｉ刺激によるＴＣＲシグナル伝達の何らかの欠損の迂回を介して、これらの結果は、ＩＦＮ−γ産生がクロマチンレベルで異なり、差次的Ｉｋａｒｏｓ機能による可能性があることを示す。
移入Ｉｋｚｆ１±Ｔ細胞による抗腫瘍活性の増加に鑑み、免疫抑制性腫瘍微小環境における本組成物の影響も試験し、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)および骨髄系由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)の数を９日目に評価した。移入９日後、野生型またはＩｋｚｆ１±メソＣＡＲ Ｔ細胞を受けた宿主で同様のレベルのＴｒｅｇが観察された(図３１Ｅ)。概して免疫抑制性および腫瘍形成促進性Ｍ２マクロファージとして特徴付けられる、Ｌｙ６Ｇ−／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ２０６＋マクロファージの存在を検出した。処置９日目、ＣＤ２０６発現は全３群(未処置、野生型およびＩｋｚｆ１±)で類似した(図３１Ｆ)。
Ｉｋａｒｏｓが減少したＴ細胞は、可溶性阻害因子ＴＧＦおよびアデノシンに低感受性である
免疫抑制性腫瘍微小環境とメソＣＡＲ Ｔ細胞の相互作用をさらに特徴付けるために、インビトロ培養系を利用した。ＩＤＯ、ＩＬ−１０、アデノシンおよびＴＧＦ−βのような可溶性阻害因子(Wang et al., Oncoimmunology. 2013;2:e26492)は、浸潤性腫瘍リンパ球の阻止に貢献することが示されている。Ｉｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞における選択した阻害因子のインビトロの効果を試験して、免疫抑制性環境がその溶解性機能に影響するか否かを決定した。野生型ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βおよびアデノシン存在下、ＩＦＮ−γを製造する能力が５０％減少し、溶解性機能が減少した(図３２)。Ｉｋａｒｏｓのレベルが減少したＣＡＲ Ｔ細胞(Ｉｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ)は、阻害剤非存在下で野生型カウンターパートより多くのＩＦＮ−γを製造し続け、ＴＧＦ−βおよびアデノシン存在下で、わずかしか阻害されなかった(図３２Ａ)。野生型Ｔ細胞と比較したＩｋｚｆ１±およびＩｋＤＮ ＣＡＲ Ｔ細胞の溶解性機能増加が観察された(図３２Ｂ)。これらのデータは、Ｉｋａｒｏｓが減少したＴ細胞は、ＴＧＦ−βおよびアデノシン阻害に低感受性であることが示される。
考察
本実施例において、腫瘍環境においてＣＡＲ発現Ｔ細胞を生存させ、そのエフェクター機能を増加させる新たな試みが同定された。Ｔ細胞機能に関与する多種多様な遺伝子、例えば、サイトカイン遺伝子(ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)、細胞溶解性メディエーター(グランザイムＢ)およびＴ細胞分化に影響する重要なＴ−ｂｏｘ転写因子(Ｒ−ＢｅｔおよびＥｏｍｅｓ)を阻害することが知られる、転写リプレッサーＩｋａｒｏｓの不活性化である。
上記実験からの重要な知見は、Ｉｋａｒｏｓ機能が欠損したＣＡＲ Ｔ細胞が、腫瘍増殖の抑制に野生型ＣＡＲ Ｔ細胞より有意に良好であったことである(図３０)。これらの結果は複数の腫瘍モデルで、２種の異なるＣＡＲ構築物を使用して観察された。Ｉｋａｒｏｓが制御する遺伝子が多数であるため、Ｉｋａｒｏｓが免疫抑制に通常感受性である多くの経路を制御し得ることは妥当である。ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓレベル減少によるＩＦＮ−ｇ産生増加は、腫瘍におけるクラスＩ ＭＨＣ発現を上方制御でき、それによりその免疫原性を改善し、抗血管形成活性を改善し、Ｔｈ１細胞のＳＴＡＴ１介在機能の駆動をする。ＩＦＮ−γ増加の可能性のある効果は、腫瘍内のマクロファージ表現型の改変であろうが、しかしながら、マクロファージ総数も、Ｍ２様マクロファージ比率も(ＣＤ２０６発現で測定して)差異は観察されなかった。ＩＬ−２産生増加もまたＣＤ４ Ｔｒｅｇ細胞の形成を増加させ得るが、しかしながら、ＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＩｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞で処置した腫瘍を比較したとき、差異は観察されなかった。
注射９日後、腫瘍浸潤性リンパ球数の増加が観察された。３日目のＷＴとＩｋａｒｏｓ欠損ＴＩＬの数が類似していたため、これは輸送増加によるものではなさそうである。むしろ、これらの結果は、Ｉｋａｒｏｓ欠損ＴＩＬが増殖増加または抗原誘発細胞死(ＡＩＣＤ)減少を示したことを示唆する。インビトロ試験は、２タイプのＴ細胞でＡＩＣが類似しており、この差異が増殖増加によるものであるとの可能性を高めた。これは、これらの細胞により産生されるＩＬ−２の増加と一致する。残留性の増加に加えて、Ｉｋａｒｏｓ欠損ＴＩＬは機能低下が低いように見える。腫瘍浸潤性ＣＡＲ Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体またはＰＭＡおよびイオノマイシンで再刺激したとき、Ｉｋａｒｏｓ欠損を有するＣＡＲ ＴＩＬは、野生型カウンターパートよりも多くのＩＦＮ−γを産生できた(図３１Ｃおよび３１Ｄ)。
インビトロ試験は、インビボで観察された抗腫瘍有効性増加の機構的支持のさらなる試験を可能にした。Ｉｋａｒｏｓの既知阻害機能と一致して、１個のＩｋａｒｏｓアレルの欠失(Ｉｋｚｆ±)または１個のアレルのＩｋａｒｏｓドミナントネガティブ構築物への置換(ＩｋＤＮ)は、ベースライン自己分泌ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ産生がいくぶん増加したが(図２６)、より重要なことに、インビトロでのＴＣＲまたはＣＡＲ刺激後著しく増加したサイトカイン分泌および顆粒放出を示した、Ｔ細胞を生じた。これはインビトロでの腫瘍細胞致死増加に附随した。Ｉｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞がＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞より低い活性化閾値を有するか否かを試験するために、Dynabeadsを１０倍低いメソテリンタンパク質で被覆し、Ｉｋｚｆ±ＣＡＲ Ｔ細胞がこの低密度でなおメソテリン抗原に応答し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを産生できるが、ＷＴ ＣＡＲ Ｔ細胞はできなかったことを示した。Ｉｋａｒｏｓ障害ＣＡＲ Ｔ細胞も、ＴＧＦ−βおよびアデノシンのような既知免疫抑制性因子による阻害に、より抵抗性であった(図３２)。これは、恐らく、サイトカイン(すなわちＩＬ−２およびＩＦＮ−γ)およびＴ細胞エフェクター(すなわちグランザイムＢ)遺伝子が、ＴＣＲ／ＣＡＲ活性化後Ｉｋａｒｏｓ欠損Ｔ細胞における転写のためにより利用しやすいとの事実による。これは、免疫抑制性腫瘍微小環境内の最適以下Ｔ細胞活性化に対する代償を助けると考えられる。
先の試験、例えば、実施例９において、第二メッセンジャージアシルグリセロールを代謝し、ＲＡＳ／ＥＲＫ活性化を制限する酵素であるＤＧＫの枯渇により、類似の表現型(すなわち細胞溶解およびＩＦＮ産生の増加)がＣＡＲ Ｔ細胞で観察された。ＤＧＫ欠失を用いて、しかしながら、ＣＡＲ／ＴＣＲシグナル伝達経路の明確な変化が観察された。具体的に、ＲＡＳ／ＥＲＫ活性化は、ＴＣＲおよびＣＡＲ両者での活性化の後劇的に増強された。これは、ＣＤ６９上方制御の増加により測定して、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬおよびＩＦＮ−γのようなエフェクター分子の産生はどうであろうと、活性化を増加させた。パーフォリンおよびグランザイムＢは、ＷＴおよびＤＧＫ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞で類似した。Ｉｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞が本試験で極めて異なる表現型であった。ＤＧＫ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞とは対照的に、Ｉｋａｒｏｓ欠損ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ６９およびＣＤ２５上方制御で示して類似のＣＡＲ／ＴＣＲ活性化(図２８)および複数のＴＣＲシグナル伝達分子のリン酸化により測定して類似のＣＡＲ／ＴＣＲシグナル伝達(図３４)およびカルシウムシグナル伝達を有した。ＤＧＫ欠損Ｔ細胞とは異なり、Ｉｋａｒｏｓ枯渇ＣＡＲ Ｔ細胞は、ベースラインで高いグランザイムＢおよびＩＦＮレベル(図２６および２７)ならびにＥＲＫおよびＡｋｔのようないくつかのＴＣＲシグナル伝達の構成的低レベル活性化を有した(図２８)。このベースライン活性化は、恐らく、ＩＦＮおよびグランザイムＢ遺伝子発現をトランス活性化するＥｏｍｅｓのような他の転写因子と協調する、Ｔ−ｂｅｔ(Thomas et al., J of Biol Chemistry. 2010; 285:2545-53)の誘導による(Pearce et al., Science. 2003; 302:1041-3;およびIntelkofer et al., Nat Immunol. 2005; 6:1236-44)。
これらの知見は、遺伝的または生化学的試みのいずれかを使用して、形質導入ヒトＴ細胞(臨床試験)においてＩｋａｒｏｓを治療ターゲティングとすることが有益である可能性を生じさせる。遺伝的試みは、マウスでこれらの結果を模倣し、ｓｈＲＮＡを使用したＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓのノックダウンまたは内在性Ｉｋａｒｏｓと競合するためのドミナントネガティブ構築物の使用を含む。他の選択肢は、一過性にＩｋａｒｏｓレベルを低下させる薬理学的阻害剤の使用である。最近の報告では、免疫調節剤であるレナリドマイドが、Ｅ３リガーゼ複合体ＣＲＬ４ＣＲＢＮによるユビキチン介在分解についてＩｋａｒｏｓを標的とすることが示されている(Gandhi et al., Br J Haematol. 2013; 164:811-21; Kronke et al, Science. 2014; 343:301-5;およびSakamaki et al., Leukemia. 2013; 28:329-37)。レナリドマイドで処理したＣＤ３刺激ヒトＴ細胞は、Ｉｋａｒｏｓレベルが減少したＴ細胞の重要な性質である、より多くのＩＬ−２を産生する(Gandhi et al., Br J Haematol. 2013;164:811-21)。予備試験において、ＴＣＲ／ＣＤ２８刺激メソテリン−ＣＡＲ形質導入ヒトＰＢＭＣは、インビトロで、レナリドマイドでの前処理後、より多くのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを産生した。それゆえに、ＣＡＲ Ｔ細胞療法とレナリドマイドのインビボ投与の組み合わせは、Ｉｋａｒｏｓの阻害によるＴ細胞機能低下の回復のための治療戦略を提供し得る。
結論として、この実施例は、転写リプレッサーのターゲティングがＣＡＲ介在抗腫瘍免疫を増強できることを最初に示す。本機構は、シグナル伝達の変化を伴わない、サイトカインおよびエフェクター機能増強を含んだ。この試みの臨床への転換は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるＩｋａｒｏｓを標的とするｓｈＲＮＡ、ドミナントネガティブ構築物または薬理学的阻害剤(例えばレナリドマイド)の使用を介して探究できる。
実施例１１：ヒト卵巣癌におけるメソＣＡＲＴ
本実施例において、メソテリンＣＡＲを発現させるために形質導入した自己Ｔ細胞の静脈内注入の安全性を、進行再発性漿液性卵巣癌を有するヒト患者で決定した。
一患者処置プロトコールは、自己Ｔ細胞発現メソテリンＣＡＲ(メソＣＡＲＴ)注入の安全性および実行可能性を評価するための、計画した第Ｉ相治験(実施例３に記載のとおり)を模倣した。患者からのＴ細胞を、４−１ＢＢおよびＴＣＲゼータシグナル伝達ドメインに融合した細胞外抗メソテリン単一鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含むＣＡＲを発現するように形質導入した。３×１０７メソＣＡＲ Ｔ細胞／ｍ２、計４.６５×１０７メソＣＡＲ Ｔ細胞を患者に注入した。注入前に、化学療法剤でのリンパ球枯渇はしなかった。
メソＣＡＲＴ注入は、急性有毒作用はなかった。患者は、グレード３の両側性胸水、呼吸困難、発熱、低血圧および誤嚥を経験した。心膜炎または腹膜炎のような、メソＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍外／標的上効果による臨床毒性はなかった。不明な発熱、昇圧剤を必要とする低血圧、フェリチン(＞７０００ng／mL)およびＣＲＰ(＞１６０mg／Ｌ)の血清レベル増加に基づき、サイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)が疑われるために、注入２１日後に、患者をトシリズマブ(抗ＩＬ６)で処置した。
メソＣＡＲ Ｔ細胞は、末梢血液サンプルならびに肝臓および腹膜からの腫瘍サンプルで検出可能であり、最高数は心膜および胸水であった。サイトカイン評価は、胸水内のＩＬ−６の著しい増加を示し(ベースラインから＞８０倍増加)、２２〜２３日目でピークであった。血液の評価は、血中のＩＬ−６レベル増加も確認した(２２日目にベースラインから１５倍増加)。ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γレベルの増加は検出されなかった。
予備的結果は、２１日目に実施した腹部および骨盤のＣＴ造影が、２週間前のＣＴ造影と比較して腹膜癌腫症が最小限改善したことを示した。具体的に、１個の腫瘍が３.４×３.１cmから３.０×２.６cmに減少した。左側胸水からの細胞診は注入８日後の悪性腫瘍を示したが、２１日目および２６日目には、悪性腫瘍の証拠はなかった。
これらの結果は、リンパ球枯渇を伴わないメソＣＡＲ Ｔ細胞の注入が実行可能であり、かつ安全であったことを示した。注入による毒性または重篤な心膜炎もしくは腹膜炎の証拠はなかった。また、悪性胸水の消失により証明されるように、処置有効性の臨床的証拠があった。
実施例１２：種々の細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲの一過性発現
本実施例において、ＣＡＲ構築における異なる共刺激ドメインの使用ならびに細胞寿命延長、記憶分化および細胞代謝特徴におけるその効果を試験する。
インビトロＴ細胞刺激の新規系を、一ラウンドのＣＡＲ特異的刺激の結果を試験し、多様なＣＡＲシグナル伝達エンドドメインによるシグナル伝達を解析するために開発した。ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８：ｚおよび４−１ＢＢ：ｚの種々の細胞内シグナル伝達ドメインを有する、インビトロ転写ｍＲＮＡコード化抗メソテリンＳＳ１−ＣＡＲ構築物を、初代静止ヒトＴ細胞にした。この方法で、９０％を超えるＣＡＲ陽性Ｔ細胞集団が達成された。ＣＡＲ発現確認後、Ｔ細胞を、ビーズに固定化した組み換えメソテリンで刺激し、培養した。ＲＮＡが一過性に発現されるため、ＣＡＲは、１ラウンドの刺激後に細胞表面から消失し、ＣＡＲ単独によるシグナル伝達の明確な解析を可能にする(すなわち、さらなるメソテリン結合事象からのその後のシグナル伝達がない)。それゆえに、この試みは、内在性Ｔ細胞受容体を介する刺激の必要性を排除し、ＣＡＲ Ｔ細胞の代替抗原によるシグナル伝達の解析を始めて可能にした。これらの実験を初代末梢血Ｔ細胞、選別ナイーブＴ細胞および臍帯血液細胞で実施した。
種々のＣＡＲ構築物(ＳＳ−１とＣＤ３ゼータ、ＳＳ１とＣＤ２８：ｚおよびＳＳ１と４−１ＢＢ：ｚ)を、Ｔ細胞表面に同等のレベルで発現させた。全てのシグナル伝達ドメインは、メソテリンを発現する標的細胞と培養したとき、同等なおよび特定の細胞溶解能を有することが示された。
４−１ＢＢｚ含有ＣＡＲによる初代Ｔ細胞刺激は、ＣＤ２８ベースのＣＡＲと比較したとき、優れた生存および増殖プロファイルを示した。４−１ＢＢおよびＣＤ２８ベースのＣＡＲのいずれも、５を超える集団倍加を示した。しかしながら、４−１ＢＢベースのＣＡＲＴは、インビトロで長く増殖した。４−１ＢＢベースのＣＡＲ Ｔ細胞の表現型解析は、中央メモリー表面マーカーを有する細胞集団が産生されたことを確認した。対照的に、ＣＤ２８ベースのＣＡＲは、ＣＡＲ Ｔ細胞のエフェクター記憶プールに急速に分化した。
ＣＤ２８ｚ含有ＣＡＲは、４−１ＢＢｚカウンターパートと比較して、有意に高い比率のエフェクター記憶細胞を産生し、阻害ＰＤ−１、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３分子の発現増加は中程度であった。これらの結果は、バルク末梢血Ｔ細胞、ナイーブ(ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ９５−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋選別)末梢血Ｔ細胞または臍帯血Ｔ細胞の出発集団を使用したかに一致したままであった。
培養におけるSea-Horseアッセイ(Seahorse Biosciences)を使用したメソテリン刺激ＣＡＲ Ｔ細胞の代謝プロファイリングは、ＣＤ２８ｚカウンターパートと比較して、４−１ＢＢｚ−ＣＡＲ刺激細胞における脂質酸化の相当な増加を確認した。さらに、マイクロアレイ試験は、異なるＣＡＲシグナル伝達ドメインでの刺激後回収した細胞における独特な遺伝子サインを確認している。
合わせて、これらの結果は、ＣＡＲ Ｔ細胞が共刺激ドメインによって差次的生存および機能を示すことを示す。この系はまた新規ＣＡＲ設計の迅速な特徴づけおよび機能的解析も可能にする。
実施例１３：高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、ｍＴＯＲ経路である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(ＨＳＣ)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な疲弊したＰＤ−１陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798;およびShimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間の処置がＨＳＣ機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
ヒト加齢関連表現型に対するｍＴＯＲ阻害の効果をおよびｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が免疫老化を軽減するかを評価するために、ＲＡＤ００１またはプラセボを投与された高齢志願者におけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、ＲＡＤ００１が、十分耐容性である用量で高齢志願者のインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。ＲＡＤ００１はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、ｍＴＯＲ阻害が高齢志願者における免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１での６週間処置は、高齢ヒト志願者におけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
方法
治験集団
不安定な基礎疾患のない６５歳以上の高齢志願者が、ニュージーランドおよびオーストラリアの９箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン＜９.０ｇ／dL、白血球数＜３,５００／mm３、好中球数＜２,０００／mm３または血小板数＜１２５,０００／mm３、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする 医学的状態、概算糸球体濾過速度＜３０ml／分、重度の未管理高コレステロール血症(＞３５０mg／dL、９.１mmol／Ｌ)または高トリグリセリド血症(＞５００mg／dL、５.６mmol／Ｌ)の存在を含んだ。
処置アーム間のベースライン個体群統計学は類似した(表８)。２１８名の参加対象中、２１１名が治験を終了した。７名は治験を中止した。５名は有害事象(ＡＥ)が原因であり、１名は同意の上中止し、１名はプロトコール違反の結果、治験を去った。
＊肥満度指数は、身長(ｍ)の二乗で除した体重(kg)である
治験設計および遂行
２０１１年１２月から２０１２年４月まで、２１８名の高齢志願者が、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるＲＡＤ００１対プラセボ比５：２で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
ＲＡＤ００１ ０.５mg連日またはプラセボ
ＲＡＤ００１ ５mg毎週またはプラセボ
ＲＡＤ００１ ２０mg毎週またはプラセボ
であった。
ＲＡＤ００１ ０.５mg連日および２０mg毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるＲＡＤ００１錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験職員は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は６週間であり、その間、対象は２週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が４週間投与された後、ＲＡＤ００１定常レベルを投与前および投与１時間後に測定した。６週間コースの治験薬完了後、対象はＲＡＤ００１が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために２週間休薬させ、その後株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を含む２０１２年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Agrippal(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種４週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。３種のインフルエンザワクチン株ならびに２種の異種株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９特異的ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および４週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、Good Clinical Practiceの原則に従い、適切な倫理委員会および規制統御句に承認された。
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている６週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院日から３０日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は８４日目測定値であった。６３日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたＳＡＳ ９.２ ｐｒｏｃを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ＝ＵＮ)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも１回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した２１８名の対象中１９９名治験が治療企図集団であった。
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、６週間の治験薬処置後および対象が６週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した４週間後である治験の最後の３時点に採血した全血から単離した。７６個のＰＢＭＣサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで８色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。７６個のＰＢＭＣサブセットを、８色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能＞８０％および２×１０６細胞を超える収量のＰＢＭＣサンプルを解析に入れた。
ベースラインから治験薬処置６週目までおよびベースラインから治験の最後(１２週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各ＲＡＤ００１投薬コホートで計算した。スチューデントＴ検定を行い、ベースラインから２回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で０とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の６週目または１２週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
３投薬群下の７６表現型の６０８試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のＦＤＲ(ｑ値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するｑ値≦０.１の０.０５有意水準で棄却された。０.０５有意水準および対応するｑ＜０.１で棄却される複数試験調節戦略は、結果の１０％未満が偽であることを確実にした。
第二の解析において、免疫表現型は、全３個のＲＡＤ００１投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置６週目およびベースラインと治験終了時(１２週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。７６個の表現型の１５２試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300;およびSun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、ＦＤＲ(ｑ値)計算を、それぞれ各層内で実施した。０.０５有意水準およびｑ値２０％未満での全帰無仮説は棄却された。これは、０.０５未満のＰ値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである２０％未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
結果
一般に、ＲＡＤ００１は、特に０.５mg連日および５mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。３名の対象は、ＲＡＤ００１と無関係であると評価された４つの重篤な有害事象(ＳＡＥ)を経験した。４つのＳＡＥは、先に６週間５mg毎週ＲＡＤ００１の６週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明；プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率＞２％の処置関連有害事象(ＡＥ)の一覧を表９に提供する。最も一般的なＲＡＤ００１関連ＡＥは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、ＲＡＤ００１を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のＡＥ発生率は類似した。１個の重度のＡＥのみがＲＡＤ００１と関連すると評価され、２０mg毎週ＲＡＤ００１処置対象の口腔内潰瘍であった。
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を改善する能力を、２０１２年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。３種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種４週間後の血球凝集阻害(ＨＩ)幾何平均力価(ＧＭＴ)を表１０に示す。一次解析変数は、ＨＩ ＧＭＴ比(ワクチン接種４週間後／ベースライン)であった。治験を、少なくとも３種のインフルエンザワクチン株中２種において、１)プラセボに対して相対的に≧１.２倍ＧＭＴ；および２)８０％以上が、１を超えるプラセボ補正ＧＭＴ比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、ＭＦ−５９ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザＧＭＴ比の１.２倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
ベースラインは、インフルエンザワクチン接種２週間前を示す
４週目はインフルエンザワクチン接種４週間後を示す
Ｎはコホートあたりの対象数である
ＧＭＴは幾何平均力価である
ＧＭＴ比は、ワクチン接種４週目のＧＭＴ／ベースラインのＧＭＴである
ＣＶ％は、変動係数を示す
治療企図(ＩＴＴ)集団において、高用量(２０mg毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１(０.５mg連日または５mg毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図３３Ａ)。これは、低用量でＲＡＤ００１の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、ｍＴＯＲ阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦１：４０)のサブセットの対象は、ＩＴＴ集団より高い力価のＲＡＤ００１関連増加を経験した(図３３Ｂ)。これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ベースラインで予防的(＞１：４０)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露／応答相関を示す(図３４)。Ｓ６キナーゼ(Ｓ６Ｋ)のｍＴＯＲ介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、２０mg毎週投与レジメンがｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋ活性をほぼ完全に阻止し、５mg毎週投与レジメンはＳ６Ｋ活性を５０％を超えて阻止し、０.５mg連日投与レジメンは、Ｓ６Ｋリン酸化を投与の合間に約３８％まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１での、部分的ｍＴＯＲ阻害、例えば、ｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量ＲＡＤ００１でのほぼ完全なｍＴＯＲ阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
インフルエンザワクチン接種４週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、ＨＩ力価＜１：１０)から、ワクチン接種後ＨＩ力価≧１：４０への変化または非陰性(≧１：１０)ワクチン接種前ＨＩ力価からの少なくとも４倍増加として定義された。治療企図集団、Ｈ３Ｎ２およびＢ株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表１１)。ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０の対象の亜集団において、ＲＡＤ００１処置はまたＨ３Ｎ２およびＢ株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、０.５mg連日投薬コホートでＢ株に対して統計額的有意性に達した。これらのデータは、さらにＲＡＤ００１が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
＊ ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。ＲＡＤ００１が高齢志願者におけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に含まれないインフルエンザの２種の異種株に対するＨＩ力価を測定した。異種株に対するＨＩ ＧＭＴ比の増加は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった(図３５)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった。５mgおよび２０mg毎週ＲＡＤ００１投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、Ｈ３Ｎ２異種株に対して統計的有意であった(表１２)。プールしたＲＡＤ００１コホートについてのＨ３Ｎ２抗体陽転率は３９％であり、それに対しプラセボコホートは２０％であった(ｐ＝０.００７)。ここに示した結果は、ｍＴＯＲ阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢志願者の血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、Ｂ細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザＩｇＭレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザＩｇＭおよびＩｇＧレベルがＲＡＤ００１コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、ＲＡＤ００１で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図３６)。
＊ ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(治験薬中止６週間後)に対象から得たＰＢＭＣサンプルで実施した。大部分のＰＢＭＣサブセットのパーセンテージはＲＡＤ００１コホートとプラセボの間で差がなかったが、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で低かった(図３７)。ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞は年齢とともに蓄積し、ＰＤ−１がＴ細胞受容体誘発Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージの経時的増加があった。１２週目(ワクチン接種４週間後)で、インフルエンザウイルスがＰＤ−１陽性Ｔ細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全ＲＡＤ００１コホートでＣＤ４ ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージは６週目および１２週目でベースラインから下がった(図３７Ａ)。ＣＤ８ ＰＤ−１陽性細胞のパーセンテージも、２つの低用量ＲＡＤ００１コホートで６週目および１２週目の両者でベースラインから下がった(図３７Ｂ)。ＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１コホートで増加した(図３７Ｃ)。
ＲＡＤ００１コホートからの結果をプールし、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)で、６週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の３０.２％の統計的に有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であった(図３８Ａ)。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図３８Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の統計的に有意な３７.４％の減少を示し、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)である。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤ００１の１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。それゆえに、図３７および３８の結果は、合わせて、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
結論
結論として、ここに提供したデータは、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
ＲＡＤ００１投薬をワクチン接種２週間前に中断したため、ＲＡＤ００１の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、ＲＡＤ００１が、プラセボと比較して疲弊したＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。ＰＤ−１発現はＴＣＲシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、ＲＡＤ００１が高齢志願者における慢性免疫活性化を減少し、それによりＰＤ−１発現を減少させた可能性がある。ＲＡＤ００１はまたイムノフィリンシクロスポリンＡについて報告されているように、ＰＤ−１発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１誘発減少は、Ｔ細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、ｍＴＯＲ阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶ＣＤ８ Ｔ細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、ｍＴＯＲ阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてＲＡＤ００１対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
ＲＡＤ００１がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後Ｂ細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種２週間前にＲＡＤ００１を中止した高齢対象におけるＢ細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
インフルエンザ抗体力価に対するＲＡＤ００１の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているＭＦ５９ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のＲＡＤ００１駆動増強は、高齢者におけるＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、ＲＡＤ００１はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、ｍＴＯＲ阻害剤の免疫調節効果が用量および／または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆ＲＡＤ００１暴露／ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なｍＴＯＲ阻害は通常のシクロフィリン−ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的ｍＴＯＲ阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、ｍＴＯＲ活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、ｍＴＯＲ活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、ｍＴＯＲ活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
加齢関連適応症の処置におけるＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのＲＡＤ００１の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血および高血糖を含む。しかしながら、これらのＡＥは、血中のＲＡＤ００１のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したＲＡＤ００１投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。０.５mg連日、５mg毎週および２０mg毎週投薬コホートの平均ＲＡＤ００１トラフレベルは、それぞれ０.９ng／ml、０.３ng／ml(定量下限)未満および０.７ng／mlであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、６週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、０.５mg連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するｍＴＯＲ阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
実施例１４：高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。ｍＴＯＲ阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、高齢志願者におけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
ＲＡＤ００１の次の３投与レジメンを治験で使用した：
２０mg毎週(トラフレベル：０.７ng／ml)
５mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
０.５mg連日(トラフレベル：０.９ng／ml)
移植および腫瘍適応症で承認されているＲＡＤ００１の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。１０mg連日腫瘍学投与レジメンに付随するＲＡＤ００１のトラフレベルは約２０ng／mlである。０.７５〜１.５mg ｂｉｄ移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約３ng／mlである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは３〜２０倍低かった。
ＲＡＤ００１関連ＡＥがトラフレベルと関係するため、３投与レジメンは正常志願者に対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、３用量は、一定範囲のｍＴＯＲ阻害を与えることが予想された。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０ Ｓ６Ｋ)は、ｍＴＯＲによりリン酸化される下流標的である。Ｐ７０ Ｓ６Ｋリン酸化のレベルは、ｍＴＯＲ活性の指標として働く。ＲＡＤ００１の前臨床試験および臨床試験で得たＰ７０ Ｓ６Ｋリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、２０mg毎週が丸一週間ｍＴＯＲ活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方５mg毎週および０.５mg連日はｍＴＯＲ活性を一部阻害すると予測された。
６５歳以上の高齢志願者を、３つのＲＡＤ００１処置群(５０対象／アーム)またはプラセボ(２０対象／アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で６週間処置し、２週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種４週間後、インフルエンザワクチンの３インフルエンザ株(Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(ＧＭＴｓ)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(１)安全性および耐容性および(２)ワクチン接種４週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の２／３のインフルエンザ力価の１.２倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の１.２倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。５mg毎週および０.５mg １日用量は十分耐容性であり、２０mg毎週用量と異なり、ＧＭＴ主要評価項目を満たした(図３３Ａ)。高齢志願者においてプラセボと比較して、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、２３種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の７種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。６／７血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全３つのＲＡＤコホートで増加した。
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(８０〜１００％未満)ｍＴＯＲ阻害が、完全なｍＴＯＲ阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
実施例１５：低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのｍＴＯＲ阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例２に記載した０.５mg連日投薬コホートの対象も、投与１年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図３９)。これらのデータは、ラパログでの部分的ｍＴＯＲ阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
実施例１６：ＲＡＤ００１でのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、ｍＴＯＲ活性を部分的に阻害すると予測されるＲＡＤ００１の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、Ｐ７０ Ｓ６ＫはｍＴＯＲによりリン酸化され、Ｐ７０ Ｓ６Ｋのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたｍＴＯＲの下流標的である。それゆえにモデリングを、Ｐ７０ Ｓ６Ｋ活性を一部阻害するＲＡＤ００１の用量で行った。≧０.１mgおよび＜２０mgの範囲の毎週投薬がＰ７０ Ｓ６Ｋ活性の部分的阻害を達成すると予測される(図４０)。
連日投薬について、３０pM〜４nMの濃度のＲＡＤ００１が細胞株におけるＰ７０ Ｓ６Ｋ活性を部分的に阻害する(表１３)。これらの血清濃度は、≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１の用量で達成されると予測される。
結論
Ｐ７０ Ｓ６Ｋを部分的にしか阻害しない用量のｍＴＯＲ阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法。加齢適応症における低用量のＲＡＤ００１での部分的ｍＴＯＲ阻害の有効性は予想外の発見である。≧０.１mg〜＜２０mg毎週および≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１用量範囲が部分的ｍＴＯＲ阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
実施例１７：卵巣癌におけるＭＳＬＮ ＣＡＲＴ
２×１０６メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与の抗腫瘍活性を、実施例８に記載のとおり、先に卵巣腫瘍マウスモデルでインビボで評価した。実施例８に記載のような、本モデルにおけるＭ５およびＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞での抗腫瘍活性が増加されるかを見るために、腫瘍体積が平均１５０mm３となったときである腫瘍移植１４日後に高用量の４×１０６メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞を投与し、同一用量のＣＡＲ Ｔ細胞を再投与した。マウスの半分は、ＣＡＲ Ｔ細胞の二回目の同一用量を５日後に受け、これが先にこのモデルで見られた抗腫瘍活性を増強するかを見た。
材料および方法：
細胞株：ＯＶＣＡＲ８は、卵巣腺癌を有する６４歳女性患者に由来し、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するように形質導入されているヒト卵巣癌細胞株である。細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＲＭＰＩ培地で増殖させた。この細胞株は、組織培養フラスコに接着性で増殖する。この細胞株は、側腹部に皮下的にインプラントし、マトリゲルと混合したとき、マウスで腫瘍を形成する。移植中のマトリゲルの細胞への付加は、マトリクスがマウスの側腹部で発達することを可能にし、これが腫瘍細胞が増殖開始するための構造を提供する。１０〜１２日間にわたり、マトリゲルプラグは分解し、残った固形腫瘍は腫瘍細胞および周辺間質細胞からなる。ＯＶＣＡＲ８細胞はｍＣｈｅｒｒｙを発現するように修飾されており、そのため腫瘍細胞増殖をマウスの造影によりモニターもできる。
マウス：６週齢ＮＳＧ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgTM1Wjl/SzJ)マウスをJackson Laboratory(stock number 005557)から得た。動物は、Novartis NIBRI animal facilityで少なくとも３日気候馴化させ、その後実験した。動物を、Novartis ACUC regulations and guidelinesに従い取り扱った。動物同定用電子トランスポンダを、腫瘍移植１日前に左側腹部にインプラントした。腫瘍移植前に、マウスの右側腹部を剪毛した。
腫瘍移植：対数期のＯＶＣＡＲ８細胞を、０.２５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理後に採取した。細胞を５０mlファルコンチューブで、１２００rpmで５分、１回増殖培地中、次いで２回冷無菌ＰＢＳで洗浄した。細胞を、１００×１０６／mlの濃度でＰＢＳに再懸濁し、氷上に置いた。細胞を含むＰＢＳ溶液を、次いで、マトリゲルと１：１で混合し、５０×１０６細胞／ml ＰＢＳ−マトリゲルの最終濃度を得た。細胞を氷上に置き、直ぐにマウスにインプラントした。腫瘍を、２００μlを右側腹部に皮下にインプラントした。
ＯＶＣＡＲ８モデルは、内因性にメソテリンを発現し、それゆえに、ＣＡＲ Ｔ細胞に指向性のメソテリンのインビボ有効性の試験に使用できる。このモデルは、マウスの側腹部に皮下インプラントしたとき良好に増殖し、腫瘍体積測定のためにカリパス測定できる。ＰＢＳおよびマトリゲルの５０：５０混合物中１０×１０６腫瘍細胞の移植により、１週間で腫瘍は確立され、適格に測定できる。１３〜１５日以内に、平均腫瘍体積は１００〜２００mm３になり、腫瘍は６０〜６５日までにエンドポイント体積(１０００〜１２００mm３)に達する。治療剤の抗腫瘍活性は、しばしば、腫瘍が完全に生着し、マトリゲルが再吸収されたら試験する。それゆえに、ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性が観察できるまでに、このモデルには大きな窓がある。
ＣＡＲ Ｔ細胞投薬：マウスに４×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞(１３.３×１０６総Ｔ細胞)を腫瘍移植１４日後に投与した。細胞を３７℃水浴で一部解凍し、細胞を含むチューブへの１mlの冷無菌ＰＢＳ添加により完全に解凍した。解凍した細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに調節した。細胞を、各時１０００rpmで１０分で洗浄し、次いで血球計数器で計数した。次いで、Ｔ細胞を１３３×１０６細胞／ml 冷ＰＢＳの濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上に置いた。マウスに、マウスあたり４×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞(１３.３×１０６総Ｔ細胞)用量の１００μlのＴ細胞を尾静脈から静脈内注射した。７匹のマウス／群は１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)またはアイソタイプＣＡＲを形質導入したＴ細胞(アイソタイプ)のいずれかで処置した。１４匹のマウス／群を、ＳＳ１メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍ５メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ１１メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかで処置した。５日後、ＳＳ１、Ｍ５およびＭ１１群を半分に分け、各群７匹のマウスを、同一の二回目のＣＡＲ Ｔ細胞で処置した。群はＳＳ１単(１用量のＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞)、ＳＳ１二倍(２用量のＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞)、Ｍ５単(１用量のＭ５ ＣＡＲ Ｔ細胞)、Ｍ５二倍(２用量のＭ５ ＣＡＲ Ｔ細胞)、Ｍ１１単(１用量のＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞)、Ｍ１１二倍(２用量のＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞)として同定した。アイソタイプＴ細胞、ＳＳ１ Ｔ細胞、Ｍ５ Ｔ細胞およびＭ１１ Ｔ細胞は、全て、平行して同じドナーから調製した。
動物モニタリング：週２回の体重測定を含み、マウスの健康状態を毎日モニターした。体重の変化パーセントを(ＢＷ現在−ＢＷ初期)／(ＢＷ初期)×１００％として計算した。腫瘍を週に２〜３回、カリパス測定によりモニターし、腫瘍体積(ＴＶ)を楕円体式：ＴＶ(mm３)＝((長さ×幅２)×３.１４１５９))／６を使用して計算した。腫瘍体積を、平均±平均の標準誤差(ＳＥＭ)として報告する。処置／対照(Ｔ／Ｃ)値パーセントを次の式：
ΔＴ≧０であるならば、％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ；
ΔＴ＜０であるならば、％退縮＝１００×ΔＴ／Ｔ初期；
(式中、Ｔ＝試験最終日の薬物処置群の平均腫瘍体積であり、Ｔ初期＝投薬初日の薬物処置群の平均腫瘍体積であり、ΔＴ＝試験最終日の薬物処置群の平均腫瘍体積−投薬初日の薬物処置群の平均腫瘍体積であり、Ｃ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積であり、ΔＣ＝試験最終日の対照群の平均腫瘍体積−投薬初日の対照群の平均腫瘍体積である)
を使用して計算した。１００％〜４２％の範囲のＴ／Ｃ値は、抗腫瘍活性がないか最小限であると解釈し、＜４２％および＞１０％のＴ／Ｃ値は抗腫瘍活性または腫瘍増殖阻害を有すると解釈する。Ｔ／Ｃ値≦１０％または退縮値≧−１０％は腫瘍静止と解釈する。退縮値＜−１０％は退縮と記録する。
結果：
メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、皮下卵巣腺癌異種移植モデルで評価した。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを処置群に無作為化し、４×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞(１３.３×１０６総Ｔ細胞)を、腫瘍移植１４日後、外側尾静脈から静脈内注射した。２回目の同一用量のＴ細胞を、５日後にマウスの半分に与えた。腫瘍増殖および動物の健康状態を、動物がエンドポイントを達成するまでモニターした。全群のマウスを５７日目〜６２日に、腫瘍が、動物ボディ・コンディション・スコアを変化させる、潰瘍の徴候を示し始めたときに殺した。
全処置群の平均±ＳＥＭ腫瘍体積を図４３にプロットする。Ｔ細胞を受けなかったＰＢＳ処置群は、皮下にインプラントされたＮＳＧマウスのベースラインＯＶＣＡＲ８腫瘍増殖動態学を示す。アイソタイプ処置群は、対照ＣＡＲで形質導入したＴ細胞を受けた。これらの細胞は、このモデルにおけるヒトドナーＴ細胞の非特定の応答を示すためのＴ細胞対照として働く。ＰＢＳおよびアイソタイプ処置群の両者は、本試験を通した継続的腫瘍進行を示す。アイソタイプ群は、ドナーＴ細胞の背景活性によりわずかに遅い腫瘍増殖を示す。先の試験に類似して、４×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の単回投与は、ＳＳ１処置群の腫瘍増殖を変化させなかった。二回投与のＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、同様にＯＶＣＡＲ８腫瘍増殖を変化させなかった。Ｍ５およびＭ１１単回投与群は、先の２×１０６ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を投与したときと同様、明確な抗腫瘍活性を示す。Ｍ５およびＭ１１二回投与群の両者とも、単回投与群と比較して、抗腫瘍活性の増加を示した。これらの群の腫瘍は、腫瘍増殖阻害とは対照的に、退縮を示した。Ｍ５二回投与群は、７匹中４匹のマウスで、複数の時点で測定可能な腫瘍なく、完全な退縮を示す。
アイソタイプ群に対する腫瘍体積変化(デルタＴ／Ｃ％)を、腫瘍潰瘍化によりマウスを除く前の、最後の腫瘍体積測定である５２日目に計算した。表１４は、各群のデルタＴ／Ｃ値を示す。ＳＳ１単および二回投与群のいずれも、ＰＢＳ対照処置群と同様抗腫瘍活性を示さなかった。Ｍ５単回投与群は、デルタＴ／Ｃ値３０.２８％で腫瘍増殖阻害を示し、Ｍ５二回投与群は、−６３.９０％の退縮値で退縮を示した。Ｍ１１単回投与群は、デルタＴ／Ｃ値５２.９１％で最小の抗腫瘍活性を示し、Ｍ１１二回投与群はまた−１５.８０％の退縮値で退縮を示した。
考察：
この試験は、メソテリン特異的ＣＡＲ Ｔ細胞(Ｍ５およびＭ１１)が、最初のＴ細胞投与５日後に２回目の投与をしたとき、ＯＶＣＡＲ８腫瘍の退縮をもたらすことができることを示した。この応答は、Ｍ５およびＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞の両者の単回投与後の抗腫瘍活性とともに、耐久性がある。さらに、Ｍ５二回投与群における７匹中４匹のマウスが、カリパスまたは触診で測定可能な腫瘍がない完全な退縮を示す。
例えば、実施例８において先に見られるように、Ｍ５またはＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞の２×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与は、ＮＳＧマウスのＯＶＣＡＲ８異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性および静止状態のようなものが示される。本実験において、４×１０６ Ｍ５またはＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞の単回投与は同じ結果を示す。アイソタイプＣＡＲ Ｔ細胞またはＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、Ｍ５およびＭ１１群は、単回投与でも明確な抗腫瘍活性を示す(図４３)。ＳＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の２回目の投与は抗腫瘍応答の増加を示さない。しかしながら、Ｍ５またはＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞の２回目の投与は、これら両群で抗腫瘍応答を増強させ、腫瘍の退縮に至る。
Ｍ５およびＭ１１ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性増加は、いくつかの機構が原因であり得る。第一には、高用量のＣＡＲ Ｔ細胞はＯＶＣＡＲ８モデルにおける退縮を達成することである。ＣＡＲ Ｔ細胞の用量を、例えば、８×１０６ ＣＡＲ Ｔ細胞に、例えば、単回投与で増やすと、抗腫瘍活性が増強され、退縮をもたらし得る。他の機構は、さらなる用量のＣＡＲ Ｔ細胞が抗腫瘍活性および腫瘍退縮を改善することである。例えば、初回投与は、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞によるサイトカイン産生により、いくぶん抗腫瘍活性を生じ得る。さらなる投与、例えば、細胞がまだ増殖中の５日後に２回目の投与をすると、先に投与されたＣＡＲ Ｔ細胞により既に産生されているサイトカインにより、細胞の活性が増加し得る。
さらに、先の試験は、ＯＶＣＡＲ８腫瘍へのＣＡＲ Ｔ細胞の浸潤を示している。ＣＡＲ Ｔ細胞の浸潤はまた、ＣＤ８＋(細胞毒性)Ｔ細胞の大きな浸潤があるかを決定するために、ＣＡＲ Ｔ細胞の二回投与を受けたマウスでも試験する。ＣＡＲ Ｔ細胞の残留性もこれらのマウスの脾臓および骨髄における細胞の解析により評価する。
実施例１８：水素−重水素交換マススペクトロメトリーによるエピトープマッピング
水素−重水素交換(ＨＤＸ)マススペクトロメトリーを実施して、ｓｃＦｖ構築物ＳＳ１およびＭ５により認識されているエピトープに貢献するメソテリンの領域を予測した。ＨＤＸにおいて、標的タンパク質のアミド主鎖の水素を重水素と交換する。標的タンパク質と結合タンパク質、例えば、抗体の間の相互作用は、標的タンパク質の領域を溶媒到達性から“保護”し、それにより標的タンパク質と結合タンパク質の界面の水素交換を阻止する。したがって、ＨＤＸマススペクトロメトリーを使用して、タンパク質結合界面のマッピング、例えば、抗体のエピトープの予測のためにプローブできる。
実施例２に記載のように、ＳＳ１に対するＳＰＲベースのエピトープビニングによるｓｃＦｖ構築物Ｍ５、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１４、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ２１およびＭ２３の解析は、Ｍ５およびＭ１１がＳＳ１と異なるエピトープに結合することを示した。ＳＳ１およびＭ５により結合され得るヒトメソテリンの領域への見識を深めるために、ＨＤＸマススペクトロメトリーを次のとおり実施した。
発現プラスミドのクローニング
メソテリン(Uniprot Q13421)のアミノ酸Ｖａｌ２９７〜Ｇｌｙ５８８に対応するＤＮＡフラグメントを、それぞれ５’および３’で制限部位ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを使用して哺乳動物発現ベクターにクローン化した。その後、分泌シグナルを、アミノ酸
に対応するアミノ末端に導入した。カルボキシル末端に、アミノ酸
に対応するＶ５−Ｈｉｓタグも導入した。３箇所の予想グリコシル化部位Ｎ３８８Ｑ、Ｎ４９６ＱおよびＮ５２３Ｑを変異させた。最終の発現配列を下に示す。
グリコシル化欠損メソテリン(２９６−５８８；Ｎ３８８Ｑ、Ｎ４９６Ｑ、Ｎ５２３Ｑ)
Ｍ５ ＩｇＧ(例えば、配列番号４３)に対応するｓｃＦｖも同様に哺乳動物発現ベクターにＮ末端リーダー
およびＣ末端８ヒスチジン精製タグ
を用いてクローン化した。最終の発現配列を下に示す。
タンパク質発現および精製
メソテリンおよびｓｃＦｖ Ｍ５の両者を、Ｅｘｐｉ２９３発現系(Life Technologies)においてＣＭＶプロモーターの制御下に発現させた。メソテリンおよびｓｃＦｖプラスミドを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地(Life Technologies)中、１mgの各精製プラスミドおよび５mgのポリエチレンイミン(ＰＥＩ)を使用して、２.３×１０６細胞／mLの密度および生存能＞９７％で２ＬのＥｘｐｉ２９３細胞に共遺伝子導入した。メソテリンを、１mgのプラスミドＤＮＡおよび２.５mgの ＰＥＩを使用する１Ｌの細胞以外、類似のプロトコールに従い、単独でも遺伝子導入した。遺伝子導入を５日間継続し、細胞を生存能が８０％に達したとき収集した。
生存能が８０％に低下すると、細胞および馴化を開始し、４０００×ｇで１０分遠沈した。次いで馴化培地を０.２２μMフィルターで濾過して、あらゆる残骸を浄化し、一夜、RocheのcOmplete His-Tag Purification Resinと共に４ｏＣで撹拌した。計３mLのビーズをｓｃＦｖ−Ｍ５／メソテリン馴化培地に添加し、１.５mLのビーズをメソテリン単独培地に添加した。
翌朝、ビーズをBio-Rad Econo-Columnに載せ、１５カラム体積の５０mM Ｔｒｉｓ.Ｃｌ ｐＨ＝８.０、３００mM ＮａＣｌ、続いて８カラム体積の５０mM Ｔｒｉｓ.Ｃｌ ｐＨ＝８.０、３００mM ＮａＣｌ、２０mMイミダゾールで洗浄した。次いでタンパク質を５０mM Ｔｒｉｓ.Ｃｌ ｐＨ＝８.０、３００mM ＮａＣｌ、２５０mMイミダゾールでカラムから溶出した。溶出サンプルを回収し、６mLに濃縮し、２０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７.４、１５０mM ＮａＣｌ中、AKTAxpress(GE)に連結したSuperdex 75 16/60カラムに載せた。メソテリン：Ｍ５複合体またはメソテリン単独の予測サイズに対応する溶出物を回収し、５mg／mLに濃縮した。
水素−重水素交換／マススペクトロメトリーによるエピトープマッピング
マススペクトロメトリー(ＭＳ)と組み合わせた水素−重水素交換(ＨＤｘ)(Woods VL, Hamuro Y (2001) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (DXMS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in Pharmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp.; 84(37): 89-98)を使用して、ここで、ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８(配列番号２７８)と呼ぶ、ヒトメソテリン(２９６〜５８８)上のｓｃＦｖ抗体Ｍ５およびＳＳ１の推定結合部位をマップした。ＨＤｘにおいて、タンパク質の交換可能アミド水素を重水素に置き換える。この過程は、タンパク質構造／動力学および溶媒到達性に感受性であり、それゆえに、リガンド結合により重水素取り込みの減少を受けている位置を報告できる。
ＨＤｘ／ＭＳ実験を、文献に記載のものに類似する方法を使用して実施した(Chalmers MJ, Busby SA, Pascal BD, He Y, Hendrickson CL, Marshall AG, Griffin PR (2006) Probing protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem.; 78(4): 1005-1014.Chalmers, 2006)。実験を、LEAPオートサンプラー、nanoACQUITY UPLCおよびSynapt G2マススペクトロメーターを含むWaters HDx/MSプラットフォームで実施した。重水素でｈＭＳＬＮ２９６〜５８８のタンパク質主鎖を標識するために使用した重水素緩衝液は、２５mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.４であり、溶液中の重水素の全般的なパーセンテージは９４.５％であった。抗体不在下のｈＭＳＬＮ２９６〜５８８重水素標識実験のために、６.９μl体積の４００pmolのｈＭＳＬＮ２９６〜５８８を１００μlの重水素緩衝液を使用して１５分、４℃で希釈した。次いで標識反応を１００μlの冷却クエンチ緩衝液で２℃で３分停止させ、続いてＬＣ−ＭＳ系に自動化ペプシン消化およびペプチド解析のために注入した。
ｓｃＦｖ Ｍ５存在下のｈＭＳＬＮ２９６〜５８８重水素標識実験のために、体積６.９μlのＭ５と共発現した４００pmolのｈＭＳＬＮ２９６〜５８８を、１００μlの重水素緩衝液を１５分、４℃で使用して希釈した。次いで標識反応を１００μlの冷却クエンチ緩衝液で２℃で３分停止させ、続いて自動化ペプシン消化およびペプチド解析のためにＬＣ−ＭＳ系に注入した。ｓｃＦｖ ＳＳ１存在下のｈＭＳＬＮ２９６〜５８８重水素標識実験のために、４００pmolのｈＭＳＬＮ２９６〜５８８を４８０pmolのＳＳ１ ｓｃＦｖと組み合わせる。３０分、４℃でＳＳ１とｈＭＳＬＮ２９６〜５８８をインキュベーション後、総量６.９μlを１００μlの重水素緩衝液を１５分、４℃で使用して希釈した。次いで標識反応を１００μlの冷却クエンチ緩衝液で２℃で３分停止させ、自動化ペプシン消化およびペプチド解析のためにＬＣ−ＭＳ系に注入した。
全ての重水素交換実験を、０.５Ｍ ＴＣＥＰおよび３Ｍ 尿素(ｐＨ＝２.６)を使用して反応停止させた。反応停止後、交換された抗原を、Poroszyme Immobilized Pepsinカラム(２.１×３０mm)を１２℃で使用するオンラインペプシン消化と続くWaters Vanguard HSS T3トラップカラムによるトラップに付した。ペプチドをトラップカラムから溶出し、Waters BEH C18 １×１００mmカラム(１℃に維持)で、４０μl／分の流速で、２〜３５％Ｂ(移動相Ａは９９.９％水および０.１％ギ酸であり、移動相Ｂは９９.９％アセトニトリルおよび０.１％ギ酸であった)の二元８.４分勾配を使用して分離した。
重水素交換実験によりモニターしたｈＭＳＬＮ２９６〜５８８からのペプチドを図４４に示す(各棒はペプチドを示す)。ｈＭＳＬＮ２９６〜５８８の８０％を超える範囲が達成された。
結合した状態の抗体と未結合の状態の抗体(Ｍ５またはＳＳ１)間の差次的実験のために、これら２つの状態間の重水素取り込みの差を試験することは有益である。図４５Ａおよび４５Ｂにおいて、負の値はメソテリン−抗体複合体がメソテリン単独と比較して重水素取り込みが少ないことを示す。重水素取り込みの減少は、交換可能重水素からの領域の保護または水素結合ネットワークの安定化によるものであり得る。対照的に、正の値は、該複合体がメソテリン単独と比較して重水素取り込みが多いことを示す。重水素取り込みの増加は、水素結合ネットワークの脱安定化(すなわちタンパク質の局在的変性)によるものであり得る。
アポメソテリン(apo mesolethin)とＳＳ１またはＭ５のいずれかと複合体化したメソテリンの間の差次的重水素交換は、１)差が０.７５Daより大きいならば、または差が０.７５Da以下である場合、２)差が０.２Daより大きく、テューキー検定を使用したとき統計的に有意である(ｐ＜０.０１)ならば、有意と考えた。例えば、Houde D, Berkowitz SA, Engen JR (2010) The Utility of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Comparability Studies. J. Pharma. Sci.; 100(6): 2071-2086; Chalmers, MJ, Pascal BD, Willis S, Zhang J, iturria SJ, Dodge JA, Griffin PR (2011) Methods for the Analysis of High Precision Differential Hydrogen Deuterium Exchange Data Int. J. Mass Spectrom.; 302(1-3): 59-68参照。
図４５Ａは、メソテリンのアミノ酸２９７位から４６４位のＭ５−メソテリン複合体の差次的重水素取り込み(黒色棒)およびＳＳ１−メソテリン複合体の差次的取り込み(灰色棒)を示す。この領域を超えて、メソテリンへのＭ５の結合は保護を起こさず、一部極わずかな脱安定化が観察される。対照的に、メソテリンへのＳＳ１の結合は、次のペプチドに有意な保護をもたらした：２９７〜３１５、３１５〜３２２、３１６〜３２５、３３７〜３４６、３３７〜３４９、３５０〜３７５および３６９〜３７６。ペプチド２９７〜３１５、３１５〜３２２、３１６〜３２５、３３７〜３４６、３３７〜３４９の保護は、残基Ｅ３１３、Ｆ３１７、Ｋ３１９、Ｐ３４３およびＹ３４６がエピトープの相当部分を形成する、公表された結晶学構造と一致する((Ma J, Tang WK, Esser L, Pastan I, Xia D (2012) Recognition of Mesotehlin by the Therapuetic Antibody MORAb-009 J. Biol. Chem.; (287)40: 33123-33131)。図４５Ｂは、メソテリンのアミノ酸位置４５８〜５８６についての差次的重水素取り込みを示す。この領域を超えて、Ｍ５の結合は、次のペプチドに有意な保護をもたらした：４８１〜４９０、４８３〜４９０、４９８〜５１０、５０１〜５０７、５３１〜５４０、５３２〜５４０、５３２〜５４６、５３７〜５４６、５４５〜５５８、５４６〜５６９、５４７〜５６０、５５８〜５７１、５６１〜５７２。重複ペプチドの保護を比較することにより、我々は、領域４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７および５４５〜５７２がＭ５−メソテリン複合体で顕著に保護されていると推定した。対照的に、ＳＳ１−メソテリン複合体は、上記基準を使用して、顕著に保護された領域４５８〜５８６におけるいずれのペプチドも含まなかった。
図４６は、Ｍ５およびＳＳ１複合体両者の保護領域の概要を示す。これらのデータは、Ｍ５が排他的にメソテリンのＣ末端側に対して保護し、アミノ酸残基４８５〜４９０、４９８〜５０７、５３２〜５３７および５４５〜５７２がＭ５−メソテリン相互作用に寄与し得ることを示唆する。対照的に、ＳＳ１は排他的にメソテリンのＮ末端側に対して保護し、ＳＳ１より保護される領域およびＭ５より保護される領域との重複は見られなかった。ＳＳ１とＭ５の２個の異なる保護パターンの観察は、Ｍ５がＳＳ１と異なるエピトープに結合する可能性を示唆する。Ｍ１１は、Ｍ５と比較して、ＭＳＬＮと類似の領域に結合することが予測される？Ｍ１１およびＭ５は同一ＣＤＲ３領域を含み、軽鎖および重鎖の両者に高相同性を有する。
均等物
ここに引用した各および全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明を特定の面を引用して開示しているが、本発明の他の面およびバリエーションが、他の当業者により、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく考案され得る。添付する特許請求の範囲は、全てのこのような面および同等のバリエーションを含むと解釈されることを意図する。

Claims (44)

  1. （ｉ）ヒト抗メソテリン結合ドメイン；（ｉｉ）膜貫通型ドメイン；および（ｉｉｉ）刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であって、ここで、該抗メソテリン結合ドメインが
    （ａ） 配列番号２０３の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号２２７の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、配列番号２５１の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；ならびに配列番号１３８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号１５６の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１７９の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）；または
    （ｂ） 配列番号２０９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２３３のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号２５７のＬＣ ＣＤＲ３；ならびに配列番号１４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１６２のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号１８５のＨＣ ＣＤＲ３
    を含む、
    単離核酸分子。
  2. 抗メソテリン結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項１に記載の単離核酸分子。
  3. 抗メソテリン結合ドメインが
    （ｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｖ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｖ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｖｉ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｖｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｖｉｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｘ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１または２に記載の単離核酸分子。
  4. （ａ） 抗メソテリン結合ドメインが、配列番号４３、配列番号４９、または配列番号４３または配列番号４９と９５〜９９％同一性を有する配列を含む；または
    （ｂ） 抗メソテリン結合ドメインをコードする核酸配列が、配列番号９１、配列番号９７、または配列番号９１または配列番号９７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸分子。
  5. （ａ） 膜貫通型ドメインがＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメインを含む；
    （ｂ） 膜貫通型ドメインが配列番号６を含む；
    （ｃ） 膜貫通型ドメインが配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む；
    （ｄ） 膜貫通型ドメインが配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む；または
    （ｅ） 膜貫通型ドメインをコードする核酸配列が配列番号１７の配列または配列番号１７と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、
    請求項１〜４のいずれかに記載の単離核酸分子。
  6. 抗メソテリン結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通型ドメインに接続され、
    （ａ） ヒンジ領域が配列番号２、または配列番号２と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、または
    （ｂ） ヒンジ領域が配列番号１３によりコードされるアミノ酸配列を含むか、またはヒンジ領域が配列番号１３の核酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
  7. さらに共刺激ドメインをコードする配列を含み、
    （ａ） 共刺激ドメインがＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインであるか、または共刺激ドメインが配列番号７の配列を含む；
    （ｂ） 共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む；
    （ｃ） 共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む；
    （ｄ） 共刺激ドメインをコードする核酸配列が配列番号１８の配列を含むか、または共刺激ドメインをコードする配列が配列番号１８の核酸配列と少なくとも９０％同一性を有する配列を含む；または
    （ｅ） 共刺激ドメインが配列番号１８の核酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、
    請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
  8. 細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子。
  9. 細胞内シグナル伝達ドメインが、
    （ｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列；
    （ｉｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｖ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０の配列、ここで、該細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される；または
    （ｖ） 配列番号１８の配列またはこれと９５〜９９％同一性を有する配列によりコードされるアミノ酸配列、および配列番号２０または配列番号２１の配列またはこれらと９５〜９９％同一性を有する配列によりコードされるアミノ酸配列
    を含む、請求項８に記載の単離核酸分子。
  10. さらにリーダー配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の単離核酸分子。
  11. リーダー配列が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離核酸分子。
  12. 配列番号６７または配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる単離キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子。
  13. ヒト抗メソテリン結合ドメイン；膜貫通型ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ヒト抗メソテリン結合ドメインが、
    （ｉ） 配列番号２０３の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号２２７の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号２５１の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；ならびに配列番号１３８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号１５６の重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１７９の重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）；または
    （ｉｉ） 配列番号２０９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２３３のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号２５７のＬＣ ＣＤＲ３；ならびに配列番号１４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１６２のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号１８５のＨＣ ＣＤＲ３
    を含む、
    単離キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子。
  14. ヒト抗メソテリン結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項１３に記載の単離ＣＡＲ分子。
  15. ヒト抗メソテリン結合ドメインが、
    （ｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｉｖ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｖ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｖｉ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    （ｖｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｖｉｉｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｘ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１３または１４に記載の単離ＣＡＲ分子。
  16. 膜貫通型ドメインが、
    （ｉ） Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通型ドメイン；
    （ｉｉ） 配列番号６のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ） 配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｖ） 配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  17. ヒト抗メソテリン結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通型ドメインに接続され、ヒンジ領域が配列番号２またはこれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  18. 細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインが、
    （ａ） ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメイン；
    （ｂ） 配列番号７のアミノ酸配列；
    （ｃ） 配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｄ） 配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  19. 細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１３〜１８のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  20. 細胞内シグナル伝達ドメインが、
    （ｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列；
    （ｉｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｉｖ） 配列番号７のアミノ酸配列および配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１９に記載の単離ＣＡＲ分子。
  21. 細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が同じフレーム内にかつ単一ポリペプチド鎖として発現される、請求項２０に記載の単離ＣＡＲ分子。
  22. さらにリーダー配列を含む、請求項１３〜１９のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  23. リーダー配列が配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項２２に記載の単離ＣＡＲ分子。
  24. 配列番号６７または配列番号７３から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６７または配列番号７３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１３〜２３のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子。
  25. （ａ） 配列番号２０３のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２２７のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号２５１のＬＣ ＣＤＲ３；ならびに配列番号１３８のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１５６のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号１７９のＨＣ ＣＤＲ３；または
    （ｂ） 配列番号２０９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２３３のＬＣ ＣＤＲ２、配列番号２５７のＬＣ ＣＤＲ３；ならびに配列番号１４４のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号１６２のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号１８５のＨＣ ＣＤＲ３
    を含む、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）ＣＤＲを含むヒト抗メソテリン結合ドメイン。
  26. （ｉ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域および重鎖可変領域；
    （ｉｉ）
    （ａ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｂ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｃ） 配列番号４３または配列番号４９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列
    を含む軽鎖可変領域；または
    （ｉｉｉ）
    （ｄ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域を含むアミノ酸配列；
    （ｅ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列；または
    （ｆ） 配列番号４３または配列番号４９の重鎖可変領域と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列；
    を含む重鎖可変領域
    を含む、請求項２５に記載のヒト抗メソテリン結合ドメイン。
  27. プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
  28. ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２７に記載のベクター。
  29. 請求項２７または２８に記載のベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
  30. 免疫エフェクター細胞を請求項２７または２８に記載のベクターでインビトロで形質導入することを含む、免疫エフェクター細胞の製造方法。
  31. インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞にインビトロで導入することを含み、ここで、ＲＮＡが請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む、ＲＮＡ操作細胞の集団の産生方法。
  32. 哺乳動物における抗癌免疫を提供する方法において使用するための請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞であって、該方法が哺乳動物に該細胞の有効量を投与することを含む、細胞。
  33. メソテリンの発現と関係する疾患を有する哺乳動物の処置方法において使用するための請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞であって、該方法が哺乳動物に該細胞の有効量を投与することを含む、細胞。
  34. 疾患が中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、転移性膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるメソテリンと関係する癌である、請求項３３に記載の使用のための細胞。
  35. 医薬として使用するための、またはメソテリンを発現する疾患の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項１２〜２４のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子、請求項２５〜２６のいずれかに記載の抗メソテリン結合ドメイン、請求項２７または２８に記載のベクターまたは請求項２９に記載の細胞。
  36. さらに細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二ポリペプチドと結合した阻害分子の少なくとも一部を含む第一ポリペプチドを含むポリペプチドを発現する、請求項２９に記載の細胞。
  37. 請求項３３または３４に記載の使用のための細胞であって、ここで、核酸をインビトロ転写を使用してＴ細胞またはＮＫ細胞に導入し、対象は核酸を含む細胞の最初の投与と１回以上のその後の核酸を含む細胞の投与を受け、ここで、１回以上のその後の投与は、前回の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に投与する、細胞。
  38. 哺乳動物における抗癌免疫を提供するための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞の使用。
  39. メソテリンの発現と関係する疾患を有する哺乳動物を処置するための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞の使用。
  40. 疾患が中皮腫、悪性胸膜中皮腫、非小細胞性肺癌、小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌または大細胞肺癌、膵臓癌、膵管腺癌、転移性膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌および膀胱癌またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるメソテリンと関係する癌である、医薬の製造のための請求項３９に記載の使用。
  41. メソテリンを発現する疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項１２〜２４のいずれかに記載の単離ＣＡＲ分子、請求項２５または２６に記載の抗メソテリン結合ドメイン、請求項２７または２８に記載のベクターまたは請求項２９に記載の細胞の使用。
  42. さらに細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二ポリペプチドと結合した阻害分子の少なくとも一部を含む第一ポリペプチドを含む阻害分子を発現する、医薬の製造のための請求項２９に記載の細胞の使用。
  43. 核酸をインビトロ転写を使用してＴ細胞またはＮＫ細胞に導入する、医薬の製造のための請求項３９または４０に記載の使用。
  44. 医薬の製造のための請求項３９、４０または４３のいずれかに記載の使用であって、該細胞は、
    核酸を含む細胞の最初の投与；および
    １回以上のその後の核酸を含む細胞の投与
    のために製剤され、
    ここで、１回以上のその後の投与は、前回の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に投与する、
    使用。
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