JP6847036B2

JP6847036B2 - アセトインを産生する方法

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Publication number: JP6847036B2
Application number: JP2017524104A
Authority: JP
Inventors: メラニー・ブルモン; カリーヌ・ジャイヤールドン; ドミニク・ルイ; ドミニク・トマ
Original assignee: アルデリス
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2015-07-23
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2035-07-23
Also published as: US10301655B2; CN106715679A; EP3172313A1; US20170159081A1; KR20170041768A; CN106715679B; JP2020195384A; IL250099A0; BR112017001542A2; RU2017101673A; WO2016012561A1; JP2017525388A; IL250099B; AU2015293864A1; AU2015293864B2; CA2956184C; RU2686614C2; KR102281701B1; NZ728287A; CA2956184A1

Description

本発明は、改善されたアセトイン経路を有する微生物に関する。組換え微生物が、無改変微生物に比べてアセトインの産生を改善させるため改変される。本発明は、このような微生物を用いてアセトインを産生させる方法も提供する。

3-ヒドロキシブタノン又はアセチルメチルカルビノールとしても知られているアセトインは、細菌中でピルビン酸(pyruvate)から2つの酵素の作用により形成される、その酵素とは、すなわち、2つのピルビン酸分子の単一の脱カルボキシル化での縮合を触媒してα-アセト乳酸が得られるα-アセト乳酸シンターゼと、この最後のものをアセトインに脱カルボキシル化するα-アセト乳酸デカルボキシラーゼである(Juni、1952)。

アセトインは、一般に食品産業において使用される香味料であり、より安全であるとみなされていることが理由でジアセチルから置き換わっている(Huang、2011)。アセトインは、キイチゴ、イチゴ、バニラ、クルミ、ラム、バター、バタースコッチ、カラメル、ココナツ、コーヒー及び果実各香味料のための調合物中に香味料成分として使用される。アセトインは、アルコール性及び非アルコール性の飲料、例えば、クリームソーダに添加されてもよい。そのバターのような香味料は、アイスクリーム、アイス、キャンディー、焼いた製品(baked goods)、マーガリン、ゼラチンデザート、カッテージチーズ、マーガリン及びショートニングによく適している。アセトインは、美容産業では香料中で、及びアロマ担体として芳香剤中で使用される。最後に、アセトインは、タバコ中の及び電子タバコ中の香味料剤としてトップの化学的な添加物のうちの1つである。更に、アセトインは、化学の有用な中間体である、メチルビニルケトン(MVK)の前駆体である。

アセトインの伝統的な化学合成は、石油不足及び環境汚染の難点に直面しており、一方、食物香味料としてのアセトインの市場は、現在のところ、年間割合で5から5,5%なおも増殖しており、2018年には140億ドルに達すると予想されている。芳香剤市場は、2018年には160億ドルを超えると予想されている。

過去において伝統的な化学プロセスによってのみ製造することができた多くの化学物質は、現在、再生可能資源を用いて、生物学的に生成される可能性を有しうる(Danner&Braun、1999;Hatti-Kaulら、2007)。アセトインの微生物産生は、そのような例の1つである。このバイオプロセスに対する関心は、著しく増加しており、その理由は、アセトインが上述のように多数の産業上の適用を有しており、微生物産生が、プラットホーム化学物質の製造のために石油供給への依存性を緩和すると見込まれるからである。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)は、そのようなバイオプロセスの特によく適したプラットホームである(Nielsen 2013)。アセトインの微生物産生に関して、大部分の研究は、アセトインを産生させるために、微生物、例えば、カンジダグラブラータ(Candida glabrata)、枯草菌(Bacillus subtilis)を使用した(Shubo Liら、Microbial Cell Factories 2014、13:55;Silbersack Jら、Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Dec;73(4):895-903;

したがって、GRAS(すなわち、一般に安全であると認識される)微生物によるアセトイン産生が望ましいであろう。酵母、より詳細には、出芽酵母が、これに関して、適切な微生物である。出芽酵母は、天然でアセトインを産生することが知られているが、アセトイン産生の収率及び生産性は乏しい。エタノール産生は実は出芽酵母における効率的なアセトイン産生について実際に最も明白な障壁であり、その理由は、鍵となる中間体であるピルビン酸がアセトインというよりむしろエタノールを産生するために優先的に使用されるからである。

国際公開第2004/076659号米国特許第2011/0124060号国際公開第2013/076144号国際公開第2006/134277号国際公開第2011/041426号

Shubo Liら、Microbial Cell Factories 2014、13:55 Silbersack Jら、Appl Microbiol Biotechnol. 2006 Dec;73(4):895-903 DiCarloら、(Nucl. Acids Res.、vol. 41、No. 7、2013: 4336-4343) D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) Casal M,ら、(1999)、J. Bacteriol.、181(8): 2620-3 Tanakaら、(2012) Appl Environ Microbiol.、78(22): 8161-3 Shaoら、(Nucleic Acids Research、2009、Vol. 37、No. 2: e16) Shaoら、(Methods in Enzymology、2012 Elsevier Inc.、Vol. 517: 203 Wangら、(Biochemistry、2001、40: 1755-1763) Poulsenら、(Eur. J. Biochem. 185、1989: 433-439) Dulieuら、(Enzyme and Microbial Technology 25、1999: 537-542) Lopez DE FELIPEら、(International Daily Journal、2001、vol. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946)) velculescuら、(1997) Cell 88、243-251 Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2、337-347 busckeら、biosource technology 2013 Kimら、(Bioresource Technology、vol. 146、2013 : 274) Kimら、(Journal of Biotechnology、2014) Thomas及びRothstein (1989)、Cell. 56、619-630 Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke、D. Dawson、T. Stearns CSHL Press Gonzalesら(2010)、Applied and environmental Microbiology 76 670-679

したがって、明らかな理由のため、微生物プロセスを通してアセトインの産生を改善すること、より詳細には、ピルビン酸をアセトインに変換することは、継続的な課題のままである。より詳細には、特に産業化要件に適合する、アセトインの増強された産生収率を有する安定な組換え微生物の必要性がなお存在する。

本発明は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組換え酵母に関し、そのゲノム中には:
- アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする1つ又は複数の核酸、及び
- NADHオキシダーゼ(NOXE)をコードする1つ又は複数のコピーの核酸
が挿入されている。

特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、以下の式:
(I)5'-[遺伝子1]_x1-3'及び5'-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(II)5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(III)5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-[遺伝子3]_x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)
を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含んでいてもよい。

好ましくは、「x1」、「x2」及び「x3」のうちのそれぞれは、相互に独立に、0から12、より詳細には0から5の範囲、特に0から3の範囲を含む0から15の範囲の整数を表し、更に良好には1に等しい整数を表す。

別の特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、同一又は異なる、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの上述の式(II)のDNA構築物であって、「遺伝子3」がNADHオキシダーゼをコードする核酸を意味するDNA構築物を含んでいてもよい。

更に別の特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、同一又は異なる、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物であって、各式(IIa)が以下の式:
(IIa) 5'-[(prom5)_y1-遺伝子1-term5]_x5-[prom1-遺伝子1-term1]_x1-[prom2-遺伝子2-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-遺伝子3-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2、遺伝子3、「x1」、「x2」及び「x3」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。

別の特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、同一又は異なる、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物であって、各式(IIb)が以下の式:
(IIb) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE;「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。

別の特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、少なくとも2つの式(II)、(IIa)又は(IIb)のDNA構築物を含んでいてもよく、但し、NOXEの核酸の全てのコピーは、少なくとも2つの式(II)、(IIa)又は(IIb)のDNA構築物の1つに位置する。

別の特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、少なくとも2つの、好ましくは厳密に2つの、以下の式(IIc)及び(IId):
(IIc) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x7-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE;「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」及び「term5」;「x1」、「x2」及び「x3」;及び「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは(better still)3に等しい整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)
のDNA構築物を含んでいてもよい。

本発明はまた、メチルビニルケトンを包含する、アセトイン及び/又はその誘導体の産生のための、本発明による組換え酵母の使用に属する。

本発明はまた、アセトインの産生のための方法に関し、前記方法は以下の工程:
(a)適切な培養培地において本発明による組換え酵母を培養する工程;及び
(c)アセトインを回収する工程
を含む。

好ましくは、前記培養培地は、好ましくはグルコース及びスクロースを含む群から選択される炭素源を含む。

エタノールの産生をアセトインに有利に置き換えるような組換え酵母株中の代謝経路を示す図である。

定義
本明細書で使用される、用語「微生物」は、人工的に改変されていない酵母を指す。微生物「アクセプター」に組み込まれ、発現することになる外来の遺伝因子を供する場合、又は遺伝子構築若しくはタンパク質発現のためのツールとして使用される場合に、微生物は「ドナー」となりうる。本発明の微生物は、アセトインの生合成のための遺伝子を発現する酵母のうちから選ばれる。

本明細書で使用される、用語「組換え微生物」又は「遺伝子改変された微生物」又は「組換え酵母」又は「遺伝子改変された酵母」は、遺伝子改変された又は遺伝子操作された酵母を指す。これは、これらの用語の通常の意味に従って、本発明の微生物が、天然に見出されず、天然に見出される相当する微生物からの遺伝因子の導入又は欠失又は改変のいずれかによって改変されることを意味する。特定の淘汰圧下で、定方向突然変異誘発及び進化を組み合わせることによって新しい代謝経路の発生及び進化を強制することによって改変することもできる(例として、国際公開第2004/076659号を参照されたい)。

外因性遺伝子が宿主微生物における発現を可能にする全てのエレメントとともに微生物に導入される場合に、微生物はこれらの遺伝子を発現するために改変されうる。微生物は、内因性遺伝子の発現レベルを調節するため改変されてもよい。酵母の様な微生物の外因性DNAでの改変又は「形質転換」は、当業者にとってルーチン作業である。特に、本発明による微生物の遺伝的な改変、より詳細には、本明細書に規定する遺伝的な改変は、DiCarloら、(Nucl. Acids Res.、vol.41、No.7、2013:4336-4343)記載される通りにCRISPR-Casシステムを用いることによって行ってもよい。

用語「内因性遺伝子」は、その遺伝子が、野生型株において、任意の遺伝的な改変の前に微生物において存在していたことを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節エレメントに加えて又は内因性調節エレメントを置き換えて異種配列を導入することによって、或いは1つ又は複数の補充コピーの遺伝子を染色体又はプラスミドに導入することによって過剰発現されてもよい。内因性遺伝子は、それらの発現及び/又は活性を調節するため改変されてもよい。例えば、変異は遺伝子産物を改変するためコード配列に導入されてもよい或いは異種配列は内因性調節エレメントに加えて又は内因性調節エレメントを置き換えて導入されてもよい。内因性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性の上方制御及び/又は増強、或いは、内因性遺伝子産物の活性の下方制御及び/又は減弱をもたらしうる。内因性遺伝子の発現を増強する別の方式は、1つ又は複数の補充コピーの遺伝子を染色体又はプラスミドに導入することである。

用語「外因性遺伝子」は、その遺伝子が当業者によって周知の手段によって微生物に導入されたこと、一方、この遺伝子が野生型微生物において天然に存在しないことを意味する。外因性遺伝子が宿主微生物においてそれらの発現を可能にする全てのエレメントとともに微生物に導入される場合に、微生物はこれらの遺伝子を発現することができる。微生物を外因性DNAで形質転換することは、当業者にとってルーチン作業である。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれてもよく、又は染色体外性にプラスミド若しくはベクターから発現されてもよい。細胞中のそれらの複製開始点及びそれらのコピー数に関して異なる種々のプラスミドは、全て当技術分野において知られている。外因性遺伝子の配列は、宿主微生物におけるその発現のために適合されてもよい。実際、当業者は、コドン使用バイアスという考えについて及びどのようにして、推定されるタンパク質を改変することなく、特定のコドン使用バイアスに核配列(nucleic sequence)を適合するかについて知っている。

用語「異種遺伝子」は、その遺伝子が、それを発現するレシピエント微生物と異なる微生物の種に由来することを意味する。その用語は、微生物において天然に存在しない遺伝子を指す。

本出願において、全ての遺伝子は、それらの共通の名称並びにそれらのヌクレオチド配列及び生じるケースではそれらのアミノ酸配列を参照して参照される。既知遺伝子についての受託番号に与えられる参照を用いて、当業者は、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等における相当する遺伝子を決定できる。このルーチン作業は、他の微生物に由来する遺伝子と配列の整列を行うこと及び別の生物における対応する遺伝子をクローン化するための縮重プローブをデザインすることによって決定することができるコンセンサス配列を用いて有利に行われる。

当業者は、内因性遺伝子の発現を調節する及び特に上方制御する又は下方制御する異なる手段について知っている。例えば、内因性遺伝子の発現を増強する別の方式は、1つ又は複数の補充コピーの遺伝子を染色体又はプラスミドに導入することである。

別の方式は、遺伝子の内因性プロモーターをより強力なプロモーターで置き換えることである。これらのプロモーターは、相同性又は異種性であってもよい。酵母における発現の高レベルを可能にすることが知られている相同性プロモーターは、ADH1、GPDH、TEF1、切断型HXT7、PFK1、FBA1、PGK1及びTDH3等の群において選択されるものである。本発明において特に興味深いプロモーターは、以下により詳しく規定される。

酵母において、核酸発現構築物は、好ましくは、考慮される遺伝子のそれぞれを及び、より詳細には、本発明による上述のALS、ALD及びNOXE酵素のそれぞれをコードする核酸配列に作動可能に連結される、制御配列、例えば、プロモーター及びターミネーター配列を含む。

核酸発現構築物は、5'及び/若しくは3'認識配列並びに/又は選択マーカーを更に含んでもよい。

用語「過剰発現」は、遺伝子の又は酵素の発現が、非改変微生物と比較して増加することを意味する。酵素の発現の増加は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることによって得られる。遺伝子の発現の増加は、当業者によって知られている全ての技術によって行ってもよい。これに関して、プロモーター、特に強力なプロモーター及びターミネーターの間の前記核酸の幾つかのコピーの過剰発現又は導入が意図される核酸の上流の強力なプロモーターの実装がとりわけ引用されうる。

酵素の「活性」は、用語「機能」と交換可能に使用され、本発明に関しては、所望の反応を触媒する酵素の能力を指す。

酵素の「減少した活性」又は「減弱した活性」という用語は、アミノ酸配列における変異によって得られるタンパク質の減少した特異的な触媒活性及び/又はヌクレオチド配列の変異によって若しくは同族の対応する遺伝子の欠失によって得られる細胞におけるタンパク質の低下した濃度のいずれかを意味する。

酵素の「増強された活性」という用語は、例えば、酵素をコードする遺伝子の過剰発現によって得られる、酵素の増加した特異的な触媒活性及び/又は細胞における酵素の増加した量/利用可能性のいずれかを指定する。

「コードする(encoding)」又は「コードする(coding)」という用語は、転写及び翻訳の機構を通して、ポリヌクレオチドがアミノ酸配列を産生するプロセスを指す。

本発明において考慮される酵素をコードする遺伝子は、外因性又は内因性でありうる。

遺伝子の「減弱」は、遺伝子が、非改変微生物におけるよりも下位の割合で発現されることを意味する。減弱は、当業者によって知られている手段及び方法によって達成されてもよく、相同組換えによって得られる遺伝子欠失、遺伝子への外部エレメントの挿入による遺伝子減弱(gene attenuation)又は弱いプロモーター下での遺伝子発現を含有する。当業者は、異なる強度を示す種々のプロモーター及び弱い遺伝的な発現のために使用するプロモーターについて知っている。

本発明において施行される方法は、好ましくは、染色体における特定の位置への異種ヌクレオチド配列の安定的な導入のための又は遺伝子改変された微生物細胞における1つ若しくは複数の標的遺伝子の機能的な破壊のための1つ若しくは複数の染色体組込み構築物の使用を必要とする。幾つかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、関連する機能的タンパク質の発現を妨げる。幾つかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、破壊された遺伝子からの非機能的タンパク質の発現をもたらす。

本発明の実施において変動しうる染色体組込み構築物のパラメータには、相同配列の長さ;相同配列のヌクレオチド配列;組込み用配列の長さ;組込み用配列のヌクレオチド配列;及び標的座位のヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、各相同配列の長さについての有効な範囲は、20から5,000塩基対、優先的には50から100塩基対である。特定の実施形態において、各相同配列の長さは、約50塩基対である。遺伝子ターゲティングに必要とされる相同性の長さについてのより多くの情報については、D.Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)を参照されたい。

幾つかの実施形態において、上述のDNA構築物が挿入されることが意図される、破壊されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、形質転換された微生物細胞の選択に有用な1つ又は複数の選択可能なマーカーを有利に含んでいてもよい。好ましくは、前記選択可能なマーカーは、本発明によるDNA構築物に含まれる。

幾つかの実施形態において、選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性マーカーである。抗生物質抵抗性マーカーの例示には、NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>、及びSH BLE遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。S.ノールゼイ(S.noursei)からのNAT1遺伝子産物はノールゼオスリシン(nourseothricin)に対する抵抗性を与え;出芽酵母からのAURl-C遺伝子産物はオーレオバシジンA(AbA)に対する抵抗性を与え;肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)のHPH遺伝子産物はハイグロマイシンBに対する抵抗性を与え;大腸菌(E.coli)のDSDA遺伝子産物は唯一の窒素源としてD-セリンを有するプレートにおいて細胞が増殖することを可能にし;Tn903トランスポゾンのKAN<R>遺伝子はG418に対する抵抗性を与え;ストレプトアロテイカスヒンダスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus)からのSH BLE遺伝子産物はZeocin(ブレオマイシン)に対する抵抗性を与える。

幾つかの実施形態において、抗生物質抵抗性マーカーは、本発明の遺伝子改変された微生物細胞が単離された後に欠失させる。当業者は、特定の遺伝子に関して適切なマーカーを選択することができる。

幾つかの実施形態において、選択可能なマーカーは、遺伝子改変された微生物細胞における栄養要求性(例えば、栄養素要求性)をレスキューする。このような実施形態において、親微生物細胞は、親微生物細胞を1つ又は複数の栄養素(栄養要求性表現型)を補充しない培地において増殖する能力をなくさせる、酵母におけるアミノ酸又はヌクレオチド生合成経路において機能する1つ又は複数の遺伝子産物、例えば、HIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2、及びURA3遺伝子産物における機能的な破壊を含む。次に、栄養要求性表現型は、破壊された遺伝子産物(NB:遺伝子の機能的なコピーは、クルイロベロマイセス(Kluveromyces)、カンジダ(Candida)等の近い種に由来しうる)の機能的なコピーをコードする染色体組込み体で親微生物細胞を形質転換することによってレスキューすることができる、並びに、生成された遺伝子改変された微生物細胞は、親微生物細胞の栄養要求性表現型の欠損に基づいて選択されうる。

プロモーター配列、コード配列(例えば、酵素コード配列)、又はターミネーター配列を含む核酸配列のそれぞれについて、参照配列が本明細書に記載される。本記載は、参照核酸配列との特定の核酸同一率(%)を有する核酸配列も包含する。

対象のアミノ酸配列のそれぞれについて、参照配列は本明細書に記載される。本記載は、参照アミノ酸配列との特定のアミノ酸配列同一率(%)を有するアミノ酸配列(例えば、酵素アミノ酸配列)も包含する。

明らかな理由のため、全ての本記載において、それぞれ、考慮されるヌクレオチド又はアミノ酸同一性に従う、特定の核酸配列又は特定のアミノ酸配列は、所望の生物活性を示すタンパク質(又は酵素)を得ることに更に導かれるべきである。本明細書で使用される、2つの核酸配列の間又は2つのアミノ酸配列の間の「同一率(%)」は、比較ウィンドウを通じて至適に整列された両方の配列を比較することによって決定される。

したがって、比較ウィンドウにおけるヌクレオチド又はアミノ酸配列の部分は、両方の配列の間の至適な整列を得るように、付加又は欠失(例えば、「ギャップ」)を(これらの付加又はこれらの欠失を含まない)参照配列と比較して含んでいてもよい。

同一率(%)は、同一核酸塩基又は同一アミノ酸残基が比較される両配列について認めることができる位置の数を決定すること、次に同一性が両方の核酸塩基の間で又は両方のアミノ酸残基の間で観察することができる位置の数を比較ウィンドウにおける位置のトータル数で割ること、次に結果に100を乗じて2つの配列の間のヌクレオチド同一率(%)又は2つの配列の間のアミノ酸同一率(%)を得ることによって計算される。

配列至適な整列の比較は、既知のアルゴリズムを用いるコンピュータによって行ってもよい。

最も好ましくは、配列同一率(%)は、CLUSTAL Wソフトウェア(バージョン1.82)を用いてパラメータを以下のとおり設定して決定される:(1)CPU MODE=ClustalW mp;(2)ALIGNMENT="full";(3)OUTPUT FORMAT="aln w/numbers";(4)OUTPUT ORDER="aligned";(5)COLOR ALIGNMENT="no";(6)KTUP(word size)="default";(7)WINDOW LENGTH="default";(8)SCORE TYPE="percent";(9)TOPDIAG="default";(10)PAIRGAP="default";(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none";(12)MATRIX="default";(13)GAP OPEN="default";(14)END GAPS="default";(15)GAP EXTENSION="default";(16)GAP DISTANCES="default";(17)TREE TYPE="cladogram"及び(18)TREE GRAP DISTANCES="hide"。

「発酵」又は「培養」は、培養される微生物に適合し、少なくとも1つの単純な炭素源、及び必要に応じて補基質を含有する、適切な培養培地を有する発酵槽中で一般に行われる。

本明細書に開示される微生物は、ピルビン酸から産物を産生させるための発酵培地中で増殖させてもよい。アセトインの最大産生のために、産生宿主として使用される微生物株は、好ましくは、炭水化物利用の高い割合を有する。これらの特徴は、突然変異誘発及び選択、遺伝的なエンジニアリングによって与えられてもよく、又は天然であってもよい。本細胞のための発酵培地又は「培養培地」は、少なくとも約10g/Lのグルコースを含有してもよい。付加的な炭素基質には、単糖、例えば、果糖、マンノース、キシロース及びアラビノース;オリゴ糖、例えば、ラクトース、マルトース、ガラクトース、若しくはスクロース;多糖、例えば、デンプン若しくはセルロース又はそれらの混合物並びに回復可能な供給原料、例えば、チーズ乳清浸透コーンスティープ液、サトウダイコン糖蜜、及びオオムギ麦芽からの未精製混合物が含まれうるが、これらに限定されない。他の炭素基質は、グリセロールを含んでいてもよい。

それ故、本発明において利用される炭素の供給源は、基質を含有する多様な炭素を包含しうること及び生物の選択によってのみ制限されることが意図される。

全ての上述の炭素基質及びそれらの混合物は本発明に適切であることが意図されるが、好ましい炭素基質は、グルコース、果糖、及びスクロース、又はこれらとC5糖を使用するよう改変された微生物のためのC5糖、例えば、キシロース及び/又はアラビノースとの混合物、並びに、より詳細にはグルコースである。

好ましい炭素基質は、スクロースである。

特定の実施形態によると、本発明による炭素基質は、キシロースからならない。

適切な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者に知られている、培養物の増殖及び所望の産物の産生に必要な酵素経路の促進に適切な、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝剤及び他の成分を含有してもよい。

そのほか、本発明による組換え微生物の増殖のために適切な付加的な遺伝的な改変が、考慮されてもよい。

2,3-BDOに対するアセトインのエスケイプを妨げるため、2,3-BDOへのアセトインの減少に関与する遺伝子は不活化されてもよい。これに関して、内因性ブタンジオールデヒドロゲナーゼbdh1及びbdh2(EC番号1.1.1.4によって特に知られている)が引用されうるが、内因性アルコールデヒドロゲナーゼadh1、adh3及びadh4(ECC番号1.1.1.1によって特に知られている)も引用されうる。前記遺伝子の不活性化は、当業者の技術常識に属する。

弱酸の存在は、増殖のために制限されることが知られており、セルロース又は糖蜜由来培地中にしばしば存在する。

付加的な遺伝的な改変、例えば、JEN1遺伝子(又は系統名:YKL217W又はタンパク質受託番号P36035(UniProtKB swiss-Prot))の破壊及び/又はHAA-1遺伝子(系統名:YPR008W又は受託番号Q12753(UniProtKB swiss-Prot))の過剰発現により、施行される培養培地中の弱酸に対して抵抗性の株の改善が導かれる。

Jen1は、細胞における乳酸の取込み輸送を荷う膜タンパク質である(Casal M,ら、(1999)、J. Bacteriol.、181(8): 2620-3)。

HAA-1は、弱酸に対する抵抗性を荷う膜ストレスタンパク質の発現を制御する転写アクチベータである。その過剰発現により、酢酸に対する酵母の抵抗性が増強される(Tanakaら、(2012) Appl Environ Microbiol.、78(22): 8161-3)。

JEN1遺伝子の破壊及びHAA-1遺伝子の過剰発現は、当業者の技術常識に属し、本明細書に示される方法を用いて特に行ってもよい。

酵母におけるアセトインの合成についての以下の式の観点において、本発明において考慮される条件は、必然的に好気性条件である。

用語「好気性条件」は、最終的な電子受容体として二酸素を使用する好気性又は通性嫌気性微生物に十分である培養培地中の酸素の濃度を指す。

「マイクロ好気性条件」は、酸素の濃度が、空気中の濃度未満、すなわち、6%O₂までの酸素濃度である培養培地を指す。

「適切な培養培地」は、例えば、炭素源又は炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム;リン源、例えば、リン酸一カリウム又はリン酸二カリウム;微量元素(例えば、金属塩)、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩及び/又はマンガン塩;並びに増殖因子、例えば、アミノ酸、ビタミン、増殖プロモーター等の細胞の維持及び/又は増殖に必須な又は有益な栄養素を含む培地(例えば、無菌の液体培地)を指定する。本発明による「炭素源」又は「炭素基質」又は「炭素の供給源」という用語は、ヘキソース(例えば、グルコース、ガラクトース又はラクトース)、ペントース、単糖、オリゴ糖、二糖(例えば、スクロース、セロビオース又はマルトース)、糖蜜、デンプン又はその誘導体、セルロース、ヘミセルロース及びそれらの組合せを含む、微生物の正常な増殖を支持するため当業者が使用することができる任意の炭素の供給源を意味する。

本発明による組換え酵母
上述のように、本発明は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組換え酵母に関し、そのゲノム中には以下のものが挿入されている:
- アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする1つ又は複数の核酸、及び
- NADHオキシダーゼ(又はNOXE)をコードする1つ又は複数のコピーの核酸。

本明細書の実施例に示されているように、本発明者らは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が減少し、アセトインの合成に必要とされるALS及びALD酵素の発現を可能にする遺伝子が更に組み込まれている組換え酵母において、NADHオキシダーゼをコードする核酸の存在、有利には複数のそのコピーの存在が、前記組換え酵母を安定化に寄与するだけでなく、この株の増殖並びにアセトイン産生の収率の有意な増強も可能にすることを予想外に見出した。

対象の代謝産物の産生のための、出芽酵母等のクラブトリー陽性酵母菌、特に出芽酵母等の組換え酵母菌の使用は、有利であり、その理由は、細菌とは対照的に酵母細胞は、グルコース又はスクロース等の十分な量の糖の存在下、酸素の存在下で、発酵を行う能力を有しているからである。対照的に、細菌は、嫌気性条件のみにおいて発酵を行う。更に、酵母菌はウイルス感染を受けず、細菌についてバクテリオファージがいることとは対照的である。なお更に、酵母菌の培養は、細菌等の非所望の微生物による混入を受けるのは稀であるが、その理由は、酵母細胞が、環境、例えば、増殖を支持する培養培地のpH4までの急速な酸性化を引き起こすからである。いっそう更に、酵母細胞は、培養培地中の存在が対象の代謝産物の引き続く精製のために実際上の弱点である、幾つかの望まれない代謝産物、例えば、乳酸を排出しない。なお更に、組換え酵母菌を含む、酵母菌は、細菌と比較して高度な遺伝的安定性を有する。

酵母におけるアセトインの合成についての式は、以下のものである:

前記質量式は、出芽酵母が、酸素の存在下でさえも発酵することができるという事実に従ってありうる。

上記式の観点において、アセトインの最大の理論的な収率は、200gのグルコースのインプットについて97.78gになるであろう。

本明細書の実施例に示されているように、本発明による組換え酵母でのアセトインの実効収率は、この最大の理論的収率(最大83%)に比較的近い。本発明者の知識によると、このような収率は、今までに酵母において決して得られることはなかった。

したがって、アセトインの高い収率での産生は、本発明による組換え酵母において成功裏に到達しており、酵母におけるアセトインの産業上の製造のための道筋が整えられる。

驚くべきことに、本明細書の実施例にも示されているように、酵母細胞において産生されたアセトインの無毒性が、合成されたアセトインの高い濃度でさえも観察される。その上、合成されたアセトインは、細胞の外側に完全に排出輸送されるため、精製プロセスが実質的に単純化される。

本発明による組換え酵母において使用されるNADHオキシダーゼ(又はNOXE)は、非常に特異的な「NADH依存的な」酵素であり、いずれかの炭酸アクセプターを消費しない。この理由のため、選択されたNADHオキシダーゼは、炭酸代謝に直接的に干渉しないが、産生される水にNAD⁺プールを補給する。

これに関して、本発明による組換え酵母において使用されるNADHオキシダーゼは、上述の先行技術文献に並びに特に米国特許出願第2011/0124060号及び国際公開第2013/076144号に開示される「NADH依存的な」酵素とは著しく異なる。

特定の実施形態によると、組換え酵母は、以下の式:
(I) 5'-[遺伝子1]_x1-3'及び5'-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(II) 5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(III) 5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-[遺伝子3]_x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)
を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含んでいてもよい。

好ましくは、「x1」、「x2」及び「x3」のうちのそれぞれは、相互に独立に、0から10の範囲、より詳細には0から5の範囲、特に0から3の範囲の整数を表し、更に良好には1に等しい整数を表す。

本明細書で意図される、x1、x2及びx3のそれぞれは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及び50を含む群から選択される値を有しうる。

上記式(I)から(III)のDNA構築物において、1つ又は複数の整数「x1」、「x2」及び/又は「x3」が、相互に独立に、2以上の値を有する、特定の実施形態では、関連する遺伝子1、遺伝子2及び/又は遺伝子3のうちの対応する遺伝子の2以上のコピーのそれぞれは、同一であってもよく又は異なっていてもよい。ALS、ALD及びNOXEの様々な別個の配列は、本明細書中のTable 1(表1)に示される。

「x1」が2に等しい整数であり、遺伝子1がアセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードする核酸である、上記式(I)から(III)のもののうちから選択されるDNA構築物の例示の実施形態では、前記DNA構築物に含有される2つのALSコード配列は同一であってもよく又は異なっていてもよい。

例えば、この特定の実施形態によると、これは、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸の第1のコピーはALS.Bsをコードする核酸であってもよいこと及びアセト乳酸シンターゼをコードする核酸の第2のコピーはALS.Ppをコードする核酸であってもよいことを意味する。

前記組換え酵母が、式(I)から(III)のDNA構築物を含む群から選択される少なくとも2つのDNA構築物を含む、本発明による組換え酵母の実施形態では、各DNA構築物は、より詳細には、それに含有される関連する遺伝子1、遺伝子2及び/又は遺伝子3のうちの遺伝子のそれぞれは、同一であってもよく又は異なっていてもよい。

以下に、式(I)、(II)及び(III)のDNA構築物を含む群から選択されるDNA構築物の幾つかの例示の実施形態が提示される。

式(I)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(I) 5'-[ALS]₂-3'及び5'-[ALD]₂-3'及び5'-[NOXE]₃-3'
上記式(I)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、そのゲノム中に導入される以下の3つのDNA部分構築物(i)から(iii):
(i)相互に同一又は異なり、2つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はALSをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入される、DNA部分構築物;
(ii)相互に同一又は異なり、2つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はALDをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、その位置はALSをコードする核酸を含むDNA部分構築物が挿入されている位置とは別個である、DNA部分構築物;並びに
(iii)相互に同一又は異なり、3つの核酸を含むDNA部分構築物であって、各核酸はNOXEをコードし、前記DNA部分構築物は前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、その位置は、それぞれ、ALSをコードする核酸を含むDNA部分構築物及びALDをコードする核酸を含むDNA部分構築物が挿入されている、第1及び第2の位置とは別個である、DNA部分構築物
を有する。

幾つかの実施形態において、前記特定の組換え酵母の必要とされる減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのDNA部分構築物(i)から(iii)、又は代わりにそれらの組合せの少なくとも1つの酵母pdc遺伝子における挿入によって得られうる。

式(II)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(II) 5'-[ALS]₂-[ALD]₂-3'及び5'-[NOXE]₃-3'
上記式(II)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の2つのDNA部分構築物(A)及び(B)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]₂-[ALD]₂-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)相互に同一又は異なり、各核酸がALSをコードする、2つの核酸;及び
(ii)相互に同一又は異なり、各核酸がALDをコードする、2つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;並びに
(B)第2のDNA部分構築物5'-[NOXE]₃-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、その位置が、第1のDNA部分構築物が挿入されている第1の位置から離れており、(iii)相互に同一又は異なり、各々がNOXEをコードする3つの核酸を含む、前記第2のDNA部分構築物。

特定の実施形態において、前記特定の組換え酵母の必要とされる減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、第1のDNA部分構築物の及び/又は第2のDNA部分構築物の少なくとも1つの酵母pdc遺伝子における挿入によって得られうる。

式(III)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(III) 5'-[ALS]₂-[ALD]₂-[NOXE]₃-3'
上記式(III)のDNA構築物を含む組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、前記組換え酵母のゲノム中の所望の位置に位置する1つのDNA構築物が挿入されているゲノムを有し、前記DNA構築物は以下のもの:
(i)相互に同一又は異なり、各核酸がALSをコードする、2つの核酸;
(ii)相互に同一又は異なり、各核酸がALDをコードする、2つの核酸;及び
(iii)相互に同一又は異なり、各核酸がNOXEをコードする、3つの核酸
を含む。

特定の実施形態において、前記特定の組換え酵母の必要とされる減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つの酵母pdc遺伝子における前記DNA構築物の挿入によって得られうる。

本発明による組換え酵母の上記これらの3つの例示の実施形態のそれぞれについて、上述のように、「x1」から「x3」は、相互に独立に、2以上の値を有する整数を表し:
- 単一のDNA構築物内の1コピーのALSは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのALSと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのALSと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのALSは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのALSと別個であってもよい。
- 単一のDNA構築物内の1コピーのALDは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのALDと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのALDと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのALDは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのALDと別個であってもよい。
- 単一のDNA構築物内の1コピーのNOXEは、前記DNA構築物に含まれる別のコピーのNOXEと同一であってもよく又は前記DNA構築物に含有される全ての他のコピーのNOXEと同一であってもよく、或いは、代わりに前記1コピーのNOXEは前記DNA構築物に含有される互いのコピーのNOXEと別個であってもよい。

式(III)の1つのDNA構築物及び式(I)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(III) 5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'、及び
(I) 5'-[ALS]₀-3'及び5'-[ALD]₀-3'及び5'-[NOXE]₁₂-3'
生じた組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の2つのDNA部分構築物(A)及び(B)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
並びに
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]₀-3'及び5'-[ALD]₀-3'及び5'-[NOXE]₁₂-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)NOXEをコードする12の核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物。

式(III)の2つのDNA構築物及び式(I)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(III-1) 5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'、
(III-2) 5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'、
(I) 5'-[ALS]₀-3'及び5'-[ALD]₀-3'及び5'-[NOXE]₁₂-3'
生じた組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の3つのDNA部分構築物(A)、(B)及び(C)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]₁-[ALD]₁-[NOXE]₁-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;
(ii)ALDをコードする1つの核酸;及び
(iii)NOXEをコードする1つの核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物;
並びに
(C)第3のDNA部分構築物5'-[ALS]₀-3'及び5'-[ALD]₀-3'及び5'-[NOXE]₁₂-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、以下のもの:
(i)NOXEをコードする12の核酸
を含む前記第3のDNA部分構築物。

式(II)の2つのDNA構築物及び式(I)の1つのDNA構築物を含む組換え酵母:
(II-1) 5'-[ALS]₁-[ALD]₁-3'及び5'-[NOXE]₀-3'、
(II-2) 5'-[ALS]₁-[ALD]₁-3'及び5'-[NOXE]₀-3'、
(I) 5'-[ALS]₀-3'及び5'-[ALD]₀-3'及び5'-[NOXE]₁₂-3'

生じた組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、以下の3つのDNA部分構築物(A)、(B)及び(C)が挿入されているゲノムを有する:
(A)第1のDNA部分構築物5'-[ALS]₁-[ALD]₁-3'及び5'-[NOXE]₀-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第1の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;及び
(ii)ALDをコードする1つの核酸
を含む前記第1のDNA部分構築物;
(B)第2のDNA部分構築物5'-[ALS]₁-[ALD]₁-3'及び5'-[NOXE]₀-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第2の位置に導入され、以下のもの:
(i)ALSをコードする1つの核酸;及び
(ii)ALDをコードする1つの核酸
を含む前記第2のDNA部分構築物;
並びに
(C)第3のDNA部分構築物5'-[NOXE]₁₂-3'であって、前記組換え酵母のゲノムにおける第3の位置に導入され、その位置が、第1のDNA部分構築物が挿入されている第1の位置から離れており、(iii)相互に同一又は異なり、各々がNOXEをコードする、12の核酸を含むDNA部分構築物。

ある特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、上述の式(II)の少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つのDNA構築物であって、「遺伝子3」がNADHオキシダーゼ(又はNOXE)をコードする核酸を意味するDNA構築物を含んでいてもよい。

これらの特定の実施形態によると、遺伝子1及び遺伝子2のうちの各核酸は、ALS及びALDを含む群から選択される核酸を必然的に意味する。これらの実施形態において、少なくとも1コピーの挿入されたALS及びALDが、存在する。式(II)の1つの構築物のみが酵母ゲノムに挿入される実施形態において、遺伝子1及び遺伝子2のうちの各核酸はALS及びALDを含む群から選択される核酸を必然的に意味し、ALS及びALDのそれぞれの1コピーが存在する。式(II)の2以上の構築物のセットが酵母ゲノムに挿入される実施形態において、遺伝子1及び遺伝子2のうちの各核酸はALS及びALDを含む群から選択される核酸を必然的に意味し、ALS及びALDのそれぞれの少なくとも1コピーが式(II)の2以上の構築物の前記セットに存在する。

加えて、本発明による前記組換え酵母は少なくとも2つの上記式(II)のDNA構築物を含む場合、上述の式(II)の前記DNA構築物は、同一であってもよく又は異なっていてもよい。

好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、同一又は異なる、少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物であって、各式(IIa)が以下の式:
(IIa) 5'-[(prom5)_y1-遺伝子1-term5]_x5-[prom1-遺伝子1-term1]_x1-[prom2-遺伝子2-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-遺伝子3-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2及び遺伝子3、「x1」、「x2」及び「x3」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が式(IIa)の少なくとも2つのDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよい又は異なっていてもよい;
- 「prom 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;及び
- 「term 5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)
を有するDNA構築物を含んでいてもよい。

特徴「x5」及び「y1」に関してより明確にするために、関連する特定の実施形態をより詳しく例示する例が以下に提示される:
・「x5」が1に等しい整数であり、「y1」が0に等しい整数を表す場合、考慮される遺伝子1が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子のプロモーターの制御下にあることを意味する;又は
・「x5」が1に等しい整数であり、「y1」が1に等しい整数を表す場合、考慮される遺伝子1が、プロモーター「prom5」の制御下にあることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子の、好ましくはpdc遺伝子のプロモーターの配列は、排除される又は少なくとも中断され、並びにその関連するコード領域の配列である。

加えて、とりわけ特徴「y2」及び「z2」に関しては、以下、関連する特定の実施形態をより詳しく例示する例が以下に提示される(もちろん、これらの以下の例において、「x3」は、1以上の整数を表す):
・「y2」が0に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子のプロモーターの制御下にあることを意味する;又は
・「y2」が1に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、プロモーター「prom3」の制御下にあることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子のプロモーターの配列は、排除される又は少なくとも中断される、並びにその関連するコード領域の配列である。
・「z2」が0に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子の転写ターミネーターに連結されることを意味する;又は
・「z2」が1に等しい整数である場合、考慮される遺伝子3が、転写ターミネーター「term3」に連結されることを意味する。これに関して、DNA構築物が挿入される、内因性遺伝子の転写ターミネーターの配列は、排除される又は少なくとも中断され、並びにその関連するコード領域の配列である。

「z1」に関して、本明細書中に記載される式に存在する場合、「z2」に関する上述のことを準用する。

別の好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、以下の式(IIb)の少なくとも1つの、好ましくは少なくとも2つのDNA構築物を含んでもよい:
(IIb) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- ALS、ALD、NOXE、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom 5はprom 1と同一又は異なり;
- 「term 1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term 5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term 5はterm 1と同一又は異なる)。

別の好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、式(II)、(IIa)又は(IIb)の少なくとも2つのDNA構築物を含んでいてもよく、但し、NOXEの核酸の全てのコピーは、式(II)、(IIa)又は(IIb)の少なくとも2つのDNA構築物の1つに位置する。

別の好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、以下の式(IIc)及び(IId)の少なくとも2つの、好ましくは厳密に2つの、DNA構築物を含んでもよい:
(IIc) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD--(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x7-3';
(式中:
- ALS、ALD、NOXE、「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」、「term5」、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定したものであり;並びに
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは3に等しい整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)。

有利には、式(I)から(III)のDNA構築物における5'-における第1の遺伝子1は好ましくはALSをコードする核酸によって表される遺伝子であり、より詳細には前記第1の遺伝子1は、考慮されるDNA構築物が挿入されている組換え酵母の遺伝子のプロモーターの制御下にある。

より詳細には、式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)のDNA構築物について、「x5」が1に等しい整数を有利に表し、「y1」が0に等しい整数を表すことを意味する。

本発明による上述のDNA構築物及びDNA部分構築物の複雑性の観点において、以下のことが強調される:
・本発明の1つのDNA構築物に関して、「x1」、「x2」及び/若しくは「x3」は、2以上の整数を表し:
o遺伝子1、遺伝子2及び/若しくは遺伝子3のうちの関連する核酸についての各コピーは、同一であってもよく若しくは異なっていてもよく;並びに/又は
o遺伝子1、遺伝子2及び/若しくは遺伝子3のうちの関連する核酸についての各コピーについてのプロモーター及び/若しくはターミネーターは、同一であってもよく若しくは異なっていてもよく;
・組換え酵母が少なくとも2つのDNA構築物を含む場合、前記少なくとも2つのDNA構築物は、以下のことに関して、同一であってもよく又は異なっていてもよい:
(i)DNA構築物が式(I)から(III)を含む群のうちから選択される式により特徴付けられうる、それらの一般式;
(ii)「x1」から「x3」及び「x5」から「x7」、「y1」、「y2」、「z1」及び/若しくは「z2」の値;
(iii)同じ遺伝子に関するプロモーターの性質;
(iv)同じ遺伝子に関するターミネーターの性質;並びに/又は
(v)ALS、ALD及びNOXEが、特に以下Table 1(表1)に示されるように、異なる属に属する生物から由来しうる、同じ遺伝子それ自体の性質。

上記で規定したもの等のDNA構築物を実現するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、最終的には僅かな変更だけをした、Shaoら(Nucleic Acids Research、2009、Vol. 37、No. 2: e16)及びShaoら(Methods in Enzymology、2012 Elsevier Inc.、Vol. 517: 203に記載される方法、より詳細には以下の例において展開される方法を有利に引用しうる。

減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性
酵母における内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換し、これは次にエタノールに又はアセチル-CoAにアセテートを経て変換される。

前に述べたように、本発明は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する組換え酵母に関し、そのゲノム中には特定のDNA構築物が挿入されている。

特定の実施形態によると、組換え酵母は、1つ又は複数の内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼコード遺伝子がスイッチオフされうるとの事実により特徴付けられる。

本発明による組換え酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、当業者によって知られている全ての方法によって減少されてもよい。

これに関して、本発明による組換え酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、例えば、(i)ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする前記少なくとも1つの遺伝子内に少なくとも1つの外因性DNA構築物を当業者によって知られている方法によって挿入することによって破壊すること、(ii)ピルビン酸デカルボキシラーゼ転写を減少させる調節領域中の変異、(iii)特に、AUGをGUGに置き換えることによる、開始コドンにおける変異、及び(iv)活性を変更するコード配列における変異、(v)タンパク質安定性を変更するコード配列における変異、挿入又は欠失(vi)ピルビン酸デカルボキシラーゼmRNA半減期を変更する変異によって減少されてもよい。

第1の選択肢(i)に関して、考慮されるpdc遺伝子を破壊するために施行されるDNA構築物は、前に述べたような本発明によるDNA構築物と異なる外因性DNA構築物、本発明によるDNA構築物、又はそれらの組合せであってもよい。

また、上述のように、式(I)及び(II)の本発明によるDNA構築物は、2以上のDNA部分構築物からそれぞれ構成される。

したがって、特定の実現方法によると、本発明による組換え酵母のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子を、前記遺伝子内に式(I)及び(II)の本発明による少なくとも1つのDNA構築物の少なくとも1つのDNA部分構築物のみを挿入することによって破壊することによって減少されてもよい。

好ましくは、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのpdc遺伝子の破壊によって減少されてもよい。

実際、酵母は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pyruvate decarboylase)をコードする1つ又は複数の遺伝子を有しうる。例えば、クライベロマイセスラクティス(Kluyveromyces lactis)においてピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする1つの遺伝子が存在するが、他方では、出芽酵母においてPDC1、PDC5、及びPDC6遺伝子によってコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの3つのアイソザイム並びにピルビン酸デカルボキシラーゼ調節遺伝子PDC2が存在する。

好ましくは、以下で規定されるような、本発明による組換え酵母は、組換えサッカロマイセス属、及び好ましくは組換え出芽酵母種であってもよい。

これに関して、第1の変法によると、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのpdc遺伝子、好ましくは少なくとも2つのpdc遺伝子、及びより詳細には2つのpdc遺伝子のみの破壊によって減少されてもよい。

加えて、破壊されたpdc遺伝子は、pdc1、pdc5、pdc6及びそれらの混合物、並びに好ましくはpdc1及びpdc6からなる群から選択されてもよい。

好ましくは、組換え酵母がサッカロマイセス属に属する場合、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、好ましくは、pdc1、pdc5、pdc6及びそれらの組合せからなる群から選択される、より詳細にはpdc1及びpdc6からなる群から選択される少なくとも2つのpdc遺伝子の破壊によって減少されてもよい。

実際、サッカロマイセス属、好ましくは出芽酵母種における3つのpdc遺伝子の中断は、株増殖を劇的に減少させて、いずれの産業上の適用にも不適合性にする。

特定の変法によると、サッカロマイセス属、好ましくは出芽酵母種において、pdc1及びpdc6遺伝子のみが破壊され、pdc5の発現は減弱される。

特定の遺伝子の発現を減弱させるために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、当技術分野において周知されている任意の方法を有利に参照しうる。

有利には、pdc5の発現を減弱させるために、その転写は、特に、RPLA1、URA3、MET25、HIS3、TRP1、GAP1、NUP57又はTFC1、及び好ましくはRPLA1(=配列番号37)等の弱いプロモーターの制御下に配置されてもよい。

ピルビン酸デカルボキシラーゼの活性レベルを測定するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、Wangら(Biochemistry、2001、40: 1755-1763)に記載される方法を有利に引用しうる。

アセト乳酸シンターゼ
アセト乳酸シンターゼ(ALS)酵素(アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)、α-アセトヒドロキシ酸シンセターゼ、α-アセトヒドロキシ酸シンターゼ、α-アセト乳酸シンターゼ、α-アセト乳酸シンセターゼ、アセトヒドロキシ酸シンセターゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸ピルビン酸リアーゼ(カルボキシル化)、アセト乳酸シンセターゼとしても知られている)は、分枝状鎖アミノ酸(バリン、ロイシン、及びイソロイシン)の合成における第1のステップを触媒するタンパク質である。

ALSは、2つのピルビン酸分子のアセト乳酸分子及び二酸化炭素への変換に関与している化学反応に特異的に関与する酵素である。その反応は、2つのピルビン酸分子を連結するためにサイアミンピロリン酸を使用している。

アセト乳酸シンターゼの活性レベルを測定するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、Poulsenら、(Eur. J. Biochem. 185、1989: 433-439)に記載される方法を有利に引用しうる。

本発明における好ましいアセト乳酸シンターゼは、EC番号2.2.1.6によって知られている。

好ましい実施形態によると、アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする核酸は、好ましくは、枯草菌(Bacillus subtilis)、タバコ(Nicotiana tabacum)、パエニバチルスポリミキサ(Paenibacillus polymyxa)、及びそれらの混合物、並びに、好ましくはタバコ及びパエニバチルスポリミキサを含む群から選択される核酸であってもよい。

更に好ましい実施形態によると、アセト乳酸シンターゼ又はALSをコードする核酸は、核酸配列配列番号1、3及び5と少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照核酸配列と少なくとも65%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を包含する。

本明細書に記載されているように、参照核酸配列と少なくとも80%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を包含する。

別の特定の実施形態によると、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸は、配列配列番号2、5及び6と少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照アミノ酸配列と少なくとも65%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。

本明細書に記載されているように、参照アミノ酸配列と少なくとも80%ヌクレオチド同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。

上述のように、本発明におけるALSの発現レベルは、例えば、以下により詳しく規定される、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって制御され、これらはALSをコードする核酸配列のそれぞれ5'位及び3'位に存在する。

アセト乳酸デカルボキシラーゼ
アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALD)酵素(α-アセト乳酸デカルボキシラーゼ、(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ、(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ[(R)-2-アセトイン-形成]又は(S)-2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソブタノエートカルボキシ-リアーゼ[(3R)-3-ヒドロキシブタン-2-オン-形成]としても知られている)は、リアーゼのファミリー、具体化には炭素間結合を切断し、ブタノエート代謝及びc5-分枝二塩基酸代謝に参加するカルボキシリアーゼに属する。

ALDは、α-アセト乳酸分子をアセトイン分子及び二酸化炭素への変換に関与している化学反応に特異的に関与する酵素である。

アセト乳酸デカルボキシラーゼの活性レベルを測定するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、Dulieuら、(Enzyme and Microbial Technology 25、1999: 537-542)に記載される方法を有利に引用しうる。

本発明における好ましいアセト乳酸デカルボキシラーゼは、EC番号4.1.1.5によって知られている。

好ましい実施形態によると、アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする核酸は、ブレビバチルスブレビス(Brevibacillus brevis)、エロバクターエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、ラクトコッカスラクティス(Lactococcus lactis)、及びそれらの混合物、好ましくはブレビバチルスブレビス及びエロバクターエロゲネスを含む群から選択される核酸であってもよい。

更に好ましい実施形態によると、アセト乳酸デカルボキシラーゼ又はALDをコードする核酸は、核酸配列配列番号7、9及び11と少なくとも36%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照核酸配列と少なくとも36%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を包含する。

別の特定の実施形態によると、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸は、配列配列番号8、10及び12と少なくとも36%、好ましくは少なくとも80%同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照アミノ酸配列と少なくとも36%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。

上述のように、本発明におけるALDの発現レベルは、例えば、以下により詳しく規定される、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって制御され、これらはALDをコードする核酸配列のそれぞれ5'位及び3'位に存在する。

NADHオキシダーゼ
少なくとも1つのpdc遺伝子の活性の不活性化又は減少は、酵母におけるエタノール発酵経路を不活化又は減少させる。結果として、このことにより、ALS及びALDの発現によって解放されないアンバランスなレドックス状態が誘導される。実際、グルコースから2ピルビン酸への経路は、2NADH均等物を生成し、他方では、2ピルビン酸からアセトインへの転換はNADHからNAD⁺にリサイクルしない(図1を参照されたい)。

特定の発現レベルで、細菌性水形成性NADHオキシダーゼ(本記載においてNOXEオキシダーゼ又はNOXEとも呼ばれる)酵素が、この株の安定性の増強を可能にする、レドックス状態の平衡化を可能にするだけでなく、この株の増殖の増強も可能にし、更にアセトインの収率を改善することを本発明者らは見出した。

細菌性水形成性NADHオキシダーゼは、以下の反応を触媒する酵素である:
2NADH + 1/2O₂ → 2NAD⁺ + H₂O

本発明における好ましい水形成性NADHオキシダーゼは、EC番号1.6.3.1及び1.6.99.3(NAD(P)Hオキシダーゼ(H(2)O(2)-形成性としても知られている)、二重オキシダーゼ(dual oxidase)、NAD(P)Hオキシダーゼ、ThOX、THOX2、甲状腺NADPHオキシダーゼ、甲状腺オキシダーゼ甲状腺オキシダーゼ2(EC1.6.3.1に関する)並びにNADHデヒドロゲナーゼ、ベータ-NADHデヒドロゲナーゼジヌクレオチド、チトクロムCレダクターゼ、ジアホラーゼ、ジヒドロコデヒドロゲナーゼIデヒドロゲナーゼ、ジヒドロニコチナマイドアデニンジヌクレオチドデヒドロゲナーゼ、ジホスホピリナーゼ(Diphosphopyrinase)、DPNHジアホラーゼ、NADHジアホラーゼ、NADHヒドロゲナーゼ、NADHオキシドレダクターゼ、NADH-メナジオンオキシドレダクターゼ、NADH:チトクロムCオキシドレダクターゼ、還元型ジホスホピリジンヌクレオチドジアホラーゼ、タイプ1デヒドロゲナーゼ、タイプIデヒドロゲナーゼ(EC1.6.99.3に関する)によって知られている。

本発明において考慮されうる水形成性NADHオキシダーゼは、特に、国際公開第2006/134277号に記載されている。

本発明によるNADHオキシダーゼの活性レベルを測定するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。

これに関して、当業者は、Lopez DE FELIPEら、(International Daily Journal、2001、vol. 11: 37-44(ISSN 0958-6946))に記載される方法を有利に引用しうる。

好ましい実施形態によると、NADHオキシダーゼ又はNOXEをコードする核酸は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、ラクトコッカスラクティス、エンテロコッカスフェカーリス(Enterococcus faecalis)、乳酸短杆菌(Lactobacillus brevis)及びそれらの混合物、並びに、好ましくは、肺炎連鎖球菌を含む群から選択される核酸であってもよい。

別の好ましい実施形態によると、NADHオキシダーゼ又はNOXEをコードする核酸は、核酸配列配列番号21、23、25及び27と少なくとも78%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有する配列からなる群から選択される核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照核酸配列と少なくとも78%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列と少なくとも79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%ヌクレオチド同一性を有する核酸配列を包含する。

別の特定の実施形態によると、NADHオキシダーゼをコードする核酸は、配列配列番号22、24、26及び28と少なくとも78%、好ましくは少なくとも80%同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸であってもよい。

本明細書に記載されているように、参照アミノ酸配列と少なくとも78%ヌクレオチド同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列と少なくとも79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含する。

上述のように、本発明におけるNADHオキシダーゼの発現レベルは、例えば、以下により詳しく規定される、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーターによって制御され、これらはNADHオキシダーゼをコードする核酸配列のそれぞれ5'位及び3'位に存在する。

加えて、上述の有利な技術的な効果は、前記NADHオキシダーゼの発現レベルとリンクする。実際、以下の例から明らかになるように、NADHオキシダーゼが単に存在することが重要であるだけでなく、NADHオキシダーゼ発現のレベルがアセトイン産生における極度な重要性も有している。

上述のように、本発明による組換え酵母は、減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有し、そのゲノム中、特に、NADHオキシダーゼ又はNOXEをコードする1つ又は複数のコピーの核酸が挿入されている。

これに関して、本発明による組換え酵母は、特に、NADHオキシダーゼをコードする1から20コピーの核酸を含んでいてもよい。

好ましくは、本発明による組換え酵母は、1から12コピーの、特に2から5コピーの、好ましくは3から4コピーの、及び更に好ましくは3コピーに等しいNADHオキシダーゼをコードする核酸を含んでいてもよい。

特定の実施形態によると、少なくともNOXE遺伝子を含む式(I)から(III)のDNA構築物は、前記組換え酵母の内因性URA3遺伝子に挿入されてもよい。

上記の観点において、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、特に、以下に規定されるもの等の、望まれない制御を回避するように、プロモーターの及びターミネーターの制御下にある。

プロモーター
明らかな理由のため、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、同一又は異なる、プロモーターの制御下にある。

所与の遺伝子の構成的な過剰発現を可能にする、同一又は異なる、前記プロモーターは、文献(velculescuら、(1997) Cell 88、243-251)中に見出されうる。

本発明において特により興味深いプロモーターは、以下を含む群から選択されてもよい:
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からpADH1(ADH1遺伝子=配列番号32)、
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からpTDH3(TDH3遺伝子=配列番号39)、
・翻訳伸長因子EF-1アルファをコードする遺伝子からpTEF2.Kl(TEF2遺伝子=配列番号30)、
・グリセリン酸ホスホムターゼをコードする遺伝子からpGPM1(GPM1遺伝子=配列番号33)、
・ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子からpPDC1(PDC1遺伝子=配列番号35)、
・エノラーゼIIをコードする遺伝子からpENO2(ENO2遺伝子=配列番号29)、
・翻訳伸長因子eEF1Bのガンマサブユニットをコードする遺伝子からpTEF3(TEF3遺伝子=配列番号31)、
・フルクトース1,6-二リン酸エステルアルドラーゼIIをコードする遺伝子からpFBA1(FBA1遺伝子=配列番号34)、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子からpPGK1(PGK1遺伝子=配列番号36)、
・ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子からpPYK1(PYK1遺伝子=配列番号49)、
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からpTPI1(TPI1遺伝子=配列番号50)、又は
・翻訳伸長因子EF-1アルファをコードする遺伝子からpTEF1(TEF1遺伝子=配列番号38)。

加えて、他の近縁の酵母からの相同性プロモーターは、サッカロマイセス属からの他の酵母からの、又はカンジダ属、デバリオマイセス属(Debaryomyces)、ピキア属(Pichia)又はクルベロマイセス属等の他の属からの酵母からのプロモーターとして使用することもできる。

Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58に記載されるような合成プロモーターも使用することができる。

より詳細には、同一又は異なる、前記プロモーターは、好ましくは、核酸配列配列番号29から39、49及び50と少なくとも80%核酸同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列により特徴付けられてもよい。

特定の実施形態によると、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、同一又は異なる、転写ターミネーターの制御下にあり、前記転写ターミネーターは、配列番号40から48の核酸配列と少なくとも80%核酸同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列により特徴付けられる。

ターミネーター
明らかな理由のため、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及びNADHオキシダーゼをコードする核酸のそれぞれは、同一又は異なる、転写ターミネーター(本明細書において「ターミネーター」とも称されうる)に連結される。

同一又は異なる、前記転写ターミネーターは、文献Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2、337-347中に見出されうる。

本発明において特により興味深いターミネーターは、以下を含む群から選択されてもよい:
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からtTPI1(TPI1遺伝子=配列番号44)、
・O-アセチルホモセリン-O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子からtMET25(Met25遺伝子=配列番号45)、
・アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子からtADH1(ADH1遺伝子=配列番号43)、
・エノラーゼIIをコードする遺伝子からtENO2(ENO2遺伝子=配列番号46)、
・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム2をコードする遺伝子からtTDH2(TDH2遺伝子=配列番号40)、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子からtPGK1(PGK1遺伝子=配列番号48)、
・tCYC1(=配列番号41)、
・tMET3(=配列番号47)、及び
・tTDH3(=配列番号42)、及び
・tDIT1(=配列番号43)。

より詳細には、同一又は異なる、前記ターミネーターは、好ましくは、配列配列番号32から40及び43と少なくとも80%同一性を有する配列からなる群から選択される核酸の配列により特徴付けられてもよい。

組換え酵母
一般に、酵母は、急速に増殖することができ、細菌と比較して高密度で培養することができ、産業上の設定において無菌的な環境を必要としない。更に、酵母細胞は、産物抽出及び精製のための非常に単純化されたプロセスで、細菌細胞と比較して、培養培地からより容易に分離することができる。

優先的には、本発明の酵母は、サッカロマイセス属、カンジダ属(Candida)、アシュビア属(Ashbya)、デッケラ属(Dekkera)、ピキア属(Pichia)(ハンゼヌラ属(Hansenula))、デバリオマイセス属、クラビスポラ属(Clavispora)、ロデロマイセス属(Lodderomyces)、ヤロウィア属(Yarrowia)、ジゴサッカロマイセス属(Zigosaccharomyces)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、トルラスポラ属(Torulaspora)、クライベロマイセス属、ブレタノマイセス属(Brettanomycces)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)又はマラセチア属(Malassezia)のうちから選択されてもよい。

より優先的には、酵母は、サッカロマイセス属、デッケラ属、シゾサッカロマイセス属、クライベロマイセス属、トルラスポラ属ジゴサッカロマイセス属、又はブレタノマイセスの属のクラブトリー陽性酵母であってもよい。

より優先的には、酵母は、出芽酵母、サッカロマイセスボウラルディ(Saccharomyces boulardii)、サッカロマイセスダグラシー(Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセスバヤヌス(Saccharomyces bayanus)又はジゴサッカロマイセスバイリー(Zigosaccharomyces bailii)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、デッケラブルセレンシス(Dekkera brucelensis)、デッケラインターメディア(Dekkera intermedia)、ブレタノマイセスカスターシー(Brettanomycces custersii)、ブレタノマイセスインテルメディウス(Brettanomycces intermedius)、クライベロマイセスサーモトレレンス(Kluyveromyces themotolerens)、トルラスポラグロボサ(Torulaspora globosa)、トルラスポラグラブラータ(Torulaspora glabrata)の種に由来してもよい。

より優先的には、組換え酵母は、サッカロマイセス属、及び好ましくは出芽酵母種に属しうる。

上述のように、本発明による組換え酵母は、式(I)から(III)を含む群から選択される少なくとも1つのDNA構築物の、並びに好ましくはALS及び/又はALDをコードする少なくとも1つの核酸のみを含む少なくとも1つの前記DNA構築物の挿入によって減少される、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する。

好ましい実施形態によると、組換え酵母は組換え出芽酵母であってもよく、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は2つのpdc遺伝子のみの破壊によって減少される。より好ましくは、破壊されたpdc遺伝子は、pdc1、pdc5、pdc6及びそれらの混合物、並びに好ましくはpdc1及びpdc6からなる群から選択されてもよい。

遺伝子及びより詳細にはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有する特定のDNA構築物を挿入するために施行される方法は、当業者の技術常識に属する。関連する方法は、以下の例により詳しく記載される。

最も好ましい実施形態
有利には、本発明において施行される酵素をコードする核酸は、ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea、NOXE.spn、NOXE.Ll及びそれらの混合物のうちから有利に選ばれる。

好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が、少なくとも2つのpdc遺伝子の破壊によって、特に、pdc1及びpdc6遺伝子の破壊によって減少される、サッカロマイセス属、特に出芽酵母種に属することにより特徴付けられてもよく、ここで:
- 1つのpdc遺伝子、好ましくはpdc1遺伝子は、以下の式(IIe):
5'-[(prom5)_y1-ALS.Bs-term5]_x5-[prom1-ALS.Bs-term1]_x1-[prom2-ALD.Ll-(term2)_z1]_x2-3' (IIe)
のDNA構築物の挿入によって破壊される、及び
- 上述の破壊されたpdc遺伝子と別個に、少なくとも他のpdc遺伝子、及び好ましくはpdc6遺伝子は、以下の式(IIf'):
5'-[(prom5)_y1-ALS.Pp-term5]_x5-[prom1-ALS.Pp-term1]_x1-[prom2-ALD.Ea-(term2)_z1]_x2-3' (IIf')
のDNA構築物の挿入によって破壊される、
並びに、ここで、以下の式(IIf''):
5'-[(prom3)_y2-NOXE.Ll-(term3)_z2]_x3-3' (IIf'')
のDNA構築物は、URA3遺伝子に挿入され、
式中:
- prom1、prom2、prom3、prom5、term1、term2、term3、term5、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、例えば、上記で規定され、ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea及びNOXE.Llは、例えば、以下のTable 1(表1)で規定され、
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から10、より詳細には0から3の範囲の、及び特に1に等しい整数を表し;
- 「x3」は、0から50、好ましくは0から20、好ましくは0から12、より詳細には2から5、好ましくは3から4の範囲、及び更に好ましくは3に等しい整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、各ALS、ALD及びNOXEをコードする少なくとも1つの核酸を含み、但し、より詳細には式(IIe)及び(IIf')の各DNA構築物は、ALS及びALDをコードするそれぞれの少なくとも1つの核酸を含む。

上記の観点において、暗示的に開示されているが、各式(IIe)と(IIf')の間:
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」;並びに/又は
- 考慮される遺伝子についての各コピーの核酸についてのプロモーター及び/又はターミネーターは、同一であってもよく又は異なっていてもよいことが特定される。

特定の好ましい実施形態によると、本発明による組換え酵母は、内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が、少なくとも2つのpdc遺伝子の破壊によって、特に、pdc1及びpdc6遺伝子の破壊によって減少される、サッカロマイセス属、特に出芽酵母種に属することにより特徴付けられてもよく、ここで:
- 1つのpdc遺伝子、好ましくはpdc1遺伝子は、以下の式(IIg):
5'-[ALS.Bs-tTDH2]₁-[pENO2-ALD.Ll-tCYC1]₁-3' (IIg)
のDNA構築物の挿入によって破壊され、
- 上述の破壊されたpdc遺伝子と別個に、少なくとも他のpdc遺伝子、及び好ましくはpdc6遺伝子は、以下の式(IIh'):
5'-[pADH1-ALS.Pp-tDPI1]₁-[pTDH3-ALD.Ea-tMET25]₁-3' a (IIh')
のDNA構築物の挿入によって破壊され、
並びに、ここで、以下の式(IIh'')のDNA構築物:
5'-[pENO2-NOXE. Ll-tPGK1]₁₂-3' (IIh'')
は、URA3遺伝子に挿入され、
ここで:
- 式(IIg)のDNA構築物の「ALS.Bs」遺伝子は、式(IIg)の前記DNA構築物が挿入される、pdc遺伝子のプロモーターの制御下にあり、
- pENO2、pADH1、pTDH3、tTDH2、tCYC1、tDPI1、tMET25及びtPGK1は、例えば、本記載において、並びに、より詳細には以下の配列表において規定され、
- ALS.Bs、ALS.Pp、ALD.Ll、ALD.Ea及びNOXE.Llは、例えば、以下のtable 1(表1)において、並びに、より詳細には以下の配列表において規定される。

特定の実施形態によると、本発明による組換え酵母は、アセトイン産生を至適化するため更に改変されてもよい。

糖の代替供給源の使用:
糖の代替供給源、例えば、デンプンの直接的な使用は、外因性α-アミラーゼ及びグルコアミラーゼの酵母における過剰発現を更に必要とする(busckeら、biosource technology 2013)。

糖の取込み輸送-C5糖の取込み輸送の改善
組換え微生物によるペントースの取込み輸送は、産業上のプロセスについての重要な課題であり、その理由は、C5糖が、加水分解されたリグノセルロース性バイオマスの主要な構成要素であるからである。多くの他のタイプの酵母の様な出芽酵母の天然の株は、発酵基質としてキシロース又はアラビノースのいずれも利用することができない(Hahn-Hagerdalら、2007;Jinら、2004)。興味深いことに、その株は、キシロースが天然の基質ではないとしても、その糖を取り込むことが可能である(Hamacherら、2002)。

出芽酵母GAL2、HXT1、HXT2、HXT4、HXT5、及びHXT7は、キシロースの取込みを触媒し、その理由は、それらが広い基質特異性を有しているからである(Hamacherら、2002;Saloheimoら、2007;Sedlak & Ho 2004)。しかしながら、キシロースについてのそれらの親和性は、グルコースについての親和性よりもかなり低く、トランスポーターによるキシロース取込みは、グルコースにより強く阻害される(Saloheimoら、2007)。

幾つかの変化は、増殖すること及びキシロース及び/又はアラビノースを消費することが可能な株を得るために必要である。これらの異なる改変は、本発明の一部である。

異種性キシローストランスポーターの過剰発現
キシロース及びアラビノース取込みを改善するために、組換えアセトイン産生株は、キシロース又はアラビノーストランスポーターをコードする異種遺伝子を発現するため改変されなければならない。例えば、カンジダインターメディア(Candida intermedia)、ピキアスティピティス(Pichia stipitis)及びシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のそれぞれからの遺伝子GXF1、SUT1及びAT5g59250は、酵母によるキシロース利用を改善するため過剰発現される(Runquistら、2010)。

キシロース及びアラビノースの代謝に関与する経路の過剰発現
酵母株は、キシロースが天然の基質ではないとしても、その糖を取込むことが可能である。キシロース同化作用についての遺伝子が出芽酵母中に存在するとしても、それらは有意な糖同化作用を可能にする十分なレベルで発現されない。したがって、遺伝的な改変は、ペントース糖の同化作用を改善するため必要である。キシロース又はアラビノースのキシリトールへの転換を可能にする全ての酵素が増強されること並びにキシリトールをキシルロースに及びキシルロースをキシルロース-5-リン酸に変換する酵素が必要である。キシロース及びアラビノース経路からの相同遺伝子は過剰発現されなければならないか又は細菌からの異種遺伝子は過剰発現されなければならないかのいずれかである。

本発明の一実施形態において、株によるキシロース取込み及びその同化作用は、例えば、以下のものを過剰発現させることによって改善される:
1)P.スティピティスからのキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするXYL2の過剰発現と関連させ、それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と組み合わせた、それぞれP.スティピティス及び出芽酵母のアルドラーゼレダクターゼをコードする遺伝子XYL1又はGRE3、
2)それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と関連させた細菌又はピロマイセス(Piromyces)からのキシロースイソメラーゼをコードする遺伝子xylA。

本発明の別の実施形態において、株によるアラビノース取込み及びその同化作用は、例えば、以下のものを過剰発現させることによって改善される:
1)トリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)からのL-アラビニトール4-ヒドロゲナーゼをコードするladl及びL-キシルロースレダクターゼをコードするIxrlと関連させ、P.スティピティスからのキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするXYL2の過剰発現、並びに、加えて、それぞれ出芽酵母及びP.スティピティスからのキシルロキナーゼをコードする遺伝子XKS1又はXYL3の過剰発現と組み合わせた、それぞれP.スティピティス及び出芽酵母のアルドラーゼレダクターゼをコードする相同遺伝子XYL1又はGRE3、
2)細菌性アラビノースイソメラーゼ及びリブロースキナーゼをコードする異種遺伝子araA及びaraB。

ペントースリン酸経路の最適化
これは、酵母株からの非酸化的ペントースリン酸経路に属する少なくとも1つの遺伝子;TALI、TKL1、RKL1及びRPE1を過剰発現によって行うことができる。

C5糖の代謝に関与する酵素に必要とされるNAPDH補助因子の利用可能性の最適化
これは、酵母株において大腸菌のトランスヒドロゲナーゼ発現させることによって達成される。大腸菌からの遺伝子udhA及び/又はpntABは、産生株中で過剰発現される。

グリセロール合成に向けたグルコース消費の防止:
これは、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼEC1.1.1.8.(GPDH)をコードするGPD1遺伝子の破壊によって行うことができる。

この実施形態による本発明は、GPD1遺伝子の破壊によってNADを優先してNADHを消費する酵素活性の除去が導かれるとの事実があるにもかかわらず、特にアセトインにおける収率の観点において興味深い。このように生成されたレドックス不平衡を釣り合わせるために、GPD1破壊株は、NOXEの付加的な発現を必要とする可能性がある。

特定の実施形態によると、本発明による組換え株は、国際公開第2011/041426号又はKimら、(Bioresource Technology、vol. 146、2013 : 274)に開示されるような、グルコース抑制を減少させる効果を有する、任意の遺伝的な改変を含まない。

特定の実施形態によると、本発明による組換え株は、Kimら、(Journal of Biotechnology、2014)に開示されるような、任意のキシロース同化作用経路の発現を可能にする、任意の遺伝的な改変を含まない。

培養条件
本発明はまた、アセトイン及び/又はその誘導体、特にメチルビニルケトン(MVK)の産生のための、例えば、上記で規定される、組換え酵母の使用に関する。

本発明は更に、以下の工程を含むアセトインの産生の方法に関する:
- 前に述べたような組換え微生物を用意する工程、炭素の供給源を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程、及び
- アセトインを回収する工程。

典型的には、本発明の微生物は、適切な培養培地において、約20℃から約37℃の範囲、好ましくは27から34℃の範囲の温度で増殖させてもよい。

本発明による組換え酵母が出芽酵母種に属する場合、温度は、適切な培養培地において、有利に27から34℃の範囲にわたりうる。

酵母に適切な増殖培地は、最も増殖させるための至適な割合で、酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、及びデキストロース(炭素/エネルギー源として)又はYPD培地、ペプトンのブレンド、酵母抽出物、及びデキストロースを含む、ブロス等の共通の市販の調製培地である。他の規定された又は合成の増殖培地が使用されてもよく、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学又は発酵科学の当業者に知られる。

用語「適切な培養培地」は、上記で規定される。

本発明による組換え酵母のための既知の培養培地の例は、当業者に知られており、文献D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)に提示されている。

発酵のための適切なpH範囲は、pH3.0からpH7.5の間であってもよく、ここで、pH4.5からpH6.5が初期条件として好ましい。

発酵は、好気性条件又はマイクロ好気性条件下で行ってもよい。

発酵培地中の産物の量は、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又はガスクロマトグラフ法(GC)等の当技術分野において知られている幾つかの方法を用いて決定することができる。

本プロセスは、発酵のバッチ法を利用してもよい。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が、発酵の最初に設定され、発酵の間に人工的な変更を受けない、閉鎖系である。したがって、発酵の最初に、培地は所望の生物を接種され、系になにも添加することなく、発酵の発生が許可される。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は、炭素源の付加に関してバッチであり、温度、pH及び酸素濃度等の制御因子下で多くの試みがなされる。バッチシステムにおいて、系の代謝産物及びバイオマス組成物は、発酵が停止する時間まで常に変化する。バッチ培養内で、細胞は、静的な誘導期から高増殖対数期及び最終的に増殖速度が落ちる又は停止される定常期を通して進行する。未処置である場合に、定常期における細胞は最終的には死滅する。対数期における細胞は、一般に最終産物又は中間物の産生の大半を荷う。

フェッドバッチシステムも、本発明に使用してもよい。フェッドバッチシステムは、炭素源基質が発酵が進行するにつれて小刻みに添加されることを例外として、典型的なバッチシステムに類似する。フェッドバッチシステムは、異化産物抑制(例えば、グルコース抑制)が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合及び培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に、有用である。フェッドバッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は、困難であり、したがって、pH、溶存酸素及びCO₂等の廃棄ガスの分圧等の測定可能な因子の変化の基礎のもとに推定される。

発酵は、共通であり、当技術分野において周知されており、例が参照により本明細書中に組み込まれているSunderlandら、(1992)中に見出されうる。本発明はバッチ様式で行われるが、方法が連続発酵に適応可能であることが意図される。

連続発酵は、規定の発酵培地が連続的にバイオリアクターに添加され、等量の馴化培地がプロセシングと同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に培養を、細胞が主に対数期増殖にある定常的な高密度に維持される。

連続発酵は、細胞増殖又は最終産物濃度に影響する、1つの因子又は任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、1つの方法は、炭素源又は窒素レベル等の限定的な栄養分を固定レートに維持し、全ての他のパラメータが変動することを可能にする。他の系において、増殖に影響する幾つかの因子は、培地濁度によって測定される細胞濃度を定常に保っている間に、連続的に変更することができる。連続システムは努めて定常状態増殖を維持するため、流し出される培地に起因する細胞欠損は発酵中の細胞増殖速度に対してバランスをとらなければならない。連続発酵プロセスのための栄養分及び増殖因子を調節する方法並びに産物形成の速度を最大化するための技術は、工業微生物学の分野において周知である。

本発明がバッチ、フェッドバッチ又は連続プロセスを用いて実施されうること及び発酵の任意の既知の様式が適切であることが意図される。更に、細胞が、全細胞触媒として基質に固定化され、産生のための発酵条件に付されうることが意図される。

アセトイン産生をなお改善するために、特定の実施形態は、組換え酵母細胞を、上述のような適切な培養培地において培養する工程であって、前記培養培地が至適な量の炭素源、特にグルコースを含む工程からなってもよい。

好ましくは、細胞は、全培養持続時間の一部のみの間に至適な培養培地において培養される。幾つかの実施形態において、酵母細胞は、前記至適な培養培地において、培養の開始後11、12、13、14、15又は16時間以上を包含する、培養の開始後10時間以上インキュベートされる。

好ましくは、細胞は、そのような至適な培養培地において、培養の開始後6時間から10時間、例えば8時間を含む、5時間から15時間の範囲の期間の間に培養される。

好ましい実施形態において、炭素源は、グルコースから構成される前記至適な培養培地に含まれる。好ましい実施形態において、前記至適な培養培地は、15% w/w以上のグルコースを含む、12% w/w以上のグルコースを含む。好ましい実施形態において、前記至適な培養培地は、多くとも35% w/wグルコースを含む、多くとも40% w/wグルコースを含む。

したがって、上記の好ましい実施形態において、本発明によるアセトインの産生のための方法は、工程(a)と(c)の間に、酵母細胞を前記至適な培養培地において培養する工程からなる中間工程(b)を更に含んでもよい。

アセトインの精製
本発明の特定の態様によると、アセトインの発酵性産生は、培養培地からのアセトインの単離の工程を含む。培養培地からアセトインを回収する工程は、当業者にとってルーチン作業である。蒸留、ガスストリッピング、浸透気化法又は液体抽出を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において周知される幾つかの技術によって達成されてもよい。当該分野における専門家は、どのようにして分離される物質の特徴に依存して各技術のパラメータに適合させるかについて知っている。

本発明における微生物モデルとしての酵母は、合成されたアセトインが完全に細胞外に排出輸送されるために保持されており、したがって精製プロセスが単純化する。

合成されたアセトインは、蒸留によって収集されてもよい。蒸留は、共沸混合物を特に水と形成させることによってアセトインの単離を促進させるために、培養培地と異なる任意選択の成分を伴っていてもよい。この任意選択の成分は、有機溶媒、例えば、シクロヘキサン、ペンタン、ブタノール、ベンゼン、トルエン、トリクロロエチレン、オクタン、ジエチルエーテル又はそれらの混合物である。

ガスストリッピングは、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、水素、窒素又はそれらの混合物のうちから選ばれるガスのストリッピングで達成される。

液体抽出は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、ドデカン等の疎水性相としての有機溶媒で達成される。

本明細書において記載される組換え酵母細胞によって産生されるアセトインから出発し、メチルビニルケトンを含めた、アセトイン誘導体が、当業者によって周知されている様々な方法を通じて得られうる。

請求項を含めた記載全体を通して、「1つを含む(comprising)」の表現は、別の特定がない限り、「少なくとも1つを含む(comprising at least one)」と同義であると理解すべきである。

加えて、考慮される前後関係による「式(I)から(III)」の表現は、反対の指摘がない限り、式(I)、(II)及び(III)のDNA構築物を意味するが、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf')、(IIf")、(IIg)、(IIh')及び/又は(IIh")も意味する。

用語「...と...との間(between...and...)」及び「...から...の範囲(ranging from...to...)」は、別の特定がない限り、限界値を包むと理解すべきである。

以下の例及び図は、例証として提供され、本発明の限定を示唆していない。

a)本発明による組換え出芽酵母株を作製するためのプロトコール
全ての以下の施行される組換え出芽酵母株を、標準株W303(Thomas及びRothstein (1989)、Cell. 56、619-630)から標準的な酵母分子遺伝学手順(Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke、D. Dawson、T. Stearns CSHL Press)を用いて構築した。

これらの株において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのpdc遺伝子(pdc1、pdc5、pdc6)の破壊によって又は弱いプロモーターによるそれらの同族転写プロモーターの置き換えによって減少されてもよい。

最も効率的な株において、pdc1及びpdc6のみを、欠失させた。

種々の外因性酵素を、考慮される組換え出芽酵母株において発現させた。それらを、利用可能な場合、それらのミカエリスメンテン酵素パラメータに従って選んだ(以下のtable 1(表1)を参照されたい)。高い効率について高いkcat及び基質中の異なる濃度をカバーする様々なKm。パエニバチルスポリミキサを選び、その理由は、この微生物が、天然の2,3ブタンジオール産生菌であり、アセトインから直接由来する産物であるからである。したがって、これはアセトイン合成を効率的に触媒する酵素を有している。

施行される外因性酵素アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ及び水形成性NADHオキシダーゼに関連する遺伝子命名法は、以下のTable 1(表1)に示される。

これらの遺伝子は、以下のとおり、酵素の頭字語と続いての起源の生物の頭字語によって指定される:

加えて、理解を深めるために以下の遺伝子型:
- ade2、his3、leu2、trp1及びura3は、栄養要求性マーカー遺伝子である。
- 小文字は考慮される遺伝子が不活性であることを意味し、大文字は活性遺伝子を反映している。
- 遺伝子名に続く「::」:は、遺伝子が、続くものによって中断されることを意味する(一を超える遺伝子が挿入される場合に、それらは角型括弧[]中に注記される)。遺伝子の中断は、コード配列の全体的な欠失が付随するが、しかし、プロモーターは保存される。結果として、「::」が続く遺伝子は、不活性であり、小文字で注記される。特定されない場合に、挿入される遺伝子の転写は、破壊された遺伝子のプロモーターによって制御される。
- 「遺伝子.Kl」は、遺伝子が、クライベロマイセスラクティスに由来することを意味する。
- 所与の遺伝子の構成的な過剰発現を可能にする転写プロモーターは、文献(velculescuら、(1997) Cell 88、243-251)中に見出される。本明細書に使用されるプロモーターは、「p」と続くそれらの同族遺伝子名によって指定される。それらそれぞれの配列番号も、以下に記述される。
- 転写ターミネーターも、各遺伝子の後に配置される。不用な制御プロモーター及びターミネーター枠を回避するため、ある挿入される遺伝子は、同じオリジナル遺伝子から取得されなかった。本明細書に使用されるターミネーターは、「t」と続くそれらの同族遺伝子名によって指定される。それらそれぞれの配列番号も、以下に記述される。

上述の遺伝子のクラスターを、配列相同性を有するフリーなDNA末端を効率的に組換える酵母の能力を用いて一挙(at once)に組換え酵母に組み込んだ。

組換え酵母は、当業者に利用可能な刊行された方法に従って得た。特に、最終的には僅かな変更だけをした、Shaoら、(Nucleic Acids Research、2009、Vol. 37、No. 2: e16)及びShaoら、(Methods in Enzymology、2012 Elsevier Inc.、Vol. 517: 203)に記載される方法に従ってもよい。

より詳細には、クローン化されるコード配列を、人工的に合成した。異種配列(非酵母)について、核配列を、酵母コドン使用を用いて同義のコード配列を得るために改変した。制限酵素及び古典的なクローニング技術を用いて、各合成配列を、転写プロモーターと転写ターミネーターの間にクローン化した。各プロモーター配列は、上流遺伝子のターミネーターの配列に相同的な50から200ヌクレオチド配列で先行される。同様に、各遺伝子(プロモーター-コード配列-ターミネーターを含む遺伝子)のターミネーターに、直ちに隣接して続く遺伝子に相同的な配列が続く。故に、組み込まれるユニットのそれぞれは、ユニット上流及びユニット下流の両方との50〜200ヌクレオチド重複を有する。最初のユニットについて、プロモーターは、組み込まれる座位に対する酵母染色体ヌクレオチドに相同的な50〜200ヌクレオチドで先行される。同様に、最後のユニットについて、ターミネーターに、組み込まれる座位に対する酵母染色体ヌクレオチドに相同的な50〜200ヌクレオチドが続く。

各ユニットは、次にプラスミド構築物からPCR増幅され、オーバーラップ配列を有する直鎖状DNAのXユニットを産出する。この遺伝子の1つは、組換えイベントを選択するための、栄養要求性マーカーである。全ての直鎖状断片は一挙に酵母に形質転換され、組換え酵母は使用されるマーカーに関連する栄養要求性について選択される。配列の組込み性は、次に、PCR及び配列決定によって検証される。

b)ALS及びALD酵素に関して
ALS及びALD酵素は、個々に評価せず、アセトインの収率を通じて、ペア(ALS+ALD)で評価した。3つの外因性ALD及びALSを、それらの動力学的なパラメータに従って選び、ALS.Nt、ALS.Pp、ALS.Bs及びALD.Bb、ALD.Ll、ALD.Eaとした(上記を参照されたい)。

ALS及びALDの9つの可能な組合せのうちの8つを、プロモーターの後ろで且つ1つのターミネーターが続くura3-酵母株の染色体に共同的(conjointly)に挿入した。

これらの2つの遺伝子の挿入により、pdc1遺伝子が破壊される。URA3マーカー遺伝子は、形質転換体を選択するため付随して挿入される。ALS/ALD組合せを、株YA747、すなわち以下の遺伝子型を有するW303派生体に挿入した:
YA747: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::HIS5.Sp、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3.

以下の株を、構築した:
YA768: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1:: [-ALS.Bs-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
NB:このケースでは、遺伝子「ALS.Bs」は、pdc1の天然プロモーター、すなわちプロモーターpPDC1の制御下にある。
YA769: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1:: [-ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA770: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA771: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA772: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[- ALS.Nt-tTPI1、pTDH3-ALD.Ll-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA773: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ll-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA810: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3
YA811: MAT-a、ade2、bdh1::TRP1.Kl、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Bb-tMET25、URA3.Kl]、pdc6::LEU2.Kl、trp1、ura3

全てのこれらの株を、24時間、8%グルコースYPA(酵母抽出物1%、Bactoペプトン2%、アデニン0.1mM、グルコース8%)中で増殖させた。それらを収穫し、アセトイン及びエタノール量をGonzalesら(2010)、Applied and environmental Microbiology 76 670-679中の事項から特異的に適合させた標準方法に従って決定した。

幾つかの株について、幾つかのクローンをアッセイした、「-」の後の最後の番号はクローン番号である。内因性bdh酵素が破壊され、2,3-BDOが産生されないことが注記される。

エタノール及びアセトイン産生は、標準方法及びGonzalesら(2010)、Applied and environmental Microbiology 76 670-679に従ってモニターされる。

結果
以下のTable 2(表2)は、上述の検査した株のアセトイン産生を示す。

これらの結果から、別々に解釈すると、アセトイン産生を増強する最良の酵素は、実際に最も効率的な酵素であるように思われる、ALS Pp、ALS Nt、ALD Ea及びALD Bbであると結論付けられうる。

c)アセトイン収率におけるNOXE酵素の有利な技術的な効果
YA1609による組換え酵母が、調製されている。
YA1609: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2- pENO2-ALD.Ll- tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12

YA1609-1、YA1609-2及びYA1609-4は、この株YA1609からの異なるクローンである。

これらの組換え酵母が常にそれらの天然の内因性BHH活性を有することが注意される。

これらの株を、16%グルコースYPA(酵母抽出物1%、Bactoペプトン2%、アデニン0.1mM、グルコース8%)中で、上記と比べて同じ条件下、アセトイン産生について次にアッセイした。

結果
結果は、以下のTable 3(表3)に報告される。

これらの結果は、NOXEの存在によりアセトインの非常に意味のある蓄積が導かれることを示す。

YA1609-4は、ここで、上述と比べ同じ培養培地中で施行される。しかしながら、本アッセイは、以下のパラメータによって異なっている:
環境:0.5l YPA、16%グルコース。
細胞培養の開始の16時間後、細胞を、16% w/wグルコースの最終濃度を含む培養培地中で8時間の期間インキュベートした。
撹拌:800rpm(2枚羽根)、1.9ms^-1
温度:30℃
空気:0.15L/分(0.3vvm)

細胞を、アセトイン産生について次にアッセイした。エタノール及びアセトイン産生は、標準方法及びGonzalesら(2010)、Applied and environmental Microbiology 76 670-679に従ってモニターされる。

結果
結果は、以下のTable 4(表4)に報告される。

これらの結果は、考慮される培養パラメータもアセトイン産生に影響を与えるうることを示す。

d)アセトインを産生する組換え酵母の更なる例
更なる組換え酵母が、調製され、以下に記載される。
YA1573-4: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tDPI1,pTDH3-ALD.Ea-tMET25,pTEF2-TRP1.Sc-tADH1,pGMP1-BDH.Sc-tENO2]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1609-4: MAT-a,his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1661-2: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12.

結果
結果は、以下のTable 5(表5)に報告される。

これらのTable 5(表5)の結果は、組換え酵母におけるNOXEをコードする複数の核酸の存在により、NOXEをコードする単一核酸で形質転換された組換え酵母と比較してアセトインの蓄積の増加が導かれることを示す。

e)2,3-BDOに向けたアセトインのエスケイプの防止
以下の内因性bdh1、bdh2、adh1、adh3及び/又はadh4遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子が、不活化されてもよい。幾つかの株において、栄養要求性マーカーを再導入して、それらを原栄養体とした。それらは、全てYA1660と比べ同じプロモーター及びターミネーターを有する:
YA1660-2、YA1660-3、YA1660-4、及びYA1711-16C: MAT-a、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12.
YA1711-45c : Mat-α、his3、leu2、pdc1::[-ALS.Bs-tTDH2、pENO2-ALD.Ll-tCYC1、HIS5.Sp]、pdc6::[pADH1-ALS.Pp-tTPI1、pTDH3-ALD.Ea-tMET25、pENO2-NOXE.Spn-tPGK1、LEU2.Kl]、trp1、ura3::[pENO2-NOXE.Ll-tPGK1、URA3]x12
YA1711-13A、YA1711-16B: Mat-a、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1711-19A及びYA1711-46A: Mat-α、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1822-1及びYA1822-2: Mat-α、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1::TRP1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA 1870-10A: Mat-a、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA 1870-11B: Mat-α、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-10B: Mat-α、adh1::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-11A: Mat-α、adh1::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12
YA1870-2A及びYA1870-3D: Mat-a、adh1::TRP1.Kl、adh3::TRP1.Kl、bdh1::LEU2.Kl、bdh2::HIS5.Sp、his3、leu2、pdc1::[ALS.Bs-ALD.Ll-HIS5.Sp-loxP]、pdc6::[ALS.Pp-ALD.Ea-NOXE.Spn-LEU2.Kl-loxP]、trp1、ura3::[NOXE.Ll-URA3]x12

全ての上記の株並びにYA1609-4及びYA1661-2及びこれらの株の二倍体組合せは、改善されたアセトイン収率を有する株として考慮すべきである。

f)2,3-BDOに向けたアセトインのエスケイプの防止を示す更なる例
株YA1711-19Aを、3l発酵槽中、酵母抽出物2%、スクロース10%中で、0から24時間増殖させ、次に600gのグルコースをゆっくりと添加した(30g/lで20時間)。

全てが外因性ALS、ALD及びNOXEが導入されている株からなる、以下の株を、500mlエルレンマイヤーフラスコ中でインキュベートし、24時間及び48時間、30℃、酵母抽出物2%及びスクロース30%中で振盪した:

配列表

配列番号1(=ADN ALS.Bs)

配列番号2(=アミノ酸 ALS.Bs)

配列番号3(=ADN ALS.Nt)

配列番号4(=アミノ酸 ALS.Nt)

配列番号5(=ADN ALS.Pp)

配列番号6(=アミノ酸 ALS.Pp)

配列番号7(=ADN ALD.Bb)

配列番号8(=アミノ酸 ALD.Bb)

配列番号9(=ADN ALD.Ea)

配列番号10(=アミノ酸 ALD.Ea)

配列番号11(=ADN ALD.Ll)

配列番号12(=アミノ酸 ALD.Ll)

配列番号13(=ADN NOXE.Ll)

配列番号14(=アミノ酸 NOXE.Ll)

配列番号15(=ADN NOXE.spn)

配列番号16(=アミノ酸 NOXE.spn)

配列番号17(=ADN NOXE.Ef)

配列番号18(=アミノ酸 NOXE.Ef)

配列番号19(=ADN NOXE.Lb)

配列番号20(=アミノ酸 NOXE.Lb)

配列番号21(=pENO2)

配列番号22(=pTEF2.Kl)

配列番号23(=pTEF3)

配列番号24(=pADH1)

配列番号25(=pGPM1)

配列番号26(=pFBA1)

配列番号27(=pPDC1)

配列番号28(=pPGK1)

配列番号29(=pRPLA1)

配列番号30(=pTEF1)

配列番号31(=pTDH3)

配列番号32(=tTHD2)

配列番号33(=tCYC1)

配列番号34(=tTDH3)

配列番号35(=tADH1)

配列番号36(=tTPI1)

配列番号37(=tMET25)

配列番号38(=tENO2)

配列番号39(=tMET3)

配列番号40(=tPGK1)

配列番号41(=pPYK1)

配列番号42(=pTPI1)

配列番号43(=tDIT1)

配列番号44(=loxP)

配列番号45(=核酸 HAA-1)

配列番号46(=アミノ酸 HAA-1)

配列番号47(=核酸 LEU2.Kl)

配列番号48(=アミノ酸 LEU2.Kl)

配列番号49(=核酸 His5)

配列番号50(=アミノ酸 His5)

配列番号51(=核酸 Trp1 kl)

配列番号52(=アミノ酸 Trp1 Kl)

Claims

対応する非組換え酵母と比較して減少したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有する、Saccharomyces cerevisiae（サッカロマイセス・セレビシエ）種に属する組換え酵母であって、そのゲノム中に:
- アセト乳酸シンターゼ（ALS）をコードする1つ又は複数の核酸、
- アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ALD）をコードする1つ又は複数の核酸、並びに、
- 核酸配列の配列番号13又は15を有する核酸配列を有する、NADHオキシダーゼ（NOXE）をコードする1つ又は複数のコピーの核酸
が挿入されている組換え酵母。
以下の式を含む群から選択される1つ又は複数のDNA構築物を含む、請求項1に記載の組換え酵母:
(I) 5'-[遺伝子1]_x1-3'及び5'-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(II) 5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-3'及び5'-[遺伝子3]_x3-3'、
(III) 5'-[遺伝子1]_x1-[遺伝子2]_x2-[遺伝子3]_x3-3'、並びに
その組合せ、
(式中:
- 「遺伝子1」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択される核酸を意味し;
- 「遺伝子2」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1とは異なる核酸を意味し;
- 「遺伝子3」は、ALS、ALD又はNOXEを含む群から選択されるが、遺伝子1及び2とは異なる核酸を意味し;
- 「ALS」は、アセト乳酸シンターゼをコードする核酸であり;
- 「ALD」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする核酸であり;
- 「NOXE」は、NADHオキシダーゼをコードする核酸であり;
- 「x1」、「x2」及び「x3」のそれぞれは、相互に独立に、0から50の範囲の整数を表し、
但し、前記組換え酵母は、ALS、ALD及びNOXEのそれぞれをコードする少なくとも1つの核酸を含む)。
少なくとも1つの式(II)のDNA構築物を含み、「遺伝子3」がNADHオキシダーゼをコードする核酸を意味する、請求項2に記載の組換え酵母。
同一又は異なる、少なくとも1つの式(IIa)のDNA構築物を含み、各式(IIa)が以下の式を有する、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIa) 5'-[(prom5)_y1-遺伝子1-term5]_x5-[prom1-遺伝子1-term1]_x1-[prom2-遺伝子2-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-遺伝子3-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- 遺伝子1、遺伝子2及び遺伝子3は、請求項2又は3に規定したものであり、「x1」、「x2」及び「x3」は、請求項2に規定したものであり;
- 「x5」は、0又は1に等しい整数を表し;
- 「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、相互に独立に、0又は1に等しい整数を表し;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIa)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom5」は、遺伝子1の発現を制御する制御配列であり、前記prom5はprom1と同一又は異なり;
- 「term1」は、遺伝子1をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term2」は、遺伝子2をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term3」は、遺伝子3をコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term5」は、遺伝子1の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term5はterm1と同一又は異なる)。
同一又は異なる、少なくとも1つの式(IIb)のDNA構築物を含み、各式(IIb)が以下の式を有する、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIb) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x3-3'
(式中:
- ALS、ALD及びNOXEは、請求項1に規定したものであり;「x1」、「x2」及び「x3」は、請求項2に規定したものであり;「x5」及び「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、請求項4に規定したものであり;
- 前記組換え酵母が少なくとも2つの式(IIb)のDNA構築物を含む場合、「x1」、「x2」、「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は同一であってもよく又は異なっていてもよく;
- 「prom1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり;
- 「prom5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を制御する制御配列であり、前記prom5はprom1と同一又は異なり;
- 「term1」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term2」は、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term3」は、NADHオキシダーゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり;
- 「term5」は、アセト乳酸シンターゼをコードする配列の発現を終了させる転写ターミネーター配列であり、前記term5はterm1と同一又は異なる)。
少なくとも2つの、式(II)、請求項4に規定される式(IIa)、又は、請求項5に規定される式(IIb)のDNA構築物を含み、但し、NOXEの核酸の全てのコピーは、少なくとも2つの式(II)、(IIa)又は(IIb)のDNA構築物の1つに位置する、請求項2に記載の組換え酵母。
少なくとも2つの、以下の式(IIc)及び(IId)のDNA構築物を含む、請求項2に記載の組換え酵母:
(IIc) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x6-3';並びに
(IId) 5'-[(prom5)_y1-ALS-term5]_x5-[prom1-ALS-term1]_x1-[prom2-ALD-(term2)_z1]_x2-3'及び5'-[(prom3)_y2-NOXE-(term3)_z2]_x7-3';
(式中:
- ALS、ALD及びNOXEは、請求項1に規定したものであり;「prom1」、「prom2」、「prom3」、「prom5」、「term1」、「term2」、「term3」及び「term5」は、請求項4から5のいずれか一項に規定したものであり;「x1」、及び、「x2」は、請求項2に規定したものであり;「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は、請求項4に規定したものであり;
- 「x1」から「x3」、「x5」、「y1」、「y2」、「z1」及び「z2」は各式(IIc)及び(IId)について同一又は異なり;並びに
- 「x6」及び「x7」は、0から50の範囲の整数を表し、但し、「x6」及び「x7」のうちの1つは0を表す)。
アセト乳酸シンターゼ（ALS）をコードする核酸は、核酸配列の配列番号1、3及び5からなる群から選択される核酸である、請求項1に記載の組換え酵母。
アセト乳酸デカルボキシラーゼ（ALD）をコードする核酸は、核酸配列の配列番号7、9及び11からなる群から選択される核酸である、請求項1に記載の組換え酵母。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、少なくとも1つのpdc遺伝子の破壊によって減少される、請求項1に記載の組換え酵母。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、請求項2に規定される式(I)から(III)を含む群から選択される少なくとも1つのDNA構築物の挿入によって減少される、請求項10に記載の組換え酵母。
少なくともNOXE遺伝子を含む式(I)から(III)を含む群から選択されるDNA構築物は、前記組換え酵母の内因性URA3遺伝子に挿入される、請求項2に記載の組換え酵母。
アセトイン又はメチルビニルケトンの産生のための、請求項1に記載の組換え酵母の使用。
(a)請求項1に記載される組換え酵母を適切な培養培地において培養する工程;及び
(c)アセトインを回収する工程
を含む、アセトインを産生する方法。
前記培養培地は炭素源を含む、請求項14に記載の方法。