JP6911112B2

JP6911112B2 - 観察装置

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Publication number: JP6911112B2
Application number: JP2019521536A
Authority: JP
Inventors: 平田　唯史; 唯史平田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2017-05-29
Publication date: 2021-07-28
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Description

本発明は、観察装置に関するものである。

細胞等の被写体を標識せずに観察する装置として、位相差観察法や微分干渉観察法を用いた観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開平７−２６１０８９号公報

しかしながら、特許文献１の観察装置は、被写体を挟んで撮影光学系と照明光学系とを配置する必要があり、装置が大型化、複雑化するという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができる観察装置を提供することを目的としている。

本発明の一態様は、試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、該照明光学系から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において前記照明光学系とは別経路で撮影する対物光学系とを備え、該対物光学系が、瞳面近傍に部分的に透過率を低下させかつ光の位相を変調する瞳変調素子を備え、前記照明光学系が、光源と、該光源からの光を特定の射出領域に制限する照明領域制限部と、該照明領域制限部による前記射出領域を前記対物光学系の光軸に直交する方向に調節可能な照明位置可変機構とを備え、該照明位置可変機構が前記光軸回りの周方向に間隔をあけた複数位置に配置された前記射出領域を前記光軸に直交する方向に個別に調節可能である観察装置である。

本態様によれば、光源から発せられた照明光は試料の下方から上方に向けて射出された後、試料の上方において反射されて試料を上方から下方に透過させられる。試料を透過した透過光は、試料の下方に配置されている照明光学系とは別経路の対物光学系によって撮影される。光源および対物光学系の両方を試料の下方に配置したので、装置を大型化させることなく、透過光を撮影することにより細胞等の被写体を標識せずに観察することができる。

また、光源から発せられた光は照明領域制限部によって射出領域が制限された照明光となって試料に照射され、対物光学系の瞳面近傍に入射される。瞳面近傍に配置されている瞳変調素子には、透過率が部分的に低下した領域が備えられているので、試料を通過しない光が透過率の部分的に低下した領域を通過するように設定しておくことにより、試料を通過しない光は減衰されさらに位相が遅れて像面に達する。

一方、試料を通過した光は試料内の微小構造により回折する光と回折しない光（０次回折光）とに分かれる。０次回折光は、瞳面近傍に配置されている瞳変調素子の透過率が部分的に低下した領域を通過して減衰され、さらに位相が遅れて像面に達する。試料において回折された光は瞳変調素子の透過率が低下させられていない領域を透過するのであまり減衰せず、かつ位相がπ／４遅れて像面に達する。

これにより、試料を通過しなかった光は瞳変調素子で減衰させられて暗くなり、試料を通過した光は０次回折光と回折光の両方の位相遅れ量が同じなので両者の位相差は０となり、干渉して、試料を通過しなかった光より明るい像を形成する。すなわち、試料が細胞である場合、細胞は明るさムラがなく等方的で、回折光を利用することにより細胞内の微細構造まで観察可能な明るい像を得ることができる。

そして、この場合において、本態様によれば、試料の上方に配置されている反射面が傾斜しても、照明位置可変機構の作動により、照明領域制限部による射出領域を対物光学系の光軸に直交する方向に調節することによって、上記条件を満たすように照明光の射出領域を調節することができる。

上記態様においては、前記照明位置可変機構が前記光軸回りの周方向に間隔をあけた複数位置に配置された前記射出領域を前記光軸に直交する方向に個別に調節可能である。
このようにすることで、複数の方向からの照明光によって試料を際立たせた明るい像による観察を行うことができる。

また、上記態様においては、前記照明領域制限部がマスクであり、前記照明位置可変機構が前記マスクを移動させてもよい。
このようにすることで、簡易に照明光の射出領域を調節することができる。

また、上記態様においては、前記照明領域制限部が、前記照明光を前記光軸に沿う方向に通過させる複数の窓部を有する平板状の固定マスクと、該固定マスクに対して該固定マスクの表面に沿って異なる方向に移動させられる複数の可動マスクとを備えていてもよい。
このようにすることで、固定マスクによって複数の窓部を通過する照明光のみに制限し、固定マスクに対して可動マスクを移動させることにより、固定マスクによって制限された照明光の内の一部を射出させる射出領域を簡易に調節することができる。

また、上記態様においては、前記可動マスクが、前記光軸回りに回転可能に支持され、前記光軸回りの異なる周方向位置に径方向位置を異ならせて配置された複数の窓部を備えていてもよい。
このようにすることで、可動マスクを光軸回りに回転させることにより、照明光を射出させる窓部を切り替えて、射出領域を径方向に移動させることができる。

また、上記態様においては、前記光源が、複数の光源部を備え、前記照明領域制限部が、各前記光源部からの前記照明光を前記光軸に直交する方向に異なる前記射出領域から射出させるように制限し、前記照明位置可変機構が、前記光源部を択一的に点灯させてもよい。
このようにすることで、光源部を切り替えて点灯させることにより、照明光を射出させる射出領域を簡易に切り替えることができる。

また、上記態様においては、前記照明領域制限部が、各前記光源部から各前記射出領域まで前記照明光を近接させながら導光する光学接続機構を備えていてもよい。
光源からの照明光をコリメートレンズによって集光し、対物光学系の瞳面に照明光の投影像を正確に一致させるには、コリメートレンズの焦点距離を十分に大きく確保する必要があるため、光源から射出領域までの高さ寸法が大きくなるが、光学接続機構を設けることで、各光源が大きくても射出領域を近接させることができ、高さ寸法を低減してコンパクトに構成することができる。

また、上記態様においては、前記光学接続機構が、各前記光源からの前記照明光を混ざらないように区画してもよい。
このようにすることで、光源を切り替えたときに該光源に対応する射出領域のみから照明光を射出させることができる。

また、上記態様においては、前記光学接続機構がライトガイドファイバであってもよい。
このようにすることで、光源から射出された照明光がライトガイドファイバによって導光され、光源よりも面積の小さい射出領域から射出させることができる。ライトガイドファイバを湾曲させることで、高さ寸法を低減してコンパクトに構成することができる。

本発明によれば、装置を大型化させることなく、細胞等の被写体を標識せずに観察することができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る観察装置を示す縦断面図である。図１の観察装置に備えられる光源の配置例を示す平面図である。図１の観察装置に備えられる固定マスクを示す平面図である。図１の観察装置に備えられる可動マスクの一例を示す平面図である。図１の観察装置に備えられる瞳変調素子の一例を示す平面図である。図１の観察装置の作用を説明する対物光学系の縦断面図である。図１の観察装置により取得された画像の一例を示す図である。図１の観察装置において容器の天板が傾いた場合の瞳変調素子における可動マスクの開口の投影像の一例を示す平面図である。図１の観察装置において可動マスクを移動させた場合に撮像素子により取得される像の明るさの平均値の変化を示す図である。図１の観察装置の第１の変形例を示す照明光学系の縦断面図である。図１０の照明光学系に備えられる固定マスクの一例を示す平面図である。図１０の照明光学系に備えられる可動マスクの一例を示す平面図である。図１２の可動マスクを図１１の固定マスクに対して回転させ、いずれかの開口を一致させた状態を示す平面図である。図１の観察装置の第２の変形例を示す縦断面図である。図１の観察装置の第３の変形例を示す縦断面図である。図１の観察装置の第４の変形例を示す縦断面図である。

本発明の第１の実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、細胞等の試料Ｘを収容した容器２を載置するステージ３と、該ステージ３の下方に配置され、ステージ３を上方から透過して来る光を集光する対物レンズ５ａを備え、試料Ｘを透過した光を撮影する対物光学系５と、対物光学系５の径方向外方に配置され、ステージ３を透過して上方に照明光を射出する対物光学系５とは別経路の照明光学系６と、照明光学系６を制御する制御部（図示略）とを備えている。

ステージ３は、対物光学系５および照明光学系６の上方を覆うように、光学的に透明な材質、例えば、ガラスからなる載置台３ａを備え、容器２は載置台３ａの上面に載置されるようになっている。
容器２は、例えば、天板２ａを有する細胞培養フラスコであり、全体的に光学的に透明な樹脂により構成されている。

照明光学系６は、図２に示されるように、対物光学系５の外側に周方向に等間隔を開けて配置された４個のＬＥＤ光源（光源）６ａと、各ＬＥＤ光源６ａからの光を拡散させる拡散板６ｂと、該拡散板６ｂに近接して備えられ、ＬＥＤ光源６ａからの照明光を特定の射出領域に制限するマスク６ｃと、制限された射出領域から射出され次第に拡散する照明光を略平行光にするコリメートレンズ６ｄとを備えている。

マスク６ｃは、拡散板６ｂの上面に板厚方向に重ねて配置される平板状の固定マスク（照明領域制限部）６ｃ１および平板状の可動マスク（照明位置可変機構）６ｃ２を備えている。固定マスク６ｃ１は、図３に示されるように、リング板状の遮光部材に、周方向に等間隔を開けて４箇所の照明光を透過させる扇形状の開口（射出領域、窓部）６ｅ１を有している。

また、可動マスク６ｃ２は、図４に示されるように、固定マスク６ｃ１の各開口６ｅ１を閉塞する位置にそれぞれ配置され遮光部材に固定マスク６ｃ１の開口６ｅ１よりも径方向の寸法が小さい扇形状の開口（射出領域、窓部）６ｅ２を備えている。各可動マスク６ｃ２は固定マスク６ｃ１の径方向に移動可能に支持されており、制御部によって開口６ｅ２の径方向の位置が調節されるようになっている。これにより、ＬＥＤ光源６ａからの光が射出される開口６ｅ２の位置を径方向に調節することができるようになっている。

本実施形態において、コリメートレンズ６ｄは、開口６ｅ２の上部、かつ対物光学系５の光軸Ａ回りに周方向４箇所に配置されている。好ましくは、各コリメートレンズ６ｄは、光軸Ａ上に中心を有する円上に周方向に等間隔で配置されている。
また、光軸Ａの周方向において、コリメートレンズ６ｄの光軸Ｂは、開口６ｅ２の位置よりも対物光学系５の光軸Ａ側に配置されている。これにより、ＬＥＤ光源６ａから入射された光を略平行光にするとともに、平行光束を光軸Ａに沿う方向に傾斜させて射出するようになっている。

また、図１４に示されるように中央に貫通孔６ｆを設けた単一のコリメートレンズ６ｄと、貫通孔６ｆ内に対物光学系５を配置してもよい。
コリメートレンズ６ｄによって傾斜させられて射出された略平行光は、上方に配置されている容器２の天板２ａによって反射され、下方の容器２内の液体Ｙ、試料Ｘおよびステージ３の載置台３ａを透過した後に対物光学系５に入射させられるようになっている。

対物光学系５は、図６に示されるように、上方から入射されてきた透過光を集光する対物レンズ５ａ、瞳面近傍に配置された瞳変調素子５ｂ、フレア絞り５ｇ、結像レンズ５ｃおよび撮像素子５ｄを備えている。瞳変調素子５ｂは、瞳面近傍に配置された明るさ絞り５ｅの内側に、図５に示されるように、瞳面の中心から径方向に所定距離だけ離れた位置に、輪帯状の位相膜５ｈを備えている。

位相膜５ｈは、部分的に透過率を低くするとともに透過する光の位相を変調してπ／４だけ遅らせる機能を有している。符号５ｆは明るさ絞り５ｅおよび瞳変調素子５ｂを支持するガラス板である。

このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について以下に説明する。
照明光学系６のＬＥＤ光源６ａから発せられた照明光は、図１に示されるように、可動マスク６ｃ２の開口６ｅ２を通過することにより、所定の大きさを有する射出領域に制限された光束として上方に向けて射出され、上方に配されているコリメートレンズ６ｄを通過することによって略平行光に変換されるとともに、コリメートレンズ６ｄの光軸Ａに向かって傾斜する光束となる。

コリメートレンズ６ｄから上方に向かう略平行光は、ステージ３を構成している載置台３ａ、容器２の底面および液体Ｙを透過して、容器２の天板２ａで反射され、斜め下方の試料Ｘに斜め上方から照射される偏斜照明となる。そして、容器２内を透過した透過光が容器２の底面および載置台３ａを透過した後に対物レンズ５ａによって集光され、瞳変調素子５ｂを通過して結像レンズ５ｃによって結像され、撮像素子５ｄによって撮影される。

すなわち、試料Ｘを斜め上方から透過する略平行光からなる照明光は、試料Ｘを透過した透過光が対物レンズ５ａによって集光される。図６に示されるように、試料Ｘが存在しない領域を透過した透過光は、屈折されることなく、略平行光のまま対物レンズ５ａに入射するので、対物レンズ５ａの瞳面に配置されている瞳変調素子５ｂにマスク６ｃの開口６ｅ１，６ｅ２の像を投影した後、結像レンズ５ｃによって結像され、撮像素子５ｄにより撮像される。

試料Ｘが存在する領域を透過した透過光は、試料Ｘの屈折率が周囲の屈折率と異なることによって屈折させられる。図６において、試料Ｘを通過しない光線ａ，ｅおよび試料Ｘの表面に直交して入射する光線ｃは屈折することなく瞳変調素子５ｂの位相膜５ｈを通過するので、位相膜５ｈによって低減された明るさの像を結ぶ。

一方、図６において試料Ｘを透過した光線ｂ，ｄは、試料Ｘを通過した光は試料Ｘ内の微小構造により回折する回折光（図中破線で示す。）と回折しない光（０次回折光）とに分かれる。０次回折光は、瞳変調素子５ｂの位相膜５ｈを通過して減衰され、さらに位相が遅れて像面に達する。試料Ｘにおける回折光は位相膜５ｈの外側を透過するので減衰せず、かつ位相がπ／４遅れて０次回折光と同じ位置に像面に達する。

これにより、試料Ｘを通過しなかった光は瞳変調素子５ｂで減衰させられて暗くなり、試料Ｘを通過した光は０次回折光と回折光の両方の位相遅れ量が同じなので両者の位相差は０となり、干渉して、試料Ｘを通過しなかった光より明るい像を形成する。すなわち、試料Ｘが細胞である場合、細胞は明るさムラがなく等方的であるため、図７に示されるように、回折光を利用することにより細胞内の微細構造まで観察可能な明るい像を得ることができる。

この場合において、ステージ３に載置された容器２の天板２ａが何らかの原因で傾斜あるいは湾曲していた場合には、射出領域から射出され、天板２ａにおいて反射され、試料Ｘを通過することなく対物レンズ５ａによって集光された光が位相膜５ｈを通過しないことが発生する。例えば、図８に示されるように、瞳変調素子５ｂにおける射出領域の投影像（図中ハッチングで示す。）が位相膜５ｈから外れてしまう。このような場合には、上記の干渉が発生しないので、試料Ｘをその他の部位から際立たせた像を得ることができない。

このような場合に、本実施形態によれば、固定マスク６ｃ１に対して可動マスク６ｃ２を径方向に移動させることにより、射出領域を径方向に移動させて、天板２ａにおいて反射され、対物レンズ５ａによって集光された光が位相膜５ｈを通過するように位置を調節することができる。

さらに具体的には、可動マスク６ｃ２を径方向に移動させると撮像素子５ｄにより取得される像の明るさの平均値が図９に示されるように変動する。
すなわち、
（１）可動マスク６ｃ２の開口６ｅ２が光軸Ａに近いときには対物光学系５の枠などでけられるため、像の明るさの平均値は低く、
（２）けられが少なくなると、像の明るさの平均値は上昇し、
（３）けられがなくなると、像の明るさの平均値は一定となり、
（４）投影像が位相膜５ｈに一致すると、像の明るさの平均値が一旦低下する。
（５）投影像が位相膜５ｈから外れると、像の明るさの平均値が再度一定になり、
（６）可動マスク６ｃ２の開口６ｅ２が光軸Ａから離れると明るさ絞り５ｅによってけられるようになり、像の明るさの平均値は低下していく。

したがって、可動マスク６ｃ２を径方向に移動させて上記（４）の位置を検出することにより、射出領域の投影像を位相膜５ｈに一致させることができる。そして、この作業を４つの可動マスク６ｃ２についてそれぞれ行うことにより、全ての方向において射出領域の投影像を位相膜５ｈに重なる位置に配置することができる。
すなわち、本実施形態に係る観察装置１によれば、ステージ３に搭載する容器２の天板２ａが何らかの原因によって傾いたり変形したりしていたとしても、他の部位から試料Ｘを際立たせた高コントラストの像による観察を行うことができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、可動マスク６ｃ２のみを移動させることとしたが、これに代えて、ＬＥＤ光源６ａとマスク６ｃとを一体的に移動することにしてもよい。これにより、ＬＥＤ光源６ａからの光を効率よく利用することができる。
また、本実施形態においては、可動マスク６ｃ２の開口６ｅ２の径方向の位置を制御部によって調整することとしたが、これに代えて、手動で調整するものを採用してもよい。

また、本実施形態においては、固定マスク６ｃ１に対して可動マスク６ｃ２を径方向に移動させることにより、開口６ｅ２を径方向に移動させることとしたが、これに代えて、図１０から図１２に示されるように、可動マスク６ｃ２を光軸Ａ回りに回転させることにより、開口６ｅ２を径方向に切り替えることにしてもよい。

すなわち、固定マスク６ｃ１には、図１１に示されるように、周方向に等間隔を開けた４箇所に扇形状の開口６ｅ１が径方向に間隔をあけて複数設けられ、可動マスク６ｃ２には、図１２に示されるように、固定マスク６ｃ１の開口６ｅ１と等しい数だけ周方向および径方向に異なる位置に、開口６ｅ２が設けられている。可動マスク６ｃ２は、図１０に示されるように、積層状態に４枚配置され、固定マスク６ｃ１の周方向の各位置の開口６ｅ１に対応して、個別に回転可能に備えられている。すなわち、可動マスク６ｃ２は、図１２に示される形態のものがその開口６ｅ２の位置を略９０°ずつ異ならせて４枚積層されている。

固定マスク６ｃ１の周方向の各位置の開口６ｅ１に対応する可動マスク６ｃ２を回転させることにより、図１３に示されるように、可動マスク６ｃ２のいずれかの開口６ｅ２を択一的に固定マスク６ｃ１のいずれかの開口６ｅ１に一致させることができ、これによって、上記と同様に射出領域を径方向に移動させることができる。図１３は、固定マスク６ｃ１の周方向の一方向に配置されている固定マスク６ｃ１と対応する可動マスク６ｃ２との位置関係の一例を示している。

また、上記実施形態においては可動マスク６ｃ２の移動によって射出領域を切り替えることとしたが、これに代えて、図１４に示されるように、径方向に配列された複数のＬＥＤ光源（光源部）６ａを図１０と同様の固定マスク６ｃ１の各開口６ｅ１に対応して配置しておき、点灯するＬＥＤ光源６ａを切り替えることにより射出領域を径方向に移動させることにしてもよい。固定マスク６ｃ１の各開口６ｅ１の間には、隣接するＬＥＤ光源６ａからの光の入射を阻止するように遮光壁６ｇが設けられている。この場合、制御部（照明位置可変機構）によって、ＬＥＤ光源６ａの点灯が制御されるようになっている。

また、図１５に示されるように、径方向に配列されたＬＥＤ光源６ａの光軸を相互に近接させるようにＬＥＤ光源６ａを傾斜して配置し、各ＬＥＤ光源６ａにコリメートレンズ６ｈを取り付けるとともに、拡散板６ｂとコリメートレンズ６ｈとの間に各ＬＥＤ光源６ａからの光を相互区画する導光路（照明領域制限部、光学接続機構）６ｉを設けることにしてもよい。図１５に示す例では、導光路６ｉが、コリメートレンズ６ｈから拡散板６ｂに向かって徐々に狭くなる横断面形状を有しており、ＬＥＤ光源６ａが大きくても拡散板６ｂ近傍における射出領域を小さく限定することができる。これにより、コリメートレンズ６ｈの焦点距離を短くすることができて、コリメートレンズ６ｈから拡散板６ｂまでの距離を短くして、照明光学系６の高さを抑えることができる。

この場合、導光路６ｉ内面を鏡面により構成してもよいし、ガラスロッドによって埋めてもよい。また、拡散板６ｂの上側に負のパワーのレンズを配置して拡散角を広げることにしてもよい、

また、硬質の導光路６ｉに代えて、図１６に示されるように、ライトガイドファイババンドル（照明領域制限部）６ｋを採用してもよい。この場合、ライトガイドファイババンドル６ｋを構成する各ライトガイドファイバ（光学接続機構）６ｋ１の射出開口数により、射出される光が拡がるので、拡散板６ｂを備えなくてもよい。この場合、光源となるＬＥＤ光源６ａの配置の自由度を向上して、比較的離れた位置に配置することができ、試料Ｘの温度上昇を防止することができる。

また、上記各実施形態においては、対物光学系５の光軸Ａ回りに周方向４箇所に照明光の射出領域を設定したが、これに代えて、１箇所以上の任意の数だけ設けることにしてもよい。
また、位相膜５ｈを輪帯状に配置したが、射出領域の数に合わせて周方向に間隔をあけた複数の扇状の位相膜５ｈを配置してもよい。

また、位相膜５ｈにおいて光の位相をπ／４だけ遅らせることとしたが、これに代えて、３π／４だけ遅らせることにしてもよい。これにより、０次回折光に対する回折光の位相遅れをπとすることができ、０次回折光と回折光との干渉によって、試料Ｘの領域が周囲より暗くなることで際立たされた画像を取得することができる。

１観察装置
５対物光学系
５ｂ瞳変調素子
６照明光学系
６ａＬＥＤ光源（光源、光源部）
６ｃ１固定マスク（照明領域制限部）
６ｃ２可動マスク（照明位置可変機構）
６ｅ１開口（射出領域、窓部）
６ｅ２開口（射出領域、窓部）
６ｉ導光路（照明領域制限部、光学接続機構）
６ｋライトガイドファイババンドル（照明領域制限部）
６ｋ１ライトガイドファイバ（光学接続機構）
Ａ光軸
Ｘ試料

Claims

試料の下方から上方に向けて照明光を射出する照明光学系と、
該照明光学系から射出された前記照明光が前記試料の上方で反射されて前記試料を透過した透過光を前記試料の下方において前記照明光学系とは別経路で撮影する対物光学系とを備え、
該対物光学系が、瞳面近傍に部分的に透過率を低下させかつ光の位相を変調する瞳変調素子を備え、
前記照明光学系が、光源と、該光源からの光を特定の射出領域に制限する照明領域制限部と、該照明領域制限部による前記射出領域を前記対物光学系の光軸に直交する方向に調節可能な照明位置可変機構とを備え、
該照明位置可変機構が前記光軸回りの周方向に間隔をあけた複数位置に配置された前記射出領域を前記光軸に直交する方向に個別に調節可能である観察装置。
前記照明領域制限部がマスクであり、
前記照明位置可変機構が前記マスクを移動させる請求項１に記載の観察装置。
前記照明領域制限部が、前記照明光を前記光軸に沿う方向に通過させる複数の窓部を有する平板状の固定マスクを備え、
前記照明位置可変機構が、前記固定マスクに対して該固定マスクの表面に沿って異なる方向に移動させられる複数の可動マスクを備える請求項２に記載の観察装置。
前記可動マスクが、前記光軸回りに回転可能に支持され、前記光軸回りの異なる周方向位置に径方向位置を異ならせて配置された複数の窓部を備える請求項３に記載の観察装置。
前記光源が、複数の光源部を備え、
前記照明領域制限部が、各前記光源部からの前記照明光を前記光軸に直交する方向に異なる前記射出領域から射出させるように制限し、
前記照明位置可変機構が、前記光源部を択一的に点灯させる請求項１に記載の観察装置。
前記照明領域制限部が、各前記光源部から各前記射出領域まで前記照明光を近接させながら導光する光学接続機構を備える請求項５に記載の観察装置。
前記光学接続機構が、各前記光源からの前記照明光を混ざらないように区画する請求項６に記載の観察装置。
前記光学接続機構がライトガイドファイバである請求項６または請求項７に記載の観察装置。