JP6997773B2 - 無細胞ｄｎａの分析用の核酸サンプル調製の方法 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２０１６年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５，３４７号の米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。

技術分野
本明細書で記載される技術は、分析用の核酸分子の調製において有用な方法および組成物に関する。

背景
次世代シーケンシングする前の標的富化は、全ゲノム、全エキソーム、および全トランスクリプトームシーケンシングより費用効果が高く、従って、広い実行に関して；研究発見および臨床適用の両方に関してより実践的である。例えば、標的富化アプローチによって与えられる高カバレッジ深度（ｈｉｇｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｄｅｐｔｈ）は、アレル計数のより広いダイナミックレンジ（遺伝子発現およびコピー数評価において）および低頻度変異の検出を可能にし、これは、がんにおける体細胞変異を評価するために有利である。次世代シーケンシングの現在の富化プロトコルの例としては、ハイブリダイゼーションベースの捕捉アッセイ（ＴｒｕＳｅｑ Ｃａｐｔｕｒｅ， Ｉｌｌｕｍｉｎａ； ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ， Ａｇｉｌｅｎｔ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイ（ＨａｌｏＰｌｅｘ， Ａｇｉｌｅｎｔ； Ａ
ｍｐｌｉＳｅｑ， Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ； ＴｒｕＳｅｑ Ａｍｐｌｉｃｏｎ， Ｉｌｌｕｍｉｎａ； エマルジョン／デジタルＰＣＲ、Ｒａｉｎｄａｎｃｅ）が挙げられる。ハイブリダイゼーションベースのアプローチは、捕捉プローブによって網羅される標的化された配列のみならず、シーケンシング能力を消耗する近くのオフターゲット塩基をも捕捉する。さらに、これらの方法は、比較的時間浪費型、労働集約的であり、特異性が比較的低レベルであるという欠点をもつ。

要旨
本明細書で開示される技術の局面は、核酸を調製および分析するための方法に関する。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、核酸調製物（無細胞ＤＮＡ調製物（例えば、尿または血液サンプルに由来する）を含む）中の超低頻度アレルバリアント（例えば、融合、一塩基バリアント、コピー数バリアント）を検出するために有用である。本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態においてその方法が無細胞ＤＮＡ調製物中のバリアントを検出するために特に有用であるように、高度にフラグメント化した物質を富化するライゲーションベースの捕捉を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、フラグメント化された投入物から（例えば、無細胞ＤＮＡ調製物からを含む）の高カバレッジ（例えば、高い特有のカバレッジ）シーケンシングライブラリーの生成を促進する。いくつかの実施形態において、特有の分子深度は、個体、例えば、腫瘍を有する個体から抽出した核酸に関して従来の方法を超えて大いに改善される。いくつかの実施形態において、カバレッジ深度は、個体、例えば、腫瘍を有する個体から抽出した核酸に関する従来の方法と比較して、少なくとも倍加される。いくつかの実施形態において、改善された深度は、改善されたフロントエンド捕捉化学現象の結果として達成される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、シーケンシングを介してＲＮＡ免疫レパートリーを評価するために有用である。いくつかの実施形態において、配列分析用の核酸サンプルの調製において（例えば、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を使用して）有用な方法および組成物は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸配列を決定するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、シーケンシング前に１またはこれより多くの標的ヌクレオチド配列を含む核酸を富化することに関する。いくつかの局面において、本開示は、１またはこれより多くの捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを核酸に付加する工程を包含する、核酸を調製するための（例えば、シーケンシング分析において使用するための）方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、アダプター核酸を、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ライゲーション生成物と上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、上記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ライゲーション生成物を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または別の適切な増幅アプローチによって増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、２本鎖核酸）の３’末端に付加する工程を包含する核酸を調製するための方法が提供され、ここで上記１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記核酸の３’末端に上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが存在すると、上記核酸全体に修飾されたヌクレオチドが（例えば、ランダムに）組み込まれることを回避しながら、上記核酸の単離、精製および／または洗浄が促進される。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、２本鎖核酸）へと組み込む工程を包含する核酸を調製するため
の方法が提供され、ここで上記１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのヌクレオチドは、プライマー（例えば、逆転写プライマー）を使用して組み込まれる。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのヌクレオチドは、上記核酸を調製する先の工程の間に組み込まれる。例えば、いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのヌクレオチドは、フラグメント化、ランダムプライミング、第１鎖合成、第２鎖合成、および／または末端修復の間に組み込まれる。

いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖核酸の３’末端に付加する工程であって、ここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程；（ｂ）アダプター核酸を、該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された該２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程（ａ）における該２本鎖核酸の３’末端に付加された該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｃ）該ライゲーション生成物と該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程；ならびに（ｄ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、を包含する。

いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、上記アダプター核酸、上記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含する。いくつかの実施形態において、該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、該オーバーハング配列は、工程（ａ）における上記２本鎖核酸の３’末端に付加された上記１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的な、該アダプター核酸の上記３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列を含む。

いくつかの実施形態において、工程（ｂ）は、上記アダプター核酸、上記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、１本鎖である。

いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、（ｅ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって工程（ｄ）の増幅生成物を増幅する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記第２の標的特異的プライマーは、上記第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、上記第２の標的特異的プライマーは、上記標的ヌクレオチド配列にアニールしない５’テールを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記第２の標的特異的プライマーの５’テールと同一である３’部分を含むさらなるプライマーを添加する工程をさらに包含する。

いくつかの実施形態において、上記捕捉部分は、ビオチン部分である。 いくつかの実施形態において、上記ビオチン部分は、ビオチン－トリエチレングリコール、ビス－ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン－トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む。

いくつかの実施形態において、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分は、５位、６位、７位または８位において、上記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分は、７位において上記アデニン核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記アデニン核塩基の７位は、炭素原子である。

いくつかの実施形態において、上記ビオチン部分は、任意の適切な長さのリンカーを介して、上記核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記ビオチン部分は、例えば、長さが５～２０個の原子（例えば、長さが５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個の原子）のリンカーを介して、上記核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、ビオチン－ｎ－ｄＮＴＰであり、ここでｎは、該ビオチン部分のカルボニル基と該ＮＴＰの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す５～２０の整数である。いくつかの実施形態において、

いくつかの実施形態において、上記結合パートナーは、ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態において、上記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される。

いくつかの実施形態において、工程（ａ）において、１個のヌクレオチドが、上記標的ヌクレオチド配列を含む上記２本鎖核酸の上記３’末端に付加される。

いくつかの実施形態において、上記方法は、非特異的核酸の精製をさらに包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ｂ）の後でかつ工程（ｃ）の前に反応クリーンアップまたは洗浄工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｃ）の後でかつ工程（ｄ）の前に：ｉ）上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを含む上記２本鎖核酸を、常磁性基材または表面（例えば、ポリスチレン常磁性ビーズ）上に固定化する工程；およびｉｉ）上記固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｉｉ）の後に：ｉｉｉ）上記洗浄した固定化２本鎖核酸を上記常磁性基材または表面から放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化２本鎖核酸は、化学的試薬と接触させることおよび／または熱を適用することによって、上記常磁性基材または表面から放出される。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、塩基である。いくつかの実施形態において、上記化学的試薬は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む。いくつかの実施形態において、接触させることが２種の溶液（例えば、塩基を含む溶液および洗浄した固定化核酸を含む溶液）を混合する工程、固体を溶液に添加する工程、または溶液を固体に添加する工程を包含し得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化２本鎖核酸は、ＮａＯＨと接触させることおよび加熱すること（例えば、室温より高く（例えば、２５～９０℃、２５～７０℃、２５～５０℃、３５～６５℃、３５～４５℃、３０～４０℃、４０～５０℃の範囲の温度）加熱すること）によって、上記常磁性基材または表面から放出される。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化２本鎖核酸は、例えば、分析用のさらなる調製のために、上記常磁性基材または表面上に残存する。いくつかの実施形態において、上記洗浄した固定化２本鎖核酸は、分析用のさらなる調製の前に、上記常磁性基材または表面から放出される。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、工程（ａ）の前に、上記
２本鎖核酸を５’リン酸化する工程をさらに包含する。

いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、工程（ａ）の前に：ｉ）テンプレートとしてＲＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程；ならびにｉｉ）該ｃＤＮＡを末端修復して、平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程、をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、工程ｉｉ）の後に：ｉｉｉ）上記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを含む上記２本鎖核酸を、常磁性基材または表面上に固定化する工程；ｉｖ）該固定化した２本鎖核酸を洗浄する工程；およびｖ）該洗浄した固定化した２本鎖核酸を該常磁性基材または表面から放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記常磁性基材または表面は、被覆（例えば、ポリスチレン被覆）を含む。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、遺伝子特異的にプライムされた第１鎖合成を行うことによって分析のために調製される。いくつかの実施形態において、末端修復する工程は、ＤＮＡ末端を平滑化および／またはリン酸化する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、方法は、工程（ｅ）の後に、（ｆ）上記工程（ｅ）の増幅生成物を常磁性基材または表面上に固定化する工程；（ｇ）上記固定化した増幅生成物を洗浄する工程；および（ｈ）上記洗浄した固定化増幅生成物を上記常磁性基材または表面から放出する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、１またはこれより多くの間にある洗浄工程（例えば、本明細書で記載される方法のうちのいずれかの工程の間に増幅生成物を洗浄する工程）をさらに包含する。例えば、いくつかの実施形態において、上記方法は、工程（ｅ）の後でかつ工程（ｆ）の前に、洗浄工程をさらに包含する。

いくつかの実施形態において、工程（ｂ）において、上記２本鎖核酸は、クラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の存在下で上記アダプター核酸にライゲーションされる。いくつかの実施形態において、上記クラウディング剤は、ライゲーション混合物の５％～５０％に相当する量のポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、上記２本鎖核酸は、平滑末端化される。いくつかの実施形態において、上記２本鎖核酸は、オーバーハングを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）テンプレートとしてＲＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここで該ＲＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；（ｂ）該ｃＤＮＡを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；（ｃ）該平滑末端化した２本鎖核酸を常磁性基材または表面上に固定化する工程；（ｄ）該固定化した平滑末端化２本鎖核酸を洗浄する工程；（ｅ）該洗浄した固定化平滑末端化２本鎖核酸を該常磁性基材または表面から放出する工程；（ｆ）１またはこれより多くのヌクレオチドを該放出した平滑末端化２本鎖核酸の３’末端に付加する工程；（ｇ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプターを、工程（ｆ）において生成した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｈ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程；（ｉ）工程（ｈ）の増幅生成物を、第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程であって、ここで該第
２の標的特異的プライマーは、該第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；（ｊ）工程（ｉ）の該増幅生成物を常磁性基材または表面に固定化する工程；（ｋ）該固定化した増幅生成物を洗浄する工程；ならびに（ｌ）該洗浄した固定化増幅生成物を該常磁性基材または表面から放出する工程、を包含する。いくつかの実施形態において、工程（ｈ）は、上記ライゲーション生成物を洗浄することなしに行われる。

いくつかの実施形態において、本開示は、分析用の核酸を調製する方法を提供し、該方法は、（ａ）テンプレートとして核酸調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここで該核酸調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；（ｂ）該ｃＤＮＡを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；（ｃ）該平滑末端化した２本鎖核酸を洗浄する工程；（ｄ）１またはこれより多くのヌクレオチドを工程（ｃ）において洗浄した該核酸の３’末端に付加する工程であって、必要に応じてここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程；（ｅ）工程（ｄ）において生成した該核酸を洗浄する工程；（ｆ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程（ｅ）において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｇ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程；（ｈ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；ならびに（ｊ）該工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程、を包含する。

いくつかの実施形態において、上記洗浄する工程は、可逆的固相固定化技術を使用して行われる。

いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドであり、上記方法は、工程（ｆ）の後でかつ工程（ｇ）の前に、該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の固定化した結合パートナーを使用して上記ライゲーション生成物を捕捉する工程；および該捕捉したライゲーション生成物を清浄にする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記捕捉部分は、ビオチン部分を含み、上記結合パートナーは、ストレプトアビジンを含む。

いくつかの実施形態において、上記第２のアダプタープライマーは、上記第１のアダプタープライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、上記第２のアダプタープライマーは、上記アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする。

本開示の他の利点および新規な特徴は、添付の図面とともに考慮される場合に、本発明の種々の非限定的実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書および参考として援用される文献が矛盾するおよび／または一致しない開示を含む場合には、本明細書が優先するものとする。

本発明の非限定的実施形態は、添付の図面を参照して例示によって記載される。図面は、模式図であり、一定の縮尺で描かれることは意図されない。図面において、図示される
各同一のまたはほぼ同一の構成要素は、代表的には、ひとつの数字によって表される。明瞭にする目的で、あらゆる構成要素があらゆる図においても表示されているわけではなく、当業者に本発明を理解させるために図示が必要でない場合には、本発明の各実施形態のあらゆる構成要素が示されるわけではない。図面において：

図１は、アダプターをライゲーションした核酸ライブラリーの捕捉を可能にするプロセスの図示である。

図２は、分析用の高フィデリティー核酸サンプルを調製するための方法の図示である。

図３は、テンプレートＲＮＡ鎖を使用して２本鎖ｃＤＮＡを生成するプロセスを示す。

図４は、捕捉したライゲーション生成物が増幅前に磁性ビーズから溶離される場合に、テンプレートＲＮＡ鎖を使用して２本鎖ｃＤＮＡサンプルを生成するプロセスを示す。

図５は、分析用の高フィデリティー核酸サンプルを調製するための方法の作業フローの描写である。

図６は、ポリメラーゼ不活性化なしで末端修復されたライブラリーサンプルをおよびポリメラーゼの熱不活性化後に末端修復されたライブラリーサンプルを示すゲルの画像表示である。

図７は、クラウディング剤の非存在下または存在下でライゲーションしたサンプルのアダプターライゲーション効率を示すゲルの画像表示である。

図８Ａは、アダプター核酸を含み得る構成要素を図示する図表である。

図８Ｂは、第２の標的特異的プライマーを含み得る構成要素を図示する図表である。

図９は、繋留化多重ＰＣＲ（ＡＭＰ）を使用する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のために標的を富化したライブラリーを生成するための全体的な方法を示す。

図１０は、超低頻度アレル（ＡＦ）バリアントの理論的感度を示すグラフである。

図１１は、サンプリング深度０～１０，０００の間の最小ＡＦのさらなる深度ビューを示すグラフである。

図１２は、古典的な方法に対してＡＭＰ法を使用するライゲーションベースの捕捉によって富化された高度にフラグメント化した物質を示す模式図である。

図１３は、古典的な方法から生じる観察に対してＡＭＰ法を使用して促進された独立した観察を示す模式図である。

図１４は、再発性膀胱がんを有しない個体に対して、再発性膀胱がんを有する個体を比較する、尿中のｃｆＤＮＡの質量分析を示す。

図１５は、フラグメント化された投入物によって生成される高カバレッジライブラリーを示すグラフである。

図１６は、合成ＤＮＡレポートアッセイを使用するフロントエンドライゲーション捕捉の最適化を示す。

図１７は、その最適化した捕捉化学現象が、古典的な方法より有意に高いカバレッジを生じることを示すグラフである。

図１８は、Ｈｏｒｉｚｏｎ ｃｆＤＮＡ物質を使用して標的化された遺伝子座で高深度の特有のカバレッジを示すグラフを示す。

図１９は、シーケンシング深度のＲＯＩ曲線を示すグラフを示す。

図２０は、ＲＮＡ免疫レパートリーのシーケンシングストラテジーを示す。

図２１は、代表的なＡＭＰデータを生成するＴＣＲＢに由来するリードのマッピングを示す。

図２２は、ＴＣＲＡから経験的に得られたＶおよびＪセグメントを示す。

図２３は、ＢＣＲ Ｖセグメント使用を示すグラフを示す。

図２３は、ＢＣＲ Ｖセグメント使用を示すグラフを示す。

図２３は、ＢＣＲ Ｖセグメント使用を示すグラフを示す。

図２４は、段階希釈においてＪｕｒｋａｔ ＴＲＢ ＣＤＲ３の頻度を示すグラフを示す。

図２５は、希釈比を比較した場合、そのＪｕｒｋａｔクローン頻度の相関を示す。

図２６は、Ｊｕｒｋａｔクローンに対する非Ｊｕｒｋａｔクローンの関係を示す。

図２７は、分子バーコードが、ＰＣＲに由来するエラーおよびシーケンシングに由来するエラーの両方を較正することを図示する。 図２７は、分子バーコードが、ＰＣＲに由来するエラーおよびシーケンシングに由来するエラーの両方を較正することを図示する。

図２８は、ｃｆＤＮＡフラグメント長の微小流体電気泳動（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）分析を示す。

図２９は、ｃｆＤＮＡでＡｍｐｌｉｓｅｑと比較した場合、ＡＭＰの利点を示す。

図３０は、アッセイ投入物が感度に影響を及ぼすことを示す。

図３１は、変動するｃｆＤＮＡ投入物量にわたるカバレッジ比較を図示する。

図３２は、投入物が複雑性および感度を決めることを示すグラフである。

図３３は、合成ｃｆＤＮＡ投入物に基づく高カバレッジおよび再現性を示すグラフである。

図３４は、パネルアッセイの結果を示す。

図３５は、非常に定量的なバリアント検出を示す４つのグラフである。

図３６は、エラー較正がバリアンド同定を大きく高めることを示す。

図３７は、カバレッジ比較を示す。

図３８は、ｃｔＤＮＡパネルが低い投入物量で４００倍超のカバレッジを生じることを示す。

図３９は、ｃｆＤＮＡのバリアントコーリングデータを示す。

図４０は、ｃｆＤＮＡのサンプルバリアントコーリングデータを示す。

詳細な説明
他の局面の中でも、本開示は、分析用の核酸サンプルライブラリー（例えば、無細胞ＤＮＡサンプル（ｃｆＤＮＡ））の調製に関する改善された技術を提供する。本明細書で記載されるように、アダプター核酸は、標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る。アダプター核酸の使用は、ライブラリー調製およびシーケンシング分析の間に、例えば、プライマー結合部位および分子バーコードまたはインデックス配列を提供することによって、有用であり得る。いくつかの局面において、本開示は、アダプターライゲーションに関するプロセスにおける改善および分子バーコードフィデリティーを実質的に改善するアダプターをライゲーションしたサンプル単離に関する。

いくつかの局面において、本開示は、アダプターライゲーション後に、その後のＰＣＲ反応へのライゲーションしなかったアダプターの持ち越しが分子バーコードの過剰存在量を生じ得るという認識に関する。分子バーコードのこの過剰存在量、またはインフレーションは、１つの分子が１つのバーコードのみを含むべきであるので、偽陽性を生じ得る。いくつかの実施形態において、ライゲーションしなかったアダプターが、場合によっては、ＰＣＲの間に既存のフラグメントの中の共通領域をプライムオフ（ｐｒｉｍｅ ｏｆｆ）し得ることは認識される。多数の反応サイクルにわたって、バーコードまたは他の人口配列のさらなるコピーは、単一の分子へと組み込まれ得る。よって、本発明者らは、アダプターのライゲーションおよびアダプターをライゲーションしたライブラリーフラグメントの単離に関する改善されたプロセスの必要性を認識および察知した。

いくつかの局面において、本開示は、分析用の核酸を調製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを２本鎖核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ）の３’末端に付加する工程、アダプター核酸を、その捕捉部分で修飾され
たヌクレオチドを有する２本鎖核酸にライゲーションする工程、およびそのアダプターをライゲーションした核酸を、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの結合パートナーで捕捉する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、ビオチン部分で修飾されたヌクレオチドである。この方法の一般的描写は、図１に示され、これは、ビオチン部分で修飾されたヌクレオチドを要する方法の非限定的例を提供する。この実施液体において、平滑末端化した５’リン酸化２本鎖核酸のライブラリー１０２が提供される。ビオチン標識ＡＴＰ１０４は、その２本鎖核酸の３’末端に付加されて、フラグメントの３’末端に捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを含むライブラリー１０６を生成する。そのライブラリーフラグメントは、アダプター１０８とライゲーションされて、アダプターをライゲーションしたライブラリーフラグメントとともにライゲーションしなかったアダプターを有するサンプル１１０を生成する。ライゲーションされたライブラリーフラグメントは、ストレプトアビジン被覆表面を使用してライゲーションしなかったアダプターから捕捉または単離されて、ライゲーションしなかったアダプター持ち越しの発生を最小化または排除するライブラリー１１２を生成する。この例は、ビオチン捕捉部分を利用するが、単離のために（例えば、結合パートナーとの相互作用を介して）特異的に標的化され得る任意の部分が、本明細書で記載される技術において適切であり得る。

無細胞ＤＮＡ
他の局面の中でも、本開示は、分析用の無細胞ＤＮＡの調製に関する。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、体液（例えば、循環血液、尿、リンパ液、間質液など）中で自由に循環しているＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、体液（例えば、血液、血漿、および尿）から抽出され得る。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡは、血流または他の体液へと放出され、最終的に溶解される、アポトーシス細胞、壊死細胞、および無傷の細胞から生じ得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される調製技術は、例えば、スクリーニング試験と関連するｃｆＤＮＡの分析およびシーケンシングに有用であり得る。いくつかの実施形態において、無細胞ＤＮＡスクリーニング試験はまた、腫瘍ＤＮＡ（例えば、がん患者の血液中に存在するような）をスクリーニングするために使用され得る。その患者のゲノムに由来する通常のアレルと比較して、無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に由来する変異アレルの画分を分析することで、最小限に侵襲性のがん診断、予後、および腫瘍モニタリングの機会が提供される。さらに、血清および血漿中のｃｆＤＮＡは通常、健康な細胞に由来する無細胞ＤＮＡフラグメントから主に構成される。がん患者では、ｃｔＤＮＡは、非侵襲性の診断のために全血より高いシグナル対ノイズ比で検出され得る。

いくつかの実施形態において、体液からｃｆＤＮＡを抽出するために適したプロトコルは、本明細書で記載される調製方法において使用されるべきｃｆＤＮＡサンプルを得るために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、血液からｃｆＤＮＡを単離するために適したプロトコルは、血液、血清または血漿サンプルの遠心分離、続いて、そのサンプルからの無細胞ＤＮＡの単離および精製を包含し得る。いくつかの実施形態において、類似の工程が、無細胞腫瘍ＤＮＡを分析するために行われ得、ここでは、血液が、全ての細胞を除去するために、例えば、遠心分離によって処理され得、その残りのサンプルは、ｃｆＤＮＡを得るために処理され得るおよび／またはさらに分析され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、腫瘍ＤＮＡおよび変異検出を評価するために有用であり得る。いくつかの実施形態において、腫瘍組織は、無細胞腫瘍ＤＮＡを検出するために評価され得る。無細胞腫瘍ＤＮＡは、広い範囲のがんにおいて存在し得るが、異なるレベルおよび変異アレル画分において起こる。例えば、無細胞腫
瘍ＤＮＡが１７０ｂｐあたりに高度にフラグメント化されることが報告されている。いくつかの実施形態において、健康な個体から単離された血小板は、ＲＮＡ含有膜小胞をがん細胞から取りあげることが観察され得る。いくつかの実施形態において、無細胞腫瘍ＤＮＡ分子は、腫瘍細胞によって放出され、がん患者の血液中で循環する。いくつかの実施形態において、これらの分子を使用するアッセイは、早期の腫瘍検出、モニタリング、または抵抗性変異の検出のために使用され得る。

いくつかの実施形態において、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、栄養膜に端を発し、これは、例えば、胎盤の中で見出され得る。従って、いくつかの実施形態において、非侵襲的な出生前検査（ＮＩＰＴ）は、Ｘ染色体およびＹ染色体における胎児異常をスクリーニングするために、ならびに女性が、ダウン症候群（２１トリソミー）、１８トリソミーまたは１３トリソミーを有する胎児を有する高いリスクにあるか否かを決定するために、使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、胎児ＤＮＡおよび変異検出のサンプルを調製するために有用であり得る。例えば、研究は一般に、胎児ＤＮＡを検出するために父系から遺伝した配列を検出することに焦点を当てる。これは、いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために、男性胎児のＹ染色体を標的化するためにデザインされたプライマーを使用して行われ得る。

いくつかの実施形態において、母系ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間の遺伝子活性化における差異が利用され得る。いくつかの実施形態において、エピジェネティック改変が、無細胞胎児ＤＮＡを検出するために行われ得る。いくつかの実施形態において、過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターは、無細胞胎児ＤＮＡの存在を確認するために、ユニバーサル胎児マーカーとして使用され得る。

いくつかの実施形態において、胎盤において発現される遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写物は、母体血漿中で検出可能である。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡサンプルを単離する工程は、血漿の混合物を遠心分離する工程およびその水層を移す工程を包含する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡが抽出され、ＲＴ－ＰＣＲが、選択されたＲＮＡ発現のために設定される。いくつかの実施形態において、ｈＰＬおよびβ－ｈＣＧ ｍＲＮＡは、母体血液中で安定している。いくつかの実施形態において、母体血漿中の胎児ＤＮＡの存在は、任意の適切な手段によって決定され得る。いくつかの実施形態において、ｃｆＤＮＡサンプルは、以下の遺伝子のうちの１またはこれより多くの標的配列を検出するために評価され得る：ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＴＮＢＢ１、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＡＤ４、およびＴＰ５３。しかし、ゲノムの任意の遺伝子が分析のために標的化され得ることは、認識されるべきである。

捕捉部分
本明細書で記載される技術の局面は、目的の分子（例えば、核酸、ライゲーション生成物など）を単離するための捕捉部分の使用に関する。本明細書で使用される場合、「捕捉部分（ｃａｐｔｕｒｅ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、その目的の分子を捕捉する（例えば、単離する／精製する）目的で、結合パートナーと選択的に相互作用するように構成される部分をいう。

捕捉部分およびその捕捉部分の結合パートナーは、任意の適切な結合対を含み得る。いくつかの実施形態において、結合対は、共有結合または非共有結合を通じて選択的に相互作用し得る。いくつかの実施形態において、結合対は、ハイブリダイゼーション、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、またはこれらの力の任意の組み合わせによって選択的に相互作用し得る。いくつかの実施形態において、捕捉部分および／または
結合パートナーは、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、イノシン、アビジン、ＧＳＴ配列、改変ＧＳＴ配列、ビオチンリガーゼ認識（ＢｉＴａｇ）配列、Ｓタグ、ＳＮＡＰタグ、エンテロキナーゼ部位、トロンビン部位、抗体もしくは抗体ドメイン、抗体フラグメント、抗原、レセプター、レセプタードメイン、レセプターフラグメント、またはこれらの組み合わせを含み得る。

いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ビオチン部分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、分析用の核酸サンプルを調製するにあたって有用である。よって、いくつかの実施形態において、核酸分子は、ビオチン化捕捉部分を含む。いくつかの実施形態において、その核酸分子は、ビオチン部分を含む少なくとも１個の捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、式（Ｉ）の一般構造：

を含む。

式（Ｉ）に示されるように、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、ヌクレオチドの核塩基に付着したビオチン部分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、そのビオチン部分は、ビオチン－トリエチレングリコール、ビス－ビオチン、光切断性ビオチン、デスチオビオチン、デスチオビオチン－トリエチレングリコール、またはアジ化ビオチンを含む。捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの非限定的な例は、表１に示される。

いくつかの実施形態において、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、その捕捉部分とそのヌクレオチドの核塩基との間にリンカーを含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、任意の適切な長さのリンカーを介して、その核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、長さが５～２０個の原子のリンカーを介して、その核塩基に共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、そのリンカーは、脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、－（ＣＨ_２）ｎ－を含み、ここでｎは、１～２０の整数（両端の値を含む）である。いくつかの実施形態において、ｎは、１～１０の整数（両端の値を含む）である。ある種の実施形態において、リンカーは、ヘテロ脂肪族鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリプロピレングリコール部分を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ－を含み、ここでｎは、１～２０の整数（両端の値を含む）である。いくつかの実施形態において、リンカーは、－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ－を含み、ここでｎは、１～１０の整数（両端の値を含む）である。ある種の実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのアリーレンを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのフェニレン（例えば、パラ置換されたフェニレン）を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、キラル中心を含む。ある種の実施形態において、リンカーは、１またはこれより多くのホスフェート、脂肪族鎖、ヘテロ脂肪族鎖、および１またはこれより多くのアミド（例えば、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－）を含む。

いくつかの実施形態において、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、ビオチン－ｎ－ｄＮＴＰであり、ここでｎは、そのビオチン部分のカルボニル基とそのＮＴＰの核塩基上の付着位置との間のリンカー原子の数を表す５～２０の整数である。

いくつかの実施形態において、結合パートナーは、不溶性支持体に付着される。従って、いくつかの実施形態において、その目的の分子は、捕捉部分と不溶性支持体に付着された捕捉部分の結合パートナーとの間で形成される選択的結合相互作用を通じて、その不溶性支持体上に固定化され得る。

いくつかの実施形態において、その不溶性支持体は、ビーズまたは他の固体表面を含む。例えば、いくつかの実施形態において、そのビーズは、常磁性ビーズである。単離するためにビーズを使用することは、当該分野で周知であり、任意の適切なビーズ単離法が、本明細書で記載される技術とともに使用され得る。いくつかの実施形態において、ビーズ
は、目的の分子がそのビーズに付着され得、そのビーズが洗浄されて、そのビーズに付着しなかった溶液構成要素を除去し得、精製および単離を可能にするという点で、単離に有用であり得る。いくつかの実施形態において、そのビーズは、サイズ、密度、または誘電特性、イオン特性、および磁性特性のような特性に基づいて、その溶液中の他の構成要素から分離され得る。

いくつかの実施形態において、その不溶性支持体は、磁性ビーズである。ビーズの使用は、誘導体化された核酸捕捉部分が、遠心分離もしくは濾過によって、または磁性ビーズの場合には、磁場の印加によって、反応混合物から分離されることを可能にする。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、溶液へと導入、混合、除去、および磁場を使用して放出され得る。いくつかの実施形態において、磁性ビーズを利用するプロセスは、自動化され得る。いくつかの実施形態において、そのビーズは、周知の化学現象を使用して官能化されて、捕捉部分の結合パートナーを付着させるために適した官能化を有する表面を提供し得る。その捕捉部分の結合を可能にするための表面の誘導体化は、当該分野で従来からのものである。例えば、ストレプトアビジンでの表面の被覆は、ビオチン化捕捉部分の結合を可能にする。ストレプトアビジンでの表面の被覆は、例えば、米国特許第５，３７４，５２４号（Ｍｉｌｌｅｒ）に記載されている。いくつかの実施形態において、ビーズ以外の固体表面が使用され得る。いくつかの実施形態において、その固体表面は、平らな表面（例えば、ハイブリダイゼーションマイクロアレイのために使用されるもの）であり得るか、またはその固体表面は、分離カラムを充填したものであり得る。

いくつかの実施形態において、捕捉部分の結合パートナーは、その捕捉部分を結合する前に、同時に、または後に、不溶性支持体に付着され得る。いくつかの実施形態において、捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとを、両方が溶液中に存在する間に接触させることは、好ましいことであり得る。このような実施形態において、その捕捉部分：結合パートナー複合体は、次いで、その複合体と適切に誘導体化された表面とを接触させることによって、不溶性支持体上に固定化され得る。従って、いくつかの実施形態において、その目的の分子は、その目的の分子に付着した捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとの間で形成される複合体を通じて単離され得る。

いくつかの実施形態において、その捕捉部分をヌクレオチドの核塩基に付着させることは、望ましいことであり得る。この様式では、その３’末端は、アダプター核酸に必要に応じてライゲーションされるように遊離のままである一方で、その捕捉部分は、結合パートナーによって捕捉されるために利用可能である。いくつかの実施形態において、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、５位、６位、７位または８位においてアデニン核塩基またはその誘導体へと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、その捕捉部分は、７位においてアデニン核塩基へと共有結合的に連結される。アデニン環の番号付けスキームは、式（ＩＩ）に示される：

いくつかの実施形態において、捕捉部分に付着される核塩基上の１またはこれより多くの位置を改変することは、望ましいことであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、アデニン核塩基の７位は、炭素原子である。しかし、さらなる共有結合を形成し得る任意の原子（例えば、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓなど）が捕捉部分の付着のために適した核塩基上の位置へと置換され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、そのアダプターをライゲーションしたフラグメントを捕捉した後に、そのライブラリーは、標的ヌクレオチド配列を富化するために増幅に供される。

分析用の核酸の調製
本開示の局面は、既知の標的ヌクレオチド配列（例えば、ｃｆＤＮＡの既知の標的ヌクレオチド配列）に連続したヌクレオチド配列を決定する改善された方法を提供する。旧来のシーケンシング法は、配列情報を無作為に（例えば、「ショットガン（ｓｈｏｔｇｕｎ）」シーケンシング）、またはプライマーをデザインするために使用される２つの既知の配列の間で生成する。対照的に、本明細書で開示される方法のうちのある種のものは、いくつかの実施形態において、高レベルの特異性および感度で既知の配列のうちの１つの領域の上流または下流にあるヌクレオチド配列を決定する（例えば、シーケンシングする）ことを可能にする。

いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、自動化様式で、次世代シーケンシング技術を使用して特定のヌクレオチド配列を決定する前に、その特定のヌクレオチド配列を富化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むサンプルを富化することに関し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、（ａ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖核酸の３’末端に付加する工程であって、ここでその１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個またはこれより多く）は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程；（ｂ）アダプター核酸を、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここでそのアダプター核酸の３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程（ａ）において２本鎖核酸の３’末端に付加された１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｃ）そのライゲーション生成物とその捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の結合パートナーとを接触させることによって、そのライゲーション生成物を捕捉する工程；および（ｄ）その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、そのライゲーション生成物を増幅する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、その方法は、（ｅ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｄ）の増幅生成物を増幅する工程をさらに包含する。例えば、図２は、この実施形態が進められ得る非限定的プロセス２００を示す。標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖核酸２０２は、１またはこれより多くの捕捉部分で修飾されたヌクレオチド２０４を、その３’末端に付加する（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはこれより多くの捕捉部分で修飾されたヌクレオチド）ことによってテール付加され得る。その捕捉部分が標識された核酸は、アダプター２０６とライゲーションされて、アダプターをライゲーションしたライブラリーフラグメント２０８を生成する。そのアダプターをライゲーションしたフラグメントは、その捕捉部分の結合パートナーを導入することによって単離され、そのうちの前者は、磁性支持体２１０に付着される。磁場２１２の印加は、アダプターをライゲーションした核酸をライゲーションしなかったアダプターから単離した。その捕捉したライゲーション生成物は、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライ
マー２１４およびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマー２１６を使用する第１のＰＣＲラウンドに供される。このようにして、その第１のアダプタープライマー２１６は、その第１の標的特異的プライマー２１４によって生成される鎖をプライムオフする。第２のＰＣＲラウンドは、第２の標的特異的プライマー２１８および第２のアダプタープライマー２２０を使用して行われる。示されるように、その第２の標的特異的プライマー２１８は、その第１の標的特異的プライマー２１４に対してネスト化される。また示されるように、その第２の標的特異的プライマーは、その標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない５’領域でテール付加される。その第１のＰＣＲラウンドに類似の様式で、その第２のアダプタープライマー２２０は、その第２の標的特異的プライマー２１８によって生成される鎖をプライムオフする。この第２のＰＣＲラウンドでは、さらなるプライマー２２２が含まれ、これは、（ｉ）その第２の標的特異的プライマー２１８のテール付加された５’領域のうちの少なくとも一部と同一である３’領域、および（ｉｉ）シーケンシングに有用なさらなる要素（例えば、インデックスまたはバーコード配列およびプライマー結合部位）を含み得る５’領域を含む。その第２のアダプタープライマー２２０がその第２の標的特異的プライマー２１８によって生成される相補鎖からセンス鎖を生成した後に、そのさらなるプライマー２２２は、次いで、シーケンシングの準備ができた生成物２２４を生成するために、そのテール付加された領域の目下の相補的配列をプライムオフする。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される技術は、核酸サンプルからの標的ヌクレオチド配列の富化を可能にする。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、その核酸サンプルは、ｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、テンプレートとしてランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用するそのランダムにプライムした第１鎖合成反応を行うことによって調製され得、ここでそのＲＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸シーケンシングライブラリーは、ＲＮＡ調製物から調製される。例えば、図３は、２本鎖核酸ライブラリーフラグメントがＲＮＡテンプレートから調製されるプロセス３００を概して記載する。

示されるように、ＲＮＡテンプレート３０２は、ランダムプライマー３０４（例えば、ランダムヘキサマー）とハイブリダイゼーションに適した条件下でアニールされる。ランダムプライミングの後に、第１鎖ｃＤＮＡ合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド３０６を生成するために、逆転写酵素を使用するテンプレート依存性伸長によって達成される。そのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖は、酵素によりまたは化学的に切断される。ＤＮＡ鎖３１０にハイブリダイズしたままであるＲＮＡ３０８の得られるフラグメントは、ポリメラーゼの作用を介する第２鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして働く。いくつかの実施形態において、第２鎖ｃＤＮＡ合成後のポリメラーゼの不活性化は、例えば、末端修復の間に５’→３’および／または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を防止するために望ましいことであり得る。第２鎖ｃＤＮＡ合成後に、その２本鎖ｃＤＮＡ３１２は、平滑末端化した５’リン酸化ｃＤＮＡ３１４を生成するために、末端修復に供される。いくつかの実施形態において、ＳＰＲＩクリーンアップ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ）は、末端修復後に行われる。そのプロセスにおけるその後の工程は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドをその核酸の３’末端に付加する工程を包含し得るので、サンプル中の任意の残りのｄＮＴＰを除去することは、好ましいことであり得る。従って、溶液からｄＮＴＰを除去し得る任意のクリーンアップ法は、この技術において適切であると想定される。いくつかの実施形態において、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、核酸を調製するための先の工程（例えば、フラグメント化、ランダムもしくは特異的プライミング、第１鎖合成、第２鎖合成、および／または末端修復）において核酸に付加および／または組み込まれ得る。従って、このような実施形態において、その捕捉部分で修飾されたヌクレオチドを添加および／または組み込む工程の前に、クリーンアップ工程を行うことは、望ましいことで
あり得る。

平滑末端化した５’リン酸化ｃＤＮＡ３１４は、その３’末端においてチオエート結合（例えば、ホスホロチオエート結合）を含むビオチン標識ｄＡＴＰ３１６（ビオチン－１１－ＡＴＰ）でテール付加され、アダプターをライゲーションしたライブラリーフラグメント３１８を生成するために、アダプター核酸とライゲーションされる前に、ＳＰＲＩクリーンアップに供される。クラウディング剤（２０％）を含めると、アダプターライゲーション効率を増大させることが示された。そのアダプターをライゲーションしたフラグメント３１８は、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ３２０を導入することによって捕捉される。非共有結合的なビオチン－ストレプトアビジン複合体が一旦形成された後、磁場３２２の印加は、アダプターをライゲーションした核酸を捕捉して、その所望の生成物をライゲーションしなかったアダプターから単離する。

図３に示されるように、いくつかの実施形態において、その捕捉したアダプターをライゲーションした核酸は、ビーズ固定化生成物の形成において第１のＰＣＲラウンド３２４に供される。さらに他の実施形態において、図４に示されるように、その捕捉したアダプターをライゲーションした核酸は、第１のＰＣＲラウンド３２４の前に、常磁性ビーズ３２０から溶離される。そのビーズからの捕捉したアダプターをライゲーションした核酸の溶離は、例示によれば（そして限定ではない）、化学的試薬および／または熱を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、その化学的試薬は、塩基（例えば、ＮａＯＨ）である。いくつかの実施形態において、捕捉したアダプターをライゲーションした核酸は、低濃度（例えば、１Ｍ未満、０．５Ｍ未満、０．１Ｍ未満、０．０５Ｍ未満、０．０１Ｍ未満、０．００１Ｍ未満、０．０００１Ｍ未満）のＮａＯＨで溶離される。いくつかの実施形態において、捕捉したアダプターをライゲーションした核酸は、低濃度のＮａＯＨおよび熱で溶離される。

その固定化された（例えば、図３にあるように）または溶離された（例えば、図４にあるように）アダプターをライゲーションした核酸は、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の遺伝子特異的プライマー（「ＧＳＰ１」）およびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマー（「Ｐ５＿１」）を使用する第１のＰＣＲラウンド３２４に供される。このようにして、Ｐ５＿１は、ＧＳＰ１によって生成される鎖をプライムオフする。示されるように、いくつかの実施形態において、ＧＳＰ１（例えば、第１の標的特異的プライマー）は、その標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない５’領域でテール付加される。いくつかの実施形態において、５’テール領域は、例えば、プライマーダイマーの発生を最小化する配列内容物を有することによって、プライマーダイマーを防止し得る。いくつかの実施形態において、ＧＳＰ１は、その５’テール付加領域でテール付加されない。図３にさらに示されるように、第２のＰＣＲラウンド３２６は、第２の遺伝子特異的プライマー（「ＧＳＰ２」）および第２のアダプタープライマー（「Ｐ５＿２」）を使用して行われる。示されるように、ＧＳＰ２は、ＧＳＰ１に対してネスト化される。また示されるように、ＧＳＰ２は、その標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしない５’領域でテール付加される。第１のＰＣＲラウンドに類似の様式で、Ｐ５＿２は、ＧＳＰ２によって生成される鎖をプライムオフする。この第２のＰＣＲラウンドでは、さらなるプライマー（「ＳＩＮＧＬＥ ＰＲＩＭＥＲ」）が含まれ、このプライマーは、（ｉ）ＧＳＰ２のテール付加された５’領域のうちの少なくとも一部と同一の３’領域、および（ｉｉ）シーケンシングに有用なさらなる要素（例えば、シーケンシングプライマー結合部位およびサンプルインデックス）を含む５’領域を含む。Ｐ５＿２がＧＳＰ２によって生成される相補鎖からセンス鎖を生成した後に、そのさらなるプライマーは、次いで、シーケンシングの準備ができた生成物３２８を生成するために、ＧＳＰ２テール付加された領域の目下の相補的配列をプライムオフする。

サンプル精製
いくつかの実施形態において、標的核酸および／またはその増幅生成物は、１つの方法のうちの任意の適切な工程の前および／または後で、酵素、プライマー、または緩衝液構成要素から単離され得る。核酸を単離するための任意の適切な方法が、使用され得る。いくつかの実施形態において、その単離は、固相可逆的固定法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ））クリーンアップを含み得る。ＳＰＲＩクリーンアップのための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ － ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（カタログ番号Ａ６３８８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ； Ｂｒｅａ， ＣＡ））。いくつかの実施形態において、酵素は、加熱処理によって不活性化され得る。いくつかの実施形態において、非標識ｄＮＴＰは、酵素処理によって除去される。

いくつかの実施形態において、ハイブリダイズしなかったプライマーは、適切な方法（例えば、精製、消化など）を使用して核酸調製物から除去され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）は、調製物からプライマーを除去するために使用される。いくつかの実施形態において、このようなヌクレアーゼは、プライマー消化後に熱不活性化される。そのヌクレアーゼが一旦不活性化されると、プライマーのさらなるセットが、さらなる増幅反応を行うために、他の適切な構成要素（例えば、酵素、緩衝液）と一緒に添加され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法の工程は、必要に応じて、間にあるサンプル精製工程を含む。いくつかの実施形態において、サンプル精製工程は、洗浄工程を含む。いくつかの実施形態において、サンプル精製工程は、ＳＰＲＩクリーンアップ（例えば、ＡＭＰｕｒｅ）を含む。例えば、分析用の核酸を調製するための方法は、（ａ）テンプレートとしてＲＮＡ調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとしてそのランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここでそのＲＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；（ｂ）そのｃＤＮＡを末端修復して、その標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；（ｃ）その平滑末端化した２本鎖核酸を常磁性基材または表面上に固定化する工程；（ｄ）その固定化した平滑末端化２本鎖核酸を洗浄する工程；（ｅ）その洗浄した固定化平滑末端化２本鎖核酸をその常磁性基材または表面から放出する工程；（ｆ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、その放出した平滑末端化２本鎖核酸の３’末端に付加する工程；（ｇ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプターを工程（ｆ）において生成した核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここでそのオーバーハング配列は、その１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｈ）そのライゲーション生成物を洗浄することなしに、その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、そのライゲーション生成物を増幅する工程；（ｉ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｈ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここでその第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；（ｊ）工程（ｉ）の増幅生成物を常磁性基材または表面に固定化する工程；（ｋ）その固定化した増幅生成物を洗浄する工程；ならびに（ｌ）その洗浄した固定化増幅生成物をその常磁性基材または表面から放出する工程を包含し得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法の工程は、必要に応じて、１またはこれより多くのヌクレオチドを核酸に付加する工程であって、ここでその１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分を含む工程、およびそ
の捕捉部分とその捕捉部分の結合パートナーとの間の相互作用を介してその核酸を捕捉する工程を包含する。例えば、分析用の核酸を調製するための方法は、（ａ）テンプレートとして核酸調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとしてそのランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここでその核酸調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；（ｂ）そのｃＤＮＡを末端修復して、その標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；（ｃ）その平滑末端化した２本鎖核酸を洗浄する工程；（ｄ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、工程（ｃ）において洗浄した核酸の３’末端に付加する工程であって、必要に応じてここで、その１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドである工程；（ｅ）工程（ｄ）において生成した核酸を洗浄する工程；（ｆ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程（ｅ）で生成した核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここでそのオーバーハング配列は、その１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；（ｇ）その標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよびそのアダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、そのライゲーション生成物を増幅する工程；（ｈ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここでその第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；ならびに（ｊ）工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程を包含し得る。

核酸アダプター
本明細書で使用される場合、用語「核酸アダプター（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｄａｐｔｅｒ）」または「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」とは、標的ヌクレオチド配列の増幅および／またはシーケンシングの間に有用な１またはこれより多くの要素を提供する、その標的ヌクレオチド配列を含む核酸にライゲーションされ得る核酸分子をいう。いくつかの実施形態において、アダプターは、１本鎖である。いくつかの実施形態において、アダプターは、２本鎖である。いくつかの実施形態において、２本鎖アダプターは、第１のライゲーション可能な二重鎖末端および第２の不対末端を含む。いくつかの実施形態において、アダプターは、増幅鎖およびブロッキング鎖を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、５’不対部分および３’二重鎖部分を含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、３’オーバーハングをさらに含む。いくつかの実施形態において、その３’オーバーハングは、３’Ｔオーバーハングである。いくつかの実施形態において、その増幅鎖は、第１のおよび第２のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、５’二重鎖部分および伸長不能な３’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、３’不対部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、その増幅鎖およびそのブロッキング鎖の二重鎖部分は、実質的に相補的であり、そしてその二重鎖部分は、ライゲーション温度においてにおいて二重鎖形態を保持するために十分な長さである。

いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のアダプタープライマーと同一のヌクレオチド配列を含む増幅鎖の一部は、少なくとも部分的に、その増幅鎖の５’不対部分によって含まれ得る。

いくつかの実施形態において、そのアダプターは、「Ｙ」形状を有し得る、すなわち、その第２の不対末端は、増幅鎖の５’不対部分およびブロッキング鎖の３’部分を含む。そのブロッキング鎖の３’不対部分は、その増幅鎖の５’不対部分より短くてもよいし、長くてもよいし、長さが等しくてもよい。いくつかの実施形態において、そのブロッキン
グ鎖の３’不対部分は、その増幅鎖の５’不対部分より短い可能性がある。Ｙ形状のアダプターは、そのブロッキング鎖の不対部分がＰＣＲレジメンの間の３’伸長に左右されないという利点を有する。

いくつかの実施形態において、そのアダプターのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分に実質的に相補的でない３’不対部分をさらに含み得る；ここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーのうちのいずれにも実質的に相補的でないか、または実質的に同一でない。いくつかの実施形態において、そのブロッキング鎖は、その増幅鎖の５’不対部分にアニーリング温度で特異的にアニールしない３’不対部分をさらに含み得る；ここでそのブロッキング鎖の３’不対部分は、プライマーまたはその相補体のうちのいずれにも、アニーリング温度で特異的にアニールしない。いくつかの実施形態において、アダプター核酸は、最低でも、多重化のためのサンプルインデックス配列を含む。しかし、いくつかの実施形態において、そのアダプター核酸は、ランダム分子バーコードをさらに含む。

増幅
本開示の局面は、１またはこれより多くの増幅ラウンドを含み得る技術に関する。いくつかの実施形態において、第１の増幅ラウンドは、第１の標的特異的プライマーおよび第１のアダプタープライマーを使用して行われる。

本明細書で使用される場合、「第１の標的特異的プライマー（ｆｉｒｓｔ ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適したアニーリング条件下で、テンプレート核酸の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。増幅の間に、その第１の標的特異的プライマーは、そのテンプレートに相補的な鎖を生成し、この相補鎖は、第１のアダプタープライマーとハイブリダイズされ得る。

本明細書で使用される場合、「第１のアダプタープライマー（ｆｉｒｓｔ ａｄａｐｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）」は、適したアニーリング条件下で、アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。このように、その第１のアダプタープライマーは、そのアダプターのうちの少なくとも一部と同一であるので、それは、その第１の標的特異的プライマーによって生成される相補鎖にアニールして、増幅が進むことを可能にする。

いくつかの実施形態において、第１の増幅工程の第１のＰＣＲ増幅サイクルでは、第１の標的特異的プライマーは、標的ヌクレオチド配列を含む核酸のテンプレート鎖に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その第１の標的特異的プライマーがデザインされた配向に依存して、その標的ヌクレオチド配列の上流または下流にある配列は、そのテンプレート鎖に相補的な鎖として合成される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲの伸長相の間に、テンプレート鎖の５’末端がライゲーションされたアダプターで終結する場合、その新たに合成された相補鎖の３’末端は、第１のアダプタープライマーとハイブリダイズし得る配列を含む。その後のＰＣＲ増幅サイクルでは、その第１の標的特異的プライマーおよびその第１のアダプタープライマーの両方が、その標的核酸配列の適切な鎖に特異的にアニールし得、その既知のヌクレオチド標的配列とそのアダプターとの間の配列は、増幅され得る。いくつかの実施形態において、第２の増幅ラウンドは、第２の標的特異的プライマーおよび第２のアダプタープライマーを使用して行われる。

本明細書で使用される場合、「第２の標的特異的プライマー（ｓｅｃｏｎｄ ｔａｒｇｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）」は、適したアニーリング条件下で、先の増幅工程から生じるアンプリコンによって含まれるその標的ヌクレオチド配列の一部に特異的
にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。増幅の間に、その第２の標的特異的プライマーは、そのテンプレートに相補的な鎖を生成し、この相補鎖は、第２のアダプタープライマーとハイブリダイズされ得る。

本明細書で使用される場合、「第２のアダプタープライマー（ｓｅｃｏｎｄ ａｄａｐｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）」とは、適したアニーリング条件下で、アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールし得る核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。このように、その第１のアダプタープライマーは、そのアダプターのうちの少なくとも一部と同一であるので、それは、その第２の標的特異的プライマーによって生成される相補鎖にアニールして、増幅が進むことを可能にする。

いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される。いくつかの実施形態において、ネスト化したアダプタープライマーを使用すると、増幅可能である（例えば、ブリッジＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲの間に）が、シーケンシングできない（半ネスト化法の間に生じ得る状況）最終アンプリコンを生成する可能性を排除する。他の状況において、シーケンシングプライマーと同一のプライマーを使用する半ネスト化アプローチは、第１のＰＣＲ工程から第２のＰＣＲ工程への望ましくない増幅生成物の持ち越しを生じ得、最終的には、人工シーケンシングリードを生じる。いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、第１の標的特異的プライマーに関して少なくとも１ヌクレオチド、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはこれより多くのヌクレオチドがネスト化される。いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、約５ヌクレオチド～約１０ヌクレオチドが、約１０ヌクレオチド～約１５ヌクレオチドが、約１５ヌクレオチド～約２０ヌクレオチドが、または約２０個もしくはこれより多くのヌクレオチドが第１の標的特異的プライマーに関してネスト化される。

他の局面の中でも、本明細書で記載される技術は、１またはこれより多くのネスト化プライマーの使用を包含し得る。いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用すると、予測外のプライマー結合部位の増幅に起因して、ＰＣＲ生成物における非特異的に結合が低減し得る。本明細書で使用される場合、用語「ネスト化される（ｎｅｓｔｅｄ）」は、１つのプライマー対の１つのプライマーのアニーリング部位と別のプライマー対の別のプライマーのアニーリング部位との間の位置的関係性を記載するために使用される。例えば、いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、１個、２個、３個またはこれより多くのヌクレオチドが第１のプライマーに対してネスト化され、このことは、１個、２個、３個またはこれより多くのヌクレオチドがフレームシフトされるそのテンプレート鎖上の部位にその第２のプライマーが結合することを意味する。

いくつかの実施形態において、第２の標的特異的プライマーは、標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする３’部分およびその標的ヌクレオチド配列にアニールしない５’テールを含む。いくつかの実施形態において、その５’テールは、第２のシーケンシングプライマーと同一の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、反応中に存在する多数のプライマー（例えば、１もしくはこれより多くの標的特異的プライマーおよび／または１もしくはこれより多くのアダプタープライマー）は、同一の５’テール配列部分を含み得る。

いくつかの実施形態において、５’テールは、ＧＣリッチ配列であり得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくとも５０％ ＧＣ含量、少なくとも５５％
ＧＣ含量、少なくとも６０％ ＧＣ含量、少なくとも６５％ ＧＣ含量、少なくとも７０％ ＧＣ含量、少なくとも７５％ ＧＣ含量、少なくとも８０％ ＧＣ含量、またはより高いＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくと
も６０％ ＧＣ含量を含み得る。いくつかの実施形態において、５’テール配列は、少なくとも６５％ ＧＣ含量を含み得る。

いくつかの実施形態において、第２の増幅ラウンドは、５’テールを含む第２の標的特異的プライマー、第１のアダプタープライマー、およびさらなるプライマーを含む。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、その第２の標的特異的プライマーの５’テールと同一の３’部分を含む。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、バーコード、インデックス、アダプター配列、またはシーケンシングプライマー部位を含み得るハイブリダイゼーション配列の５’側にさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのさらなるプライマーは、包括的なシーケンシングアダプター／インデックスプライマーである。

いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２の標的特異的プライマーは、その標的核酸の同じ鎖に実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも２０個の特有の塩基、例えば、２０個もしくはこれより多くの特有の塩基、２５個もしくはこれより多くの特有の塩基、３０個もしくはこれより多くの特有の塩基、３５個もしくはこれより多くの特有の塩基、４０個もしくはこれより多くの特有の塩基、または５０個もしくはこれより多くの特有の塩基を含み得る。いくつかの実施形態において、その既知の標的配列に特異的にアニールするその第１のおよび第２の標的特異的プライマーの一部は、合計で、その既知の標的ヌクレオチド配列の少なくとも３０個の特有の塩基を含み得る。

いくつかの実施形態において、その第１のアダプタープライマーは、そのアダプターの増幅鎖の約２０個の最も５’側の塩基と同一の核酸配列を含み得、その第２のアダプタープライマーは、そのアダプターの増幅鎖の約３０個の塩基と同一の核酸配列と、その増幅鎖の５’末端の３’側にある少なくとも１個のヌクレオチドである５’塩基とを含み得る。

いくつかの実施形態において、アダプターをライゲーションした核酸（例えば、ライゲーション生成物）は、最小限である。このような実施形態において、第１のアダプタープライマーが使用され得、これは、その３’末端においてアダプター核酸配列の一部、および次いで、その５’末端にシーケンサーにとって重要なさらなる情報を含む。このような実施形態において、第２のアダプタープライマーが使用され得、これは、その３’末端において、その第１のアダプタープライマーの５’末端を含む。このような実施形態において、その第２のアダプタープライマーはまた、その５’末端においてシーケンシングを可能にするヌクレオチド配列を有し得る。このような実施形態において、ＰＣＲを使用して、シーケンサー適合性であるライブラリーを生成することは、可能である。

プライマー
いくつかの実施形態において、プライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマー、ならびに第１のおよび第２のアダプタープライマー）を、これらが、約６１～７２℃、例えば、約６１～６９℃、約６３～６９℃、約６３～６７℃、約６４～６６℃のアニーリング温度において、これらの相補的配列に特異的にアニールするように、デザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが７２℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが７０℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、これらが６８℃未満のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、プライマーは、こ
れらが約６５℃のアニーリング温度でこれらの相補的配列に特異的にアニールするようにデザインされる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクリングすることによって）変更して、プライマーアニーリングを促進するように構成される。

いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６１～７２℃、例えば、約６１～６９℃、約６３～６９℃、約６３～６７℃、約６４～６６℃の温度で特異的にアニールする。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする標的特異的プライマーの一部は、約６５℃の温度で、ＰＣＲ緩衝液中で特異的にアニールする。

核酸伸長、増幅、およびＰＣＲ
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、伸長レジメンまたは工程を含む。このような実施形態において、伸長は、１つまたはこれより多くのハイブリダイズしたランダムプライマーから、プライマーがテンプレートに関してハイブリダイズされる核酸分子を使用して、進み得る。伸長工程は、本明細書で記載される。いくつかの実施形態において、１つまたはこれより多くのランダムプライマーは、サンプル中の核酸の実質的に全てにハイブリダイズし得、そのうちの多くは、標的ヌクレオチド配列を含まなくてもよい。よって、いくつかの実施形態において、ランダムプライマーの伸長は、標的ヌクレオチド配列を含まないテンプレートとのハイブリダイゼーションに起因して起こり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅レジメンを包含し得る（１つまたはこれより多くの増幅サイクルを包含する）。本明細書で記載される方法の増幅工程は、各々ＰＣＲ増幅レジメンを、すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルのセットを含み得る。本明細書で使用される場合、用語「増幅レジメン（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎ）」とは、目的の核酸を特異的に増幅する（その存在量を増大させる）プロセスをいう。いくつかの実施形態において、指数関数的増幅は、以前のポリメラーゼ伸長の生成物が連続する伸長ラウンドにわたってテンプレートとして働く場合に起こる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うＰＣＲ増幅レジメンは、少なくとも１回、およびいくつかの場合には、少なくとも５回またはこれより多くの反復サイクルを含み得る。いくつかの実施形態において、各反復サイクルは、１）鎖分離（例えば、熱変性）；２）テンプレート分子へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング；および３）そのアニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長という工程を含み得る。これらの工程の各々に関与する任意の適切な条件および時間が使用され得ることは、認識されるべきである。いくつかの実施形態において、選択される条件および時間は、長さ、配列の内容、融解温度、二次構造特徴、または反応において使用される核酸テンプレートおよび／もしくはプライマーに関する他の因子に依存し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラー（そのうちの多くは市販されている）で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、線形的増幅を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、ネスト化プライマーを使用して行われる増幅工程は、線形的増幅を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を使用して行われ得る。例えば、いくつかの実施形態において、増幅は、Ｔ７媒介性ＮＡＳＢＡ反応を含む。

いくつかの実施形態において、核酸伸長反応は、核酸ポリメラーゼの使用を包含する。本明細書で使用される場合、語句「核酸ポリメラーゼ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、ヌクレオシド三リン酸のテンプレート依存性重合を触媒して、テンプレート核酸配列に相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。核酸ポ
リメラーゼ酵素は、アニールしたプライマーの３’末端における合成を開始し、そのテンプレートの５’末端に向かう方向で進む。多くの核酸ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、市販されている。核酸ポリメラーゼのうちの１グループは、熱安定性である。すなわち、それらは、相補的な核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度（例えば、９４℃、または時にはより高い）に供された後に機能を保持する。増幅のためのプロトコルの非限定的な例は、以下の条件下でポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｔａｑ、ＶｅｒａＳｅｑ）を使用することを包含する：９８℃で３０秒間、続いて、以下を含む１４～２２回のサイクル（９８℃で１０秒間での融解、続いて、６８℃で３０秒間のアニーリング、続いて、７２℃で３分間の伸長、続いて、４℃での反応の保持）。しかし、他の適切な反応条件が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、アニーリング／伸長温度は、塩濃度における差異を考慮するために調節され得る（例えば、より高い塩濃度に対して３℃高い）。いくつかの実施形態において、例えば、９８℃から６５℃への傾斜率を（例えば、１℃／秒、０．５℃／秒、０．２８℃／秒、０．１℃／秒またはよりゆっくりと）遅らせることは、より多重化したサンプル中でプライマー性能および適用範囲の均一性を改善する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムは、容器温度を（例えば、種々の温度範囲の間でサイクルさせ、制御された上昇率または下降率を有することによって）変更して、増幅を促進するように構成される。

いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、その酵素がテンプレート依存性伸長を行う条件下で使用される。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＶｅｒａＳｅｑ ＵＬｔｒａポリメラーゼ、ＶｅｒａＳｅｑ ＨＦ ２．０ポリメラーゼ、ＥｎｚＳｃｒｉｐｔ、または別の適切なポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素ではない。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、その核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートに対して作用する。いくつかの実施形態において、伸長反応は、相補的なＤＮＡ分子を生成するために、ＲＮＡに対して行われる逆転写を包含する（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）。いくつかの実施形態において、逆転写酵素は、マウスのモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＨＩＶ－２逆転写酵素、または別の適切な逆転写酵素である。

いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、反応混合物の加熱を概して要する鎖分離工程を包含するサイクルを要する。本明細書で使用される場合、用語「鎖分離（ｓｔｒａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」または「鎖を分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、相補的な２本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用可能な２本の単一の鎖へと分離されるようにする核酸サンプルの処理を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法に従う鎖分離は、核酸サンプルをその融解点（Ｔ_ｍ）を上回って加熱することによって達成される。いくつかの実施形態において、核酸ポリメラーゼに適した反応調製物における核酸分子を含むサンプルに関しては、９４℃への加熱は、鎖分離を達成するために十分である。いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１～１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１～１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、少なくとも１種の緩衝化剤（例えば、１～２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、およびキャリア（例えば、０．０１～０．５％ ＢＳＡ）を含む。適切な緩衝液の非限定的な例は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５～３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および０．１％
ＢＳＡを含む。適切な緩衝液のさらなる非限定的な例は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、０．５～５ｍＭ（例えば、およそ０
．５ｍＭ、およそ１ｍＭ、およそ２ｍＭ、およそ３ｍＭ、およそ４ｍＭ、およそ５ｍＭ）
ＭｇＣｌ２、および０．１％ ＢＳＡを含む。

いくつかの実施形態において、核酸増幅は、標的核酸に特徴的な鎖を有する核酸テンプレートにプライマーをアニールさせることを包含する。いくつかの実施形態において、標的核酸の鎖は、テンプレート核酸として働き得る。本明細書で使用される場合、用語「アニールする（ａｎｎｅａｌ）とは、２つの核酸の間での１つまたはこれより多くの相補的塩基対の形成をいう。いくつかの実施形態において、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は、２つの相補的または実質的に相補的な核酸鎖が一緒にハイブリダイズすることを要する。いくつかの実施形態において、伸長反応の状況では、アニーリングは、テンプレート依存性ポリメラーゼ酵素のプライマー伸長基質が形成されるように、テンプレートへのプライマーのハイブリダイゼーションを要する。いくつかの実施形態において、アニーリング（例えば、プライマーと核酸テンプレートとの間）の条件は、プライマーの長さおよび配列に基づいて変動し得る。いくつかの実施形態において、アニーリングの条件は、プライマーのＴ_ｍ（例えば、計算されたＴ_ｍ）に基づく。いくつかの実施形態において、伸長レジメンのアニーリング工程は、鎖分離工程後の温度を、プライマーのＴ_ｍ（例えば、計算されたＴ_ｍ）に基づく温度へと、このようなアニーリングを可能にするために十分な時間にわたって低下させることを要する。いくつかの実施形態において、Ｔ_ｍは、多くのアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ． Ｃｏｌｏｒａｄｏ）プライマーデザインソフトウェアおよびＶＥＮＴＲＯ ＮＴＩ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ． Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プライマーデザインソフトウェアおよびインターネット上で入手可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｏｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ、およびＮｅｔＰｒｉｍｅｒ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ； Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ；およびワールドワイドウェブ上で（例えば、ａｔ ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／Ｈｅｌｐ／ｘｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌにおいて）無料で入手可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、プライマーのＴ_ｍは、以下の式を使用して計算され得る（これは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェアによって使用され、Ｆｒｉｅｉｒ，ら ＰＮＡＳ １９８６
８３：９３７３－９３７７（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）により詳細に記載される）。

ここで：ΔＨは，ヘリックス形成のエンタルピーであり；ΔＳは、ヘリックス形成のエントロピーであり；Ｒは、モル気体定数（１．９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）であり；Ｃは、核酸濃度であり；そして［Ｋ^＋］は、塩濃度である。大部分の増幅レジメンに関して、アニーリング温度は、推定Ｔ_ｍより約５℃低いように選択されるが、例えば、推定Ｔ_ｍより５℃より大きく低い温度（例えば、６℃低い、８℃低い、１０℃低い、またはより低い）であり得るように、Ｔ_ｍにより近く、Ｔ_ｍを上回る温度（例えば、推定Ｔ_ｍより１℃～５℃の間または低い、推定Ｔ_ｍより１℃～５℃の間高い）が使用され得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度がＴ_ｍに近いほど、アニーリングはより特異的になる。いくつかの実施形態において、伸長反応の間（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、反応の容積に基づいて決定される（例えば、容積が大きいほど、より長い時間を要する）。いくつかの実施形態において、伸長反応の間に（例えば、ＰＣＲ増幅レジメンの状況内で）プライマーアニーリングに使用される時間は、少なくとも部分的に、プライマーおよびテンプレート濃度に基づいて決定される（例えば、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度が高いほど、より低い相対的濃度より、より短い時間を要する）。いくつかの実施形態において、容積および相対的プライマー／テンプレート濃度に依存して、伸長反応における（例えば
、増幅レジメンの状況内での）プライマーアニーリング工程は、１秒～５分、１０秒～２分、または３０秒～２分の範囲内であり得る。本明細書で使用される場合、「実質的にアニールする（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｎｎｅａｌ）」とは、相補的塩基対が、ＰＣＲ増幅レジメンの状況において使用される場合に、特異的に増幅された生成物の検出可能なレベルを生じるために十分である２つの核酸の間で形成する程度を指す。

本明細書で使用される場合、用語「ポリメラーゼ伸長（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）とは、核酸ポリメラーゼによる、核酸テンプレートにアニールされるプライマーの３’末端への少なくとも１個の相補的ヌクレオチドのテンプレート依存性付加をいう。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、例えば、テンプレートの全長に相当するヌクレオチドまでおよびそれを含む１個より多くのヌクレオチドを付加する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長の条件は、少なくとも部分的に、使用されるポリメラーゼが何であるかに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長に使用されるテンプレートは、その酵素の既知の活性特性に基づく。アニーリング温度がその酵素の至適温度を下回るいくつかの実施形態において、より低い伸長温度を使用することは、許容可能であり得る。いくつかの実施形態において、酵素は、それらの至適伸長温度より下で少なくとも部分的活性を保持し得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長（例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよびその改変体のような熱安定性ポリメラーゼで行われる）は、６５℃～７５℃または６８℃～７２℃で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ＰＣＲ増幅レジメンの各サイクルにおいて核酸テンプレートにアニールされるプライマーのポリメラーゼ伸長を要する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ伸長は、比較的強い鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態において、強い鎖置換を有するポリメラーゼは、融合物（例えば、５’融合物）を検出する目的で核酸を調製するために有用である。いくつかの実施形態において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）は、長いライブラリーフラグメントを生成するために有用である。

いくつかの実施形態において、プライマー伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件下で行われる。本明細書で使用される場合、用語「伸長生成物が生成されるようにアニールしたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｐｅｒｍｉｔ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｎｅａｌｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｃｈ ｔｈａｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」とは、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する条件のセット（例えば、温度、塩および補因子濃度、ｐＨ、ならびに酵素濃度）をいう。いくつかの実施形態において、このような条件は、少なくとも部分的に、使用されている核酸ポリメラーゼに基づく。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、適切な反応調製物中でプライマー伸長反応を行い得る。

いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１つまたはこれより多くの塩（例えば、１～１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１～１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、少なくとも１つの緩衝化剤（例えば、１～２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１～０．５％ ＢＳＡ）、および１つまたはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が１０～２００μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する７２℃において５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５～３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、および０．１％ ＢＳＡである。

いくつかの実施形態において、適切な反応調製物は、１種またはこれより多くの塩（例えば、１～１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５～５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、少なくとも１種の緩衝
化剤（例えば、１～２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、キャリア（例えば、０．０１～０．５％ ＢＳＡ）、および１またはこれより多くのＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの各々が５０～３５０μＭ）を含む。条件の非限定的なセットは、７２℃において、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、および０．１％ ＢＳＡであり、このセットの下で、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する。条件のさらなる非限定的なセットは、７２℃において、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．８）、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２６６μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、１３３μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、および０．１％ ＢＳＡであり、このセットの下で、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）がプライマー伸長を触媒する。

いくつかの実施形態において、開始および伸長の条件は、適切な緩衝液中に、１種、２種、３種または４種の種々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰから選択される）および重合誘導剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、「緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）」とは、溶媒（例えば、水性溶媒）に加えて、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす適切な補因子および試薬を含み得る。いくつかの実施形態において、その２種、３種または４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、等モルの、またはおよそ等モルの濃度で存在する。いくつかの実施形態において、その２種、３種または４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、その技術の特定の実行に適していると経験的に決定された異なる濃度で存在する。

いくつかの実施形態において、核酸増幅は、５回まで、１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、またはこれより多くのラウンド（サイクル）の増幅を要する。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、長さが５サイクル～２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、増幅工程は、長さが１０サイクル～２０サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、各増幅工程は、長さが１２サイクル～１６サイクルのＰＣＲ増幅レジメンのサイクルのセットを含み得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７０℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、７２℃未満であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６５℃であり得る。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、約６１～約７２℃であり得る。

種々の実施形態において、本明細書で記載される方法および組成物は、本明細書で記載されるプライマーのタイプのうちの１つまたはこれより多くを用いてＰＣＲ増幅レジメンを行うことに関する。本明細書で使用される場合、「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」とは、核酸テンプレートに特異的にアニーリングし、テンプレート依存性ポリメラーゼの基質として働く３’末端を提供して、そのテンプレートに相補的な伸長生成物を生成し得るオリゴヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態において、プライマーは、プライマーおよびその相補体がアニールして２つの鎖を形成し得るようにする１本鎖である。本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーは、長さが３００ヌクレオチド以下であり、例えば、３００以下、または２５０、または２００、または１５０、または１００、または９０、または８０、または７０、または６０、または５０、または４０、または３０、またはこれより少ない、または２０もしくはこれより少ない、または１５もしくはこれより少ないが、長さが少なくとも６ヌクレオチドであるハイブリダイゼーション配列（例えば、核酸テンプレートとアニールする配列）を含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーのハイブリダイゼーション配列は、長さが６～５０ヌクレオチド、長さが６～３５ヌクレオチド、長さが６～２０ヌクレオチド、長さが１０～２５ヌクレオチドであり得る。

任意の適切な方法が、オリゴヌクレオチドおよびプライマーを合成するために使用され得る。いくつかの実施形態において、市販の供給源は、本明細書で記載される方法および組成物における使用のためのプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス（例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ^ＴＭ Ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ， ＩＡ）からの特注のＤＮＡ Ｏｌｉｇｏ）を提供する。

標的核酸
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「標的ヌクレオチド配列を含む核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、目的の核酸分子（例えば、分析されるべき核酸）をいう。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知のまたは所定のヌクレオチド配列）および決定されるべき隣接するヌクレオチド配列（これは、未知の配列といわれ得る）の両方を含む。標的核酸は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、２本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、１本鎖である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含む。

本明細書で記載される方法における使用に適したシーケンシング法のうちの多くは、数十から数百のヌクレオチド塩基の至適リード長でのシーケンシング実行を提供する（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、２００～４００ｂｐのリード長を生成し得る）。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、この至適リード長より実質的に長い核酸分子によって含まれ得る。第２の増幅工程から生じる増幅された核酸部分が特定のシーケンシング技術における使用のための適切な長さ（例えば、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ）のものであるために、その既知の標的ヌクレオチド配列とアダプターがライゲーションされ得る標的核酸の末端との間の平均距離は、選択された技術の至適リード長に可能な限り近くであるべきである。例えば、所定のシーケンシング技術の至適リード長が２００ｂｐである場合、本明細書で記載される方法に従って増幅される核酸分子は、約４００ｂｐまたはこれより短い平均長を有するべきである。しかし、いくつかの実施形態において、核酸分子が長さ４００ｂｐを超える場合に本明細書で記載される技術が実行され得ることは、認識されるべきである。例えば、いくつかの実施形態において、核酸フラグメントは、およそ４００個またはこれより多くのヌクレオチド、５００個またはこれより多くのヌクレオチド、６００個またはこれより多くのヌクレオチド、７００個またはこれより多くのヌクレオチド、８００個またはこれより多くのヌクレオチド、９００個またはこれより多くのヌクレオチド、１０００個またはこれより多くのヌクレオチド、１５００個またはこれより多くのヌクレオチド、２０００個またはこれより多くのヌクレオチド、２５００個またはこれより多くのヌクレオチド、３０００個またはこれより多くのヌクレオチド、４０００個またはこれより多くのヌクレオチド、５０００個またはこれより多くのヌクレオチド、１００００個またはこれより多くのヌクレオチドであり得る。

例えば、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡによって含まれる標的核酸は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼ
ーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）から市販されるＡＦＡ^ＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡによって含まれる標的核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。

いくつかの実施形態において、その標的核酸がＲＮＡによって含まれる場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得る。いくつかの実施形態において、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、そのＤＮＡテンプレートは、剪断されない。例えば、いくつかの実施形態において、逆転写酵素レジメンの間に使用されるプライマーの濃度は、生成物ｃＤＮＡが適切な「フラグメント化（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）」された長さのものであるように調節され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって；およびその核酸を末端修復、リン酸化、およびアデニル化に供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。

いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、遺伝子再編成によって含まれ得る。本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適合される。なぜならその遺伝子再編成の半分のみが何であるかが、先に決定されなければならないからである（すなわち、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の半分）。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、その遺伝子再編成は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え生成物を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「既知の標的ヌクレオチド配列（ｋｎｏｗｎ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「標的ヌクレオチド配列（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、その配列（例えば、その核酸が何であるかおよびその核酸のヌクレオチド塩基の順序）が既知である標的核酸の一部をいう。例えば、いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列は、既知であるかまたはその核酸の隣接する未知の配列のインターロゲーションより先に決定された核酸のヌクレオチド配列である。既知の標的ヌクレオチド配列は、任意の適切な長さであり得る。

いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、６００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、７００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、８００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、９００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、２５００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、３０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、４０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、５０００個もしくはこれより多くのヌクレオチド、１００００個もしくはこれより多くのヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列）は、１０～１００個のヌクレオチド、１０～５００個のヌクレオチド、１０～１０００個のヌクレオチド、１００～５００個のヌクレオチド、１００～１０００個のヌクレオチド、５００～１０００個のヌクレオチド、５００～５０００個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。

いくつかの実施形態において、方法は、核酸の連続する（または隣接する）部分の配列を決定するために、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、用語「に連続するヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ
ｔｏ）」とは、別のヌクレオチド配列（例えば、既知のヌクレオチド配列）の直ぐ上流または下流にある核酸分子（例えば、標的核酸）のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、任意の適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列は、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、例えば、１ｋｂまたはこれより短いヌクレオチド配列、７５０ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、５００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、４００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、３００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、２００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列、１００ｂｐまたはこれより短いヌクレオチド配列を含む。サンプルが既知の標的ヌクレオチド配列を含む種々の標的核酸（例えば、既知の標的ヌクレオチド配列が、そのゲノムに、または別個の同一でない染色体上に何度も出現する細胞）を含むいくつかの実施形態において、その既知の標的ヌクレオチド配列「に連続するヌクレオチド配列」を含む多数の配列が存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列（またはそのヌクレオチド配列）を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａ（ｏｒ ｔｈｅ） ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、核酸のヌクレオチド塩基が何であるかおよびその相対的位置を決定することを指す。

いくつかの実施形態において、既知の標的核酸は、遺伝子再編成から生じる融合配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、遺伝子再編成の存在および／または何であるかを決定するために適している。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成の１つの部分が何であるかは、先に既知であり（例えば、遺伝子特異的プライマーによって標的化されるべき遺伝子再編成の一部）、他の部分の配列は、本明細書で開示される方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子を要し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、融合発がん遺伝子を含み得る。

分子バーコードおよびインデックス配列
いくつかの実施形態において、プライマーおよび／またはアダプターは、識別子配列（例えば、バーコード、インデックス）、シーケンシングプライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｒｄ１）、およびアダプター配列のようなさらなる配列を含み得る。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、次世代シーケンシングシステムとともに使用される配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのシーケンシング技術のためのＰ５およびＰ７配列である。いくつかの実施形態において、そのアダプター配列は、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング技術と適合性のＰ１およびＡである。

いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）」、「分子バーコード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｒｃｏｄｅ）」、および「分子バーコードタグ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｒｃｏｄｅ ｔａｇ）」とは、交換可能に使用され得、そして一般に、その特定の核酸に関する識別子として有用であるアダプター核酸（その特定の核酸にアダプター核酸がライゲーションされる）の領域を指す。いくつか
の実施形態において、分子バーコードは、その核酸に関して特有の識別子を提供するランダム化した核酸配列（その核酸に対してそのランダム化した核酸配列がライゲーションされる）を含む。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、特有のフラグメントを同定し、サンプルに由来するシーケンシングリードを「重複削除する（ｄｅ－ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）」ために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、ＰＣＲ重複を同定および除去するために使用され得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、長さが２～２５ヌクレオチド、長さが２～１５ヌクレオチド、長さが２～１０ヌクレオチド、長さが２～６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、分子バーコードは、８個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「インデックス（ｉｎｄｅｘ）」、「インデックス配列（ｉｎｄｅｘ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「インデックス領域（ｉｎｄｅｘ ｒｅｇｉｏｎ）」、および「サンプルインデックス（ｓａｍｐｌｅ ｉｎｄｅｘ）」とは、交換可能に使用され得、そして一般に、そのライゲーションされた核酸が属する集団に関する識別子として有用であるアダプター核酸の領域を指す。いくつかの実施形態において、インデックスは、共通するライブラリーに属する配列の集まりを同定するために使用され得る固定された核酸配列を含む。例えば、インデックスは、核酸に対応するサンプルを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、例えば、共有されるかまたは共通する特性（例えば、ライブラリーの他の核酸の間で共通する）に関連する核酸の供給源識別子、位置識別子、日付もしくは時間識別子（例えば、サンプリングまたは処理の日付もしくは時間）、または他の識別子として使用され得る。いくつかの実施形態において、このようなインデックス配列は、核酸の集団に存在する核酸の異なる局面を同定するために有用である。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、標的核酸に関する供給源または位置識別子を提供し得る。例えば、インデックス配列は、核酸が得られる患者を同定するように働き得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、１つの反応（例えば、１つのフローセルで行われる）での多数の異なるサンプルのシーケンシングを可能にする。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、個々のシーケンシング反応を検出する目的で配列イメージャーを配向するために使用され得る。いくつかの実施形態において、インデックス配列は、長さが２～２５ヌクレオチド、長さが２～１５ヌクレオチド、長さが２～１０ヌクレオチド、長さが２～６ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、インデックスは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーの集団が、本明細書で記載される方法に従って使用される場合、多数の区別可能な増幅生成物は、増幅後に存在し得る。いくつかの実施形態において、テール付加ランダムプライマーは、サンプルの核酸分子全体を通じて種々の位置においてハイブリダイズするので、標的特異的プライマーのセットは、１回より多くのハイブリダイゼーション事象によって作られる伸長生成物をハイブリダイズ（および増幅）し得る。例えば、１つのテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第１の距離（例えば、１００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、別のテール付加ランダムプライマーは、標的特異的プライマーハイブリダイゼーション部位から第２の距離（例えば、２００ヌクレオチド）においてハイブリダイズし得、それによって、２つの増幅生成物（例えば、約１００ｂｐを含む第１の増幅生成物および約２００ｂｐを含む第２の増幅生成物）を生じ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物は各々、次世代シーケンシング
技術を使用してシーケンシングされ得る。いくつかの実施形態において、これらの多数の増幅生成物のシーケンシングは、増幅またはシーケンシングプロセスの間に導入される配列エラーを検出するために互いと比較され得る多数の重なり合う配列リードを提供することから有利である。いくつかの実施形態において、個々の増幅生成物（例えば、単一の分子に由来する）が整列され得、それらが特定の塩基において存在する配列の中で異なる場合、ＰＣＲおよび／またはシーケンシングのアーチファクトまたはエラーが存在し得る。

ＤＮＡ剪断／フラグメント化
本明細書で記載される核酸分子は、任意の所望のサイズのフラグメントを生成するために、剪断され得る（例えば、機械的にまたは酵素により剪断され得るか、ネブライザーにより剪断され得る）。機械的剪断プロセスの非限定的な例としては、超音波処理、ネブライゼーション、およびＣｏｖａｒｉｓ（Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）から市販されるＡＦＡ^ＴＭ剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態において、核酸は、超音波処理によって機械的に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、剪断も消化もされない。いくつかの実施形態において、調製工程の核酸生成物（例えば、伸長生成物、増幅生成物）は、剪断も酵素消化もされない。

いくつかの実施形態において、標的核酸配列がＲＮＡを含む場合、そのサンプルは、ＤＮＡテンプレートを生成するために逆転写酵素レジメンに供され得、次いで、そのＤＮＡテンプレートは、剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡは、逆転写酵素レジメンを行う前に剪断され得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡを含むサンプルは、新鮮なまたは分解された標本のいずれかから抽出された全核酸を使用して；ｃＤＮＡシーケンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要性なしに；ｃＤＮＡシーケンシングのためにリボソームＲＮＡを枯渇させる必要性なしに；工程のうちのいずれかにおける機械的剪断または酵素による剪断の必要性もなしに；ランダムヘキサマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成のためにＲＮＡを供することによって、本明細書で記載される方法において使用され得る。

シーケンシング
いくつかの局面において、本明細書で記載される技術は、オリゴヌクレオチドシーケンシングのために核酸サンプルを富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングは、次世代シーケンシング法によって行われ得る。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」とは、数千から数百万のシーケンシング反応を並行して行いかつ読み取ることに起因して、従来のシーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング法）で可能な速度を上回る速度でオリゴヌクレオチドをシーケンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシーケンシング技術をいう。次世代シーケンシング法／プラットフォームの非限定的な例としては、以下が挙げられる：大規模並行シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；４５４パイロシーケンシング（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）；固相可逆的ダイターミネーターシーケンシング（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ， ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｙｅ－ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）；ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔ）；ＤＮＡナノボールシーケンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な技術。いくつかの実施形態において、そのシーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合性の部分を含み得る。次世代シーケンシング技術およ
びその制約、ならびに関連したシーケンシングプライマーのデザインパラメーターは、当該分野で周知である（例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら，「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」， Ｎａｔｕｒｅ， ２００８， ｖｏｌ． ２６，
Ｎｏ． １０， １１３５－１１４５；Ｍａｒｄｉｓ， 「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ」， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００７， ｖｏｌ． ２４， Ｎｏ． ３， ｐｐ． １３３－１４１； Ｓｕら， 「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ， ２０１１， １１（３）：３３３－４３；Ｚｈａｎｇら， 「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」， Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２０１１， ３８（３）：９５－１０９；（Ｎｙｒｅｎ， Ｐ．ら Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８：
１７１７５（１９９３）； Ｂｅｎｔｌｅｙ， Ｄ． Ｒ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １６：５４５－５２（２００６）； Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ， Ｒ．
Ｌ．ら， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｔｏｄａｙ １３：５６９－７７（２００８）；米国特許第７，２８２，３３７号；米国特許第７，２７９，５６３号；米国特許第７，２２６，７２０号；米国特許第７，２２０，５４９号；米国特許第７，１６９，５６０号；米国特許第６，８１８，３９５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国公開番号２００６／０２５２０７７；同２００７／００７０３４９；および同２００７００７０３４９を参照のこと；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）。

いくつかの実施形態において、そのシーケンシング工程は、第１のおよび第２のシーケンシングプライマーの使用に依拠する。いくつかの実施形態において、その第１のおよび第２のシーケンシングプライマーは、本明細書で記載されるとおりの次世代シーケンシング法と適合性であるように選択される。

シーケンシングリードをゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列の既知の配列データベースに整列させるための方法は、当該分野で周知であり、ソフトウェアは、このプロセスのために市販される。いくつかの実施形態において、それらの全体において、野生型配列データベースにマッピングされないリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成または大きなインデル変異であり得る。いくつかの実施形態において、ゲノム中の多数の位置にマッピングされる配列を含むリード（より小さいシーケンシングプライマーおよび／またはアダプターヌクレオチド配列）は、ゲノム再編成であり得る。いくつかの実施形態において、連続する配列、または「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」に重なり合うリードのデノボアセンブリが構築され得、シーケンシングリードのアラインメントにおいて利用され得る。いくつかの実施形態において、公にアクセス可能なゲノミクスデータベースに依拠しないホットスポット参照が利用され得る。

サンプル
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、標的核酸、標的ヌクレオチド配列を含む核酸）は、適切なサンプル（例えば、食品サンプル、環境サンプル、生物学的サンプル、例えば、血液サンプルなど）中に存在するかまたはこれらサンプルから得られる。いくつかの実施形態において、その標的核酸は、被験体から得られる生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られる診断サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤、および／または他の物質をさらに含み得る。非限定的な例によれば、サンプルは、口内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離物、胸膜液、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検物、唾液、吸引物、またはこれらの組み合わせであ
り得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、切除物または生検物によって得られ得る。

いくつかの実施形態において、そのサンプルは、遺伝子変化（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）と関連する疾患（例えば、がんまたは遺伝性疾患）の処置の必要性のある被験体から得られ得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子に存在する。

いくつかの実施形態において、サンプルは、がんの処置の必要性のある被験体から得られる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍細胞の集団、例えば、少なくとも１個の腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、腫瘍生検物（非処理の生検組織物または処理生検組織物（例えば、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋した生検組織）が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。

いくつかの実施形態において、そのサンプルは、新たに集められる。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において使用される前に貯蔵される。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、非処理サンプルである。本明細書で使用される場合、「非処理サンプル（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ）」とは、溶液中での希釈および／または懸濁を除いて、いかなる事前のサンプル事前処理をも有しなかった生物学的サンプルをいう。いくつかの実施形態において、サンプルは、被験体から得られ、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に保存または処理される。非限定的な例によれば、サンプルは、パラフィンワックス中に包埋され得るか、冷蔵され得るか、または凍結され得る。凍結サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物に従って、核酸の存在を決定する前に融解され得る。いくつかの実施形態において、そのサンプルは、処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｏｒ ｔｒｅａｔｅｄ）サンプルであり得る。サンプルを処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）ための例示的な方法としては、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結および融解、保存剤（例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター）との接触、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、化学的および／または生物学的試薬で処理され得る。化学的および／または生物学的試薬は、処理および／または貯蔵の間に、サンプルの安定性またはそのサンプルによって含まれる核酸を保護および／または維持するために使用され得る。さらに、または代わりに、化学的および／または生物学的試薬は、そのサンプルの他の構成要素から核酸を放出するために使用され得る。非限定的な例によれば、血液サンプルは、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に、抗凝固剤で処理され得る。核酸分析のためのサンプルの処理、保存、または処理に適切な方法およびプロセスは、本明細書で開示される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、清澄にした流体サンプルであり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、その清澄にされる流体サンプルを含む上清の低速遠心分離（例えば、３，０００×ｇまたはこれより小さい）および収集によって清澄にされ得る。

いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する核酸は、本明細書で記載される方法および組成物において利用される前に単離され得るか、富化され得るか、または精製され得る。サンプルから核酸を単離、富化、または精製するために適した方法は、使用され得る。例えば、ゲノムＤＮＡを種々のサンプルタイプから単離するためのキットは、市販されている（例えば、カタログ番号５１１０４、５１３０４、５６５０４、および５６４０４； Ｑｉａｇｅｎ； Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＭＤ）。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、標的核酸のシーケンシングの前に、標的核酸を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、富化されるべき標的核酸の一方の末端の配列は、シーケンシングの前には知られていない。いくつかの実施形態に
おいて、本明細書で記載される方法は、次世代シーケンシング技術を使用してヌクレオチド配列を決定する前に、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法に関する。いくつかの実施形態において、特定のヌクレオチド配列を富化するための方法は、ハイブリダイゼーション富化を含まない。

標的遺伝子および治療適用
本明細書で記載される技術のいくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列の決定は、疾患の処置と直接関連する情報を提供し得る。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、疾患を処置することを補助するために使用され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、遺伝的変化と関連する疾患の処置の必要性のある被験体に由来し得る。いくつかの実施形態において、既知の標的配列は、疾患関連遺伝子、例えば、発がん遺伝子の配列である。いくつかの実施形態において、既知のオリゴヌクレオチド標的配列に連続する配列および／またはその既知のオリゴヌクレオチド標的配列は、疾患に関連する変異または遺伝的異常（例えば、ＳＮＰ、挿入、欠失、および／または遺伝子再編成）を含み得る。いくつかの実施形態において、サンプル中に存在する既知の標的配列に連続する配列および／または既知の標的配列は、遺伝子再編成生成物の配列を含んだ。いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、発がん遺伝子、例えば、融合発がん遺伝子であり得る。

がんのある種の処置は、ある種の発がん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効である。例えば、所定の融合発がん遺伝子の作用または発現を標的化する処置薬剤は、その融合発がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効であり得るが、その融合発がん遺伝子を欠く腫瘍に対しては有効でない。本明細書で記載される方法は、発がん遺伝子状態（例えば、変異、ＳＮＰ、および／または再編成）を明らかにする特定の配列の決定を促進し得る。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、隣接する領域の配列が既知である場合に、特定の配列の決定をさらに可能にし得る。例えば、本明細書で記載される方法は、精密な位置および／または再編成パートナーが、本明細書で記載される方法が行われる前に既知ではない既知の遺伝子（例えば、発がん遺伝子）を要する遺伝子再編成の存在および何であるかを決定し得る。

いくつかの実施形態において、被験体は、（例えば、標的化がん治療であるＥＧＦＲ－ＴＫＩを用いた）肺がんの処置の必要性がある。いくつかの実施形態において、例えば、そのサンプルが、肺がんの処置の必要性のある被験体から得られる場合、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。よって、いくつかの実施形態において、遺伝子再編成は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む融合物を生じる。ＡＬＫ、ＲＯＳ１、またはＲＥＴを含む遺伝子再編成の非限定的な例は、例えば、以下に記載される：Ｓｏｄａら Ｎａｔｕｒｅ ２００７ ４４８５６１－６： Ｒｉｋｏｖａら Ｃｅｌｌ ２００７ １３１：１１９０－１２０３； Ｋｏｈｎｏら Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ １８：３７５－７；
Ｔａｋｏｕｃｈｉら Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ １８：３７８－８１；これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される。しかし、再編成に関与する第２の遺伝子の遺伝子再編成の精密な位置および何であるかが予め既知でなくてもよいことは、認識されるべきである。よって、本明細書で記載される方法において、このような再編成の存在および何であるかは、遺伝子再編成に関与する第２の遺伝子の再編成の位置または何であるかを知る必要なしに検出され得る。

いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、およびＲＥＴの群から選択される遺伝子に由来する配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＡＬＫの
遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＡＬＫインヒビター；ＥＧＦＲ；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６）；ＡＰ２６１１３；ＬＤＫ３７８；３－３９；ＡＦ８０２；ＩＰＩ－５０４；ＡＳＰ３０２６；ＡＰ－２６１１３；Ｘ－３９６；ＧＳＫ－１８３８７０５Ａ；ＣＨ５４２４８０２；ＡＬＫキナーゼ活性のジアミノおよびアミノピリミジンインヒビター（例えば、ＮＶＰ－ＴＡＥ６８４およびＰＦ－０２３４１０６６（例えば、Ｇａｌｋｉｎら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００７， １０４：２７０－２７５； Ｚｏｕら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００７， ６７：４４０８－４４１７； Ｈａｌｌｂｅｒｇ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒ Ｆ１０００ Ｍｅｄ Ｒｅｐｏｒｔｓ
２０１１ ３：２１； Ｓａｋａｍｏｔｏら， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１１ １９：６７９－６９０；およびＷＯ ０４／０７９３２６で開示される分子を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細書に参考として援用される。ＡＬＫインヒビターは、ＡＬＫまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＡＬＫまたはその一部の発現および／または活性を低減する例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「未分化リンパ腫キナーゼ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ）」または「ＡＬＫ」とは、代表的には野生型形態におけるニューロン調節に関与する膜貫通チロシンキナーゼ（ｔｙＲＯＳ１ｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）をいう。ＡＬＫ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３８の下で註釈されるとおり）。

いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＯＳ１の遺伝子再編成の存在は、腫瘍がＲＯＳ１インヒビターおよび上記で記載されるとおりのＡＬＫインヒビター（例えば、ククリゾチニブ）からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る。ＲＯＳ１インヒビターは、ＲＯＳ１またはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＯＳ１またはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合「ｃ－ｒｏｓ発癌遺伝子１（ｃ－ｒｏｓ ｏｎｃｏｇｅｎｅ １）」または「ＲＯＳ１」（当該分野ではｒｏｓ－１ともいわれる）とは、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓサブファミリーの膜貫通チロシンキナーゼを指し、これは、ＰＴＰＮ６と相互作用する。ＲＯＳ１遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：６０９８の下で註釈されるとおり）。

いくつかの実施形態において、被験体における腫瘍から得られるサンプル中のＲＥＴの遺伝子再編成の存在は、その腫瘍が以下からなる群より選択される処置での処置に影響を受けやすいことを示し得る：ＲＥＴインヒビター；ＤＰ－２４９０、ＤＰ－３６３６、ＳＵ５４１６；ＢＡＹ ４３－９００６、ＢＡＹ ７３－４５０６（レゴラフェニブ）、ＺＤ６４７４、ＮＶＰ－ＡＳＴ４８７、ソラフェニブ、ＲＰＩ－１、ＸＬ１８４、バンデタニブ、スニチニブ、イマチニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ、ゲフィチニブ、およびウィザフェリンＡ（例えば、Ｓａｍａｄｉら， Ｓｕｒｇｅｒｙ ２０１０ １４８：１２２８－３６； Ｃｕｃｃｕｒｕら， ＪＮＣＩ ２００４ １３：１００６－１０１４； Ａｋｅｎｏ－Ｓｔｕａｒｔら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ ６７：６９５６； Ｇｒａｚｍａら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０ ２８：１５ｓ ５５５９； Ｍｏｌｏｇｎｉら， Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００６ ３７：１９９－２１２； Ｃａｌｍｏｍａｇｎｏら， Ｊｏｕｒｎａｌ ＮＣＩ ２００６ ９８：３２６－３３４； Ｍｏｌｏｇｎｉ， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１１ １８：１６２－１７５；ならびにＷＯ ０６／０３４８３３で開示される化合物；米国特許公開２０１１／０２０１５９８および米国特許第８，０６７，４３４号で開示される化合物を参照のこと）。前述の参考文献の全ては、それらの全体において本明細
書に参考として援用される。ＲＥＴインヒビターは、ＲＥＴまたはその一部の発現および／またはキナーゼ活性を低減する任意の薬剤（ＲＥＴまたはその一部の発現および／または活性を低減する、例えば、オリゴヌクレオチド、低分子、および／またはペプチドを含む）を含み得る。本明細書で使用される場合、「トランスフェクションの間に再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「ＲＥＴ」とは、神経堤発生に関与し、グリア細胞由来神経栄養因子ファミリーシグナル伝達分子を認識するカドヘリンスーパーファミリーのレセプターチロシンキナーゼをいう。ＲＥＴ遺伝子およびｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、多くの種（ヒトを含む）に関して公知である（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５９７９の下で註釈されるとおり）。

いくつかの実施形態において、その既知の標的配列は、表２から選択される遺伝子を含み得る。

本明細書で記載される方法の適用のさらなる非限定的な例としては、造血悪性腫瘍マーカーおよびその一団の検出（例えば、リンパ腫および白血病においてゲノム再編成を検出するものが挙げられる）、肉腫関連ゲノム再編成およびその一団の検出；ならびにリンパ腫検査のためのＩＧＨ／ＴＣＲ遺伝子再編成およびその一団の検出が挙げられる。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、例えば、がんを有するまたはがんを有すると診断された被験体を、がんの処置で処置することに関する。がんを有する被験体は、がんを診断するための現在の方法を使用して医師によって同定され得る。例えば、肺がんの状態を特徴付けかつ診断を補助する、肺がんの症状および／または合併症は、当該分野で周知であり、呼吸の虚弱（ｗｅａｋ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）、鎖骨上リンパ節腫脹、肺の異常音、胸部を軽くたたいた場合の濁音（ｄｕｌｌｎｅｓｓ）および胸痛が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、肺がんの診断を補助し得る検査としては、ｘ線、高レベルのある種の物質（例えば、カルシウム）に関する血液検査、ＣＴスキャン、および腫瘍生検が挙げられるが、これらに限定されない。肺がんの家族歴、または肺がんのリスク因子への曝露（例えば、喫煙または煙および／もしくは空気汚染への曝露）はまた、被験体が肺がんを有するようであるか否かを決定するか、または肺がんの診断を行うことを補助し得る。

がんとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：癌腫（腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、白血病、扁平細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、膠芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、脳のがん（膠芽腫および髄芽腫が挙げられる）が挙げられる）；乳がん、子宮頚がん、絨毛がん；結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、子宮内膜がん；食道がん、胃がん；種々のタイプの頭頚部がん、上皮内新生物（ボーエン病およびパジェット病が挙げられる）；血液新生物（急性リンパ性白血病および骨髄性白血病が挙げられる）；カポジ肉腫、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫が挙げられる）；肝臓がん（例えば、肝臓癌腫および肝細胞がん）、メル血細胞がん、黒色腫、多発性骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（扁平上皮がんが挙げられる）；卵巣がん（上皮細胞に由来するものが挙げられる）、肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫（ｆｉｂＲＯＳ１ａｒｃｏｍａ）、および骨肉腫が挙げられる）；膵臓がん；皮膚がん（黒色腫、間質細胞、胚細胞および間葉系細胞が挙げられる）；前立腺がん（ｐＲＯＳ１ｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん；外陰部がん（ｖｕｌｖａｌ ｃａｎｃｅｒ）、腎がん（腺癌を含む）；精巣がん（胚細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、非精上皮腫（奇形腫、絨毛がん）、間質腫瘍、および胚細胞腫瘍が挙げられる）；甲状腺がん（甲状腺腺がんおよび髄様がんを含む）；食道がん、唾液腺がん、およびウィルムス腫瘍。いくつかの実施形態において、そのがんは、肺がんであり得る。

多重方法
本明細書で記載される方法は、多重形式で使用され得る。本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定することを含み得る。本明細書で使用される場合、「多重増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、１つまたはこれより多くの反応容器において１より多くの標的核酸の同時増幅を包含するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、方法は、プライマーの１つまたはこれより多くのセットを使用して、多重増幅生成物の配列のその後の決定を包含する。多重とは、約２～１，０００個の間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを指し得る。しかし、いくつかの実施形態において、多重とは、１つの反応での約１，０００～１０，０００の間
の異なる標的配列の検出に指し得る。いくつかの実施形態において、多重とは、１つの反応での約１０，０００～１００，０００の間の異なる標的配列の検出を指し得る。本明細書で使用される場合、多重とは、２～１，０００の間の任意の範囲、例えば、５～５００個、２５～１，０００個、または１０～１００個などの間の異なる標的配列を１つの反応において検出することを言う。ＰＣＲに当てはまる場合の用語「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）」とは、同じＰＣＲ反応において少なくとも２個の異なる標的配列に特異的なプライマーが存在することを示唆する。

いくつかの実施形態において、サンプル中の標的核酸、またはサンプルの別個の部分は、複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）で増幅され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、複数の第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの反応混合物中に存在し得る。例えば、多数の増幅生成物は、同じ反応混合物中で生成され得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１のおよび第２の標的特異的プライマーの複数のセット）は、別個の遺伝子によって含まれる既知の標的配列に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、１つの遺伝子によって含まれる既知の標的配列の異なる部分に特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２セットのプライマー（例えば、少なくとも２セットの第１のおよび第２の標的特異的プライマー）は、既知の標的配列を含む遺伝子の異なるエキソンに特異的にアニールし得る。いくつかの実施形態において、その複数のプライマー（例えば、第１の標的特異的プライマー）は、同一の５’タグ配列部分を含み得る。

本明細書で記載される方法の実施形態において、多重適用は、１つのシーケンシング反応またはシーケンシング実行において多数のサンプル中の１つまたはこれより多くの既知の標的ヌクレオチド配列に連続するヌクレオチド配列を決定する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、多数のサンプルは、異なる起源のもの、例えば、異なる組織および／または異なる被験体に由来するものであり得る。このような実施形態において、プライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、バーコード部分をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、特有のバーコード部分を有するプライマー（例えば、テール付加ランダムプライマー）は、各サンプルに添加され得、その中の核酸にライゲーションされ得る；そのサンプルはその後、プールされ得る。このような実施形態において、増幅生成物の各得られたシーケンシングリードは、増幅生成物が由来するテンプレート核酸を含むサンプルを同定するバーコードを含む。

以下の実施例は、本発明のある種の局面を含め、本明細書で記載されるある種の実施形態を例証することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するわけではない。

実施例１：技術特異的アダプター核酸のデザイン
種々の次世代シーケンシング技術における使用に適したアダプター核酸および相当するアダプタープライマーを、デザインし生成した。

Ｉｌｌｕｍｉｎａ特異的適用において使用され得るアダプター核酸およびアダプタープライマーの例は、以下に示される：
Ｉｌｌｕｍｉｎａ特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ（増幅）鎖（５’→３’）：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＧＴＡＣＡＣＡ
ＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧ^＊Ｔ（配列番号１）（ここで「Ｎ」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「^＊Ｔ」は、ホスホチオエート結合を有するＴを表す）
ボトム（ブロッキング）鎖（５’→３’）：
５ｐｈｏｓＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴｔ（配列番号２）（ここで「ｔ」は、改変チミン核塩基（例えば、逆方向チミン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｈｙｍｉｎｅ）を表す）
第１のアダプタープライマー（５’→３’）：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡ（配列番号３）
第２のアダプタープライマー（５’→３’）：
ＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号４）

示されるように、その第１のおよび第２のアダプタープライマーは、そのトップ（増幅）鎖の一部と同一の配列を含む。このデザインの結果として、各プライマーは、第１のおよび第２のＰＣＲ工程の間に、それぞれ、第１のおよび第２の標的特異的プライマーによって生成される相補鎖をプライムオフし得る。この実施例における第２のアダプタープライマーは、２個のさらなるヌクレオチドを含み、その第１のアダプタープライマーに対してネスト化される。

イオン半導体特異的適用において使用され得るアダプター核酸およびアダプタープライマーの例は、以下に示される：
イオン特異的アダプター核酸およびアダプタープライマー
トップ（増幅）鎖（５’→３’）：
ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ^＊Ｔ（配列番号５）（ここで「Ｎ」は、分子バーコード配列のヌクレオチドを表し、「^＊Ｔ」は、ホスホチオエート結合を有するＴを表す）
ボトム（ブロッキング）鎖（５’→３’）：
５ｐｈｏｓＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣｔ（配列番号６）（ここで「ｔ」は、改変チミン核塩基（例えば、逆方向チミン）を表す）
第１のアダプタープライマー（５’→３’）：
ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣ（配列番号７）
第２のアダプタープライマー（５’→３’）：
ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号８）

示されるように、その第１のおよび第２のアダプタープライマーは、そのトップ（増幅）鎖の一部と同一の配列を含む。このデザインの結果として、各プライマーは、第１のおよび第２のＰＣＲ工程の間に、それぞれ、第１のおよび第２の標的特異的プライマーによって生成される相補鎖をプライムオフし得る。この実施例における第２のアダプタープライマーは、１０個のさらなるヌクレオチドを含み、その第１のアダプタープライマーに対してネスト化される。

実施例２：分析用の核酸サンプルの調製
分析用の核酸サンプルを調製するための方法を図示する作業フローの例は、図５に示される。ＲＮＡ分子のサンプルを、ランダムプライマーとアニールする。このアニーリングは、例えば、ランダムヘキサマーをそのサンプルに添加し、続いて、６５℃において５分間加熱することによって達成され得る。アニーリング後に、第１鎖ｃＤＮＡ合成を、プライマー伸長によって（例えば、室温において）逆転写酵素を使用して達成して、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成する。

この点において、「ＰｒｅＳｅｑ」ＲＮＡ ＱＣアッセイを行って、ライブラリー複雑
性を評価し得る。このアッセイにおいて、６００ｎｇのランダムヘキサマー（６５℃において５分間アニールされる）の使用を、１００ｎｇのランダムヘキサマー（６５℃において５分間アニールされる）の使用と比較した。「Ｃｔ」値の決定は、ライブラリー複雑性の示度および後の工程の間の分子バーコードインフレーションの確率の推定を提供する。一般に、２８という閾値Ｃｔが、ベンチマークとして使用され、この閾値未満の値が最も望ましい。ランダムプライマー濃度を増大させることは、有利なことには、Ｃｔを最小化することが見出された。

選択肢的なＰｒｅＳｅｑアッセイ後に、例えば、そのサンプルをＲｎａｓｅＨで処理することによってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを切断する。そのＤＮＡにハイブリダイズしたままのＲＮＡの得られたフラグメントは、第２鎖ｃＤＮＡ合成のプライマーとして働く。これは、ＤＮＡ ＰｏｌＩを使用し、そのサンプルを例えば、１６℃で６０分間インキュベートして達成される。この期間の後に、ＤＮＡ ＰｏｌＩを熱によって（例えば、そのサンプルを７５℃で２０分間インキュベートすることによって）不活性化する。ＤＮＡ ＰｏｌＩの熱不活性化は、その後のサンプル調製工程においてサンプル完全性を大きく増大させることが見出された。

図６に示されるように、ＤＮＡ ＰｏｌＩの熱不活性化は、熱不活性化なしと比較した場合に、第２鎖合成後のゲルクロマトグラフィーによって遙かによりはっきりとしたバンドを示すサンプルを生じた。ＤＮＡ ＰｏｌＩは、末端修復の間に活性になり、その５’→３’および／または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に起因してフラグメントを損傷していると仮定される－第２鎖合成後のＤＮＡ ＰｏｌＩの熱不活性化は、これが起こることを防止する。

その２本鎖ｃＤＮＡサンプルは、末端修復に供されて、そのｃＤＮＡを平滑末端化し、５’末端をリン酸化する。この工程では、過剰のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを、十分なｄＮＴＰとともにサンプルに添加し、インキュベートすることを可能にする（例えば、２５℃で３０分間）。この期間後のＡＭＰｕｒｅクリーンアップ（２．５×）は重要である。なぜならそれは、ビオチン標識ｄＡＴＰでテール付加する前に、残りのｄＡＴＰをそのライブラリー調製物から除去するからである。このクリーンアップ工程は、ライブラリーフラグメントをビオチン－ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰで標識することを防止し、これは、捕捉工程の間に誤って標識されたフラグメントの喪失を生じる。

そのライブラリーフラグメントは、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３’－５’エキソ－）を使用する第１のライゲーション工程において、３’末端にビオチン標識ｄＡＴＰでＡテール付加される。これは、例えば、そのサンプルおよび必要な構成要素を３７℃で１５分間インキュベートすることによって達成され得る。Ａテール付加後のＡＭＰｕｒｅクリーンアップ（２．５×）は重要である。なぜならそれは、その捕捉工程の前に、そのライブラリー調製物から残りのビオチン標識ｄＡＴＰを除去するからである。このクリーンアップは、遊離ビオチン－ｄＡＴＰを、ストレプトアビジン結合部位を飽和させることから防止し、捕捉の間のライブラリーフラグメントの喪失を生じる。

第２のライゲーション工程では、アダプター核酸は、ビオチン－Ａテール付加ライブラリーフラグメントにＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションされる。興味深いことに、クラウディング剤をそのライゲーション混合物に添加すると、全ての末端塩基にわたってライゲーション効率が大きく増大されることを見出した。図７に示されるように、５’末端塩基に関係なく、１０％ ＰＥＧを含めると、二重にライゲーションしたフラグメント（Ｌ２）を増大させると同時に、ライゲーションしなかったフラグメント（なし）および１つライゲーションしたフラグメント（Ｌ１）がさらに最小化された。さらに、１０％
ＰＥＧでのアダプターライゲーションは、６０分間で行われる「標準」プロトコルと比較して、５分間で達成された。さらなるデータは、２０％ ＰＥＧがライゲーション効率をさらにもっと改善することを示した（示さず）。

図８Ａは、これらの実験において使用される核酸アダプターを示す。示されるように、そのトップ鎖（増幅鎖）は、５’→３’において、ユニバーサルアダプタープライマー部位領域、サンプルインデックス領域、シーケンシングプライマー部位領域、分子バーコード領域、３’二重鎖部分、および３’Ｔオーバーハングを含む。そのボトム鎖（ブロッキング鎖）は、そのトップ鎖の３’二重鎖部分と二重鎖化される共通領域、５’リン酸化末端、およびその鎖の伸長を防止する逆方向ｄＴ塩基を含む。

アダプターライゲーション後に、ライゲーションクリーンアップは、ストレプトアビジン被覆ビーズを介するライブラリーフラグメントの捕捉によって行われる。これは、Ｍ－２８０ストレプトアビジンダイナビーズ（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０２％ アジド中で貯蔵された１０ｍｇ／ｍＬ濃度）を使用して行われる。その貯蔵緩衝液は、そのサンプルにそのビーズを添加する前に、ライゲーションクリーンアップ緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８）と交換される。そのライゲーションされたＤＮＡ生成物（５０μＬ）は、ライゲーションクリーンアップビーズと混合される（合計１００μＬに対して５０μＬ）。磁場は、その後、そのサンプルに印加されて、ライブラリーフラグメントを捕捉し、この上清は除去される。次いで、ライブラリーが結合したビーズは、第１のＰＣＲ工程のために別個の構成要素混合物に移される。

第１のＰＣＲラウンドは、第１の標的特異的プライマーおよび第１のアダプタープライマーを使用して行われる。その第１のアダプタープライマーは、これがその第１の標的特異的プライマーによって生成される相補鎖にアニールするように、その増幅鎖のうちの少なくとも一部と同一である。第２のＰＣＲラウンドは、第２の標的特異的プライマーおよび第２のアダプタープライマーを使用して行われ、そのうちの後者は同様に、その増幅鎖の一部と同一である。その第２の標的特異的プライマーは、その第１の標的特異的プライマーに対してネスト化され、さらなるプライマーによってさらに接触される。

図８Ｂに示されるように、その第２の標的特異的プライマーは、標的特異的領域にハイブリダイズしない５’テールを含む。５’テールと同一の領域とともに、第２のサンプルインデックス領域およびシーケンシングアダプター領域を含むさらなるプライマーが、含まれる。このようにして、その第２の標的特異的プライマーは、共通しないテール付加領域を有する相補鎖を生成するために、そのテンプレート鎖をプライムオフする。その第１のＰＣＲラウンドにおけるように、その第２のアダプターは、そのテンプレート鎖のコピーを生成するために、この相補鎖をプライムオフする。そのテンプレート鎖のこのコピーは、その５’テール配列に相補的な領域を含むので、その第２のサンプルインデックス領域およびシーケンシングアダプター領域を含むさらなるプライマーは、シーケンシングの準備のできたボトム鎖を生成するために、この配列をプライムオフする。

実施例３：分析用の無細胞核酸サンプルの調製
繋留化多重ＰＣＲ（ＡＭＰ）法
繋留化多重ＰＣＲ法は、その目的の領域を増幅するために、一方向の遺伝子特異的プライマーおよび共通アダプター配列プライマーで行われる。そのＰＣＲ生成物は、必要に応じて、可逆的固相固定（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＰＲＩ）を使用して精製される。あるいは、第１の増幅後のＰＣＲ生成物の少しの部分が、ネスト化ＰＣＲに直接添加される。そのネスト化ＰＣＲは、第２のプライマーセットで行われる。そのＰＣＲ生成物は再び、次世代シーケンシングにおける
使用のためにＳＰＲＩを使用して精製される（図９）。

超低頻度アレルバリアントの感度
バリアント検出感度は、インターロゲーションの深度およびシグナル対ノイズ比の関数である。図１０は、９５％感度で検出可能な最低ＡＦを示す。これらの実験では、その検出閾値を、誤ってコールされる塩基の予測数＋３標準偏差として設定した。エラー較正および特有の分子の同定は、低ＡＦバリアント検出に必要不可欠である。図１１は、サンプリング深度０～１０，０００の間でのエラー率において最初の低下を示し、シーケンシングエラー率の制限を図示する。

フラグメント化した物質
多重ポリメラーゼ連鎖反応アッセイＡＭＰを使用すると、一塩基バリアント、挿入／欠失、コピー数変化、および再編成の検出が可能である（図１２、左パネル、図１３、左パネル）。この方法を使用すると、そのアッセイは、市販の試薬、特注のプライマー、および標準的ライブラリー調製機器を使用して１チューブまたは２チューブ形式において、少量のＲＮＡまたはＤＮＡで行われ得る。

アンプリコンシーケンシングは、特定のゲノム領域における遺伝的バリエーションを分析するための標的化されたアプローチである（図１２、右パネル）。アンプリコンのシーケンシングは、バリアント同定および特徴付けを可能にする。この方法を使用すると、ｃｆＤＮＡおよび他のＤＮＡフラグメントは、等しく増幅可能であり、それらを増幅後に区別不能にする（図１３、右パネル）。さらに、バックグラウンドシグナルが増大し、同じバリアントを見出すためにより大きなシーケンシング頻度を必要とする。

物質の分析
キャピラリー電気泳動は、血液から腎障壁を通って尿へと通過したｃｆＤＮＡを分析するために使用され得る。そのＡＭＰ法を使用して、ｃｆＤＮＡは、再発性膀胱がんを有する患者（図１４、上パネル）においてがんのない患者（図１４、下パネル）より高いレベルで示される。

その特有のカバレッジ深度は、腫瘍を有する個体から抽出したＤＮＡの少なくとも２倍まで示される（図１５）。

最低化した捕捉
アダプター核酸ライゲーションの最適化は、クラウディング剤の添加を含め、既存のプロトコルに対するいくつかの改変を生じた。これは、ライゲーション効率を大いに改善した（図１６）。ゲルクロマトグラフィーによって可視化された結果と一致して、その最適化したライゲーションプロトコルは、有意により高いカバレッジを生じた（図１７）。

標的化された遺伝子座での深度
先の実験は、Ｈｏｒｉｚｏｎ ｃｆＤＮＡ物質を使用した。これは、野生型ｃｆＤＮＡアッセイおよびプラットフォームの感度、特異性、および精度を比較するためにコントロールとして、リキッドバイオプシーを使用して抽出される。この場合には、そのＤＮＡ ＱＣアッセイは、５０％未満のＤＮＡ質量が１１５ｂｐアンプリコンにおいて増幅可能であることを明らかにした（図１８）。

最新の実験は、ＰＣＲ均質性に対する改善に焦点を当てている。その目標は、ビン深度を緩和することである。なぜならシーケンシング深度のＲＯＩ曲線は、ビン深度均質性が複雑性を妨げることを示唆するからである（図１９）。

Ｔ細胞およびＢ細胞レセプター
Ｔ細胞レセプターの定常領域に対する、ならびに免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域に対するｍＲＮＡ特異的プライマーをデザインしようとした（図２０、左パネル）。Ｖ－Ｄ－Ｊ再編成後のＴＣＲβまたはＩＧＨ鎖の可変性領域をコードする遺伝子座の包括的構造は、４つのフレームワーク（ＦＲ１～ＦＲ４）および３つの相補性決定（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）領域をコードする間隔、そのＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントによって与えられる部分、ならびにＶ－Ｄ接合部およびＤ－Ｊ接合部において挿入された「Ｎ」ヌクレオチドを図示する。ＦＲ１～ＦＲ３、ＣＤＲ１、およびＣＤＲ２の最大長、ならびにＣＤＲ３の形式上の長さ（塩基対（ｂｐ）およびアミノ酸（ａａ）単位）は、図２０，右パネルの上の数字によって示される。ブロック構造の下の左向き矢印は、最新のディープシーケンシングプロトコルに代表的な、Ｊ遺伝子セグメントの５’領域にアニールするシーケンシングプライマーによって開始される示された長さ（６５ｂｐ、１３０ｂｐ、または≧４００ｂｐ）のリードでシーケンシングされる遺伝子座の近い画分を示す。図面の下のスケールバーは、塩基対単位で遺伝子座の長さを示す。

ＴＣＲＢに由来するリードのマッピングから生成される代表的なＡＭＰデータがここで示される。結果は、数千のＲＮＡに由来するリードおよびいくつかのＤＮＡに由来するリードを示す。そのＤＮＡリードは、プライマー機能性のコントロールとして、低複雑性サンプルを示す。ＲＮＡリードは、Ｊセグメントにとんだリードとして、エキソンの５’末端上でソフトクリップされる（図２１）。また、ＴＣＲＡに由来するＶセグメントおよびＪセグメントによって補助された、更新されたｈｇ１９免疫遺伝子座註釈がここで示される（図２２）。

ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）情報システムを使用して、シーケンシングされた物質の全てのヌクレオチド、タンパク質、遺伝的、および構造的免疫遺伝データへのアクセスが可能である。ここで示される結果は、末梢血白血球におけるＢ細胞レセプターＶセグメント使用が、ＩＭＧＴにおいて報告されたセグメント使用と密接に相関することを決定した（図２３）。

ここで示される方法を使用して、ＴＲＢアッセイはまた、反復Ｒ２におけるアウトライアーを除いて、定量的クローン追跡を可能にすることが示された（図２４および表１）。

ＴＲＢクローンを検討した場合、結果は、予測頻度を超えてＪｕｒｋａｔ頻度における急上昇（ｓｐｉｋｅ）を示した（図２５）。その５つの最も頻度の高い非Ｊｕｒｋａｔクローンと、そのＪｕｒｋａｔクローンとを比較した場合、その非Ｊｕｒｋａｔクローンが
、サンプルにわたってそれらの相対的頻度順序を保持することが報告された（図２６）。

実施例４：ｃｆＤＮＡ評価
ｃｆＤＮＡのさらなる評価を行った。図２７は、分子バーコードがＰＣＲに由来するエラーおよびシーケンシングに由来するエラーの両方を較正することを図示する。図２８は、ｃｆＤＮＡフラグメント長の微小流体電気泳動分析を示す。３５ｂｐ～１０．４ｋｂの間のＤＮＡサイズ分布を、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡチップを使用して測定した。サンプルを、クロマトグラフィーの前に（時点１）および最初のクロマトグラフィーサイクルの後（時点２）に得た。時点２で患者１および２から得たサンプルは、これらのサンプル中のｃｆＤＮＡの供給源としての壊死と一致して、サイズ範囲２００ｂｐ～１０．４ｋｂを有する実質的により大きなＤＮＡフラグメント（矢印）を含んだ。ここで、ｃｆＤＮＡは、フラグメント化ｇＤＮＡから構成される。がん細胞は、アポトーシスまたは壊死を受ける；小さなｃｆＤＮＡフラグメントは、アポトーシスに由来する一方で、大きなフラグメント（図２８）は、壊死細胞に由来する。

図２９は、Ａｍｐｌｉｓｅｑと比較して、ＡＭＰの利点を示す。ｃｆＤＮＡは、ＡＭＰを使用して１００％捕捉可能であるが、それは、Ａｍｐｌｉｓｅｑによっては１１％捕捉可能であるに過ぎない。図３０は、アッセイ投入物が感度に影響を及ぼすことを示す。３３０ゲノム／ｎｇの理論的感度および１００％効率の想定は、以下を生じる：

図３１は、変動するｃｆＤＮＡ投入物量にわたるカバレッジ比較を図示する。図３２は、投入物が複雑性および感度を決めることを示すグラフである。図３３は、１００ｎｇの合成ｃｆＤＮＡ投入物の高カバレッジおよび再現性を示すグラフである。合計でおよそ４００万個のリードは、３．４ｋｂ超であった。図３４は、１００ｎｇ 合成ｃｆＤＮＡサンプルを使用するパネルアッセイの結果を示す。図３５は、ＡＦ＝０．１％に低下した非常に定量的なバリアント検出を示す４つのグラフである。そのグラフは、代表的バリアントを示し、エラー較正されていない。図３６は、エラー較正がＡＦ＝０．５％（上）およびＡＦ＝０．１％（下）でのバリアント同定を大きく高めることを示す。図３７は、カバレッジ比較を示す。投入物質量は、カバレッジ深度と強く相関し、高投入物は、０．１％
アレル画分に低下した検出を可能にする：

図３８は、ｃｔＤＮＡパネルが低い（４ｎｇ）投入物量で４００倍超のカバレッジを生じることを示す。図３９は、４ｎｇの１％ ＡＦ Ｈｏｒｉｚｏｎ ｃｆＤＮＡからのバリアントコーリングを示す。図４０は、Ｈｏｒｉｚｏｎ ｃｆＤＮＡのサンプルバリアントコーリングデータを示す。Ｈｏｒｉｚｏｎ １％ ＡＦサンプルの生データは、以下に示される：

均等物
いくつかの発明の実施形態は、本明細書で記載および例証されてきたが、当業者は、その機能を行うならびに／または結果および／もしくは本明細書で記載される利点のうちの１つもしくはこれより多くを得るための、種々の他の手段および／または指示を容易に想定し得、このようなバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあると見做される。より一般には、当業者は、本明細書で記載される全てのパラメーター、寸法、物質、および構成が、例示的であることが意味され、その実際のパラメーター、寸法、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に依存することを容易に認識する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使
用して、本明細書で記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確認し得る。従って、前述の実施形態が例示によって提示されるに過ぎず、そして添付の請求項およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が具体的に記載されかつ請求項に記載されるとおりのもの以外の方法で実施され得ることは、理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書で記載される各個々の特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法に関する。さらに、２つまたはこれより多くのこのような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、このような特徴、システム、物品、物質、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。

全ての定義（本明細書で定義され使用されるとおり）は、辞書の定義、参考として援用される文書中の定義、および／またはその定義された用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。

本明細書で開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される、いくつかの場合には、その文書の全体を包含し得る主題に関して参考として援用される。

不定冠詞「１つの、ある（ａ）」および「１つの、ある（ａｎ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そうでないことが明確に示されなければ、「少なくとも１」を意味することが理解されるべきである。

語句「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、そのように結合された要素のうちの「いずれかまたは両方（ｅｉｔｈｅｒ ｏｒ ｂｏｔｈ）」、すなわち、いくつかの場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味することが理解されるべきである。「および／または」とともに列挙される多数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合されたその要素のうちの「１またはこれより多く」と解釈されるべきである。他の要素は、必要に応じて、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、その「および／または」節によって具体的に識別される要素以外に存在し得る。従って、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような制約のない文言とともに使用される場合、一実施形態において、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態において、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態においてＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）；などを言及し得る。

本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義されるとおりの「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストの中で項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多くの要素または要素のリストのうちの少なくとも１（しかし１より多くを含む）、そして必要に応じて、さらなる列挙されない項目をも包含すると解釈されるものとする。そうでないことが明確に示される用語のみ、例えば、「のうちの１のみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」もしくは「のうちの正確に１（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または請求項において使用される場合に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、多くの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含に言及する。一般に、用語「または」は、本明細書で使用される場合、排他的な用語（例えば、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「のうちの１（ｏｎｅ ｏｆ）」、「のうちの１のみ」、または「のうちの正確に１」が先行する時に排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない（ｏｎｅ ｏｒ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｏｔｈ）」を示すと解釈されるに過ぎないものとする。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、特許請求の範囲に
おいて使用される場合、特許法の分野で使用されるとおりのその通常の意味を有するものとする。

本明細書においておよび特許請求の範囲においてここに使用される場合、１つまたはこれより多くの要素のリストへの言及において語句「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）とは、要素のリスト中にある要素のうちのいずれか１つまたはこれより多くから選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙される各要素およびあらゆる要素のうちの少なくとも１を必ずしも含むわけではなく、要素のリスト中にある要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、具体的に識別されるそれら要素に関連しようが関連しまいが、要素のリスト（これに対して文言「少なくとも１」が指す）内で具体的に識別される要素以外の要素が必要に応じて存在し得ることを可能にする。従って、非限定的な例としては、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一方（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）」（または、等しくは、「ＡまたはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ Ａ ｏｒ Ｂ）」、または、等しくは、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一方（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ Ａ ａｎｄ／ｏｒ Ｂ）」は、一実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）ＡであってＢは存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）に；別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂであって、Ａは存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ａ、および少なくとも１つの（必要に応じて、１つより多くのを含む）Ｂ（および必要に応じて、他の要素を含む）；などを指し得る。

そうでないと明らかに示されなければ、１より多くの工程または行為を含む本明細書で請求項に記載される任意の方法において、その方法の工程または行為の順序は、その方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことはまた、理解されるべきである。

請求項において、上記の明細書においても同様に、全ての移行句（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などは、制約がないこと、すなわち、が挙げられるが、これらに限定されないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみが、米国特許審査基準２１１１．０３節に示されるように、それぞれ、制約のあるまたは半制約の移行句であるものとする。制限のない移行句（例えば、「含む、包含する」）を使用するこの文書中で記載される実施形態が、代替の実施形態において、その制限のない移行句によって記載される「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の特徴としても企図されることは、認識されるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ａｎｄ Ｂ）」を記載する場合、本開示はまた、代替の実施形態、「ＡおよびＢからなる組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）」を企図する。

Claims (35)

1. 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
   （ａ）１またはこれより多くのヌクレオチドを、標的ヌクレオチド配列を含む２本鎖核酸の３’末端に付加する工程であって、ここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１個は、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドであり、該捕捉部分は、結合パートナーと選択的に相互作用する部分であり、そして該２本鎖核酸は、無細胞ＤＮＡから得られる工程；
   （ｂ）アダプター核酸を、該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドが付加された該２本鎖核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該アダプター核酸の３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列は、工程（ａ）における該２本鎖核酸の３’末端に付加された該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；ならびに
   （ｃ）該ライゲーション生成物と該捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの該捕捉部分の該結合パートナーとを接触させることによって、該ライゲーション生成物を捕捉する工程を包含する方法。
2. （ｄ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって該ライゲーション生成物を増幅する工程、
   をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. （ｅ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって工程（ｄ）の増幅生成物を増幅する工程、
   をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
4. 前記第２の標的特異的プライマーは、前記第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される、請求項３に記載の方法。
5. 前記第２の標的特異的プライマーは、前記標的ヌクレオチド配列にアニールしない５’テールを含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記第２の標的特異的プライマーの５’テールと同一である３’部分を含むさらなるプライマーを添加する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
7. 工程（ｂ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、二重鎖部分およびオーバーハング配列を含み、ここで該オーバーハング配列は、工程（ａ）における前記２本鎖核酸の３’末端に付加された前記１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的な、該アダプター核酸の前記３’末端における１またはこれより多くのヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の方法。
8. 工程（ｂ）は、前記アダプター核酸、前記２本鎖核酸、およびリガーゼを、該リガーゼが該アダプター核酸を該２本鎖核酸にライゲーションする条件下で合わせる工程を包含し、ここで該２本鎖核酸と合わせられる該アダプター核酸は、１本鎖である、請求項１に記載の方法。
9. 前記捕捉部分は、ビオチン部分である、請求項１に記載の方法。
10. 前記ビオチン部分は、長さが５～２０個の原子のリンカーを介して前記ヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項９に記載の方法。
11. 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記捕捉部分は、５位、６位、７位または８位において、前記アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記アデニン核塩基またはその誘導体の７位は、炭素原子である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項１に記載の方法。
16. 前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、請求項１５に記載の方法。
17. 工程（ａ）において、１個のヌクレオチドが、前記標的ヌクレオチド配列を含む前記２本鎖核酸の前記３’末端に付加される、請求項１に記載の方法。
18. 工程（ａ）の後でかつ工程（ｂ）の前に洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
19. 工程（ａ）の前に、前記２本鎖核酸を５’リン酸化する工程をさらに包含する、請求項１項に記載の方法。
20. 工程（ｂ）において、前記２本鎖核酸は、クラウディング剤の存在下で前記アダプター核酸にライゲーションされる、請求項１に記載の方法。
21. 前記クラウディング剤は、（ｂ）におけるライゲーション混合物の５％～５０％に相当する量のポリエチレングリコールである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記標的ヌクレオチド配列は、Ｔ細胞レセプター定常領域または免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖の定常領域に相当する配列内に存在する、請求項１に記載の方法。
23. 分析用の核酸を調製する方法であって、該方法は、
    （ａ）テンプレートとして無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）調製物を使用するランダムにプライムした第１鎖合成反応およびテンプレートとして該ランダムにプライムした第１鎖合成反応の生成物を使用する第２鎖合成反応を行うことによって、ｃＤＮＡを調製する工程であって、ここで該ｃｆＲＮＡ調製物は、標的ヌクレオチド配列を含む工程；
    （ｂ）該ｃＤＮＡを末端修復して、該標的ヌクレオチド配列を含む平滑末端化した２本鎖核酸を生成する工程；
    （ｃ）該平滑末端化した２本鎖核酸を洗浄する工程；
    （ｄ）１またはこれより多くのヌクレオチドを工程（ｃ）において洗浄した該核酸の３’末端に付加する工程であって、ここで該１またはこれより多くのヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、捕捉部分で修飾されたヌクレオチドであり、該捕捉部分は、結合パートナーと選択的に相互作用する部分である、工程；
    （ｅ）工程（ｄ）において生成した該核酸を洗浄する工程；
    （ｆ）ライゲーション可能な二重鎖部分およびオーバーハング配列を含むアダプター核酸を、工程（ｅ）において洗浄した該核酸にライゲーションして、ライゲーション生成物を生成する工程であって、ここで該オーバーハング配列は、工程（ｄ）において付加された該１またはこれより多くのヌクレオチドと相補的である工程；
    （ｇ）該標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする第１の標的特異的プライマーおよび該アダプター核酸の相補的配列に特異的にアニールする第１のアダプタープライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、該ライゲーション生成物を増幅する工程；
    （ｈ）第２のアダプタープライマーおよび第２の標的特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、工程（ｇ）の増幅生成物を増幅する工程であって、ここで該第２の標的特異的プライマーは、該第１の標的特異的プライマーに対してネスト化される工程；ならびに
    （ｉ）該工程（ｈ）の増幅生成物を洗浄する工程、
    を包含する方法。
24. 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、およびシトシン、またはこれらの誘導体からなる群より選択される核塩基を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドは、アデニン核塩基またはその誘導体を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記捕捉部分は、５位、６位、７位または８位において、該アデニン核塩基またはその誘導体に共有結合的に連結される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記アデニン核塩基またはその誘導体の７位は、炭素原子である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記捕捉部分は、ビオチン部分である、請求項２３に記載の方法。
29. 前記ビオチン部分は、長さが５～２０個の原子のリンカーを介して前記ヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記方法は、工程（ｆ）の後でかつ工程（ｇ）の前に、前記捕捉部分で修飾されたヌクレオチドの捕捉部分の固定化した前記結合パートナーを使用して前記ライゲーション生成物を捕捉する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。
31. 前記結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ストレプトアビジンは、常磁性ビーズに付着される、請求項３１に記載の方法。
33. 前記捕捉したライゲーション生成物を精製する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
34. 前記洗浄する工程は、可逆的固相固定化技術を使用して行われる、請求項２３に記載の方法。
35. 前記第２のアダプタープライマーは、前記第１のアダプタープライマーに対してネスト化される、請求項２３に記載の方法。

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