JP7096482B2 - 感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段 - Google Patents

Description

本発明は、不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬の劣化防止手段に関する発明である。本発明に依ると、感作された不溶性担体粒子に関して、凍結・融解のプロセスに伴う不溶性担体粒子同士の非特異的な凝集による液状態様試薬の劣化を防止することができる。代表的な不溶性担体粒子として、ラテックス粒子がある。

現在、ラテックス粒子等の不溶性担体粒子を用いる免疫測定試薬は、種々の臨床検査項目において用いられている。

例えば、ラテックス凝集法を用いる免疫測定試薬では、液相中において抗原又は抗体を感作させたラテックス、あるいは、未感作のラテックスを用い、抗体又は抗原を検出する測定系を形成する。免疫複合体の形成によりラテックス粒子が凝集する性質に基づき、凝集の程度を目視により確認するか、濁度の増加を吸光度又は散乱光強度の光学的な変化として測定を行うことができる。

ラテックス凝集法は、操作が簡便であり、自動分析装置にも比較的容易に適用でき、現在盛んに用いられている検査方式の一つである。

ラテックス粒子等の不溶性担体粒子を用いる免疫測定試薬は、販売時には凍結乾燥状態であったとしても、用時には不溶性担体粒子の分散液として用いられる。従って、予め分散液の態様であることが現場での取扱いの簡便性の観点から好適である。

ＷＯ２０１４／１３２８３３ 国際公開パンフレット

上記の分散液の態様のラテックス粒子等の不溶性担体粒子液を用いる免疫測定試薬（以下、液状態様試薬ともいう）は、２－８℃の適切な冷蔵環境で保存され、通常、凍結劣化は起こり難い。しかしながら、輸送時や温度制御が不十分な冷蔵設備では、過冷却や局所冷却により液状態様試薬の全部又は一部が凍結し、それが融解する際に不溶性担体粒子同士が非特異的に凝集してしまうことが問題となっている。このような非特異的な凝集が起こると試薬の反応性が変わってしまい、肝心な測定値の正確性が損なわれ、誤った診断結果に繋がることになり好ましくない。

液状態様試薬における凍結劣化の防止対策として、一般的にはグリセリンやエチレングリコール等の不凍アルコール、トレハロース等の糖類の添加が行われていたが、いずれも効果は不十分であった。近年では、ベタイン（トリメチルグリシン：以下、用語としてベタインを用いる）を５－３０質量％添加することで、効果的に未感作ラテックス試薬における凍結劣化を防止する方法が報告されている（特許文献１）。感作ラテックス試薬は、ラテックス粒子の表面に付着している抗原又は抗体により一様な表面性状をしておらず、また表面の荷電状態も不均一な為、未感作ラテックス試薬に比べて凍結劣化の防止が難しいと推測される。

本発明者らは、感作されたラテックス粒子等の不溶性担体粒子に対するベタインの上記の劣化防止性能について検討を行った。その結果、驚くべきことに、従来知られている未感作のラテックス粒子のみならず、感作された上記不溶性担体粒子に関しても優れた劣化防止性能を、しかも比較的低濃度のベタインの使用であっても実現可能であることを見出した。

本発明では、第１に、溶媒中に、感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬において、試薬の０．１－３０質量％のベタイン（トリメチルグリシン）を含有することを特徴とする、免疫測定試薬（以下、本発明の免疫測定試薬ともいう）を提供する。

第２に、感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中に、試薬の０．１－３０質量％のベタインを共存させることにより、当該不溶性担体粒子の非特異的な凝集を防止する、免疫測定試薬の劣化防止方法（以下、本発明の劣化防止方法ともいう）を提供する。

なお、本発明において「感作」とは、不溶性担体粒子において抗原又は抗体を付着させる行為又は付着された状態であり、「担持」と同意義である。

上記本発明の免疫測定試薬と、本発明の劣化防止方法についての概要を説明する。

不溶性担体粒子は、免疫測定試薬として用いることが可能であれば限定されず、例えば、ラテックス粒子、シリカ粒子、金コロイド粒子等の無機粒子；ゼラチン粒子、赤血球等が挙げられる。これらの中でも、ラテックス粒子が特に代表的な不溶性担体粒子である。

ラテックスは、ポリマーエマルジョンとも呼ばれ、ポリマーが水等の水性溶媒に分散したものであり、当該水性溶媒が連続相となり、真球又は球に近い形のポリマー粒子が不連続相としてなるものである。ラテックス粒子とは、このラテックスの不連続相をなすポリマー粒子のことである。本明細書では、ラテックス粒子を含む総体的な表現として「ラテックス」を用いる場合もある。

ラテックスの種類は、上記のように免疫測定試薬として用いることができるものであれば限定されない。例えば、ポリスチレンラテックス、極低カルボン酸変性ラテックス、親水基局在化ラテックス等の物理吸着用ラテックス；カルボン酸変性ラテックス、アミノ変性ラテックス、ヒドロキシ変性ラテックス、グリシジル変性ラテックス、アルデヒド変性ラテックス、アミド変性ラテックス等の化学結合用ラテックス；各種の着色ラテックス；高比重ポリスチレンラテックス等の血液凝集反応用ラテックス；磁性ラテックス等が挙げられる。

上記のように、感作された不溶性担体粒子とは、不溶性担体粒子表面に何らかの物質が感作されている不溶性担体粒子であり、具体的には、免疫測定に必要な抗原抗体反応を惹起するための、抗体又は抗原が感作されている不溶性担体粒子である。当該抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、さらに、所望する抗原との抗原抗体反応を惹起することができる限り、免疫グロブリン分子の全部であっても、一部であってもよい。当該抗原は、所望する抗体と、抗原抗体反応により結合するものであれば特に限定されない。未感作の不溶性担体粒子とは、このような抗体又は抗原が感作されていない不溶性担体粒子である。

水性溶媒は、水を主体とする溶媒であり、水、あるいは各種の緩衝液等が挙げられる。ベタインは、常法により合成可能であり、市販品を用いることも可能である。免疫測定試薬の態様は、感作された不溶性担体粒子を用いており、かつ、免疫測定時以外の当該粒子の凝集が免疫測定値に悪影響を与えるものである限り、特に限定されないが、不溶性担体粒子の凝集を抗原抗体反応の指標とする「凝集法」であることが好適である。凝集法としては、スライドテスト法、光学測定法、マイクロタイター法、フィルター分離法等が挙げられる。凝集法以外の手法としては、サンドイッチ法、イムノクロマト法、ウエスタンブロット法等が挙げられる。免疫測定の標識も、ラジオアイソトープ、蛍光物質、着色物質、発色酵素、ビオチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明により、免疫測定試薬において用いられるラテックス等の感作された不溶性担体粒子液の凍結・融解に伴う非特異的な凝集による当該試薬の劣化手段が、「免疫測定試薬」と「免疫測定試薬の劣化防止方法」として提供される。本発明の劣化防止成分であるベタインは、不溶性担体粒子が未感作である場合でも、比較的少量の配合であっても、不溶性担体粒子の凍結・融解に伴う非特異的な凝集を防止して、免疫測定試薬の劣化を防止することが可能である。

凍結・融解の回数（０，１，３，６，１０回）に対する感作ラテックス試薬における非特異的なラテックス粒子の凝集を、「添加剤無し」（ａ）、及び、「ベタイン添加」（ｂは、０．１質量％ベタイン、ｃは、０．３質量％ベタイン、ｄは、１質量％ベタイン）として検討した結果を示す図面である。 上記図１－１の続きとして、図中ｅは、３質量％ベタイン、ｆは、５質量％ベタイン、ｇは、７質量％ベタイン、ｈは、１０質量％ベタインの場合である。 上記図１－１の続きとして、図中iは、１５質量％ベタイン、ｊは、２０質量％ベタイン、ｋは、２５質量％ベタイン、ｌは、３０質量％ベタインの場合である。

［免疫測定試薬］
本発明の免疫測定試薬における劣化防止成分は、上述のようにベタイン（トリメチルグリシン）であり、劣化防止の対象となる不溶性担体粒子は、「感作された不溶性担体粒子」である。

試薬中のベタインの濃度の下限は試薬の０．１質量％であり、好ましくは同１質量％であり、さらに好ましくは同３質量％であり、最も好ましくは同５質量％である。ベタインを試薬の０．１質量％とすることにより劣化防止効果が認められ、同１質量％、３質量％、５質量％と、試薬中のベタイン量を増加させるにつれて、用量依存的にベタインによる劣化防止効果を向上させることができる。

試薬中のベタイン濃度の上限は、特に限定されず、試薬の３０質量％であっても、試薬においてベタインによる劣化防止効果が発揮されるが、好ましくは試薬の２０質量％であり、さらに好ましくは同１５質量％であり、最も好ましくは同１０質量％である。ベタイン量が試薬の１０質量％を超えても、ベタイン量の増加に見合った劣化防止効果の向上は認められず、却ってベタイン量の増加に従って反応性の低下傾向が認められる。

従って、試薬中のベタイン濃度は、試薬の０．１－３０質量％であり、さらに配合下限を引き上げて、同１－３０質量％、３－３０質量％、５－３０質量％と、これらの配合下限量の増加につれてより好ましいものとなる。さらに試薬中のベタイン濃度の上限を好適量である試薬の２０質量％、すなわち同０．１－２０質量％とすることが好ましく、配合下限を引き上げて、同１－２０質量％、３－２０質量％、５－２０質量％と、これらの配合下限量の増加につれて、より好ましいものとなる。さらに試薬中のベタイン濃度の上限をさらなる好適量である試薬の１５質量％、すなわち同０．１－１５質量％とすることが好ましく、配合下限を引き上げて、同１－１５質量％、３－１５質量％、５－１５質量％と、これらの配合下限量の増加につれてより好ましいものとなる。さらに試薬中のベタイン濃度の上限を最適上限量である試薬の１０質量％、すなわち同０．１－１０質量％とすることが好ましく、配合下限を引き上げて、同１－１０質量％、３－１０質量％、５－１０質量％と、これらの配合下限量の増加につれてより好ましいものとなる。劣化防止効果の十分な発揮、反応性の確認、及びコストの抑制、を勘案した、試薬中のベタイン濃度の最適範囲は、試薬の５－１０質量％である。

本発明の免疫測定試薬の水性溶媒としては、上記のように水又は各種の緩衝液が挙げられ、当該緩衝液としては、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＢＳＡ、アラビアゴム、界面活性剤、コリン、キレート剤、防腐剤等の添加剤も、本発明の効果を実質的に損なわない質的、量的な限度で添加を行うことができる。当該水性溶媒のｐＨは抗原抗体反応に支障が無い範囲、具体的には４－９程度が好ましく、特に好ましくは６－９程度である。

不溶性担体粒子の平均粒子径は、免疫測定試薬に用いることができる限り特に限定されない。例えば、ラテックス粒子であれば、概ね０．０１－１μｍの平均粒子径から広く粒子径を選択することが可能である。

試薬中の「感作された不溶性担体粒子」の含有量は、当該不溶性担体粒子を含有する免疫測定用試薬の態様、例えば、不溶性担体粒子自体の種類、試薬の企画、等に応じて自由に選択することができる。

「感作された不溶性担体粒子」は、感作された抗原又は抗体の結合方式、例えば、ラテックス粒子であれば、物理吸着又は化学結合はいずれであってもよい。また、感作抗原は、標的の体内抗体に応じて自由に選択することが可能である。例えば、梅毒抗原、ストレプトリジンＯ等が感作抗原として挙げられるが、全くこれらには限定されない。感作抗体は、捕捉する標的抗原に応じて自由に選択することができる。さらに、感作抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、グロブリン分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのクラスであってもよく、サブクラスも限定されず、さらにこれらのグロブリン分子の全部であっても一部のみの断片であってもよい。

［劣化防止方法］
本発明の劣化防止方法における、感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中における、上記のベタインの共存は、免疫測定試薬を作成する工程のいずれかの段階で、ベタインを試薬中に添加することにより行うことができる。このベタインの添加は、感作された不溶性担体粒子の添加に先立っていても、その後であってもよい。

試薬に対するベタインの添加量の下限は試薬の０．１質量％であり、好ましくは同１質量％であり、さらに好ましくは同３質量％であり、最も好ましくは同５質量％である。ベタインを試薬の０．１質量％添加することにより劣化防止効果が認められ、同１質量％、３質量％、５質量％と、試薬へのベタイン添加量を増加させるにつれて、用量依存的にベタインによる劣化防止効果を向上させることができる。

試薬に対するベタインの添加量の上限は、特に限定されず、試薬の３０質量％であっても、試薬においてベタインによる劣化防止効果が発揮されるが、好ましくは試薬の２０質量％であり、さらに好ましくは同１５質量％であり、最も好ましくは同１０質量％である。ベタイン添加量が試薬の１０質量％を超えても、ベタイン量の増加に見合った劣化防止効果の向上は認められず、却ってベタイン添加量の増加に従って反応性の低下傾向が認められる。

従って、試薬へのベタインの添加量は、試薬の０．１－３０質量％であり、さらに添加量の下限を引き上げて、同１－３０質量％、３－３０質量％、５－３０質量％と、添加下限量の増加につれてより好ましいものとなる。さらに試薬へのベタイン添加量の上限を好適量である試薬の２０質量％、すなわち同０．１－２０質量％とすることが好ましく、添加量の下限を引き上げて、同１－２０質量％、３－２０質量％、５－２０質量％と、添加下限量の増加につれて、より好ましいものとなる。さらに試薬へのベタイン添加量の上限をさらなる好適量である試薬の１５質量％、すなわち同０．１－１５質量％とすることが好ましく、添加量の下限を引き上げて、同１－１５質量％、３－１５質量％、５－１５質量％と、添加下限量の増加につれてより好ましいものとなる。さらに試薬へのベタインの添加量の上限を最適上限量である試薬の１０質量％、すなわち同０．１－１０質量％とすることが好ましく、試薬の添加量の下限を引き上げて、同１－１０質量％、３－１０質量％、５－１０質量％と、これらの添加下限量の増加につれてより好ましいものとなる。劣化防止効果の十分な発揮、反応性の確認、及びコストの抑制、を勘案した、試薬へのベタイン添加量の最適範囲は、試薬の５－１０質量％である。

本発明の劣化防止方法が施された免疫測定試薬では、凍結・融解のプロセスにおける感作された不溶性担体粒子の不特異吸着が抑止され、これにより当該免疫測定試薬の劣化防止を行うことができる。

このようにして作成される免疫測定試薬が、本発明の免疫測定試薬である。

以下、本発明の具体例としての実施例を記載する。なお、「％」は特に断らない限り、配合対象に対する質量％である。

［実施例１］ 感作ラテックスにおける検討
＜第１試薬（検体希釈液）の調製＞
５０ｍＭグリシンを含む緩衝液に、０．１５ｍｏｌ／ｍＬとなるように塩化ナトリウムを添加し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを９．０となるように、検体希釈液を調製した。

＜第２試薬（抗体感作ラテックス分散液）の調製＞
５０ｍＭホウ酸緩衝液２０ｍＬに、抗ヒトＬｐ（ａ）ヤギポリクローナル抗体（トリナバイオリアクティブス社製）を１００ｍｇ添加して、さらに未感作のポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径０．１２μｍ：藤倉化成社製）の１０％ラテックス分散液を１２．５ｍＬ混合し、超音波装置ＶＣＸ７５０（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＩＮＣ．）を用いて、氷冷下で超音波処理を１分間行った。その後、５％ＢＳＡ水溶液を７ｍＬ添加し、５０℃で３０分間攪拌した。その後、２００００Ｇで２０分間遠心し、上澄みを除いた後、１０ｍｍｏｌ／ｍＬ ＨＥＰＥＳと共に、（１）ベタイン未添加（比較例）、（２）ベタイン（比較例：和光純薬工業社製）を、０．１％、０．３％、１％、３％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％添加し、それぞれの系に上記感作のポリスチレンラテックス粒子（平均粒子径０．１２μｍ：藤倉化成社製）を、０．３％となるように添加し、抗体感作ラテックス分散液８種類を調製した。

＜第１試薬と第２試薬を用いた凍結・融解による検量線の変動確認＞
第２試薬を、それぞれ０－１０回、上記の要領で凍結・融解を行い、凍結・融解回数による各試料の検量線を確認した。検量線は、Ｌｐ（ａ）値が０ｍｇ／ｄＬ、１５ｍｇ／ｄＬ、３０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬに調製された、精製Ｌｐ（ａ）を検体として用いて、当該検体量２．１μＬに対して第１試薬を２１０μＬ混合し、３７℃で５分間反応させた後、これに第２試薬を７０μＬ添加して、５分間における吸光度の変化量を測定することで行った。測定機器は、日立自動分析装置７１８０を用い、主波長６００ｎｍの２ポイントエンド法で行った。結果を図１［図１－１（ベタイン未添加、ベタイン０．１％、０．３％、１％添加）、図１－２（ベタイン３％、５％、７％、１０％添加）、及び、図１－３（ベタイン１５％、２０％、２５％、３０％添加）］に示す。図１－３のベタインの多量添加の結果を検討すると、いずれの添加条件でも凍結融解による反応性の変化は認められなかったが、ベタインの添加量に依存して反応性の低下が認められた。具体的には、ベタイン１０％添加に対して、１５％添加では１０－２５％程度の反応性の低下が認められ、３０％添加では２０－３０％程度の反応性の低下が認められた。

この結果より、ベタインを０．１－３０質量％添加することにより、感作ラテックス粒子の凍結・融解による非特異的な凝集を抑制できることが明らかになった。この非特異的な凝集の抑制に対する添加量は、反応性も勘案すると、ベタイン１－２０質量％添加において好ましく、３－１５質量％添加においてさらに好ましく、５－１０質量％において最も好ましかった。上記のようにベタインの添加量が１０質量％を超えても、添加量の増加に見合った効果の向上は期待できないことが明らかになり、ベタインの多量添加による反応性に対する抑制が認められた。

本発明の免疫測定試薬ないし本発明の劣化防止方法が施された免疫測定試薬は、液状態様試薬が凍結するような過酷な保存環境や輸送時の不安定な温度制御下であっても、ラテックス粒子等の不溶性担体粒子が感作された場合の非特異的な凝集が抑制され、検出性能を劣化させずに保存が可能となることにより、免疫測定試薬の保存や輸送の便宜に著しく貢献する。

Claims (3)

1. 感作された不溶性担体粒子を含有する免疫測定試薬中に、試薬の１－３０質量％のベタインを共存させることにより、当該不溶性担体粒子の凍結融解に伴う非特異的な凝集を防止する、免疫測定試薬の劣化防止方法。
2. 免疫測定試薬は、凝集法による免疫測定試薬である、請求項１に記載の劣化防止方法。
3. 不溶性担体粒子は、ラテックス粒子である、請求項１又は２に記載の劣化防止方法。

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