JPH0560757A

JPH0560757A - 抗原の定量法及び抗原定量用免疫試薬

Info

Publication number: JPH0560757A
Application number: JP22452191A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ito; 伊藤　　博; Hirosato Okazaki; 宏悟岡崎; Hiromi Iijima; 裕己飯嶋; Takeo Yamagata; 武夫山県; Mitsuo Yamaki; 光男山木
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Resonac Corp
Priority date: 1991-09-05
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1993-03-12

Abstract

(57)【要約】【目的】非特異的反応がなく、免疫反応による良好な
精度が得られる定量法及び該定量法に用いられる保存安
定性に優れた免疫試薬を提供する。【構成】測定しようとする抗原と免疫学的反応を生ず
る免疫グロブリンのＦ(ab')₂フラグメントを感作した不
溶性担体粒子を、前記免疫グロブリンのＦcフラグメン
トの存在下に、測定試料と反応させることを特徴とする
抗原の定量法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原の定量法及び該定
量法に用いる抗原定量用免疫試薬に関する。更に詳しく
は、不溶性担体粒子を用いた抗原抗体反応を利用し、抗
原を定量する方法及び免疫試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療分野において、免疫の診断の
ため、検体中の微量物質、特に抗体及び／又は抗原を迅
速、簡便にしかも精度よく定量することが非常に重要と
なってきた。このため抗体又は抗原などを不溶性担体粒
子に支持（感作）し、これと抗原又は抗体を反応させて
体液成分中の抗原又は抗体の存在を検査する、免疫血清
学的検査が広く利用されている。従来は、抗体又は抗原
が支持（感作）されたラテックス粒子（感作ラテック
ス）と検体とをガラス板上で混合し、検体中の抗原又は
抗体と抗原抗体反応を起こさせ、この凝集状態を肉眼で
観察することにより検体中の抗原又は抗体を半定量的に
測定する方法がとられていた。そこで、抗体又は抗原を
感作したラテックス粒子を使用し、ラテックスと検体中
の抗原又は抗体との反応凝集物を光学的に測定する方法
が提案されている（特公昭５８−１１５７５号公報、特
公昭６２−４３１３８号公報、特公昭６２−５５１０３
号公報等）。この方法により、最近では、専用の分析装
置を用いて抗原又は抗体を定量的に測定することも行わ
れるようになってきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし上記の方法は、
専用分析装置を用いるため高価となり、検体数の比較的
少ない免疫血清検査室等で使用するには不向きであっ
た。このため、一般の生化学分析装置に適応できる試薬
も最近研究されている。しかしながら、生化学検査用に
開発された自動分析装置への適応には種々の問題があ
る。例えば、通常の生化学項目と同時に測定するため、
セルや分注ノズル等からの試薬汚染（キャリーオバ）に
よって測定値が変動すること、光学的、電気的ノイズ及
び攪拌効率の影響を受けやすく測定精度が悪くなること
等の問題があった。

【０００４】また、ラテックス凝集法は迅速性及び簡便
性に優れた精度のよい方法であるが検体中の干渉物質に
起因する非特異反応が問題であった。この非特異的反応
は測定対象抗原と特異的に反応する免疫グロブリンのＦ
cフラグメントに起因することが多いため、このＦcフラ
グメントを除いたＦ(ab')₂フラグメントのみを抗体とし
て使用する方法も考案されている（特開昭５４−１１９
２９２号公報）。

【０００５】しかし、Ｆ(ab')₂フラグメントを用いる反
応であっても、まだ非特異的反応が存在すること及びＦ
(ab')₂フラグメントを用いたために保存安定性が悪くな
る等の問題点が明らかとなってきた。かくして、本発明
の目的は、非特異的反応がなく、免疫反応による良好な
精度が得られる定量法及び該定量法に用いられる保存安
定性に優れた免疫試薬を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、測定
しようとする抗原と免疫学的反応を生ずる免疫グロブリ
ンのＦ(ab')₂フラグメントを感作した不溶性担体粒子を
前記免疫グロブリンのＦcフラグメントの存在下に、測
定試料と反応させることを特徴とする抗原の定量法に関
する。また本発明は、測定しようとする抗原と免疫学的
反応を生ずる免疫グロブリンのＦ(ab')₂フラグメントを
感作した不溶性担体粒子と前記免疫グロブリンのＦcフ
ラグメントを含んでなる抗原定量用免疫試薬に関する。

【０００７】本発明において、不溶性担体粒子として
は、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体のよ
うな有機高分子のラテックス粒子が好ましいが、シリ
カ、アルミナのような無機酸化物等の不溶性担体粒子を
使用することもできる。その平均粒径は、0.05〜0.5μ
ｍの範囲が好ましい。不溶性担体粒子の粒径が大きすぎ
ると免疫学的反応前の試薬自体の光学的強度が高すぎて
測定が困難となりやすく、小さすぎると感度が低くなる
傾向にある。また、これらの不溶性担体粒子の媒体とし
ては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、
グッド緩衝液等を使用するのが好ましい。

【０００８】本発明において、不溶性担体粒子に感作す
る、測定しようとする抗原と免疫学的反応を生じる免疫
グロブリンのＦ(ab')₂フラグメントとしては、測定しよ
うとする抗原を免疫して得られるヤギ、ウサギ、ヒツジ
等の免疫グロブリンをペプシン等の酵素を用いて消化
し、Ｆ(ab')₂フラグメントとＦｃフラグメントに分離す
ることにより得られる。この分離操作は常法に従うこと
ができる。得られたＦ(ab')₂フラグメントを不溶性担体
粒子上に感作する方法としては、通常行われているよう
に、物理的に吸着させてもよいし、化学的に結合させて
もよいし、両者を併用してもよい。

【０００９】本発明において、反応系に添加されるＦc
フラグメントは、上記したように、測定しようとする抗
原と免疫学的反応を生じる免疫グロブリンのペプシン等
による消化反応においてＦ(ab')₂フラグメントを得ると
きに分解産物として、分離して得られる物が用いられ
る。ここで、このようなＦｃフラグメント以外の、例え
ば、正常血清のＦｃフラグメント等を用いたのでは、本
発明の良好な測定精度等の充分な効果は得られなかっ
た。使用されるＦcフラグメントの量は不溶性担体粒子
に感作したＦ(ab')₂フラグメント量の０．１重量％から
１００重量％の範囲が好ましい。添加されるＦcフラグ
メントの量が少なすぎると非特異反応を低減する効果及
び安定性に対する効果が不充分となり、この量が多すぎ
ると経済的効率が悪く好ましくない。

【００１０】ＦcフラグメントはＦ(ab')₂フラグメント
を不溶性担体粒子に感作し牛血清アルブミン等でブロッ
キングした後すぐに添加してもよいし、免疫学的反応の
直前に添加しても良いが、長く保存する場合には、保存
安定性が非常に良好な本発明の抗原定量用免疫試薬を得
るために、Ｆｃフラグメントをすぐに添加しておくのが
良い。感作された不溶性担体粒子は、免疫学的反応時ま
で媒体分散液（免疫試薬）として保持されるが、その際
は、媒体中に０．０１〜１．０重量％の濃度になるよう
に分散しておくのが保存の面で好ましく、一般的に使用
しやすい。またこの媒体中に適宜、牛血清アルブミン，
ＮａＣｌ等を溶解させてもよい。

【００１１】また、感作された不溶性担体粒子は、免疫
学的反応時には、媒体中に適宜の濃度で分散され使用さ
れるが、光学的強度測定の場合、その容易さから濃度が
０．５重量％以下になるようにして使用されるのが好ま
しく、感作量の点から０．００１重量％以上が好まし
い。この際には、前記媒体中、必要に応じて免疫グロブ
リンのＦcフラグメント、牛血清アルブミン、ＮａＣｌ
等を溶解した液（希釈液）を液量調整のために使用して
もよい。

【００１２】本発明において免疫学的反応における凝集
反応の反応性を調節するため、反応を抑制する物質や反
応を促進する物質が使用できる。使用される凝集反応を
抑制する物質としては、トリアルキルアミン、その塩
類、第４級アンモニウム塩及び糖類等が使用できる。ト
リアルキルアミンとしてはトリエチルアミン等、トリア
ルキルアミンの塩類としてはトリエチルアミンの塩酸塩
等、第４級アンモニウム塩としては塩化コリン、臭化コ
リン、塩化アセチルコリン、臭化アセチルコリン、塩酸
ベタイン等、糖類としてはショ糖等がある。これらの化
合物は一種又は二種以上使用される。

【００１３】凝集反応を抑制する物質は緩衝液に溶解し
不溶性担体粒子分散液と別に試料と混合しても良いし、
上記の不溶性担体粒子の分散液中に溶解させてもよい
し、分散液の液量調整用の希釈液中に溶解し使用時に分
散液と混合しても用いてもよい。また、感作した抗原又
は抗体と試料中の抗体又は抗原との反応性が低い場合に
は、このような凝集反応を抑制する物質を入れることな
く測定を行うことができる。緩衝液としては、リン酸緩
衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等
を使用するのが好ましい。また、この媒体中に適宜、牛
血清アルブミン、ＮａＣｌ等を溶解させてもよい。

【００１４】凝集反応を促進する物質としては、ポリエ
チレングリコ−ル等が用いられる。ポリエチレングリコ
−ルの平均分子量としては１，０００以上のものが好ま
しい。分子量が大きくなると凝集反応の促進効果が大き
くなるが、小さすぎると効果が小さい。ポリエチレング
リコ−ルは最終反応液中の濃度で０．１〜５．０重量％
の範囲で存在させるのが好ましい。ポリエチレングリコ
ールの濃度が高くなりすぎると感作された不溶性担体の
非特異的な凝集が起こりやすくなり、少なすぎると反応
促進の効果が小さい。凝集反応を促進する物質は緩衝液
中に溶解されるのが好ましい。

【００１５】本発明における抗原の定量は、抗原と抗体
の凝集反応による光学的強度の変化を求めることにより
行うのが好ましい。ここで、光学的強度とは、吸光度又
は散乱光強度を意味する。すなわち、反応混合物に光を
当て、反応により変化する透過光又は散乱光の値（変化
速度、一定時間あたりの変化量等を含む）を求めること
により定量することができる。測定する光の波長は、特
に制限されないが、感度、測定可能範囲等の面から４０
０〜１２００ｎｍが好ましい。これらの測定及び定量の
手順は、常法に従うことができる。

【００１６】

【実施例】次に、実施例によって、本発明を詳細に説明
する。以下、％は重量％を意味する。実施例１１）試薬の調製ａ）ラテックス液抗αーフェトプロテイン（ＡＦＰ）ヤギ抗体をペプシン
消化し、担体としてセファクリルＳ２００（ファルマシ
ア社製）を使用してゲル濾過を行ってＦｃフラグメント
を分離精製した後、残る分画は抗ヤギＦｃウサギ抗体を
リガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにか
けＦ(ab')₂フラグメントを精製した。得られたＦ(ab')₂
フラグメントを１．３mg/ml含有する０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５０、０.１５ＭＮａＣｌ含有）
と、平均粒径約０．２μｍのポリスチレンラテックス粒
子を０．５％分散した０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５０、０.１５ＭＮａＣｌ含有）を１：１で混合
し３７℃、２時間反応させ抗体を吸着した。１５，００
０r.p.m.で２０分遠心分離し上清を取り除いた後、沈澱
物を０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミ
ンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）
で再分散し、冷蔵庫で一晩保存することによりラテック
ス粒子の未吸着部分をブロッキングした。除去した上清
の吸光度からこの感作ラテックス粒子含有液には抗体が
０．２５mg/mlの割合で感作されていることを確認し
た。上記抗ＡＦＰヤギ抗体をペプシン消化して上記のよ
うに精製して得られたＦcフラグメントをこの感作抗体
量の１割に当たる２５μg/mlになるよう、上記感作ラテ
ックス粒子含有液に添加しラテックス液を得た。Ｂ）ラテックス添加液０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミンを
含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）を、
ラテックス添加液として調製した。Ｃ）緩衝液０．１５％ポリエチレングリコール（平均分子量７５０
０），０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミ
ンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）
を調製し、緩衝液とした。

【００１７】２）測定方法ラテックス液をラテックス添加液で４倍に希釈しラテッ
クス試液とした。検体試料１４μｌと緩衝液２５０μｌ
を反応キュベットに分注し攪拌した後、３７℃で５分間
加温した。次に、ラテックス試液２５０μｌを添加し攪
拌後、１分後と５分後の５７０ｎｍにおける吸光度差を
求めた。測定には、日立７１５０形生化学自動分析装置
（（株）日立製作所製）を用いた。対照品として、Ｆｃ
フラグメントを添加していないラテックス試薬（上記の
ラテックス調製法で牛血清アルブミンによるブロッキン
グ処理までの工程は同様に行い、Ｆｃフラグメントの添
加をしていない試薬）を用い、上記と同様に操作した。

【００１８】３）実測結果試料として生理食塩水及びＡＦＰ標準品の希釈系列（Ａ
ＦＰ濃度１０，３０，１００，２５０ｎｇ／ｍｌ）を用
い、生理食塩水を用いたときの測定値を試薬ブランクと
し検量線を作成し対照品と比較した。その結果を図１に
示す。図１のように本発明品は対照品に比較し、シグモ
イドカーブの少ない良好な検量線を示した。特に、α−
フェトプロテインの低濃度域での精度の差が大きいこと
がわかる。

【００１９】（実施例２）上記方法で製造した本発明品
と対照品（ラテックス液Ａ）を冷蔵保存し自己凝集の有
無を観察し、免疫試薬としての保存安定性の比較を行っ
た。対照品は３カ月保存で若干自己凝集によるラテック
スの沈澱を認め、６カ月保存でかなりのラテックスが自
己凝集し沈澱が認められた。この６カ月保存品を上記と
同様に測定使用としたが初期吸光度が３．０以上となり
測定不可能であった。これに対し本発明品は３，６，１
２カ月のどの時点でも自己凝集による沈澱はなかった。
また、１２カ月保存品を実施例１と同様に測定した結
果、ほぼ同様の値が得られた。

【００２０】（実施例３）上記方法で製造した本発明品
と対照品を用いて血清検体を同時測定し特異性を比較し
た。図２に示すように２００検体測定した結果、非特異
反応に起因すると思われる乖離が３検体あった。この３
検体を除いた相関を図３に示す。この検体のＲＦ（リウ
マチ因子）値を測定したが一番測定値の高い１検体は１
０００IU/ml以上と高かったが他の２検体は５０IU/ml程
度とそれほど高くなかった。これらのことから、本発明
品が非特異的凝集がほとんどなく、対照品より優れてい
ることが明らかである。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、非特異的凝集がなく、
良好な精度の抗原の定量が可能である。また、本発明の
抗原定量用免疫試薬は、保存安定性が非常に良好であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の定量法と比較対照法のα−フェトプロ
テイン濃度と測定値の関係を示す検量線のグラフであ
る。

【図２】本発明の定量法と比較対照法の測定値の相関を
示すグラフである。

【図３】本発明の定量法と比較対照法の測定値の相関を
示すグラフである（但し乖離検体を除く）。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年９月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】

【実施例】次に、実施例によって、本発明を詳細に説明
する。以下、％は重量％を意味する。実施例１１）試薬の調製ａ）ラテックス液抗αーフェトプロテイン（ＡＦＰ）ヤギ抗体をペプシン
消化し、担体としてセファクリルＳ２００（ファルマシ
ア社製）を使用してゲル濾過を行ってＦｃフラグメント
を分離精製した後、残る分画は抗ヤギＦｃウサギ抗体を
リガンドとするアフィニティークロマトグラフィーにか
けＦ(ab')₂フラグメントを精製した。得られたＦ(ab')₂
フラグメントを１．３mg/ml含有する０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５０、０.１５ＭＮａＣｌ含有）
と、平均粒径約０．２μｍのポリスチレンラテックス粒
子を０．５％分散した０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５０、０.１５ＭＮａＣｌ含有）を１：１で混合
し３７℃、２時間反応させ抗体を吸着した。１５，００
０r.p.m.で２０分遠心分離し上清を取り除いた後、沈澱
物を０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミ
ンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）
で再分散し、冷蔵庫で一晩保存することによりラテック
ス粒子の未吸着部分をブロッキングした。除去した上清
の吸光度からこの感作ラテックス粒子含有液には抗体が
０．２５mg/mlの割合で感作されていることを確認し
た。上記抗ＡＦＰヤギ抗体をペプシン消化して上記のよ
うに精製して得られたＦcフラグメントをこの感作抗体
量の１割に当たる２５μg/mlになるよう、上記感作ラテ
ックス粒子含有液に添加しラテックス液を得た。Ｂ）ラテックス添加液０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミンを
含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５０）を、
ラテックス添加液として調製した。Ｃ）緩衝液１．５％ポリエチレングリコール（平均分子量７５０
０），０.１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブ
ミンを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５
０）を調製し、緩衝液とした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山県武夫茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者山木光男茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定しようとする抗原と免疫学的反応を
生ずる免疫グロブリンのＦ(ab')₂フラグメントを感作し
た不溶性担体粒子を、前記免疫グロブリンのＦcフラグ
メントの存在下に、測定試料と反応させることを特徴と
する抗原の定量法。
【請求項２】不溶性担体粒子としてラテックス粒子を
用いる請求項１記載の抗原の定量法。
【請求項３】測定しようとする抗原の量を、免疫グロ
ブリンのＦ(ab')₂フラグメントを感作した不溶性担体粒
子と抗原との凝集反応による光学的強度の変化から求め
ることを特徴とする請求項１又は２記載の抗原の定量
法。
【請求項４】光学的強度が吸光度である請求項１、２
又は３記載の抗原の定量法。
【請求項５】測定しようとする抗原と免疫学的反応を
生ずる免疫グロブリンのＦ(ab')₂フラグメントを感作し
た不溶性担体粒子と前記免疫グロブリンのＦcフラグメ
ントを含んでなる抗原定量用免疫試薬。