JP7326663B2 - がんの処置のための活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む、がんを予防又は処置するための医薬組成物に関する。

腫瘍溶解性ウイルスは、優れた腫瘍特異的標的化能力、がん細胞での増殖能力及び殺がん細胞能力を有する。近年、腫瘍溶解性ウイルスに基づく様々な臨床試験が実行されている。２０１５年に、単純ヘルペスウイルスに基づく腫瘍溶解性ウイルスであるタリモジンラヘルパレプベク（Ｔ－Ｖｅｃ）が進行した黒色腫のための治療剤として首尾よく商品化されたので、腫瘍溶解性ウイルス分野の時代が米国及び欧州で開始した。

近年、腫瘍溶解性ウイルスの有用性はそれら自身の有効性を超え、このウイルスは腫瘍免疫を活性化し、それによって別の免疫療法剤と併用される治療剤としてのそれらの可能性を示す。腫瘍溶解性ウイルスの開発の初期段階であった２０００年までは、そのがん細胞特異的増殖によってもたらされるウイルスの直接殺作用は比較的より重要であった。しかし、以降の臨床試験は、腫瘍免疫の活性化が直接殺がん細胞作用よりも重要な機構であることを見出した。この知見に基づいて、両方とも併用される腫瘍溶解性ウイルスを含む治療剤及び免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法剤が近年開発されている。これは、免疫が抑制される腫瘍微小環境を免疫療法に適当な腫瘍微小環境に腫瘍溶解性ウイルスが変換することが知られているからである。

ワクシニアウイルスベースの腫瘍溶解性ウイルスに関するいくつかの臨床試験で、腫瘍溶解性ウイルス療法は、急性腫瘍壊死、永続的応答又は完全応答をもたらすことができるが、一部の場合には、進行性疾患又は早朝死亡などの予測困難な結果（薬力学変動）につながることがある。例えば、ワクシニアウイルスに基づくＰｅｘａ－ｖｅｃの場合、フェーズ１臨床試験では、一部の患者は腫瘍溶解性ウイルス療法から１カ月以内に早期に死亡し、これは持続的な全身炎症応答及び主要臓器機能障害と関連付けられた。さらに、腫瘍溶解性ウイルス処置の後に観察される一時的な風邪症状（高熱）及び低血圧は、腫瘍溶解性ウイルス療法の後の最も頻繁な有害事象である。

したがって、腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増強するために、がん細胞、患者の免疫状態及び腫瘍溶解性ウイルスの間の相互作用を理解することが必要であり、この理解に基づいて、腫瘍溶解性ウイルスの臨床有効性を増加させることが可能な技術の研究の必要性がある。

したがって、腫瘍溶解性ウイルスとして使用するワクシニアウイルスの抗がん効果を増強するための研究を実行した結果として、本発明者らは、がんを有する個体にワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に、ワクシニアウイルスだけが投与される従来の場合と比較して、安全な使用を確実にするために顕著に減少した全身炎症応答が得られることを見出した。さらに、本発明者らは、ワクシニアウイルスが全身投与されるときにヒドロキシ尿素が同時投与される場合、優れたがん細胞特異的選択性及び増殖能力が得られることを見出した。

上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む、がんを処置するための医薬組成物が提供される。

本発明の別の態様では、がんを処置するための方法であって、がんを有する個体にワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を投与するステップを含む方法が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんの予防又は処置のためのワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む組成物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんを予防又は処置するための医薬の製造のための、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む組成物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、活性成分としてヒドロキシ尿素を含む抗がんアジュバントが提供される。

活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む、本発明のがんを処置するための医薬組成物は、ワクシニアウイルスだけが投与される従来の場合と比較して優れた抗がん効果及び安全性を有する。したがって、活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む、本発明の医薬組成物は、がんの処置のために効果的に使用することができる。

マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に、野生型ワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス、ＷＲ）及びヒドロキシ尿素（ＨＵ）を投与し、その後０、３、７、１０及び１４日目に腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に、野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）及びＨＵを投与し、その後０、３、７、１０及び１４日目に体重を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に、ＷＲからＴＫ遺伝子を欠失させて得られた組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵ（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、その後０、３、７、１０、１４、１７及び２１日目に腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に、組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵ（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、その後０、３、７、１０及び１４日目に腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス黒色腫移植マウス（Ｂ１６Ｆ１０）に、ＷＲからＴＫ遺伝子及びワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子を同時に欠失させて得られた組換えワクシニアウイルス（ＶＶ＿ＤＤ）及びＨＵを投与した１日前、並びにそれから４及び７日目に腫瘍体積を測定して得られた結果を例示する図である。 ヒト結腸直腸がん細胞（ＣＴ－２６）移植マウスに組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びＨＵを投与し、その後０、５、１０、１２及び１５日目に腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 ヒト肺がん細胞（ＮＣＩ－Ｈ４６０）移植マウスに組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びＨＵを投与し、その後生存率を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に組換えワクシニアウイルス（ＶＶ^ｔｋ－）及びヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）又はＨＵを投与し、その後マウスで腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 組換えワクシニアウイルス（ＶＶ^ｔｋ－）及びヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）又はＨＵを投与したマウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）からの脾臓のリンパ球を単離し、リンパ球を新規のマウスに投与し、その後この新規のマウスで腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＨＵを投与し、その後マウスで腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵを投与したマウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）からＴリンパ球を単離し、Ｔリンパ球を新規のマウスに投与し、その後この新規のマウスで腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵを投与したマウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）から脾細胞を単離し、脾細胞を新規のマウスに投与し、その後この新規のマウスで腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＨＵを投与し、その後２２日目に腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＨＵを投与し、その後脾臓組織におけるＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を観察することによって得られた結果を例示する図である。 マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）に組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びＨＵを投与し、その後血液及び脾臓組織におけるＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を観察することによって得られた結果を例示する図である。 マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）の左腫瘍に組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵを投与し、その後左腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス乳がん細胞移植マウス（４Ｔ１）の左腫瘍に組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵを投与し、その後右腫瘍体積を測定することによって得られた結果を例示する図である。 マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｒｅｎｃａ）に組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びＨＵを投与し、その後マウス腫瘍組織における組換えワクシニアウイルスの分布を特定するために２２日目に染色を実行することによって得られた結果を例示する図である。 正常マウスに野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）か、又は野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）とＨＵを投与し、その後肝臓及び腎臓組織における野生型ワクシニアウイルスの分布を特定することによって得られた結果を例示する図である。

［発明を実施するための最良の形態］
以後、本発明を具体的に記載する。

本発明の一態様では、活性成分としてワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む、がんを予防又は処置するための医薬組成物が提供される。

医薬組成物に含まれるワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は、同時に、逐次的に又は逆順に併用投与することができる。具体的には、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は同時に投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に、その後ワクシニアウイルスを投与することができる。さらに、ワクシニアウイルスを最初に、その後ヒドロキシ尿素を投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に、その後ワクシニアウイルスを投与することができ、ヒドロキシ尿素を再び投与することができる。

ワクシニアウイルスは、限定されずに、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ（ＩＨＤ－Ｊ）又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ（ＩＨＤ－Ｗ）ワクシニアウイルス株に属することができる。本発明の一実施形態では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス及びＷｙｅｔｈ株ワクシニアウイルスが使用された。

ワクシニアウイルスは野生型ワクシニアウイルス又は組換えワクシニアウイルスであってよい。具体的には、組換えワクシニアウイルスは、野生型ワクシニアウイルスから遺伝子を欠失させるか又は野生型ワクシニアウイルスに外来遺伝子を挿入することによって得ることができる。ここで、野生型ワクシニアウイルスの遺伝子の中で、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）、ＷＲ５３．５、Ｆ１３．５Ｌ、Ｆ１４．５、Ａ５６Ｒ、Ｂ１８Ｒ又はその組合せからなる群から選択されるいずれか１つをコードする、ウイルス病原性に関する遺伝子を欠失させることができる。

さらに、挿入される外来遺伝子は、免疫を促進し、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、変異したＨＳＶ－ＴＫ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシルエステラーゼ１型、カルボキシルエステラーゼ２型、インターフェロンベータ（ＩＮＦ－β）、ソマトスタチン受容体２及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つをコードする遺伝子であってよい。

具体的には、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ（ＩＨＤ－Ｊ）又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ（ＩＨＤ－Ｗ）ワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させることによって得ることができる。本発明の一実施形態では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させることによって得られた組換えワクシニアウイルスを使用し、このウイルスは「ＷＲ ＶＶｔｋ－」と命名した。さらに本発明の一実施形態では、Ｗｙｅｔｈ株ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させることによって得られた組換えワクシニアウイルスを使用し、このウイルスは「Ｗｙｅｔｈ ＶＶｔｋ－」と命名した。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子及びＶＧＦ遺伝子を欠失させることによって得ることができる。本発明の一実施形態では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子及びＶＧＦ遺伝子を欠失させることによって得られた組換えワクシニアウイルスを使用し、このウイルスは「ＶＶ＿ＤＤ」と命名した。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこにＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこに変異したＨＳＶ－ＴＫ遺伝子を挿入することによって得ることができる。本発明の一実施形態では、Ｗｙｅｔｈ株ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、欠失位置に配列番号１のＨＳＶ－ＴＫ断片（１～３３０ａａ）をコードする遺伝子を挿入することによって得られた組換えワクシニアウイルスを使用し、このウイルスは「ＯＴＳ－４１２」と命名した。さらに、本発明の一実施形態では、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、欠失位置にＨＳＶ－ＴＫ遺伝子の配列番号２のＨＳＶ－ＴＫバリアントをコードする遺伝子を挿入することによって得られた組換えワクシニアウイルスを使用し、このウイルスは「ＷＯＴＳ－４１８」と命名した。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこにＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこにＣ－ＣＳＦ遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこにシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこにソマトスタチン受容体２遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子を欠失させ、そこに単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、変異したＨＳＶ－ＴＫ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、又はソマトスタチン受容体２を各々コードする遺伝子からなる群から選択される任意の２つ以上の遺伝子を挿入することによって得ることができる。

さらに、組換えワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に属するワクシニアウイルスからＴＫ遺伝子及びＶＧＦ遺伝子を欠失させ、そこに単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、変異したＨＳＶ－ＴＫ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、又はソマトスタチン受容体２を各々コードする遺伝子及びその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つの遺伝子を挿入することによって得ることができる。

本明細書で使用されるように、用語「遺伝子欠失」は、遺伝子の部分的若しくは完全な欠失のために、又はそこへの外来遺伝子の挿入のために遺伝子が発現されないことを意味する。部分的欠失が遺伝子で起こる場合、遺伝子によって発現されるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端の一部のアミノ酸が欠失してもよい。

本明細書で使用されるように、用語「チミジンキナーゼ（ＴＫ）」は、チミジンキナーゼと呼ばれてヌクレオチド生合成に関与する酵素を指す。ＴＫは、細胞及びウイルスの両方でヌクレオチド生合成のために使用される酵素である。ここで、細胞については、正常な細胞はもはや分裂せず、したがってＴＫはそこに存在しない；毛包細胞などの速やかに分裂する細胞であっても、ＴＫはウイルスが利用するのに十分な量で存在しない。これらの視点から、ウイルスはその中のＴＫ遺伝子の欠失によってＴＫが存在するがん細胞の存在下だけで増殖が許され、そのためがん細胞を選択的に死滅させることができる。

本明細書で使用されるように、用語「ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）」は上皮増殖因子と配列相同性を有し、感染細胞周囲の細胞増殖を刺激するポリペプチドを指す。ワクシニアウイルスは増殖細胞でより良好に複製し、したがってｉｎ ｖｉｖｏウイルス複製のために有利に使用することができる。腫瘍溶解性ウイルスをがん細胞だけでより特異的に増殖させるために、ウイルスはＴＫ遺伝子の欠失に加えてＶＧＦ遺伝子の欠失をさらに受けることができる。

本明細書で使用されるように、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と呼ばれる「ＧＭ－ＣＳＦ」という用語は、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞及び線維芽細胞によって分泌されるタンパク質を指す。ＧＭ－ＣＳＦは、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）及び単球を産生するように幹細胞を刺激する。さらに、ＧＭ－ＣＳＦはマクロファージの数を速やかに増加させ、それによって免疫応答を誘導する。ＧＭ－ＣＳＦはヒト起源であってよく、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５２５７８．１の配列を有するタンパク質であってよい。

本明細書で使用されるように、シトシンデアミナーゼと呼ばれる「ＣＤ」という用語は、ウラシル及びアンモニアへのシトシンの加水分解性脱アミノを触媒する酵素を指す。

本明細書で使用されるように、顆粒球コロニー刺激因子と呼ばれる「Ｇ－ＣＳＦ」という用語は、炎症又はエンドトキシンによる刺激の後にマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞などによって産生されるサイトカインを指す。Ｇ－ＣＳＦは、好中球の産生を促進する。Ｇ－ＣＳＦはヒト起源（ｒｈＧＣＳＦ）であってよく、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ０３０５６．１の配列を有するタンパク質であってよい。

本明細書で使用されるように、用語「ソマトスタチン受容体２」は、ヒトのＳＳＴＲ２遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ソマトスタチン受容体２は主に腫瘍で発現され、ソマトスタチン受容体２を過剰発現する神経内分泌腫瘍の患者は向上した予後を示す。ソマトスタチン受容体２は、がん細胞を含む多くの細胞でアポトーシスを刺激する能力を有する。

本明細書で使用されるように、用語「ヒドロキシ尿素」は、以下の式を有する化合物を指す。

ヒドロキシ尿素は、ＤＮＡ合成を阻害する抗がん剤として知られる；しかし、その正確な作用機構は解明されていない。さらに、ヒドロキシ尿素は、ヒドロキシ尿素を含有する市販薬の形で医薬組成物に含まれてもよい。ヒドロキシ尿素を含有する市販薬の例は、ヒドロキシ尿素（登録商標）、ヒドレア（Ｈｙｄｒｅａ）（登録商標）、ドロキシア（Ｄｒｏｘｉａ）（商標）、ミロセル（Ｍｙｌｏｃｅｌ）（商標）、シクロス（Ｓｉｋｌｏｓ）（登録商標）及びヒドリン（Ｈｙｄｒｉｎｅ）（登録商標）カプセルを限定されずに含むことができる。ヒドロキシ尿素は経口的にとることができ、その非経口投与も可能である。

ワクシニアウイルスの投薬量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって異なり、当業者が適切に選択することができる。投薬量は、患者が１×１０^５～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよい。具体的には、投薬量は、患者が１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位又はプラーク形成単位でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよく、上記の数値の間の様々な数値及び範囲がその中に含まれてもよい。好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与することができる。より好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５以上及び１×１０^９ｐｆｕ未満の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスは１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

さらに、ヒドロキシ尿素は１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日～６５ｍｇ／ｋｇ／日、又は３０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、ヒドロキシ尿素は３０ｍｇ／ｋｇ／日又は６０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。投薬量によって、ヒドロキシ尿素は分割用量によって１日につき数回投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は１日につき１～４回又は１日につき１～２回投与することができる。

がんは、固形がん又は血液がんであってよい。具体的には、血液がんは、リンパ腫、急性白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。固形がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵がん及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。

さらに、本発明の医薬組成物は、生理的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の調製で一般的に使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。さらに、医薬組成物は、従来の方法によって注射剤の形で製剤化することができる。

非経口投与のための調製物として製剤化される場合、医薬組成物は、無菌水溶液、非水性溶液、懸濁液、乳剤、フリーズドライ調製物、坐薬などに製剤化することができる。非水性溶液又は懸濁液の場合、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを使用することができる。坐薬の基剤として、ウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）（商標）、マクロゴール、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）６１、カカオ脂、ラウリン系脂肪、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

投与経路、投薬量及び投与の頻度に関して、医薬組成物は、患者の状態及び副作用の有無；並びに最適な投与経路、投薬量及び投与の頻度によって様々な方法及び量で対象に投与することができ、したがって、好適な範囲内で当業者が選択することができる。さらに、医薬組成物はその治療効果が処置する疾患について知られている別の薬物若しくは生理活性物質と併用投与することができるか、又は他の薬物との併用調製物の形で製剤化することができる。

医薬組成物は非経口的に投与することができ、そのような投与は任意の好適な方法、例えば腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、静脈内又は動脈内投与によって実行することができる。これらの中で、腫瘍内、腹腔内又は静脈内投与が好ましいかもしれない。他方、医薬組成物の投薬量は投与スケジュール、全投薬量及び患者の健康状態によって決定することができる。

がんを処置するための医薬組成物は、ワクシニアウイルスの増加したがん選択性によって特徴付けることができる。

本発明の別の態様では、活性成分としてワクシニアウイルスを含む第１の組成物、及び活性成分としてヒドロキシ尿素を含む第２の組成物を含む、がんを予防又は処置するためのキットが提供される。

ワクシニアウイルスは、医薬組成物について上で記載される通りである。

活性成分としてヒドロキシ尿素を含む第２の組成物は、市販薬であってよい。活性成分としてヒドロキシ尿素を含有する市販薬の例は、ヒドロキシ尿素（登録商標）、ヒドレア（登録商標）、ドロキシア（商標）、ミロセル（商標）、シクロス（登録商標）及びヒドリン（登録商標）カプセルを含むことができる。第２の組成物は経口的にとることができ、その非経口投与も可能である。

ワクシニアウイルスの投薬量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって異なり、当業者が適切に選択することができる。投薬量は、患者が１×１０^５～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよい。具体的には、投薬量は、患者が１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位又はプラーク形成単位でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよく、上記の数値の間の様々な数値及び範囲がその中に含まれてもよい。好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与することができる。より好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５以上及び１×１０^９ｐｆｕ未満の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスは１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

さらに、第２の組成物は、１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。具体的には、第２の組成物は、１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日～６５ｍｇ／ｋｇ／日又は３０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、第２の組成物は３０ｍｇ／ｋｇ／日又は６０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。投薬量によって、第２の組成物は分割用量によって１日につき数回投与することができる。具体的には、第２の組成物は１日につき１～４回又は１日につき１～２回投与することができる。

がんは、固形がん又は血液がんであってよい。具体的には、血液がんは、リンパ腫、急性白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。固形がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵がん及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。

第１の組成物及び第２の組成物は、生理的に許容される担体をさらに含むことができる。さらに、本発明のキットに含まれる組成物は、医薬組成物の調製で一般的に使用される好適な賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。さらに、組成物は、従来の方法によって注射剤の形で製剤化することができる。

非経口投与のための調製物として製剤化される場合、第１の組成物及び第２の組成物は、無菌水溶液、非水性溶液、懸濁液、乳剤、フリーズドライ調製物、坐薬などに製剤化することができる。非水性溶液又は懸濁液の場合、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用エステルなどを使用することができる。坐薬の基剤として、ウィテップゾール（商標）、マクロゴール、ツイーン（商標）６１、カカオ脂、ラウリン系脂肪、グリセロゼラチンなどを使用することができる。

投与経路、投薬量及び投与頻度に関して、第１の組成物及び第２の組成物は、患者の状態及び副作用の有無；並びに最適な投与経路、投薬量及び投与頻度によって様々な方法及び量で対象に投与することができ、したがって、好適な範囲内で当業者が選択することができる。さらに、医薬組成物はその治療効果が処置する疾患について知られている別の薬物又は生理活性物質と併用投与することができるか、又は他の薬物との併用調製物の形で製剤化することができる。

第２の組成物は、経口的に又は非経口的に投与することができる。具体的には、第２の組成物は非経口的に投与することができ、そのような投与は腹腔内、動脈内又は静脈内投与によって実行することができる。

第１の組成物は非経口的に投与することができ、そのような投与は任意の好適な方法、例えば腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、動脈内又は静脈内投与によって実行することができる。これらの中で、腫瘍内、腹腔内又は静脈内投与が好ましいかもしれない。他方、第１の組成物及び第２の組成物の投薬量は投与スケジュール、全投薬量及び患者の健康状態によって決定することができる。

さらに、第１の組成物は１～１０回又は２～５回投与することができ、個体へのその投与は７～３０日の間隔で実行することができる。具体的には、第１の組成物は、７日、１４日、２１日又は３０日の間隔で投与することができる。

第２の組成物は、第１の組成物の投与の前後に投与することができる。具体的には、第２の組成物は、第１の組成物の投与の３～５日前から開始して１日に１回連続的に投与することができ、第１の組成物の投与から２４時間以内又はその２４時間後に開始して９～２８日間、１日に１回連続的に投与することができる。本発明の一実施形態では、第２の組成物は、第１の組成物の投与の１～３日前から開始して１日に１回連続的に投与することができ、第１の組成物の投与の後に１３日間、１７日間、１８日間又は２８日間、１日に１回投与することができる。

本発明のさらに別の態様では、がんを処置するための方法であって、がんを有する個体にワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を投与するステップを含む方法が提供される。

ワクシニアウイルスは、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＮＹＶＡＣ、Ｗｙｅｔｈ、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＴｉａｎＴａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、ＩＨＤ－Ｊ又はＩＨＤ－Ｗワクシニアウイルス株に限定されずに属することができる。

ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は、同時に、逐次的に又は逆順に併用投与することができる。具体的には、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は同時に投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に、その後ワクシニアウイルスを投与することができる。さらに、ワクシニアウイルスを最初に、その後ヒドロキシ尿素を投与することができる。さらに、ヒドロキシ尿素を最初に、その後ワクシニアウイルスを投与することができ、その後ヒドロキシ尿素を再び投与することができる。

ワクシニアウイルスの投薬量は、個体の状態及び体重、疾患の重症度、薬物のタイプ、投与の経路及び期間によって異なり、当業者が適切に選択することができる。投薬量は、患者が１×１０^５～１×１０^１８のウイルス粒子、感染性ウイルス単位（ＴＣＩＤ_５０）又はプラーク形成単位（ｐｆｕ）でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよい。具体的には、投薬量は、患者が１×１０^５、２×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、５×１０^１０、１×１０^１１、５×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７又はそれ以上のウイルス粒子、感染性ウイルス単位又はプラーク形成単位でワクシニアウイルスを受けるようなものであってよく、上記の数値の間の様々な数値及び範囲がその中に含まれてもよい。好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与することができる。より好ましくは、ワクシニアウイルスは１×１０^５以上及び１×１０^９ｐｆｕ未満の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、ワクシニアウイルスは１×１０^５又は１×１０^７ｐｆｕで投与された。

さらに、ヒドロキシ尿素は１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、又は１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日～８０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日～７０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日～６５ｍｇ／ｋｇ／日又は３０ｍｇ／ｋｇ／日～６０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。本発明の一実施形態では、ヒドロキシ尿素は３０ｍｇ／ｋｇ／日又は６０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。投薬量によって、ヒドロキシ尿素は分割用量によって１日につき数回投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は１日につき１～４回又は１日につき１～２回投与することができる。

さらに、ワクシニアウイルスは１～１０回又は２～５回投与することができ、７～３０日の間隔で個体に投与することができる。具体的には、ワクシニアウイルスは、７日、１４日、２１日又は３０日の間隔で投与することができる。

ヒドロキシ尿素は、ワクシニアウイルスの投与の前、その間又は後に投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は、ワクシニアウイルスの投与の前後に投与することができる。ヒドロキシ尿素は、ワクシニアウイルスの投与の３～５日前から開始して１日に１回連続的に投与することができ、ワクシニアウイルスの投与から２４時間後に開始して９～２８日間、１日に１回連続的に投与することができる。本発明の一実施形態では、ヒドロキシ尿素は、ワクシニアウイルスの投与の１～３日前から開始して１日に１回連続的に投与することができ、ワクシニアウイルスの投与の後に１３日間、１７日間、１８日間又は２８日間、１日に１回投与することができる。

がんは、固形がん又は血液がんであってよい。具体的には、血液がんは、リンパ腫、急性白血病及び多発性骨髄腫からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。固形がんは、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵がん及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。

ヒドロキシ尿素は、経口的に又は非経口的に投与することができる。具体的には、ヒドロキシ尿素は非経口的に投与することができ、そのような投与は腹腔内、動脈内又は静脈内投与によって実行することができる。

ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は非経口投与することができ、そのような投与は任意の好適な方法、例えば腫瘍内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、静脈内又は動脈内投与によって実行することができる。これらの中で、腫瘍内、腹腔内又は静脈内投与が好ましいかもしれない。他方、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の投薬量は投与スケジュール、全投薬量及び患者の健康状態によって決定することができる。

本明細書で使用されるように、用語「個体」は、本発明の医薬組成物を投与することによって緩和、抑制又は処置することができる状態の疾患を有するか又は患っている人を指す。

本明細書で使用されるように、用語「投与」は、適当な方法によって物質の有効量を個体に導入することを意味し、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の投与は、物質が標的組織に到達することを可能にする一般的な経路を通して実行することができる。

さらに、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素は、その治療効果が処置する疾患について知られている別の薬物又は生理活性物質と併用投与することができるか、又は他の薬物との併用調製物の形で製剤化することができる。

本発明のさらに別の態様では、がんの予防又は処置のためのワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む組成物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、がんを予防又は処置するための医薬の製造のための、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む組成物の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、活性成分としてヒドロキシ尿素を含む抗がんアジュバントが提供される。ここで、ヒドロキシ尿素は、医薬組成物について上で記載される通りである。さらに、抗がんアジュバントは、活性成分としてワクシニアウイルスを含む抗がん剤のための抗がんアジュバントとして使用されることを特徴とし得る。抗がんアジュバントは、ワクシニアウイルスの抗がん活性を向上させるか、増強するか、又は増加させることを特徴とし得る。抗がんアジュバントは、ワクシニアウイルスのがん選択性を増加させることを特徴とし得る。

［発明の形態］
以降、本発明は実施例によりさらに詳細に記載される。しかし、以下の実施例は例示だけが目的であり、本発明の範囲はそれに限定されない。

調製実施例１。組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）の生成
調製実施例１．１。シャトルプラスミドベクターの構築
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失している組換えワクシニアウイルスを生成するために、野生型ワクシニアウイルス、すなわち、Ｗｙｅｔｈ株（ＮＹＣ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株を、アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ）から購入した。組換えのために、野生型ワクシニアウイルスのＴＫ領域を、ホタルルシフェラーゼリポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を含有するシャトルプラスミドベクターを使用した置換にかけた。

調製実施例１．２。組換えワクシニアウイルスの生成
組換えウイルスを得るために、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を１ウェルにつき４×１０^５細胞で６ウェルプレートに播種し、次に、１０％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地で培養を実行した。その後、野生型ワクシニアウイルスによる処理を０．０５のＭＯＩで実行した。２時間後に、培地を２％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地で置き換え、次に、Ｘｆｅｃｔ（商標）ポリマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ６３１３１７、ＵＳＡ）を使用して、調製実施例１．１で構築されて線状化された４μｇのシャトルプラスミドベクターで細胞をトランスフェクトした。培養は、４時間実行した。その後、培地を２％ウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地で置き換え、その後、培養を７２時間さらに実行した。最後に、感染細胞を収集し、次に凍結解凍を３回繰り返した。その後、細胞を超音波処理によって溶解し、スクロースクッション方法を使用して遊離の組換えワクシニアウイルスを得、それらをＷｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－又はＷＲ ＶＶ^ｔｋ－と命名した。

調製実施例２。組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）の生成
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失し、変異した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを生成するために、Ｗｙｅｔｈ株野生型ワクシニアウイルスのＴＫ領域を、配列番号１の合成された変異した１型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子（ｐＳＥ／Ｌプロモーター）及びホタルルシフェラーゼリポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子を組み換えたｐＵＣ５７ａｍｐ＋プラスミド（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＵＳＡ）をシャトルベクターとして使用した置換にかけた。上で構築したシャトルベクターを使用して、組換えワクシニアウイルスを調製実施例１．２と同様に得、このウイルスをＯＴＳ－４１２と命名した。

調製実施例３。組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の生成
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失し、変異した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを生成するために、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株野生型ワクシニアウイルスのＴＫ領域を、配列番号２の合成された変異した１型ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子（ｐＳＥ／Ｌプロモーター）及びホタルルシフェラーゼリポーター（ｐ７．５プロモーター）遺伝子を組み換えたｐＵＣ５７ａｍｐ＋プラスミド（Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＵＳＡ）をシャトルベクターとして使用した置換にかけた。上で構築したシャトルベクターを使用して、組換えワクシニアウイルスを調製実施例１．２と同様に得、このウイルスをＷＯＴＳ－４１８と命名した。

組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ＿ＤＤ）の生成
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子及びワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子が欠失している組換えワクシニアウイルスを生成するために、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株野生型ワクシニアウイルスのＴＫ領域を、増強した緑色蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を含有するシャトルプラスミドを使用した置換にかけ、同じウイルスのＶＧＦ遺伝子領域を、ｌａｃＺ遺伝子を含有するシャトルプラスミドを使用した置換にかけた。ＥＧＦＰ遺伝子を含有するシャトルプラスミド及びｌａｃＺ遺伝子を含有するシャトルプラスミドを使用して、組換えワクシニアウイルスを調製実施例１．２と同様に得、このウイルスをＶＶ＿ＤＤと命名した。

実験的実施例１。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（Ｉ）における野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
実験的実施例１．１。マウス腎臓がん細胞移植マウスの生成及び薬物投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、１０週齢）を２日間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を皮下に５×１０６細胞で移植した。それが５０ｍｍ^３～８０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後野生型ワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）は、同種移植モデルにおいてＷｙｅｔｈ株野生型ワクシニアウイルスより強力な増殖能力を有する。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝６）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ、１×１０^５ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ、１×１０^５ｐｆｕ）及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。野生型ワクシニアウイルスは腫瘍内に１回投与し；ヒドロキシ尿素は、野生型ワクシニアウイルスの投与日を除いて野生型ワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して、投与から１４日目にかけて、腹腔内に１週につき５回投与した。

実験的実施例１．２。腫瘍体積の変化の検査
腫瘍体積は、実験的実施例１．１の各群のマウスへの薬物投与の０、３、７、１０及び１４日目に測定した。その結果、陽性対照群のマウスの腫瘍体積は陰性対照群と比較して抑制され、実験群のマウスの腫瘍体積は著しく抑制されることが特定された（図１）。
実験的実施例１．３。体重変化の検査
体重は、実験的実施例１．１の陰性対照群、陽性対照群及び実験群のマウスへの各薬物投与の３、７、１０及び１４日目に測定した。その結果、全３群で有意な体重減少はなかった（図２）。

実験的実施例２。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（ＩＩ）における組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
実験的実施例２．１。マウス腎臓がん細胞移植マウスの生成及び薬物投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）を１週間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株由来組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）は、同種移植モデルにおいてＷｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルスより強力な増殖能力を有する。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝８）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（６０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に２回投与し；ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して、投与から２１日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

実験的実施例２．２。腫瘍体積の変化の検査
腫瘍体積は、実験的実施例２．１の各群のマウスへの薬物投与から０、３、７、１０、１４、１７及び２１日目に測定した。その結果、実験群のマウスの腫瘍体積は陽性対照群のマウスの腫瘍体積と比較して有意に抑制されることが特定された（図３）。

実験的実施例３。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（ＩＩＩ）における組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、１０週齢）を２日間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を左大腿の皮下に５×１０^６細胞で移植した。それが５０ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝６）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^５ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に１回投与し；ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して、投与から１４日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

腫瘍体積は、各群のマウスへの薬物投与から０、３、７、１０及び１４日目に測定した。その結果、実験群のマウスの腫瘍体積は陽性対照群のマウスの腫瘍体積と比較して成長が約２５％抑制されることが特定された（図４）。

実験的実施例４。マウス黒色腫移植マウス：Ｂ１６Ｆ１０における組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ＿ＤＤ）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
ＫＯＡＴＥＣＨ（Ｋｏｒｅａ）から購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を２日間の順化にかけ、次にマウス黒色腫がん細胞株（ＡＴＣＣ、Ｂ１６Ｆ１０）を５×１０^５細胞で皮下に移植した。それが５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ＿ＤＤ）の投与を開始した。組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ＿ＤＤ）は、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）及びワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）領域の二重欠失を実行して得られ、同種移植モデルにおいて限定的な増殖能力を有する。

生成されたマウス黒色腫移植マウスは、４群（ｎ＝６）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、ヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）又は組換えワクシニアウイルス（ＶＶ＿ＤＤ、１×１０^６ｐｆｕ）の投与を単独で受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは０及び５日目に腹腔内に投与した；ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して、投与から１５日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

腫瘍体積は、各群のマウスへの薬物投与の１日前と投与の４及び７日目に測定した。その結果、実験群のマウスの腫瘍体積は陽性対照群のマウスの腫瘍体積と比較して有意に抑制されることが特定された（図５）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス（ＶＶ＿ＤＤ）及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に相乗効果が観察されることが特定された。

実験的実施例５。ヒト肺がん細胞株移植マウス：ＮＣＩ－Ｈ４６０における組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（雌、７週齢）を２日間の順化にかけ、次にＮＣＩ－Ｈ４６０ヒト肺がん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を皮下に５×１０^６細胞で異種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）の投与を開始した。他方、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株由来組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）は、ヒト肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ４６０）異種移植マウスにおいて増殖能力を有する。

生成されたヒト肺がん細胞株移植マウスは、２群（ｎ＝４）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８、１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腹腔内に１回投与した；ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して投与から１５日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

腫瘍体積は、各群のマウスへの薬物投与の０、５、１０、１２及び１５日目に測定した。その結果、実験群のマウスの腫瘍体積は対照群と比較して約４０％抑制されることが特定された（図６）。

実験的実施例６。マウス結腸直腸がん細胞移植マウス：ＣＴ－２６における組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素の生存分析
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を２日間の順化にかけ、次にマウス結腸直腸がん細胞株（ＣＴ－２６、Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を皮下に５×１０^６細胞で移植した。７日後に、組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）及びヒドロキシ尿素の投与を開始した。他方、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株由来組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８）は、同種移植モデルにおいてＷｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルスより強力な増殖能力を有する。

生成されたマウス結腸直腸がん細胞株移植マウスは、２群（ｎ＝１２）に、すなわち、組換えワクシニアウイルス（ＷＯＴＳ－４１８、１×１０^７ｐｆｕ）の腹腔内投与を受ける群、並びに組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群に分割した。組換えワクシニアウイルスは腹腔内に１回投与した；ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与の１日目から開始して腹腔内に連続５回投与した。

それぞれの群のマウスの生存曲線を分析した。その結果、組換えワクシニアウイルスの投与を単独で受けた群では、全てのマウスは投与の２５日後に死んだ；しかし、ヒドロキシ尿素及び組換えワクシニアウイルスの同時投与を受けたマウスの３０％以上は、５５日間以上生存した（図７）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に、組換えワクシニアウイルスだけが投与される場合と比較して増強された安全性が得られることが特定された。

実験的実施例７。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（ＩＶ）における組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
実験的実施例７．１。マウス腎臓がん細胞移植マウスの生成及び薬物投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を２日間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、４群（ｎ＝４）に分割した。食塩水の腫瘍内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）及び組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ、７５μｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群、並びに組換えウイルス（ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に投与し、ｒｈＧ－ＣＳＦ又はヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与の３日前から開始して屠殺まで腹腔内に１週につき５回投与した。

実験的実施例７．２。腫瘍体積の変化の検査
実験的実施例７．１の各群のマウスは薬物投与から１６日目に屠殺し、腫瘍体積を測定した。その結果、陽性対照群のマウスと組換えワクシニアウイルス及びｒｈＧ－ＣＳＦの同時投与を受けた実験群のマウスは、最初の腫瘍体積と比較してほぼ１０倍の増加を示した。組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与を受けた実験群のマウスは、最初の腫瘍体積と比較してほぼ８倍の増加を示し、これは、観察された中で最も抑制された腫瘍体積であった（図８）。

実験的実施例７．３。抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化の特定
組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に腫瘍特異的抗がん効果が得られるかどうか特定するために、実験的実施例７．１の各群のマウスを１６日目に屠殺し、次に脾臓中のリンパ球を各群から単離した。次に、単離したリンパ球を新規の正常マウスにそれぞれ注射した。がん移植を実行し、腫瘍体積を観察した。具体的には、１週後に、マウスにＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植し、１９日目に腫瘍体積を測定した。

その結果、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与を受けた群のマウスから収集した脾細胞を注射したマウスで、腫瘍増殖は著しく抑制された。他方、残りの群のマウスから収集した脾細胞を注射したマウスの各々では、腫瘍増殖は有意に抑制されなかった（図９）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与を受けた群の場合、細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞が生成されただけでなく、適応免疫も活性化されたことが特定された。

実験的実施例８。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（Ｖ）における組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
実験的実施例８．１。マウス腎臓がん細胞移植マウスの生成及び薬物投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を１週間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植した。それが５０ｍｍ^３～１００ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）は、マウス腎臓がん細胞移植マウスモデルではほとんど増殖しない。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、４群（ｎ＝４）に分割した。食塩水の腫瘍内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、ヒドロキシ尿素の投与を単独で受ける群及び組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）の投与を単独で受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に投与し、ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与の３日前から開始して屠殺まで腹腔内に１週につき５回投与した。

実験的実施例８．２。腫瘍体積の変化の検査
腫瘍体積は、実験的実施例８．１の各群のマウスへの薬物投与の０、４、１０、１５及び２２日目に測定した。その結果、陽性対照群のマウスの腫瘍体積は最初の腫瘍体積と比較して約１１～１３倍増加した。他方、実験群のマウスの腫瘍体積は最初の腫瘍体積と比較して約４倍増加した（図１０）。

実験的実施例８．３。腫瘍特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化の特定
組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に腫瘍特異的抗がん効果が得られるかどうか特定するために、実験的実施例８．１の各群のマウスを１６日目に屠殺し、次に、脾細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を各群から単離した。次に、単離した脾細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球を新規の正常マウスにそれぞれ注射した。がん移植を実行し、腫瘍体積を観察した。具体的には、１週後に、マウスにＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植し、７、１０、１４、１８及び２１日目に腫瘍体積を測定した。

その結果、実験群のマウスから収集した脾細胞又はＴリンパ球を注射したマウスで、腫瘍増殖は著しく抑制された。他方、残りの群のマウスから収集した脾細胞又はＴリンパ球を注射したマウスでは、腫瘍増殖は有意に抑制されなかった（図１１）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与を受けた群の場合、抗がん効力を有する適応免疫が、Ｔリンパ球だけでなく脾臓で形成される他の免疫細胞によっても活性化されることが特定された（図１１及び１２）。

実験的実施例９。マウス腎臓がん細胞移植マウス：Ｒｅｎｃａ（ＶＩ）における組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素のがん治療効果の特定
実験的実施例９．１。マウス腎臓がん細胞移植マウスの生成及び薬物投与
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）を１週間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－）は、マウス腎臓がん細胞移植マウスモデルではほとんど増殖しない。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝６）に分割した。食塩水の腫瘍内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）及びヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に投与し、ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して屠殺まで腹腔内に１週につき６回投与した。

実験的実施例９．２。腫瘍体積の変化の検査
実験的実施例９．１の各群のマウスは薬物投与から２２日目に屠殺し、腫瘍体積を測定した。その結果、陽性対照群のマウスの腫瘍体積は、陰性対照群のマウスの腫瘍体積と比較して約２５％抑制された。特に、実験群のマウスの腫瘍体積は陰性対照群のマウスの腫瘍体積と比較して約３７．５％抑制され、陽性対照群のマウスの腫瘍体積と比較したときは約１５％抑制された（図１３）。

実験的実施例９．３。脾臓組織微小環境の特定
組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を同時投与した場合の、腫瘍微小環境中の免疫細胞の分布を分析した。分析のために、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用した免疫組織化学染色を実行した。具体的には、脾臓を各群のマウスから収集した。脾臓組織は０．４μｍに切断して乾燥させた。その後、組織をＰＢＳで洗浄し、次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理した。組織は、１：５０の比に希釈した一次抗体（抗ＣＤ３抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ＣＤ４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））による処理にかけ、反応は４℃で一晩進行させた。翌日、組織をＰＢＳで洗浄し、次に室温で二次抗体（Ｄａｋｏ）と３０分間反応させた。組織をＰＢＳで再び洗浄し、ＡＢＣキット（Ｄａｋｏ）を使用して反応させ、次にＨ_２Ｏ_２の添加によって発色させた。次に、組織を脱水させ、その後封入した。

その結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が実験群のマウスの腫瘍組織により豊富に分布していたことが特定された（図１４）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に、脾臓組織中のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が組換えワクシニアウイルスだけが投与される場合より分化し、活性化されることが特定された。すなわち、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素が同時投与される場合に、組換えワクシニアウイルスだけが投与される場合より適応免疫がより活性化されることが特定された。

実験的実施例１０。マウス乳がん細胞移植マウス：４Ｔ１（Ｉ）における組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）及びヒドロキシ尿素によって引き起こされる抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性化の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）を１週間の順化にかけ、次に４Ｔ１がん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を１×１０^６細胞で同種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２）は、マウス乳がん細胞移植マウスモデルではほとんど増殖しない。さらに、乳がん細胞株移植マウスは、転移が肺組織を含む体全体で進行する動物モデルであり、転移は腫瘍表面の小結節の数によって一般的に評価される。

生成されたマウス乳がん細胞移植マウスは、４群（ｎ＝５）に分割した。食塩水の腫瘍内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＯＴＳ－４１２、１×１０^７ｐｆｕ）又はヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ）の投与を受ける群は、陽性対照群として設定した。組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは先ず腫瘍内に投与し、次に第２に、第１の投与から７日目に投与した。ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて組換えワクシニアウイルスの投与の３日前から開始して屠殺の３日前まで、１日に１回腹腔内に投与した。

薬物投与から１８日目に、各群のマウスを屠殺し、血液及び脾臓をそこから収集した。血液及び脾細胞中の免疫細胞の分布を、フローサイトメトリーによって分析した。その結果、腫瘍免疫応答を誘導する血液及び脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の分布は、実験群のマウスで最も高いことが特定された。さらに、免疫抑制機能を有する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数が、陰性対照群及び陽性対照群のマウスと比較して実験群のマウスで著しく低いことが特定された（図１５）。

実験的実施例１１。マウス乳がん細胞移植マウス：４Ｔ１（ＩＩ）における組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素の適応免疫増加効果の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、１０週齢）を２日間の順化にかけ、次に４Ｔ１がん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を左大腿の皮下に１×１０^６細胞で移植した。２日後に、マウスに同数の４Ｔ１がん細胞株を右大腿の皮下に移植した。その体積が５０ｍｍ^３～２００ｍｍ^３に到達するまで右大腿の皮下に移植した腫瘍を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。

生成されたマウス乳がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝６）に分割した。食塩水の腫瘍内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^５ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（９０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは左腫瘍に１回投与し、ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して投与から１４日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

両方の大腿の皮下に移植した腫瘍の体積は、各群のマウスへの薬物投与の０、３、７、１０及び１４日目に測定した。その結果、実験群のマウスの左腫瘍の体積は陽性対照群のマウスの左腫瘍の体積と比較して成長が約３５％抑制されることが特定された（図１６）。さらに、実験群のマウスの右腫瘍の体積は陽性対照群のマウスの右腫瘍の体積と比較して成長が約４５％抑制されることが特定された（図１７）。これらの結果から、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素の同時投与がどのような効果を周囲の腫瘍に及ぼすかが特定された。

すなわち、腫瘍がワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素による同時投与によって局所的に処置される場合、ウイルスが投与されなかった腫瘍においてさえ抗がん効果が観察されることが特定された。

実験的実施例１２。マウス腎臓がん細胞移植マウス（Ｉ）における組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）及びヒドロキシ尿素の同時投与後の増加したがん選択性の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢）を１週間の順化にかけ、次にＲｅｎｃａがん細胞株（Ｋｏｒｅａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ）を５×１０^６細胞で同種移植した。それが１００ｍｍ^３～１５０ｍｍ^３に到達するまで腫瘍体積を観察し、その後組換えワクシニアウイルスの投与を開始した。他方、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株由来組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－）は、同種移植モデルにおいてＷｙｅｔｈ株由来組換えワクシニアウイルスより強力な増殖能力を有する。

生成されたマウス腎臓がん細胞移植マウスは、３群（ｎ＝８）に分割した。食塩水の腹腔内投与を受ける群は陰性対照群として設定し、組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＶＶ^ｔｋ－、１×１０^７ｐｆｕ）の投与を受ける群は陽性対照群として設定した。さらに、組換えワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（６０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は、実験群として設定した。組換えワクシニアウイルスは腫瘍内に２回投与し、ヒドロキシ尿素は、組換えワクシニアウイルスの投与日を除いて、組換えワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して投与から２１日目にかけて、腹腔内に１週につき６回投与した。

各群のマウスを２２日目に屠殺し、腫瘍をそこから単離した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用した免疫組織化学染色を通して、ウイルス増殖を比較した。具体的には、腫瘍組織を各群のマウスから収集した。腫瘍組織は０．４μｍに切断して乾燥させた。その後、組織をＰＢＳで洗浄し、次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理した。組織は１：５０の比で希釈した一次抗体（カタログ番号ＡＢＩＮ１６０６２９４、抗体－オンライン）による処理にかけ、反応を４℃で一晩進行させた。翌日、組織をＰＢＳで洗浄し、次に室温で二次抗体（Ａｌｅｘａ ５９４、カタログ番号Ａ２１２０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と３０分間反応させた。組織をＰＢＳで再び洗浄し、ＡＢＣキット（Ｄａｋｏ）を使用して反応させ、次にＨ_２Ｏ_２の添加によって発色させた。次に、組織を脱水させ、その後封入した。

その結果、組換えワクシニアウイルスが実験群のマウスの腫瘍組織により豊富に分布していたことが特定された（図１８）。これらの結果から、ヒドロキシ尿素が組換えワクシニアウイルスの全身投与時に同時投与された場合に、組換えワクシニアウイルスのより効果的な腫瘍特異的増殖が観察されることが特定された。

実験的実施例１３。正常マウス（ＩＩ）における野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ）及びヒドロキシ尿素の同時投与後の増加した生存及びがん選択性の特定
ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ（Ｂｕｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入したＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（雌、７週齢）を２日間の順化にかけ、その後野生型Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス（ＷＲ）の投与を開始した。他方、野生型Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルスは、同系マウスで限定的な増殖能力を有する。

マウスは２群（ｎ＝１２）に分割した。野生型Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス（１×１０^７ｐｆｕ）の投与を受ける群は対照群として設定し、野生型Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素（５０ｍｇ／ｋｇ）の同時投与を受ける群は実験群として設定した。野生型ワクシニアウイルスは鼻腔内に１回投与し；ヒドロキシ尿素は、野生型ワクシニアウイルスの投与の１日前から開始して、野生型ワクシニアウイルスの投与日を除いて腹腔内に１週につき５回投与した。

８日目に、対照群及び実験群のマウスを屠殺し、腎臓及び肝臓組織をそこから単離した。免疫組織化学的染色を実行した。パラフィンブロックを作製し、キシレン及びエチルアルコールを使用して各ブロックを脱パラフィンした。生じたブロックは、デクローキングチャンバーを使用して抗原回収にかけた。次に、一次抗体（カタログ番号ＡＢＩＮ１６０６２９４、抗体－オンライン）をこのブロックに結合させ、ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ａｌｅｘａ ５９４、カタログ番号Ａ２１２０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれに結合させた。次に、蛍光顕微鏡を使用して観察を行った。

その結果、対照群のマウスの肝臓及び腎臓組織と比較して、実験群のマウスの肝臓及び腎臓組織にウイルスが少数分布し、増殖することが特定された（図１９）。

Claims (18)

1. 活性成分として：
   ワクシニアウイルス；及び
   ヒドロキシ尿素
   を含み、
   前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失した組換えワクシニアウイルスであり、
   前記組換えワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子遺伝子が欠失したものであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする遺伝子が挿入されたものである、
   がんを処置するための医薬組成物。
2. 前記ワクシニアウイルスが、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、Ｌｉｓｔｅｒ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｔｉａｎ Ｔａｎ、ＵＳＳＲ、Ｔａｓｈｋｅｎｔ、Ｅｖａｎｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｊ（ＩＨＤ－Ｊ）又はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ－Ｗｈｉｔｅ（ＩＨＤ－Ｗ）ワクシニアウイルス株に属する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ワクシニアウイルスが、Ｆ１３．５Ｌ遺伝子、Ｆ１４．５遺伝子、Ａ５６Ｒ遺伝子、Ｂ１８Ｒ遺伝子又はその組合せからなる群から選択されるいずれか１つがさらに欠失したものである、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記ワクシニアウイルスが、変異したＨＳＶ－ＴＫ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシルエステラーゼ１型、カルボキシルエステラーゼ２型、インターフェロンベータ（ＩＮＦ－β）、ソマトスタチン受容体２及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つをコードする遺伝子がさらに挿入されたものである、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵がん及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. がんを処置するための前記医薬組成物が前記ワクシニアウイルスの増加したがん選択性によって特徴付けられる、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. がんを予防又は処置するためのキットであって：
   活性成分としてワクシニアウイルスを含む第１の組成物；及び
   活性成分としてヒドロキシ尿素を含む第２の組成物
   を含み、
   前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失した組換えワクシニアウイルスであり、
   前記組換えワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子遺伝子が欠失したものであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする遺伝子が挿入されたものである、
   キット。
8. ヒドロキシ尿素とともに用いられ、がんを処置するための、ワクシニアウイルスを含む医薬組成物であって、
   前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失した組換えワクシニアウイルスであり、
   前記組換えワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子遺伝子が欠失したものであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする遺伝子が挿入されたものである、医薬組成物。
9. 前記ワクシニアウイルスを前記ヒドロキシ尿素と同時に、逐次的に又は逆順に併用投与するためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記ヒドロキシ尿素が前記ワクシニアウイルスの投与の前、その間又は後に投与されるためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
11. 前記ヒドロキシ尿素が、前記ワクシニアウイルスの投与の３～５日前から開始して、及び前記ワクシニアウイルスの投与の後の９～２８日間、１日に１回連続的に投与されるためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
12. 前記ヒドロキシ尿素が１０ｍｇ／ｋｇ／日～９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与されるためのものである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記ワクシニアウイルスを１×１０^５ｐｆｕ～１×１０^１０ｐｆｕの用量で投与するためのものである、請求項８～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 前記ワクシニアウイルスを７～３０日の間隔で個体に投与するためのものである、請求項８に記載の医薬組成物。
15. 前記ヒドロキシ尿素が腫瘍内、腹腔内又は静脈内に投与されるためのものである、請求項８～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. 前記ワクシニアウイルスを腫瘍内、腹腔内又は静脈内に投与するためのものである、請求項８～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. がんの予防又は処置のための医薬の製造のための、ワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を含む組成物の使用であって、
    前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失した組換えワクシニアウイルスであり、
    前記組換えワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子遺伝子が欠失したものであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする遺伝子が挿入されたものである、使用。
18. がんを有する非ヒト個体にワクシニアウイルス及びヒドロキシ尿素を投与することを含む、がんを処置するための方法であって、
    前記ワクシニアウイルスが、チミジンキナーゼ遺伝子が欠失した組換えワクシニアウイルスであり、
    前記組換えワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子遺伝子が欠失したものであるか、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする遺伝子が挿入されたものである、方法。