KR102661908B1 - 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 - Google Patents

백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING VACCINIA VIRUS AND GRANULOPOIESIS INHIBITOR}
본 발명은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
항암바이러스(Oncolytic virus)는 종양 특이적인 표적 능력, 암세포에서의 증식능력 및 암세포 사멸능력이 우수하여, 최근 항암바이러스를 기반으로 하는 다양한 임상연구가 진행되고 있다. 2015년에는 미국과 유럽에서 헤르페스 심플렉스 바이러스를 기반으로 하는 항암바이러스인 티벡(talimogene laherparepvec, T-Vec)이 진행성 흑색종 치료제로 상업화에 성공하면서 항암바이러스 분야의 시대가 시작되었다.
최근 항암바이러스의 유용성은 그 자체로서의 효능을 넘어 종양 면역을 활성화시켜 다른 면역치료제와의 병용 치료제로써의 가능성도 보여주고 있다. 항암바이러스 개발 초기인 2000년도까지는 바이러스의 암세포 특이적 증식을 통한 직접 사멸 효과가 상대적으로 더 중요하였다. 하지만, 이후의 임상연구에서는 직접적인 암세포 사멸 효과보다 종양면역의 활성화가 핵심적 기전임을 알게 되었고, 이를 이용하여 최근에는 항암바이러스를 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 등과 같은 면역치료제와 병용 투여하는 치료제가 개발되고 있다. 이는 항암바이러스가 면역이 억제되어 있는 종양미세환경을 면역치료가 적합한 종양미세환경으로 전환시켜주기 때문인 것으로 알려져 있다.
다수의 백시니아 바이러스 기반 항암바이러스의 임상연구에서 항암바이러스 치료 후, 급속한 종양 괴사(acute tumor necrosis), 지속적 반응(durable response) 또는 완치(complete response)가 나타나기도 하지만, 때로는 종양의 진행(progressive disease) 또는 조기사망(early death)과 같은 예측하기 어려운 결과(pharmacodynamics variability)로 이어지기도 한다. 실예로, 백시니아 바이러스를 기반으로 하는 펙사벡(Pexa-vec)의 경우 1상 임상시험에서 항암바이러스 치료 후 지속적인 전신성 염증반응(systemic inflammatory response) 및 주요 기관의 기능 부전(organ dysfunction)과 관련되어 한 달 이내에 조기에 사망한 환자들이 일부 있었다. 또한, 항암바이러스 치료 후 일시적인 독감 증상(고열)과 저혈압은 항암바이러스 치료의 가장 빈번한 이상반응이다.
한편, 항암바이러스를 이용한 치료에 있어서, 약물에 의해 유도되는 호중구의 증가가 치료 결과에 미치는 영향에 대해 정확히 보고된 바가 없다. 항암바이러스 투여 시 인체 내 가장 먼저 반응하는 선천면역 세포가 호중구인데, 이는 인체 내 20시간 미만의 짧은 반감기를 가진다. 임상적으로, 클로자핀과 같은 약물로 치료받은 환자 및 급성 염증, 급성손상에서는 높은 호중구의 수가 관찰되기도 하였으나(Liao Y et al, PloS One, 8(7), 2013), 이는 일반적인 이상반응 범주(Common Terminology Criteria of Adverse Events, CTCAE)에 포함되어 있지 않기 때문에 증가된 절대 호중구 수(ANC)가 비정상적 반응으로 인식되지 않고 있다.
따라서, 호중구 수의 변화가 항암바이러스 치료에 미치는 영향에 대한 연구가 필요한 실정이다.
Liao Y et al, PloS One, 8(7), 2013
이에 본 발명자들은 항암바이러스로 사용되는 백시니아 바이러스의 항암효과를 증진시키기 위해 연구한 결과, 암이 발병된 개체에 백시니아 바이러스를 투여할 때에 호중구 수치를 낮추는 억제제를 병용하는 경우 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 전신성 염증반응을 현저하게 감소시켜 안전하게 사용할 수 있고, 나아가, 상기 억제제를 병용 투여하는 경우, 백시니아 바이러스의 암세포 특이적인 선택성 및 증식능이 개선되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 상기 억제제는 과립백혈구 형성(granulopoiesis)을 저해함으로써 호중구 수치를 낮추어 항암바이러스의 항암 효과를 개선하는 것으로 생각된다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 암이 발병된 개체에 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 기존의 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 항암효과 및 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(Western Reserve Vaccinia Virus, WR) 및 히드록시유레아(HU)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 2는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 체중을 측정한 도면이다.
도 3은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 WR에서 TK 유전자를 제거한 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(60 ㎎/㎏)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 4는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU(30 ㎎/㎏)를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 5는 마우스-흑색종(B16F10)-식립 마우스에서의 WR에서 TK 유전자 및 VGF(vaccinia virus growth factor) 유전자를 동시에 제거한 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 및 HU를 투여하기 1일 전, 투여한 후, 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 6은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 7은 인간-폐암세포(NCI-H460)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 HU를 투여한 후, 생존율을 측정한 도면이다.
도 8은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 9는 재조합 백시니아 바이러스(VVtk-)와 인간 과립구 콜로니 자극인자(rhG-CSF) 또는 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 비장 내 림프구 세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 10은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 11은 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 T 림프구를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 12는 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스로부터 분리한 비장세포를 새로운 마우스에 투여한 후, 새로운 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 13은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 14는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-) 및 HU를 투여한 후, 비장조직 내 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식 정도를 관찰한 도면이다.
도 15는 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 HU를 투여한 후, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포가 혈액 및 비장에서의 증식정도를 측정한 도면이다.
도 16은 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 왼쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 17은 마우스-유방암세포(4T1)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 HU를 왼쪽 종양에 투여한 후, 오른쪽 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 18은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 22일째에 마우스 종양조직에서 재조합 백시니아 바이러스의 분포를 확인하기 위해 염색한 도면이다.
도 19는 정상 마우스에 야생형 백시니아 바이러스(WR) 또는 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 HU를 투여한 후, 간조직 및 신장조직에서 야생형 백시니아 바이러스의 분포를 확인한 도면이다.
도 20은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, HU, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412), 재조합 백시니아 바이러스와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(OTS-412+rh-G-CSF) 또는 재조합 백시니아 바이러스와 HU(OTS-412+HU)를 투여한 후, 각 군의 마우스의 절대 호중구 수치를 나타낸 도면이다.
도 21은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 22는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 23은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 레날리도마이드 또는 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 24는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 식염수, 재조합 백시니아 바이러스, 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 레날리도마이드 또는 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)와 HU를 투여한 후, 각 군의 마우스의 혈액 내 호중구 수를 측정한 도면이다.
도 25는 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 레날리도마이드를 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 26은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 팔보시클립을 투여한 후, 마우스의 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 27은 마우스-신장암세포(Renca)-식립 마우스에 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-) 및 팔보시클립을 투여한 후, 마우스의 체중을 측정한 도면이다.
도 28은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), PD-1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 29는 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일 및 17일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 30은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 항암바이러스(Wyeth VVtk-), PD-L1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 4일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 31은 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(WR VVtk-), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 32는 마우스-유방암세포-식립 마우스(4T1)에 항암바이러스(WOTS-418), PD-L1 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 및 18일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
도 33은 마우스-신장암세포-식립 마우스(Renca)에 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR), CTLA-4 억제제 및 HU를 투여한 후, 0일, 3일 및 7일째에 종양의 크기를 측정한 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 포함된 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 Wyeth 종 백시니아 바이러스를 사용하였다.
상기 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스일 수 있다. 구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 유전자가 결실되거나, 외래 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 이때, 상기 야생형 백시니아 바이러스 유전자 중 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK), 백시니아 성장인자(vaccinia growth factor, VGF), WR53.5, F13.5L, F14.5, A56R, B18R 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 바이러스의 독성과 관련된 유전자가 결실될 수 있다.
또한, 상기 삽입되는 외래 유전자는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase), 카르복실에스테라아제(carboxyl esterase) 1형, 카르복실에스테라아제 2형, INF-β(Interferone beta), 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 면역을 촉진시키는 유전자일 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WR VVtk-"로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "Wyeth VVtk-"로 명명하였다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자를 결실시킨 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "VV_DD"로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 변이된 HSV-TK 유전자가 삽입된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 Wyeth 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 서열번호 1의 HSV-TK 단편(1-330 aa)을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "OTS-412"로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 그 위치에 HSV-TK 유전자의 서열번호 2의 HSV-TK 변이체를 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하였으며, 이를 "WOTS-418"로 명명하였다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, GM-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, G-CSF 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, CD(Cytosine deaminiase) 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, 소마토스타틴 수용체 2 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
나아가, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 2개 이상의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종 백시니아 바이러스의 TK 유전자 및 VGF 유전자가 결실되고, HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 변이된 HSV-TK, GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor), CD(cytosin deaminase) 또는 소마토스타틴 수용체 2(somatostatin receptor 2)를 코딩하는 유전자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자가 삽입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "유전자 결손"이란, 유전자 일부 결실, 전부 결실, 또는 유전자 내부에 외래 유전자가 삽입되어 유전자가 발현되지 않는 것을 의미한다. 상기 유전자의 일부가 결실될 경우, 발현되는 폴레펩타이드의 N-말단 또는 C-말단의 일부 아미노산이 결실될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TK(thymidine kinase)"란, 티미딘 키나아제로 불리며, 뉴클레오티드의 생합성에 관여하는 효소를 의미한다. 상기 TK는 세포 및 바이러스의 뉴클레오티드의 생합성에 모두 쓰이는 효소이다. 이때, 세포의 경우 정상세포는 더 이상 분열하지 않아 TK가 존재하지 않으며, 모근세포처럼 빠르게 분열하는 세포라 하더라도 TK의 양이 바이러스가 이용할 만큼 충분하지 않다. 이러한 점을 이용해 바이러스에서 TK 유전자를 결손 시킴으로써 바이러스가 암세포의 TK가 존재하는 경우에만 증식할 수 있게 함으로써, 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "VGF(vaccinia growth factor)"란, 상피 성장인자와 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드로서, 감염된 세포 주변의 세포 증식을 자극한다. 백시니아 바이러스는 증식 세포에서 더 잘 복제하기 때문에, 생체 내 바이러스 복제에 유리할 수 있다. 항암바이러스가 보다 암세포에서만 특이적으로 증식할 수 있도록 하기 위해, TK 유전자 이외에 추가적으로 VGF 유전자를 결실시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "GM-CSF"란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)로 대식세포, T세포, 비만 세포, 자연살해세포, 내피세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. GM-CSF는 줄기세포가 과립구(호중구, 호염기구, 호산구)과 단핵구를 생산하도록 자극한다. 또한, GM-CSF는 대식세포의 수를 급격히 늘려 면역반응을 유도한다. 상기 GM-CSF는 인간 유래일 수 있으며, GenBank: AAA52578.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CD"란, 시토신데아미나아제로 불리며, 시토신을 가수 분해적으로 탈아미노하여 우라실과 암모니아로 하는 반응을 접촉하는 효소를 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "G-CSF"란, 과립구 콜로니 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)로 염증이나 내독소(endotoxin)에 자극을 받아서 대식세포, 섬유모세포, 내피세포 등이 생산하는 사이토카인을 의미한다. 상기 G-CSF는 호중구의 생산을 촉진시킨다. 상기 G-CSF는 인간 유래일 수 있으며(rhGCSF), GenBank: AAA03056.1의 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "소마토스타틴 수용체 2"란, 인간에서 SSTR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 소마토스타틴 수용체 2는 주로 종양에서 발현되며, 소마토스타틴 수용체 2를 과발현하는 신경 내분비 종양 환자는 개선된 예후를 보인다. 소마토스타틴 수용체 2는 암세포를 포함한 많은 세포에서 아포토시스를 자극하는 능력을 가지고 있다.
상기 골수성 세포는 과립 백혈구일 수 있으며, 구체적으로, 상기 골수성 세포는 호중구, 호산구 또는 호염기구일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 주로 골수에서 만들어지는 과립백혈구, 예컨대, 호중구, 호산구 또는 호염기구를 억제시키는 물질일 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제는, 골수성 세포 중 하나인 호중구의 체내 개수를 감소 또는 억제시킬 때, 호중구 억제제(neutrophil inhibitor)라 지칭되거나 이를 포함할 수 있다. 상기 호중구는 중호성 백혈구라고도 불리며, 주로 골수에서 만들어지는 과립백혈구(과립구)의 일종인 혈중에서 순환하는 호중구 세포(circulating neutrophil)를 의미한다. 호중구는 과립 백혈구의 주성분으로 정상 수는 혈액 1㎜3 중에 약 1,500 내지 8,000개 정도 존재한다. 호중구는 체내에 침입한 세균 등 이물을 식작용(Phagocytosis)으로 흡수하여 과산화수소나 리소좀 등의 소화효소로 분해한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "절대 호중구 수"란, 백혈구 수×호중구 백분율을 곱한 수를 의미한다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib), 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)일 수 있다. 상기 히드록시유레아는 하기 화학식 1을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
상기 히드록시유레아의 정확한 기전은 밝혀져 있지 않으나, DNA 합성을 저해하는 항암제로 알려져 있다. 또한, 상기 히드록시유레아는 히드록시유레아를 포함하는 상업화된 약제의 형태로 약학 조성물에 포함될 수 있다. 상기 히드록시유레아 성분을 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, Droxia TM, Mylocel TM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 히드록시유레아는 경구로 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 레날리도마이드는 하기 화학식 2를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
상기 레날리도마이드는 다발성 골수종 등의 치료에 사용되는 항암제이다. 또한, 상기 레날리도마이드는 항종양 효과로서 종양억제 유전자를 활성화시킴으로써 세포의 성장 주기를 정지시키고 암 증식을 억제한다. 면역조절 효과로서 T세포, NK 세포(natural killer cell), B세포 등 면역세포를 활성화시킴으로써 종양세포를 제거하도록 한다. 그 외 암세포로 영양을 공급하기 위한 새로운 혈관이 생성되는 것을 억제하는 혈관 생성 억제 효과도 있다.
상기 탈리도마이드는 하기 화학식 3을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
상기 탈리도마이드는 정확한 기전은 밝혀져있지 않으나, 다발성 골수종(multiple myeloma) 치료와 나병(한센병) 환자의 중증 피부 병변 치료에 사용되고 있다.
상기 타다라필은 하기 화학식 4를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
상기 팔보실클립은 하기 화학식 5를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 5]
상기 알킬화제는 악성종양을 대상으로 하는 화학요법약 중 나이트로젠머스터드, 에틸렌유도체, 알킬술폰산유도체, 니트로소레아류 또는 트리아젠류 화합물일 수 있다. 이들은 많은 유기화합물, 단백질이나 핵산의 수소를 알킬기에 치환하므로 알킬화제의 명칭으로도 불릴 수 있다. 상기 알킬화제에 의한 알킬화에 의해 종양세포의 DNA복제와 mRNA의 전사가 저해되고 항종양작용을 나타낼 수 있다. 공통의 약리작용으로서 세포주기의 각상(各相)에 비특이적으로 작용하는데 증식성이 높은 세포분열을 저지할 수 있다. 방사선과 유사한 작용을 나타내므로 조혈장애가 강하고 면역억제를 일으킬 수 있다.
상기 안트라사이클린은 스트렙토 마이세스 박테리아에서 추출한 암 화학 요법에 사용되는 약물로 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소 암, 방광암 및 폐암을 포함한 많은 암을 치료하는데 사용되고 있다. 최초로 발견된 안트라 사이클린은 다우노루비신(상표명: Daunomycin)으로 방선균의 한 종인 Streptomyces peucetius에 의해 자연적으로 생성된 것이다. 임상적으로 가장 중요한 안트라사이클린은 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신 등이 있다.
상기 대사길항제는 미생물이나 종양세포의 대사나 성장에 대하여 불가결의 필수대사물질과 길항(拮抗)하여 세포의 발육, 증식을 억제하는 물질일 수 있다. 화학요법약으로써 사용되며, 역사적으로는 세균의 파라아미노안식향산 PABA와 길항하는 슬루파민이 최초에 생겨났다. 상기 대사길항제는 세균에 대한 설파약, 악성종양에 대한 퓨린대사길항약(8-아자구아닌, 6-티오구아닌, 6-메르캅토퓨린), 필리미진대사길항약(5-플오로라실, 시타라빈, 아자우리진), 엽산대사길항약(4-아미노프테린, 메토트렉세트) 또는 글투타민대사길항약(아제린, DON)일 수 있다.
상기 캄토테신은 Camptotheca acuminata(Camptotheca, Happy tree) Chonemorpha fragrans 등의 식물로부터 분리된 천연 항암물질일 수 있다.
상기 캄토테신은 하기 화학식 6을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 6]
상기 에피포도필로톡신은 Podophyllum peltatum의 뿌리에서 자연적으로 생성되는 천연 항암물질일 수 있다. 상기 에피포도 필로톡신의 유도체는 현재 암 치료에 사용될 수 있다.
상기 에피포도 필로톡신은 하기 화학식 7을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 7]
상기 마이토마이신C는 Streptomyces griseus에 의해 분리된 항생물질일 수 있다. 상기 마이토마이신C는 열에 안정적이며, 가장 독성이 낮고 항암효과가 강하다. 상기 마이토마이신C는 세포효소계 및 핵산대사를 저해함으로서 세포핵의 분열을 억제해서 악성종양세포의 증식을 저지할 수 있다. 상기 마이토마이신C의 부작용으로는 백혈구 감소, 혈소판 감소를 동반한 출혈 등이 있다.
상기 탁센은 세포분열 억제제 또는 항미세관 억제제로도 불리며, 세포분열을 억제하여 암세포 성장을 억제하는 항암제일 수 있다. 상기 탁센은 세포 유사분열 시 염색체가 이동하는 미세관을 방해하여 암세포를 사멸시킬 수 있다. 상기 탁센은 유방암, 난소암, 비소세포 폐암 등 여러 종류의 암 치료에 사용되고 있으며, 구체적으로, 상기 탁센에는 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 등이 있다.
상기 빈블라스틴은 다양한 종의 암치료에 사용되는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 성분의 항암제일 수 있다. 상기 빈블라시틴은 협죽도과에 속하는 periwinkle 식물에서 처음으로 추출된 물질이며, 현재는 합성된 물질을 사용하고 있다. 상기 빈블라스틴은 항암제 중 가장 많이 사용되고 있는 제제이며 다른 항암제와 병용요법으로도 많이 사용되고 있다. 상기 빈블라스틴은 미세관의 정상 기능을 방해하여 암세포의 분열을 막는다. 고환암, 유방암, 림프종, 카포시육종 등에 많이 사용될 수 있다. 상기 빈블라스틴은 백혈구와 혈소판감소가 가장 중요한 부작용이며 위장관 장애, 혈압상승, 땀과다, 우울증, 근육통, 욕지기, 두통 등이 부작용으로 나타날 수 있다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 이상, 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1×105 또는 1×107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아, 레날리도마이드, 팔보시클립을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 면역관문억제제는 T 세포의 활성화를 방해하는 암세포의 기전을 억제하는 물질을 의미하며, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 항-CTLA4 항체, 항 PD-L2 항체, LTF2 조절 항체, 항-LAG3 항체, 항-A2aR 항체, 항-TIGIT 항체, 항-TIM-3 항체, 항-B7-H3 항체, 항-B7-H4 항체, 항-VISTA 항체, 항-CD47 항체, 항-BTLA 항체, 항-KIR 항체, 항-IDO 항체 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
암세포는 면역반응을 회피하는 기전으로써, 면역관문체계를 차용(hijacking)한다. 구체적으로, 암세포는 면역반응을 회피하기 위해, 면역관문수용체를 이용하는데, 대표적인 수용체로는 PD-L1, PD-1, CTLA-4 등이 있다. 이러한 암세포의 면역 회피를 막기위해, 면역관문수용체에 특이적으로 결합하는 분자인 면역관문억제제를 이용하여 암 치료에 이용하고 있다. 최초의 면역관문억제제는 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4)에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 이필리무맙(ipilimumab, Yervoy®)이다. 다음으로 개발된 면역관문치료제는 PD-1(programmed cell death-1)과 해당 리간드 PD-L1(programmed death ligand-1)에 대한 단일클론 항체들이다. 대표적 약제로서, 항-PD-1 항체인 니볼루맙(nivolumab, Opdivo®), 펨브롤리주맙(pembrolizumab, Keytruda®) 등이 있으며, 항-PD-L1 항체인 아벨루맙(avelumab, Bavencio®), 아테졸리주맙(atezolizumab, Tecentriq®)과 둘바루맙(durvalumab, Imfinzi®) 등이 있다.
이외에도, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), KIR(killer cellimmunoglobulin-like receptor), LAG-3(lymphocyte-activation gene-3), TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3), TNFRSF4(tumor-necrosis factor receptor superfamily member 4) 등의 다양한 다양한 면역관문수용체에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 대한 연구가 진행 되고 있다.
상기 면역관문억제제의 투여량은 각 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여될 수 있다. 상기 면역관문억제제의 투여량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏일 수 있고, 1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다. 예를 들어, 상기 니볼루맙을 유효성분으로 하는 옵디보주(Opdivo Inj.)의 경우, 3 ㎎/㎏을 2주 간격으로 60분에 걸쳐 정맥 점적 주입하고, 병용요법으로서의 용법·용량은 1 ㎎/㎏을 30분에 걸쳐 정맥 점적 주입할 수 있다. 또한, 상기 펨브롤리주맙을 유효성분으로 하는 키트루다주(Keytruda Inj.)의 경우, 200 ㎎을 3주 간격으로 30분에 걸쳐 정맥 점적 주입할 수 있다. 이처럼 같은 항-PD-1 항체일지라도 제품에 따라 용법·용량이 상이하므로, 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여하는 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물이 면역관문억제제를 추가적으로 포함하는 경우, 상기 약학 조성물에 포함된 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
또한, 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여한 후, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 히드록시유레아를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 상기 백시니아 바이러스의 암 선택성이 증가된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 제3조성물을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 같다.
상기 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물은 상업화된 약제일 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아를 유효성분으로 포함하는 상업화된 약제는 Hydroxyurea®, Hydrea®, DroxiaTM, MylocelTM, Siklos® 하이드린캡슐일 수 있다. 상기 제2조성물은 경구로도 복용할 수 있으며, 비경구 투여도 가능하다.
상기 제1조성물의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1조성물은 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 제1조성물은 1×105 내지 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제1조성물을 1×105 또는 1×107pfu로 투여하였다.
또한, 상기 제2조성물의 투여량은 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day 로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 제2조성물을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
상기 제3조성물의 투여량은 제3조성물에 포함되는 면역관문억제제의 각 제조사의 용법·용량을 준수하여 투여될 수 있다. 상기 제3조성물의 투여량은 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏일 수 있고, 1 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물은 생리적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물은 비경구 투여를 위한 제제로서 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 제1조성물, 제2조성물 및 제3조성물의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 제2조성물은 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로 상기 제2조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 제1조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 제1조성물 및 제2조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
또한, 상기 제1조성물은 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1조성물은 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 제2조성물은 제1조성물을 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제2조성물은 제1조성물 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 제1조성물 투여한 후 24시간 이내 또는 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 제1조성물 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 제1조성물 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 제2조성물을 1일 1회 투여하였다.
상지 제3조성물은 제1조성물 투여 후, 적어도 주 1회, 1주 내지 10주 동안 연속적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 제3조성물은 제1조성물 투여 후, 적어도 주 2회 1주 내지 8주 동안 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 암이 발병된 개체에게 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 치료방법은 암이 발병된 개체에 면역관문억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다.
상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브, NYVAC, Wyeth, LC16m8, 리스터, 코펜하겐, 티안탄, USSR, 타쉬켄트, 에반스, IHD-J 또는 IHD-W 백시니아 바이러스 종(strain)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 백시니아 바이러스를 먼저 투여한 후 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여한 후 상기 백시니아 바이러스를 투여하고 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 치료방법이 면역관문억제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함할 경우, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 항암바이러스, 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제 및 면역관문억제제를 동시에 투여할 수 있다.
또한, 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 동시에 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 상기 면역관문억제제를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 상기 항암바이러스를 투여하고, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스 및 면역관문억제제를 동시에 투여한 후, 다시 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여할 수 있다.
나아가, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제를 먼저 투여하고, 상기 면역관문억제제를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여하고, 상기 항암바이러스를 투여한 후, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
또한, 상기 항암바이러스를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 면역관문억제제를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다. 상기 면역관문억제제를 먼저 투여하고, 상기 과립백혈구 형성 억제제를 투여한 후, 항암바이러스를 투여하고, 다시 과립백혈구 형성 억제제를 투여할 수 있다.
상기 백시니아 바이러스의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 환자에게 1×105 내지 1×1018의 바이러스 입자(virus particle), 감염능을 가지는 바이러스 단위(TCID50) 또는 플라크 형성 단위(pfu)의 백시니아 바이러스를 투여할 수 있다. 구체적으로는, 1×105, 2×105, 5×105, 1×106, 2×106, 5×106, 1×107, 2×107, 5×107, 1×108, 2×108, 5×108, 1×109, 2×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 1×1013, 1×1014, 1×1015, 1×1016, 1×1017 또는 그 이상의 바이러스 입자, 감염능을 가지는 바이러스 단위 또는 플라크 형성 단위의 백시니아 바이러스를 투여하는 것으로써, 상기 사이에 다양한 수 및 범위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 1×105 이상, 1×109 pfu 미만의 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 상기 백시니아 바이러스를 1×105 또는 1×107 pfu로 투여하였다.
또한, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 1 ㎎/㎏/day 내지 100 ㎎/㎏/day 또는 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day, 15 ㎎/㎏/day 내지 80 ㎎/㎏/day, 20 ㎎/㎏/day 내지 70 ㎎/㎏/day, 25 ㎎/㎏/day 내지 65 ㎎/㎏/day 또는 30 ㎎/㎏/day 내지 60 ㎎/㎏/day로 투여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제로서 히드록시유레아, 레날리도마이드, 팔보시클립을 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 50 mg/kg/day, 60 mg/kg/day 또는 100 mg/kg/day 로 투여하였다. 투여량에 따라 하루에 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 1일 1회 내지 4회, 또는 1일 1회 내지 2회 나누어 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스는 1회 내지 10회 또는 2회 내지 5회 투여할 수 있으며, 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여할 수 있다. 구체적으로, 상기 백시니아 바이러스는 7일, 14일, 21일 또는 30일 간격으로 투여할 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스 투여 전, 중 또는 후에 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스를 투여하기 전 또는 투여한 후에 투여될 수 있다. 상기 과립백혈구 형성 억제제는 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여할 수 있으며, 백시니아 바이러스 투여 후 24시간 후부터, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 1일 1회 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 과립백혈구 형성 억제제를 백시니아 바이러스 투여 전 1일 내지 3일 전부터 1일 1회 연속적으로 투여하였으며, 백시니아 바이러스 투여 후 13일, 17일, 18일 또는 28일 동안 1일 1회 투여하였다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있다. 구체적으로, 상기 혈액암은 림프종, 급성 백혈병 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 고형암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 경구 투여될 수 있으며, 비경구적으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 복강내(intraperitoneal), 동맥 내 또는 정맥 내(intra-venous) 투여될 수 있다.
상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 종양 내(intratumoral), 복강내(intraperitoneal), 피하(sub-cutaneous), 피내(intra-dermal), 림프절내(intra-nodal), 동맥 내 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 종양 내 투여, 복강 투여 또는 정맥 투여 일 수 있다. 한편, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "개체"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 질환이 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태이거나 암을 앓고 있는 사람을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에 유효량의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제의 투여 경로는 목표 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암을 예방 또는 치료하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다. 이때, 상기 과립백혈구 형성 억제제는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다. 또한, 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 암 선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
상기 과립백혈구 형성 억제제는 히드록시유레아(hydroxyurea), 레날리도마이드(Lenalidomide), 탈리도마이드(thalidomide), 타다라필(Tadalafil), 팔보시클립(palbociclib), 알킬화제(Alkylating agents), 안트라사이클린(Anthracyclines), 대사길항제(Antimetabolites), 캄토테신(Camptothecins), 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxins), 마이토마이신C(Mitomycin C), 탁센(Taxanes) 또는 빈블라스틴(Vinblastine)일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 재조합 백시니아 바이러스 제조(Wyeth VV tk- , WR VV tk- )
제조예 1.1. 셔틀 플라스미드 벡터 제조
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)에서 야생형 백시니아 바이러스 Wyeth 종(NYC Department of Health) 및 웨스턴 리저브 종을 구입하였다. 재조합을 위해 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 가진 셔틀 플라스미드 또는 GFP 유전자를 가진 셔틀 플라스미드를 벡터를 사용하여 치환하였다.
제조예 1.2. 재조합 백시니아 바이러스 제조
재조합 바이러스를 확보하기 위하여, Hela 세포(ATCC)를 6-웰 플레이트에 4×105 세포/웰 조건 및 10% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지에 배양하였다. 그 후, 야생형 백시니아 바이러스 0.05 MOI를 처리하고, 2시간 후, 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체하였다. 그 후, 상기 제조예 1.1에서 제작한 선형화시킨 셔틀 플라스미드 벡터 4 ㎍을 XfectTM polymer(Clonetech 631317, USA)를 이용하여 형질주입하였다. 4시간 배양 후, 세포를 2% 우태아 혈청이 포함된 EMEM 배지로 교체한 후 72시간 추가 배양하였다. 최종적으로, 감염된 세포를 회수한 다음 동결 및 해동을 3회 반복 후 초음파분쇄로 세포를 용해시키고, 수크로오스 쿠션 방법(sucrose cushion method)으로 분리된 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고 이를 Wyeth VVtk-, WR VV tk-로 명명하였다.
제조예 2. 재조합 백시니아 바이러스 제조(OTS-412)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 1의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 OTS-412로 명명하였다.
제조예 3. 재조합 백시니아 바이러스 제조(WOTS-418)
티미딘 키나아제(TK) 유전자가 결실되고, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 변이된 티미딘 키나아제(HSV-TK) 유전자를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위를 서열번호 2의 변이된 1형 HSV-TK 유전자(pSE/L promoter)와 firefly luciferase reporter(p7.5 promoter) 유전자를 합성하여 pUC57amp+ 플라스미드(Genewiz, USA)에 재조합하여 셔틀벡터로 사용하여 치환하였다. 상기 제조한 셔틀 벡터를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 WOTS-418로 명명하였다.
제조예 4. 재조합 백시니아 바이러스 제조(VV_DD)
티미딘 키나아제(TK) 유전자 및 백시니아 성장인자(VGF) 유전자가 결실된 재조합 백시니아 바이러스를 제조하기 위해, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스의 TK 부위에 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하고, VGF 유전자 부위에 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용해 치환하였다. 상기 EGFP 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 및 lacZ 유전자를 포함하는 셔틀플라스미드를 이용하여 상기 제조예 1.2와 동일한 방법으로 재조합 백시니아 바이러스를 확보하였고, 이를 VV_DD로 명명하였다.
I. 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 1. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(I)
실험예 1.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 80 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 야생형 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 야생형 백시니아 바이러스(WR)는 Wyeth 종 야생형 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×105 pfu) 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 1.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 1.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기도 음성대조군에 비해 억제되었으나, 실험군 마우스의 종양의 크기가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 1).
실험예 1.3. 체중 변화 확인
실험예 1.1의 음성대조군, 양성대조군 및 실험군에 각각의 약물을 투여한 후 3일, 7일, 10일 및 14일째에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 세 군 모두 유의미한 체중 감소가 나타나지 않았다(도 2).
실험예 2. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(II)
실험예 2.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 2.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 실험예 2.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 3).
실험예 3. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(III)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 4).
실험예 4. 마우스 흑색종 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: B16F10
코어텍(Koatech, Korea)에서 분양 받은 C57BL/6 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×105 세포수의 마우스 흑색종 암세포주(ATCC, B16F10)를 피하이식 하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD) 투여를 시작하였다. 상기 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD)는 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스의 TK(thymidine kinase)와 VGF(vaccinia growth factor) 부분을 이중 결실시킨 것이며 동종이식 모델에서 증식이 제한적으로 가능하다.
상기 제작한 마우스 흑색종 식립 마우스를 4개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏) 또는 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD, 1×106 pfu)를 단독 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 O일 및 5일째에 복강 내 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여하기 1일 전, 투여 후 4일 및 7일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스(VV_DD)와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우 시너지 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 5. 인간 폐암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: NCI-H460
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 NCI-H460 인간 폐암 암세포주(한국세포주은행)를 피하로 이종이식(xenograft)을 하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 인간 폐암 세포주(NCI-H460) 이종이식 마우스 에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 인간 폐암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 상기 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 15일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 5일, 10일, 12일 및 15일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 종양의 크기가 대조군에 비해 약 40% 정도 억제되는 것을 확인하였다(도 6).
실험예 6. 마우스 대장암 세포주 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아의 생존율 분석: CT-26
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 마우스 대장암 세포주(CT-26, 한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 7일 뒤 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418)는 Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 대장암 세포주 식립 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 복강 내 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹으로 분류하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 후부터 5회 연속 복강 내 투여하였다.
상기 각 그룹의 마우스의 생존곡선을 분석한 결과, 재조합 백시니아 바이러스를 단독투여받은 그룹의 경우 25일 뒤 모든 마우스가 사망하였으나, 히드록시유레아와 재조합 백시니아 바이러스를 병용투여받은 마우스는 30% 이상 55일 이상 생존하였다(도 7). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만 투여하는 경우에 비해 안전성이 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 7. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아(hydroxyurea)의 항암치료 효과 확인: Renca(IV)
실험예 7.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu) 및 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/㎏)를 투여받는 그룹과 재조합 바이러스(Wyeth VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 7.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 7.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 16일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스와 재조합 백시니아 바이러스와 rh-G-CSF를 병용투여받은 실험군의 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 10배 가까이 증가하였다. 반면, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용 투여받은 실험군 마우스는 초기 종양의 크기에서 약 8배 증가하하여, 종양의 크기가 가장 억제된 것을 관찰하였다(도 8).
실험예 7.3. CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실험예 7.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장 내 림프구 세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식(allograft)을 수행하였으며, 19일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여받은 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포를 각각 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 9). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 세포독성 T세포와 같은 면역세포가 형성되었을 뿐만 아니라, 적응면역을 활성화 시키는 것을 확인하였다.
실험예 8. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(V)
실험예 8.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - )는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)만 투여받은 그룹과 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - , 1×107 pfu)만 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - , 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 전까지 5회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 8.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 8.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 10일 15일 및 22일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 11배 내지 13배 정도 증가하였다. 반면, 실험군 마우스의 종양의 크기는 초기 종양의 크기에 비해 약 4배 정도 증가 되었다(도 10).
실험예 8.3. CTL(tumor-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여할 경우, 종양 특이적인 항암효과가 형성되는지 확인하기 위해, 실시예 8.1의 16일째 각 그룹의 마우스를 희생시킨 뒤 그룹별로 비장세포(splenocyte) 및 세포독성 T 림프구(CD8+ T cell)세포를 분리하였다. 그 후, 분리한 비장세포 또는 세포독성 T 림프구 세포를 각각 새로운 정상 마우스에 주입하고 암을 식립하여 종양의 크기를 관찰하였다. 1주일 후, 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였으며, 7일, 10일, 14일, 18일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 실험군 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서 종양의 성장이 현저하게 억제되었다. 반면, 나머지 군의 마우스로부터 채취한 비장세포 또는 T 림프구를 주입한 마우스에서는 종양의 성장이 유의미하게 억제되지 않았다(도 11). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서 T 림프구뿐만 아니라 비장에서 형성된 다른 면역세포에 의해서도 항암 효능을 가진 적응면역이 활성화되는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).
실험예 9. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VV tk- ) 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(VI)
실험예 9.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - )는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - , 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(Wyeth VVtk - , 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 희생시키기 전까지 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 9.2. 종양의 크기 변화 확인
실험예 9.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 22일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 양성대조군 마우스의 종양의 크기가 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 25% 정도 억제되었다. 특히, 실험군 마우스의 종양의 크기는 음성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해 약 37.5% 정도 억제되었으며, 양성대조군 마우스의 종양의 크기에 비해서는 약 15% 정도 더 억제되었다(도 13).
실험예 9.3. 비장조직 미세환경 확인
재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하였을 때의 종양미세환경 내 면역세포의 분포를 분석하였다. 분석에는 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 비장을 채취하여 비장 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(항-CD3 항체(Abcam), 항-CD4 항체(BD Biosciences), 항-CD8 항체(BD Biosciences))를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Dako)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양 조직에서 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 14). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우, 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하였을 때 보다, 비장조직 내 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 더 분화 및 활성화되는 것을 확인하였다. 즉, 이는 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여하는 경우가 재조합 백시니아 바이러스만을 투여하는 경우보다 적응면역을 더 잘 활성화시키는 것을 확인한 것이다.
실험예 10. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아의 CTL(Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocyte) 활성화 확인: 4T1(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스를 투여하였다. 한편, Wyeth 종 유래 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)는 유방암세포주-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다. 또한, 유방암세포주 식립 마우스는 폐조직을 포함한 전신으로의 전이가 진행되는 동물모델이며, 일반적으로 종양 표면의 소결절(nodule)의 수로써 전이를 평가한다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 4개 그룹으로 분류하였다(n=5). 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu) 또는 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 하였다. 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 첫번째 투여한 뒤 7일째 두번째 투여하였다. 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 3일 전부터 희생시키기 3일 전까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 1일 1회 복강 내 투여하였다.
약물을 투여한 후 18일째에 각 군의 마우스를 희생시켜 혈액과 비장을 채취하여 혈중 면역세포와 비장세포 내 면역세포의 분포를 유동세포분석법(Flowcytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 종양 면역반응을 유도하는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 혈액 및 비장에서의 분포가 실험군 마우스에서 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 면역억제 기능을 하는 골수유래면역억제세포(Myeloid derived suppressor cells, MDSC)가 실험군 마우스에서 음성대조군 및 양성대조군 마우스에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 15).
실험예 11. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아의 적응면역 증대 효과 확인: 4T1(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 10주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 1×106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)를 왼쪽 넓적다리에 피하이식 하고, 이틀 뒤 오른쪽 넓적다리에 같은 수의 4T1 암세포주를 피하이식 하였다. 왼쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 200 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×105 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(90 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 왼쪽 종양 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 14일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 양쪽 넓적다리에 피하이식한 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 왼쪽 종양의 크기가 양성대조군 마우스의 왼쪽 종양의 크기에 비해 약 35% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 16). 또한, 실험군 마우스의 오른쪽 종양의 크기가 양성대조군의 오른쪽 종양의 크기에 비해 약 45% 정도 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 17). 이를 통해, 재조합 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아의 병용투여시 주변의 종양에 미치는 효과를 확인한 것이다.
즉, 이는, 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아와 병용투여하여 종양을 국소 치료할 경우, 바이러스를 투여하지 않은 종양에도 항암효과가 나타나는 것을 확인한 것이다.
실험예 12. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아 병용투여 시 암 선택성 증가 확인(I)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR)투여를 시작하였다. 한편, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 동종(syngeneic)의 마우스에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 야생형 백시니아 바이러스(WR, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 상기 야생형 백시니아 바이러스 및 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여받은 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스를 22일째에 희생시킨 후, 마우스에서 종양을 분리하여 DAB(Diaminobenzidine)를 이용한 면역조직화학염색을 통해 바이러스 증식을 비교하였다. 구체적으로, 각 군의 마우스의 종양조직을 채취하여 종양 조직을 0.4 ㎛로 자르고 건조시켰다. 그 후, PBS로 조직을 세척한 후 BSA(bovine serum albumin) 처리하고, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 1:50 비율로 희석하여 조직에 처리하고 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS로 조직을 세척한 후, 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 조직을 PBS로 세척한 후, ABC kit(Dako)를 이용하여 반응을 시킨 후 H2O2를 가하여 발색을 한 후 탈수(Dehydration) 과정을 거친 후 봉입하였다.
그 결과, 실험군 마우스의 종양조직에서 야생형 백시니아 바이러스가 더 많이 분포하는 것을 확인하였다(도 18). 이를 통해, 야생형 백시니아 바이러스의 전신투여 시 히드록시유레아를 병용투여하게 되면 야생형 백시니아 바이러스의 종양 특이적 증식이 더 효과적인 것을 확인하였다.
실험예 13. 정상 마우스에서의 야생형 백시니아 바이러스(WR) 및 히드록시유레아 병용투여 시 생존율 및 암 선택성 증가 확인(II)
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c nu/nu 마우스(암컷, 7주)를 2일의 적응기간을 거친 후에 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR) 투여를 시작하였다. 한편, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 동종(syngeneic)의 마우스에서 증식이 제한적이다.
상기 마우스를 2개 그룹(n=12)으로 분류하였다. 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(1×107 pfu)을 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 야생형 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 히드록시유레아(50 ㎎/㎏)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 야생형 백시니아 바이러스는 비강 내(intranasal) 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 야생형 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 야생형 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 5회/주 복강 내 투여하였다.
8일째에 대조군 및 실험군의 마우스를 희생시켜 신장조직과 간조직을 분리하여 면역조직화학염색법을 수행하였다. 파라핀 블럭을 만든 뒤, 자일렌(xylene)과 에틸알콜(ethyl alcohol)을 이용해 탈파라핀화(deparaffinization)하였다. 디클로킹 챔버(decloaking chamber)를 이용해 항원복원과정(antigen retrieval)을 거친 후, 1차 항체(Cat no. ABIN1606294, Antibodies-Online)를 붙이고 FITC가 표지된 2차 항체(Alexa 594, Cat no. A21205, Invitrogen)를 붙인 뒤 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
그 결과, 대조군 마우스의 간조직과 신장조직에 비해 실험군 마우스의 간조직과 신장조직에서 바이러스가 적게 분포 및 증식하는 것을 확인하였다(도 19).
실험예 14. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412) 및 히드록시유레아 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 7주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412)는 마우스 신장암세포-식립 마우스 모델에서 거의 증식하지 못한다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 종양 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹, 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)와 재조합형 인간 과립구 집단 자극 인자(Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor, rh-G-CSF, 75 ㎍/㎏)를 투여받는 그룹 및 재조합 백시니아 바이러스(OTS-412, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 종양 내 투여하였으며, 첫번째 투여 후 13일 뒤 두번째 투여하였다. rh-G-CSF 또는 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 2일 전부터 희생시키기 전까지 복강 내 투여하였다.
재조합 백시니아 바이러스를 투여하고 8일째 되는 날에 각 군의 마우스를 3마리씩 희생시켜 일반혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 음성대조군에 비해 양성대조군의 절대 호중수 수치 (Absolute Neutrophil Count, ANC)가 감소한 것을 확인하였다. 실험군에서는 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹에서만 절대 호중구 수치가 양성대조군과 유사하게 측정되었다(도 20).
실험예 15. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 히드록시유레아 병용투여 시 호중구 수 측정
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 재조합 백시니아 바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 대조군으로 설정하였다. 또한, 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 투여받는 그룹 및 재조합 백시니아 바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)와 히드록시유레아(60 ㎎/㎏)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 재조합 백시니아 바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아는 재조합 백시니아 바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 재조합 백시니아 바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
재조합 백시니아 바이러스를 투여하고 8일째 되는 날에 각 군의 마우스를 3마리씩 희생시켜 일반혈액검사를 수행한 결과, 재조합 백시니아 바이러스만을 투여받은 그룹의 마우스 혈액 내 호중구 수가 대조군에 비해 증가하였다. 반면, 재조합 백시니아 바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹의 마우스 혈액 내 호중구 수는 대조군에 현저하게 감소하였다(도 21).
실험예 16. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 히드록시유레아 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 3개 그룹(n=3)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 음성대조군, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 투여한 그룹을 양성대조군, 항암바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 2일째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 3일째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 실험군 마우스의 호중구 수치가 낮아지는 경향을 확인하였다(도 22).
II. 백시니아 바이러스 및 레날리도마이드의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 17. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 레날리도마이드 투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 다시 일주일의 적응기간을 거친 후에 3개 그룹(n=3)으로 분류하여 각각 식염수, 히드록시유레아 (30 mg/kg), 레날리도마이드(30 mg/kg)를 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 4일 째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 5일 째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 레날리도마이드를 투여한 군의 마우스의 호중구 수치가 한 마리의 이상치를 제외하고 식염수를 투여한 군에 비해 낮아지는 것을 확인하였다. 또한, 히드록시유레아를 투여한 군의 마우스의 호중구 수치가 식염수를 투여한 군에 비해 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 23).
실험예 18. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WOTS-418) 및 레날리도마이드 병용투여 시 절대 호중구 수치(ANC) 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 음성대조군, 항암바이러스(WOTS-418, 1×107 pfu)를 투여한 그룹을 양성대조군, 항암바이러스와 히드록시유레아(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 레날리도마이드(30 mg/kg)를 병용투여한 그룹을 실험군으로 설정하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 히드록시유레아 또는 레날리도마이드는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 2일째까지 매일 복강 내 투여하였다.
항암바이러스 투여 후 5일째 되는 날, 각 군의 마우스를 희생시켜 일반 혈액검사(Complete Blood Count, CBC)를 수행한 결과, 실험군 마우스의 호중구 수치가 항암바이러스를 단독 투여한 양성대조군에 비해 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 24).
실험예 19. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV TK- ) 및 레날리도마이드 병용투여 시 항암치료 효과 확인
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WR VVtk-)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 6개 그룹(n=8)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 단독투여한 그룹, 항암바이러스와 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 레날리도마이드(25 mg/kg)를 병용투여한 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다. 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, 히드록시유레아 또는 레나리도마이드는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 21일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
21일째에 각 그룹의 마우스를 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 항암바이러스 단독 투여 그룹은 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 종양 성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.001). 항암바이러스와 레날리도마이드 병용 투여 그룹은 레날리도마이드를 단독투여한 그룹에 비해서는 종양성장이 억제되는 경향이 보였다. 특히, 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹은 항암바이러스 단독투여 그룹에 비해 현저히 종양의 성장이 억제되는 것을 관찰하였고(p<0.05), 레날리도마이드와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹은 항암바이러스와 히드록시유레아를 병용투여한 그룹보다 더 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 25).
III. 백시니아 바이러스 및 팔보시클립의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 20. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 재조합 백시니아 바이러스(WR VV tk- ) 및 팔보시클립 병용투여 시 항암치료 효과 확인
실험예 20.1. 마우스 신장암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 일주일의 적응기간을 거친 후에 5×106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 100 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스 투여를 시작하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418)는 마우스 신장암세포 식립 마우스 모델에서 증식이 가능하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여한 그룹을 대조군으로 설정하였으며, 항암바이러스(WR VVtk-, 1×107 pfu)를 단독투여한 그룹, 항암바이러스와 히드록시유레아(60 mg/kg)를 병용투여한 그룹, 항암바이러스와 팔보시클립(50 mg/kg, 100 mg/kg)을 병용투여한 그룹으로 나누어 실험을 수행하였다. 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, 팔보시클립은 항암바이러스를 투여 하기 5일 전 부터 1회/일 경구투여하였으며, 히드록시유레아는 항암바이러스 투여 1일 전부터 투여 후 19일까지 항암바이러스를 투여하는 날을 제외하고 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 20.2. 종양 크기 변화 확인
상기 실험예 20.1의 각 그룹의 마우스를 19일째에 희생시켜 종양의 크기를 측정한 결과, 항암바이러스를 단독투여한 그룹은 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 종양성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.05). 항암바이러스와 히드록시유레아 또는 팔보시클립을 병용투여한 그룹은 모두 항암바이러스 단독투여 군에 비해 현저히 종양의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(p<0.0001)(도 26).
실험예 20.3. 체중 변화 확인
실험예 20.1의 대조군 및 각 그룹에 각각의 약물을 투여한 후 3일, 6일, 9일, 12일, 16일 및 19일째에 마우스의 체중을 측정하였다. 그 결과, 모든 병용투여 그룹에서 체중이 감소하는 경향이 나타나지 않았고, 항암바이러스를 단독투여한 그룹에서 체중이 지속적으로 감소하는 경향이 보였으나, 투여 시작 시점의 체중에 비해 19일째 체중이 90%에 가깝게 유지되고 있어 안전성이 우려될 만한 수준이 아님을 확인하였다(도 27).
IV. 백시니아 바이러스, 과립백혈구 형성 억제제(히드록시유레아) 및 면역관문억제제의 병용투여에 따른 항암 시너지 효과 확인
실험예 21. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), PD-1 억제제 및 히드록시유레아(hydroxyurea)의 항암치료 효과 확인: Renca(I)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 PD-1 억제제(CD279, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 200 ㎜3 내지 300 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 마우스 PD-1 억제제를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)와 PD-1 억제제 병용투여 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu), PD-1 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, PD-1 억제제는 2일에 한번씩 14일, 16일, 18일 및 20일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 28).
실험예 22. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), CTLA4 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(II)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor)인 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell)의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, CTLA-4 억제제를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)와 CTLA-4 억제제 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 2일에 한번씩 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 4일, 7일, 10일, 14일 및 17일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 29). 이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(CTLA-4 억제제)를 병용투여함에 있어서, 히드록시유레아를 함께 투여할 경우 우수한 마우스 신장암 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 23. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(Wyeth VV tk- ), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: Renca(III)
항암바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 PD-L1 억제제(CD152, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(Wyeth VVtk-) 투여를 시작하였다. 상기 항암바이러스는 동종이식 모델에서 증식이 제한적이다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu)와 PD-L1 억제제를 병용투여 받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 암바이러스(Wyeth VVtk-, 1x107 pfu), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 모두 투여하는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 종양 내 1회 투여하였고, PD-L1 억제제는 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 30). 특히, 마우스를 희생시키기 전 종양의 크기를 비교하였을 때, 실험군이 항암바이러스와 PD-L1 억제제를 병용투여받은 그룹에 비해서는 약 46% 정도 작은것 확인하였다.
이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(PD-L1 억제제)를 병용투여함에 있어서, 히드록시유레아를 함께 투여할 경우 우수한 마우스 신장암 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 24. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WR VV tk- ), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1(I)
실험예 24.1. 마우스 유방암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
항암바이러스와 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell) 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 150 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 항암바이러스(WR VVtk-) 투여를 시작하였다. 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래의 항암바이러스(WR VVtk-)는 Wyeth 종 백시니아 유래의 항암바이러스에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=5)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성 대조군으로 설정하였으며, CTLA-4 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(WR VVtk-, 1x107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(WR VVtk-, 1x107 pfu)와 CTLA-4 억제제를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WR VVtk-, 1x107 pfu), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 24.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 31).
실험예 24.3. 생존율 분석
또한, 생존기간 또한 실험군 마우스의 생존기간 및 생존율이 가장 우수한 것을 확인하였다. 이를 통해, 마우스 유방암세포 식립 마우스에서 항암바이러스와 CTLA-4 억제제를 병용투여하는 경우, 히드록시유레아를 추가로 투여하는 것이 유의미한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예 25. 마우스 유방암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WOTS-418), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 항암치료 효과 확인: 4T1(II)
실험예 25.1. 마우스 유방암세포 식립 마우스 제조 및 약물 투여
항암바이러스와 PD-L1 억제제(CD152, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 4T1 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 50 ㎜3 내지 100 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스 유래 항암바이러스(WOTS-418) 투여를 시작하였다. 웨스턴리저브 종(Western Reserve)은 Wyeth 종에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 유방암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=6)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(300 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418, 1x107 pfu)를 종양 내 투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418, 1x107 pfu)와 PD-L1 억제제를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WOTS-418, 1x107 pfu), PD-L1 억제제, 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 모두 투여하는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 2회 투여하였고, PD-L1 억제제는 3일, 5일, 7일 및 9일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 6회/주 복강 내 투여하였다.
실험예 25.2. 종양의 크기 변화 확인
상기 실험예 5.1의 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일, 7일, 10일 및 14일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 32). 특히, 마우스를 희생시키기 전 종양의 크기를 비교하였을 때, 실험군이 항암바이러스와 PD-L1 억제제를 병용투여받은 그룹에 비해서는 약 30% 정도 작은 것을 확인하였다.
이를 통해, 항암바이러스와 면역관문억제제(PD-1 억제제)를 병용투여함에 있어서도 히드록시유레아를 함께 투여하는 것이 마우스 유방암을 억제하는데 시너지 효과가 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 25.3. 생존율 분석
상기 실험예 5.1의 각 군의 마우스의 30일 동안의 생존율을 분석하였다. 그 결과, 실험군 마우스의 생존율이 음성대조군 및 양성대조군 마우스의 생존율보다 높은 것을 확인하였다.
실험예 26. 마우스 대장암세포 식립 마우스에서의 항암바이러스(WR, WOTS-418), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아의 생존율 분석: CT-26 I
웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR)와 PD-L1 억제제, 및 히드록시유레아 병용투여시 안전성을 확인하기 위해, 마우스 유방암세포 식립 마우스를 이용해 생존기간을 분석하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스를 7일의 적응기간을 거친 후에 1x106 세포수의 마우스 대장암(CT-26) 세포주(한국세포주은행)를 피하이식 하였다. 7일 뒤 항암바이러스(WR), PD-L1 억제제를 복강 내 투여하고, 다음 날부터 5일 동안 매일 히드록시유레아를 투여하였다. 한편, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스 와이어스 종(Wyeth strain) 에 비해 동종이식 모델에서 증식력이 더 강하다.
상기 제작한 마우스 대장암세포 식립 마우스를 5개 그룹(n=_)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, PD-L1 억제제(200 ㎍/마우스)를 단독투여받는 그룹, 항암바이러스(WOTS-418)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 항암바이러스(WR, 1x106 pfu 또는 WOTS-418, 1x107 pfu), PD-L1 억제제 및 히드록시유레아를 병용투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 항암바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, PD-L1 억제제는 1일, 4일, 8일 및 11일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 5회/주 복강 내 투여하였다.
각 군의 마우스의 생존곡선을 분석한 결과, 음성대조군 마우스 및 양성대조군 마우스의 비해 실험군 마우스의 생존기간이 가장 긴 것을 관찰하였고, 이를 통해 항암바이러스, 면역관문억제제 및 히드록시유레아를 병용투여하는 경우 안전성이 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 27. 마우스 신장암세포 식립 마우스에서의 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR), CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아의 생존율 분석: Renca(IV)
웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 면역관문억제제(Immune Checkpoint Inhibitor) 중 하나인 CTLA-4 억제제(B7-H1, BioXCell)와의 병용투여 시 히드록시유레아를 투여하는 것에 대한 추가적인 효과를 확인하기 위해, 마우스 신장암세포 식립 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다.
먼저, 오리엔트 바이오(Orient Bio, Busan)에서 분양 받은 Balb/c 마우스(암컷, 8주)를 7일의 적응기간을 거친 후에 5x106 세포수의 Renca 암세포주(한국세포주은행)로 동종이식을 수행하였다. 종양의 크기가 30 ㎜3 내지 50 ㎜3에 도달할 때까지 관찰한 뒤 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR) 투여를 시작하였다. 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 Wyeth 종 백시니아 바이러스에 비해 동종이식 모델에서 더 증식력이 강하다.
상기 제작한 마우스 신장암세포 식립 마우스를 4개 그룹(n=4)으로 분류하였다. 식염수를 복강 내 투여받는 그룹을 음성대조군으로 설정하였으며, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스(WR, 1x105 pfu)와 히드록시유레아(30 ㎎/㎏)를 병용투여받는 그룹 및 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스와 CTLA-4 억제제(150 ㎍/마우스)를 투여받는 그룹을 양성대조군으로 설정하였다. 또한, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스, CTLA-4 억제제 및 히드록시유레아를 투여받는 그룹을 실험군으로 설정하였다. 이때, 웨스턴 리저브 종 백시니아 바이러스는 복강 내 1회 투여하였고, CTLA-4 억제제는 2일, 4일, 6일 및 8일째에 복강 내 투여하였으며, 히드록시유레아는 4회/주 복강 내 투여하였다.
상기 각 군의 마우스에 약물을 투여한 후 0일, 3일 및 7일째에 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과, 실험군의 마우스의 종양의 크기가 양성대조군의 마우스의 종양의 크기에 비해 유의미하게 억제되는 것을 확인하였다(도 33).
<110> Bionoxx Inc. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCER COMPRISING VACCINIA VIRUS AND NEUTROPHIL INHIBITOR <130> FPD202008-0030 <150> KR 10-2019-0106736 <151> 2019-08-29 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for 330 aa fregment of HSV-TK (OTS-412) <400> 1 ttagtcgtaa tccaggataa agacgtgcat gggacggagg cgtttggcca agacgtccaa 60 ggcccaggca aacacgttat acaggtcgcc gttgggggcc agcaactcgg gggcccgaaa 120 cagggtaaat aacgtgtccc cgatatgggg tcgtgggccc gcgttgctct ggggctcggc 180 accctggggc ggcacggccg tccccgaaag ctgtccccaa tcctcccacc acgacccgcc 240 gccctgcaga taccgcaccg tattggcaag cagcccgtaa acgcggcgaa tcgcggccag 300 catagccagg tcaagccgct cgccggggcg ctggcgtttg gccaggcggt cgatgtgtct 360 gtcctccgga agggccccca acacgatgtt tgtgccgggc aaggtcggcg ggatgagggc 420 cacgaacgcc agcacggcct ggggggtcat gctgcccata aggtatcgcg cggccgggta 480 gcacaggagg gcggcgatgg gatggcggtc gaagatgagg gtgagggccg ggggcggggc 540 atgtgaactc ccagcctccc ccccgacatg aggagccaga acggcgtcgg tcacggcata 600 aggcatgccc attgttatct gggcgcttgt cattaccacc gccgcgtccc cggccgatat 660 ctcaccctgg tcgaggcggt gttgtgtggt gtagatgttc gcgattgtct cggaagcccc 720 cagcacctgc cagtaagtca tcggctcggg tacgtagacg atatcgtcgc gcgaacccag 780 ggccaccagc agttgcgtgg tggtggtttt ccccatcccg tgaggaccgt ctatataaac 840 ccgcagtagc gtgggcattt tctgctccag gcggacttcc gtggcttctt gctgccggcg 900 agggcgcaac gccgtacgtc ggttgctatg gccgcgagaa cgcgcagcct ggtcgaacgc 960 agacgcgtgt tgatggcagg ggtacgaagc cat 993 <210> 2 <211> 1131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for mutated HSV-TK of WOTS-418 <400> 2 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60 ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120 cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180 gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240 gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300 tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360 atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420 cctcatgtcg gtggtgaggc tgggagttca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480 ttcgaccgcc atcccatcta cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540 agcatgaccc ctcaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600 acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660 cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720 ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggtggga ggattgggga 780 cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840 cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900 aacggcgacc tgtataacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960 cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020 ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca ccccaggctc cataccgacg 1080 atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaacta a 1131

Claims (28)

  1. 백시니아 바이러스 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    상기 백시니아 바이러스가 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스이고,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자가 결실된 것이고,
    상기 과립백혈구 형성 억제제는 팔보시클립(palbociclib)인 것인 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스는 웨스턴 리저브(Western Reserve, WR), NYVAC(New York Vaccinia Virus), Wyeth(The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, 리스터(Lister), 코펜하겐(Copenhagen), 티안탄(Tian Tan), USSR, 타쉬켄트(TashKent), 에반스(Evans), IHD-J(International Health Division-J) 또는 IHD-W(International Health Division-White) 백시니아 바이러스 종(strain)인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 추가로 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase)를 코딩하는 유전자가 삽입된 것인 암 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 전립선암, 갑상선암, 유방암, 뇌암, 두경부암, 식도암, 피부암, 흉선암, 위암, 결장암, 간암, 난소암, 자궁암, 방광암, 직장암, 담낭암, 담도암, 췌장암 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 과립백혈구가 호중구인 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물이 면역관문억제제를 추가적으로 포함하는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스 및 상기 과립백혈구 형성 억제제가 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 치료용 약학 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 백시니아 바이러스 투여 3일 내지 5일 전, 백시니아 바이러스 투여 후, 1일 1회, 9일 내지 28일 동안 연속적으로 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 10 ㎎/㎏/day 내지 90 ㎎/㎏/day 용량으로 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 1×105 pfu 내지 1×1010 pfu 용량으로 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 7일 내지 30일 간격으로 개체에 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 과립백혈구 형성 억제제가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 백시니아 바이러스가 종양 내, 복강 내 또는 정맥 내로 투여되는 것인, 암 치료용 약학 조성물.
  19. 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 제1조성물 및 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 제2조성물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 키트로서,
    상기 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스이고,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자가 결실된 것이고,
    상기 과립백혈구 형성 억제제는 팔보시클립(palbociclib)인 것인 키트.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 키트가 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는 제3조성물을 추가적으로 포함하는 것인, 암 예방 또는 치료용 키트.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 제2조성물이 제1조성물 투여 전, 중 또는 후에 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 키트.
  22. 과립백혈구 형성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제로서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제의 항암보조제로서 사용되는 것을 특징으로 하고,
    상기 백시니아 바이러스가 야생형 백시니아 바이러스 또는 재조합 백시니아 바이러스이고,
    상기 재조합 백시니아 바이러스는 야생형 백시니아 바이러스의 티미딘 키나아제(thymidine kinase) 유전자가 결실된 것이고,
    상기 과립백혈구 형성 억제제는 팔보시클립(palbociclib)인 것인 항암보조제.
  23. 삭제
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 항암보조제는 백시니아 바이러스의 항암활성을 개선, 향상 또는 증대시키는 것을 특징으로 하는 것인, 항암보조제.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7704419B2 (ja) * 2019-06-27 2025-07-08 バイオノックス インコーポレイテッド 安全性及び抗がん効果が改善された腫瘍溶解性ウイルス
KR102739298B1 (ko) * 2021-04-02 2024-12-06 주식회사 바이오녹스 바이러스 벡터 유래 항암요법 표적 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 결합 분자 또는 이의 단편
CN118443941A (zh) * 2024-04-29 2024-08-06 山东大学齐鲁医院 中性粒细胞作为诊疗膀胱癌的靶标的应用
CN119955859A (zh) * 2025-01-24 2025-05-09 郑州大学 F14l基因缺失和表达腺苷脱氨酶的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101772375B1 (ko) * 2005-09-07 2017-08-29 신라젠(주) Ｇｍ-ｃｓｆ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성 및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법
EP2073823A1 (en) * 2006-10-13 2009-07-01 Medigene AG Use of oncolytic viruses and antiangiogenic agents in the treatment of cancer
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
CA2709292A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-10 The Governors Of The University Of Alberta Oncolytic viruses and methods for treating neoplastic disorders
WO2013112942A1 (en) * 2012-01-25 2013-08-01 Dna Trix, Inc. Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation
KR101632897B1 (ko) * 2013-04-10 2016-06-23 신라젠(주) 백시니아 바이러스로부터 유래한 신규한 항암 바이러스 ｈｂｂ３０１
WO2017205674A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Oncolytic vaccinia virus mutants and using same for cancer treatment
AU2017332367B2 (en) * 2016-09-21 2021-12-23 Stephen H. Thorne High mobility group box i mutant
US11857585B2 (en) * 2017-12-28 2024-01-02 Bionoxx Inc. Oncolytic virus improved in safety and anticancer effect
CN112584852A (zh) * 2018-06-19 2021-03-30 百欧恩泰美国公司 新抗原及其用途
CA3150829A1 (en) * 2019-08-26 2021-03-04 Bionoxx Inc. Pharmaceutical composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredient for treatment of cancer
CN114364390A (zh) * 2019-08-26 2022-04-15 拜耳诺克斯有限公司 用于治疗癌症的包含抗癌病毒、免疫检查点抑制剂和羟基脲作为活性成分的药物组合物

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