JP7373833B2 - 三次元生体組織の培養方法、並びに三次元生体組織培養デバイス及びシステム - Google Patents

Description

本発明は、三次元生体組織の培養方法に関する。また、本発明は、三次元生体組織培養デバイス及びシステム方法に関する。

近年、オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）と呼ばれる、人為的に生体外で創出した、器官又は臓器に類似した組織体を構築する研究が盛んに行われている。オルガノイドは、一般に、器官形成に寄与する前駆細胞等の集合体から、生体内における発生や再生過程を模倣することにより創出される。ヒト組織オルガノイドは、器官・臓器の発生過程を理解するために用いられるのみならず、創薬研究への応用が期待されており、癌、腸、肝臓、腎臓等のオルガノイド誘導研究が既に行われている。

オルガノイドを培養する方法としては、様々な方法が開発されており、例えば、セルカルチャーインサートの多孔膜上において三次元化したオルガノイドを培養する方法が知られている（例えば、非特許文献１）。また、オルガノイドの内部へ酸素や栄養を供給するための血管網を模倣するために、微細加工技術を用いて構築したマイクロ流体デバイス上で、オルガノイドを培養する方法が開発されている（例えば、非特許文献２）。

Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｈｕｍａｎ ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｏｃｔ．２２；５２６（７５７４）：ｐｐ．５６４－５６８． Ｎａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｅｒｆｕｓａｂｌｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）．２０１７ Ｊｕｎ．１９；９（６）：５０６－５１８．

従来の器官培養法は、長期間培養すると、三次元生体組織（例えば、オルガノイド）の構造が保てず、所望の形状を有するオルガノイドが得られないという課題があった。すなわち、本発明は、酸素透過性を向上させつつ、オルガノイドの構造を維持し、所望の形状を有するオルガノイドを作製するための培養方法、並びに培養デバイスおよび培養システムを提供する。

本発明者らは、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、多孔膜の下部に、培地を灌流させるための流路を設け、三次元生体組織を気相－液相界面を維持しながら培養するという簡便な方法によって、三次元生体組織（例えば、オルガノイド）の形状が崩壊することなく、長期間培養を可能となることを見出した。本発明は、上記知見を元に完成させたものである。すなわち、本発明は以下を含む。

［１］ 三次元生体組織の培養方法であって、
培地の成分が透過する多孔膜の一方の面に載置された三次元生体組織を気相に曝露させ、かつ、前記多孔膜の他方の面に接触させた培地を、前記多孔膜と平行な液流で灌流させながら、前記三次元生体組織を培養する工程、
を含む、方法。
［２］ 前記多孔膜が、前記多孔膜の厚み方向に貫通する細孔を有する、［１］に記載の方法。
［３］ 前記多孔膜が、セルカルチャーインサートの多孔膜である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 前記三次元生体組織が、腎オルガノイド、肺オルガノイド、胸腺オルガノイドまたは精巣オルガノイドである、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 前記三次元生体組織が、腎オルガノイドである、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］ 前記培地が、０．０１μＬ／分以上の流速で灌流される、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。

［７］ セルカルチャーインサート保持部と；
前記セルカルチャーインサート保持部の底部の一部に設けられた少なくとも１つの流路と；
前記流路に培地を供給するための培地供給管と；
前記流路から培地を排出するための培地排出管と、
を備え、
ここで、前記流路の上面の一部は流路上部開口部を有し、セルカルチャーインサートが前記セルカルチャーインサート保持部に載置された時に、前記流路上部開口部が前記セルカルチャーインサートの多孔膜の下面により覆われることを特徴とする、三次元生体組織培養デバイス。
［８］ 前記セルカルチャーインサート保持部が、前記セルカルチャーインサートと密着させるための嵌合手段を有する、［７］に記載の三次元生体組織培養デバイス。
［９］ 前記嵌合手段が、テーパ構造及びシール部材からなる群から選択される１以上の嵌合手段である、［８］に記載の三次元生体組織培養デバイス。
［１０］ 前記流路が、培地が流された場合に層流となるよう形成されている、［７］～［９］のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
［１１］ 前記流路の幅／高さが、２．０以上である、［７］～［１０］のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
［１２］ 前記流路の高さが、約０．１ｍｍ～約５ｍｍである、［７］～［１１］のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
［１３］ さらに、前記セルカルチャーインサート保持部に載置されたセルカルチャーインサートを備える、［７］～［１２］のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。

［１４］ ［１３］に記載の三次元生体組織培養デバイスと、
前記培地供給管に接続された培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに培地を供給する培地供給槽と、
前記培地供給ラインに培地を送る送液ポンプと、
前記培地排出管に接続された培地排出ラインと、
前記培地排出ラインから排出された培地を貯留する培地排出槽と、
を備える、三次元生体組織培養システム。
［１５］ 前記培地供給槽と、前記培地排出槽が同一であり、培地が循環することを特徴とする、［１４］に記載の三次元生体組織培養システム。

本発明の特徴は、簡便なデバイスを用いることによって、気相－液相界面を維持しながら、三次元生体組織を培養可能とした点にある。従来、三次元生体組織、例えば腎臓オルガノイドは、その上部に培地やゲルが存在する状態で培養していたために、細胞間への培地が受動的に侵入し、内部上皮細胞構造の維持が困難で崩壊していた。本発明により、三次元生体組織の上部は気相で培養可能となり、培地のランダムな侵入なしに、酸素が十分に供給可能であり、培養期間中に三次元生体組織の組織構造を維持することが可能となる。また、三次元生体組織下部は多孔膜を介して液相と接しており、液相の還流によって培地が供給され、栄養及び酸素の供給、老廃物の除去が可能となる。また、三次元生体組織下部の液流刺激が徐々に三次元生体組織の上層に向かうにしたがって減衰するため、生体内の血流、例えば生体内の胎児腎へ供給される血流と類似しており、胎内の状態を模倣するものである。これにより、三次元生体組織の成熟が促進され、従来の三次元生体組織よりも高度に分化した三次元生体組織を得ることが可能となる。

また、本発明の三次元生体組織培養デバイスは、市販のセルカルチャーインサートと組み合わせて使用することもできる。セルカルチャーインサートの多孔膜の孔径を適宜選択することで、上部還流組織への培地の還流量も制御可能となる。さらに、通常の培養皿を用いて灌流培養可能であるため、培養中の三次元生体組織を市販の顕微鏡で観察することが可能であり、経時的な観察も可能となる。

図１－１は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイスを示す図である。（Ａ）上面図。（Ｂ）底面図。 図１－２は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイスを示す図である。（Ａ）図１－１（Ａ）のＡ－Ａ断面を示す図である。（Ｂ）図１－１（Ａ）のＢ－Ｂ断面を示す図である。 図１－３は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイスを示す図である。（Ａ）三次元生体組織培養デバイスの斜視図（上面側）である。（Ｂ）三次元生体組織培養デバイスの斜視図（底面側）である。 図２－１は、一実施形態における、培養デバイスアセンブリを示す図である。セルカルチャーインサート、三次元生体組織培養デバイス及び培養容器を組み合わせた培養デバイスアセンブリを示す斜視図である。 図２－２は、一実施形態における、培養デバイスアセンブリを示す図である。（Ａ）図１－２（Ａ）に、セルカルチャーインサート及び培養容器を組み合わせた培養デバイスアセンブリの断面図を示す。（Ｂ）図１－２（Ｂ）に、セルカルチャーインサート及び培養容器を組み合わせた培養デバイスアセンブリの断面図を示す。 図３は、一実施形態における、三次元生体組織培養システムの一部（培養デバイスアセンブリ）の使用状態を示す模式図である。 図４－１は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイスを示す図である。（Ａ）上面図。（Ｂ）底面図。 図４－２は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイスを示す図である。（Ａ）図４－１（Ａ）のＣ－Ｃ断面を示す図である。（Ｂ）図４－１（Ａ）のＤ－Ｄ断面を示す図である。 図５は、一実施形態における、三次元生体組織培養システムを示す図である。培養デバイスアセンブリは断面図で示されている。 図６は、一実施形態における、三次元生体組織培養システムを示す図である。培養デバイスアセンブリは断面図で示されている。 図７は、一実施形態における、三次元生体組織培養システム及び灌流状態を示す図である。（Ａ）三次元生体組織培養システムの一部（培養デバイスアセンブリ）の使用態様を示す模式図である。（Ｂ）蛍光ビーズを用いた灌流テストの結果を示すグラフである。流路内（（Ａ）のＦ１）の蛍光ビーズ移動度とポンプ流量の関係を示す。（Ｃ）蛍光ビーズを用いた灌流テストの結果を示すグラフである。セルカルチャーインサート内（（Ａ）のＦ２）の蛍光ビーズ移動速度とポンプ流量（μＬ／秒）の関係を示す。 図８は、ｉＰＳ細胞からの腎オルガノイドの誘導を示す図である。（Ａ）腎オルガノイドの誘導条件を示す。（Ｂ）１２ウェルセルカルチャーインサート内の誘導１８日目（３次元化後１２日）の腎オルガノイドのマクロスコピック像。（Ｃ）腎オルガノイドの経時的なＮＰＨＳ１遺伝子（ネフリン発現マーカー）の発現を示す。 図９は、腎オルガノイドの灌流培養の結果を示す。ポンプ流量１０μＬ／分で灌流した場合の蛍光レクチンの動態（赤：Ａｌｅｘａ ６４９ Ｔｏｍａｔｏ ｌｅｃｔｉｎ）を示す。 図１０は、灌流による腎オルガノイド内の尿管芽組織および誘導尿細管構造の変化を示す図である。腎オルガノイドを誘導後１８日から２１日の間培養した各々の凍結切片染色像を示す。（Ａ）及び（Ｂ）：静置培養群（対比コントロール）、（Ｃ）及び（Ｄ）：２．５μＬ／分 灌流培養群、（Ｅ）及び（Ｆ）：１０μＬ／分 灌流培養群。（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）は、赤：尿管芽細胞（ＣＫ８）、緑：発生尿細管（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ）を示す。（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｆ）は、（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｅ）の画像に、細胞核染色像を重ね合わせた画像である。 図１１は、灌流による腎オルガノイド内の遺伝子発現の変化を示す。３日間培養後の腎オルガノイドにおけるＰＡＸ８遺伝子発現の変化を示すグラフである。 図１２は、灌流による尿管芽細胞の内腔拡張を示す。（Ａ）静止培養、（Ｂ）２．５μＬ／分、（Ｃ）１０μＬ／分での３日間培養後の腎オルガノイド内尿管芽管構造を示す（赤：尿管芽細胞（ＣＫ８）、緑：発生尿細管（Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ）、青：細胞核）。 図１３は、浸漬培養した腎オルガノイドを示す。上段：培養方法の模式図、中段：培養後のオルガノイド（矢頭）、下段：培養後の凍結切片染色像（青：細胞核、赤：尿管芽細胞、緑：近位ネフロン）。 図１４は、一実施態様の三次元生体組織培養システムにおける培養環境の模式図を示す。 図１５は、がん細胞（Ｇ４０１細胞）を移植した腎オルガノイドを用いた、がん細胞の浸潤・転移の解析結果を示す。（Ａ）７日間静置培養後、又は（Ｂ）７日間灌流培養後のコラーゲンゲル包埋がん細胞（Ｇ４０１細胞）を移植した腎オルガノイドの組織切片のＨＥ染色像を示す。 図１６は、がん細胞（Ｇ４０１細胞）を移植した腎オルガノイドを用いた、がん細胞の浸潤・転移の解析結果を示す。がん細胞（Ｇ４０１細胞）を含む懸濁液を腎オルガノイドへ滴下移植し、その後灌流しながら培養を行った。灌流後の培地に含まれる細胞を回収して、別途培養し、上清中のＭＭＰの量をＥＬＩＳＡで測定した。

以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照にしながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。

Ｉ．三次元生体組織
本明細書において、「三次元生体組織」とは、細胞を含む三次元の構造体をいい、例えば、生体から単離された生体組織（例えば、臓器及び組織またはその一部（例えば、皮膚組織（例えば、毛根付随皮膚組織など）、心筋組織、骨格筋組織、平滑筋組織、肝組織、腎組織、消化管組織、眼組織（例えば角膜組織）、脳組織、胸腺組織、精巣組織、膵臓組織、甲状腺組織、乳腺組織、唾液腺組織、肺組織など）、又は、生体組織を構成する細胞を用いて再構築された三次元細胞構造体、例えば、オルガノイドが本発明に適用され得る。本発明に適用し得る生体から単離された生体組織とは、生体から採取された生体組織そのものであってもよく、生体から採取された生体組織を任意の形状に加工した組織片であってもよい。また、本発明に適用し得る三次元細胞構造体とは、細胞を含む懸濁液とゲル溶液又はゲル化剤とを混合させて形成した三次元細胞構造体であってもよく、複数枚の細胞シートを積層した三次元細胞構造体であってもよい。本発明に適用し得る三次元細胞構造体とは、ゲルの上に、細胞を播種し、培養することにより形成される三次元細胞構造体であってもよい。

本明細書において、「オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）」とは、臓器又は器官の形成に寄与する前駆細胞等の集合体から、３次元的に試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で構築された組織体をいい、当業者にとって最も広義に解釈される「オルガノイド」と同義のものを指す。オルガノイドは、一般に、実際の臓器又は器官よりも小型であり、単純な構造を有するが、解剖学的及び機能的に生体内に存在する臓器又は器官に近い特徴を示す。オルガノイドとしては、例えば、腎オルガノイド、肝臓オルガノイド、消化管オルガノイド（例えば、腸オルガノイド、口腔オルガノイド、胃オルガノイドなど）、眼杯オルガノイド、脳オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、膵臓オルガノイド、上皮オルガノイド、甲状腺オルガノイド、乳腺オルガノイド、唾液腺オルガノイド及び肺オルガノイド等が挙げられ、また、これらのオルガノイドにがん細胞を含む「がんオルガノイド」なども含まれる。また、本明細書において、オルガノイドとは、生体から採取された臓器および組織またはその一部（例えば、組織片）を含むものであってもよい（例えば、Ｓｈａｍｉｒ ＥＲ．， Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ；１５（１０）：６４７－６４を参照）。

本発明に適用可能な三次元生体組織、例えばオルガノイドを得る方法としては公知の方法を用いればよく、以下に限定されないが、例えば、腎オルガノイドは、Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５，Ｏｃｔ．２２，５２６（７５７４），ｐｐ．５６４－５６８；肺オルガノイドは、Ｕｎｂｅｋａｎｄｔ Ｍ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，２０１０，Ｍａｒ．，７７（５），ｐｐ．４０７－４１６；胸腺オルガノイドは、Ｓｈｅｒｉｄａｎ ＪＭ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００９ Ｍａｙ，４７（５），ｐｐ．３４６－３５１；精巣オルガノイドは、Ｓａｎｊｏ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８，Ｆｅｂ １２，１３（２），ｅ０１９２８８４などを参考にすればよい。その他、オルガノイドを形成する方法によって得られた任意のオルガノイドも用いることが可能である。本発明に適用可能な三次元生体組織としては、多孔膜上で培養可能である三次元生体組織であればよく、例えば、腎オルガノイド、肺オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイドに適用可能であり、好ましくは、腎オルガノイドである。

本発明に適用可能な三次元生体組織は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類の三次元生体組織である。好ましくは、哺乳動物の三次元生体組織であり、例えば、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ヤギなどの哺乳動物由来の細胞を含んでいる。

本発明に適用可能な三次元生体組織に含まれる細胞は、生体組織から採取された初代細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、多能性幹細胞若しくは組織幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）から分化誘導された細胞であってもよい。

本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、栄養芽幹細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥｐｉＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞等を含む。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号に記載の多能性幹細胞を使用することができる。

組織幹細胞や多能性細胞から、任意の三次元生体組織（例えば、オルガノイド）を構築する細胞へと分化させる方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、以下に限定されるわけではないが、腎オルガノイドを構築する細胞は、Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５，Ｏｃｔ．２２，５２６（７５７４），ｐｐ．５６４－５６８；肝臓オルガノイドを構築する細胞は、Ｔａｋｅｂｅ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，Ｊｕｌ，２５，４９９（７４５９），ｐｐ．４８１－４８４；消化管オルガノイドを構築する細胞は、Ｓａｔｏ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９，Ｍａｙ １４，４５９（７２４４），ｐｐ．２６２－２６５；眼杯オルガノイドを構築する細胞は、Ｅｉｒａｋｕ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，Ａｐｒ ７，４７２（７３４１）ｐｐ．５１－５６；脳オルガノイドを構築する細胞は、Ｅｉｒａｋｕ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００８，Ｎｏｖ ６，３（５），ｐｐ．５１９－５３２及びＬａｎｃａｓｔｅｒ ＭＡ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，Ｓｅｐ １９，５０１（７４６７），ｐｐ．３７３－３７９、肺オルガノイドを構築する細胞は、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｎｏｖ，１４（１１），ｐｐ．１０９７－１１０６；膵臓オルガノイドを構築する細胞は、Ｒａｉｋｗａｒ ＳＰ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｊａｎ ２８，１０（１），ｅ０１１６５８２；甲状腺オルガノイドを構築する細胞は、Ｍａ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．２０１５ Ａｐｒ ２２，６，５６．などを参考にすることができる。その他、三次元生体組織を構築する細胞へと分化させる方法によって得られた任意の細胞も用いることが可能である。

ＩＩ．三次元生体組織の培養方法
一実施態様において、本発明の方法は、以下の工程を含む：
培地の成分が透過する多孔膜の一方の面に載置された三次元生体組織を気相に曝露させ、かつ、前記多孔膜の他方の面に接触させた培地を、前記多孔膜と平行な液流で灌流させながら前記三次元生体組織を培養する工程。本明細書において「培地の成分が透過する多孔膜」とは、培地を構成する成分、例えば、水、緩衝液中の成分、タンパク質など、細胞培養に必要な成分が通過することができる細孔を有する多孔膜をいう。

本発明の方法を実施することによって、多孔膜上に載置された三次元生体組織には、気相から十分な酸素が供給され、虚血になることが防止される。また、三次元生体組織が接触する面とは反対の面から浸透した培地によって、三次元生体組織が接触する面の上で液流が生じる。三次元生体組織が接触する面の上に生じた液流は、極めて緩やかな流れとなるため、三次元生体組織を構成する細胞が分泌する分化に必要な因子が洗い流されずに三次元生体組織周辺にとどまることとなる。これにより、栄養を含む培地が十分に三次元生体組織へ供給されることとなる。例えば、本発明を腎オルガノイドに適用した場合、オルガノイドの構造が崩壊することが防止され、腎オルガノイドの成熟化も促進される。一実施態様において、培地の液流は、例えば、多孔膜と平行な任意の一方向流である。多孔膜と平行な任意の一方向流は、時間によって、液流の方向を変更してもよい。これにより、多孔膜の三次元生体組織が載置された面に生じる液流の向きも変更することができる。

一実施態様において、本発明に用いられる多孔質膜は、当該記多孔膜の厚み方向に貫通する細孔を有していることが好ましく、さらに好ましくはセルカルチャーインサートの多孔膜である。セルカルチャーインサートは、市販のセルカルチャーインサートを用いることができる。本発明に用いられる多孔質膜の細孔の平均孔径は、培養される三次元生体組織の種類、大きさ、用途などに応じて、適宜選択することができ、例えば、０．０１μｍ～１００μｍの平均孔径（例えば、０．０１μｍ～５０μｍ、０．０１μｍ～１０μｍ、０．１μｍ～５０μｍ、好ましくは０．１μｍ～１０μｍ）を有する。多孔膜の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍであれば、三次元生体組織に含まれる細胞が、三次元生体組織が接触する多孔膜の一方の面から、多孔膜の他方の面へ移動することが防止され、好ましい。また、本発明に用いられる多孔膜の細孔の密度は、培養される三次元生体組織の種類、大きさ、用途などに応じて、適宜選択することができるが、例えば１×１０^５／ｃｍ^２以上、好ましくは５×１０^５／ｃｍ^２以上、より好ましくは１０×１０^５／ｃｍ^２以上、さらに好ましくは５０×１０^５／ｃｍ^２以上、最も好ましくは１００×１０^５／ｃｍ^２以上の細孔の密度を有する多孔膜を使用することができる。本発明に用いられる多孔質膜の平均膜厚は、例えば、５μｍ～５００μｍ、５μｍ～１００μｍ、または５μｍ～１００μｍである。本発明に用いられる多孔膜の材質としては、例えばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等があげられるが、これに限定されない。

一実施態様において、本発明の方法は、多孔膜に接触させた培地が、０．０１μＬ／分以上の流速で灌流される。例えば、培地の流速は、０．０１μＬ／分以上、０．０５μＬ／分以上、０．１μＬ／分以上、０．５μＬ／分以上、１．０μＬ／分以上、または２．０μＬ／分以上であってもよい。また、流速は、例えば、０．０１μＬ／分～１０ｍＬ／分、０．１μＬ／分～１０ｍＬ／分、１．０μＬ／分～１０ｍＬ／分、２．０μＬ／分～１０ｍＬ／分、０．０１μＬ／分～２ｍＬ／分、０．１μＬ／分～２ｍＬ／分、１．０μＬ／分～２ｍＬ／分、２．０μＬ／分～２ｍＬ／分、０．０１μＬ／分～５００μＬ／分、０．１μＬ／分～５００μＬ／分、１．０μＬ／分～５００μＬ／分、２．０μＬ／分～５００μＬ／分、０．０１μＬ／分～１００μＬ／分、０．１μＬ／分～１００μＬ／分、１．０μＬ／分～１００μＬ／分、２．０μＬ／分～１００μＬ／分、０．０１μＬ／分～２０μＬ／分、０．１μＬ／分～２０μＬ／分、１．０μＬ／分～２０μＬ／分、２．０μＬ／分～２０μＬ／分、０．０１μＬ／分～１２．５μＬ／分、０．１μＬ／分～１２．５μＬ／分、１．０μＬ／分～１２．５μＬ／分、２．０μＬ／分～１２．５μＬ／分、０．０１μＬ／分～８．０μＬ／分、０．１μＬ／分～８．０μＬ／分、１．０μＬ／分～８．０μＬ／分、２．０μＬ／分～８．０μＬ／分であってもよい。多孔膜に接触させた培地は、層流となるように還流されることが好ましい。

一実施態様において、本発明の方法は、肺オルガノイド、胸腺オルガノイドまたは精巣オルガノイドであるに適用することが可能であり、好ましくは腎オルガノイドに適用される。

ＩＩＩ．三次元生体組織培養デバイス
図１（図１－１～３）は、一実施形態における、三次元生体組織培養デバイス１０を示す。三次元生体組織培養デバイス１０は、セルカルチャーインサート保持部１１と、セルカルチャーインサート保持部１１の底部１１０の一部に設けられた少なくとも１つの流路１２と、流路１２に培地を供給するための培地供給管１３と、前記流路１２から培地を排出するための培地排出管１４とを備えている。

セルカルチャーインサート保持部１１は、図２に示されるように、セルカルチャーインサート２０が保持できるよう設計されており、本体部１５の一部である内壁１１１と底部１１０によって規定される。セルカルチャーインサート２０は、底部１１０に載置される。セルカルチャーインサート保持部１１の形状や大きさは、載置されるセルカルチャーインサート２０の形状に応じて選択される。例えば、図２－１（Ａ）に示されるように、セルカルチャーインサート２０が円錐台形である場合、本体部１５の内壁１１１は、セルカルチャーインサート本体２１が密着して嵌合するように、嵌合手段として、テーパ構造を有しても良い。これにより、セルカルチャーインサート２０をセルカルチャーインサート保持部１１に密着させることができる。また、セルカルチャーインサート保持部１１は、嵌合手段として、シール部材、例えばＯリングを有することにより、セルカルチャーインサート２０を密着させることもできる。セルカルチャーインサート２０が、例えば、円柱形又は角柱形である場合は、それらが密着して嵌合するように、セルカルチャーインサート保持部１１の内壁１１１も円柱形又は角柱形を有する。

底部１１０の一部には、少なくとも１つの流路１２が形成されている。流路１２には、本体部１５に設けられた培地供給管１３と培地排出管１４が流体連通している。培地供給管１３は、一実施態様において、培地供給管１３及び培地排出管１４は、図２－１（Ａ）のように、本体部１５の本体部上面１５０に対して略垂直に設けられている。これにより、三次元生体組織培養デバイス１０を培養容器３０に設置した場合、培養容器３０の上部から培地を供給・排出することができる。しかしながら、培地供給管１３及び培地排出管１４の位置や形状は、適用される培養容器３０の形状や、設置する場所等によって適宜変更することができるために、特に限定されない。

図１及び２に示されるように、流路１２の上面の一部は、流路上部開口部１２１を有している。流路上部開口部１２１は、セルカルチャーインサート保持部１１の底部１１０の一部に形成されている。セルカルチャーインサート２０がセルカルチャーインサート保持部１１に載置された時に、流路上部開口部１２１は、セルカルチャーインサート２０の多孔膜２２の下面により覆われる。これにより、流路１２を流れる培地が、多孔膜２２の直下を通過することとなる。

一実施形態において、流路１２は、流路底部開口部１２２を有している（図１－１（Ｂ）、図１－２参照）。本体部１５の本体部底面１５１が、培養容器３０の培養容器底面３１と密着することにより、培養容器底面３１が流路１２の底面となる。三次元生体組織培養デバイス１０が流路底部開口部１２２を有することにより、三次元生体組織を培養しながら、例えば倒立顕微鏡により観察可能もなる。また、三次元生体組織培養デバイス１０を製造する場合、例えば３Ｄプリンターや、射出成形などによって、１つのパーツとして製造することも可能となり、製造工程が容易となる。

一実施態様において、培養容器３０が円錐台形である場合、本体部１５は、培養容器３０と密着して嵌合するように、嵌合手段として、例えばテーパ構造を有しても良い。これにより、三次元生体組織培養デバイス１０を培養容器３０に密着させることができる。また、本体部１５は、嵌合手段として、シール部材、例えばＯリングを有することにより、培養容器３０の内壁に密着させることもできる。培養容器３０の内壁が、例えば、円柱形又は角柱形である場合は、それらが密着して嵌合できるように、本体部１５も円柱形又は角柱形を有する。

流路１２は、培地が流された場合に、層流となることが期待されるよう設計されている。一般に、流体が層流となるか、または乱流となるかは、レイノルズ数を計算することによって予測することができる。レイノルズ数は、以下の式によって求めることができる。

ここで、Ｕ：代表流速（円管の場合、平均流速）、Ｌ：代表長さ（円管の場合、内径）、ν：動粘性係数、を表す。

一般に、流路が円管である場合は、レイノルズ数（Ｒｅ）が２３００未満であれば、層流と判断される。一実施態様のように、流路１２の断面（培地の流れ方向に垂直断面）が矩形である場合、流体平均深さｍ＝Ａ／Ｓ（Ａ：断面積、Ｓ：断面の周囲長）に近似するため、代表長さ（Ｌ）＝４ｍ、すなわち、「Ｌ＝４×流路の高さ」を上記式に代入することにより、レイノルズ数を計算することができる。レイノルズ数を算出することによって、層流となることが期待される流路１２を適宜設計することが可能となる。

したがって、層流となる流路１２の高さは、使用される培地の流速や動粘度係数などによって変わるために限定されないが、例えば、一般に使用される培地を灌流させる場合、流路１２の高さは、０．１ｍｍ～５．０ｍｍ、０．５ｍｍ～３．０ｍｍ、０．５ｍｍ～２．０ｍｍ、１．０ｍｍ～２．０ｍｍであれば、層流となることが期待される。培養中に三次元生体組織を観察する用途で用いる場合、流路１２の高さは２．０ｍｍ以下であることが好ましく、例えば、０．１ｍｍ～２．０ｍｍが好ましい。

図３は、三次元生体組織培養デバイス１０、セルカルチャーインサート２０及び培養容器３０を組み合わせた培養デバイスアセンブリ４において、流路１２に培地を灌流させた状態を示す模式図である。上述のように、培地は流路１２内を層流で流れるため、多孔膜２２を通過する培地の量は十分に少ないものと仮定することができる。流路１２の幅が、流路１２の高さに比べて広い場合、例えば、流路１２の「幅／高さ」（すなわち、アスペクト比）が、２．０以上、好ましくは３．０以上、より好ましくは３．５以上、さらに好ましくは４．０以上（例えば、４．５以上、５．０以上、１０．０以上）である場合、培地の流れは、流路１２の中央部では平面ポアズイユ流れ（ｐｌａｎｅ Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅ ｆｌｏｗ）に近似し、流路入口１２３から流路出口１２４に向かってわずかな圧力勾配が生じる。すなわち、流路入口１２３付近では、多孔膜を通ってセルカルチャーインサート２０に流れる向きの微小流が生じ、流路出口１２４付近では、多孔膜を通ってセルカルチャーインサート２０から排出される向きの微小流が生じる。これにより、多孔膜上に載置された三次元生体組織ＯＧ周辺には、極めて緩やかな培地の流れが生じることになる（図３の参照）。その結果、三次元生体組織ＯＧには、三次元生体組織を構成する細胞が分泌する分化に必要な因子が洗い流されずにとどまり、かつ、栄養を含む培地が供給される。

図４（図４－１～図４－２）は、他の実施形態である三次元生体組織培養デバイス１０ａを示す。各部材の符号の番号に「ａ」が付加されていること以外、三次元生体組織培養デバイス１０に設けられた各部材と同一の符号番号が付与されている各部材についての説明は、三次元生体組織培養デバイス１０の対応する各部材についての上述の説明が適用される。ここでは、三次元生体組織培養デバイス１０の各部材の説明が適用されない部材についてのみ説明する。

三次元生体組織培養デバイス１０ａは、本体部１５ａの側面に、培地供給管１３ａ及び培地排出管１４ａが設けられている。培地供給管１３ａ及び培地排出管１４ａは、流路１２ａとそれぞれ流体連通している。流路１２ａは、三次元生体組織培養デバイス１０とは異なり、流路底部開口部１２２（図１－１（Ｂ）、図１－２参照）は有しない。そのため、三次元生体組織培養デバイス１０ａは、培養容器３０と共に使用することを要しない。本体部１５ａは、培養容器３０と共に使用しないので、任意の形状であってもよい。

また、他の実施形態において、三次元生体組織培養デバイス（１０、１０ａ）は、セルカルチャーインサート保持部（１１、１１ａ）に載置されたセルカルチャーインサート２０を予め備えたものであってもよい。

ＩＶ．三次元生体組織培養システム
図５は、一実施態様における三次元生体組織培養システム１を示している。三次元生体組織培養システム１は、三次元生体組織培養デバイス１０と、三次元生体組織培養デバイス１０のセルカルチャーインサート保持部１１に載置されたセルカルチャーインサート２０と、培地供給管１３に接続された培地供給ライン１７と、培地供給ライン１７に培地を供給する培地供給槽５と、培地供給ライン１７に培地を送る送液ポンプ１９と、培地排出管１４に接続された培地排出ライン１８と、培地排出ライン１８から排出された培地を貯留する培地排出槽（図５では、培地供給槽５に相当）と、を備えている。培地供給ライン１７と培地供給管１３、及び、培地排出ライン１８と培地排出管１４は、アダプタ１６によって接続されている。

図５のように、三次元生体組織培養システム１は、培地供給槽５と、培地排出槽が同一であり、培地が循環するものであってもよく、培地供給槽５と、培地排出槽とが、別々に提供され、常に新鮮な培地が提供されるものであってもよい。送液ポンプ１９は、公知のポンプを用いることが可能であり、チューブポンプ（ペリスタポンプ）であってもよく、ピエゾポンプであってもよく、流体を送り出すことができるポンプであれば使用することができる。他の実施形態において、送液ポンプ１９と培地供給槽５とが一体となったものである、シリンジポンプであってもよい。

図６に示されるように、他の実施形態において、三次元生体組織培養システム１ａは、２以上の三次元生体組織培養デバイス１０（図６では、培養デバイスアセンブリ４に相当）が接続ライン１８０によって連結されたものであってもよい。２つ以上の三次元生体組織培養デバイス１０を連結させることにより、例えば、それぞれのセルカルチャーインサート２０に、同一の又は異なる三次元生体組織を適用し、培地を共有させた灌流培養が可能となる。これにより、離れた位置で培養された三次元生体組織が、培地を共有することによって起こる現象を観察することができる。例えば、１つの三次元生体組織培養デバイス１０に設置されたセルカルチャーインサート２０上の三次元生体組織に、任意の細胞（例えば、がん細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞など）を移植し、その後、灌流培養することにより、移植した細胞が浸潤し、他の三次元生体組織培養デバイス１０に設置されたセルカルチャーインサート２０上の三次元生体組織に転移する現象を解析し得る。

三次元生体組織培養システム（１、１ａ）に使用される三次元生体組織培養デバイス（１０、１０ａ）は、キットとして提供されてもよく、例えば、三次元生体組織培養デバイス（１０、１０ａ）と、セルカルチャーインサート２０とが同梱されたキットであってもよく、三次元生体組織培養デバイス（１０、１０ａ）と、セルカルチャーインサート２０とが別々に提供されるキットであってもよい。セルカルチャーインサート２０は、市販のものを使用することができ、使用されるセルカルチャーインサート２０の多孔膜２２の平均孔径は、培養される三次元生体組織の種類、大きさ、用途などに応じて、適宜選択することができ、例えば、０．０１μｍ～１００μｍの平均孔径（例えば、０．０１μｍ～５０μｍ、０．０１μｍ～１０μｍ、０．１μｍ～５０μｍ、好ましくは０．１μｍ～１０μｍ）を有する多孔膜を備えたセルカルチャーインサート２０を使用することができる。多孔膜２２の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍであれば、三次元生体組織に含まれる細胞が多孔膜２２の下面へ移動することが防止され、好ましい。また、使用されるセルカルチャーインサート２０の多孔膜２２の細孔の密度は、培養される三次元生体組織の種類、大きさ、用途などに応じて、適宜選択することができる。多孔膜２２の内外の培地交換効率の観点から、１×１０^５／ｃｍ^２以上、好ましくは５×１０^５／ｃｍ^２以上、より好ましくは１０×１０^５／ｃｍ^２以上、さらに好ましくは５０×１０^５／ｃｍ^２以上、最も好ましくは１００×１０^５／ｃｍ^２以上の細孔の密度を有する多孔膜２２を備えるセルカルチャーインサート２０を使用することができる。また、セルカルチャーインサート２０の多孔膜２２の平均膜厚は、例えば、５μｍ～５００μｍ、５μｍ～１００μｍまたは５μｍ～５０μｍである。また、セルカルチャーインサート２０の多孔膜２２の材質としては、例えばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等があげられるが、これに限定されない。

三次元生体組織培養デバイス１０に適用される培養容器３０は、本体部１５の形状に応じて適宜選択することができ、市販の培養容器（例えば、６ウェル培養皿、１２ウェル培養皿、３５ｍｍ培養皿、１００ｍｍ培養皿など）を使用してもよい。

本発明の三次元生体組織の培養方法、並びに三次元生体組織培養デバイス及びシステムを用いることにより、従来では維持培養が難しかった三次元生体組織を維持培養可能となる。また、本発明の三次元生体組織培養デバイス及びシステムを用いることにより、新規治療薬のスクリーニングや、毒性試験などを実施することも可能となる。

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

（実施例１）
１．材料及び実験方法
１－１．三次元生体組織培養デバイスの作製
三次元生体組織培養デバイスは３ＤＣＡＤ設計データを元に、３Ｄプリンター（ストラタシス社ｏｂｊｅｃｔ Ｅｄｅｎシリーズ、樹脂ＭＥＤ６１０）を用いて作製し、サポート材を水酸化ナトリウムにて溶解して作製した。

具体的には、三次元生体組織培養デバイスのセルカルチャーインサート保持部は、１２ウェルセルカルチャーインサート（ファルコン製）が載置可能なように、直径１４．２ｍｍに設計し、流路の幅は５ｍｍ、流路の高さは１ｍｍとなるように設計した（図１－３を参照）。また、三次元生体組織培養デバイスの本体部は、６ウェルプレートに設置可能に設計した。こうして設計した三次元生体組織培養デバイスの流路を流れる培地について、レイノルズ数を計算した。

培地の粘度が０．６ｍＰａ・Ｓ、培地の密度が１０００ｋｇ／ｍ^３と仮定すると、動粘性係数ν＝０．６ｍｍ^２／ｓとなる。流路の幅が５ｍｍ、流路の高さが１ｍｍであるので、流量Ｑ＝５ｍｍ×１ｍｍ×代表流速Ｕより、Ｕ＝Ｑ／５ｍｍ^２となる。代表長さ（Ｌ）＝４×流体平均深さ、であるので、Ｌ＝４×１ｍｍ＝４ｍｍとなる。これより、レイノルズ数は、以下のように算出することができる。Ｒｅ ＝ ＵＬ／ν＝（Ｑ／５ｍｍ^２）×（４ｍｍ）／（０．６ｍｍ^２／ｓ） ≒ Ｑ×１．３３ｓ／μＬ

流量Ｑ＝２５μＬ／ｍ（すなわち、Ｑ≒０．４２μＬ／ｓ）であると仮定すると、Ｒｅ≒（０．４２μＬ／ｓ）×（１．３３ｓ／μＬ） ≒ ０．５６となる。すなわち、レイノルズ数が２３００よりはるかに小さいために、培地の液流は層流となることが期待できる。

三次元生体組織培養デバイスの流路は、高さに対して幅が十分に広い矩形流路（幅：５ｍｍ、高さ：１ｍｍ）であるため、流路の中央部での粘性流体の流れは、平面ポアズイユ流れに近似する。上述のように、培地の流れは層流であり、流路の開口部を覆った多孔膜を通過する液量が十分に少ないものと仮定すると、流速は、以下の式に近似する分布となる。

式中、ｘ：流路長手方向座標、ｙ：高さ方向座標、ｕ：流速、Ｕ_ｍａｘ：最大流速、Ｕ_ｍｅａｎ：平均流速、Ｑ：単位奥行き当たりの流量、ｐ：圧力、ρ：密度、ｈ：流路の高さ、ν：動粘性係数、を示す。

上記式（３）を変形すると、
ｄｐ／ｄｘ ＝ －Ｕ_ｍａｘ×（８ρν）／ｈ^２（・・・（６））
となる。
さらに、式（５）から、式（６）は、
ｄｐ／ｄｘ ＝ －３／２Ｕ_ｍｅａｎ×（８ρν）／ｈ^２（・・・（７））
と変形することができる。ρνは粘度であるため、ρν＝０．６ｍＰａ・Ｓであり、Ｕ_ｍｅａｎ＝ Ｑ／５ｍｍ^２ ＝ （０．４２μＬ／ｓ）／５ｍｍ^２、ｈ＝１ｍｍを、式（７）に代入することで以下の値が算出される。
ｄｐ／ｄｘ ＝ －３／２Ｕ_ｍｅａｎ×（８ρν）／ｈ^２ ＝ －３／２（（０．４２μＬ／ｓ）／５ｍｍ^２）×（８×０．６ｍＰａ・Ｓ）／（１ｍｍ）^２ ＝ －０．６ｍＰａ／ｍｍ

従って、三次元生体組織培養デバイスの流路長１４．２ｍｍ（セルカルチャーインサート保持部の直径に相当）の流路入口から流路出口まで、－０．６ｍＰａ／ｍｍの微小な圧力勾配を生じる。これにより、流路入口付近では、多孔膜を通ってセルカルチャーインサートに流れる向きの微小流が生じ、流路出口付近では、多孔膜を通ってセルカルチャーインサートから排出される向きの微小流が生じ、多孔膜上に載置された三次元生体組織に、緩やかな培地の流れが生じる。

１－２．三次元生体組織培養システムの組み立て
三次元生体組織培養デバイスは、６ウェルインサート用プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の蓋に、培地供給管及び培地排出管を挿入するための孔を作製し、滅菌した。三次元生体組織培養デバイスを６ウェルプレートに設置し、さらに、三次元生体組織を載置した０．４μｍポアまたは３．０μｍ、１２ウェルのセルカルチャーインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｆａｌｃｏｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｕｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、Ｃａｔ＃３５３４９４または＃３５３２９２）を三次元生体組織培養デバイス上に設置した。それを蓋で覆い、培地供給管及び培地排出管にシリコンチューブを接続し、マイクロペリスタポンプ（アイカムス・ラボ）と接続した。培地供給ライン及び培地排出ラインであるシリコンチューブを培地供給槽と接続した。

１－３．灌流試験
灌流の動態を調べるために、蛍光ビーズ（Ｃａｔ．＃１７１４９、Ｌｏｔ．５３６３０９、平均粒径０．０３９４μｍ、２．５％（ｗ／ｖ）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を含有したＰＢＳ２００μＬ（０．０５％溶液）を、培地供給ラインに設けた三方活栓から導入した。Ｎｉｋｏｎ顕微鏡に接続したカメラで１分間撮影し、ビーズの移動距離をアクアコスモス（浜松フォトニクス）にて計測して移動度を解析した（図７（Ａ）のＦ１、及び図７（Ｂ））。また、セルカルチャーインサート内の液体の動態は、直径１０μｍの蛍光ビーズ（３．６ × １０^６ ｂｅａｄｓ／ｍＬ，ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）約６％含有するＰＢＳ溶液をセルカルチャーインサート内だけに入れて灌流を行い、２秒毎１～１．５分間のビーズの動態を記録し、移動度を解析した（図７（Ａ）のＦ２、及び図７（Ｃ））。

２．結果
流路に液体を流すことによって、多孔膜上の蛍光マイクロビーズが移動することを確認した。従って、理論通り、多孔膜上に緩やかな液流が生じることを確認することができた（図７（Ｃ））。

（実施例２）
１．材料及び実験方法
１－１．ｉＰＳ細胞の維持培養
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７、Ｌｏｔ Ｎｏ．１８）はＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ ｂａｎｋより分与された株を使用し、継代ｐ８～２３の間のｉＰＳ細胞を実験に使用した。ｉＰＳ細胞は、フィーダーレスで維持培養した。具体的には、予め０．４ｍｇ／ｃｍ^２ ｉｍａｔｒｉｘ－５１１（ＷＡＫＯ）でコーティングした培養皿に、４～５×１０^３個のｉＰＳ細胞を播種し、１０μＭ Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２、ＷＡＫＯ）を添加した維持培地にて培養し、２４時間以内に維持培地（ＡＫ０２Ｎ、ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ）に交換した。細胞数が増えないうちは２日に一回の培地交換を行い、細胞数が増加し、コロニーが直径１ｍｍ前後に育った後は毎日培地交換を行った。継代は、コロニー同士が融合し始める４０～５０％コンフルエントの状態で行った。ＰＢＳ（ＷＡＫＯ）で洗浄後、２分の１希釈したＴｒｙｐＬＥＴ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、７分間３７℃でインキュベーション後、剥離し、細胞数を計測し、適宜培養を続けた。保存する場合はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｅｒ（ゼノアック）を用いた緩慢凍結法で凍結した。

１－２．腎オルガノイドの誘導
腎オルガノイドは、Ｔａｋａｓａｔｏらの手法に従って行った（Ｔａｋａｓａｔｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｏｃｔ．２２；５２６（７５７４）：ｐｐ．５６４－５６８．）。具体的には、ｉＰＳ細胞を３５ｍｍ^２培養皿上で培養し、７０～８０％コンフルエントになった状態で０．８μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＷＡＫＯ）を含有するＸｅｎｏ－ｆｒｅｅ培地（ＡＰＥＬ２，ＳＴＥＭＣＥＬＬ）で４日間培養した。その後２日間、２μｇ／ｍＬのＦＧＦ９（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ）含有Ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ培地にて培養を続けた。その後、細胞を３次元化するために培養皿より継代試薬にて剥離し、細胞数６．２５×１０^５個／１００～２００μＬ／チューブの濃度に懸濁液を調製し、４００×ｇで３分間室温にて遠心した。得られたペレットを１２ウェルプレート用の０．４μｍポアのセルカルチャーインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｆａｌｃｏｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ、Ｃａｔ＃３５３４９４）の中央に移した。その後、セルカルチャーインサートを１２ウェルプレートのウェルに設置し、ウェル内にのみ培地（０．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ Ｙ２７６３２添加ＡＰＥＬ）添加し、３７℃で１時間インキュベータした。その後、２μｇ／ｍＬ ＦＧＦ９添加ＡＰＥＬ培地に交換して培養した。２日に一回、培地を交換し、培養を継続した（図８（Ａ）参照）。

１－３．灌流培養条件
遺伝子解析を行い、腎オルガイドが、腎臓細胞を誘導する時期を探索した。腎臓細胞の誘導時期に３日間オルガノイドを灌流培養した。灌流用の培地総量は２．５ｍＬ～３ｍＬを用い、灌流速度は０～１００μＬ／分の間にて設定した。培地は１．５日毎に全量を交換した。オルガノイド培養システムは、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内に設置した。ポンプコントローラーはインキュベータの外部に設置した。タイムラプスで観察する時は顕微鏡の周囲のチャンバーを３７℃に保ち、マルチウェルプレートの非使用ウェルに滅菌水を加えて５％ＣＯ_２をバブリングで供給して観察した。

１－４．腎オルガノイド灌流培養
遺伝子解析及び形態的解析の結果より、確実に腎臓細胞の誘導が進んだ誘導１８日目からオルガノイドの灌流培養を行った。６ウェルマルチウェルプレート内にオルガノイド培養デバイスを入れ、オルガノイドを載せた１２ウェルセルカルカルチャーインサートを設置し、蓋をした。その後、３方活性にてポンプを接続したシリコン製の灌流チューブを接続し、培地を充填して泡を除いた後に灌流を開始した。対比コントロールとして、約２ｍｍ程度の間隙を形成したオルガノイド培養デバイス上に１２ウェルセルカルカルチャーインサートを載置し、それを３ｍＬの培地を入れた５ｃｍ培養皿に載置し、灌流群と使用培地量を揃えることで検討した。

１－５．遺伝子解析
各々の培養期間で得られたオルガノイドを回収し、ＲＮＡ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ量を計測後、同量のＲＮＡ量をＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ（ＡＢＩ Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて逆転写反応させ、ｃＤＮＡを作製した。Ｔａｑｍａｎプローブ（ＡＢＩ Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｖｉａ７にて反応・解析を行った。標準サンプルを用いて相対的標準曲線を作成し、それを用いて定量計算を行った。内部標準はＡＣＴＢを用いた。

１－６．免疫組織染色
各々の培養期間で得られた腎オルガノイドを、４％パラフォルムアルデヒド（武藤化学）で固定し、４℃で保存した。凍結ブロックを作製するために、固定した腎オルガノイドを１５％ショ糖／ＰＢＳで３０分間処理し、新しい１５％ショ糖／ＰＢＳに交換して再度３０分間処理した。その後、３０％ショ糖／ＰＢＳに交換して３０分処理し、新しい３０％ショ糖／ＰＢＳに交換して再度３０分間処理した。得られた組織からＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテック・ジャパン）を用いて凍結ブロックを作製し、－８０℃で保存を行った。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用い、８μｍ厚にて薄切した凍結切片を作製し、それを染色に用いた。

１－７．組織内灌流培養液分布状態の可視化
灌流培養時、２日間 ０．５ｍｇ／ｍＬ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ（７０，０００ ＭＷ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）を含有する培養液で灌流し、その後、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定を行った。得られたオルガノイドから凍結切片を作製し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ陽性領域（図９Ａ）を灌流液体の組織内通過領域と見なすことで動態の可視化を行った。用いた試薬は以下の通りである。

＜一次抗体＞
・ＣＫ８（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａｂｃａｍ）１／２００希釈
・Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｃｉｎ（ｇｏａｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｒ＆Ｄ）１／５００希釈・ＰＤＧＦβｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａｂｃａｍ）１／２００希釈
・Ａｃｔｉｖｅ－Ｃａｓｐａｓｅ－３（ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａｂｃａｍ）１／２００希釈
・ＣＫ１９（ｒａｂｂｉｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａｂｃａｍ）
＜二次抗体＞
・ｍｏｕｅｓ ＩｇＧ Ｒｈｏｄａｍｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
・ｒａｂｉｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
・Ｇｏａｔ ＩｇＧ ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
それぞれ１／２００希釈にて使用。
＜核染色＞
・Ｈｏｅｃｈｘｉｓｔ ３３５２８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）１／５００希釈

２．結果
ｉＰＳ細胞から腎オルガノイドを誘導した（図８（Ａ））。その結果、腎臓細胞の遺伝子発現や形態形成は誘導１２日後より徐々に増加しはじめ、１８日後でピークを示すことが明らかとなった（図８（Ｂ）および（Ｃ））。

図９は、腎オルガノイドの灌流培養の結果を示している。腎オルガノイド下部の１００μｍ前後に培地が侵入していることが確認された。

図１０は、灌流による腎オルガノイド内の尿管芽組織および誘導尿細管構造の変化の結果を示している。ＣＫ８陽性細胞は、２．５μＬ／分の灌流で増加する傾向が観察された。

図１１は、灌流による腎オルガノイド内の遺伝子発現の変化を示している。尿管芽分岐点に発現するＰＡＸ８の発現は２．５μL／分の灌流で最も発現が上昇していた。

図１２は、灌流による尿管芽細胞の内腔拡張の様子を示す図である。灌流量の増加に伴い、尿管芽細胞の内腔が拡張する傾向が観察された。

（比較例）
腎オルガノイドの浸漬培養
誘導１８日目（３次元化１２日目）の腎オルガノイドを培養しているセルカルチャーインサート内に培地３００μＬを添加し、さらに３日間培養を行った（図１３）。

その結果、器官培養（気－液界面維持培養）から浸漬培養へ切り替えると、３日後には腎オルガノイドの３次元構造と内部組織構造が崩壊した（図１３）。

（考察）
図１４は、本発明で培養される腎オルガノイドの環境と胎内腎環境との類似点を説明する図である。本発明によって、オルガノイドは、気相から酸素が供給され、同時に、栄養が多孔膜直下を流れる液相（培地）によって供給される。本発明により実現される培養環境は、下部から上部に向かって層状に伝達する、胎児腎の血流環境と類似しており、これを模倣する環境になっているものと考えられる。

（実施例３）
１．実験方法
実施例１で作製した２個の三次元生体組織培養デバイスの流路を約２．８ｃｍポリプロピレン製コネクタで連結した。実施例２の方法により得られた腎オルガノイドを、２個の三次元生体組織培養デバイス上のセルカルチャーインサート上にそれぞれ載置した。片方の腎オルガノイドに、５０μＬのＩ型コラーゲンゲル内に包埋した１０^５個のＧ４０１細胞（小児腎癌細胞株）を移植し、約３ｍＬの培地（ＡＰＥＬ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ社 腎オルガノイド用培地）を２．５μＬ／分で灌流しながら７日間培養した。

なお、コントロール（静置培養）として、３ｍＬのＡＰＥＬ培地を入れた６ウェルプレートの１ウェルに、腎オルガノイドを載置したセルカルチャーインサートをセットし、Ｉ型コラーゲンゲル内に包埋した１０^５個のＧ４０１細胞（小児腎癌細胞株）を移植し、同様に７日間培養した。

２．結果
癌細胞を包埋したＩ型コラーゲンゲルは灌流培養により溶解が進行していた（図１５）

（実施例４）
１．実験方法
実施例１で作製した２個の三次元生体組織培養デバイスの流路を約２．８ｃｍポリプロピレン製コネクタで連結した。実施例２の方法により得られた腎オルガノイドを、２個の三次元生体組織培養デバイス上のセルカルチャーインサート上にそれぞれ載置した。片方の腎オルガノイドに、培地１ｕＬに懸濁した１００個のＧ４０１細胞を滴下して移植した。約３ｍＬの培地（ＡＰＥＬ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ社 腎オルガノイド用培地）を２．５μＬ／分で灌流しながら１４日間培養した。

培地交換後、回収した灌流後の培地を遠心分離して細胞を回収し、Ｇ４０１用１０％血清添加ＭａＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地に懸濁して、６ｗｅｌｌプレートの１ｗｅｌｌに加え、コンフルエントになるまで増殖させた。その後、無血清の培地で２４時間培養し、培養上清中に含まれるＨｕｍａｎ ＭＭＰ９の量をＥＬＩＳＡ法で測定した。コントロールとして、Ｇ４０１細胞が１個／ウェルとなるように９６穴プレートにてクローニングし、同様に増殖させた培養上清を使用した（図１６の「１ ｃｅｌｌ／ｗ（Ｍ）」）。

２．結果
灌流培養５日後の灌流培地から採取した細胞を、血清入り培地で１８日間培養した結果、癌細胞が検出され、滴下移植後に灌流培地内に癌細胞が浸潤していたことが確認された。

灌流培養３日後と７日後以降の灌流培地から採取した細胞を、血清入り培地で１８日間培養した結果、ＭＭＰ９発現の高い間葉系細胞が検出された（図１６）。Ｇ４０１細胞ではメタロプロテアーゼ活性は低かった（図１６）。

１、１ａ 三次元生体組織培養システム
１０、１０ａ 三次元生体組織培養デバイス
１１、１１ａ セルカルチャーインサート保持部
１１０、１１０ａ 底部
１１１ 内壁
１２、１２ａ 流路
１２０、１２０ａ 流路内壁
１２１、１２１ａ 流路上部開口部
１２２ 流路底部開口部
１２２ａ 流路底部
１２３ 流路入口
１２４ 流路出口
１３ 培地供給管
１３０ 下部培地供給口
１３１ 上部培地供給口
１４ 培地排出管
１４０ 下部培地排出口
１４１ 上部培地排出口
１５、１５ａ 本体部
１５０、１５０ａ 本体部上面
１５１、１５１ａ 本体部底面
１６ アダプタ
１７ 培地供給ライン
１８ 培地排出ライン
１８０ 接続ライン
１９ 送液ポンプ
２０ セルカルチャーインサート
２１ セルカルチャーインサート本体
２２ 多孔膜
３０ 培養容器
３１ 培養容器底面
４ 培養デバイスアセンブリ
５ 培地供給槽
ＯＧ 三次元生体組織
Ｍ 培地

Claims (14)

1. 三次元生体組織の培養方法であって、
   培地の成分が透過する多孔膜の一方の面に載置された三次元生体組織を気相に曝露させ、かつ、前記多孔膜の他方の面に接触させた培地を、前記多孔膜と平行な液流で灌流させながら、前記三次元生体組織を培養する工程であって、前記液流が層流である、工程、
   を含む、方法。
2. 前記多孔膜が、前記多孔膜の厚み方向に貫通する細孔を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記多孔膜が、セルカルチャーインサートの多孔膜である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記三次元生体組織が、腎オルガノイド、肺オルガノイド、胸腺オルガノイドまたは精巣オルガノイドである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記三次元生体組織が、腎オルガノイドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記培地が、０．０１μＬ／分以上の流速で灌流される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. セルカルチャーインサート保持部と；
   前記セルカルチャーインサート保持部の底部の一部に設けられた少なくとも１つの流路と；
   前記流路に培地を供給するための培地供給管と；
   前記流路から培地を排出するための培地排出管と、
   を備え、
   ここで、前記流路の上面の一部は流路上部開口部を有し、セルカルチャーインサートが前記セルカルチャーインサート保持部に載置された時に、前記流路上部開口部が前記セルカルチャーインサートの多孔膜の下面により覆われており、前記流路の形状は、培地を流した場合、層流となるよう形成されていることを特徴とする、
   三次元生体組織培養デバイス。
8. 前記セルカルチャーインサート保持部が、前記セルカルチャーインサートと密着させるための嵌合手段を有する、請求項７に記載の三次元生体組織培養デバイス。
9. 前記嵌合手段が、テーパ構造及びシール部材からなる群から選択される１以上の嵌合手段である、請求項８に記載の三次元生体組織培養デバイス。
10. 前記流路の形状において、幅／高さが、２．０以上である、請求項７～９のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
11. 前記流路の高さが、約０．１ｍｍ～約５ｍｍである、請求項７～１０のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
12. さらに、前記セルカルチャーインサート保持部に載置されたセルカルチャーインサートを備える、請求項７～１１のいずれか１項に記載の三次元生体組織培養デバイス。
13. 請求項１２に記載の三次元生体組織培養デバイスと、
    前記培地供給管に接続された培地供給ラインと、
    前記培地供給ラインに培地を供給する培地供給槽と、
    前記培地供給ラインに培地を送る送液ポンプと、
    前記培地排出管に接続された培地排出ラインと、
    前記培地排出ラインから排出された培地を貯留する培地排出槽と、
    を備える、三次元生体組織培養システム。
14. 前記培地供給槽と、前記培地排出槽が同一であり、培地が循環することを特徴とする、請求項１３に記載の三次元生体組織培養システム。

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