JP7522482B2

JP7522482B2 - クローディン１８．２の抗体及びその使用

Info

Publication number: JP7522482B2
Application number: JP2022573795A
Authority: JP
Inventors: 周清; 許伝営; 粘偉紅; 何向宇; 鄭欣桐; 張新敏; 何峰; 肖▲靖▼
Original assignee: Shanghai Escugen Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Escugen Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2021-02-10
Publication date: 2024-07-25
Anticipated expiration: 2041-02-10
Also published as: AU2021218927A1; CN115461373A; WO2021160155A1; JP2023513401A; US20230096452A1; KR102929927B1; EP4105238A4; KR20220140786A; AU2021218927B2; CA3167349A1; CN115461373B; EP4105238A1

Description

本発明は、抗体の技術分野に関し、また、該抗体の使用及び製造方法に関する。具体的には、クローディン１８．２の抗体及びその使用に関する。

クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）は分子量２０～３０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、そのファミリーには計２４個のメンバーが含まれており、多くの組織で発現し、細胞間密着結合（ＴＪ：ＴｉｇｈｔＪｕｎｃｔｉｏｎｓ）構造を形成するための重要な分子である。上皮細胞又は内皮細胞は細胞表面で発現する密着結合分子（Ｃｌａｕｄｉｎ分子を含む）を介して高度に規則的な組織の結合、即ち細胞間密着結合を形成し、上皮細胞ギャップでの分子の移動を制御する。ＴＪは正常な生理条件下での上皮細胞又は内皮細胞の恒常性や、細胞極性を維持するのに重要な役割を果たす。その中でも、注目を集めているのはクローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ１８、ＣＬＤＮ１８）であり、ＣＬＤＮ１８スプライス変異体１（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１、ＣＬＤＮ１８．１）とＣＬＤＮ１８スプライス変異体２（Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＤＮ１８．２）というスプライスによる２種類の変異体がある。

これらのうち、ＣＬＤＮ１８．２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は分子量２７．８ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、タンパク質のＮ末端及びＣ末端のいずれも細胞内にある。該タンパク質の主なコンフォメーションには４個の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と２個の細胞外ループ（ＥＣＬ）が含まれる。ＣＬＤＮ１８．２は複数種の哺乳類で高度に保存的であり、全長として２６１個のアミノ酸を含み、１～６位アミノ酸がＮ末端細胞内領域であり、７～２７位アミノ酸が膜貫通領域１（ＴＭＤ１）であり、２８～７８位アミノ酸が細胞外ループ１（ＥＣＬ１）であり、７９～９９位アミノ酸が膜貫通領域２（ＴＭＤ２）であり、１２３～１４４位アミノ酸が膜貫通領域３（ＴＭＤ３）であり、１００～１２２位アミノ酸がＴＭＤ２とＴＭＤ３を連結する細胞内領域であり、１４５～１６７位アミノ酸が細胞外ループ２（ＥＣＬ２）であり、１６８～１９０位アミノ酸が膜貫通領域４（ＴＭＤ４）であり、１９１～２６１位アミノ酸がＣ末端細胞内領域である。第１１６位のアスパラギンに１つの典型的なＮグリコシル化モチーフが存在する。

ＣＬＤＮ１８．１は、ＣＬＤＮ１８．２に比べて、タンパク質のＮ末端－膜貫通領域１－細胞外ループ１という領域内のＮ末端の最初２６個のアミノ酸配列に違いが存在し、残りの配列が同じである。

多くの証拠より明らかなように、胃、膵臓、食道などの組織の腫瘍細胞、特に腺癌サブタイプ腫瘍細胞においては、ＣＬＤＮ１８．２の発現レベルが顕著に活性化されている。正常な組織においては、ＣＬＤＮ１８．１は肺及び胃組織の上皮細胞で選択的に発現し、ＣＬＤＮ１８．２は寿命の短い胃腺状上皮粘膜組織（分化済みの腺上皮細胞）でのみ発現し、胃の上皮幹細胞で発現せず、分化済みの腺上皮細胞は胃の上皮幹細胞により絶えずに補充される。これらの分子の発現特性は抗体に基づくＣＬＤＮ１８．２関連癌の治療のための潜在的な可能性を提供する。

本発明は、胃癌、膵臓癌又は食道癌などの癌病変を効果的に治療できる癌治療用のＣＬＤＮ１８．２抗体を提供する。具体的には、本願は以下に関する。

１．ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとを含み、
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含むＣＬＤＮ１８．２抗体。
いくつかの実施形態では、本願は、以下から選択される重鎖ＣＤＲｓ及び軽鎖ＣＤＲｓと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、本願は、以下から選択される重鎖ＣＤＲｓ及び軽鎖ＣＤＲｓのアミノ酸配列の保存的変異配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２４に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６に示されるＣＤＲ３を含むか、又は
ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示されるＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示されるＣＤＲ２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示されるＣＤＲ３を含む。
２．ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６又はＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域を含む、項１に記載の抗体。
いくつかの実施形態では、本願は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、ＳＥＱＩＤＮＯ：３６又はＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
３．ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される軽鎖可変領域を含む、項１に記載の抗体。
いくつかの実施形態では、本願は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される軽鎖可変領域と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
４．１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される軽鎖可変領域と、又は
２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される軽鎖可変領域とを含む、如項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
いくつかの実施形態では、本願は、以下の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２に示される軽鎖可変領域、
２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される軽鎖可変領域。
５．１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される軽鎖可変領域と、
２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される軽鎖可変領域と、
３）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７に示される軽鎖可変領域と、
４）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示される軽鎖可変領域と、又は
５）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される軽鎖可変領域とを含む、項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
いくつかの実施形態では、本願は、以下の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。
１）ＳＥＱＩＤＮＯ：３４に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される軽鎖可変領域、
２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示される軽鎖可変領域、
３）ＳＥＱＩＤＮＯ：３６に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：３７に示される軽鎖可変領域、
４）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示される軽鎖可変領域、又は
５）ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域と、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される軽鎖可変領域。
６．キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
７．全長抗体である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
８．ＩｇＧ抗体である、項７に記載の抗体。
９．ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体断片である、項１～６のいずれか１項に記載の抗体。
１０．Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）_２である、項９に記載の抗体_。
１１．多重特異性抗体又は二重特異性抗体である、項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
１２．前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原である、項１１に記載の抗体。
１３．前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、項１２に記載の抗体。
１４．前記腫瘍抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１、及びＴｅｎＢ２から選択される、項１３に記載の抗体。
１５．項１～１０のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含む、免疫複合体。
１６．前記治療剤は化学療法薬である、項１５に記載の複合体。
１７．前記治療剤は細胞傷害性剤(細胞毒性剤)である、項１５に記載の複合体。
１８．項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む融合タンパク質又はポリペプチド。
１９．項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物。
２０．ＳＥＱＩＤＮＯｓ：１８～２９の１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
２１．ＳＥＱＩＤＮＯｓ：３０～３３の１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２０に記載の核酸。
２２．項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む項２１に記載の核酸。
２３．項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
２４．項２０～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列又は項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
２５．項１～１０のいずれか１項に記載の抗体の製造方法であって、項２４に記載の宿主細胞を培養して、培養物から前記抗体を単離することを含む製造方法。
２６．項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチドを含む医薬組成物の、癌治療薬の製造における使用。
２７．前記癌は消化器癌である、項２６に記載の使用。
２８．前記消化器癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項２７に記載の使用。
２９．項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌検出試薬。
３０．前記抗体又はその抗原結合断片は化学的に標識されたものである、項２９に記載の癌検出試薬。
３１．前記標識は酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は化学発光物標識である、項３０に記載の癌検出試薬。
３２．項２９～３１のいずれか１項に記載の癌検出試薬を含む癌診断キット。
３３．前記癌は胃癌、膵臓癌又は食道癌である、項３２に記載のキット。
３４．被検者の癌診断方法であって、項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド又は項２９～３１のいずれか１項に記載の検出試薬を被検者由来の組織サンプルと接触させることを含む診断方法。
３５．前記組織サンプルは被検者の体液（例えば血液、尿）及び組織切片（例えば組織生検サンプル）である、項３４に記載の診断方法。
３６．前記癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３４又は３５に記載の診断方法。
３７．項１～１４のいずれか１項に記載の抗体、項１５～１７のいずれか１項に記載の免疫複合体、項１８に記載の融合タンパク質又はポリペプチド、又は項１９に記載の医薬組成物の治療有効量を被検者に投与することを含む、被検者の癌治療方法。
３８．前記癌は消化器癌である、項３７に記載の方法。
３９．前記消化器癌は胃癌、膵臓癌及び食道癌から選択される、項３８に記載の方法。

ヒトｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥ（Ｔ－細胞エピトープペプチド）レトロウイルス発現プラスミドのＨＥＫ２９３－Ｔ細胞への一過性トランスフェクションである。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子のマウス腫瘍細胞株へのトランスフェクションマウス及びフローサイトメトリーによるｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞の選別である。ｈＣＬＤＮ１８．２、ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．２、ｍＣＬＤＮ１８．１を安定トランスフェクションした細胞株のフローサイトアッセイである。陽性対照抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出である。確認スクリーニングにおける陽性ハイブリドーマ陽性クローンとＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞との結合である。検証スクリーニングにおける一部の陽性ハイブリドーマクローンの５個の細胞株におけるフローサイトメトリー分析である。一部の陽性ハイブリドーマクローン上清のＡＤＣＣ効果である。ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対するハイブリドーマ単クローン上清のフローサイトメトリー分析である。陽性ハイブリドーマモノクローンの重鎖及び軽鎖のＶ領域のＰＣＲ増幅である。精製モノクローナル抗体タンパク質の還元ＣＥ－ＳＤＳ純度検出である。精製ヒトマウスキメラ体のモノクローナル抗体タンパク質の脱グリコシル化還元ＬＣ／ＭＳスペクトルである。精製ヒトマウスキメラモノクローナル抗体のＡＤＣＣ効果である。３－Ｌ４及び４－Ｉ１７の胃癌チップ組織の一部でのＩＨＣ染色である。ハイブリドーマクローン上清の正常な胃組織の凍結切片でのＩＨＣ染色である。４－Ｂ２３ハイブリドーマクローン上清のヒトの正常な組織での非特異的ＩＨＣ染色である。５－Ｍ９及び９－Ｄ１Ｆｖ領域の相同３Ｄモデリングである。５－Ｍ９及び９－Ｄ１のＶＨ及びＶＬと、ＣＤＲｓ移植受容フレームワークであるヒト生殖細胞系遺伝子との配列アラインメントである。９－Ｄ１ヒト化抗体分子タンパク質の精製後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出である。非熱処理／熱処理後の５－Ｍ９キメラ抗体及びヒト化抗体とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合である。５－Ｍ９キメラ抗体及びヒト化抗体の昆虫バキュロウイルスへの非特異的結合である。９－Ｄ１及びそのヒト化抗体の、ｈＣＬＤＮ１８．２低発現胃腫瘍細胞株ＫＡＴＯＩＩＩへの結合である。ヒト化抗体ｈ５Ｍ９Ｖ７のＤＳＦスペクトル及びＳＬＳスペクトルである。９－Ｄ１ヒト化抗体のＤＳＣ走査スペクトルである。９－Ｄ１ヒト化抗体分子のＳＥＣスペクトルである。９Ｄ１及び５Ｍ９ヒト化抗体の胃癌凍結切片でのＩＨＣ染色である。９Ｄ１及び５Ｍ９ヒト化抗体の健常者の主要な器官組織でのＩＨＣ染色である。９Ｄ１ヒト化抗体の担癌マウスへの抗腫瘍作用である。

以下図面を参照して本発明の具体的な実施例について詳細に説明する。図面においては本発明の具体的な実施例が示されているが、本発明は、ここでの実施例により限制されることなく、さまざまな形態で実現されてもよいことが理解される。むしろ、これらの実施例は本発明をより完全に理解できるようにし、本発明の範囲を完全に当業者に伝えるために提供されるのである。

１．定義
本明細書に記載の用語「抗体」は広義に使用され、ＣＬＤＮ１８．２に結合する、本明細書で開示された１つ又は複数のＣＤＲドメインを含む各種の抗体構造分子を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２）、線状抗体や一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）などを含むが、これらに限定されるものではなく、所望のＣＬＤＮ１８．２への結合活性を示すものであればよい。

当業者であれば、本発明で開示される１つ又は複数のＣＤＲドメインを他のポリペプチド配列の１種又は複数種と融合し、ＣＬＤＮ１８．２分子に結合する機能性融合タンパク質又はポリペプチド分子、例えばワクチン、細胞膜受容体拮抗薬、シグナル経路調整剤やキメラ抗原受容体分子などを製造することができる。例えば、本発明で開示される１つ又は複数のＣＤＲドメインを用いてＣＬＤＮ１８．２ＣＡＲ－Ｔ（ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＴ－ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法）分子を製造してもよい。本発明で開示される配列に基づいて誘導、製造された融合タンパク質分子も本発明の特許範囲に含まれる。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」における修飾語「モノクローナル」とは、該抗体が実質的に均質な抗体集団から得られるものであって、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体の製造中に生じる変異が微量しか含まれていないものをいう。異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤の代表例に比べて、モノクローナル抗体製剤中の各モノクローナル抗体は抗原上の単一のエピトープに対するものである。本発明のモノクローナル抗体は複数種の技術で製造されてもよく、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有する遺伝子改変動物を利用した方法が含まれるが、これらに限定されない。

「全長抗体」、「完全抗体」という用語とは、天然抗体の構造とほぼ類似している構造を有する抗体を指し、これらの用語は本明細書では交換して利用可能である。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、これらのうちのいくつかは、さらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）に分類されてもよい。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

「キメラ抗体」は１つの種に由来の少なくとも一部の重鎖可変領域と少なくとも一部の軽鎖可変領域、及び別の種に由来の少なくとも一部の定常領域を含む抗体である。例えば、一実施形態では、キメラ抗体はマウス可変領域とヒト定常領域を含んでもよい。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つのほぼ可変ドメイン全体を含み、ここで、全て又はほぼ全てのＨＶＲ（例えばＣＤＲ）は非ヒト抗体に対応するものであり、しかも、全て又はほぼ全てのＦＲはヒト抗体に対応するものである。任意により、ヒト化抗体は少なくともヒト抗体から誘導される抗体定常領域の一部を含んでもよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化形態」とはヒト化を受けた抗体のことである。

「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列から選ばれる最も一般的に存在しているアミノ酸残基を代表するフレームワークである。一般には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般には、配列サブグループは、Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD (1991),第1～3巻に記載のサブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、前記サブグループはＫａｂａｔら（同上）によるサブグループκＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、前記サブグループはＫａｂａｔら（同上）によるサブグループＩＩＩである。

「人間抗体」は「ヒト抗体」、「完全ヒト化抗体」又は「完全ヒト抗体」とも呼ばれ、そのアミノ酸配列が人間又は人間細胞から生じたアミノ酸配列に対応する抗体である。この人間抗体の定義は非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に排除する。人間抗体は本分野で公知のさまざまな技術で製造されてもよく、このような技術はファージディスプレイライブラリ技術、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marksら,J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)。Coleら,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,第77頁(1985);Boernerら,J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)の文献に記載されたような技術を含む。人間抗体は、抗原チャレンジに応答するように修飾されてこのような抗体を産生させるが、その内因性遺伝子座が能力を失った遺伝子改変動物（例えば免疫異種マウス）へ抗原を投与することにより製造されてもよい（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術については、例えば米国特許第６,０７５,１８１号及び第６,１５０,５８４号を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成された人間抗体についても、例えばＬｉら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103: 3557-3562 (2006)を参照する。

本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、抗体可変ドメインに配列超可変領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる）を有する、及び／又は構造が明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接点」）を含有する各領域である。一般には、抗体は、６個のＨＶＲ（ＣＤＲ領域）を含み、これらのうち、３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）はＶＨにあり、３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）はＶＬにある。本明細書のＨＶＲ（ＣＤＲ領域）の例には、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）に現れる超可変ループ(Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917(1987))；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）に現れるＨＶＲ（ＣＤＲ領域）(Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）及び９３～１０１（Ｈ３）に現れる抗原接点(MacCallumら, J. Mol. Biol. 262: 732-745(1996))；及び
（ｄ）ＨＶＲ（ＣＤＲ領域）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）及び９４～１０２（Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせが含まれる。

特に断らない限り、ＨＶＲ（ＣＤＲ領域）残基及び可変領域内の他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では、Ｋａｂａｔら（同上）に従って番号付けられる。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原の結合に関連する抗体重鎖又は軽鎖ドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは一般には類似の構造を有し、各ドメインは４個の保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び３個の相補性決定領域（ＣＤＲ領域）を含む（例えばKindtら,Kuby Immunology,第6版参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは抗原へ結合特異性を付与するのに十分である。

「抗体断片」とは、完全抗体以外の、該完全抗体が結合する抗原を結合する完全抗体の一部を含む分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；二機能性抗体；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用される用語「細胞傷害性剤」とは、細胞機能を抑制又は予防する、及び／又は細胞死亡又は破壊を引き起こす物質である。細胞傷害性剤は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学治療剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素や酵素活性毒素、例えばその断片及び／又はバリアント；本分野で公知の各種の抗腫瘍薬又は抗癌剤を含むが、これらに限定されるものではない。

「免疫複合体」は抗体と１つ又は複数の異種分子（を含むが、細胞傷害性剤に限定されるものではない）との複合体である。

インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ：ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇｅｎｅｓ）受容体アゴニストは、ＳＴＩＮＧが依存するシグナル経路を活性化することでＩ型インターフェロンの分泌や抗ウイルス免疫及び抗腫瘍免疫に関連するタンパク質の発現を促進し、ウイルスコピーをブロックし、癌細胞への免疫反応を促進する分子である。このような分子は、例えば環状ジヌクレオチド類、アミノベンズイミダゾール類、キサントン類やアクリドン類、ベンゾチオフェン類及びベンゾジオキソール類などの構造タイプのＳＴＩＮＧアゴニストである。
「被検者」又は「個体」は哺乳動物である。哺乳動物は、家畜化動物（例えばウシ、羊、猫、犬及び馬）、霊長類（例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ及び齧歯類動物（例えばマウス及びラット）を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、前記被検者又は個体は人間である。

「プロトコール（添付文書）」という用語は、通常、治療製品の商業包装に含まれる取扱書を指し、この取扱書には、適応症、使用方法、用量、投与、併用療法、禁忌症及び／又はこのような治療製品の使用についての警告に関する情報を含む。

「親和性」とは、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の全強度を指す。特に断らない限り、本明細書に使用される場合、「結合親和性」とは固有の結合親和性を指し、結合パートナーメンバー（例えば抗体と抗原）同士の１：１の相互作用を反映する。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は一般には解離定数（Ｋｄ）で表されてもよい。親和性は、本明細書に記載の方法など、本分野で公知の常法により測定されてもよい。結合親和性を測定するための説明的かつ例示的な特定の実施形態は以下で記載される。

参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列の相同性百分率（％）」は、候補配列と参照ポリペプチド配列とをアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大の配列相同性百分率を実現し、かついずれの保存的置換も配列相同性の一部と見なさない場合、候補配列と参照ポリペプチド配列における、アミノ酸残基が一致するアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列の相同性百分率は本分野における複数種の手段により決定されてもよく、例えば、相同性は例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などのソフトウェアを用いてアラインメントされてもよい。当業者は配列のアラインメントに適したパラメータを決定してもよく、比較対象の配列の全長に亘って最大アラインメントを行うのに必要な任意のアルゴリズムが含まれる。

例えば、ＡＬＩＧＮ－２を用いてアミノ酸配列比較を行う場合、所定のアミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂの、あるいは所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列の相同性％は以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、ＸはＡとＢについてプログラムアラインメントを行うときに配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によりマッチングしたと評価されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基総数である。理解できるものとして、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＡとＢのアミノ酸配列の相同性％はＢとＡのアミノ酸配列の相同性％に等しくない。特に断らない限り、本明細書に使用される全てのアミノ酸配列の相同性％の値はＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムにより取得される。

２．抗体、製造方法、組成物及び製品
１）抗体
本発明は抗ＣＬＤＮ１８．２抗体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を提供し、以下の（ａ）～（ｆ）から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６個の超可変領域（ＨＶＲ）（又は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）を含有する結合ドメインを含む。（ａ）ＨＶＲ－Ｈ１であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１８又はＳＥＱＩＤＮＯ：２１のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９又はＳＥＱＩＤＮＯ：２２のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２０又はＳＥＱＩＤＮＯ：２３のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｄ）ＨＶＲ－Ｌ１であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２４又はＳＥＱＩＤＮＯ：２７のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；（ｅ）ＨＶＲ－Ｌ２であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２５又はＳＥＱＩＤＮＯ：２８のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む；及び（ｆ）ＨＶＲ－Ｌ３であって、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２６又はＳＥＱＩＤＮＯ：２９のアミノ酸配列又は該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が有する重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３０又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３０又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列を含み、及び／又はその軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（領域）は、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３２又はＳＥＱＩＤＮＯ：３３と少なくとも９０％の配列相同性（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性）を有するアミノ酸配列、又は配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３２又はＳＥＱＩＤＮＯ：３３のアミノ酸配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は下記アミノ酸配列を含む。

２）抗体断片
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、（Ｆａｂ’）_２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片、並びに下記した他の断片を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの抗体断片の概要に関しては、Hudsonら,Nat. Med. 9: 129-134(２００３）を参照する。ｓｃＦｖ断片に関しては、例えばＷＯ９３／１６１８５を参照する。

二機能性抗体は２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、二価又は二重特異性であり得る。例えばＥＰ４０４,０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１を参照する。三機能性抗体及び四機能性抗体は例えばHudsonら,Nat. Med. 9: 129-134(2003)を参照する。

シングルドメイン抗体は、抗体の全て又は一部の重鎖可変領域あるいは全て又は一部の軽鎖可変領域を含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体（例えば米国特許６,２４８,５１６Ｂ１参照）である。

抗体断片はさまざまな技術により産生されてもよく、完全抗体のタンパク質水解消化及び組換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による産生を含むが、これらに限定されるものではない。

３）キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体の製造は例えば米国特許４,８１６,５６７を参照してもよい。

いくつかの実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体はヒト化されることで人間への免疫原性を低下させるとともに、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。一般には、ヒト化抗体は１つ又は複数の可変領域を含み、これらのうち、ＨＶＲ（ＣＤＲ）領域の全て又は一部が非ヒト抗体に由来し、そして、ＦＲ（又はその一部）が人間抗体配列に由来する。ヒト化抗体は任意により人間の定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト抗体由来の対応する残基でヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基を置換することにより、抗体の親和性を回復又は改善することができる。

ヒト化抗体及びその製造方法は、米国特許第５,８２１,３３７号、第７,５２７,７９１号、第６,９８２,３２１号及び第７,０８７,４０９号を参照してもよい。

４）人間抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は人間抗体である。人間抗体は本分野で公知のさまざまな技術で生産されてもよい。

人間抗体としては、修飾された遺伝子改変動物に免疫原を投与した後、抗原チャレンジにより、完全な人間抗体又はヒト可変領域を有する完全抗体を製造する。このような動物は、典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有する。このような遺伝子改変マウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般には不活性化される。遺伝子改変動物から人間抗体を取得する方法に関しては、例えば米国特許第６,０７５,１８１号及び第６,１５０,５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術が記載された）；米国特許第５,７７０,４２９号；米国特許第７,０４１,８７０号（Ｋ－Ｍ技術が記載された）；及び米国出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号を参照する。このような動物からの完全抗体から得られるヒト可変領域はさらに修飾されて、例えば異なるヒト定常領域と組み合わせられてもよい。

人間抗体はハイブリドーマに基づく方法によって製造されてもよい。ヒトモノクローナル抗体を産生するヒト骨髄腫及びマウス－ヒトハイブリッド骨髄腫細胞株が報告されており、例えばBoernerら,J. Immunol., 147: 86(1991)を参照する。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により産生された人間抗体もLiら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 3557-3562(2006)に記載されている。他の方法は、例えば米国特許第７,１８９,８２６号（ハイブリドーマ細胞株からモノクローナルヒトＩｇＭ抗体を産生することが記載される）及びNi,Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268(2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマが記載される）に記載の方法を含む。

人間抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することにより製造されてもよい。次に、このような可変領域配列と所望のヒト定常ドメインとを組み合わせてもよい。

具体的には、高親和性を有する本発明の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２結合活性を有する抗体に対してコンビナトリアルライブラリをスクリーニングして単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリを産生し、および所望の結合特徴を有する抗体に対してこのようなライブラリをスクリーニングする複数種類の方法が本分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboomら,Methods in Molecular Biology 178: 1-37(O’Brien ら編,Human Press, Totowa,NJ,2001),Marks及びBradbury,Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo編,Human Press, Totowa, NJ, 2003)及びLeeら,J. Immunol. Methods 284(1-2) :119-132 (2004)を参照することができる。

いくつかのファージディスプレイ方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＶＨ及びＶＬ遺伝子系統を単独でクローニングし、ファージライブラリにランダムに組換え、次に、抗原－結合ファージに対してスクリーニングを行う。典型的に、ファージは抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として示す。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許には、例えば、米国特許第５,７５０,３７３号及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号が含まれる。

本明細書では、ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は人間抗体又は人間抗体断片とみなされる。

５）多重特異性抗体
上記のいずれかの態様では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、一方の結合特異性はＣＬＤＮ１８．２に対するものであり、他方の結合特異性は他の任意の抗原（例えば第２生物分子、例えば細胞表面抗原、例えば腫瘍抗原）に対する。相応的に、二重特異性抗ＣＬＤＮ１８．２抗体はＣＬＤＮ１８．２及び腫瘍抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１又はＴｅｎＢ２に対して結合特異性を有してもよい。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片として製造されてもよい。

多重特異性抗体を製造する技術は、特異性の異なる２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現を含むが、これらに限定されるものではなく、ＷＯ９３／０８８２９、ＷＯ２００９／０８０２５及びＷＯ２００９／０８９００４Ａ１等を参照してもよい。

６）抗体バリアント
本発明の抗体は、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のアミノ酸配列バリアントを含む。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質をさらに改善するために製造された抗体バリアントである。抗体のアミノ酸配列バリアントは、該抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより製造されてもよい。このような修飾は、例えば抗体アミノ酸配列中の残基の欠如及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠如、挿入及び置換を任意に組み合わせて最終的な構築体を得て、その条件としては、最終的な構築体は所望の特徴、例えばＣＬＤＮ１８．２抗原との結合特性を有する。

いくつかの実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。ＨＶＲ（ＣＤＲ）領域及び／又はＦＲ領域の１つ又は複数の部位で置換して置換型変異体（保存的置換変異体又は非保存的置換変異体を含む）を取得してもよい。
アミノ酸は共通の側鎖の性質によって群分けされてもよい。
（１）疎水性：ｎ－ロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

保存的置換は同一群のアミノ酸同士の置換として定義され、非保存的置換は異なるクラス（群）のうち1種のアミノ酸が別の群のアミノ酸で置換されるものとして定義される。アミノ酸置換を本発明の抗体に導入し、所望の活性（例えば抗原結合の保持／改善又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善）に基づいて産物をスクリーニングすることにより、本発明の抗体バリアントを得ることができる。

本発明は、本発明で開示される抗体から得られた非保存的突然変異及び／又は保存的突然変異を含有する抗体バリアントを含み、該バリアントは所望のＣＬＤＮ１８．２結合活性を有していればよい。

１種の置換型バリアントは、親抗体（例えばヒト化抗体又は人間抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換した抗体バリアントに関する。一般には、さらなる研究用のために選択されるバリアントは、一部の生物学的性質（例えば親和性向上）が親抗体に対して、修飾（例えば改善）される、及び／又は親抗体のいくつかの生物学的性質が実質的に保持される。例示的な置換型バリアントは親和性成熟抗体であり、例えばファージディスプレイに基づく親和性成熟技術（例えば本明細書に記載のもの）によって容易に産生され得る。簡単に言えば、１つ又は複数のＨＶＲ（ＣＤＲ）残基を変異させ、この変異された抗体をファージにディスプレイし、特定の生物学的活性（例えば結合親和性）基づいて変異された抗体をスクリーニングする。

いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＨＶＲ（ＣＤＲ）においては置換、挿入又は欠如が発生してもよく、このような変化により抗体のＣＬＤＮ１８．２結合能力が実質的に減弱しなければよい。例えば、ＨＶＲ（ＣＤＲ）において結合親和性を実質的に低下させない保存的変化が起こってもよい。例えば、このような変化としては、ＨＶＲの抗原接触残基以外、例えばＦＲ領域の１個、２個、３個、４個、５個のアミノ酸残基で保存的又は非保存的アミノ酸置換が発生してもよい。

７）組換え方法
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、例えば、米国特許第４,８１６,５６７号に記載のとおり、組換え方法によって製造されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をコードする単離された核酸が提供されている。このような核酸は、抗体のＶＬアミノ酸配列及び／又はＶＨのアミノ酸配列をコードし得る。別の実施形態では、このような核酸を含む１種又は複数種ベクター（例えば発現ベクター）が提供されている。別の実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供されている。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター；又は（２）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター、及び該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む（例えば、形質転換によって有する）。一実施形態では、該宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の製造方法が提供されており、該方法は、該抗体の発現に適した条件下で該抗体をコードする核酸を含む上記の宿主細胞を培養することと、必要に応じて該宿主細胞（又は宿主細胞培地）から該抗体を回収することとを含む。

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を組換え産生するために、抗体をコードする核酸（例えば、上記のとおり）を単離し、１つ又は複数のベクターに挿入して、宿主細胞においてさらにクローン及び／又は発現する。このような核酸は、一般的な手順（例えば、該抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用する）によって容易に単離されて配列決定にかけられてもよい。

抗体コードベクターのクローン又は発現に適用できる宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃ効果機能が必要とされない場合、細菌にて抗体を産生する。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば米国特許第５,６４８,２３７号、第５,７８９,１９９号及び第５,８４０,５２３号を参照する。発現させた後、細菌細胞質から可溶性部分にある抗体を単離して、さらに精製してもよい。

原核生物に加えて、例えば糸状真菌又は酵母の真核微生物も、抗体コードベクターにとって適切なクローン又は発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されて、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する真菌及び酵母菌株を含む。Liら, Nat. Biotech. 24: 210-215(2006)を参照する。

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞に結合する、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞にトランスフェクションし得るバキュロウイルス株が多く同定されている。

植物細胞培養物も宿主として利用可能である。例えば米国特許第５,９５９,１７７号、第６,０４０,４９８号、第６,４２０,５４８号、第７,１２５,９７８号及び第６,４１７,４２９号（遺伝子改変植物にて抗体を産生するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術が記載されている）を参照する。

脊椎動物細胞も宿主として利用可能である。例えば、懸濁液における生長に適した哺乳動物細胞株は適用し得る。哺乳動物宿主細胞株に適した他の例には、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓細胞株（例えば２９３細胞）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリー細胞（例えばＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞；及び骨髄腫細胞株、例えばＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。

８）免疫複合体
本発明はまた、本明細書に係る抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と１種又は複数種の細胞傷害性剤とを結合した免疫複合体を提供しており、このような細胞傷害性剤は例えば化学治療剤又は化学治療薬、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片）又は放射性同位体である。

一実施形態では、免疫複合体は、抗体と１種又は複数種の薬物とが結合された抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）であり、メイタンシン、オルリスタット、ドラスタチン、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）及びＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されるものではない。

別の実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と酵素活性毒素又はその断片との複合体であり、該酵素活性毒素は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖及びトリコテセンなどを含むが、これらに限定されるものではない。

別の実施形態では、免疫複合体は、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と放射性原子とが結合された放射性複合体を含む。複数種の放射性同位体は放射性複合体の産生に有用である。その例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。

抗体と細胞傷害性剤との複合体は、複数種の二官能性タンパク質結合剤を用いて製造されてもよく、この結合剤は、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジピン酸ジメチル塩酸塩）、活性エステル（例えばジスクシニミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ジアジド化合物（例えばビス(ｐ－アジドベンゾイル)ヘキサメチレンジアミン）、ビスジアゾ誘導体（例えばビス(ｐ－ジアゾベンゾイル)－エチレンジアミン）、ジイソチオシアネート（例えばトルエン２,６－ジイソチオシアネート）及び二重活性フッ素化合物（例えば１,５－ジフルオロ－２,４－ジニトロベンゼン）である。

９）薬物製剤
本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の薬物製剤は、所望の純度を有する抗体と、１種又は複数種の薬学的に許容される任意の担体とを混合して凍結乾燥製剤又は水溶液の形態とすることで製造される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用された用量及び濃度において受容体に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルフェニルアンモニウムクロライド；バイオトリウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール；ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、またはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル類；カテコール；レゾルシン；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびメタクレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース及びデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、フコース、ソルビトールなどの糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されるものではない。

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６,２６７,９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６,１７１,５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載のものを含む。

本明細書における製剤は、治療対象の特定適応症にとって必須な１種以上の活性成分を含んでもよく、好ましくは、互いに悪影響を与えない補完的な活性を有する活性成分が好ましい。例えば、追加の治療剤（例えば化学療法剤、細胞傷害性剤、成長阻害剤及び／又は抗ホルモン剤）が必要とされる場合がある。このような活性成分は組み合わせの形態として所定の目的に有効な量で存在するのに適している。

１０）製品
本発明の別の態様では、本発明の抗体又は医薬組成物を含有する製品が提供されている。該製品は容器と、該容器上にある又は該容器に関連するレベルや添付文書（プロトコル）とを含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。このような容器は、例えばガラスやプラスチックなどの各種の材料で形成されてもよい。該容器は本発明の組成物単独又は該組成物と別の組成物との組み合わせを収容し、そして、滅菌入口を備えてもよい（例えば、該容器は点滴バッグ又は皮下注射針で穿刺可能な瓶栓を備えたバイアルであってもよい）。該組成物の少なくとも１種の活性化剤は本発明の抗体である。該レベル又は添付文書は該組成物が特定の腫瘍の治療に用いられることを示す。さらに、該製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を収容する第１容器と、（ｂ）別の腫瘍治療薬又は別の抗体を含む組成物を収容する第２容器とを含んでもよい。本発明の本実施形態の製品は、このような組成物が治療し得る腫瘍を示す添付文書をさらに含んでもよい。任意選択的に、また、該製品は、医薬的に許容される緩衝剤、例えば注射用抗菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を収容する第２（又は第３）容器をさらに含んでもよい。市販品及び使用者のニーズに合わせる他の材料をさらに含んでもよく、このような材料は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針及び注射器を含む。
実施例

実施例１免疫及びスクリーニング材料の製造
（１）ヒトｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥ（Ｔ－細胞エピトープペプチド）レトロウイルス発現プラスミドの構築
ｈＣＬＤＮ１８．２ｃＤＮＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）をクローニングして、Ｃ－末端にＴ－細胞エピトープペプチドを融合し、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを得た。Ｔ－細胞エピトープペプチドにより抗原は免疫耐性を突破して、抗体の産生（Percival-Alwyn J. et al, mAbs, 2015, 7(1), 129-137）が促進される。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥをレトロウイルスベクターにクローニングして、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを得た。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドをＨＥＫ２９３－Ｔ細胞に一過性トランスフェクションし、トランスフェクション７２時間後、ｈＣＬＤＮ１８．２のＨＥＫ２９３－Ｔ細胞表面での発現についてフローサイトメトリー分析を行った。一次抗体（１ｓｔＡｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１ｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、品番Ａ－１１０１３）（２ｎｄＡｂ、１：２００希釈）とともに、４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については、二次抗体だけインキュベートした。図１に示す結果から、野生ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞の表面ではｈＣＬＤＮ１８．２の発現が認められず、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドを一過性トランスフェクションしたＨＥＫ２９３－Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３ＴＣＬＤＮ１８．２ＴＣＥ）では、陽性細胞の８０．９％はｈＣＬＤＮ１８．２を発現させた。該ベクタープラスミドは実施例２の（１）ＤＮＡ免疫スキームに用いられる。
（２）ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞
ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルス発現プラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドとを混合して２９３－Ｔ細胞にトランスフェクションし、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子を製造した。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレンチウイルス粒子をマウス腫瘍細胞系にトランスフェクションし、７２時間後、フローサイトメトリー検出を行ってｈＣＬＤＮ１８．２を高発現させたマウス腫瘍細胞プールを選別した。一次抗体（１ｓｔＡｂ）は自作された陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｒ）キメラ抗体１６３Ｅ１２である。まず、細胞を一次抗体（１ μｇ／ｍＬ）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識したヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体（２ｎｄＡｂ、１：２００希釈）とともに４℃の条件で４５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、陰性対照細胞については二次抗体だけインキュベートした。図２に示す結果から、野生マウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲｐａｒｅｎｔａｌ）の表面では１６．８％の陽性シグナルしかなかった。ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥレトロウイルスをトランスフェクションしたマウス腫瘍細胞（ＵＢＥＲＣＬＤＮ１８．２ＴＣＥ）では、８２．７％の陽性細胞があった。フローサイトメトリー分析により選別した結果、９５．７％と多くのマウス腫瘍細胞では、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥは高レベルで発現されていた。このｈＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞は実施例２の（２）細胞免疫スキームに用いられる。
（３）ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ウイルス様粒子の製造
Thorsten K.が発表した方法（Thorsten K., et al, Cancer Res, 2011, 71(2), 515-527）に従って、ｈＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１（ＥＣＬ１：ＥｘｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒＬｏｏｐ１）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）をＢ型肝臓炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ：ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎ）の主要免疫優性領域（ＭＩＲ：Ｍａｊｏｒｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔｒｅｇｉｏｎ）に挿入し、ＥＣＬ１Ｎ－末端及びＣ－末端のそれぞれにＧ４ＳＧ４リンカーを導入し、全長融合タンパク質のＣ－末端に６ｘＨｉｓタグ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）を添加した。融合タンパク質の遺伝子全長を合成して、ｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌発現系にトランスフェクションして融合タンパク質の発現を行った。融合タンパク質の精製後、復元緩衝液にてＨＢＶｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ウイルス様粒子を製造した。該ｈＣＬＤＮ１８．２細胞外ループ１ウイルス様粒子の製造は、実施例２の（３）ウイルス様粒子多部位反復免疫－細胞免疫スキーム及び（４）ウイルス様粒子飛節免疫－細胞免疫スキームに用いられる。
（４）ＣＬＤＮ１８安定トランスフェクション細胞株の構築
ｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）、ｈＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、マウスｍｈＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）、ｍＣＬＤＮ１８．１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）遺伝子全長をそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクタープラスミドにそれぞれクローニングした。プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションして、ネオマイシン（Ｇ４１８）を加えて加圧スクリーニングを行った。限界希釈法によってｈＣＬＤＮ１８．２、ｈＣＬＤＮ１８．１、ｍｈＣＬＤＮ１８．２、ｍＣＬＤＮ１８．１を高発現させたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株をそれぞれ選択した。フローサイトメトリー検出の結果、ｈＣＬＤＮ１８．２及びｍＣＬＤＮ１８．２をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞のいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０により特異的に識別され（図３．Ａ、Ｃ）、また、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体（３４Ｈ１４Ｌ１５、Ａｂｃａｍ品番ａｂ２０３５６３）によって識別され得る（図３．Ａ、Ｃ）。ｈＣＬＤＮ１８．１及びｍＣＬＤＮ１８．１をトランスフェクションしたＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１）では、パラホルムアルデヒド固定化及び非固定化の細胞はいずれも自作された抗ＣＬＤＮ１８．２陽性対照抗体１６３Ｅ１２又は１７５Ｄ１０によって特異的に識別できず（図３．Ｂ、Ｄ）、一方、市販の広範な抗ＣＬＤＮ１８抗体（３４Ｈ１４Ｌ１５）によって識別され得る（図３．Ｂ、Ｄ）。上記のＨＥＫ２９３安定トランスフェクション細胞株は実施例３のハイブリドーマスクリーニングに用いられる。
（５）陽性対照抗体４３Ａ１１、１７５Ｄ１０、及び１６３Ｅ１２の製造
ヒトマウスキメラ陽性対照抗体４３Ａ１１の重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）及び軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、１７５Ｄ１０の重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）及び軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、並びに１６３Ｅ１２の重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）及び軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）の抗体遺伝子全長をそれぞれ合成して、それぞれのＮ－末端にシグナルペプチドを添加し、その後、ｐｃＤＮＡ３．４真核発現ベクターにクローニングした。４３Ａ１１、１７５Ｄ１０及び１６３Ｅ１２の重鎖及び軽鎖発現プラスミドをそれぞれ混合してＣＨＯＳ細胞に共トランスフェクションし、一過性トランスフェクションタンパク質の発現を行い、上清を収集して、ＰｒｏｔｉｅｎＡを用いて親和精製を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、結果を図４に示す。

実施例２マウス免疫プログラム及びハイブリドーマの製造
合計４種類の免疫スキーム（表１）を採用し、そして、免疫スキームごとに少なくとも２つの異なる種（ｓｔｒａｉｎ）のマウスを用いて免疫を行った（表２）。いずれの免疫スキームにおいても、マウスの一部の個体で高レベルの血清免疫力価が認められた。各免疫スキームにおいて高レベルの免疫力価が認められたマウスの個体を殺して脾臓を摘出し、Ｂリンパ球を単離して混合した後、マウス骨髄腫細胞系と電気融合し、ハイブリドーマを製造した。合計３バッチのハイブリドーマを製造した（表２）。

実施例３ハイブリドーマのスクリーニング
３バッチ由来のハイブリドーマを限界希釈法によってクローン化培養し、クローン上清をフローサイトメトリーで結合又は逆結合スクリーニングを３回行い、抗体タイピング及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｘｉｔｙ）を測定し、ＣＬＤＮ１８．２に強く特異的に結合し得るが、ＣＬＤＮ１８．１に結合せず又は僅かに結合され、そして抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を有するハイブリドーマクローンを２０個スクリーニングした。スクリーニングステップ及び各段階のスクリーニングにより得られたハイブリドーマクローンを表３にまとめて示す。

１）一次スクリーニング：各クローン上清発現産物とＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥを高レベルで発現させたマウス腫瘍細胞株（ＵＢＥＲＣＬＤＮ１８．２ＴＣＥ）との結合をフローサイトメトリーによって解析した。限界希釈法によって融合後のハイブリドーマを３８４ウェルプレートに接種し、１０日間培養後、上清を取り、フローサイトメトリーで陽性ハイブリドーマクローンをスクリーニングした。上清をＵＢＥＲＣＬＤＮ１８．２ＴＣＥ細胞（２００００個（細胞）／ウェル）とともに４℃で４５分間共インキュベートした後、プレートを洗浄し、以ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ品番Ａ２８１７５）を二次抗体としてフローサイトメトリー検出を行い、平均蛍光強度が１００,０００以上のクローンをスクリーニングして増幅し、飽和上清を収集し、確認スクリーニングを行った。
３バッチのハイブリドーマについて、各バッチを限界希釈法によって１０個の３８４ウェルプレートにクローン化した。一次スクリーニングによって、３バッチのハイブリドーマは、ＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＥのマウス腫瘍細胞株との結合が陽性であるハイブリドーマクローンをそれぞれ３４１個の（ＭＦＩ＞１００,０００）、３３６個の（ＭＦＩ＞７５,０００又はＭＦＩ＞８０,０００）及び８９個の（ＭＦＩ＞９０,０００）を得た。
２）確認スクリーニング：前のステップである一次スクリーニングによる陽性クローンの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との結合が陽性であるが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３野生型細胞との結合が陰性であるクローンをローサイトメトリーによってスクリーニングして増幅し、飽和上清を収集し、検証スクリーニングを行った。
確認スクリーニングをした結果、３バッチのハイブリドーマは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に強く特異的に結合され得るが、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞に弱く結合され、しかもＨＥＫ２９３野生型細胞に結合しないクローンをそれぞれ１６５個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ＭＦＩ＞２００,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ＭＦＩ＜１００,０００）、１２０個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ＭＦＩ＞５０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ＭＦＩ＜４０,０００）、及び２１個の（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２ＭＦＩ＞７０,０００、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１ＭＦＩ＜３０,０００）を得た。陽性クローンの一部のＦＡＣＳ解析を図５に示す。
３）検証スクリーニング：３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにおいて得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個）陽性ハイブリドーマの上清発現産物を、それぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞とインキュベートし（２００００個（細胞）／ウェル、４℃、４５分間）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリーによって解析した。図６に示す一部のクローンの５個の細胞株におけるフローサイトメトリー分析結果から、陽性クローンは、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞のいずれでも、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が５００,０００を超え、一方、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞、ＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１細胞、及びＨＥＫ２９３野生型細胞細胞株では、平均蛍光強度が全て２０,０００未満であり、多くのクローン（１６／２０）は、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．２細胞では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）がＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１細胞及びＨＥＫ２９３－ｍＣＬＤＮ１８．１細胞の場合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の５０倍を上回ることが示された。
４）抗体タイピング：ＩｇＧ分子は、サブタイプによって、ＡＤＣＣ効果媒介能力が異なる。このため、抗体依存性細胞殺傷検出に先立って、マウス抗体サブタイプ検出キットを用いて、３バッチ由来のハイブリドーマの確認スクリーニングにより得られた３０６個の（１６５個＋１２０個＋２１個の）陽性ハイブリドーマの上清抗体発現産物について、マウス抗体サブタイプのタイピングを行った。３０６個のクローンのサブタイプのほとんどはＡＤＣＣ機能を備えたマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３であり、僅か少量（２６／３０６）はＡＤＣＣ機能を備えないＩｇＧ１サブタイプ（ヒトに対応する抗体ＩｇＧ４サブタイプ）である。一部のクローンは混合サブタイプであり、これは、ハイブリドーマクローンがモノクローナルではないことによると考えられる。軽鎖は全てマウスκサブタイプである。
５）ＡＤＣＣ効果測定
前述確認スクリーニング、検証スクリーニング及び抗体タイピングの結果を総合的に考慮して、１２８個の陽性クローンの飽和上清を選択して、抗体依存性細胞傷害性の機能検出を行った。エフェクター細胞は、２人のドナー（４５及び４６号）から試験の前日に採血して、採取した血液を室温で保存し、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を行うことにより新たに単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）である。ターゲット細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）である。ハイブリドーマ発現産物を全て４倍希釈した。新しく取得したＰＢＭＣ細胞とターゲット細胞を２５：１のエフェクター細胞／ターゲット細胞比で各サンプルと４時間共インキュベートした。細胞傷害性に関連する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することによって抗体のＡＤＣＣ効果を表す。ターゲット細胞が自発的に溶解した場合に検出された吸光度値を０％、ターゲット細胞が全て溶解した場合に検出された吸光度値を１００％に定義して、試験サンプルごとに、活性百分率でＡＤＣＣ効果を表す。一部のクローンのＡＤＣＣ効果の結果は、図７に示すように、クローンのＡＤＣＣ殺傷効果が平均で２０％よりも高く、一部のクローン（９Ｄ－１、８－Ｏ１１）のＡＤＣＣ効果は５０％よりも高く、一方、マウスＩｇＧ１サブタイプの６－Ｇ１１及び４－Ｏ２に対しては、ＡＤＣＣ効果は１０％を下回った。

実施例４陽性ハイブリドーマクローンのサブクローニング及び抗体分子配列の配列決定
凍結保存した陽性ハイブリドーマクローンを蘇生させて、サブクローニングを行った。各陽性ハイブリドーマクローンを限界希釈法によってサブクローニングした。顕微鏡検査によってモノクローンを選択して増幅培養し、その後、上清を収集して、フローサイトメトリー分析方法によって、サブクローン上清とＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞との特異的結合を検出した。上清をＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞（２００００個（細胞）／ウェル）とともに４℃で４５分間共インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、品番Ａ２８１７５）を二次抗体として、フローサイトメトリー検出を行った。後続の配列決定の成功率を確保するために、ハイブリドーマごとに２個のモノクローン（クローンＡ及びクローンＢ）を選択して増幅し、凍結保存した。図８に示すサブクローニング後の陽性単クローン上清のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞に対するフローサイトメトリー分析から、選択された単クローン上清はＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞への特異的結合を保持することが示された。
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端高速増幅技術）方法を用いて、ハイブリドーマ単クローンのＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を増幅した。増幅させたハイブリドーマモノクローナル細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、５’－ＲＡＣＥ反応によって５’－のユニバーサルプライマーと３’－Ｈ、Ｌ（κ）又はＬ（λ）ＦＲ１区の縮重プライマーとの組み合わせを用いて、重鎖又は軽鎖のＶ領域にＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動によって陽性増幅バンドを確認した。図９に示す結果から、ＰＣＲの目的バンドが全て合理的な範囲であることが分かった。ゲルを切ってアガロースゲル電気泳動におけるＰＣＲ陽性バンドを回収し、ＴＯＰＯクローン方法でＰＣＲ増幅断片を配列決定ベクターに連結して、配列決定を行った。表４及び表５は、それぞれ、５Ｍ９－Ａ及び９Ｄ１－Ａクローンの重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（５－Ｍ９－Ａ及び９－Ｄ１－Ａはクローン、５－Ｍ９及び９－Ｄ１は５－Ｍ９－Ａ及び９－Ｄ１－Ａクローンに対応する抗体を表す）を示している。ここでは、軽鎖、重鎖のＣＤＲ領域はＣｈｏｔｈｉａ番号系統に基づいて分けられる。

実施例５ヒトマウスキメラ抗体の製造及び特徴付け
候補マウス抗体の重鎖及び軽鎖のＶ領域を、それぞれヒトＩｇＧ１型重鎖（Ｇ１ｍ１７）の定常領域（ＨＣ）及びヒトκ型軽鎖の定常領域（ＬＣ）と融合し、ヒトマウスキメラ重鎖全長遺伝子及び軽鎖全長遺伝子をそれぞれ合成し、発現ベクターにクローンし、配列決定によって検証した。候補分子ごとに構築された発現プラスミドに対して増幅及びプラスミド抽出を行い、アガロースゲル電気泳動を通じて検証し、トランスフェクション材料として使用した。
ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｕｎａ２９３ＴＭ）を振とうフラスコに接種して、化学成分が明確な無血清培地を用いて懸濁種子培養を行った。トランスフェクションの前日に、増幅させたＨＥＫ２９３細胞を新しい振とうフラスコに接種して、新しい培地に変換した。各候補ヒトマウスキメラ抗体分子の重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションし、細胞活性が低下するまで流加培養（Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）を行うと、上清を収集して産物精製を行った。
まず、上清液に対する遠心分離及びろ過によって、大部分の細胞破片及び不溶性粒子を除去し、その後、試料液をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに注入し、抗体分子を充填剤におけるＰｒｏｔｅｉｎＡと結合し、平衡化ステップの後に、大部分の不純物を除去し、低ｐＨの溶出液で抗体タンパク質を溶出し、画分を収集した。ｐＨを調整して限外ろ過を通じて製剤緩衝液に置換した。最後にＯＤ２８０を測定してタンパク質の濃度を算出した。精製された抗体タンパク質について還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒｅｄｕｃｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）を行って純度を検査し、還元ＣＥ－ＳＤＳ検出の結果、２０個のヒトマウスキメラモノクローナル抗体分子の純度は９５％よりも高かった（表６）。一部の抗体タンパク質の還元ＣＥ－ＳＤＳを図１０に示す。

精製されたモノクローナル抗体について、デグリコシラーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）で脱グリコシル化して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で軽鎖及び重鎖を還元した後、逆相超高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＲＰ－ＵＰＬＣ／ＭＳ）による分子量測定を行った。ここでは、液相部分はＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＨ－Ｃｌａｓｓシステムを用い、移動相Ａは０．１％ギ酸（ＦＡ）／水、移動相Ｂは０．１％ＦＡ／アセトニトリル（ＡＣＮ）、カラムはＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＰｒｏｔｅｉｎＢＥＨＣ４、質量分析装置はＷａｔｅｒｓＸｅｖｏＧ２－ＸＳＱｔｏｆとし、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源が装備されており、走査パターンはＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎであり、収集したターゲットピーク化合物の多電荷原子価の生の一次質量分析データに対してＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを用いてノイズ低減、平滑化、及びデコンボリューション処理を行い、一部のモノクローナル抗体の総イオンクロマトグラム、軽鎖及び重鎖のデコンボリューションスペクトルを図１１に示し、２０個のヒトマウスキメラモノクローナル抗体分子の分子量の測定結果を表６に示し、全てのモノクローナル抗体の質量分析分子量は、理論分子量との誤差としては、重鎖では、５Ｄａ以下、軽鎖では、１Ｄａ以下であり、理論値と一致すると認められた。なお、サンプル処理及び液相測定においては、程度が異なるが、抗体タンパク質のコンフォメーションが変わり、結果として、重鎖ピークのカラムにおける保留時間が変わり、ピークスプリットが見られ、質量分析測定をした結果、スプリットした２つの重鎖ピークでは、分子量が一致する。

実施例６ヒトマウスキメラモノクローナル抗体の細胞表面ＣＬＤＮ１８．２への親和性の測定
本実施例では、フローサイトメトリーによって、２０個の精製ヒトマウスキメラモノクローナル抗体の細胞表面ＣＬＤＮ１８．２への親和性を測定した。細胞表面のタンパク質親和性の測定方法は、(Hunter S.A. et al, Methods in Enzymology, 2016, 580, 21-44)に記載の直接ＦＡＣＳ結合法を参照する。ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）を蘇生させた後に培養し、所定の細胞数となるまで継代し、細胞を５×１０^４密度／ｍＬで１ｍＬ遠心分離管に移し、遠心分離して使用に備えた。各モノクローナル抗体について、（１０μｇ／ｍＬ、３．３μｇ／ｍＬ、１．１μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ｍＬ、０．１１２３μｇ／ｍＬ、０．００４１μｇ／ｍＬ、０．００１３μｇ／ｍＬ）のような一連の抗体濃度のものを調製した。リガンド枯渇効果（ＬｉｇａｎｄＤｅｐｌｅｔｉｏｎ）をなくするために、抗体濃度シリーズの調製においては、ＰＢＳと緩衝液との組み合わせを用いて、対応するリガンド枯渇体積となるまで希釈した。ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を、リガンド枯渇体積となるように調製した一連の濃度の抗体と混合してインキュベートした。４℃の条件で平衡化するまでインキュベートした。４℃で遠心分離して細胞を収集し、予冷ＰＢＳで洗浄した後、蛍光染料を備えた抗ヒトＩｇＧの第２抗体とともに４℃で３０分間共インキュベートし、予冷ＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ結合解析を行い、その結果に基づいて非線形曲線回帰を行って、結合速度定数（ＫＤ）の値を算出した。表７に示す結果から、全ての抗体の親和性（ＫＤ）はサブナノモル（ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌｅｒ）であることが示された。抗体の一部は、親和性が陽性対照抗体（ＢＭ：Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）１６３Ｅ１２（重鎖アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１２；軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）及び１７５Ｄ１０（重鎖アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１０；軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）よりも３～５倍低く、ほぼピコモルの親和性があった。

実施例７ヒトマウスキメラモノクローナル抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能
本実施例では、エフェクター細胞レポーター遺伝子方法を用いて、精製ヒトマウスキメラモノクローナル抗体についてＡＤＣＣ機能を測定した。この方法では、エフェクター細胞はヒトＦｃ受容体（ＦｃγＲIIIａＶ１５８）及びＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞核因子）応答性誘導発現ルシフェラーゼ（ＮＦＡＴ－ＲＥ－Ｌｕｃ）を安定的に発現させたＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ, Ｇ７０１８）である。このエフェクター細胞がターゲット細胞に結合された関連測定対象抗体のＦｃ領域に結合されると、応答細胞におけるＦｃγＲIIIａ受容体を活性化し、さらに細胞内のＮＦＡＴ細胞シグナル経路を活性化し、ＮＦＡＴに対応するルシフェラーゼ発現を媒介した。この蛍光活性を定量化することでＡＤＣＣ効果を測定した。
抗体濃度について２μｇ／ｍＬから５倍勾配希釈を行い、８個の濃度（それぞれ２０００ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、３．２ｎｇ／ｍＬ、０．６４ｎｇ／ｍＬ、０．１２８ｎｇ／ｍＬ、０．０２５６ｎｇ／ｍＬ）の一連の希釈抗体サンプルを得た。まず、抗体サンプルを、ヒトＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現させたターゲット細胞（ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２）と混合し、その後、エフェクター細胞・ターゲット細胞比５：１（７５０００：１５０００）でエフェクター細胞を加えた。反応系を３７℃で６時間培養し、フルオレセイン底物を加えて、蛍光強度（ＲＬＵ）を読み取った。縦座標の誘導倍数（ＦｏｌｄＩｎｄｕｃｔｉｏｎ）を下記式から算出した。
誘導倍数＝（誘導蛍光強度－バックグラウンド蛍光強度）／（抗体なし対照蛍光強度－バックグラウンド蛍光強度）
図１２に示す２０個の精製ヒトマウスキメラモノクローナル抗体のＡＤＣＣ効果結果、表８に示すこれらに対応するＡＤＣＣ最大殺傷及び半数効果用量（ＥＣ５０）から明らかなように、ほとんどの抗体（１７／２０）のＡＤＣＣ効果の半数効果用量は陽性対照抗体（１６３Ｅ１２）よりも大きかった。２－Ｂ８－Ａクローンの最大殺傷は対照抗体よりも顕著に低減した。これらのうち、５－Ｍ９－Ａモノクローナル抗体は、ＥＣ５０（０．２８７ｐｇ／ｍＬ）が陽性対照抗体（１９．５ｐｇ／ｍＬ）よりも顕著に高く、最大殺傷（４０倍）も対照抗体（３６．３倍）よりも明らかに高かった。

実施例８ハイブリドーマ抗体の胃癌組織の凍結組織チップ、正常な胃組織及び重要器官組織での免疫組織化学（ＩＨＣ：Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の研究
本実施例では、免疫組織化学方法を用いて、凍結組織チップにおける２０個のハイブリドーマ抗体の正常な胃組織及び胃癌組織への結合を検出した。まず、Ｅｌｉｓａ方法によって２０個のハイブリドーマ上清中のマウスＩｇＧ抗体の濃度を定量化し、その後、ハイブリドーマ上清中のマウスＩｇＧの定量結果に基づいてハイブリドーマ上清を希釈し、正常な胃組織の凍結切片において胃粘膜上皮腺に対するハイブリドーマ上清のＩＨＣを検証し、検証したＩＨＣ条件を利用して、２０個のハイブリドーマ上清の正常なヒト胃組織及び胃癌組織の凍結チップ（ＴＭＡ：ＴｉｓｓｕｅＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ）（ＢｉｏＭａｘ, ＦＳＴ４０１）でＩＨＣ研究を行った。凍結組織チップを、濃度が検証された各ハイブリドーマ上清のそれぞれと３７℃でインキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で３回すすぎ、その後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに３７℃でインキュベートし、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法で発色させた。表９には、２０個の各ハイブリドーマクローン上清の、１６例の胃癌組織及び４例の正常な胃組織を含む凍結ＴＭＡにおけるＩＨＣ結果が示されている。これらのうち、５－Ｍ９、３－Ｎ１２、３－Ｌ４、９－Ｄ１及び４－Ｂ２３のいずれも、胃癌組織では、陽性染色率が６７％よりも高く、一方、正常な胃組織上皮細胞組織染色では、９－Ｄ１の染色は２５％しかなく、他の４個のクローン（＞５０％）よりもはるかに低く、このことから、９－Ｄ１抗体が、胃腫瘍組織で高い陽性染色を有するものの、正常な胃粘膜上皮との結合が弱いことが示され、これは、９－Ｄ１は治療性抗体として腫瘍外標的に発現している正常な組織において低い毒性（Ｏｎｔａｒｇｅｔｏｆｆｔｕｍｏｒｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有することを示し、９－Ｄ１抗体が薬剤形成性において強い優位性を有する可能性を示唆している。腫瘍組織中の標的に対して強い結合を有するが、正常な組織中の標的に対して弱い結合を有する抗体をスクリーニングすることは近年治療性抗体をスクリーニングする新しい傾向であり、多くの標的は腫瘍組織の特殊な生理環境により、腫瘍細胞上の分子構造が正常な組織で正常な機能を維持する標的分子構造と異なるが、腫瘍標的特異的抗体をスクリーニングすると、この区別を特異的に識別することができる(Garrett T. P. J. et al, PNAS, 2009, 106(13), 5082-5087)。３－Ｌ４及び４－Ｉ１７の一部の胃癌チップ組織でのＩＨＣ染色例を図１３に示す。

なお、４－Ｂ２３が正常な胃凍結組織切片でＩＨＣ条件探索を行ったところ、非常に明らかな非特異的な強いＩＨＣ染色が認められ、非特異的染色は主に胃組織の平滑筋に集中していた。４－Ｂ２３及び一部の他のクローンの正常な胃組織凍結切片でのＩＨＣ染色を図１４に示す。ここでは、矢印は４－Ｂ２３が胃腺下層平滑筋及び血管平滑筋に強く非特異的に発色していることを示している。他のクローンの陽性発色は特異的に胃腺の上皮細胞にある。
５個のハイブリドーマ（４－Ｂ２３、３－Ｎ１２、５－Ｍ９、８－Ｏ１１及び３－Ｌ４）の単クローン上清の人の正常な心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓の凍結組織でのＩＨＣ染色結果を表１０にまとめた。ここでは、陽性対照抗体（１６３Ｅ１２）、３－Ｎ１２、５－Ｍ９、８－Ｏ１１及び３－Ｌ４は、人の正常な心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓の凍結組織でのＩＨＣ染色が全て陰性であり、４－Ｂ２３は上記の重要な器官組織では、全て強い陽性染色が現れた。図１５は、４－Ｂ２３がＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞ブロックの凍結切片では陽性であり、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．１及びＨＥＫ２９３では陰性であったが、心臓、肺及び腎臓では陽性染色を示し、強染色部位は平滑筋に位置し、正常な胃組織の上粘膜の下層平滑筋に見られる非特異的染色と一致していたことを示している。これは、４－Ｂ２３が非特異的結合による予期せぬ臨床毒性を示す可能性があり、薬剤形成性を有しないことを示唆している。

実施例９モノクローナル抗体５－Ｍ９及び９－Ｄ１の配列ヒト化
抗体５－Ｍ９及び９－Ｄ１の配列ヒト化は、抗体の３Ｄモデリングに基づいて行われ(Kurella et al, Methods Mol. Biol., 2018, 1827, 3-14)、設計プロセスは市販のＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ’ｓＢｉｏｌｕｍｉｎａｔｅソフトウェアにより行われた。まず、抗体重鎖Ｖ領域及び抗体軽鎖Ｖ領域に対して相同性モデリングを行い、ＰＤＢ（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）データベース中の既存抗体配列との配列アラインメントにより、配列相同性が最も高いＶＨ及びＶＬ構造をテンプレートとして選択し、それぞれモデリング対象の抗体のＶＨ及びＶＬを３Ｄモデリングした。次に、３ＤモデリングされたＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域を解析し、ＣＤＲ領域、典型的なフレームワーク領域（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）、Ｖｅｒｎｉｅｒ領域、及びＶＨ／ＶＬ結合領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）の重要なアミノ酸残基を特定した。被ヒト化抗体ＶＨ及びＶＬとヒト抗体生殖細胞株遺伝子との相同性アラインメントにより、相同化の度合いが最も高いヒト生殖細胞株遺伝子を見つけてヒト化のテンプレートとした後、被ヒト化抗体のＣＤＲを対応するヒト生殖細胞株遺伝子フレームワーク領域に移植した。以下の３つの基本原則を通じてＣＤＲ移植のヒト由来フレームワーク領域の重要なアミノ酸に対して回復変異を行うかどうかを判断した。１）３Ｄ構造上のヒト由来のフレームワーク領域のアミノ酸残基がＣＤＲ領域、典型的なフレームワーク領域（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）、Ｖｅｒｎｉｅｒ領域、及びＶＨ／ＶＬ結合領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）に対して新たな接触部位（イオン結合、水素結合、及び疎水性作用）を生成した場合、対応するフレームワーク領域のヒト由来のアミノ酸残基は、対応するマウス由来のフレームワーク領域の残基に回復変異する。２）ＣＤＲ領域、典型的なフレームワーク領域（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）、Ｖｅｒｎｉｅｒ領域、及びＶＨ／ＶＬ結合領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）と本来接触部位（イオン結合、水素結合及び疎水性作用）を有する３Ｄ構造上のマウス由来のフレームワーク領域のアミノ酸残基が、対応するヒトフレームワーク領域のアミノ酸残基に置換された後に、接触部位が弱まるか又は消失する場合、対応するフレームワーク領域のヒト由来のアミノ酸残基は対応するマウス由来のフレームワーク領域の残基に回復変異する。３）マウス由来の典型的なフレームワーク領域（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）、Ｖｅｒｎｉｅｒ領域、及びＶＨ／ＶＬ結合領域（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）のアミノ酸残基をヒト由来の残基に置換する場合は、慎重な検討と慎重な置換が必要である。
Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェアは上記の原則を通じて予測されたヒト化抗体に対して、３Ｄ構造に基づいてさらに１）タンパク質表面解析を行い、ヒト化後にマウス由来抗体の表面に対して大きな疎水性露出領域を形成するアミノ酸を標記し、もしヒト化抗体が後続の製造・特徴づけにおいて多くの凝集体を形成するならば、大きな疎水性露出領域を有するアミノ酸残基を修正して対応する表面疎水性領域を破壊し、２）アミノ酸翻訳後修飾解析では、ヒト化後に翻訳後修飾が生じやすいアミノ酸側鎖が３Ｄ構造表面に５０％を越えて露出しているアミノ酸残基を標記し、もしヒト化抗体では後続の製造・特徴づけにおいて翻訳後修飾が現れたならば、表面露出のリスクが高い翻訳後修飾アミノ酸残基を修正し、３）抗体配列の免疫原性解析は、Ｔ細胞エピトープ解析、Ｂ細胞エピトープ解析、ＭＨＣIIエピトープ解析を含み、抗薬物抗体（ＡＤＡ：Ａｎｔｉ－Ｄｒｕｇ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ）産生能を有する高免疫原性ペプチドセグメントの位置を標記した。
図１６は、ＰＢＤデータベースの３ＫＪ４と４Ｍ６１をテンプレートとした、５－Ｍ９及び９－Ｄ１Ｆｖ領域のそれぞれの相同３Ｄモデルを示しており、濃赤色の領域がＣＤＲｓ領域、白色と灰色の領域がＶＨ／ＶＬの界面結合アミノ酸残基、黄色の領域が典型的なフレームワーク（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）アミノ酸残基、緑色の領域がＶｅｒｎｉｅｒ領域アミノ酸残基である。図１７はそれぞれ５－Ｍ９及び９－Ｄ１のＶＨ及びＶＬの相同性と最も高いヒト抗体生殖細胞株遺伝子ＩＧＨＶ４－４＊８、ＩＧＫＶ４－１＊０１、ＩＧＨＶ１－４６＊０１、及びＩＧＫＶ４－１＊０１を示しており、ヒト生殖細胞株遺伝子に対応するフレームワーク領域はそれぞれ５－Ｍ９及び９－Ｄ１のＶＨ及びＶＬＣＤＲｓが移植する受容フレームワークとなった。濃色の領域はＣＤＲｓ領域、典型的なフレームワーク領域（Ｃａｎｏｎｉｃａｌｆｏｌｄ）及びＶｅｒｎｉｅｒ領域の感受性アミノ酸であり、濃色の領域を除く黄色は、アミノ酸残基がヒト生殖細胞株遺伝子とマウス由来抗体の配列との差異アミノ酸であることを示している。
各抗体配列のＶＨとＶＬごとに３～４個のヒト化配列が提供されており、表１１はそれぞれＶＨ及びＶＬのマウス由来配列と対応するヒト化配列のヒト化度を示しており、ＶＨのヒト化度はマウス由来のものの約６０％から最高で約８０％に、ＶＬのヒト化度はマウス由来のものの約８０％から最高で約９０％に向上した。ヒト化重鎖及び軽鎖に対して全長遺伝子合成を行い、重鎖及び軽鎖の定常領域はそれぞれヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ１７）の重鎖及びヒトκ型軽鎖である。全長遺伝子を発現プラスミドにクローニングし、重鎖及び軽鎖の発現プラスミドについて並べ替えを行い、ＨＥＫ２９３を共トランスフェクションして抗体発現を行った。表１２はＶＨ／ＶＬヒト化配列の並べ替えによるヒト化分子の発現を示しており、５－Ｍ９では１２個、９－Ｄ１では９個のヒト化分子が発現していることが示された。図１８は、９－Ｄ１ヒト化抗体分子タンパク質の精製後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示しており、９個のヒト化バージョンの電気泳動純度が９５％よりも大きく、重鎖及び軽鎖のバンドの分子量が予想通りで、対照であるヒト由来ＩｇＧ１抗体の位置と一致していることを示している。

実施例１０ヒト化抗体と細胞表面ｈＣＬＤＮ１８．２との結合活性の解析
本実施例では、フローサイトメトリー分析方法を用いて、５－Ｍ９及び９－Ｄ１ヒト化抗体の細胞表面ｈＣＬＤＮ１８．２に対する結合活性を測定した。良好に成長したＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２を安定トランスフェクションした細胞株とフローサイトメトリーで選別・濃化されたｈＣＬＤＮ１８．２低発現ＫＡＴＯＩＩＩヒト胃癌細胞株とをパンクレアチン（トリプシン）で消化し、再懸濁させて細胞濃度が１．５×１０^６～２×１０^６／ｍＬとなるように調整し、９６ウェルＵ字底プレートに１００μＬ／ウェル（１５万～２０万細胞／ウェル）で加えた。１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有のＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。ＰＢＳ（＋１％ＦＢＳ）で調製した試験濃度の抗体溶液（１００μＬ／ウェル）を加えて細胞と均一に混合し、４℃で１時間インキュベートした。細胞２００ｇを遠心分離して、ＰＢＳ（＋１％ＦＢＳ）で１回洗浄した。１０００倍のＰＢＳ（＋１％ＦＢＳ）で希釈したＣｙ３－ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｓ、品番１０９－１６５－００３）又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、品番Ａ－１１０１３）を１００μＬ／ウェルで加え、細胞と均一に混合した後、４℃で４５分間インキュベートし、細胞２００ｇを遠心分離して、ＰＢＳ（＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ（＋１％ＦＢＳ）１００μＬで再懸濁させた後、フローサイトメトリーで解析した。５－Ｍ９の１２個のヒト化分子の予備ＦＡＣＳ結合解析には、ＨＥＫ２９３細胞の抗体発現上清を用い、上清中の抗体濃度をＰｒｏｂｌｉｆｅで定量化し、ＥＬＩＳＡで修正した。熱処理による抗体結合特性への影響の検討において、濃度測定対象の抗体をＰＣＲ装置にて７０℃で５分間熱処理した後、細胞とインキュベートして結合した。
ヒト化抗体の多糖、脂質及びタンパク質に対する非特異性を評価する検討において、昆虫バキュロウイルス（ＢＶ：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）の結合能に対する抗体の影響をＥＬＩＳＡ法で検出した(Hotzel et al, mAbs, 2012, 4(6), 753-760)。昆虫ウイルスエンベロープは多くの脂質類、多糖類及びタンパク質類を含み、ヒトの細胞や組織と類似した生化学混合物の特徴を持ち、抗体の昆虫バキュロウイルスに対する結合能力はある程度に抗体の体内での非特異的結合のリスクを評価することができる。昆虫バキュロウイルスはバキュロウイルスプラスミドを昆虫細胞に感染させて得られたものである。昆虫バキュロウイルスをＰＢＳで１：５００希釈し、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに被覆し、４℃で一晩放置した。ＰＢＳ（３００μＬ／ウェル）でプレートを３回洗浄し、１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし（２００μＬ／ウェル）、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。各濃度の抗体（１００μＬ／ウェル）を加えて室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（３００μＬ／ウェル）でプレートを６回洗浄した。１：５０００希釈ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄヤギ抗ヒト二次抗体（１００μＬ／ウェル）を加えた。室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ（３００μＬ／ウェル）でプレートを６回洗浄した。Ｈ_２Ｏ_２－Ａｍｐｌｘ（１００μＬ／ウェル）を加えて、室温、遮光下、値を読み取った。
表１３は、５－Ｍ９ヒト化抗体発現上清の非熱処理／熱処理後のＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合特徴を示しており、その中でも、ｈ５Ｍ９Ｖ７、ｈ５Ｍ９Ｖ１０、及びｈ５Ｍ９Ｖ１２は、合計１２個のヒト化分子において高い結合活性を有し、抗体は、７０℃で５分間熱処理した後も安定な結合特徴を維持した。

ｈ５Ｍ９Ｖ７、ｈ５Ｍ９Ｖ１０及びｈ５Ｍ９Ｖ１２の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。

５－Ｍ９キメラ抗体（Ｃｈｉ５－Ｍ９）、ｈ５Ｍ９Ｖ７、ｈ５Ｍ９Ｖ１０及びｈ５Ｍ９Ｖ１２（それぞれｈ５Ｍ９－Ｖ７、ｈ５Ｍ９－Ｖ１０及びｈ５Ｍ９－Ｖ１２とも呼ばれる）の精製抗体は、非熱処理／熱処理後、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２との結合特徴が図１９に示されており、精製ヒト化抗体ｈ５Ｍ９Ｖ７、ｈ５Ｍ９Ｖ１０及びｈ５Ｍ９Ｖ１２はＣｈｉ５－Ｍ９抗体と同様の結合特徴を有している。７０℃で熱処理後の３個のヒト化分子の結合特徴はＣｈｉ５－Ｍ９と一致し、熱的不安定性は示さなかった。５－Ｍ９及びそのヒト化抗体の非特異的結合のリスクを評価する検討では、図２０に示すように、ヒト化抗体は、参照対照（Ｒｉｔｕｘａｎ）及びＣｈｉ５－Ｍ９抗体と比較して、高濃度条件下で、非特異的結合が相対的に増強され、その中でも、ｈ５Ｍ９Ｖ７は最も弱い非特異的結合を示した。
試験抗体のｈＣＬＤＮ１８．２低発現細胞株への結合特性は、患者の胃腫瘍ＣＬＤＮ１８．２の発現レベルが臨床上不均一であり、１／３近くが低発現レベルであり、単一腫瘍の発現が異質性であることから、抗体の臨床応用を評価するための価値がある(Zhu G. et al, Sci Rep, 2019, 9, 8420-8431)。図２１は、ｈＣＬＤＮ１８．２低発現胃腫瘍細胞株ＫＡＴＯＩＩＩに対する９－Ｄ１及びそのヒト化抗体の結合を示しており、９－Ｄ１及びそのヒト化分子は、ＫＡＴＯＩＩＩへの結合が類似しており、いずれも強い結合能を示しており（図２１、Ａ）、ＥＣ５０（０．４～０．５μｇ／ｍＬ）は陽性対照（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）１７５Ｄ１０の半分（約０．８μｇ／ｍＬ）しかなく、最大結合強度（８００～１０００ＭＦＩ）は１７５Ｄ１０（３００～６００ＭＦＩ）の２倍である。９－Ｄ１及びそのヒト化分子がＫＡＴＯＩＩＩに結合した最大陽性細胞率（８０～９５％）は、陽性対照１７５Ｄ１０（３０～４０％）の２倍である（図２１、Ｂ）。

実施例１１ヒト化抗体の物理的・化学的性質の解析
本実施例では、５－Ｍ９及び９－Ｄ１、並びにそのヒト化抗体分子について、抗体の熱安定性、凝集体形成及び純度の物理的・化学的性質の解析を複数の方法で行った。
抗体の熱安定性解析：示差走査熱量蛍光測定（ＤＳＦ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓｃａｎｎｉｎｇｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）と静的光散乱（ＳＬＳ：Ｓｔａｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｎｔｔｅｒｉｎｇ）によってＵｎｃｌｅｓｙｓｔｅｍ（ＵＮＣＨＡＩＮＥＤＬＡＢＳ）で解析を行い、ＤＳＦとＳＬＳは、温度検出範囲２０～９５℃、昇温速度１℃／ｍｉｎであり、波長２６６ｎｍと４７３ｎｍの静的光散乱を検出し、溶融温度（Ｔ_ｍ：ＭｅｌｔｉｎｇＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）及び熱凝集温度（Ｔ_ａｇｇ：Ｔｈｅｒｍａｌａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）はＵｎｃｌｅｓｙｓｔｅｍソフトウェアで解析された。示差走査熱量測定装置（ＤＬＣ：ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）は、ＭａｌｖｅｒｎＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－ＣａｐｉｌｌａｒｙＤＳＣである。温度変化範囲は２５℃から１００℃、走査速度は１℃／ｍｉｎとした。試料緩衝液をブランク溶液として走査した。元のデータはＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－ＣａｐｉｌｌａｒｙＤＳＣＡｕｔｏｍａｔｅｄＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで処理された。
抗体凝集体解析：動的光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｎｔｔｅｒｉｎｇ）はＵｎｃｌｅｓｙｓｔｅｍ上で、試験温度２５℃で行い、Ｕｎｃｌｅｓｙｓｔｅｍソフトウェアで解析した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ－ＥｘｃｌｕｓｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）検出装置はＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅｅ２６９５システムであり、ＰＤＡ検出器を備えている。カラムはＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、品番０００８５４１である。移動相は０．１Ｍリン酸緩衝液、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８である。流速１．０ｍＬ／ｍｉｎとして、アイソクラティック溶出を行った。カラム温度２５℃、検出波長２８０ｎｍ、試料注入量１００μｇとした。
ＩｇＧ抗体は、それぞれ固有の融解温度（Ｔ_ｍ）を有する複数のタンパク質ドメインを有し、重鎖定常領域２（ＣＨ２）はＰＢＳ溶液中で一般的に約７０℃のＴ_ｍを有し、重鎖定常領域３（ＣＨ３）は比較的安定で、Ｔ_ｍが約８０℃である。抗体Ｆａｂｓ領域は大きな配列差異性を持つため、Ｔ_ｍ範囲が約５０℃～８５℃と広い。しかし、各ドメインのＴ_ｍは過渡的であり、ドメインのＴ_ｍ値が近いために分離できない場合がある。表１４は５－Ｍ９及びそのヒト化抗体の熱安定性解析結果を示しており、各抗体は２つ又は３つのＴ_ｍがあり、その中でも、Ｔ_ｍ１は全て約７０℃であり、ＣＨ２ドメインのＴ_ｍであると考えられ、Ｔ_ｍ２又はＴ_ｍ３はＣＨ３又はＦａｂドメインのＴ_ｍであり、全体的には、ｈ５Ｍ９Ｖ７はＴ_ｍ値が高く（図２２）、熱安定性が高かった。Ｔ_ａｇｇは静的光散乱が凝集体の出現を検出し始めることができる開始温度であり、その中でも、Ｔ_ａｇｇ２６６ｎｍは２６６ｎｍのＳＬＳを測定したものであり、小さな凝集粒子の検出に高感度であり、Ｔ_ａｇｇ４７３ｎｍは４７３ｎｍのＳＬＳを測定したものであり、大きな凝集粒子の検出に高感度である。ｈ５Ｍ９Ｖ７のＴ_ａｇｇ２６６ｎｍ及びＴ_ａｇｇ４７３ｎｍは、他のヒト化抗体及び５－Ｍ９キメラ抗体よりも有意に高かった（図２２）。

９－Ｄ１抗体及びそのヒト化抗体の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）検出スペクトルを図２３に、対応する融解温度（Ｔ_ｍ値）を表１５に示す。その結果、各抗体候補は良好な熱安定性を示した。抗体ＣＨ２領域の熱安定性を示すＴ_ｍ１値は、全ての候補抗体では、５０℃よりも高かった。抗体Ｆａｂ領域の熱安定性を示すＴ_ｍ２値は、全ての候補抗体では、６５℃よりも高かった。ｈ９Ｄ１Ｖ１は他のヒト化抗体より明らかに高いＴ_ｍ値を持ち、Ｔ_ｍ１は他のヒト化抗体より少なくとも５℃高く、Ｔ_ｍ２は他のヒト化抗体より少なくとも３℃高く、他の９－Ｄ１ヒト化抗体よりもｈ９Ｄ１Ｖ１には明らかな熱安定性上の優位性があることが示された。

５－Ｍ９のヒト化抗体の凝集体解析には、それぞれ動的光散乱法（ＤＬＳ）を用い、ＤＬＳデータを表１６にまとめた。各抗体分子は、２５℃の条件での粒子半径が約９．５ｎｍ（ピーク１）であり、抗体単体の半径範囲にあり、ＩｇＧ単体分子であり、含有量は約１００％である。多分散度指数（ＰＤＩ：ＰｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙＩｎｄｅｘ）は粒子の分散度を反映しており、ＰＤＩ＜０．２５は単一の均質な粒子と見なす。ｈ５Ｍ９Ｖ７及びｈ５Ｍ９Ｖ１２のＰＤＩは両方とも０．２５未満であり、Ｃｈｉ５－Ｍ９及びｈ５Ｍ９Ｖ１０のＰＤＩよりも大幅に小さく、単体の分散性が良好で、凝集体になりにくいことを示している。
９－Ｄ１のヒト化抗体の凝集体解析には、それぞれサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法を採用し、図２４に示すＳＥＣ検出スペクトルから、９－Ｄ１の各ヒト化抗体は良好な単体純度を持っており、明らかな凝集体と断裂断片が現れていないことが分かった。その中でも、ｈ９Ｄ１Ｖ３、ｈ９Ｄ１Ｖ６、ｈ９Ｄ１Ｖ７、及びｈ９Ｄ１Ｖ９抗体の主ピークは少し尾を引く。ｈ９Ｄ１Ｖ１の主ピークの形状は最適であり、尾引き現象がなかった。

実施例１２ヒト化抗体の胃癌組織及び健常者の主要器官組織でのＩＨＣ染色
本実施例では、精製された９Ｄ１及び５Ｍ９ヒト化抗体を利用して、ポリペルオキシダーゼ多量体（Ｐｏｌｙ－ＨＲＰ－ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いて抗体の直接結合（ＷＯ２０１５１７１９３８）を行い、次に、免疫組織化学方法を用いて、１６例の胃癌組織と５つの健常者の主要器官組織（心臓、肝臓、脾臓、肺及び腎臓、組織ごとに３例）の凍結切片でのヒト化抗体の染色を検出し、Ｐｏｌｙ－ＨＲＰ－ｐｏｌｙｍｅｒに結合したｈＩｇＧアイソタイプ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、品番１２０００Ｃ、）は陰性対照、Ｐｏｌｙ－ＨＲＰ－ｐｏｌｙｍｅｒに結合した１７５Ｄ１０抗体は参照抗体（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）とした。免疫組織化学方法では、凍結組織切片を凍結アセトンで５分間固定化し、その後、３％Ｈ_２Ｏ_２含有ＰＢＳ緩衝液で５分間不活化し、ＰＢＳでリンスした後、５ｇ／ｍＬのＰｏｌｙ－ＨＲＰ－ｐｏｌｙｍｅｒ抗体結合物とともに５分間インキュベートし、ＰＢＳで切片を洗浄し、ＤＡＢ基質３分発色後に反応を停止し、顕微鏡で撮影した。表１７は１６例の胃癌凍結切片における９Ｄ１及び５Ｍ９のヒト化抗体のＩＨＣ染色結果をまとめた。陰性対照（ｈＩｇＧアイソタイプ抗体）全ての組織での染色結果は陰性であり、参照抗体（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）１７５Ｄ１０の陽性染色率は３１．３％（－５／１６）であったが、ｈ９Ｄ１－Ｖ１、ｈ９Ｄ１－Ｖ２、ｈ５Ｍ９－Ｖ７及びｈ５Ｍ９－Ｖ１０の陽性染色率は参照抗体１７５Ｄ１０より有意に高く、それぞれ７５％（１２／１６）、６２．５％（１０／１６）、７５％（１２／１６）及び８１．２５％（１３／１６）であり、陽性染色組織では、ヒト化抗体９Ｄ１及び５Ｍ９抗体の染色強度は１７５Ｄ１０より有意に強かった（図２５参照）。

以下、ｈ９Ｄ１－Ｖ１及びｈ９Ｄ１－Ｖ２（ｈ９Ｄ１Ｖ１及びｈ９Ｄ１Ｖ２ともいう）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。これらの重鎖定常領域配列及び軽鎖定常領域配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３８、及びＳＥＱＩＤＮＯ：３９である。

９Ｄ１及び５Ｍ９のヒト化抗体、並びに対照抗体の健常者の心臓（３例）、肝臓（３例）、脾臓（３例）、肺（３例）、及び腎臓（３例）の凍結切片でのＩＨＣ染色結果を表１８にまとめたが、全て陰性であった。図２６は、正常な腎臓組織（＃１２５）と正常な肝臓組織（＃１２８）のそれぞれでの抗体の陰性染色結果を示す。

これらの結果は、参照抗体（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）１７５Ｄ１０抗体に比べ、ヒト化９Ｄ１及び５Ｍ９抗体は、胃癌組織では、顕著に向上した特異的陽性染色率及び染色強度を有し、非標的主要器官組織では、非特異的な組織交差反応を有さないことを示した。これは９Ｄ１及び５Ｍ９抗体の高い薬剤形成性を示唆しており、腫瘍組織を最大限に標的化しながら、標的外毒性（オフターゲット毒性）を持たない。

実施例１３抗体の担癌マウスへの抗腫瘍作用
本実施例では、ｈ９Ｄ１Ｖ１抗体及び陽性対照抗体１７５Ｄ１０の荷腫マウスへの抗腫瘍作用を検討した。実験動物飼育室にＣＢ１７－ＳＣＡＤマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ社、系統コード４０４）を入れて、検疫適応を７日間した。細胞検疫に合格したものを実験に入れ、ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２細胞を５×１０^６個、体積１００μｌ（マトリゲル（Ｂｉｏｃｏａｔ、品番３５６２３４）：ＰＢＳ＝１：１）を側腹中部に接種し、１日観察し、接種翌日、１群９匹で３群（ＰＢＳ群、１７５Ｄ１０、ｈ９Ｄ１Ｖ１）に無作為に分け、腹腔内投与を開始し（２００μｇ／匹、投与濃度１ｍｇ／ｍＬ、投与体積２００μＬ、週２回、計４週間）、接種後１週間から腫瘍体積を測定し、それ以降３日ごとに１回測定し、体重は６日ごとに測定した。統計学はＯｎｅ－ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙｐｏｓｔ－ｈｏｃ検定を用い、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１であった。その結果、図２７に示すように、ＰＢＳ群に比べて、１７５Ｄ１０投与群は腫瘍の成長を有意に抑制したのに対し、ｈ９Ｄ１Ｖ１は同様に腫瘍の成長を有意に抑制しており、１７５Ｄ１０とｈ９Ｄ１Ｖ１では有意差が認められなかった。投与期間中のマウスの体重変化の傾向は同じであり、明らかな投与関連変化はなかった。

Claims

ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、重鎖ＣＤＲｓと軽鎖ＣＤＲｓとを含み、
前記重鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３であり、かつ、
前記軽鎖ＣＤＲｓは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３である、ＣＬＤＮ１８．２抗体。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３１又はＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体であって、前記重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３１に示され、前記軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：３３に示される、抗体。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体であって、
１）前記重鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示され、前記軽鎖可変領域はＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示される、又は
２）前記重鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示され、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示される、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＣＬＤＮ１８．２抗体であって、
（１）前記重鎖可変領域は、配列番号３４で示され、前記軽鎖可変領域は、配列番号３５で示される、または
（２）前記重鎖可変領域は、配列番号３６で示され、前記軽鎖可変領域は、配列番号３５で示される、
ＣＬＤＮ１８．２抗体。
多重特異性抗体又は二重特異性抗体である、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体。
前記多重特異性抗体又は二重特異性抗体は第２生物分子に結合する結合ドメインを含み、前記第２生物分子は細胞表面抗原である、請求項８に記載の抗体。
前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、請求項９に記載の抗体。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体に連結される治療剤、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体アゴニスト、サイトカイン、放射性核種又は酵素を含む、免疫複合体。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１１に記載の免疫複合体を含む医薬組成物。
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列又は請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
請求項１５に記載の宿主細胞を培養して、培養物から抗体を単離することを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を製造する方法。
癌の治療における使用のための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１１に記載の免疫複合体。