JP7573019B2 - Ａｔｒ阻害剤の結晶形及びその使用 - Google Patents
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Description
本願は、出願日が２０１９年８月６日である第ＣＮ２０１９１０７２２１０２．７号の優先権を主張するものである。
本発明は、ＡＴＲ阻害剤の結晶形及びその製造方法に関し、かつＡＴＲ関連疾患を治療する薬物の製造におけるその使用に関する。
ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調及びＲＡＤ－３関連プロテインキナーゼ）は、ＰＩＫＫｓ（ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ－関連キナーゼ）ファミリーに属し、ＤＮＡの損傷修復に関与して遺伝子の安定性を維持する。ＡＴＲプロテインキナーゼは、ＤＮＡの損傷、複製ストレス及び細胞周期の妨害に対して相乗的応答を生じる。ＡＴＲ及びＡＴＭは、いずれもセリン／スレオニンプロテインキナーゼのＰＩＫＫファミリーに属し、それらは、細胞周期及びＤＮＡの損傷修復の共同構成部分であり、それら以外、Ｃｈｋｌ、ＢＢＲＣＡｌ、ｐ５３をさらに含む。ＡＴＲは、主にＤＮＡ複製ストレス（複製フォーク停止）、一本鎖切断の修復を担当する。
ＤＮＡ二本鎖切断において切除又は複製フォーク停止が発生すると、ＡＴＲは、ＤＮＡ一本鎖構造によって活性化される。ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ複製過程に留まり、複製ヘリカーゼがＤＮＡ複製フォークの先端で巻き戻し続けて、長い一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の生成を招き、その後、一本鎖ＤＮＡがＲＰＡ（複製タンパク質Ａ）と結合する。複製ストレス又はＤＮＡ損傷の場合に、ＲＰＡによってリクルートされたＡＴＲ／ＡＴＲは、タンパク質の複合体を損傷部位に作用させ、ＲＰＡ－一本鎖ＤＮＡ複合体は、ＲＡＤ１７／ｒｆｃ２－５複合体を活性化して損傷部位に結合させ、ＤＮＡ－ｓｓＤＮＡ接合部でＲａｄ９－ＨＵＳ１－ＲＡＤ１（９－１－１）ヘテロ三量体を活性化し、逆に９－１－１は、ＡＴＲを活性化するためにＴｏｐＢＰ１をリクルートする。ＡＴＲが活性化されると、ＡＴＲは、下流ターゲットによってＤＮＡの修復、安定化を促進し、そして停止した複製フォークを再開し、一時的な細胞周期停止を再活性化する。これらの機能は、ＡＴＲが下流標的Ｃｈｋ１を媒介することで実現される。ＡＴＲは、Ｓ期にＤＮＡ損傷細胞周期チェックポイントの役割を果たしている。それは、Ｃｈｋ１によりＣＤＣ２５Ａの分解を媒介することにより、ＤＮＡの複製過程を遅延させ、複製フォークの修復に時間を提供する。ＡＴＲもＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントの主要な調節者であり、ＤＮＡ複製が完了するか又はＤＮＡが損傷される前に、細胞が有糸分裂に早期に入ることを阻止する。このようなＡＴＲに依存するＧ２／Ｍ細胞周期停止は、主に以下の１～２の２つのメカニズムによって媒介される。１、ＣＤＣ２５Ａの分解。２、Ｃｈｋ１によりＣｄｃ２５Ｃをリン酸化して１４－３－タンパク質に結合させること。Ｃｄｃ２５Ｃと１４－３－３タンパク質との結合は、細胞核からＣｄｃ２を輸送し細胞質と隔離することを促進することにより、Ｃｄｃ２５Ｃが核Ｃｄｃ２を脱リン酸化して活性化する能力を抑制し、さらに有糸分裂に入ることを阻止する。
ＡＴＲ遺伝子の突然変異は、極めて稀であり、少数のＳｅｃｋｅｌ症候群患者のみにＡＴＲ遺伝子の突然変異があり、その特徴は、発育遅延と小頭症である。ＡＴＲ関連経路の中断は、ゲノムの不安定を招く一方、ＡＴＲタンパク質は、多くの癌化学療法によって活性化される。また、ＡＴＲ遺伝子の重複は、横紋筋肉腫の危険因子として記述されている。
ＡＴＲは、細胞の自己複製に不可欠であり、かつ複製開始点を調節し、損傷した複製フォークを修復するためにＳ期に活性化される。複製フォークが損傷すると、プラチナ系とヒドロキシウレア系抗癌剤に対する癌細胞の感度を増加させ、癌細胞の薬剤耐性を低下させることができる。したがって、ＡＴＲの阻害は、将来の癌治療において有効な方法となる可能性がある。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角：８．１０±０．２０°、１８．３３±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＡのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：７．４６±０．２０°、８．１０±０．２０°、１３．０３±０．２０°、１５．０７±０．２０°、１５．５８±０．２０°、１６．１９±０．２０°、１８．３３±０．２０°及び２２．６３±０．２°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＡのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：７．４６±０．２０°、８．１０±０．２０°、１３．０３±０．２０°、１３．４６±０．２０°、１５．０７±０．２０°、１５．５８±０．２０°、１６．１９±０．２０°、１８．３３±０．２０°、２１．１７±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＡのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：７．４６、８．１０、１１．２４°、１３．０３°、１３．４６°、１５．０７°、１５．５８°、１５．９８°、１６．１９°、１７．７０°、１８．３３°、１９．６０°、２１．１７°、２２．６３°、２３．８４°、２５．５６°及び２６．５７°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＡのＸＲＰＤパターンは、図１に示される。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＡのＸＲＰＤパターンの解析データは、表１に示される。
表１ 結晶形ＡのＸＲＰＤパターンの解析データ
表１ 結晶形ＡのＸＲＰＤパターンの解析データ
本発明に係る式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、Ｘ線粉末回折パターンが、２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°及び２０．５６±０．２０°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°、１４．８３±０．２０°、１５．５４±０．２０°、１７．３３±０．２０°、２０．５６±０．２０°、２２．００±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°、１４．８３±０．２０°、１５．５４±０．２０°、１７．３３±０．２０°、２０．０８±０．２０°、２０．５６±０．２０°、２２．００±０．２０°、２２．６３±０．２０°及び２５．２６±０．２０°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＸ線粉末回折パターンは、２θ角：８．４５°、９．２０°、１０．８７°、１２．５７°、１４．１４°、１４．５３°、１４．８３°、１５．５４°、１６．８０°、１７．３３°、１８．４３°、１９．８４°、２０．０８°、２０．５６°、２１．３９°、２２．００°、２２．４４°、２２．６３°、２３．２６°、２５．２６°、２５．８５°及び２６．９８°に特徴的な回折ピークを有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＸＲＰＤパターンは、図２に示される。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＸＲＰＤパターンの解析データは、表２に示される。
表２ 結晶形ＢのＸＲＰＤパターンの解析データ
表２ 結晶形ＢのＸＲＰＤパターンの解析データ
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形Ｂの示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）は、１７４．３±３℃で１つの吸熱ピークの開始点を有する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＤＳＣパターンは、図３に示される。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形Ｂの熱重量分析曲線（ＴＧＡ）は、１５０±３℃で重量減少が１．４９％に達する。
本発明のいくつかの態様において、前記結晶形ＢのＴＧＡパターンは、図４に示される。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａの製造方法は、
式（Ｉ）の化合物をエタノール溶媒に添加するステップ１）と、
水を添加するステップ２）と、
１００～１２０時間撹拌するステップ３）と、
室温で再結晶して得るステップ４）と、を含む。
式（Ｉ）の化合物をエタノール溶媒に添加するステップ１）と、
水を添加するステップ２）と、
１００～１２０時間撹拌するステップ３）と、
室温で再結晶して得るステップ４）と、を含む。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂの製造方法は、
式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加するステップ１）と、
一定の温度に加熱して２．５～１２０時間撹拌するステップ２）と、
室温で再結晶して結晶形Ｂを得るステップ３）と、を含む。
式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加するステップ１）と、
一定の温度に加熱して２．５～１２０時間撹拌するステップ２）と、
室温で再結晶して結晶形Ｂを得るステップ３）と、を含む。
本発明のいくつかの態様において、前記溶媒は、メタノール、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、メタノール／水（Ｖ／Ｖ、１：０．３～１）、アセトン／水（Ｖ／Ｖ、１：１）、イソプロパノール／水（Ｖ／Ｖ、１：１）、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、酢酸イソプロピル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、エタノール／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、アセトニトリル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、イソプロパノール／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）又はジクロロメタン／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）である。
本発明のいくつかの態様において、前記温度は、２５～７０℃である。
本発明に係る式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂの製造方法は、
式（Ｉ）の化合物をアルコール系溶媒に添加するステップ１）と、
水を添加するステップ２）と、
１５～２０時間撹拌するステップ３）と、
室温で再結晶して得るステップ４）と、を含む。
式（Ｉ）の化合物をアルコール系溶媒に添加するステップ１）と、
水を添加するステップ２）と、
１５～２０時間撹拌するステップ３）と、
室温で再結晶して得るステップ４）と、を含む。
本発明のいくつかの態様において、前記アルコール系溶媒と水との体積比は、１：１～１：４である。
本発明のいくつかの態様において、前記アルコール系溶媒は、メタノールから選択される。
本発明のいくつかの態様において、前記式（Ｉ）の化合物の濃度範囲は、２５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬから選択される。
本発明は、前記式（Ｉ）の化合物、前記結晶形Ａ又は前記結晶形Ｂの、ＡＴＲ関連疾患を治療する薬物の製造における使用をさらに提供する。
本発明のいくつかの態様において、前記使用は、前記薬物が固形腫瘍又は血液腫瘍を治療するための薬物であることを特徴とする。
本発明のいくつかの態様において、前記使用は、前記薬物が結腸直腸癌、胃癌、食道癌、原発性腹膜癌、副腎皮質癌、腎臓明細胞癌、前立腺癌、膀胱尿路上皮癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、卵管癌、非小細胞肺癌又は小細胞肺癌を治療するための薬物であることを特徴とする。
本発明の式（I）の化合物の結晶形Ａ及び結晶形Ｂは安定し、光熱湿度による影響が小さく、かつ良好なインビボ投与薬効を有し、製剤化の将来性が広い。
定義及び説明
定義及び説明
特に説明しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を含むものとする。特定の語句や用語は、特別な定義がない限り、不明確又は不明瞭であるとみなされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書で商品名が現れる場合、その対応する商品又はその活性成分を指すものとする。
本発明の中間体化合物は、以下に列挙する具体的な実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることによって形成される実施形態、及び当業者に周知の均等置換形態を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって製造でき、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の具体的な実施形態における化学反応は、適切な溶媒中で完成し、上記溶媒は、本発明の化学変化及びそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を取得するために、当業者が既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応フローを変更するか又は選択する必要がある場合がある。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明を何ら限定するものではない。
本発明で使用される全ての溶媒は、市販されており、さらに精製することなく使用することができる。
本発明で使用される溶媒は、市販品として入手可能である。本発明は、以下の略語を使用する。ＥｔＯＨは、エタノールを表し、ＭｅＯＨは、メタノールを表し、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸を表し、ＴｓＯＨは、ｐ－トルエンスルホン酸を表し、ｍｐは、融点を表し、ＥｔＳＯ３Ｈは、エタンスルホン酸を表し、ＭｅＳＯ３Ｈは、メタンスルホン酸を表し、ＴＨＦは、テトラヒドロフランを表し、ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルを表す。
本発明のＸ線粉末回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、 ＸＲＰＤ）方法
機器型番：
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用する。
機器型番：
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用する。
詳細なＸＲＰＤパラメータは、以下のとおりである。
Ｘ線源：Ｃｕ、ｋα（Ｋα１＝１．５４０５９８Ａ、Ｋα２＝１．５４４４２６Ａ、Ｋα２／Ｋα１の強度比率：０．５）
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ、Ｘ線管電流：４０ｍＡ
発散スリット：固定１／８ｄｅｇ
第１のソーラースリット：０．０４ｒａｄ
第２のソーラースリット：０．０４ｒａｄ
レシービングスリット：なし
散乱防止スリット：７．５ｍｍ
測定時間：５ｍｉｎ
走査角度範囲：３～４０ｄｅｇ
ステップ幅角度：０．０２６３ｄｅｇ
ステップサイズ：４６．６６５秒
サンプルディスク回転数：１５ｒｐｍ
Ｘ線源：Ｃｕ、ｋα（Ｋα１＝１．５４０５９８Ａ、Ｋα２＝１．５４４４２６Ａ、Ｋα２／Ｋα１の強度比率：０．５）
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ、Ｘ線管電流：４０ｍＡ
発散スリット：固定１／８ｄｅｇ
第１のソーラースリット：０．０４ｒａｄ
第２のソーラースリット：０．０４ｒａｄ
レシービングスリット：なし
散乱防止スリット：７．５ｍｍ
測定時間：５ｍｉｎ
走査角度範囲：３～４０ｄｅｇ
ステップ幅角度：０．０２６３ｄｅｇ
ステップサイズ：４６．６６５秒
サンプルディスク回転数：１５ｒｐｍ
本発明の示差走査熱量（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、 ＤＳＣ）方法
機器型番：ＴＡＱ２００／Ｑ２０００／２５００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（約１～５ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムディスクに入れて試験を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを２５℃（室温）からサンプルを分解するまで加熱する。
機器型番：ＴＡＱ２００／Ｑ２０００／２５００示差走査熱量計
試験方法：サンプル（約１～５ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムディスクに入れて試験を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを２５℃（室温）からサンプルを分解するまで加熱する。
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＴＧＡ）方法
機器型番：ＴＡＱ５０００／５５００熱重量分析計
試験方法：サンプル（約１～５ｍｇ）をＴＧＡアルミニウムディスクに入れて試験を行い、１０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温から３５０℃に加熱する。
機器型番：ＴＡＱ５０００／５５００熱重量分析計
試験方法：サンプル（約１～５ｍｇ）をＴＧＡアルミニウムディスクに入れて試験を行い、１０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温から３５０℃に加熱する。
本発明の内容をよりよく理解するために、以下に具体的な実施例を参照してさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容を限定するものではない。
実施例１：式（Ｉ）の化合物の製造
ステップ１：化合物１－ＳＭ１－２の製造
室温で、まず、５０Ｌの反応釜に４．０Ｌのジメチルスルホキシドを添加し、撹拌しながら釜内に１－ＳＭ１－Ａ（１５００．６９ｇ、８．３９ｍｏｌ）、（Ｒ）－３－メチルモルホリン（８５４．９７ｇ、８．４５ｍｏｌ）、炭酸カリウム（２８９１ｇ、２０．９２ｍｏｌ）を順に添加し、釜内に６．０Ｌのジメチルスルホキシドを再び添加して希釈し、添加した後に９５℃で３時間撹拌した。完全に１－ＳＭ１－１に変換されたことを検出すると、温度を４５℃に低下させ、反応釜内に窒素ガスを５分間流し、次に１，４－ジメチルピラゾール－５－ピナコールボロン酸エステル（１９５２．４４ｇ、８．７９ｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１９２．９８ｇ、０．１６７ｍｏｌ）を添加し、添加した後に釜内に２．０Ｌのジメチルスルホキシドを添加して内壁を洗い流し、窒素ガス雰囲気で１０４℃で１２時間撹拌した。反応が終了した後に４０℃に降温し、濾過し、濾過ケーキを２０．０Ｌの酢酸エチルで洗い流し、濾液を釜内に注ぎ、釜内に１５．０Ｌの水を添加し、２分間撹拌して静置分液し、水相を１０．０Ｌの酢酸エチルで抽出し、次に有機相を合わせ、それぞれ水（１０．０Ｌ）、飽和食塩水（８．０Ｌ＊２）で洗浄し、有機相を濃縮して粗化合物１－ＳＭ１－２を得て次の反応に直接用いた。
ＭＳ ｍ／ｚ：３０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋
室温で、まず、５０Ｌの反応釜に４．０Ｌのジメチルスルホキシドを添加し、撹拌しながら釜内に１－ＳＭ１－Ａ（１５００．６９ｇ、８．３９ｍｏｌ）、（Ｒ）－３－メチルモルホリン（８５４．９７ｇ、８．４５ｍｏｌ）、炭酸カリウム（２８９１ｇ、２０．９２ｍｏｌ）を順に添加し、釜内に６．０Ｌのジメチルスルホキシドを再び添加して希釈し、添加した後に９５℃で３時間撹拌した。完全に１－ＳＭ１－１に変換されたことを検出すると、温度を４５℃に低下させ、反応釜内に窒素ガスを５分間流し、次に１，４－ジメチルピラゾール－５－ピナコールボロン酸エステル（１９５２．４４ｇ、８．７９ｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１９２．９８ｇ、０．１６７ｍｏｌ）を添加し、添加した後に釜内に２．０Ｌのジメチルスルホキシドを添加して内壁を洗い流し、窒素ガス雰囲気で１０４℃で１２時間撹拌した。反応が終了した後に４０℃に降温し、濾過し、濾過ケーキを２０．０Ｌの酢酸エチルで洗い流し、濾液を釜内に注ぎ、釜内に１５．０Ｌの水を添加し、２分間撹拌して静置分液し、水相を１０．０Ｌの酢酸エチルで抽出し、次に有機相を合わせ、それぞれ水（１０．０Ｌ）、飽和食塩水（８．０Ｌ＊２）で洗浄し、有機相を濃縮して粗化合物１－ＳＭ１－２を得て次の反応に直接用いた。
ＭＳ ｍ／ｚ：３０４．０［Ｍ＋Ｈ］＋
ステップ２：化合物１－ＳＭ１の製造
－４０℃で６．０Ｌの１，４－ジオキサンに塩化水素ガス（１３４４．０ｇ、３６．８２ｍｏｌ）を流して使用に備えた。まず、５０Ｌの反応釜内に５．０Ｌの１，４－ジオキサンを添加し、濃縮して得られた粗生成物１－ＳＭ１－２を５．０Ｌの１，４－ジオキサンで溶解して釜内に入れ、撹拌しながら１５．０Ｌの１，４－ジオキサンを添加して希釈した。７０℃に昇温し、反応液に上記製造した塩酸／１，４－ジオキサン（１３４４ｇ、６．０Ｌ）を徐々に添加し、９８℃で１５時間反応させた。４０℃に降温し、濾過し、濾過ケーキを１５．０Ｌの酢酸エチルで洗い流し、固体を反応釜に注ぎ、１５．０Ｌの酢酸エチルで３０分間叩解した。濾過し、濾過ケーキを５．０Ｌの酢酸エチルで洗い流した。固体を真空オーブンに入れて乾燥させて化合物１－ＳＭ１を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：２９０．１［Ｍ＋Ｈ］＋
－４０℃で６．０Ｌの１，４－ジオキサンに塩化水素ガス（１３４４．０ｇ、３６．８２ｍｏｌ）を流して使用に備えた。まず、５０Ｌの反応釜内に５．０Ｌの１，４－ジオキサンを添加し、濃縮して得られた粗生成物１－ＳＭ１－２を５．０Ｌの１，４－ジオキサンで溶解して釜内に入れ、撹拌しながら１５．０Ｌの１，４－ジオキサンを添加して希釈した。７０℃に昇温し、反応液に上記製造した塩酸／１，４－ジオキサン（１３４４ｇ、６．０Ｌ）を徐々に添加し、９８℃で１５時間反応させた。４０℃に降温し、濾過し、濾過ケーキを１５．０Ｌの酢酸エチルで洗い流し、固体を反応釜に注ぎ、１５．０Ｌの酢酸エチルで３０分間叩解した。濾過し、濾過ケーキを５．０Ｌの酢酸エチルで洗い流した。固体を真空オーブンに入れて乾燥させて化合物１－ＳＭ１を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：２９０．１［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６） δｐｐｍ １．３４ （ｂｒｄ、Ｊ＝６．５２Ｈｚ、３Ｈ） ２．０８ （ｓ、３Ｈ） ３．４７～３．５８ （ｍ、２Ｈ） ３．６４～３．７０ （ｍ、１Ｈ） ３．７２～３．７８ （ｍ、１Ｈ） ３．８７ （ｓ、３Ｈ） ３．９７ （ｂｒｓ、１Ｈ） ４．０７～４．３２ （ｍ、１Ｈ） ４．４７ （ｂｒｓ、１Ｈ） ６．６１ （ｓ、１Ｈ） ７．４４ （ｓ、１Ｈ）
ステップ３：化合物１－ＳＭ２の製造
化合物１－ＳＭ２－１（２ｇ、７．８７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラート）ジボロン（４．００ｇ、１５．７４ｍｍｏｌ）及び１，１－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（０．３ｇ、４１０．００μｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（２５．０ｍＬ）溶液に酢酸カリウム（２．３２ｇ、２３．６１ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガスで３回置換し、１００℃で８時間加熱し撹拌し反応させた。濾過し、溶液を濃縮して粗生成物を得て、粗生成物をカラムクロマトグラフィーで分離して化合物１－ＳＭ２を得た。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：３０２．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＭＳ－ＥＳＩ ｍ／ｚ：３０２．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ステップ４：化合物１－１の製造
室温で、まず、５０Ｌの反応釜に１５．０Ｌのトルエンを添加し、撹拌しながら釜内に化合物１－ＳＭ１（１５００．０ｇ、４．２３ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１１７５．０ｍｌ、８．４５ｍｏｌ）を順に添加し、塩化ホスホリル（１１７８．０ｍｌ、１２．６８ｍｏｌ）を数回に分けて添加し、添加した後に反応液を１０３～１０８℃で１時間４０分間撹拌し、反応が完了したと検出すると温度を４５℃に低下させ、反応液を一時保管バケツに移し、反応釜内に１５．０Ｌの純水を添加し、撹拌しながら反応液を純水に数回に分けて添加し、温度を２０～４０℃に制御し、添加した後に１２．０Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（４Ｍ）でｐＨを６～７に調節し、温度を２０～４０℃に制御した。ｐＨを調整した後、反応釜内に７．５Ｌの酢酸エチルを添加して均一に撹拌した後に分層し、水相を１５．０Ｌの酢酸エチルで抽出し、有機相を合わせて１２．０Ｌの飽和食塩水で洗浄した。留出物がなくなるまで有機相を減圧濃縮して粗生成物を得て、粗生成物を１．５Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで溶解し、撹拌しながら１２．０Ｌのｎ－ヘプタンを数回に分けて添加し、５分間撹拌して濾過し、濾過ケーキを５．０Ｌのｎ－ヘプタンで洗い流し濾過を続け、固体をトレイに入れて自然乾燥させて化合物１－１を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：３０８．０［Ｍ＋Ｈ］＋
ＭＳ ｍ／ｚ：３０８．０［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６） δｐｐｍ １．２９ （ｂｒｄ、Ｊ＝６．７８Ｈｚ、３Ｈ） ２．１７ （ｓ、３Ｈ） ３．２４～３．３２ （ｍ、１Ｈ） ３．５２ （ｂｒｓ、１Ｈ） ３．６３～３．６９ （ｍ、１Ｈ） ３．７８ （ｂｒｄ、Ｊ＝１１．５４Ｈｚ、１Ｈ） ３．９６ （ｓ、３Ｈ）４．０１ （ｂｒｓ、１Ｈ） ４．１４ （ｂｒｓ、１Ｈ） ４．４７ （ｂｒｓ、１Ｈ） ６．８９ （ｓ、１Ｈ） ７．４２ （ｓ、１Ｈ）
ステップ５：化合物１－２の製造
２０～３０℃で、窒素ガス雰囲気下で、１０Ｌのガラス釜に２．１Ｌのジメチルスルホキシドを添加し、撹拌しながら、供給漏斗を用いて化合物１－１（０．２１ｋｇ）、化合物１－ＳＭ２（０．３０６ｋｇ）、炭酸ナトリウム水溶液（１．３Ｍ、１．０５Ｌ）、１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（０．００７４９ｋｇ）を順に添加し、加熱して内温６０～７０℃に昇温し、４～１６時間保温して反応させた。体系を４０～４５℃に降温し、３０分間内に５．２５Ｌの水を滴下し、３０分間撹拌し続け、吸引濾過し、２．１Ｌの水で濾過ケーキを洗浄した。４５℃で真空乾燥させて粗生成物を得た。前段で得られた粗生成物に２．６２５Ｌの酢酸エチルを添加し、均一に撹拌して溶解した後、１０．５Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを再び添加し、３０分間撹拌し続け、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、珪藻土層を２．１Ｌの酢酸エチルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶液（体積比１：４）で再び洗浄し、濾液を合わせ、有機相を濃縮して濃縮物を得た。珪藻土の上層の黒色の濾過ケーキを収集し、酢酸エチルを１．５Ｌ添加して室温で１時間撹拌した後、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、濾過ケーキを０．５Ｌの酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮し、上記２回で得られた濃縮物を合わせた。
２０～３０℃で、窒素ガス雰囲気下で、１０Ｌのガラス釜に２．１Ｌのジメチルスルホキシドを添加し、撹拌しながら、供給漏斗を用いて化合物１－１（０．２１ｋｇ）、化合物１－ＳＭ２（０．３０６ｋｇ）、炭酸ナトリウム水溶液（１．３Ｍ、１．０５Ｌ）、１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセンジクロロパラジウム（０．００７４９ｋｇ）を順に添加し、加熱して内温６０～７０℃に昇温し、４～１６時間保温して反応させた。体系を４０～４５℃に降温し、３０分間内に５．２５Ｌの水を滴下し、３０分間撹拌し続け、吸引濾過し、２．１Ｌの水で濾過ケーキを洗浄した。４５℃で真空乾燥させて粗生成物を得た。前段で得られた粗生成物に２．６２５Ｌの酢酸エチルを添加し、均一に撹拌して溶解した後、１０．５Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを再び添加し、３０分間撹拌し続け、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、珪藻土層を２．１Ｌの酢酸エチルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶液（体積比１：４）で再び洗浄し、濾液を合わせ、有機相を濃縮して濃縮物を得た。珪藻土の上層の黒色の濾過ケーキを収集し、酢酸エチルを１．５Ｌ添加して室温で１時間撹拌した後、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、濾過ケーキを０．５Ｌの酢酸エチルで洗浄し、濾液を濃縮し、上記２回で得られた濃縮物を合わせた。
前段で得られた濃縮物に１．５Ｌの酢酸エチルを添加して溶解し、撹拌中の４．５Ｌのｎ－ヘプタン溶液（１．５時間）に徐々に滴下し、２時間撹拌し続けて濾過し、濾過ケーキを０．４Ｌの酢酸エチルとｎ－ヘプタン（体積比１：３）の混合溶液で洗浄した。 濾過ケーキを真空乾燥させた後に２Ｌの一口フラスコに入れ、かつ０．８Ｌの酢酸イソプロピルを添加し、４時間還流した後に室温に徐々に下げて一晩撹拌し、ブフナー漏斗で濾過し、濾過ケーキを０．３Ｌの酢酸イソプロピルで洗浄し、固体を収集し、固体を真空乾燥させて生成物を得た。
生成物を４．２Ｌの酢酸エチルに溶解し、撹拌しながら４２ｇの活性炭を添加した後に還流下で一晩撹拌し、熱濾過し、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、珪藻土層を２．０Ｌの酢酸エチルで再び洗浄し、濾液を合わせ、有機相を３．０Ｌに濃縮した。上記有機相に１．２Ｌの酢酸エチル及び４３ｇの活性炭を添加し、還流下で８ｈ撹拌した後に熱濾過し、珪藻土を敷いたブフナー漏斗で濾過し、珪藻土層を２．０Ｌの酢酸エチルで洗浄し、濾液を合わせ、有機相を濃縮し、かつ真空乾燥させて化合物１－２を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：４４７．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
ＭＳ ｍ／ｚ：４４７．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＨＣｌ３－ｄ、４００ＭＨｚ）： δ＝８．９８ （ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．５７ （ｂｒｓ、１Ｈ）、８．２７ （ｓ、１Ｈ）、７．５８ （ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９ （ｔ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２ （ｓ、１Ｈ）、６．５０ （ｓ、１Ｈ）、４．４８ （ｂｒｓ、１Ｈ）、４．２９ （ｂｒｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１７ （ｓ、３Ｈ）、４．１３ （ｄｄ、Ｊ＝１１．９、２．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．９８ （ｓ、３Ｈ）、３．８７～３．９３ （ｍ、１Ｈ）、３．８０～３．８７ （ｍ、１Ｈ）、３．６９ （ｔｄ、Ｊ＝１１．９、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．４４ （ｔｄ、Ｊ＝１２．８、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．２５ （ｓ、３Ｈ）、１．４４ｐｐｍ （ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）
ステップ６：式（１）の化合物の製造
２０℃で、化合物１－２（３５．０ｇ、７８．３９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５０．０ｍＬ）に水素化アルミニウムリチウム（６３．０ｍＬ、２．５Ｍ）を添加し、２０℃で１時間撹拌し反応させた。０～５℃で反応液に６．９ｍＬの水、６．９ｍＬの１５％の水酸化ナトリウム及び２０．７ｍＬの水を徐々に順に添加し、次に濾過し、濾液を濃縮して粗生成物を得て、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル：５０～１００％）で分離して生成物を得た。室温で上記生成物を２０．０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、撹拌中の４００ｍＬの水に徐々に滴下し、濾過して乾燥させて式（I）の化合物を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：４１９．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋
２０℃で、化合物１－２（３５．０ｇ、７８．３９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５０．０ｍＬ）に水素化アルミニウムリチウム（６３．０ｍＬ、２．５Ｍ）を添加し、２０℃で１時間撹拌し反応させた。０～５℃で反応液に６．９ｍＬの水、６．９ｍＬの１５％の水酸化ナトリウム及び２０．７ｍＬの水を徐々に順に添加し、次に濾過し、濾液を濃縮して粗生成物を得て、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル：５０～１００％）で分離して生成物を得た。室温で上記生成物を２０．０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、撹拌中の４００ｍＬの水に徐々に滴下し、濾過して乾燥させて式（I）の化合物を得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：４１９．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＣＨＣｌ３－ｄ） δｐｐｍ ８．３９ （ｂｒｓ、１Ｈ）、８．２８ （ｓ、１Ｈ）、７．５８ （ｓ、１Ｈ）、７．５１ （ｂｒｓ、１Ｈ）、７．４２ （ｓ、１Ｈ）、７．３５ （ｔ、Ｊ＝２．７６Ｈｚ、１Ｈ）、６．４９ （ｓ、１Ｈ）、４．８９ （ｓ、２Ｈ）、４．５１ （ｂｒｓ、１Ｈ）、４．３０ （ｂｒｄ、Ｊ＝１４．０５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１１～４．１８ （ｍ、４Ｈ）、３．８１～３．９４ （ｍ、２Ｈ）、３．７０ （ｔｄ、Ｊ＝１１．８６、３．１４Ｈｚ、１Ｈ）、３．４４ （ｔｄ、Ｊ＝１２．８６、３．８９Ｈｚ、１Ｈ）、２．２６ （ｓ、３Ｈ）、１．４５ （ｄ、Ｊ＝６．７８Ｈｚ、３Ｈ）
実施例２：式（１）の化合物の結晶形Ａの製造
約５００．０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を秤量して５ｍＬのエタノールに溶解し、１５ｍＬの精製水を滴ずつ滴下した。滴下終了後、マグネチックスターラー（２０℃）に入れて１２０時間撹拌した。懸濁液を濾過して固体を得て、固体を真空オーブンで一晩乾燥させて、式（I）の化合物の結晶形Ａを得た。
約５００．０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を秤量して５ｍＬのエタノールに溶解し、１５ｍＬの精製水を滴ずつ滴下した。滴下終了後、マグネチックスターラー（２０℃）に入れて１２０時間撹拌した。懸濁液を濾過して固体を得て、固体を真空オーブンで一晩乾燥させて、式（I）の化合物の結晶形Ａを得た。
１Ｈ ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＣＨＣｌ３－ｄ） δ＝８．３９ （ｂｒｓ、１Ｈ）、８．２５ （ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．５３ （ｓ、１Ｈ）、７．４９ （ｔ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０ （ｓ、１Ｈ）、７．３１ （ｔ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．４６ （ｓ、１Ｈ）、４．８６ （ｓ、２Ｈ）、４．４８ （ｂｒｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２８ （ｂｒｄ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５～４．０７ （ｍ、４Ｈ）、３．９１～３．８６ （ｍ、１Ｈ）、３．８４～３．７９ （ｍ、１Ｈ）、３．６７ （ｄｔ、Ｊ＝３．０、１１．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．４２ （ｄｔ、Ｊ＝３．９、１２．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．２３ （ｓ、３Ｈ）、１．４２ （ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）
実施例３：式（１）の化合物の結晶形Ｂの製造
約１００ｍｇの式（１）の化合物を異なるガラス瓶にそれぞれ添加し、それぞれ適量の有機溶媒又は溶媒混合物を添加した（表３）。上記サンプルを恒温ミキサー（４０℃）に入れて撹拌した（撹拌時間を表３に示す）（遮光）。次に固体を濾過して真空オーブン（４０℃）に入れて一晩乾燥させて、いずれも結晶形Ｂを得た。
約１００ｍｇの式（１）の化合物を異なるガラス瓶にそれぞれ添加し、それぞれ適量の有機溶媒又は溶媒混合物を添加した（表３）。上記サンプルを恒温ミキサー（４０℃）に入れて撹拌した（撹拌時間を表３に示す）（遮光）。次に固体を濾過して真空オーブン（４０℃）に入れて一晩乾燥させて、いずれも結晶形Ｂを得た。
表３ 各適量の有機溶媒及び撹拌時間
実施例４：式（１）の化合物の結晶形Ｂの製造
式（１）の化合物（質量を表４に示す）を、温度が（６０～７０℃）のメタノール溶媒（体積量を表４に示す）に徐々に添加した後、水（体積量を表４に示す）を徐々に滴下し、６０℃で０．５ｈ撹拌した後、５５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、５０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、４５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、４０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、３５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、３０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、２０～２５℃に降温して１０ｈ撹拌した後、固体を濾過して結晶形Ｂを得た。
式（１）の化合物（質量を表４に示す）を、温度が（６０～７０℃）のメタノール溶媒（体積量を表４に示す）に徐々に添加した後、水（体積量を表４に示す）を徐々に滴下し、６０℃で０．５ｈ撹拌した後、５５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、５０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、４５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、４０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、３５℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、３０℃に降温して０．５ｈ撹拌した後、２０～２５℃に降温して１０ｈ撹拌した後、固体を濾過して結晶形Ｂを得た。
表４ 各適量の有機溶媒及び撹拌時間
実施例５：式（１）の化合物の結晶形Ｂの製造
実験手順：約５．５ｇの式（１）の化合物を、５０ｍＬの温度が（６０～７０℃）のメタノール溶媒に徐々に添加し、６０℃で０．５ｈ撹拌した後、２５℃に降温して２ｈ撹拌した後、固体を濾過して結晶形Ｂを得た。
実験手順：約５．５ｇの式（１）の化合物を、５０ｍＬの温度が（６０～７０℃）のメタノール溶媒に徐々に添加し、６０℃で０．５ｈ撹拌した後、２５℃に降温して２ｈ撹拌した後、固体を濾過して結晶形Ｂを得た。
実施例６：式（１）の化合物の結晶形Ｂの製造
９００．０ｇの式（Ｉ）の化合物を９．０Ｌのメタノールに溶解した後、室温（２５℃）で９．０Ｌの精製水を徐々に滴下した後、２０時間撹拌し続けた。減圧濾過し、濾過ケーキを６．０Ｌの精製水で洗浄し、固体を真空乾燥させて式（I）の化合物の結晶形Ｂを得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：４１９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
９００．０ｇの式（Ｉ）の化合物を９．０Ｌのメタノールに溶解した後、室温（２５℃）で９．０Ｌの精製水を徐々に滴下した後、２０時間撹拌し続けた。減圧濾過し、濾過ケーキを６．０Ｌの精製水で洗浄し、固体を真空乾燥させて式（I）の化合物の結晶形Ｂを得た。
ＭＳ ｍ／ｚ：４１９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＨＣｌ３－ｄ、４００ＭＨｚ）： δ＝８．６０ （ｂｒｓ、１Ｈ）、８．２１ （ｓ、１Ｈ）、７．４５ （ｂｒｓ、１Ｈ）、７．４２ （ｂｒｓ、１Ｈ）、７．４０ （ｓ、１Ｈ）、７．２５ （ｂｒｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．４５ （ｓ、１Ｈ）、４．８１ （ｂｒｓ、２Ｈ）、４．４７ （ｂｒｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２７ （ｂｒｄ、Ｊ＝１３．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．０７～４．１３ （ｍ、４Ｈ）、３．８５～３．９１ （ｍ、１Ｈ）、３．７８～３．８４ （ｍ、１Ｈ）、３．６６ （ｔｄ、Ｊ＝１１．９、３．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．４１ （ｔｄ、Ｊ＝１２．８、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．２２ （ｓ、３Ｈ）、１．４１ｐｐｍ （ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）
実施例７：高温、高湿条件下での結晶形Ａの固体の安定性試験
２部の結晶形Ａのサンプルを平行に秤量し、各部を約１００ｍｇとして、サンプルガラス瓶の底部に入れ、薄い層に広げた。サンプルに対してアルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証し、４０℃／７５％の湿度条件の恒温恒湿槽に入れた。上記条件で放置したサンプルを３０日目にサンプリングして検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、試験結果を以下の表５に示す。
２部の結晶形Ａのサンプルを平行に秤量し、各部を約１００ｍｇとして、サンプルガラス瓶の底部に入れ、薄い層に広げた。サンプルに対してアルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証し、４０℃／７５％の湿度条件の恒温恒湿槽に入れた。上記条件で放置したサンプルを３０日目にサンプリングして検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、試験結果を以下の表５に示す。
表５ 結晶形Ａの固体の安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａは、安定性が高く、製剤化されやすい。
実施例８：結晶形Ａの異なる温度、湿度及び光照射条件での固体の物理的安定性試験
４部の式結晶形Ａのサンプルを平行に秤量し、各部を約１００ｍｇとし、サンプルガラス瓶の底部に放置し、薄い層に広げ、アルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証した。製造された４部のサンプルを２５℃／９２．５％の相対湿度、６０℃、４０℃／７５％及び光照射条件下でそれぞれ放置し、サンプルの１０日目の物理的安定性を考察した。同時に、約１００ｍｇの結晶形Ａのサンプルを単独で秤量し、サンプルガラス瓶の底部に放置し、ネジ付きキャップで密封した後、－２０℃の条件で保存し、対照品として使用した。１０日目に、全てのサンプルを取り出し、室温に戻し、サンプルの外観変化を観察し、かつＸＲＰＤでサンプルの結晶形を検出した。加速サンプルと対照サンプルを比較することにより、式（I）の化合物の結晶形Ａの固体の物理的安定性を判断する。以下の表６は、結晶形Ａの固体の物理的安定性の実験結果である。
４部の式結晶形Ａのサンプルを平行に秤量し、各部を約１００ｍｇとし、サンプルガラス瓶の底部に放置し、薄い層に広げ、アルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証した。製造された４部のサンプルを２５℃／９２．５％の相対湿度、６０℃、４０℃／７５％及び光照射条件下でそれぞれ放置し、サンプルの１０日目の物理的安定性を考察した。同時に、約１００ｍｇの結晶形Ａのサンプルを単独で秤量し、サンプルガラス瓶の底部に放置し、ネジ付きキャップで密封した後、－２０℃の条件で保存し、対照品として使用した。１０日目に、全てのサンプルを取り出し、室温に戻し、サンプルの外観変化を観察し、かつＸＲＰＤでサンプルの結晶形を検出した。加速サンプルと対照サンプルを比較することにより、式（I）の化合物の結晶形Ａの固体の物理的安定性を判断する。以下の表６は、結晶形Ａの固体の物理的安定性の実験結果である。
表６ 結晶形Ａの異なる温度、湿度及び光照射条件での固体の物理的安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａは、安定性が高く、製剤化されやすい。
実験例９：結晶形Ｂの高温、高湿及び光照射条件での固体の物理的安定性試験
各組に２部の結晶形Ｂのサンプルを平行に秤量し、サンプルガラス瓶の底部に入れ、薄い層に広げた。サンプルに対してアルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証し、異なる湿度条件の恒温恒湿又は光照射槽に入れた。上記条件で放置したサンプルを５日目、１０日目、３０日目、１月目、３月目又は６月目にサンプリングして検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、試験結果を以下の表７～１１に示す。
各組に２部の結晶形Ｂのサンプルを平行に秤量し、サンプルガラス瓶の底部に入れ、薄い層に広げた。サンプルに対してアルミ箔紙で瓶口を封止し、かつアルミ箔紙に小孔を開けて、サンプルが環境空気と十分に接触することを保証し、異なる湿度条件の恒温恒湿又は光照射槽に入れた。上記条件で放置したサンプルを５日目、１０日目、３０日目、１月目、３月目又は６月目にサンプリングして検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、試験結果を以下の表７～１１に示す。
表７ 結晶形Ｂの固体の高温６０℃での安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、高温安定性が高く、製剤化されやすい。
表８ 結晶形Ｂの固体の高湿２５℃／９２．５％ＲＨでの安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、高湿安定性が高く、製剤化されやすい。
表９ 結晶形Ｂの固体の光照射安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、光照射安定性が高い。
表１０ 結晶形Ｂの固体の４０℃／７５％ＲＨでの安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、安定性が高く、製剤化されやすい。
表１１ 結晶形Ｂの固体の２５℃／６５％ＲＨでの安定性試験
実験結論：式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂは、安定性が高く、製剤化されやすい。
試験例１：インビトロ評価
ＩＣ５０を測定することによりヒトのＡＴＲキナーゼに対する被検化合物の阻害活性を評価した。
ＩＣ５０を測定することによりヒトのＡＴＲキナーゼに対する被検化合物の阻害活性を評価した。
５０ｎＭのＧＳＴ－ｃＭｙｃ－ｐ５３及びＭｇ／ＡＴＰ（必要に応じた濃度）を含む測定緩衝液中でＡＴＲ／ＡＴＲＩＰ（ｈ）をインキュベートした。Ｍｇ／ＡＴＰ混合物を添加することにより反応を開始した。室温で３０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡを含む停止溶液を添加して反応を停止させた。最後に、ｄ２で標識した抗ＧＳＴモノクローナル抗体を含む検出緩衝液と、抗リン酸化ｐ５３のユウロピウム標識抗リン酸Ｓｅｒ１５抗体を添加した。その後に時間分解蛍光モードでプレートを読み取り、かつ均一時間分解を行った。
公式ＨＴＲＦ＝１００００×（Ｅｍ６６５ｎｍ／Ｅｍ６２０ｎｍ）に基づいて蛍光（ＨＴＲＦ）シグナルを決定した。
ＸＬＦｉｔバージョン５．３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いてＩＣ５０データを解析した。非線形回帰分析を用いてＳ字状の用量反応（可変勾配）曲線をフィッティングした。試験結果を表１２に示す。
表１２ 本発明の化合物のインビトロスクリーニング試験結果
結論：本発明の式（Ｉ）の化合物は、キナーゼＡＴＲに対して優れた阻害活性を有する。
試験例２：インビトロ細胞活性試験
本試験では、腫瘍細胞系ＬｏＶｏにおける化合物のインビトロ細胞活性への影響を検出することにより化合物の細胞増殖に対する阻害作用を研究した。
本試験では、腫瘍細胞系ＬｏＶｏにおける化合物のインビトロ細胞活性への影響を検出することにより化合物の細胞増殖に対する阻害作用を研究した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光法による細胞活性の検出
以下の手順は、ＰｒｏｍｅｇａＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光法による細胞活性の検出用キット（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）の説明書に従って行った。
以下の手順は、ＰｒｏｍｅｇａＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光法による細胞活性の検出用キット（Ｐｒｏｍｅｇａ－Ｇ７５７３）の説明書に従って行った。
（１）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を融解させ、かつ室温になるまで放置した。
（２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質を室温になるまで放置した。
（３）１瓶のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を添加して基質を溶解させて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作動液を調製した。
（４）徐々にボルテックスして十分に溶解させた。
（５）細胞培養プレートを取り出し３０分間放置して、室温になるまで平衡させた。
（６）各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作動液（各ウェルにおける細胞培養液の半分の体積に等しい）を添加した。細胞プレートをアルミ箔紙で包んで遮光する。
（７）培養プレートをオービタルシェーカー上で２分間振盪して細胞溶解を誘導した。
（８）培養プレートを室温で１０分間放置して発光シグナルを安定させた。
（９）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダー上で発光シグナルを検出した。
（２）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質を室温になるまで放置した。
（３）１瓶のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ基質にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ緩衝液を添加して基質を溶解させて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作動液を調製した。
（４）徐々にボルテックスして十分に溶解させた。
（５）細胞培養プレートを取り出し３０分間放置して、室温になるまで平衡させた。
（６）各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ作動液（各ウェルにおける細胞培養液の半分の体積に等しい）を添加した。細胞プレートをアルミ箔紙で包んで遮光する。
（７）培養プレートをオービタルシェーカー上で２分間振盪して細胞溶解を誘導した。
（８）培養プレートを室温で１０分間放置して発光シグナルを安定させた。
（９）ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダー上で発光シグナルを検出した。
データ分析
被検化合物の阻害率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）を、ＩＲ（％）＝（１－（ＲＬＵ化合物－ＲＬＵブランク対照）／（ＲＬＵ溶媒対照－ＲＬＵブランク対照））＊１００％という公式に基づいて計算する。Ｅｘｃｅｌで異なる濃度の化合物の阻害率を計算し、次にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて阻害折れ線グラフを作成し、最小阻害率、最大阻害率及びＩＣ５０を含む関連パラメータを計算した。
被検化合物の阻害率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ、ＩＲ）を、ＩＲ（％）＝（１－（ＲＬＵ化合物－ＲＬＵブランク対照）／（ＲＬＵ溶媒対照－ＲＬＵブランク対照））＊１００％という公式に基づいて計算する。Ｅｘｃｅｌで異なる濃度の化合物の阻害率を計算し、次にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて阻害折れ線グラフを作成し、最小阻害率、最大阻害率及びＩＣ５０を含む関連パラメータを計算した。
試験結果を表１３に示す。
表１３ インビトロＬｏＶｏ細胞の増殖阻害試験結果
試験結論：本発明の式（１）の化合物ＴＲは、ＡＴＭシグナル通路が突然変異してなるＬｏＶｏ腫瘍細胞に対していずれも優れた阻害作用を有する。
試験例３：インビボ薬物動態学的性質の研究
供試サンプル：上記試験を基に、ここでの活性が高く、構造が代表的な化合物を選択してさらなる試験を行う。
供試サンプル：上記試験を基に、ここでの活性が高く、構造が代表的な化合物を選択してさらなる試験を行う。
試験方法：該研究は、当該化合物の薬物動態学的パラメータを測定し、かつ雌Ｂａｌｂ／ｃ Ｎｕｄｅマウスにおける胃内投与の生物学的利用率を計算することを目的とする。該項目では、６匹の雌Ｂａｌｂ／ｃ Ｎｕｄｅマウスを用い、３匹のマウスに対して静脈注射による投与を行い、投与量を１ｍｇ／ｋｇとし、０ｈ（投与前）と投与後の０．０８３３、０．２５、０．５、１、２、４、６、８及び２４ｈの血漿サンプルを収集し、他の３匹のマウスに対して胃内投与を行い、投与量を１０ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇとし、０ｈ（投与前）と投与後の０．５、１、２、３、４、６、８、２４ｈの血漿サンプルを収集し、その後に収集したサンプルに対してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行い、かつデータを収集し、収集した分析データに対してＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２．１ソフトウェアを用いて関連薬物動態学的パラメータを計算した。試験結果を表１４．１及び１４．２に示す。
１４．１ 静脈注射による投与の結果
１４．２ 胃内投与結果
注釈：Ｃ０（ｎＭ）は、０分間でのインビボ薬物濃度であり、Ｃｌ（ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇ）は、インビボ薬物除去率である。Ｖｄｓｓ（Ｌ／ｋｇ）は、インビボ薬物分布容積である。Ｔ１／２（ｈ）は、半減期である。ＡＵＣ０－ｔ（ｎＭ．ｈ）は、インビボ薬物露出量である。Ｃｍａｘ（ｎＭ）は、インビボ薬物最高濃度である。Ｆは、生物学的利用率である。
試験結論：本発明の式（１）の化合物は、胃内投与にも優れた吸収と露出量を有し、経口投与に適する。
試験結論：本発明の式（１）の化合物は、胃内投与にも優れた吸収と露出量を有し、経口投与に適する。
試験例４：結腸直腸癌ＬｏＶｏ ＣＤＸインビボ薬効研究
試験目的：
ＬｏＶｏは、ＭＲＥ１１Ａが突然変異してなる（ＭＲＥ１１Ａは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関するＡＴＭシグナル通路の重要な構成部分である）結腸直腸癌腫瘍細胞であり、ＡＴＲ阻害剤に敏感である。本試験では、直腸癌ＬｏＶｏ ＣＤＸモデルによりＡＴＭシグナル通路欠陥による腫瘍に対するＡＴＲ阻害剤の単剤の阻害作用を検証した。
試験目的：
ＬｏＶｏは、ＭＲＥ１１Ａが突然変異してなる（ＭＲＥ１１Ａは、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関するＡＴＭシグナル通路の重要な構成部分である）結腸直腸癌腫瘍細胞であり、ＡＴＲ阻害剤に敏感である。本試験では、直腸癌ＬｏＶｏ ＣＤＸモデルによりＡＴＭシグナル通路欠陥による腫瘍に対するＡＴＲ阻害剤の単剤の阻害作用を検証した。
実験方法：
１．実験動物
種属：マウス
品種：ＢＡＬＢ／ｃ ヌードマウス
サプライヤー： 北京維通利華実験動物技術有限公司
週齢及び体重：６～８週齢、体重１８～２２グラム
性別：雌性
１．実験動物
種属：マウス
品種：ＢＡＬＢ／ｃ ヌードマウス
サプライヤー： 北京維通利華実験動物技術有限公司
週齢及び体重：６～８週齢、体重１８～２２グラム
性別：雌性
２．細胞培養
ヒト結腸癌ＬｏＶｏ細胞（ＥＣＡＣＣ、品番：８７０６０１０１）を、インビトロで単層培養し、培養条件は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地に１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを添加し、３７℃、５％のＣＯ２で培養することである。膵酵素－ＥＤＴＡで週２回通常消化処理して継代した。細胞飽和度が８０％～９０％になると、細胞を収集し、計数し、接種した。０．１ｍＬ（１０×１０６個）のＬｏＶｏ細胞を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種し、腫瘍の平均体積が１７３ｍｍ３に達すると、群分けして投与した。
ヒト結腸癌ＬｏＶｏ細胞（ＥＣＡＣＣ、品番：８７０６０１０１）を、インビトロで単層培養し、培養条件は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地に１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを添加し、３７℃、５％のＣＯ２で培養することである。膵酵素－ＥＤＴＡで週２回通常消化処理して継代した。細胞飽和度が８０％～９０％になると、細胞を収集し、計数し、接種した。０．１ｍＬ（１０×１０６個）のＬｏＶｏ細胞を、各ヌードマウスの右背部に皮下接種し、腫瘍の平均体積が１７３ｍｍ３に達すると、群分けして投与した。
３．検体物の調製と投与量
２５．５１ｍｇの式（１）の化合物を秤量して０．５００ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、２．０００ｍＬのプロピレングリコール及び２．５００ｍＬの脱イオン水を添加し、ボルテックスして均一に混合し、ＰＨ＝６．０に調節して、清澄溶液を得た。
投与量：全ての被検化合物を、２５ｍｇ／ｋｇで１日２回胃内投与し、１日に８時間間隔で投与した。
２５．５１ｍｇの式（１）の化合物を秤量して０．５００ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、２．０００ｍＬのプロピレングリコール及び２．５００ｍＬの脱イオン水を添加し、ボルテックスして均一に混合し、ＰＨ＝６．０に調節して、清澄溶液を得た。
投与量：全ての被検化合物を、２５ｍｇ／ｋｇで１日２回胃内投与し、１日に８時間間隔で投与した。
４．腫瘍測定及び実験指標
カーソルスケールで週２回腫瘍径を測定した。腫瘍体積の計算公式は、Ｖ＝０．５ａ×
ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
化合物の腫瘍阻害効果を、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）で評価した。 相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶは、治療群のＲＴＶ平均値であり、ＣＲＴＶは、陰性対照群のＲＴＶ平均値である）。腫瘍測定の結果に基づいて相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を算出し、計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、ここで、Ｖ０は、群分けして投与する時（即ちＤ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは、ある回測定時の腫瘍体積であり、ＴＲＴＶとＣＲＴＶとは同じ日のデータである。
ＴＧＩ（％）は、腫瘍成長阻害率を反映するものである。ＴＧＩ（％）＝［１－（ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積－当該処理群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
実験終了後に、腫瘍重量を検出し、Ｔ／Ｃｗｅｉｇｈｔパーセントを計算し、ＴｗｅｉｇｈｔとＣｗｅｉｇｈｔは、それぞれ投与群と溶媒対照群の腫瘍重量を表す。
カーソルスケールで週２回腫瘍径を測定した。腫瘍体積の計算公式は、Ｖ＝０．５ａ×
ｂ２であり、ａとｂは、それぞれ腫瘍の長径と短径を表す。
化合物の腫瘍阻害効果を、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）で評価した。 相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶは、治療群のＲＴＶ平均値であり、ＣＲＴＶは、陰性対照群のＲＴＶ平均値である）。腫瘍測定の結果に基づいて相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ、ＲＴＶ）を算出し、計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０であり、ここで、Ｖ０は、群分けして投与する時（即ちＤ０）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは、ある回測定時の腫瘍体積であり、ＴＲＴＶとＣＲＴＶとは同じ日のデータである。
ＴＧＩ（％）は、腫瘍成長阻害率を反映するものである。ＴＧＩ（％）＝［１－（ある処理群の投与終了時の平均腫瘍体積－当該処理群の投与開始時の平均腫瘍体積）／（溶媒対照群の治療終了時の平均腫瘍体積－溶媒対照群の治療開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
実験終了後に、腫瘍重量を検出し、Ｔ／Ｃｗｅｉｇｈｔパーセントを計算し、ＴｗｅｉｇｈｔとＣｗｅｉｇｈｔは、それぞれ投与群と溶媒対照群の腫瘍重量を表す。
５．試験結果
本試験では、ヒト結腸直腸癌異種移植腫瘍モデルにおける化合物の薬効を評価し、溶媒対照群を参照とした。１７日間投与した時、式（１）の化合物（２５ｍｇ／ｋｇ）群と溶媒対照群とを比較すると、Ｔ／Ｃ及びＴＧＩは、それぞれ２７．８％及び９０．７％である。
本試験では、ヒト結腸直腸癌異種移植腫瘍モデルにおける化合物の薬効を評価し、溶媒対照群を参照とした。１７日間投与した時、式（１）の化合物（２５ｍｇ／ｋｇ）群と溶媒対照群とを比較すると、Ｔ／Ｃ及びＴＧＩは、それぞれ２７．８％及び９０．７％である。
６．結論
本試験では、本発明の式（１）の化合物は、ヒト結腸直腸癌ＬｏＶｏ細胞の皮下異種移植腫瘍モデルの担癌マウスの成長に対して一定の阻害作用を有する。
本試験では、本発明の式（１）の化合物は、ヒト結腸直腸癌ＬｏＶｏ細胞の皮下異種移植腫瘍モデルの担癌マウスの成長に対して一定の阻害作用を有する。
Claims (22)
- ２θ角：８．１０±０．２０°、１８．３３±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、式（Ｉ）の化合物の結晶Ａ。
- ２θ角：７．４６±０．２０°、８．１０±０．２０°、１３．０３±０．２０°、１５．０７±０．２０°、１５．５８±０．２０°、１６．１９±０．２０°、１８．３３±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項１に記載の結晶Ａ。
- ２θ角：７．４６±０．２０°、８．１０±０．２０°、１３．０３±０．２０°、１３．４６±０．２０°、１５．０７±０．２０°、１５．５８±０．２０°、１６．１９±０．２０°、１８．３３±０．２０°、２１．１７±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項２に記載の結晶Ａ。
- ２θ角：７．４６°、８．１０°、１１．２４°、１３．０３°、１３．４６°、１５．０７°、１５．５８°、１５．９８°、１６．１９°、１７．７０°、１８．３３°、１９．６０°、２１．１７°、２２．６３°、２３．８４°、２５．５６°及び２６．５７°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項３に記載の結晶Ａ。
- 以下のＸＲＰＤパターン
- ２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°及び２０．５６±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、式（Ｉ）
- ２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°、１４．８３±０．２０°、１５．５４±０．２０°、１７．３３±０．２０°、２０．５６±０．２０°、２２．００±０．２０°及び２２．６３±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項６に記載の結晶Ｂ。
- ２θ角：８．４５±０．２０°、１０．８７±０．２０°、１４．８３±０．２０°、１５．５４±０．２０°、１７．３３±０．２０°、２０．０８±０．２０°、２０．５６±０．２０°、２２．００±０．２０°、２２．６３±０．２０°及び２５．２６±０．２０°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項７に記載の結晶Ｂ。
- ２θ角：８．４５°、９．２０°、１０．８７°、１２．５７°、１４．１４°、１４．５３°、１４．８３°、１５．５４°、１６．８０°、１７．３３°、１８．４３°、１９．８４°、２０．０８°、２０．５６°、２１．３９°、２２．００°、２２．４４°、２２．６３°、２３．２６°、２５．２６°、２５．８５°及び２６．９８°に特徴的な回折ピークを有するＸ線粉末回折パターンを有する、請求項８に記載の結晶Ｂ。
- 以下のＸＲＰＤパターン
- １７４．３±３℃で１つの吸熱ピークの開始点を有する示差走査熱量曲線（ＤＳＣ）を有する、請求項６から１０のいずれか一項に記載の結晶Ｂ。
- 以下のＤＳＣパターン
- １５０±３℃で重量減少が１．４９％に達する熱重量分析曲線（ＴＧＡ）を有する、請求項６から１０のいずれか一項に記載の結晶Ｂ。
- 以下のＴＧＡパターン
- 式（Ｉ）の化合物をエタノール溶媒に添加するステップ１）と、
水を添加するステップ２）と、
１００～１２０時間撹拌するステップ３）と、
室温で再結晶して結晶Ａを得るステップ４）と、を含む、請求項１から５のいずれか
一項に記載の式（Ｉ）の化合物の結晶Ａの製造方法。 - 式（Ｉ）の化合物を溶媒に添加するステップ１）と、
２．５～１２０時間、撹拌しながら一定の温度に加熱するステップ２）と、
室温で再結晶して結晶Ｂを得るステップ３）と、を含み、
前記溶媒は、メタノール、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、メタノール／水（Ｖ／Ｖ、１：０．３～１）、アセトン／水（Ｖ／Ｖ、１：１）、イソプロパノール／水（Ｖ／Ｖ、１：１）、酢酸エチル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、酢酸イソプロピル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、エタノール／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、アセトニトリル／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）、イソプロパノール／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）又はジクロロメタン／ｎ－ヘプタン（Ｖ／Ｖ、１：１）である、請求項６から１４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の結晶Ｂの製造方法。 - 前記温度は、２５～７０℃である、請求項１６に記載の製造方法。
- ステップ１）における式（Ｉ）の化合物の濃度範囲は、２５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬから選択される、請求項１６に記載の製造方法。
- ＡＴＲ関連疾患を治療するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶Ａ又は請求項６から１４のいずれか一項に記載の結晶Ｂを含む組成物。
- 前記組成物は、固形腫瘍又は血液腫瘍を治療するための、請求項１９に記載の組成物。
- 結腸直腸癌、胃癌、食道癌、原発性腹膜癌、副腎皮質癌、腎臓明細胞癌、前立腺癌、膀胱尿路上皮癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、卵管癌、非小細胞肺癌又は小細胞肺癌を治療するための、請求項１９に記載の組成物。
- 請求項１から５のいずれか一項に記載の結晶Ａ又は請求項６から１４のいずれか一項に記載の結晶Ｂを含む、医薬組成物。
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