RS66523B1 - Kristalni oblici inhibitora atr i njihova upotreba - Google Patents
Kristalni oblici inhibitora atr i njihova upotrebaInfo
- Publication number
- RS66523B1 RS66523B1 RS20250185A RSP20250185A RS66523B1 RS 66523 B1 RS66523 B1 RS 66523B1 RS 20250185 A RS20250185 A RS 20250185A RS P20250185 A RSP20250185 A RS P20250185A RS 66523 B1 RS66523 B1 RS 66523B1
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- crystalline form
- vol
- cancer
- compound
- formula
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Opis
Prioritet
[0001] CN201910722102.7, sa datumom podnošenja 06.08. 2019. godine.
Tehnička oblast
[0002] Obezbeđeni su kristalni oblici inhibitora ATR i postupci njihove pripreme i upotreba za proizvodnju medikamenta za lečenje bolesti povezane sa ATR.
Pozadina
[0003] ATR (Ataxia Telangiectasia-mutirana i Rad3-srodna protein kinaza) pripada porodici PIKK (fosfatidilinozitol-3-kinazi-srodna kinaza) i učestvuje u popravljanju oštećenja DNK radi održavanja stabilnosti gena. ATR protein kinaza ima sinergistički odgovor na oštećenje DNK, replikacioni stres i poremećaje ćelijskog ciklusa. ATR i ATM pripadaju porodici PIKK serin/treonin protein kinaza, i česta su komponenta ćelijskog ciklusa i popravljanja oštećenja DNK, a drugi članovi uključuju Chk1, BRCA1, p53. ATR je uglavnom odgovorna za replikacioni stres DNK (zastoj duplikacione viljuške) i popravku jednolančanog prekida.
[0004] Kada se dvolančana DNK prekine ili dođe do zastoja replikacione viljuške, ATR se aktivira jednolančanom DNK strukturom. DNK polimeraza ostaje u procesu replikacije DNK, a replikaciona helikaza nastavlja da odvija na vodećem kraju replikacione viljuške DNK, što rezultuje proizvodnjom dugačke jednolančane DNK (ssDNA), koja je zatim vezana jednolančanom DNK i RPA (replikacioni protein A). ATR/ATR delujući proteinski kompleks regrutuje se od strane RPA nakon replikacionog stresa ili oštećenja DNK na mesto oštećenja, kompleks RPA-jednolančana DNK aktivira RAD17/rfc2-5 kompleks da se veže za mesto oštećenja, DNK-ssDNA spoj aktivira Rad9-HUS-RAD1 (9‑1‑1) heterotrimer, 9‑1‑1 zauzvrat regrutuje TopBP1 da aktivira ATR. Jednom kada se ATR aktivira, ATR promoviše popravku DNK preko nizvodnih ciljeva, stabilizaciju i ponovno pokretanje zastalih replikacionih viljuški i prolaznog zastoja ćelijskog ciklusa. Ove funkcije se postižu pomoću ATR putem posredovanja na nizvodni cilj Chk1. ATR deluje kao kontrolna tačka za oštećenje DNK u ćelijskom ciklusu tokom S faze. Može da posreduje u degradaciji CDC25A preko Chk1, čime se odlaže proces replikacije DNK i obezbeđuje vreme za popravku replikacione viljuške. ATR je takođe glavni regulator G2/M kontrolne tačke ćelijskog ciklusa, sprečavajući ćelije da uđu u mitozu prevremeno pre nego što se replikacija DNK završi ili ako postoji oštećenje DNK. Ovaj ATR-zavisan G2/M zastoj ćelijskog ciklusa uglavnom je posredovan od strane dva mehanizma: 1. Degradacije CDC25A; 2. Fosforilacije Cdc25C pomoću Chk1 da se veže za 14-3-protein. Vezivanje Cdc25C za 14‑3‑3 protein promoviše njegov izlazak iz nukleusa i citoplazmatsku izolaciju, čime se inhibira njegova sposobnost da defosforiliše i aktivira nukleusni Cdc2, što zauzvrat sprečava ulazak u mitozu.
[0005] Mutacije ATR gena su veoma retke, i samo nekoliko pacijenata sa Sekelovim (Seckel) sindromom ima mutacije ATR gena, koje karakterišu zakržljanje i mikrocefalija. Poremećaj ATR-povezanih puteva može dovesti do nestabilnosti genoma, i ATR protein se aktivira većinom hemioterapija za kancer. Pored toga, duplikacija ATR gena je opisana kao faktor rizika za rabdomiosarkom.
[0006] ATR je neophodan za samoreplikaciju ćelije i aktivira se u S fazi da reguliše oridžin replikacije i popravi oštećene replikacione viljuške. Oštećenje replikacionih viljuški može povećati osetljivost kancerskih ćelija na antikancerske agense platine i hidroksiuree i redukovati otpornost kancerskih ćelija. Prema tome, inhibiranje ATR može biti efikasan postupak u lečenju kancera u budućnosti. EP3753937, WO2019/036641, WO2011/154737 i WO2019/050889 objavljuju inhibitore ATR kinaze.
Sažetak
[0007] Obezbeđen je kristalni oblik A jedinjenja formule (I), kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,10±0,20°, 18,33±0,20° i 22,63±0,20°.
[0008] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46±0,20°, 8,10±0,20°, 13,03±0,20°, 15,07±0,20°, 15,58±0,20°, 16,19±0,20°, 18,33±0,20° i 22,63 ±0,20°.
[0009] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46±0,20°, 8,10±0,20°, 13,03±0,20°, 13,46±0,20°, 15,07±0,20°, 15,58±0,20°, 16,19±0,20°, 18,33±0,20°, 21,17±0,20° i 22,63 ±0,20°.
[0010] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46°, 8,10°, 11,24°, 13,03°, 13,46°, 15,07°, 15,58°, 15,98°, 16,19°, 17,70°, 18,33°, 19,60°, 21,17°, 22,63°, 23,84°, 25,56° i 26,57°.
[0011] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik A ima XRPD obrazac kao što je pokazano na Slici 1.
[0012] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik A ima XRPD obrazac sa podacima analize pokazanim u Tabeli 1:
Tabela 1: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika A
[0013] Obezbeđen je kristalni oblik B jedinjenja formule (I), pri čemu kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20° i 20,56±0,20°.
[0014] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20°, 14,83±0,20°, 15,54±0,20°, 17,33±0,20°, 20,56±0,20°, 22,00±0,20° i 22,63±0,20°.
[0015] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20°, 14,83±0,20°, 15,54±0,20°, 17,33±0,20°, 20,08±0,20°, 20,56±0,20°, 22,00±0,20°, 22,63±0,20° i 25,26±0,20°.
[0016] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRPD) koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45°, 9,20°, 10,87°, 12,57°, 14,14°, 14,53°, 14,83°, 15,54°, 16,80°, 17,33°, 18,43°, 19,84°, 20,08°, 20,56°, 21,39°, 22,00°, 22,44°, 22,63°, 23,26°, 25,26°, 25,85° i 26,98°.
[0017] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima XRPD obrazac kao što je pokazano na Slici 2.
[0018] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima XRPD obrazac sa podacima analize pokazanim u Tabeli 2:
Tabela 2: Podaci analize XRPD obrasca kristalnog oblika B
[0019] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu tačku početka endotermnog pika na 174,3±3 °C.
[0020] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima DSC obrazac kao što je pokazano na Slici 3.
[0021] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu je gubitak težine na 150 °C±3 °C 1,49%.
[0022] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, kristalni oblik B ima TGA obrazac kao što je pokazano na Slici 4.
[0023] Obezbeđen je postupak za pripremanje kristalnog oblika A jedinjenja formule (I), koji sadrži:
1) dodavanje jedinjenja formule (I) u etanolni rastvarač;
2) dodavanje vode;
3) mešanje tokom 100-120 h;
4) izvođenje rekristalizacije na sobnoj temperaturi kako bi se dobio kristalni oblik A.
[0024] Obezbeđen je postupak za pripremanje kristalnog oblika B jedinjenja formule (I), koji sadrži:
1) dodavanje jedinjenja formule (I) u rastvarač;
2) zagrevanje na temperaturu uz mešanje tokom 2,5-120 h;
3) izvođenje rekristalizacije na sobnoj temperaturi kako bi se dobio kristalni oblik B.
[0025] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, rastvarač je: metanol, metil tercijarni butil etar, metanol/voda (zapr./zapr. 1:0,3‑1), aceton/voda (zapr./zapr. 1:1), izopropanol/voda (zapr./zapr. 1:1), etil acetat/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), izopropil acetat/nheptan (zapr./zapr. 1:1), etanol/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), acetonitril/n-heptan (zapr./zapr.
1:1), izopropanol/n-heptan (zapr./zapr.1:1) ili dihlorometan/n-heptan (zapr./zapr.1:1).
[0026] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, temperatura je 25-70 °C.
[0027] Obezbeđen je postupak za pripremanje kristalnog oblika B jedinjenja formule (I), koji sadrži:
1) dodavanje jedinjenja formule (I) u alkoholni rastvarač;
2) dodavanje vode;
3) mešanje tokom 15-20 h;
4) izvođenje rekristalizacije na sobnoj temperaturi kako bi se dobio kristalni oblik B.
[0028] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, zapreminski odnos alkoholnog rastvarača i vode je 1:1-1:4.
[0029] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, alkoholni rastvarač je odabran iz grupe koja se sastoji od metanola.
[0030] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, opseg koncentracija jedinjenja formule (I) odabran je iz grupe koja se sastoji od 25 mg/ml-50 mg/ml.
[0031] Takođe je obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I), kristalnog oblika A ili kristalnog oblika B za proizvodnju medikamenta za lečenje bolesti povezane sa ATR.
[0032] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, medikament je za upotrebu u lečenju čvrstog tumora ili tumora krvi.
[0033] U nekim primerima izvođenja u skladu sa predmetnom objavom, medikament je za upotrebu u lečenju kolorektalnog kancera, kancera želuca, kancera jednjaka, primarnog peritonealnog karcinoma, adrenokortikalnog karcinoma, svetloćelijskog karcinoma bubrežnih ćelija, kancera prostate, urotelnog karcinoma mokraćne bešike, kancera jajnika, kancera dojke, karcinoma endometrijuma, karcinoma Falopijeve tube, nesitnoćelijskog kancera pluća ili sitnoćelijskog kancera pluća.
Tehnički efekat
[0034] Kristalni oblik A i kristalni oblik B jedinjenja formule (I) u skladu sa predmetnom objavom su stabilni, na njih manje utiče svetlost, toplota i vlažnost, imaju dobru efikasnost leka in vivo, i obećavajući su za komercijalnu upotrebu kao farmaceutski lek (drugability).
Definicija i opis
[0035] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, sledeći termini i fraze imaju sledeće definicije. Specifični termin ili frazu ne treba smatrati neodređenim ili nejasnim bez specifične definicije i treba ih razumeti u skladu sa normalnim značenjima. Trgovački naziv koji se ovde upotrebljava odnosiće se na odgovarajući artikal ili aktivni sastojak.
[0036] Intermedijerna jedinjenja ovde se mogu pripremiti različitim postupcima sinteze koji su dobro poznati osobi sa iskustvom u struci, uključujući specifične primere izvođenja koji su nabrojani u nastavku, primere izvođenja uz pomoć kombinacije sa drugim postupcima hemijske sinteze, i ekvivalentne alternative dobro poznate osobi sa iskustvom u struci. Poželjni primeri izvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na primere u nastavku.
[0037] Hemijska reakcija specifičnih primera izvođenja izvodi se u pogodnom rastvaraču, a rastvarač treba da bude pogodan za hemijske promene iz predmetne objave i potrebne reagense i materijale. Kako bi se dobilo jedinjenje iz predmetne objave, osoba sa iskustvom u struci može da modifikuje ili odabere korak sinteze ili reakcionu šemu na osnovu dostupnih primera izvođenja.
[0038] Predmetna objava će biti opisana na detaljan način i primere ne treba smatrati njenim ograničenjem.
[0039] Rastvarači koji se ovde upotrebljavaju su komercijalno dostupni i mogu se upotrebljavati bez dodatnog prečišćavanja.
[0040] Rastvarači koji se ovde upotrebljavaju mogu biti komercijalno dostupni. Ovde se upotrebljavaju sledeće skraćenice: EtOH predstavlja etanol; MeOH predstavlja metanol; TFA predstavlja trifluorosirćetnu kiselinu; TsOH predstavlja p-toluensulfonsku kiselinu; mp predstavlja tačku topljenja; EtSO3H predstavlja etansulfonsku kiselinu; MeSO3H predstavlja metansulfonsku kiselinu; THF predstavlja tetrahidrofuran; EtOAc predstavlja etil acetat.
Difraktometar rendgenskih zraka na prahu (XRPD)
[0041]
Uređaj:
Postupak testiranja: oko 10-20 mg uzorka se upotrebljava za XRPD detekciju.
Detaljni XRPD parametri su sledeći:
Izvor zračenja: Cu, kα (Kα1=1,540598 Å, Kα2=1,544426 Å, odnos intenziteta Kα2/Kα1: 0,5)
Napon svetlosne cevi: 45 kV, Struja svetlosne cevi: 40 mA
Divergencioni prorez: fiksni 1/8 stepena
1. soller prorez: 0,04 rad
2. soller prorez: 0,04 rad
Prijemni prorez: nema
Prorez protiv raspršivanja: 7,5 mm
Vreme merenja: 5 min
Opseg ugla skeniranja: 3‑40 stepeni
Ugao širine koraka: 0,0263 stepena
Vreme/korak: 46,665 s
Brzina ploče sa uzorkom: 15 o/min
Diferencijalni skenirajući kalorimetar (DSC)
[0042]
Uređaj: TA Q200/Q2000/2500 diferencijalni skenirajući kalorimetar
Postupak testiranja: Uzorak (oko 1-5 mg) se postavlja u DSC aluminijumsku ploču za testiranje, pod 50 ml/min N2, i zagreva se od 25 °C (sobna temperatura) do raspadanja na stopi zagrevanja od 10 °C/min.
Termalni gravimetrijski analizator (TGA)
[0043]
Uređaj: TA Q5000/5500 termalni gravimetrijski analizator
Postupak testiranja: Uzorak (oko 1-5 mg) se postavlja u TGA aluminijumsku ploču za testiranje, pod 10 ml/min N2, i zagreva se od sobne temperature do 350 °C na stopi zagrevanja od 10 °C/min.
Kratak opis crteža
[0044]
Slika 1 pokazuje XRPD obrazac pri Cu-Kα zračenju kristalnog oblika A jedinjenja formule (I);
Slika 2 pokazuje XRPD obrazac pri Cu-Kα zračenju kristalnog oblika B jedinjenja formule (I);
Slika 3 pokazuje DSC obrazac kristalnog oblika B jedinjenja formule (I);
Slika 4 pokazuje TGA obrazac kristalnog oblika B jedinjenja formule (I).
Detaljan opis
[0045] Zarad boljeg razumevanja predmetne objave, dodatni opis će biti obezbeđen u nastavku pozivanjem na specifične primere, koji nisu nikakvo njeno ograničenje.
Primer 1: Priprema jedinjenja formule (I)
[0046]
Korak 1: Priprema jedinjenja 1-SM1-2
[0047] Dodato je 4,0 l dimetil sulfoksida u rezervoar reaktor od 50 l na sobnoj temperaturi, u koji su sukcesivno dodati 1-SM1-A (1500,69 g, 8,39 mol), (R)-3-metilmorfolin (854,97 g, 8,45 mol), kalijum karbonat (2891 g, 20,92 mol), i zatim je ponovo dodato 6,0 l dimetil sulfoksida za razblaživanje. Posle dodavanja, reakcioni sistem je mešan na 95 °C tokom 3 h. Posle detekcije potpune konverzije u 1-SM1‑1, temperatura je snižena na 45 °C i rezervoar reaktor je pročišćen azotom tokom 5 min i zatim su dodati pinakol estar 1,4-dimetilpirazol-5-boronske kiseline (1952,44 g, 8,79 mol), tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (192,98 g, 0,167 mol). Posle dodavanja, dodato je 2,0 l dimetil sulfoksida kako bi se isprao unutrašnji zid, i zatim je izvedeno mešanje tokom 12 h na 104 °C pod atmosferom azota. Pošto je reakcija završena, temperatura je snižena na 40 °C, i reakcioni sistem je filtriran. Filter kolač je ispran sa 20,0 l etil acetata, i filtrat je sipan u reaktor. U reaktor je dodato 15,0 l vode, i reakcioni sistem je mešan tokom 2 min i omogućeno je da odstoji da se tečnost odvoji. Vodena faza je ponovo ekstrahovana sa 10,0 l etil acetata, i organske faze su kombinovane, isprane vodom (10,0 l), zasićenim rastvorom soli (8,0 l x 2), respektivno. Organske faze su koncentrovane da daju sirovo jedinjenje 1-SM1‑2 direktno za sledeću reakciju. MS m/z: 304,0[M+H]<+>
Korak 2: Priprema jedinjenja 1-SM1
[0048] Hlorovodonik (1344,0 g, 36,82 mol) je propušten u 6,0 l 1,4-dioksana na -40 °C za dalju upotrebu. Dodato je 5,0 l 1,4-dioksana u rezervoar reaktor od 50 l. Sirovi proizvod 1-SM1‑2 koji je dobijen koncentrovanjem rastvoren je u 5,0 l 1,4-dioksana i dodat u reaktor, čemu je dodato 15,0 l 1,4-dioksana za razblaživanje uz mešanje. Temperatura je podignuta na 70 °C, i u reakcionu tečnost je polako dodata prethodno pomenuta hlorovodonična kiselina/1,4-dioksan (1344 g, 6,0 l) i reakcija je izvedena na 98 °C tokom 15 h. Temperatura je snižena na 40 °C i reakcioni sistem je filtriran. Filter kolač je ispran sa 15,0 l etil acetata, i čvrsta supstanca je sipana u rezervoar reaktor i skašena sa 15,0 l etil acetata tokom 30 min. Reakcioni sistem je filtriran, i filter kolač je ispran sa 5,0 l etil acetata. Čvrsta supstanca je osušena u komori za sušenje pod vakuumom da dâ jedinjenje 1-SM1.
MS m/z: 290,1[M+H]<+>
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,34 (br d, J=6,52 Hz, 3 H) 2,08 (s, 3 H) 3,47 -3,58 (m, 2 H) 3,64 - 3,70 (m, 1 H) 3,72 - 3,78 (m, 1 H) 3,87 (s, 3 H) 3,97 (br s, 1 H) 4,07 - 4,32 (m, 1 H) 4,47 (br s, 1 H) 6,61 (s, 1 H) 7,44 (s, 1 H)
Korak 3: Priprema jedinjenja 1-SM2
[0049]
[0050] Rastvoru jedinjenja 1-SM2‑1 (2 g, 7,87 mmol), bis(pinakolato)dibora (4,00 g, 15,74 mmol) i [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijuma(II) (0,3 g, 410,00 μmol) u 1,4dioksanu (25,0 ml) dodat je kalijum acetat (2,32 g, 23,61 mmol) i reakcioni sistem je pročišćen azotom tri puta. Reakcioni sistem je zagrejan na 100 °C uz mešanje tokom 8 h i filtriran. Rastvor je koncentrovan da dâ sirovi proizvod koji je odvojen hromatografijom na koloni da dâ jedinjenje 1-SM2.
MS-ESI m/z: 302,1 [M+H]<+>.
Korak 4: Priprema jedinjenja 1‑1
[0051]
[0052] Na sobnoj temperaturi, 15,0 l toluena je dodato u rezervoar reaktor od 50 l, i jedinjenje 1-SM1 (1500,0 g, 4,23 mol), trietilamin (1175,0 ml, 8,45 mol) dodati su sukcesivno, i fosfor oksihlorid (1178,0 ml, 12,68 mol) je dodat u obrocima uz mešanje. Posle dodavanja, reakcioni rastvor je mešan na 103-108 °C tokom 1 h i 40 min. Posle detekcije završetka reakcije, temperatura je snižena na 45 °C. Reakcioni rastvor je prebačen u rezervoar za privremeno skladištenje i 15,0 l prečišćene vode je dodato u rezervoar reaktor. Uz mešanje, reakcioni rastvor je dodat u prečišćenu vodu u obrocima, sa kontrolisanom temperaturom na 20-40 °C. Posle dodavanja, pH je podešena na 6-7 sa 12,0 l vodenog rastvora natrijum hidroksida (4 M) i temperatura je kontrolisana na 20-40 °C. Posle podešavanja pH, 7,5 l etil acetata je dodato u rezervoar reaktor uz ravnomerno mešanje radi stvaranja slojeva. Vodena faza je ekstrahovana sa 15,0 l etil acetata. Organske faze su kombinovane, isprane sa 12,0 l zasićenog rastvora soli, koncentrovane pod redukovanim pritiskom do stadijuma bez frakcije da daju sirovi proizvod. Sirovi proizvod je rastvoren sa 1,5 l metil tercijarnog butil etra, čemu je dodato 12,0 l nheptana u obrocima uz mešanje, i smeša je mešana tokom 5 min i filtrirana. Filter kolač je ispran sa 5,0 l n-heptana, i čvrsta supstanca je stavljena u poslužavnik i omogućeno je da se spontano osuši da dâ jedinjenje 1-1.
[0053] MS m/z: 308,0[M+H]<+>
[0054]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,29 (br d, J=6,78 Hz, 3 H) 2,17 (s, 3 H) 3,24 -3,32 (m, 1 H) 3,52 (br s, 1 H) 3,63 - 3,69 (m, 1 H) 3,78 (br d, J=11,54 Hz, 1 H) 3,96 (s, 3 H) 4,01 (br s, 1 H) 4,14 (br s, 1 H) 4,47 (br s, 1 H) 6,89 (s, 1 H) 7,42 (s, 1 H)
Korak 5: Priprema jedinjenja 1‑2
[0055] Na 20‑30 °C pod zaštitom azotom, 2,1 l dimetil sulfoksida je dodato u stakleni kotao od 10 l uz mešanje, čemu su dodati jedinjenje 1‑1 (0,21 kg), jedinjenje 1-SM2 (0,306 kg), vodeni rastvor natrijum karbonata (1,3 M, 1,05 l), [1,1ꞌbis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijum (II) (0,00749 kg) sukcesivno sa levkom za dodavanje. Reakcioni sistem je zagrejan do unutrašnje temperature od 60-70 °C, i temperatura je održavana tokom 4-16 h. Sistem je ohlađen na 40-45 °C, čemu je kap po kap dodato 5,25 l vode unutar 30 min, i zatim je mešano tokom 30 min. Sistem je filtriran sa sukcijom i filter kolač je ispran sa 2,1 l vode. Sušenje pod vakuumom na 45 °C dalo je sirovi proizvod. Sirovom proizvodu koji je dobijen u prethodnoj fazi dodato je 2,625 l etil acetata. Posle ravnomernog mešanja do rastvaranja, ponovo je dodato 10,5 l metil tercijarnog butil etra uz dodatno mešanje tokom 30 min. Posle filtracije pomoću Bihnerovog levka prekrivenog celitom, sloj celita je ponovo ispran sa mešovitim rastvorom od 2,1 l etil acetata i metil tercijarnog butil etra (zapreminski odnos 1:4). Filtrati su kombinovani, i organska faza je koncentrovana da dâ koncentrat. Gornji crni filter kolač celita je sakupljen, čemu je dodato 1,5 l etil acetata. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 1 h, filtracija je izvedena pomoću Bihnerovog levka prekrivenog celitom, filter kolač je ispran sa 0,5 l etil acetata, i filtrat je koncentrovan. Koncentrati koji su dobijeni u prethodne dve faze su kombinovani.
[0056] U prethodno dobijeni koncentrat dodato je 1,5 l etil acetata za rastvaranje, i zatim je polako kap po kap dodato u 4,5 l rastvora n-heptana uz mešanje (1,5 h), i zatim je dodatno mešano tokom 2 h. Sistem je filtriran, i filter kolač je ispran sa mešovitim rastvorom od 0,4 l etil acetata i n-heptana (zapreminski odnos 1:3). Posle sušenja pod vakuumom, filter kolač je dodat u flask sa jednim grlom od 2 l, u koji je dodato 0,8 l izopropil acetata. Posle refluksa tokom 4 h, reakcioni sistem je polako ohlađen do sobne temperature i mešan preko noći. Reakcioni sistem je filtriran pomoću Bihnerovog levka, i filter kolač je ispran sa 0,3 l izopropil acetata. Čvrsta supstanca je sakupljena i osušena pod vakuumom da dâ proizvod.
[0057] Proizvod je rastvoren u 4,2 l etil acetata, i dodato je 42 g aktivnog uglja uz mešanje. Reakcioni sistem je mešan preko noći pod refluksom, filtriran dok je vruć, i filtriran kroz Bihnerov levak prekriven celitom. Sloj celita je ponovo ispran sa 2,0 l etil acetata i filtrati su kombinovani. Organska faza je koncentrovana do 3,0 l. Dodati su 1,2 l etil acetata i 43 g aktivnog uglja u prethodnu organsku fazu, koja je mešana pod refluksom tokom 8 h i zatim filtrirana dok je vruća. Reakcioni sistem je filtriran kroz Bihnerov levak prekriven celitom. Sloj celita je ispran sa 2,0 l etil acetata, i filtrati su kombinovani. Organska faza je koncentrovana i osušena pod vakuumom da dâ jedinjenje 1-2.
MS m/z: 447,0 [M+H]<+>
<1>H NMR (CHCl3-d, 400MHz): δ = 8,98 (d, J=1,3 Hz, 1H), 8,57 (br s, 1H), 8,27 (s, 1H), 7,58 (d, J=2,0 Hz, 1H), 7,49 (t, J=2,8 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 4,48 (br s, 1H), 4,29 (br d, J=12,5 Hz, 1H), 4,17 (s, 3H), 4,13 (dd, J=11,9, 2,9 Hz, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,87-3,93 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 1H), 3,69 (td, J=11,9, 3,0 Hz, 1H), 3,44 (td, J=12,8, 3,8 Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 1,44 ppm (d, J=7,0 Hz, 3H)
Korak 6: Priprema jedinjenja formule (1)
[0058] Na 20 °C, litijum aluminijum hidrid (63,0 ml, 2,5 M) dodat je jedinjenju 1-2 (35,0 g, 78,39 mmol) u tetrahidrofuranu (50,0 ml), i reakcioni sistem je mešan na 20 °C tokom 1 h. Na 0-5 °C, 6,9 ml vode, 6,9 ml 15% natrijum hidroksida i 20,7 ml vode polako su dodati u reakcioni rastvor sukcesivno, koji je zatim filtriran. Filtrat je koncentrovan da dâ sirovi proizvod, koji je odvojen hromatografijom na koloni (etil acetat/petrol etar: 50-100%) da dâ proizvod. Prethodni proizvod je rastvoren u 20,0 ml dimetil sulfoksida na sobnoj temperaturi, polako je kap po kap dodat u 400 ml mešane vode, filtriran i osušen da dâ jedinjenje formule (I).
MS m/z: 419,1 [M+H]<+>
<1>H NMR (400 MHz, CHCl3-d) δ ppm 8,39 (br s, 1 H), 8,28 (s, 1 H), 7,58 (s, 1 H), 7,51 (br s, 1 H), 7,42 (s, 1 H), 7,35 (t, J=2,76 Hz, 1 H), 6,49 (s, 1 H), 4,89 (s, 2 H), 4,51 (br s, 1 H), 4,30 (br d, J=14,05 Hz, 1 H), 4,11 - 4,18 (m, 4 H), 3,81 - 3,94 (m, 2 H), 3,70 (td, J=11,86, 3,14 Hz, 1 H), 3,44 (td, J=12,86, 3,89 Hz, 1 H), 2,26 (s, 3 H), 1,45 (d, J=6,78 Hz, 3 H)
Primer 2: Priprema kristalnog oblika A jedinjenja formule (1)
[0059] Oko 500,0 mg jedinjenja formule (I) izmereno je i rastvoreno u 5 ml etanola, čemu je kap po kap dodato 15 ml prečišćene vode. Posle dodavanja, reakcioni sistem je stavljen na magnetnu mešalicu (20 °C) i mešan tokom 120 h. Suspenzija je filtrirana da dâ čvrstu supstancu, koja je sušena preko noći u komori za sušenje pod vakuumom da dâ kristalni oblik A jedinjenja formule (I).
<1>H NMR (400MHz, CHCl3-d) δ = 8,39 (br s, 1H), 8,25 (d, J=1,3 Hz, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,49 (t, J=2,3 Hz, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,31 (t, J=2,8 Hz, 1H), 6,46 (s, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,48 (br d, J=4,8 Hz, 1H), 4,28 (br d, J=12,5 Hz, 1H), 4,15 - 4,07 (m, 4H), 3,91 - 3,86 (m, 1H), 3,84 -3,79 (m, 1H), 3,67 (dt, J=3,0, 11,9 Hz, 1H), 3,42 (dt, J=3,9, 12,9 Hz, 1H), 2,23 (s, 3H), 1,42 (d, J=7,0 Hz, 3H)
Primer 3: Priprema kristalnog oblika B jedinjenja formule (1)
[0060] Oko 100 mg jedinjenja formule (1) dodato je u različite staklene boce, čemu su dodate odgovarajuće količine organskih rastvarača ili smeša rastvarača (Tabela 3). Prethodni uzorci su mešani u mešalici sa konstantnom temperaturom (40 °C) (videti Tabelu 3 za vreme mešanja) (zaštita od svetlosti). Zatim je čvrsta supstanca filtrirana i stavljena u komoru za sušenje pod vakuumom (40 °C) radi sušenja preko noći. Svi tretmani dali su kristalni oblik B.
Tabela 3. Različite odgovarajuće količine organskih rastvarača i vreme mešanja
Primer 4: Priprema kristalnog oblika B jedinjenja formule (1)
[0061] Jedinjenje formule (1) (videti Tabelu 4 za masu) polako je dodato u metanolni rastvarač na (60-70 °C) (videti Tabelu 4 za zapreminu), i zatim je polako dodata voda (videti Tabelu 4 za zapreminu). Posle mešanja tokom 0,5 h na 60 °C, temperatura je snižena na 55 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 50 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 45 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 40 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 35 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 30 °C i mešano je tokom 0,5 h. Zatim je temperatura snižena na 20-25 °C i mešano je tokom 10 h. Čvrsta supstanca je filtrirana da dâ kristalni oblik B.
Tabela 4. Različite odgovarajuće količine organskih rastvarača i vreme mešanja
Primer 5: Priprema kristalnog oblika B jedinjenja formule (1)
[0062] Eksperimentalna procedura: Oko 5,5 g jedinjenja formule (1) polako je dodato u 50 ml metanolnog rastvarača na (60-70 °C). Posle mešanja na 60 °C tokom 0,5 h, temperatura je snižena na 25 °C i mešano je tokom 2 h, i čvrsta supstanca je filtrirana da dâ kristalni oblik B.
Primer 6: Priprema kristalnog oblika B jedinjenja formule (1)
[0063] Rastvoreno je 900,0 g jedinjenja formule (I) u 9,0 l metanola, čemu je polako kap po kap dodato 9,0 l prečišćene vode na sobnoj temperaturi (25 °C). Reakcioni sistem je dodatno mešan tokom 20 h i filtriran pod redukovanim pritiskom. Filter kolač je ispran sa 6,0 l prečišćene vode i čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom da dâ kristalni oblik B jedinjenja formule (I).
MS m/z: 419,0 [M+H]<+>
<1>H NMR (CHCl3-d, 400MHz): δ = 8,60 (br s, 1H), 8,21 (s, 1H), 7,45 (br s, 1H), 7,42 (br s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,25 (br d, J=2,5 Hz, 1H), 6,45 (s, 1H), 4,81 (br s, 2H), 4,47 (br d, J=5,8 Hz, 1H), 4,27 (br d, J=13,8 Hz, 1H), 4,07-4,13 (m, 4H), 3,85-3,91 (m, 1H), 3,78-3,84 (m, 1H), 3,66 (td, J=11,9, 3,0Hz, 1H), 3,41 (td, J=12,8, 3,8Hz, 1H), 2,22 (s, 3H), 1,41 ppm (d, J=6,8 Hz, 3H)
Primer 7: Testovi stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika A pod uslovima visoke temperature i visoke vlažnosti
[0064] Dva uzorka kristalnog oblika A izmerena su paralelno, svaki od oko 100 mg, stavljena na dno staklene boce za uzorke i raširena u tanak sloj. Uzorci su zaptiveni aluminijumskom folijom, i nekoliko malih rupa je probušeno u aluminijumskoj foliji kako bi se osiguralo da uzorak može u potpunosti da bude u kontaktu sa okolnim vazduhom. Uzorci su stavljeni u kutiju sa konstantnom temperaturom i vlažnošću pod uslovima 40 °C/75% vlažnosti. Uzorci pod prethodno navedenim uslovima uzorkovani su i testirani na dan 30, i rezultati testa su upoređeni sa inicijalnim rezultatom testa na dan 0. Rezultati testa pokazani su u Tabeli 5 u nastavku:
Tabela 5: Test stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika A
Primer 8: Testovi fizičke stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika A pod različitim uslovima temperature, vlažnosti i na svetlosti
[0065] Četiri uzorka kristalnog oblika A izmerena su paralelno, svaki od oko 100 mg, stavljena na dno staklene boce za uzorke i raširena u tanak sloj. Uzorci su zaptiveni aluminijumskom folijom, i nekoliko malih rupa je probušeno u aluminijumskoj foliji kako bi se osiguralo da uzorak može u potpunosti da bude u kontaktu sa okolnim vazduhom. Četiri pripremljena uzorka su stavljena u uslove 25 °C/92,5% relativne vlažnosti, 60 °C, 40 °C/75% i svetlosti, respektivno, i istraživana je fizička stabilnost uzoraka na 10. dan. U isto vreme, uzorak od oko 100 mg kristalnog oblika A izmeren je odvojeno, stavljen na dno staklene boce za uzorke, zaptiven poklopcem sa navojem, i skladišten na -20 °C za upotrebu kao kontrola. Na 10. dan svi uzorci su izvađeni, vraćeni na sobnu temperaturu, i uočene su promene izgleda uzoraka. XRPD je upotrebljena kako bi se detektovali uzorci kristalnih oblika. Poređenjem ubrzanih uzoraka sa kontrolnim uzorkom, određena je fizička stabilnost čvrste supstance kristalnog oblika A jedinjenja formule (I). Sledeća Tabela 6 pokazuje rezultate eksperimenta fizičke stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika A.
Tabela 6. Testovi fizičke stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika A pod različitim uslovima temperature i vlažnosti i na svetlosti
Primer 9: Testovi fizičke stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika B pod uslovima visoke temperature, visoke vlažnosti i na svetlosti
[0066] Dva uzorka kristalnog oblika B izmerena su paralelno za svaku grupu, stavljena na dno staklene boce za uzorke i raširena u tanak sloj. Uzorci su zaptiveni aluminijumskom folijom, i nekoliko malih rupa je probušeno u aluminijumskoj foliji kako bi se osiguralo da uzorak može u potpunosti da bude u kontaktu sa okolnim vazduhom. Uzorci su stavljeni u kutiju sa konstantnom temperaturom i vlažnošću ili na svetlost pod različitim uslovima vlažnosti. Uzorci koji su stavljeni pod prethodno navedene uslove uzorkovani su i testirani na dan 5, dan 10, dan 30, 1 mesec, 3 meseca ili 6 meseci. Rezultati testa su upoređeni sa inicijalnim rezultatima testa na dan 0. Rezultati testa pokazani su u Tabeli 7-11 u nastavku:
Tabela 7. Test stabilnosti čvrste supstance na visokoj temperaturi kristalnog oblika B na 60 °C
Tabela 8. Test stabilnosti čvrste supstance na visokoj vlažnosti kristalnog oblika B na 25
°C/92,5% RH
Tabela 9. Test stabilnosti čvrste supstance na svetlosti kristalnog oblika B
Tabela 10. Test stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika B na 40 °C/75% RH
Tabela 11. Test stabilnosti čvrste supstance kristalnog oblika B na 25 °C/65% RH
Eksperimentalni primer 1: In vitro procena
[0067] Vrednosti IC50su određene kako bi se procenila inhibitorna aktivnost test jedinjenja na humanu ATR kinazu.
[0068] ATR/ATRIP(h) je inkubiran u testnom puferu koji sadrži 50 nM GST-cMyc-p53 i Mg/ATP (koncentracija po potrebi). Reakcija je inicirana dodavanjem smeše Mg/ATP. Posle inkubacije tokom 30 min na sobnoj temperaturi, dodat je stop rastvor koji sadrži EDTA kako bi se reakcija prekinula. Konačno, dodati su detektujući pufer koji sadrži d<2>-obeleženo anti-GST monoklonalno antitelo i evropijumom-obeleženo anti-fosfo Ser15 antitelo prema fosforilisanom p<53>. Zatim, očitana je ploča u režimu vremenski razrešene fluorescencije i izvedena je homogena vremenska rezolucija.
[0069] Signal fluorescencije (HTRF) je određen u skladu sa formulom: HTRF = HTRF = 10000×(Em665 nm / Em620 nm).
[0070] XLFit verzija 5.3 (ID Business Solutions) je upotrebljen kako bi se analizirali IC50podaci. Nelinearna regresiona analiza je upotrebljena za fitovanje krive doznog odgovora u obliku slova S (promenljivi nagib). Rezultat testa pokazan je u Tabeli 12:
Tabela 12: Rezultat in vitro testa pregleda predmetnog jedinjenja
Eksperimentalni primer 2: In vitro test vijabilnosti ćelija
[0071] Efekat jedinjenja na inhibiranje proliferacije ćelija istražen je u ovom testu detektovanjem efekta jedinjenja na ćelijsku aktivnost in vitro u tumorskim ćelijskim linijama LoVo.
CellTiter-Glo detekcija vijabilnosti ćelija postupkom luminescencije
[0072] Sledeći koraci su sprovedeni u skladu sa uputstvima Promega CellTiter-Glo Luminescence Cell Viability Detection kompleta (Promega-G7573).
(1). CellTiter-Glo pufer je rastopljen i omogućeno je da dostigne sobnu temperaturu. (2). CellTiter-Glo supstratu je omogućeno da dostigne sobnu temperaturu.
(3). CellTiter-Glo pufer je dodat u bocu CellTiter-Glo supstrata kako bi se supstrat rastvorio kako bi se pripremio CellTiter-Glo radni rastvor.
(4). Vortex je izveden polako do potpunog rastvaranja.
(5). Ploča za kulturu ćelija je izvađena i stavljena na 30 min da se uravnoteži na sobnoj temperaturi.
(6). 50 µl (pola zapremine medijuma za ćelijsku kulturu u svakom bunariću) CellTiter-Glo radnog rastvora dodato je u svaki bunarić. Ploča za ćelije je umotana aluminijumskom folijom radi zaštite od svetlosti.
(7). Ploča za kulturu je mućkana na orbitalnom šejkeru tokom 2 min kako bi se indukovala liza ćelija.
(8). Ploči za kulturu je omogućeno da stoji na sobnoj temperaturi tokom 10 min kako bi se stabilizovao signal luminescencije.
(9). Signal luminescencije je detektovan na SpectraMax i3x čitaču ploča Molecular Devices.
Analiza podataka
[0073] Sledeća formula je upotrebljena za izračunavanje stope inhibicije (IR) test jedinjenja: IR (%) = (1 - (RLU jedinjenje - RLU prazna kontrola) / (RLU kontrola nosača - RLU prazna kontrola))*100%.
[0074] Stope inhibicije različitih koncentracija jedinjenja izračunate su u Excel, a zatim je upotrebljen GraphPad Prism softver kako bi se nacrtala kriva inhibicije i izračunali relevantni parametri, uključujući minimalnu stopu inhibicije, maksimalnu stopu inhibicije i IC50.
[0075] Rezultati testa pokazani su u Tabeli 13:
Tabela 13: Rezultat in vitro testa inhibicije proliferacije LoVo ćelija
Eksperimentalni primer 3: In vivo studija farmakokinetičkih svojstava
[0076] Test uzorci: Na osnovu prethodnih testova, neka od ovih jedinjenja sa visokom aktivnošću i reprezentativnim strukturama odabrana su za dodatne testove.
[0077] Eksperimentalna procedura: Svrha ove studije je da se odrede farmakokinetički parametri jedinjenja i izračuna njegova gavažna bioraspoloživost kod ženki Balb/c golih miševa.
[0078] U ovom projektu upotrebljeno je šest ženki Balb/c golih miševa, tri miša su injektirana intravenski, sa dozom od 1 mg/kg, gde su sakupljeni uzorci plazme na 0 h (pre primene) i na 0,0833, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 i 24 h posle primene, a na ostala tri miša je primenjena intragastrično doza od 10 mg/kg ili 25 mg/kg, gde su sakupljeni uzorci plazme na 0 h (pre primene) i 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24 h posle primene. LC-MS/MS analiza je izvedena na sakupljenim uzorcima i podaci su sakupljeni. Sakupljeni podaci analize su izračunati pomoću Phoenix WinNonlin 6.2.1 softvera za relevantne farmakokinetičke parametre. Rezultati testa pokazani su u Tabeli 14.1 i 14.2.
14.1 Rezultati primene intravenskom injekcijom
14.2 Rezultati intragastrične primene
Eksperimentalni primer 4: In vivo studija efikasnosti na LoVo CDX kolorektalnog kancera
[0079] Svrha: LoVo je tumorska ćelija kolorektalnog adenokarcinoma sa MRE11A mutacijom (MRE11A je ključna komponenta ATM signalnog puta za popravku dvolančanog prekida DNK), koja je osetljiva na inhibitor ATR. Ovaj test upotrebljava LoVo CDX model rektalnog kancera da potvrdi inhibitorni efekat inhibitora ATR na tumor sa defektnim ATM signalnim putem.
Eksperimentalna procedura:
1. Eksperimentalne životinje
[0080]
Vrsta: Miš
Soj: BALB/c goli miševi
Dobavljač: Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
Starost u nedeljama i težina: 6-8 nedelja, 18-22 g
Pol: ženski
2. Kultura ćelija
[0081] Humane LoVo ćelije kancera kolona (ECACC, Katalog: 87060101), in vitro monoslojna kultura, uslovi kulture su bili Hamov (Hamꞌs) F-12 medijum sa 10% fetalnim goveđim serumom, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 2 mM glutaminom, 37 °C, 5% CO2kultura.
[0082] Pankreatin-EDTA je upotrebljen za rutinsku digestiju i pasaž dva puta nedeljno. Kada je zasićenost ćelija bila 80%-90%, ćelije su sakupljene, prebrojane, i zasejane. 0,1 ml (10 × 10<6>) LoVo ćelija je subkutano inokulisano na desnoj strani leđa svakog golog miša, i grupna primena je inicirana kada je prosečna zapremina tumora dostigla 173 mm<3>.
3. Priprema test supstance i doziranje
[0083] Izmereno je 25,51 mg jedinjenja formule (1) i rastvoreno u 0,500 ml DMSO. Dodato je 2,000 ml propilen glikola i 2,500 ml dejonizovane vode, što je vorteksovano i dobro izmešano i podešeno na pH=6,0 kako bi se dobio bistar rastvor.
[0084] Doziranje: 25 mg/kg svih test jedinjenja primenjeno je gavažom dva puta dnevno, sa intervalom od 8 h unutar jednog dana.
4. Merenje tumora i eksperimentalni indikatori
[0085] Prečnik tumora je meren nonijus kaliperom dva puta nedeljno. Formula za izračunavanje zapremine tumora: V = 0,5a × b<2>, gde a i b predstavljaju duži prečnik i kraći prečnik tumora, respektivno.
[0086] Antitumorska efikasnost jedinjenja procenjena je pomoću TGI (%) ili relativne stope proliferacije tumora T/C (%).
[0087] Relativna stopa proliferacije tumora T/C (%) = TRTV / CRTV × 100 % (TRTV: prosečna RTV grupe sa tretmanom; CRTV: prosečna RTV grupe negativne kontrole). U skladu sa rezultatima merenja tumora, izračunata je relativna zapremina tumora (RTV), i formula za izračunavanje je RTV = Vt / V0, gde je V0 zapremina tumora izmerena u vreme grupne primene (tj. D0), Vt je zapremina tumora pri određenom merenju, i TRTV i CRTV upotrebljavaju podatke na isti dan.
[0088] TGI (%) predstavlja stopu inhibicije rasta tumora. TGI (%) = [1‑(prosečna zapremina tumora na kraju grupe sa određenim tretmanom - prosečna zapremina tumora na početku grupe sa tretmanom) / (prosečna zapremina tumora na kraju tretmana u kontrolnoj grupi sa rastvaračem - prosečna zapremina tumora na početku tretmana u kontrolnoj grupi sa rastvaračem)]×100%.
[0089] Pošto je eksperiment završen, detektovana je težina tumora i izračunat je procenat T/C težine, gde T težina i C težina predstavljaju težinu tumora grupe sa primenom i kontrolne grupe sa vehikulumom, respektivno.
5. Rezultati testa
[0090] Efikasnost jedinjenja u ksenograft modelu tumora humanog kolorektalnog kancera procenjena je u ovom testu, sa kontrolnom grupom sa rastvaračem kao referencom. Na dan 17 primene, grupa sa jedinjenjem formule (1) (25 mg/kg) imala je T/C i TGI od 27,8% i 90,7%, respektivno, u poređenju sa kontrolnom grupom sa vehikulumom.
6. Zaključak
[0091] U ovom eksperimentu, predmetno jedinjenje formule (1) pokazuje inhibitorni efekat na rast LoVo ćelija humanog kolorektalnog kancera kod miševa koji subkutano nose ksenograft tumora.
Claims (15)
- Patentni zahtevi 1. Kristalni oblik A jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,10±0,20°, 18,33±0,20° i 22,63±0,20° pri Cu kα zračenju
- 2. Kristalni oblik A u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46±0,20°, 8,10±0,20°, 13,03±0,20°, 15,07±0,20°, 15,58±0,20°, 16,19±0,20°, 18,33±0,20° i 22,63±0,20°.
- 3. Kristalni oblik A u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46±0,20°, 8,10±0,20°, 13,03±0,20°, 13,46±0,20°, 15,07±0,20°, 15,58±0,20°, 16,19±0,20°, 18,33±0,20°, 21,17±0,20° i 22,63 ±0,20°.
- 4. Kristalni oblik A u skladu sa patentnim zahtevom 3, naznačen time što kristalni oblik A ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 7,46°, 8,10°, 11,24°, 13,03°, 13,46°, 15,07°, 15,58°, 15,98°, 16,19°, 17,70°, 18,33°, 19,60°, 21,17°, 22,63°, 23,84°, 25,56° i 26,57°.
- 5. Kristalni oblik B jedinjenja formule (I), naznačen time što kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20° i 20,56±0,20° pri Cu kα zračenju
- 6. Kristalni oblik B u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20°, 14,83±0,20°, 15,54±0,20°, 17,33±0,20°, 20,56±0,20°, 22,00±0,20° i 22,63 ±0,20°.
- 7. Kristalni oblik B u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačen time što kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45±0,20°, 10,87±0,20°, 14,83±0,20°, 15,54±0,20°, 17,33±0,20°, 20,08±0,20°, 20,56±0,20°, 22,00±0,20°, 22,63±0,20° i 25,26±0,20°.
- 8. Kristalni oblik B u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačen time što kristalni oblik B ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka na prahu koji ima karakteristične difrakcione pikove na sledećim 2θ uglovima: 8,45°, 9,20°, 10,87°, 12,57°, 14,14°, 14,53°, 14,83°, 15,54°, 16,80°, 17,33°, 18,43°, 19,84°, 20,08°, 20,56°, 21,39°, 22,00°, 22,44°, 22,63°, 23,26°, 25,26°, 25,85° i 26,98°.
- 9. Kristalni oblik B u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time što kristalni oblik B ima krivu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) koja ima jednu tačku početka endotermnog pika na 174,3±3 °C pri stopi zagrevanja od 10 °C/min.
- 10. Kristalni oblik B u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time što kristalni oblik B ima krivu termogravimetrijske analize (TGA), pri čemu je gubitak težine na 150 °C±3 °C 1,49% pri stopi zagrevanja od 10 °C/min.
- 11. Postupak za pripremanje kristalnog oblika A jedinjenja formule (I) u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što sadrži: 1) dodavanje jedinjenja formule (I) u etanolni rastvarač; 2) dodavanje vode; 3) mešanje tokom 100-120 h; 4) izvođenje rekristalizacije na sobnoj temperaturi kako bi se dobio kristalni oblik A.
- 12. Postupak za pripremanje kristalnog oblika B jedinjenja formule (I) u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 do 10, naznačen time što sadrži: 1) dodavanje jedinjenja formule (I) u rastvarač; 2) zagrevanje na temperaturu uz mešanje tokom 2,5-120 h; 3) izvođenje rekristalizacije na sobnoj temperaturi kako bi se dobio kristalni oblik B.
- 13. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačen time što (i) rastvarač je metanol, metil tercijarni butil etar, metanol/voda (zapr./zapr. 1:0,3‑1), aceton/voda (zapr./zapr. 1:1), izopropanol/voda (zapr./zapr. 1:1), etil acetat/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), izopropil acetat/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), etanol/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), acetonitril/n-heptan (zapr./zapr. 1:1), izopropanol/n-heptan (zapr./zapr.1:1) ili dihlorometan/n-heptan (zapr./zapr.1:1); (ii) temperatura je 25‑70 °C; i/ili (iii) opseg koncentracije jedinjenja formule (I) odabran je iz grupe koja se sastoji od 25 mg/ml-50 mg/ml.
- 14. Kristalni oblik A u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4 ili kristalni oblik B u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 do 10 za upotrebu u postupku lečenja bolesti povezane sa ATR, pri čemu je bolest čvrsti tumor ili tumor krvi.
- 15. Kristalni oblik A ili kristalni oblik B za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je bolest kolorektalni kancer, kancer želuca, kancer jednjaka, primarni peritonealni karcinom, adrenokortikalni karcinom, svetloćelijski karcinom bubrežnih ćelija, kancer prostate, urotelni karcinom mokraćne bešike, kancer jajnika, kancer dojke, karcinom endometrijuma, karcinom Falopijeve tube, nesitnoćelijski kancer pluća ili sitnoćelijski kancer pluća.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910722102 | 2019-08-06 | ||
| EP20851028.9A EP4011881B1 (en) | 2019-08-06 | 2020-08-06 | Crystalline forms of an atr inhibitor and use thereof |
| PCT/CN2020/107474 WO2021023272A1 (zh) | 2019-08-06 | 2020-08-06 | 一种atr抑制剂的晶型及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RS66523B1 true RS66523B1 (sr) | 2025-03-31 |
Family
ID=74503892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RS20250185A RS66523B1 (sr) | 2019-08-06 | 2020-08-06 | Kristalni oblici inhibitora atr i njihova upotreba |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12479839B2 (sr) |
| EP (1) | EP4011881B1 (sr) |
| JP (1) | JP7573019B2 (sr) |
| CN (1) | CN114728957B (sr) |
| AU (1) | AU2020325416B2 (sr) |
| BR (1) | BR112022001393A2 (sr) |
| CA (1) | CA3147322C (sr) |
| DK (1) | DK4011881T3 (sr) |
| ES (1) | ES3013996T3 (sr) |
| FI (1) | FI4011881T3 (sr) |
| HR (1) | HRP20250236T1 (sr) |
| HU (1) | HUE070635T2 (sr) |
| IL (1) | IL290106B1 (sr) |
| LT (1) | LT4011881T (sr) |
| PL (1) | PL4011881T3 (sr) |
| PT (1) | PT4011881T (sr) |
| RS (1) | RS66523B1 (sr) |
| SI (1) | SI4011881T1 (sr) |
| SM (1) | SMT202500105T1 (sr) |
| WO (1) | WO2021023272A1 (sr) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118619944A (zh) | 2019-06-06 | 2024-09-10 | 北京泰德制药股份有限公司 | 作为atr激酶抑制剂的2,4,6-三取代的嘧啶化合物 |
| CN116178366B (zh) * | 2021-11-26 | 2025-03-18 | 无锡瓴方生物医药科技有限公司 | 氟代吡啶并吡咯类化合物的晶型及其制备方法 |
| US20250352539A1 (en) | 2022-06-15 | 2025-11-20 | Astrazeneca Ab | Combination therapy for treating cancer |
| TWI844293B (zh) * | 2023-03-07 | 2024-06-01 | 宏碁股份有限公司 | 風扇及葉輪 |
| TW202508595A (zh) | 2023-05-04 | 2025-03-01 | 美商銳新醫藥公司 | 用於ｒａｓ相關疾病或病症之組合療法 |
| US20250049810A1 (en) | 2023-08-07 | 2025-02-13 | Revolution Medicines, Inc. | Methods of treating a ras protein-related disease or disorder |
| AU2024360465A1 (en) | 2023-10-12 | 2026-04-09 | Revolution Medicines, Inc. | Macrocyclic ras inhibitors |
| WO2025171296A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | Revolution Medicines, Inc. | Ras inhibitors |
| WO2025217307A1 (en) | 2024-04-09 | 2025-10-16 | Revolution Medicines, Inc. | Methods for predicting response to a ras(on) inhibitor and combination therapies |
| TW202547461A (zh) | 2024-05-17 | 2025-12-16 | 美商銳新醫藥公司 | Ｒａｓ抑制劑 |
| WO2025255438A1 (en) | 2024-06-07 | 2025-12-11 | Revolution Medicines, Inc. | Methods of treating a ras protein-related disease or disorder |
| WO2025265060A1 (en) | 2024-06-21 | 2025-12-26 | Revolution Medicines, Inc. | Therapeutic compositions and methods for managing treatment-related effects |
| WO2026006747A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Revolution Medicines, Inc. | Ras inhibitors |
| WO2026015801A1 (en) | 2024-07-12 | 2026-01-15 | Revolution Medicines, Inc. | Methods of treating a ras related disease or disorder |
| WO2026015790A1 (en) | 2024-07-12 | 2026-01-15 | Revolution Medicines, Inc. | Methods of treating a ras related disease or disorder |
| WO2026015796A1 (en) | 2024-07-12 | 2026-01-15 | Revolution Medicines, Inc. | Methods of treating a ras related disease or disorder |
| WO2026015825A1 (en) | 2024-07-12 | 2026-01-15 | Revolution Medicines, Inc. | Use of ras inhibitor for treating pancreatic cancer |
| WO2026050446A1 (en) | 2024-08-29 | 2026-03-05 | Revolution Medicines, Inc. | Ras inhibitors |
| WO2026072904A2 (en) | 2024-09-26 | 2026-04-02 | Revolution Medicines, Inc. | Compositions and methods for treating lung cancer |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0415364D0 (en) | 2004-07-09 | 2004-08-11 | Astrazeneca Ab | Pyrimidine derivatives |
| US7851476B2 (en) | 2005-12-14 | 2010-12-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Crystalline forms of 1-benzoyl-4-[2-[4-methoxy-7-(3-methyl-1H-1,2,4-triazol-1-YL)-1-[(phosphonooxy)methyl]-1H-pyrrolo[2,3-C]pyridin-3-YL]-1,2-dioxoethyl]-piperazine |
| WO2009093981A1 (en) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | S Bio Pte Ltd | Triazine compounds as kinase inhibitors |
| SA111320519B1 (ar) * | 2010-06-11 | 2014-07-02 | Astrazeneca Ab | مركبات بيريميدينيل للاستخدام كمثبطات atr |
| JP7290627B2 (ja) * | 2017-08-17 | 2023-06-13 | ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | Ａｔｒキナーゼの複素環式阻害剤 |
| EP3679041B1 (en) | 2017-09-08 | 2022-07-06 | Newave Pharmaceutical Inc. | Substituted pyrrolopyridines as atr inhibitors |
| DK3753937T3 (da) * | 2018-02-07 | 2024-02-12 | Wuxi Biocity Biopharmaceutics Co Ltd | Atr-hæmmer og anvendelse deraf |
-
2020
- 2020-08-06 PT PT208510289T patent/PT4011881T/pt unknown
- 2020-08-06 US US17/632,823 patent/US12479839B2/en active Active
- 2020-08-06 PL PL20851028.9T patent/PL4011881T3/pl unknown
- 2020-08-06 CN CN202080054862.6A patent/CN114728957B/zh active Active
- 2020-08-06 SM SM20250105T patent/SMT202500105T1/it unknown
- 2020-08-06 CA CA3147322A patent/CA3147322C/en active Active
- 2020-08-06 HU HUE20851028A patent/HUE070635T2/hu unknown
- 2020-08-06 ES ES20851028T patent/ES3013996T3/es active Active
- 2020-08-06 DK DK20851028.9T patent/DK4011881T3/da active
- 2020-08-06 LT LTEPPCT/CN2020/107474T patent/LT4011881T/lt unknown
- 2020-08-06 AU AU2020325416A patent/AU2020325416B2/en active Active
- 2020-08-06 SI SI202030591T patent/SI4011881T1/sl unknown
- 2020-08-06 BR BR112022001393A patent/BR112022001393A2/pt unknown
- 2020-08-06 WO PCT/CN2020/107474 patent/WO2021023272A1/zh not_active Ceased
- 2020-08-06 RS RS20250185A patent/RS66523B1/sr unknown
- 2020-08-06 JP JP2022507699A patent/JP7573019B2/ja active Active
- 2020-08-06 FI FIEP20851028.9T patent/FI4011881T3/fi active
- 2020-08-06 EP EP20851028.9A patent/EP4011881B1/en active Active
- 2020-08-06 HR HRP20250236TT patent/HRP20250236T1/hr unknown
-
2022
- 2022-01-25 IL IL290106A patent/IL290106B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3147322C (en) | 2024-05-21 |
| AU2020325416B2 (en) | 2025-08-21 |
| SI4011881T1 (sl) | 2025-04-30 |
| ES3013996T3 (en) | 2025-04-16 |
| IL290106A (en) | 2022-03-01 |
| DK4011881T3 (da) | 2025-03-10 |
| AU2020325416A1 (en) | 2022-02-03 |
| LT4011881T (lt) | 2025-03-10 |
| EP4011881A1 (en) | 2022-06-15 |
| HRP20250236T1 (hr) | 2025-04-11 |
| EP4011881B1 (en) | 2025-02-12 |
| JP7573019B2 (ja) | 2024-10-24 |
| PL4011881T3 (pl) | 2025-04-07 |
| US12479839B2 (en) | 2025-11-25 |
| CA3147322A1 (en) | 2021-02-11 |
| CN114728957B (zh) | 2023-09-22 |
| SMT202500105T1 (it) | 2025-05-12 |
| IL290106B1 (en) | 2026-03-01 |
| EP4011881A4 (en) | 2023-08-09 |
| WO2021023272A1 (zh) | 2021-02-11 |
| BR112022001393A2 (pt) | 2022-03-22 |
| NZ784192A (en) | 2025-05-30 |
| JP2022543856A (ja) | 2022-10-14 |
| HUE070635T2 (hu) | 2025-06-28 |
| US20220281858A1 (en) | 2022-09-08 |
| FI4011881T3 (fi) | 2025-03-19 |
| PT4011881T (pt) | 2025-03-05 |
| CN114728957A (zh) | 2022-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RS66523B1 (sr) | Kristalni oblici inhibitora atr i njihova upotreba | |
| US12291536B2 (en) | Crystal form of Wee1 inhibitor compound and use thereof | |
| AU2019260240B2 (en) | Crystal form of c-MET inhibitor and salt form thereof and preparation method therefor | |
| RS62464B1 (sr) | Pirimidopirimidinoni korisni kao inhibitori wee-1 kinaze | |
| RU2832707C2 (ru) | Кристаллическая форма ингибитора atr и ее применение | |
| CN115448874B (zh) | 固体形式的周期蛋白依赖性激酶9抑制剂及其用途 | |
| HK40074313B (zh) | 一种atr抑制剂的晶型及其应用 | |
| WO2020224585A1 (zh) | 一种mTORC1/2双激酶活性抑制剂的盐型、晶型及其制备方法 | |
| CN119060055B (zh) | 共价激酶抑制剂、制备方法、药物组合物和应用 | |
| RU2842334C2 (ru) | Кристаллическая форма ингибирующего wee1 соединения и ее применение | |
| HK40074313A (en) | Crystalline form of atr inhibitor and use thereof | |
| US11919898B2 (en) | Crystal form of azaindole derivative and use thereof | |
| HK40060045B (zh) | Wee1抑制剂化合物的晶型及其应用 | |
| CN120365220A (zh) | 一种2，4-二取代喹唑啉衍生物及其制备方法和应用 | |
| CN121824513A (zh) | 一种基于1,2,4-恶二唑结构的hnRNP A2B1抑制剂及其应用 | |
| HK40060045A (en) | Crystal form of wee1 inhibitor compound and use thereof | |
| HK40101086B (zh) | 甲基吡唑取代的吡啶并咪唑类化合物的晶型及其制备方法 | |
| HK40101086A (zh) | 甲基吡唑取代的吡啶并咪唑类化合物的晶型及其制备方法 |