JP7650802B2 - 抗ウサギｃｄ１９抗体および使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウサギＣＤ１９に対する抗体（抗ウサギＣＤ１９抗体）、その産生方法およびその使用に関する。

Ｂ細胞は、プロＢ細胞およびプレＢ細胞から発生し、骨髄において成熟して抗原特異的細胞表面抗体分子を発現し、次いで、リンパ系組織内で未成熟Ｂ細胞発生の移行期Ｔ１およびＴ２段階を経て進む。脾臓では、Ｂ細胞の大部分は、成熟濾胞区画に、または少数は、辺縁帯、Ｂ１ａ、および制御性Ｂ１０細胞サブセットに分配される。外来抗原によって活性化された抗原特異的成熟Ｂ細胞は、クローン増殖し、短寿命の形質細胞に分化する。濾胞Ｂ細胞はまた、抗原選択Ｂ細胞が増殖する胚中心に入ることができ、それらの抗原受容体は親和性成熟およびクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）を受ける。Ｂ細胞は、メモリーＢ細胞として胚中心を離れるか、または骨髄に遊走する長寿命の形質芽球に分化する。Ｂ細胞はまた、インターロイキン－１０を産生することができる制御性Ｂ１０細胞サブセット、大部分の天然Ａｂを産生するＢ１ａサブセット、およびＴＩ抗原に対する適応抗体応答を生じるＢ１ｂサブセットを含む、腹腔内に見出される。大部分の成熟Ｂ細胞はＣＤ２０を発現するのに対し、ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞、ならびにいくつかのプレＢ細胞、形質芽球、ならびに短寿命および長寿命形質細胞によって発現される。ＣＤ１９は、腹膜Ｂ１ａおよびＢ１ｂ細胞によって、より高い密度で発現される（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．５（２００９）５７２～５７７（非特許文献1）、ＬｅＢｉｅｎ，Ｔ．Ｗ．およびＴｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．、Ｂｌｏｏｄ １１２（２００８）１５７０～１５８０（非特許文献2））。

ＣＤ１９は、膜貫通タンパク質（Ｂ細胞共受容体）である。ヒトＣＤ１９構造遺伝子は、抗原受容体依存性刺激の閾値を低下させるために、Ｂ細胞受容体と集合する細胞表面分子をコードする。ＣＤ１９は、主にＣＤ２１およびＣＤ８１と共に、Ｂ細胞共受容体として作用する。ＣＤ１９およびＣＤ２１は、正常なＢ細胞分化に必要である（Ｃａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２６（２００２）４５～５４（非特許文献3））。活性化すると、ＣＤ１９の細胞質尾部はリン酸化され、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる結合およびＰＩ－３キナーゼの動員をもたらす。

ヒトＣＤ１９に対する抗体は、例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号（特許文献1）、国際公開第２００５／０１２４９３号（特許文献2）、国際公開第２００６／０８９１３３号（特許文献3）、国際公開第２００７／００２２２３号（特許文献4）、国際公開第２００６／１３３４５０号（特許文献5）、国際公開第２００６／１２１８５２号（特許文献6）、国際公開第２００３／０４８２０９号（特許文献7）、米国特許第７，１０９，３０４号（特許文献8）、米国特許出願公開第２００６／０２３３７９１号（特許文献9）、米国特許出願公開第２００６／０２８０７３８号（特許文献10）、米国特許出願公開第２００６／０２６３３５７号（特許文献11）、米国特許出願公開第２００６／０２５７３９８号（特許文献12）、欧州特許出願公開第１６４８５１２号（特許文献13）、欧州特許出願公開第１６２９０１２号（特許文献14）、米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号（特許文献15）、国際公開第２００８／０２２１５２号（特許文献16）、国際公開第２０１１／１４７８３４号（特許文献17）、およびＢｒｕｅｎｋｅ，Ｊ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３０（２００５）２１８～２２８（非特許文献4）、Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９（２００４）１１～２３（非特許文献5）、Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０４（２００４）１７８～１８３（非特許文献6）、Ｌａｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）３９８２～３９８５（非特許文献7）、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９５（２０００）２０９８～２１０３（非特許文献8）、Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｆ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５３（１９９９）１６４～１６８（非特許文献9）、Ｌｉ，Ｑ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７（１９９８）１２１～１３０（非特許文献10）、Ｅｂｅｒｌ，Ｇ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４（１９９８）１７３～１７８（非特許文献11）、Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，Ｇ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４１（１９９５）５３～６０（非特許文献12）、Ｍｙｅｒｓ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１８（１９９５）９３～１０２（非特許文献13）、Ｂｅｊｃｅｋ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１９９５）２３４６～２３５１（非特許文献14）、Ｈａｇｅｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８５（１９９５）３２０８～３２１２（非特許文献15）、Ｖｌａｓｆｅｌｄ，Ｌ．Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４０（１９９５）３７～４７（非特許文献16）、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｅ．Ｇ．ら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１０（１９９２）４８５～４８９（非特許文献17）、Ｚｏｌａ，Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６９（１９９１）４１１～４２２（非特許文献18）、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）３２４５～３２４８（非特許文献19）、Ｕｃｋｕｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７１（１９８８）１３～２９（非特許文献20）、Ｐｅｚｚｕｔｔｏ，Ａ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８（１９８７）２７９３～２７９９（非特許文献21）に記載されている。モノクローナル抗体ＳＪ２５－Ｃ１は市販されている（製品番号４７３７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＵＳＡ、配列番号２１～２４）。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が増加した抗体は、国際公開第２００８／０２２１５２号（特許文献16）に記載されている。

ウサギゲノムは配列決定されており、２００９年に６．５１の冗長性でアセンブルされた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍａｍｍａｌｓ－ｍｏｄｅｌｓ／ｒａｂｂｉｔ／ｒａｂｂｉｔ－ｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｐｒｏｊｅｃｔ（非特許文献22）を参照されたい）。

モノクローナル抗ウサギＣＤ１９抗体は、これまで報告されていない。いくつかのポリクローナル抗体によって主張されているが、抗ヒトＣＤ１９抗体または抗マウスＣＤ１９抗体と、ウサギＣＤ１９との交差反応性は証明することができなかった。

したがって、モノクローナル抗ウサギＣＤ１９抗体を提供する必要がある。

国際公開第２００４／１０６３８１号 国際公開第２００５／０１２４９３号 国際公開第２００６／０８９１３３号 国際公開第２００７／００２２２３号 国際公開第２００６／１３３４５０号 国際公開第２００６／１２１８５２号 国際公開第２００３／０４８２０９号 米国特許第７，１０９，３０４号 米国特許出願公開第２００６／０２３３７９１号 米国特許出願公開第２００６／０２８０７３８号 米国特許出願公開第２００６／０２６３３５７号 米国特許出願公開第２００６／０２５７３９８号 欧州特許出願公開第１６４８５１２号 欧州特許出願公開第１６２９０１２号 米国特許出願公開第２００８／０１３８３３６号 国際公開第２００８／０２２１５２号 国際公開第２０１１／１４７８３４号

Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．５（２００９）５７２～５７７ ＬｅＢｉｅｎ，Ｔ．Ｗ．およびＴｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．、Ｂｌｏｏｄ １１２（２００８）１５７０～１５８０ Ｃａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２６（２００２）４５～５４ Ｂｒｕｅｎｋｅ，Ｊ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１３０（２００５）２１８～２２８ Ｖａｌｌｅｒａ，Ｄ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９（２００４）１１～２３ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０４（２００４）１７８～１８３ Ｌａｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）３９８２～３９８５ Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ９５（２０００）２０９８～２１０３ Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｆ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５３（１９９９）１６４～１６８ Ｌｉ，Ｑ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７（１９９８）１２１～１３０ Ｅｂｅｒｌ，Ｇ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４（１９９８）１７３～１７８ Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，Ｇ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４１（１９９５）５３～６０ Ｍｙｅｒｓ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１８（１９９５）９３～１０２ Ｂｅｊｃｅｋ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１９９５）２３４６～２３５１ Ｈａｇｅｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８５（１９９５）３２０８～３２１２ Ｖｌａｓｆｅｌｄ，Ｌ．Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４０（１９９５）３７～４７ Ｒｈｏｄｅｓ，Ｅ．Ｇ．ら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１０（１９９２）４８５～４８９ Ｚｏｌａ，Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６９（１９９１）４１１～４２２ Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）３２４５～３２４８ Ｕｃｋｕｎ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ７１（１９８８）１３～２９ Ｐｅｚｚｕｔｔｏ，Ａ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８（１９８７）２７９３～２７９９ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍａｍｍａｌｓ－ｍｏｄｅｌｓ／ｒａｂｂｉｔ／ｒａｂｂｉｔ－ｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｐｒｏｊｅｃｔ

本発明は、抗ウサギＣＤ１９抗体、およびウサギＢ細胞の標識におけるその使用に関する。

本発明による抗体は、とりわけ、
－ ウサギＰＢＭＣまたは脾細胞中のＢ細胞を特徴付けすること、
－ 抗原パニングの前または後のいずれかで、マクロファージ枯渇後に抗原特異的Ｂ細胞を濃縮すること、
－ フィーダー細胞（フィーダー細胞は、Ｂ細胞を桁違いに増殖させる）との共培養後に、Ｂ細胞を選択的に染色すること、ならびに
－ （任意で、１種または複数のさらなるマーカーと組み合わせて）改善された収率および品質で、Ｂ細胞を選別および選択すること
を少なくとも可能にする。

本発明の一態様は、（ａ）配列番号３２または３３または３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５または３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ウサギＣＤ１９に特異的に結合する単離された抗体である。

一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

一実施形態では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。

一実施形態では、抗体は、配列番号３０の重鎖可変ドメインおよび配列番号２６の軽鎖可変ドメインを含む。

一態様は、
ａ）ウサギの血液からＢ細胞を得る工程、
ｂ）Ｂ細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

一実施形態では、方法は、
工程ｂ）の後かつ工程ｃ）の前における、Ｂ細胞を共培養培地中で３７℃で１時間インキュベートする工程、
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を、個々の容器に（単一で）置く工程、
ｄ）（単一で）置かれた細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、
ｅ）工程ｄ）で増殖しているＢ細胞を選択し、それによって、Ｂ細胞を選択する工程
のうちの１つまたは複数をさらに含む。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）本発明による標識された抗体の結合に基づいて、ＦＡＣＳによって単一細胞として置かれたＢ細胞の集団のＢ細胞のそれぞれを、フィーダー細胞としてのマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞と共培養する工程、および
ｂ）工程ａ）において、増殖し、かつ抗体を分泌するＢ細胞クローンを選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

一実施形態では、共培養は、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数種を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われる。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）本発明による標識された抗体の結合に基づいて、ＦＡＣＳによって個々の容器に置かれたＢ細胞の集団の１つまたは複数のＢ細胞を、任意で、フィーダー細胞としてのマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞、ならびにフィーダー混合物としてのＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数の存在下で、共培養する工程、
ｂ）標的抗原に特異的に結合する抗体を産生する、Ｂ細胞クローンを選択する工程と、
ｂ１）逆転写ＰＣＲによって該抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を決定する工程、
ｂ２）該抗体軽鎖可変ドメインおよび該重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む核酸で、細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）で選択されたＢ細胞クローンによって産生される抗体またはそのヒト化バリアントをコードする核酸を含有する細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収することによって、抗体を産生する工程
を含む、標的抗原に結合する抗体を産生するための方法である。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。

本明細書に記載の一態様は、
－ 多数のウサギＢ細胞を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体とインキュベートする工程／多数のウサギＢ細胞の個々のＢ細胞を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体で標識する工程、
－ 本発明による抗体がその表面上に結合している／個々のＢ細胞（単一細胞として置かれたＢ細胞）またはＢ細胞のプール（個々の容器中）のいずれかとして標識されている、１つまたは複数のウサギＢ細胞を選択する／置く工程、および
－ 該単一細胞として置かれたウサギＢ細胞または該ウサギＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程、
－ 任意で、共培養後に、得られた細胞混合物を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体とインキュベートし、本発明による抗体がその表面上に結合している／標識されている、ウサギＢ細胞を選択する／置く／計数する工程
を含む、１つまたは複数のウサギＢ細胞を共培養するための方法である。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）単一細胞または細胞のプールのいずれかとして置かれたＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を選択することによって、非Ｂ細胞を除去する工程
を含む、培養物についてＢ細胞を選択する／非Ｂ細胞を除去するための方法である。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）単一細胞として置かれたＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している細胞の数を数えることによって、培養物中のＢ細胞の数を決定する工程
を含む、単一細胞として置かれたＢ細胞の培養後に、Ｂ細胞の数を決定する方法である。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。

本発明の一態様は、
ａ）単一細胞として置かれたＢ細胞またはＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数の細胞を選択し、それによってＢ細胞を選択し、細胞の混合物から非Ｂ細胞を除去する工程
を含む、細胞の混合物（例えば、培養物）について非Ｂ細胞を除去する方法である。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。

本発明による一態様は、
ａ）単一細胞として置かれたＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している細胞の数を数えることによって、培養物中のＢ細胞の数を決定する工程
を含む、単一細胞として置かれたＢ細胞とフィーダー細胞との共培養物中のＢ細胞の数を決定するための方法である。

一実施形態では、Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である。
[本発明1001]
ウサギＣＤ19に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号32または33または34のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ1、
（ｂ）配列番号35または36のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ2、
（ｃ）配列番号37のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ3、
（ｄ）配列番号38のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ1、
（ｅ）配列番号39のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ2、および
（ｆ）配列番号40のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ3
を含む、抗体。
[本発明1002]
モノクローナル抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
キメラ抗体またはヒト化抗体である、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1004]
配列番号30の重鎖可変ドメインと配列番号26の軽鎖可変ドメインとを含む、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1005]
全長抗体または抗体断片である、本発明1001から1004のいずれかの抗体。
[本発明1006]
検出可能な標識にコンジュゲートされている、本発明1001から1005のいずれかの抗体。
[本発明1007]
前記検出可能な標識が、蛍光色素である、本発明1006の抗体。
[本発明1008]
ウサギＢ細胞を選択するための方法であって、
ａ）多数のウサギＢ細胞を、本発明1001から1007のいずれかの抗体とインキュベートする工程、および
ｂ）本発明1001から1007のいずれかの抗体が結合している1つまたは複数のＢ細胞を選択し、それによって、ウサギＢ細胞を選択する工程
を含む、方法。
[本発明1009]
工程ｂ）の後かつ工程ｃ）の前における、前記ウサギＢ細胞を共培養培地中で37℃で1時間インキュベートする工程、および／または
ｃ）本発明1001から1007のいずれかの抗体が結合している1つもしくは複数のウサギＢ細胞を単一細胞として置く工程、および／または
ｄ）前記単一細胞として置かれたウサギＢ細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、および／または
ｅ）工程ｄ）で増殖しているウサギＢ細胞を選択し、それによって、ウサギＢ細胞を選択する工程
のうちの1つまたは複数をさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
培養物について非Ｂ細胞を除去するための方法であって、
ａ）単一細胞または細胞のプールのいずれかとして置かれたウサギＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの前記細胞を、本発明1001から1007のいずれかの抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明1001から1007のいずれかの抗体が結合している1つまたは複数のウサギＢ細胞を選択し、それによって、非Ｂ細胞を除去する工程
を含む、方法。
[本発明1011]
単一細胞として置かれたＢ細胞とフィーダー細胞との共培養物中のＢ細胞の数を決定するための方法であって、
ａ）単一細胞として置かれたウサギＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの前記細胞を、本発明1001から1007のいずれかの抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明1001から1007のいずれかの抗体が結合している細胞の数を数えることによって、前記培養物中のＢ細胞の数を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1012]
1つまたは複数のウサギＢ細胞を共培養するための方法であって、
－ 多数のウサギＢ細胞を、本発明1001から1007のいずれかの抗体とインキュベートする工程／多数のウサギＢ細胞の個々のＢ細胞を、本発明1001から1007のいずれかの抗体で標識する工程、
－ 本発明1001から1007のいずれかの抗体がその表面に結合している／個々のＢ細胞（単一細胞として置かれたＢ細胞）またはＢ細胞のプールのいずれかとして標識されている、1つまたは複数のウサギＢ細胞を選択する／置く工程、および
－ 前記単一細胞として置かれたウサギＢ細胞または前記ウサギＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程
を含む、方法。
[本発明1013]
前記共培養が、ＩＬ－1β、ＴＮＦα、ＩＬ－10、ならびにＩＬ－21、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－2、ＩＬ－4、およびＩＬ－6から選択される1種または複数種を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われる、本発明1009から1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
ａ）ウサギの血液からＢ細胞を得る工程、
ｂ）前記Ｂ細胞を、ビーズに結合している本発明1001から1005のいずれかの抗体とインキュベートする工程、
ｃ）結合していないＢ細胞を除去する工程、および
ｄ）結合したＢ細胞を前記ビーズから回収し、それによって、1つまたは複数のＢ細胞を選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法。
[本発明1015]
ｅ）任意で、前記回収されたＢ細胞を、共培養培地中で37℃で1時間インキュベートする工程、
ｆ）1つまたは複数の回収されたＢ細胞を、個々の容器に置く工程、
ｇ）前記置かれた細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、および
ｈ）工程ｇ）で増殖しているＢ細胞を選択し、それによって、Ｂ細胞を選択する工程
をさらに含む、本発明1014の方法。

本発明の態様の詳細な説明
ＣＤ１９は、形質細胞への最終分化までのＢ細胞発生のほとんどすべての段階で発現されるので、最適な汎Ｂ細胞マーカーである（例えば、上記のＴｅｄｄｅｒを参照されたい）。

Ｉ．定義
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）において提供されている。重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）において記載されているＫａｂａｔ付番システムにより付番することができ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる付番」と呼ばれる。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ付番システム（６４７～６６０頁を参照）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス付番システム（６６１～７２３頁を参照）は、定常重鎖ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３、本明細書では、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる付番」と呼ぶことによってさらに明確にしている）に使用される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数のものを含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知なそれらの均等物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。

また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、互換的に使用され得ることにも留意されたい。

当業者にとって、例えば、ペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、対応するコード核酸配列へと変換する手順および方法は周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって、同様に、該核酸配列によってコードされるペプチドリンカーまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列によって特徴付けられる。

組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体を、例えば、置換、改変、交換、欠失、または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化を、例えば、部位特異的変異導入によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄを参照されたい）。

本発明を実施するための有用な方法および技法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ～ＩＩ巻（１９８５）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（編）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎ．Ｙ．、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。

「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施形態では、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。

本明細書の目的のための「アクセプタ・ヒト・フレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワーク「由来の」アクセプタ・ヒト・フレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変更の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプタ・ヒト・フレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒト・コンセンサス・フレームワーク配列に対して、配列が同一である。

「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性を、一般に、解離定数（ｋ_ｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって、測定され得る。

「抗ウサギＣＤ１９抗体」および「ウサギＣＤ１９に特異的に結合する抗体」という用語は、十分な親和性でウサギＣＤ１９に結合することができる抗体を指し、抗体がウサギＣＤ１９を標的とする際に診断剤として有用である。

本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、所望のウサギＣＤ１９結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない。

「抗体断片」は、ウサギＣＤ１９に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５種類の主要なクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で、少なくとも一部分の定常領域を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域断片を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域の、それぞれ、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）またはグリシン－リジンのジペプチド（Ｇｌｙ４４６－Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる付番。

「（抗体の）定常領域」という用語は、本明細書で、可変ドメインを除く免疫グロブリン重鎖の部分を定義するために使用される。この用語は、天然配列定常領域とバリアント定常領域とを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ａｌａ１１４から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域の、それぞれ、Ｃ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）またはグリシン－リジンのジペプチド（Ｇｌｙ４４６－Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる付番。

本発明による抗体は、Ｆｃ領域として、一実施形態では、ヒト起源に由来するＦｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒト定常領域のすべての部分を含む。抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、ある特定の条件に依存し、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５～２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７～９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８～３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５～１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８～４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１～１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９～３２４、および欧州特許出願公開第０３０７４３４号において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる付番）である。ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐおよび／またはＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる付番）を含むヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、および任意でＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる付番）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。

本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、色素原（蛍光または発光基、および色素）、酵素、ＮＭＲ活性基、金属粒子、またはジゴキシゲニンなどのハプテンを包含する。一実施形態では、検出可能な標識は、蛍光色素である。電気化学発光によって検出することができる金属キレートもまた、一実施形態では、シグナル放出基であり、例えば、ルテニウム（ビスピリジル）_３ ^２＋キレートなどのルテニウムキレートが特に好ましい。好適なルテニウム標識基は、例えば、欧州特許出願公開第０５８０９７９号、国際公開第９０／０５３０１号、国際公開第９０／１１５１１号、および国際公開第９２／１４１３８号に記載されている。

「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１～３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、第１～３巻にあるようなサブグループである。一態様では、ＶＬに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるように、サブグループカッパＩまたはＩＩＩである。一態様では、ＶＨに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるように、サブグループカッパＩＩＩである。

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列およびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）における次の配列において表される：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代の数にかかわらず、初代の形質転換された細胞、および初代の形質転換された細胞に由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、または選択されるのと同じ機能または生物学的活性を有する変異型の子孫は、本発明に含まれる。

「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１～３２４２、第１～３巻にあるように、サブグループである。一実施形態では、ＶＬに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるように、サブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨに関して、サブグループは、上記のＫａｂａｔらにあるように、サブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意で、少なくとも一部分のヒト抗体に由来する抗体定常領域を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）であり、かつ／または構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、アミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。

ＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１～９１７）、
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１～３２４２）、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））、ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ
を含む。

別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書で、上記のＫａｂａｔらによって付番される。

「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法のレビューについては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８（２００７）７９～８７を参照されたい。

「単離された」核酸は、その自然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含有する細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する、核酸分子を含む。

「抗ウサギＣＤ１９抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重鎖および軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つまたは複数の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター中のこのような核酸分子（複数可）を含み、このような核酸分子（複数可）は、宿主細胞中の１つまたは複数の場所に存在する。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。ただし、例えば、自然発生の変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる、起こり得るバリアント抗体（このようなバリアントは一般的に少量で存在する）は除く。一般に、様々な決定基（エピトープ）に対して指向する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするようには解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、多様な技法によって作製することができるが、これらに限定されず、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

「裸抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。

「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向けて、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）とを有し、第１と第２の定常ドメインの間にヒンジ領域が位置する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向けて、各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの一方に分けられ得る。

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要ならばギャップを導入した後、アラインメントの目的では保存的置換を配列同一性の一部としては考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的ためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある様々な様式で、例えば、一般に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、またはＦＡＳＴＡプログラムパッケージを使用して、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントさせるために適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性パーセントの値を、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して、生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９）にユーザマニュアルと共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。

別途示されない限り、本明細書での目的に対して、アミノ酸配列同一性パーセントの値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃまたはそれ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスと共に使用して、生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ ８５：２４４４～２４４８、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７～２５８、ならびにＰｅａｒｓｏｎら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４～３６によって記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌまたはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから一般に利用可能である。あるいは、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムおよびデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、ローカルではなくグローバルのアラインメントを行うことを保証し、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、出力アラインメントヘッダーで与えられる。

「ＣＤ１９」という用語は、本明細書で使用される場合、ウサギＢリンパ球抗原ＣＤ１９（代替名：分化抗原ＣＤ１９、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｔ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２）を指す。この用語は、本明細書に記載の抗体が、例えば、配列番号０１およびその断片などに、結合する限り、「全長」のプロセシングされていないウサギＣＤ１９（配列番号０２）ならびに細胞におけるプロセシングから（例えば、シグナルペプチドの切断によって）生じる、ウサギＣＤ１９の任意の形態を包含する。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．（２００７）、９１頁を参照されたい。）単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離され得る。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０～８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４～６２８を参照されたい。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

ＩＩ．組成物および方法
本発明は、ウサギＣＤ１９が、非常に価値のある汎ウサギＢ細胞マーカーである、という知見に少なくとも部分的に基づく。

より詳細には、ウサギＣＤ１９は、ウサギＢ細胞の分析および特徴付けのために有利な細胞表面マーカーであることが見出された。表面に提示されたＣＤ１９を介したウサギＢ細胞の標識化は、Ｂ細胞の濃縮または選別さえも改善できる。改善は、とりわけ、より特異的な標識化、それによる濃縮／選別／単一細胞として置くこと、または／および処理されるＢ細胞の数が減少し、同時に抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の数が増加する、易化したプロセスである。

本発明は、本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体が、抗ウサギＣＤ２０抗体と比較して、細胞表面マーカーとして使用された場合に、Ｂ細胞のアポトーシスをもたらさない、という知見に少なくとも部分的に基づく。

本発明がなされるまで、ウサギＢ細胞を特異的に染色するために有用であった唯一の抗体は、ヒトトランスジェニックウサギにおけるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはヒト軽鎖のような、細胞表面免疫グロブリンに対する抗体であった。Ｂ細胞集団全体を特異的に染色するために利用可能な特異的Ｂ細胞マーカーはなかった。本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体により、ウサギＢ細胞集団全体を同定し、特異的に染色することが初めて可能になる。

ウサギＣＤ１９配列は、他の非げっ歯類哺乳動物種と比較して、エクソン＃３に伸長したギャップを含む（アラインメントを参照されたい）。

ウサギゲノムからの遺伝子の単離のために、５’／３’－ＵＴＲ領域をウサギ、ヒト、およびマウスから抽出し、比較して、ＰＣＲプライマーを配置できる領域を得た（ｒｂ＿５ＵＴＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｇｉｏｎ１（配列番号１７）、ｒｂ＿５ＵＴＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｇｉｏｎ２（配列番号１８）、ｒｂ＿３ＵＴＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿ｒｅｇｉｏｎ（配列番号１９））。例示的なプライマーは、配列番号５３（３’ＵＴＲで結合）および配列番号５４（５’ＵＴＲで結合）の配列を有する。

ウサギＣＤ１９ゲノムＤＮＡの単離のために、ｒｂＣＤ１９ ＵＴＲフォワードプライマーとｒｂＣＤ１９ ＵＴＲリバースプライマーとのプライマー組合せ（ウサギＣＤ１９構造遺伝子の５’／３’－ＵＴＲ配列で結合：配列番号２０および２１）またはｒｂＣＤ１９ ＣＤＳフォワードプライマーとｒｂＣＤ１９ ＣＤＳリバースプライマーとのプライマー組合せ（ウサギＣＤ１９構造遺伝子の開始コドンおよび停止コドンで結合：配列番号２２および２３）のいずれかを使用することができる。それぞれの増幅産物は、それぞれ、１８３１ｂｐまたは１６６３ｂｐの長さを有する。

ウサギＣＤ１９の発現プラスミドでマウスを免疫することによって、本発明による抗体を生成した。Ｂ細胞を採取する前に、ウサギＣＤ１９ ＤＮＡでトランスフェクトされたウサギＣＤ１９提示細胞で免疫マウスをブーストした。採取したＢ細胞を、骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成した。

ブーストに使用されるウサギＣＤ１９発現細胞は、ウサギＣＤ１９－ＧＰＩアンカー－ＦＬＡＧタグ融合ポリペプチドでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５８（商標））マウス胚線維芽細胞である。細胞表面上のウサギＣＤ１９の発現は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（２４時間後に約４０％のＦＩＴＣ陽性細胞）において良好に機能し、細胞内染色により高いシグナルが得られる。予想外なことに、密接に関連するＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７７２（商標））マウス筋芽細胞を使用した場合、前記構築物の発現を検出することはできなかった（検出可能なウサギＣＤ１９陽性細胞がほとんどなし、２４時間後に約９％のＦＩＴＣ陽性細胞）。ウサギＣＤ１９の発現のさらなる改善は、逆トランスフェクションアプローチを使用することによって、達成することができた（図１を参照されたい）。ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞について、ＦＬＡＧタグを細胞表面に発現されたウサギＣＤ１９の検出の代用として使用できることが示されている（以下の表を参照されたい）。

抗Ｆｌａｇタグ抗体－Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート＝Ａｌｅｘａ４８８で標識された抗Ｆｌａｇタグ抗体によるＦＬＡＧタグの検出
ポリクローナル抗ｍＩｇＧ抗体－ＡＰＣコンジュゲート＝ＡＰＣで標識された抗マウスＩｇＧ抗体による抗ウサギＣＤ１９抗体の検出

生成された３５６個のハイブリドーマ細胞のうち、単一の細胞であるクローン１Ｈ２のみが、Ｂ細胞表面の天然ウサギＣＤ１９に対する（十分に良い）親和性を有する抗ウサギＣＤ１９抗体を発現した（図２および以下の表を参照されたい）。

本発明は、抗ウサギＣＤ１９抗体を発現するＢ細胞またはハイブリドーマを、それぞれ得るために、特定の免疫化プロトコルに従う必要がある、という知見に少なくとも部分的に基づく。ＤＮＡ免疫化と、採取前にその表面にウサギＣＤ１９を発現する細胞によるブーストとの組合せにより、ウサギＣＤ１９特異的抗体を発現するＢ細胞を得ることができることが見出された。

この理論に拘束されるものではないが、モノクローナル抗体はもちろんのこと、抗ウサギＣＤ１９抗体は、このような抗体を生成することが実に困難であるため、これまで利用可能ではなかったと考えられる。例えば、経験から、組換えタンパク質としての、または組換え細胞株としてのみのＣＤ１９による免疫化は、Ｂ細胞上の天然ＣＤ１９に結合する抗体をもたらさないことが明らかになった。したがって、ＣＤ１９が天然の確認として動物中に存在すると仮定して、最終的な細胞ブーストを含むＤＮＡのみの免疫化を行った。

本明細書では、ウサギＢ細胞の標識化および濃縮／選択のためのツールとして有用な、ウサギＣＤ１９に対する抗体が提供される。

この理論に拘束されるものではないが、これらの抗体を、とりわけ、マクロファージ枯渇後および／またはＩｇＭ－ＩｇＧ＋ＣＤ１９＋－Ｂ細胞の染色のために、有益に使用することができると想定される。

本発明は、ＣＤ１９を利用して、単一細胞を置くことまたはプール選別のためにＢ細胞を標識できる、という知見に少なくとも部分的に基づく。抗原特異的ＩｇＧを産生するすべてのＢ細胞は、それぞれ置く日または選別する日に、ＣＤ１９陽性であることが見出された。したがって、ウサギ細胞上のＣＤ１９を利用して、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を選択することができる（図３および以下の表を参照されたい）。

本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体は、ＩｇＧ陽性およびＩｇＭ陽性のＢ細胞を検出するために使用することができる（すべての抗原特異的ＩｇＧ陽性Ｂ細胞は高レベルのＣＤ１９を有する）。本発明による抗体を用いて、脾臓中のＢ細胞の全細胞の約５．４％がＣＤ１９陽性であり、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＢ細胞の全細胞の平均３８．７％がＣＤ１９陽性であることを初めて決定することができた。血液から新たに単離されたウサギＰＢＭＣ中のウサギＣＤ１９陽性細胞の割合は、免疫グロブリン染色されたＢ細胞の合計よりも高く、抗ウサギＣＤ１９抗体が、すべてのウサギＢ細胞を標識するための優れたマーカーであることを意味することを指摘しなければならない。結果を下の表に示す。

特に、ＩｇＧで選別されたＢ細胞集団では、すべてのＩｇＧ陽性細胞が高レベルのＣＤ１９を有することは重要である（以下の表のデータを参照されたい）。

本発明は、ＣＤ１９を利用して、Ｂ細胞の共培養物においてＢ細胞をフィーダー細胞から区別することができる、という知見に少なくとも部分的に基づく。単一細胞として置かれたＢ細胞は、増殖および細胞分裂のために、培養物中のフィーダー細胞の存在を必要とする。フィーダー細胞は、その増殖および細胞分裂を減少させるために、Ｂ細胞との共培養の前に放射線照射されるが、その総数および細胞サイズは、共培養後に得られるＢ細胞の数および細胞サイズと同程度である。本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体により、共培養後の単純なＦＡＣＳ解析によって、フィーダー細胞とＢ細胞とを区別することが今や可能である。これによって、Ｂ細胞の総数を特定することができる。このことは、抗体産生速度または収率などの他の培養パラメータの正規化を可能にする（図４および図５を参照されたい）。

本発明の前には、細胞表面Ｂ細胞マーカーとしてのウサギＩｇＧは、その発現が培養中に低下するために適切ではなく、したがってＢ細胞マーカーとして使用することができないために、培養後に、Ｂ細胞数に関して、増殖したＢ細胞クローンのサイズを推定することができなかった。本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体の使用は、ウサギＣＤ１９が培養後のＢ細胞上に依然として発現され、それによって培養後のＢ細胞を計数することを可能にするので、この問題を解決する（Ｂ細胞／ウェル＝ＣＤ１９＋ゲート中のイベント数／Ｆａｃｓされた体積×試料体積）。

以下の表では、培養後の３６個の単一ウェルのＢ細胞のカウント数（ＣＤ１９陽性ＰＩ－細胞）を示す。Ｂ細胞のカウント数は、広範囲にわたっていた。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞のカウント数の計算を、以下のように行った：ＦＡＣＳゲート中のカウント数／１５０（Ｆａｃｓされた体積）×２００（全試料体積）。

Ｂ細胞クローンが存在するたびに、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞を検出し、生きているフィーダー細胞を除外して計数することができた。Ｂ細胞クローンの細胞カウント数（＝細胞の総数）は、広範囲にわたって非常に不均一であることが分かる。

Ｂ細胞クローンのサイズは、Ｂ細胞増殖の成功のための非常に好適な代用マーカーである。さらに、Ｂ細胞クローンのサイズは、事前に選別されたＢ細胞集団と相関させることができ、ＥＬＩＳＡ結果は、システムのより良好な特徴付けを可能にする。

さらに、特に大過剰のフィーダー細胞において、増殖が遅い、ならびに産生性が低いＢ細胞を同定することが可能である。同時に、死んだフィーダー細胞は、染色および分析／選択プロセスを妨害しない。この特異的標識化により、（死んだまたは生きている）フィーダー細胞の存在下でのＢ細胞の計数を、培養物中（例えば、マルチウェルプレートのウェル中）で直接行うことが可能である。

本発明は、置く時の細胞の表面上のＣＤ１９レベルが、培養後に得られたＩｇＧ力価と正の相関がある、という知見に少なくとも部分的に基づく。この相関を、ウサギから単離した直後に、共培養を行う必要なしに、高産生Ｂ細胞を選択するために利用することができる。

本発明は、ＣＤ１９を利用して、ウサギＢ細胞を濃縮し、それによって、単一細胞選別のためのＢ細胞集団、例えばＩｇＧ＋Ｂ細胞集団を増加させ、それによって、望ましくない細胞の数を減少させることができる、という知見に少なくとも部分的に基づく。この理論に拘束されるものではないが、この特性は、とりわけ、改善された選別結果をもたらし得る。

本発明は、本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体が、ウサギ初代Ｂ細胞の同定に使用できる、という知見に少なくとも部分的に基づく。

本発明による抗体を用いて、例えば、ウサギＰＢＭＣまたはウサギ脾細胞などの試料中のＣＤ１９陽性Ｂ細胞の割合を決定することが可能であった。ＰＢＭＣに関する結果を、下表に示す。

０．２％～２％のウサギＰＢＭＣでＦＩＴＣ標識にコンジュゲートされた市販のヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ ＳＴＡＲ１２１Ｆ）（図６）。

細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗ＩｇＧ抗体、およびＡＰＣで標識された本発明による抗ウサギＣＤ１９抗体で、二重染色した。続いて、細胞をＦＳＣおよびＩｇＧについて、インデックス選別した。結果は、ＣＤ１９およびＩｇＧ陽性細胞のみが、その後のＥＬＩＳＡにおいて、ＩｇＧを産生したことを示す。次いで、選別されたＣＤ１９陽性細胞の割合についてチェックした。これを、本発明による抗体を使用することによって、どの程度の選別効率が改善され得るかを推定するための尺度として使用した。平均して、効率は、ＩｇＧおよびＣＤ１９二重陽性細胞のみを選別する場合に、約１４％改善することができ、最良の場合には、ＩｇＧ陽性細胞または抗原特異的細胞の有意な損失なしに、２０％超改善することができる。結果を下表に示す。

ビーズベースの選択／抽出プロセスのために、様々な条件を以下のように試験した：
－ ビオチン化抗原およびストレプトアビジンビーズによる磁気ビーズベースのパニング、その後のＦＳＣ、ならびにＩｇＧ（ＦＩＴＣ）およびＣＤ１９（ＡＰＣ）二重染色細胞の選別ゲーティング、ならびに
－ 本発明によるビオチン化抗ＣＤ１９抗体およびストレプトアビジンビーズによる磁気ビーズベースのパニング、その後のＦＣＳ、ならびにＩｇＧ（ＦＩＴＣ）および抗原（ＡＰＣ）二重染色細胞の選別ゲーティング。

どちらの場合も、７ＡＡＤを用いて、生死に関する染色を行った。

本発明による抗ＣＤ１９抗体によるパニングは、Ｂ細胞の生存率の（４倍高い）増加をもたらすことが見出された。この理論に拘束されるものではないが、架橋および活性化の減少のために、生存率の増加が引き起こされ得ると想定される。

本発明は、細胞の集団からＢ細胞を濃縮するためのパニング工程において、本発明による抗ＣＤ１９抗体を使用することによって、より高い割合の選別されたＢ細胞が、その後のＥＬＩＳＡに示されるように、抗原に特異的な抗体を産生している、という知見に少なくとも部分的に基づく。さらに、交差反応性アッセイで陽性の細胞も少なく、使用できるクローンの数が多くなる。これは、細胞の生存率の増加に関連し得る。

様々な免疫化キャンペーン（様々な抗原）からのＢ細胞を用いて得られた結果を、以下の表に示す。

Ａ．例示的な抗ウサギＣＤ１９抗体およびその使用
Ａ．１例示的な抗体
ウサギＣＤ１９は、ウサギＢ細胞の分析および特徴付けのために有利な細胞表面マーカーであることが見出された。表面提示されたＣＤ１９を介したウサギＢ細胞の標識化は、改善されたＢ細胞選別を可能にする。改善は、とりわけ、より特異的な標識化、それによる選別／単一細胞として置くこと、または／および処理されるＢ細胞の数が減少し、同時に抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の数が増加する、易化したプロセスである。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３２または３３または３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５または３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む、ウサギＣＤ１９に特異的に結合する単離された抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３２または３３または３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５または３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ウサギＣＤ１９に特異的に結合する単離された抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

一態様では、本明細書で、（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。

別の態様では、本明細書に記載の抗ウサギＣＤ１９抗体は、（ｉ）（ａ）配列番号３２または３３または３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５または３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉｉ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、本明細書に記載の抗ウサギＣＤ１９抗体は、（ｉ）（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉｉ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、本明細書に記載の抗ウサギＣＤ１９抗体は、（ｉ）（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉｉ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、本明細書に記載の抗ウサギＣＤ１９抗体は、（ｉ）（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＨ ＨＶＲ配列を含むＶＨドメイン、ならびに（ｉｉ）（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つすべてのＶＬ ＨＶＲ配列を含むＶＬドメインを含む。

別の態様では、ヒト化抗体である抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。一実施形態では、ヒト化抗ウサギＣＤ１９抗体は、上述の実施形態のうちのいずれかにあるようなＨＶＲを含み、アクセプタ・ヒト・フレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリン（生殖細胞系列）フレームワークまたはヒト・コンセンサス・フレームワークをさらに含む。

さらなる態様では、本明細書で、本明細書に記載の抗ウサギＣＤ１９抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。例えば、ある特定の実施形態では、配列番号３０のＶＨ配列および配列番号２６のＶＬ配列を含む抗ウサギＣＤ１９抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。

一実施形態では、上記の実施形態のいずれかによる抗ウサギＣＤ１９抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ウサギＣＤ１９抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）_２断片である。別の実施形態では、抗体は、全長抗体、例えば、本明細書で定義されるインタクトなＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体、または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。

すべての態様の一実施形態では、抗体は、
ｉ）任意で、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、または
ｉｉ）任意で、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、または
ｉｉｉ）変異（Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、およびＨ４３５Ａ、もしくは変異（Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、およびＹ４３６Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、または
ｉｖ）
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含むか、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含むか、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ領域、
または
ｖ）両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、ならびに
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含むか、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含むか、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含み、
または
ｖｉ）両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＬ２３５Ｅを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、ならびに
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含むか、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含むか、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含み、
または
ｖｉｉ）ｉｉｉ）のうちの１つと、ｖｉ）、ｖ）、およびｖｉ）のうちの１つとの組合せを含む（すべての位置は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）。

さらなる態様では、上記の実施形態のいずれかによる抗ウサギＣＤ１９抗体は、以下のセクションで記載される特徴のうちのいずれかを、単独で、または組合せで、組み込むことができる。

１．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載の他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片のレビューについては、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９～１３４を参照されたい。ｓｃＦｖ断片のレビューについては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、２６９～３１５頁を参照されたく、また国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号、および米国特許第５，５８７，４５８号も参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含む、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

ダイアボディは、二価または二重特異性であることができる、２つの抗原結合部位を伴う抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第０４０４０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９～１３４、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４～６４４８を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３９ １２９～１３４）にも記載されている。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。

抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作られてもよい。

２．キメラ抗体およびヒト化抗体
本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１～６８５５）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

ヒト化抗体は、キメラ抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親の非ヒト抗体の特異性および親和性は保持するようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその部分）が非ヒト抗体由来であり、かつＦＲ（またはその部分）がヒト抗体配列由来である、１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、少なくとも一部分のヒト定常領域も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

ヒト化抗体およびその作成方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．およびＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９～１６３３でレビューされ、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３～３２９、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９～１００３３、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、および米国特許第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２５～３４（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトの記述）、Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１９９１）４８９～４９８（「表面再構成」の記述）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）４３～６０（「ＦＲシャッフリング」の記述）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）６１～６８およびＫｌｉｍｋａ，Ａ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８３（２０００）２５２～２６０（ＦＲシャッフリングの「ガイド付き選択」アプローチの記述）に、さらに記載されている。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、「ベストフィット」方法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２２９６～２３０８を参照）、軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５～４２８９、およびＰｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１（１９９３）２６２３～２６３２を参照）、ヒト成熟（体細胞性変異を受けた）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．およびＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９～１６３３を参照）、およびＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１０６７８～１０６８４およびＲｏｓｏｋ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６９ ２２６１１～２２６１８を参照）が挙げられる。

３．抗体バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、調製されてもよい。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入、および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有するという条件で、最終構築物に到達するように行うことができる。

ａ）置換、挿入、および欠失バリアント
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による変異導入に関して、目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換を、以下の表の「好ましい置換」という見出しの下に示す。より実質的な変化を表１に「例示的な置換」の見出しの下に示し、またアミノ酸側鎖クラスに関して下にさらに記載する。アミノ酸置換が目的の抗体に導入され、生成物は所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。

アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ化され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。

ある種類の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなるの研究のために選択される、結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修飾（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有する。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法などを使用して、簡便に生成されてもよい。簡潔には、１つまたは複数のＨＶＲ残基が変異を受け、バリアント抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

改変（例えば、置換）をＨＶＲに行い、例えば、抗体親和性を改善することができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７（２００８）１７９～１９６を参照）、および／または抗原と接触する残基で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨまたはＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築およびそれからの再選択による親和性成熟については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８（２００２）１～３７に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異導入）のうちのいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリがスクリーニングされて、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が、標的にされることが多い。

ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、このような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に行われてもよい。このような改変は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外側であり得る。上に提供されるバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されていないか、または１つ以下、２つ以下、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。

変異導入のために標的とされ得る、抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．およびＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）１０８１～１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを判定する。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、または取り除かれてもよい。バリアントは、所望の特性を有するかどうかを判定するためにスクリーニングされてもよい。

アミノ酸配列挿入には、１残基から１００残基以上を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入型バリアントには、抗体のＮ末端もしくはＣ末端に、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものが含まれる。

ｂ）グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つまたは複数のグリコシル化部位が創出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を改変させることによって、簡便に達成され得る。

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合される分岐状の二分岐型オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、ＴＩＢＴＥＣＨ １５（１９９７）２６～３２を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体中のオリゴ糖の修飾は、ある特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作成するために行われてもよい。

一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定される場合、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖鎖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（ＫａｂａｔによるＦｃ領域残基のＥＵ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のマイナーな配列変化に起因して、２９７位の上流または下流、すなわち２９４位と３００位との間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（２００４）１２３９～１２４９、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４～６２２が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ，Ｊ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９（１９８６）５３３～５４５、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、および国際公開第２００４／０５６３１２、特に実施例１１）、およびα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２００４）６１４～６２２、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４（２００６）６８０～６８８、および国際公開第２００３／０８５１０７号）などのノックアウト細胞株を挙げることができる。

例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐型オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアントがさらに提供される。このような抗体バリアントは、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号、米国特許第６，６０２，６８４号、および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する、抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、国際公開第１９９８／５８９６４号、および国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。

ｃ）Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによって、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。

ある特定の実施形態では、本明細書で、すべてではないが、いくつかのエフェクター機能を保有する抗体バリアントが提供され、該抗体バリアントは、インビボでの抗体の半減期が重要であり、その上、ある特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる。インビトロおよび／またはインビボ細胞毒性アッセイを行うことにより、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことにより、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．およびＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７～４９２の４６４頁、表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１９８６）７０５９～７０６３、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）１４９９～１５０２を参照）、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１～１３６１を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１９９８）６５２～６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行い、抗体がＣ１ｑに結合することができないために、ＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２（１９９６）１６３～１７１、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０１（２００３）１０４５～１０５２、ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３（２００４）２７３８～２７４３を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合およびインビボでのクリアランス／半減期の決定はまた、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（２００６：１７５９～１７６９を参照されたい）。

低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

ＦｃＲに対する結合が、向上または減少したある特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１～６６０４を参照されたい。）

ある特定の実施形態では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。

いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８～４１８４に記載されているように、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（すなわち、向上または減少のいずれか）をもたらすＦｃ領域中で改変が行われる。

半減期が長くなり、母体のＩｇＧの胎児への移行を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した抗体（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７～５９３、およびＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９～２４３４）は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域の、ＦｃＲｎへの結合を改善する、１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つまたは複数での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するバリアントが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。

Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８～７４０、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、ならびに国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。

ｄ）システインが改変された抗体バリアント
ある特定の実施形態では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン改変抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分またはリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートして、本明細書にさらに記載されているように、イムノコンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ付番）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。システイン改変抗体を、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように、生成することができる。

Ａ．２つの例示的な使用
本発明による抗ウサギＣＤ－１９抗体を、ウサギＢ細胞の特異的標識化および検出を必要とする任意の方法で使用することができる。

個々の方法は、
ｉ）Ｂ細胞またはＢ細胞クローンを、Ｂ－細胞または他の細胞の集団から単離し、それによって単離されたＢ細胞またはＢ細胞クローンが標的に特異的に結合する抗体を産生するため、
ｉｉ）単一細胞として置かれたＢ細胞の共培養をするため、
ｉｉｉ）計数するおよび選択する／置くために、Ｂ細胞を標識化するため、ならびに
ｉｖ）抗体を産生するため
の方法である。

方法と同時に、対応する使用も包含され、開示される。

一態様は、
ａ）ウサギの血液からＢ細胞を得る工程、
ｂ）Ｂ細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

一実施形態では、方法は、
工程ｂ）の後かつ工程ｃ）の前における、Ｂ細胞を共培養培地中で３７℃で１時間インキュベートする工程、
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を（個々の容器に）置く工程、
ｄ）該置かれた細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、
ｅ）工程ｄ）で増殖しているＢ細胞を選択し、それによって、Ｂ細胞を選択する工程
のうちの１つまたは複数をさらに含む。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）本発明による標識抗体の結合に基づいて、ＦＡＣＳによって単一細胞として置かれたＢ細胞の集団のＢ細胞のそれぞれを、フィーダー細胞としてのマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞と共培養する工程、および
ｂ）工程ａ）において、増殖し、かつ抗体を分泌するＢ細胞クローンを選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）本発明による標識抗体の結合に基づいて、ＦＡＣＳによって、個々の容器に置かれたＢ細胞の集団の１つまたは複数のＢ細胞を、任意で、フィーダー細胞としてのマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞、ならびにフィーダー混合物としてのＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数の存在下で、共培養する工程、
ｂ）標的抗原に特異的に結合する抗体を産生する、Ｂ細胞クローンを選択する工程、
ｂ１）逆転写ＰＣＲによって該抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を決定する工程、
ｂ２）該抗体軽鎖可変ドメインおよび該重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む核酸で、細胞をトランスフェクトする工程、ならびに
ｃ）工程ｂ）で選択されたＢ細胞クローンによって産生される抗体またはそのヒト化バリアントをコードする核酸を含有する細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収することによって、抗体を産生する工程
を含む、標的抗原に結合する抗体を産生するための方法である。

本明細書に記載の一態様は、
－ 多数のウサギＢ細胞を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体とインキュベートする工程／多数のウサギＢ細胞の個々のＢ細胞を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体で標識する工程、
－ 本発明による抗体が表面上に結合している／個々のＢ細胞（単一細胞として置かれたＢ細胞）またはＢ細胞のプールのいずれかとして標識されている、１つまたは複数のウサギＢ細胞を選択する／置く工程、および
－ 該単一細胞として置かれたウサギＢ細胞または該ウサギＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程、
－ 任意で、共培養後に、得られた細胞混合物を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体とインキュベートし、本発明による抗体がその表面上に結合している／標識されている、ウサギＢ細胞を選択する／置く／計数する工程
を含む、１つまたは複数のウサギＢ細胞を共培養するための方法である。

本発明の一態様は、
ａ）単一細胞として置かれたＢ細胞またはＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している１つまたは複数の細胞を選択し、それによってＢ細胞を選択し、細胞の混合物から非Ｂ細胞を除去する工程
を含む、細胞の混合物（例えば、培養物）について非Ｂ細胞を除去する方法である。

本発明による一態様は、
ａ）単一細胞として置かれたＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの細胞を、本発明による抗体とインキュベートする工程、および
ｃ）本発明による抗体が結合している細胞の数を数えることによって、培養物中のＢ細胞の数を決定する工程
を含む、単一細胞として置かれたＢ細胞とフィーダー細胞との共培養物中のＢ細胞の数を決定するための方法である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、共培養は、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４およびＩＬ－６から選択される１種または複数種を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー細胞は、ＥＬ－４ Ｂ５細胞である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー細胞の数（共培養の開始時）は、Ｂ細胞あたり５×１０^４個未満である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー細胞は、共培養の前に放射線照射されている。一実施形態では、放射線照射は、約５０Ｇｙ以下の線量によるものである。一実施形態では、放射線照射は、９．５Ｇｙ以下および０Ｇｙ超の線量によるものである。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、ＥＬ－４ Ｂ５細胞の数は、Ｂ細胞あたり１×１０^４個未満のＥＬ－４ Ｂ５細胞である（これによって、この実施形態では、放射線照射は０Ｇｙである）。一実施形態では、ＥＬ－４ Ｂ５細胞の数は、Ｂ細胞あたり７．５×１０^３個未満のＥＬ－４ Ｂ５細胞である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、共培養は、追加でフィーダー混合物の存在下で行われる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物（サイトカイン混合物、ＣＭ）は、
ｉ）インターロイキン－１βおよび腫瘍壊死因子α、
ｉｉ）インターロイキン－２（ＩＬ－２）および／またはインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、
ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ株の細胞（ＳＡＣ）、
ｉｖ）インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、および任意で、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、
ｖ）腫瘍壊死因子ファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、
ｖｉ）インターロイキン－６（ＩＬ－６）、
ｖｉｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）、ならびに
ｖｉｉｉ）胸腺細胞培養上清のうちの１つまたは複数を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、
最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１β、
最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＴＮＦα、
最大約５０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－２、
最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１０、および
最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－６、
またはその一部を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、
５．５～１４×１０^８ＩＵ／ｍｇを有する最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１β、
２．３～２．９×１０^８Ｕ／ｍｇを有する最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＴＮＦα、
６～７（好ましくは６．３）×１０^６ＩＵ／ｍｇを有する最大約５０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－２、
６～７．５×１０^５ＩＵ／ｍｇを有する最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１０、および
９．２～１６．１×１０^８Ｕ／ｍｇを有する最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－６、
またはその一部を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物の割合は、前記ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、およびＩＬ－６の各濃度の１．０～０．０１５倍の範囲である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物の割合は、前記ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、およびＩＬ－６の各濃度の０．７５倍、０．５倍、０．３２倍、０．２５倍、０．１倍、０．０６６倍、０．０３２倍、０．０１５倍、０．０１倍、０．００７５倍、および０．００３８倍からなる割合の群から選択される。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～１．０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）をさらに含む。一実施形態では、フィーダー混合物は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～０．５ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテートをさらに含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、１つまたは複数のＢ細胞の（共）培養は、
－ フィーダー混合物の存在下で、１つまたは複数のＢ細胞を、ＥＬ－４ Ｂ５細胞と共培養する工程を含み、
該共培養の前に、該ＥＬ－４ Ｂ５細胞に９．５Ｇｙ以下の線量で放射線照射し、
（共培養の開始時の）ＥＬ－４ Ｂ５細胞の数が、Ｂ細胞あたり４×１０^４個未満のＥＬ－４ Ｂ５細胞であり、
該フィーダー混合物は、
５．５～１４×１０^８ＩＵ／ｍｇを有する最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１β、
２．３～２．９×１０^８Ｕ／ｍｇを有する最大約２ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＴＮＦα、
６～７（好ましくは６．３）×１０^６ＩＵ／ｍｇを有する最大約５０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－２、
６～７．５×１０^５ＩＵ／ｍｇを有する最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－１０、および
９．２～１６．１×１０^８Ｕ／ｍｇを有する最大約１０ｎｇ／ｍｌの（マウス）ＩＬ－６、
または前記ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、およびＩＬ－６の各濃度の０．７５倍、０．５倍、０．３２倍、０．２５倍、０．１倍、０．０６６倍、０．０３２倍、０．０１５倍、０．０１倍、０．００７５倍、または０．００３８倍の割合を含み、
該フィーダー混合物は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ～１．０ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテートをさらに含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ株の細胞（ＳＡＣ）および胸腺細胞培養上清を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、方法は、１つのＢ細胞の共培養のためのものである。１つの好ましい実施形態では、１つのＢ細胞は、単一細胞として置かれたＢ細胞である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、共培養は、５～１０日間である。１つの好ましい実施形態では、共培養は約７日間である。

本明細書に記載の一態様は、本明細書に記載の共培養法を含む、抗体を産生するための方法である。

本明細書に記載のすべての方法および使用は、
－ フィーダー混合物が補充された共培養培地中で、フィーダー細胞とＢ細胞（単一細胞として置かれた各Ｂ細胞、またはプールされたＢ細胞）を（個々に）共培養する工程
を含む。

共培養の結果は、Ｂ細胞クローン、すなわち、単一のＢ細胞の子孫であるＢ細胞の集団である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、共培養工程の前に、
－ 本発明による標識抗体と接触させ、それによって、Ｂ細胞にフルオロフォアが結合したおよび／または結合していない、Ｂ細胞の集団のそれらのＢ細胞を、１つまたは複数の個々の容器に置く工程
をさらに含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、共培養工程の前に、
－ 本発明による標識抗体と接触させ、それによって、フルオロフォアがＢ細胞に結合したおよび／または結合していない、Ｂ細胞の集団のそれらのＢ細胞を、単一Ｂ細胞として置く工程
をさらに含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、共培養工程の前に、
－ 本発明による抗体、および異なるＢ細胞表面抗原にそれぞれ特異的に結合する１～４個の追加の抗体（これらの抗体は、単一細胞として１～５個の蛍光色素で標識され、それによって、各抗体が異なる蛍光色素にコンジュゲートされている）と接触させたＢ細胞の集団のこれらのＢ細胞を置く工程
をさらに含む。

標識化は、Ｂ細胞集団を（順次または同時に）蛍光標識抗体と接触させることによる。これによって、標識されたＢ細胞の調製物が得られる。蛍光標識された抗体のそれぞれは、異なるＢ細胞表面マーカー／標的に結合する。

置くことは、標識されたＢ細胞調製物をフローサイトメーターに導入し、それらの細胞を１～３個の蛍光標識で標識された単一細胞として置くことによる。セルソーターにおいて細胞を選択するために使用されるものと同様に、より多くの蛍光色素と細胞をインキュベートすることが可能であるので、細胞を、特定の表面マーカーの存在について選択することができ、（任意で）同時に他の表面マーカーの非存在について選択することができる。

標識化および単一細胞を置くことは、意図された特徴を有する抗体を産生する可能性が低いＢ細胞を枯渇させることによって、Ｂ細胞集団の複雑性を低減するために行われる。標識された抗体は、Ｂ細胞の表面上にディスプレイされた特定のポリペプチドに結合し、したがって、陽性選択標識を提供する。同様に、例えば、２つのうちの１つの蛍光標識を有する細胞（すなわち、２つの蛍光標識抗体とのインキュベーションが行われたが、そのうちの１つのみがＢ細胞に結合する）など、Ｂ細胞がインキュベートされた標識抗体の数と比較して、減少した数の蛍光色素でのみ標識された細胞を選択することも可能である。Ｂ細胞集団の個々のＢ細胞への蛍光標識抗体の結合／非結合に基づいて、マイクロ流体選別装置を使用して、標的Ｂ細胞を同定および分離することが可能である。選択と同時に、標識の量も決定することができる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、単一細胞を置く間／前に、共培養培地中でフィーダー細胞なしで／フィーダー細胞の非存在下で、Ｂ細胞の集団をインキュベートする工程をさらに含む。一実施形態では、インキュベーションは、約３７℃である。一実施形態では、インキュベーションは、約０．５～約２時間である。一実施形態では、インキュベーションは、約１時間である。１つの好ましい実施形態では、インキュベーションは、約３７℃で約１時間である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、置く工程の後かつ共培養工程の前であるが、ＥＬ－４ Ｂ５フィーダー細胞の添加後に、単一細胞を置くことＢ細胞を遠心分離する工程をさらに含む。この理論に拘束されるものではないが、それによって、フィーダー細胞とＢ細胞との間の物理的接触が増加すると想定される。一実施形態では、遠心分離は、約１分～約３０分間である。一実施形態では、遠心分離は、約５分間である。一実施形態では、遠心分離は、約１００×ｇ～約１，０００×ｇである。一実施形態では、遠心分離は、約３００×ｇである。１つの好ましい実施形態では、遠心分離は、約３００×ｇで約５分間である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞（クローン）を選択する／得るための方法は、以下の工程をさらに含む：
ａ）Ｂ細胞の集団のＢ細胞を、（１～５つの）蛍光色素で（任意で、２～５つの異なる所定のＢ細胞表面マーカーに特異的に結合する２～５つの蛍光標識抗体とＢ細胞集団をインキュベートすることによって）標識する工程であって、そのうちの１つが本発明による抗体（にコンジュゲートされたもの）である、標識する工程、
ｂ）任意で、共培養培地中で標識された細胞をインキュベートする工程、
ｃ）９．５Ｇｙ以下の線量で放射線照射されたＥＬ－４ Ｂ５フィーダー細胞上の単一細胞として、少なくとも１つ（１つから５つ）の蛍光色素で標識された（および、任意で、他の蛍光色素で標識されていない）Ｂ細胞の集団のそれらのＢ細胞を置く工程、
ｄ）任意で、単一細胞として置かれたＢ細胞／フィーダー細胞混合物を遠心分離する工程、
ｅ）フィーダー混合物が補充された共培養培地中で、単一細胞として置かれた各Ｂ細胞をフィーダー細胞（個々に）共培養する工程、
ｆ）工程ｅ）において抗体を増殖および分泌するＢ細胞クローンを選択する工程。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、標的に特異的に結合する抗体を産生するための方法は、以下の工程をさらに含む：
ａ）Ｂ細胞の集団のＢ細胞を（１～５つの）蛍光色素で（任意で、２～５つの異なる所定のＢ細胞表面マーカーに特異的に結合する２～５つの蛍光標識抗体とＢ細胞集団をインキュベートすることによって）標識する工程であって、そのうちの１つが本発明による抗体（にコンジュゲートされたもの）である、標識する工程、
ｂ）任意で、共培養培地中で細胞をインキュベートする工程、
ｃ）９．５Ｇｙ以下の線量で放射線照射された単一細胞ＥＬ－４ Ｂ５フィーダー細胞として、少なくとも１つ（１つから５つ）の蛍光色素で標識された（および、任意で、他の蛍光色素で標識されていない）Ｂ細胞の集団のそれらのＢ細胞を置く工程、
ｄ）任意で、単一細胞として置かれたＢ細胞／フィーダー細胞混合物を遠心分離する工程、
ｅ）フィーダー混合物が補充された共培養培地中で、単一細胞として置かれた各Ｂ細胞をフィーダー細胞と（個々に）共培養する工程、
ｆ）抗体を分泌する工程ｅ）のＢ細胞クローンを選択する工程、
ｇ）ｉ）工程ｇ）で選択されたＢ細胞クローンから分泌された抗体の可変ドメインをコードする、１つまたは複数の核酸を得る工程、
ｉｉ）Ｂ細胞クローンが可変ドメインをヒト化するヒトＢ細胞クローンではない場合、それぞれをコードする核酸を提供する工程、および
ｉｉｉ）定常領域をコードする核酸配列とインフレームで、１つまたは複数の発現ベクターに、１つまたは複数の核酸を導入する工程、
ｈ）工程ｇ）の１つまたは複数の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞（任意で、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞から選択される）を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収し、それによって、抗体を産生する工程。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、抗体を産生するための方法は、以下の工程をさらに含む：
ａ）Ｂ細胞の集団のＢ細胞を（１～５つの）蛍光色素で（任意で、２～５つの異なる所定のＢ細胞表面マーカーに特異的に結合する２～５つの蛍光標識抗体とＢ細胞集団をインキュベートすることによって）標識する工程であって、そのうちの１つが本発明による抗体に（にコンジュゲートされたもの）である、標識する工程、
ｂ）任意で、共培養培地中で細胞をインキュベートする工程、
ｃ）９．５Ｇｙ以下の線量で放射線照射されたＥＬ－４ Ｂ５フィーダー細胞上の単一細胞として、少なくとも１つ（１つから５つ）の蛍光色素で標識された（および、任意で、他の蛍光色素で標識されていない）Ｂ細胞の集団のそれらのＢ細胞を置く工程、
ｄ）任意で、単一細胞として置かれたＢ細胞／フィーダー細胞混合物を遠心分離する工程、
ｅ）フィーダー混合物が補充された共培養培地中で、単一細胞として置かれた各Ｂ細胞をフィーダー細胞と（個々に）共培養する工程、
ｆ）共培養されたＢ細胞の培養培地中に分泌された抗体の結合特異性を、各上清について個別に決定する工程、
ｇ）分泌された抗体の結合特性に基づいて、工程ｆ）のＢ細胞クローンを選択する工程、
ｈ）逆転写ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定によって、工程ｇ）で選択されたＢ細胞クローンから分泌された抗体の可変ドメインをコードする、１つまたは複数の核酸を得る工程（および、それによって、モノクローナル抗体可変軽鎖および重鎖ドメインをコードする核酸を得る工程）、
ｉ）Ｂ細胞が、可変軽鎖および重鎖可変ドメインをヒト化する非ヒトＢ細胞である場合、ヒト化可変ドメインをコードする核酸を提供する工程、
ｊ）モノクローナル抗体可変軽および重鎖可変ドメインをコードする核酸を、（ヒトまたはヒト化）抗体を発現させるために、１つまたは複数の発現ベクターに、（抗体定常ドメインをコードする核酸とインフレームで）導入する工程、
ｋ）（任意で、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞から選択される）哺乳動物細胞に発現ベクター（複数可）を導入する工程、
ｌ）細胞を培養し、細胞または細胞培養上清から抗体を回収し、それによって、抗体を産生する工程。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞クローンから分泌抗体の可変ドメインをコードする、１つまたは複数の核酸を得ることは、以下の工程をさらに含む：
－ 抗体産生Ｂ細胞クローンから全ＲＮＡを抽出する工程、
－ 抽出されたポリＡ^＋ｍＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡ合成／逆転写を行う工程、
－ 種特異的プライマーのセットを用いてＰＣＲを行う工程、
－ 任意で、ＰＣＲプライマーの除去／ＰＣＲ産物の精製工程、
－ 任意で、該ＰＣＲ産物の配列決定をする工程。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、核酸をコードするモノクローナル抗体可変軽および／または重鎖可変ドメインを、（ヒトまたはヒト化）抗体の発現のために、発現ベクターに導入することは、以下の工程をさらに含む：
－ 可変軽および重鎖可変ドメインのＴ４ポリメラーゼインキュベーション工程、
－ 発現ベクターの線形化および増幅工程、
－ 増幅された発現ベクターのＴ４ポリメラーゼインキュベーション工程、
－ 増幅された発現ベクターへ、可変ドメインをコードする核酸を、配列およびライゲーション非依存的にクローニングする工程、ならびに
－ ベクターで形質転換された大腸菌細胞のプールからのベクター（複数可）の調製工程。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、方法は、標識化工程の直前に、
－ Ｂ細胞の集団を、可溶性、蛍光標識された、または固体表面上に固定化された（標的）抗原とインキュベートし、（固定化された）抗原に結合したＢ細胞（のみ）を回収する工程
をさらに含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞の集団は、免疫化の少なくとも４日後に、ウサギの血液から得られる。一実施形態では、Ｂ細胞の集団は、免疫化の４日後から最大で１３日後までに、ウサギの血液から得られる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞の集団は、密度勾配遠心分離によって、血液から得られる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞は、成熟Ｂ細胞である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、単一細胞は、マルチウェルプレートのウェルに（個別に）置かれる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、天然胸腺細胞培養上清（ＴＳＮ）または定義されたおよび／もしくは合成フィーダー混合物である。一実施形態では、胸腺細胞培養上清は、若齢動物の胸腺の胸腺細胞から得られる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、定義されたおよび／または合成フィーダー混合物である。一実施形態では、定義されたおよび／または合成フィーダー混合物は、
ｉ）インターロイキン－１βおよび腫瘍壊死因子α、ならびに／または
ｉｉ）インターロイキン－２（ＩＬ－２）および／もしくはインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ならびに／または
ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ株の細胞（ＳＡＣ）、ならびに／または
ｉｖ）インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）および、任意で、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ならびに／または
ｖ）腫瘍壊死因子ファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、ならびに／または
ｖｉ）インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ならびに／または
ｖｉｉ）インターロイキン－４（ＩＬ－４）
を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－α、ならびにＩＬ－１０、ＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数種を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、フィーダー混合物は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＳＡＣ、およびＩＬ－２を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞集団はウサギＢ細胞集団であり、フィーダー混合物は胸腺細胞培養上清である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞集団はウサギＢ細胞集団であり、フィーダー混合物はＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０のうちのいずれか２つからなる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞集団はウサギＢ細胞集団であり、フィーダー混合物はＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－１０からなる。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞集団はウサギＢ細胞集団であり、フィーダー混合物はＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１０、ＳＡＣ、およびＩＬ－２またはＩＬ－６を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、Ｂ細胞集団はウサギＢ細胞集団であり、フィーダー混合物はＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２１、ならびに少なくとも１つのＩＬ－２、ＩＬ－１０、およびＩＬ－６を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、標識化は、Ｂ細胞表面ＩｇＧの標識である。

すべての対応する態様または実施形態の１つの好ましい実施形態では、インキュベーションは、本発明による蛍光標識抗体、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体、および蛍光標識抗ＩｇＭ抗体（標識化は、細胞表面ＩｇＧおよび細胞表面ＩｇＭのものである）とのインキュベーションであり、選択は、細胞表面ＣＤ１９、細胞表面ＩｇＧに対して陽性、および細胞表面ＩｇＭに対して陰性の細胞の選択である（ＣＤ１９^＋ＩｇＧ^＋ＩｇＭ^－Ｂ細胞を単一細胞として置くことをもたらす）。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、インキュベーションは、本発明による蛍光標識抗体、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体、および蛍光標識抗軽鎖抗体（標識化は、細胞表面ＩｇＧおよび細胞表面抗体軽鎖のものである）とのインキュベーションであり、選択は、細胞表面ＣＤ１９、細胞表面ＩｇＧ、および細胞表面抗体軽鎖に対して陽性の細胞の選択である（ＩｇＧ＋ＬＣ＋Ｂ細胞を単一細胞として置くことをもたらす）。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、インキュベーションは、蛍光標識抗軽鎖抗体（標識化は、他の２つの標識に加えて、細胞表面抗体軽鎖のものである）に加えて行われ、選択は、細胞表面抗体軽鎖に対して陽性の細胞の選択である（ＬＣ＋Ｂ細胞を単一細胞として置くことをもたらす）。

すべての対応する態様または実施形態の１つの好ましい実施形態では、インキュベーションは、本発明による蛍光標識抗体、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体、および蛍光標識抗ＩｇＭ抗体（標識化は、細胞表面ＣＤ１９、細胞表面ＩｇＧ、および細胞表面ＩｇＭのものである）とのインキュベーションであり、選択は、細胞表面ＣＤ１９およびＩｇＧに対して陽性であり、細胞表面ＩｇＭに対して陰性である細胞の選択であり（ＣＤ１９^＋ＩｇＧ^＋ＩｇＭ^－Ｂ細胞を単一細胞として置くことをもたらす）、それによって、Ｂ細胞の集団は、固体表面上に固定化された（標的）抗原とインキュベートされており、固定化された抗原に結合したＢ細胞（のみ）が回収され、蛍光標識抗体とのインキュベーションに供された。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、共培養は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１％（ｗ／ｖ）の２００ｍＭグルタミン溶液、２％（ｖ／ｖ）の１００ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液、および１％（ｖ／ｖ）の１Ｍの２－（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジン）－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む共培養培地中で行われる。一実施形態では、共培養培地は、０．０５ｍＭのβ－メルカプトエタノールをさらに含む。

さらなる方法では、本発明による抗体またはそのウサギＣＤ１９結合断片を固相に固定化し、ウサギＣＤ１９陽性Ｂ細胞を捕捉するために使用する。固体表面は、マルチウェルプレートまたはビーズ、特に磁気ビーズのウェルを含む、任意の表面によるものであり得る。本発明によるこれらの固定化抗体は、本発明による標識抗体と同様の様式で、すなわちウサギＣＤ１９陽性Ｂ細胞に選択的に結合するために使用することができる。当業者は、上記の方法におけるＦＡＣＳベースの工程をビーズベースのアプローチに置き換える方法を知っている。

例えば、本発明の一態様は、
ａ）ウサギの血液からＢ細胞を得る工程、
ｂ）ビーズに固定化された本発明による抗体と、Ｂ細胞をインキュベートする工程、
ｃ）結合していないＢ細胞を除去するために、ビーズを洗浄する工程、および
ｄ）任意で、ビーズからＢ細胞を回収し、それによって、本発明による抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、ビーズは、磁気ビーズである。さらなる実施形態では、方法は、工程ｂ）の後かつ工程ｃ）の前に、ビーズを磁石に結合させるｂｃ）の工程を含む。

すべての対応する態様または実施形態の一実施形態では、方法は、
ｄ）任意で、Ｂ細胞を共培養培地中で３７℃で１時間インキュベートする工程、
ｅ）１つまたは複数のＢ細胞またはビーズを、個々の容器に置く工程、
ｆ）該置かれた細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、
ｇ）工程ｆ）で増殖しているＢ細胞を選択し、それによってＢ細胞を選択する工程
のうちの１つまたは複数をさらに含む。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）それ自体が固体表面に結合された本発明による抗体に結合することによって、Ｂ細胞の元々の集団から得られたＢ細胞の濃縮集団の各Ｂ細胞を、フィーダー細胞としてマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞と共培養する工程、および
ｂ）工程ａ）において、増殖し、かつ抗体を分泌するＢ細胞クローンを選択する工程
を含む、Ｂ細胞を選択するための方法である。

本明細書に記載の一態様は、
ａ）それ自体が固体表面に結合された本発明による抗体に結合することによって、Ｂ細胞の元々の集団から得られた、Ｂ細胞の濃縮集団の１つまたは複数のＢ細胞を、任意で、フィーダー細胞としてのマウスＥＬ－４ Ｂ５細胞、ならびにフィーダー混合物としてのＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数の存在下で、共培養する工程と、
ｂ）標的抗原に特異的に結合する抗体を産生する、Ｂ細胞クローンを選択する工程と、
ｂ１）逆転写ＰＣＲによって該抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を決定する工程と、
ｂ２）該抗体軽鎖可変ドメインおよび該重鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む核酸で、細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）工程ｂ）で選択されたＢ細胞クローンによって産生される抗体またはそのヒト化バリアントをコードする核酸を含有する細胞を培養し、細胞または培養上清から抗体を回収することによって、抗体を産生する工程と
を含む、標的抗原に結合する抗体を産生するための方法である。

本明細書に記載の一態様は、
－ 多数のウサギＢ細胞を、固体表面に結合された本発明による抗体とインキュベートする工程／多数のウサギＢ細胞の個々のＢ細胞を、固体表面に結合された本発明による抗体で標識する工程、
－ 個々のＢ細胞（単一細胞として置かれたＢ細胞）またはＢ細胞のプールのいずれかとして、本発明による抗体が表面上に結合している、１つまたは複数のウサギＢ細胞を選択する／置く工程、および
－ 該単一細胞として置かれたウサギＢ細胞または該ウサギＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程、
－ 任意で、共培養後に、得られた細胞混合物を、検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明による抗体とインキュベートし、本発明による抗体がその表面上に結合している／標識されている、ウサギＢ細胞を選択する／置く／計数する工程
を含む、１つまたは複数のウサギＢ細胞を共培養するための方法である。

Ｂ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法および組成物を使用して生産されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載の抗ヒトＣＤ１９抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらベクターで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。一実施形態では、抗ウサギＣＤ１９抗体を作成する方法が提供され、該方法は、上に提供されるように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。

抗ウサギＣＤ１９抗体の組換え産生のために、例えば、上述のものなどの抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞中でさらなるクローニングおよび／または発現のために、１つまたは複数のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００３）、２４５～２５４頁も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。

原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌または酵母は、抗体をコードするベクターに適切なクローニングまたは発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株および酵母株を含み、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９～１４１４、およびＬｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０～２１５を参照されたい。

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、これを昆虫細胞と共に、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。

植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号、および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記述）を参照されたい。

脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胎児腎細胞株（例えば、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９～７４）に記載されるような、２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３～２５２に記載されるような、ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４～６８に記載されるようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞がある。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ^－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６～４２２０）、ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０、およびＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞のレビューについては、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．およびＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５－２６８頁を参照されたい。

Ｃ．診断および検出のための方法および組成物
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ウサギＣＤ１９抗体はいずれも、生物学的試料中のウサギＣＤ１９提示細胞の存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出すること」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、細胞または組織、例えば、血液、血清または血漿などを含む。

一実施形態では、診断または検出の方法で使用するための抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。これらの態様は、上で概説されている。

ある特定の実施形態では、標識された抗ウサギＣＤ１９抗体が提供される。標識には、直接的に検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識など）、ならびに例えば、酵素的反応または分子相互作用を介して間接的に検出される部分（酵素またはリガンドなど）が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：放射性同位元素^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、および^１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体などのフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどとカップリングしたもの。

ＩＩＩ．配列表の説明
配列番号０１ シグナルペプチドを伴わないウサギＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０２ シグナルペプチドを伴うウサギＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０３ ウサギＣＤ１９ ｃＤＮＡ
配列番号０４ ハムスターＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０５ マウスＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０６ ラットＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０７ リスＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０８ マーモセットＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号０９ アカゲザルＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１０ ヒトＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１１ ネコＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１２ ハダカデバネズミＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１３ モルモットＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１４ ブタＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１５ イヌＣＤ１９アミノ酸配列
配列番号１６ ギャップコンセンサスアミノ酸配列
配列番号１７ プライマー
配列番号１８ プライマー
配列番号１９ プライマー
配列番号２０ プライマー
配列番号２１ プライマー
配列番号２２ プライマー
配列番号２３ プライマー
配列番号２４ 抗体１Ｈ２軽鎖アミノ酸配列
配列番号２５ 抗体１Ｈ２軽鎖リーダーペプチドアミノ酸配列
配列番号２６ 抗体１Ｈ２軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
配列番号２７ 抗体１Ｈ２軽鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号２８ 抗体１Ｈ２重鎖アミノ酸配列
配列番号２９ 抗体１Ｈ２重鎖リーダーペプチドアミノ酸配列
配列番号３０ 抗体１Ｈ２重鎖可変ドメインアミノ酸配列
配列番号３１ 抗体１Ｈ２重鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号３２ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－１バリアント１
配列番号３３ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－１バリアント２
配列番号３４ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－１バリアント３
配列番号３５ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－２バリアント１
配列番号３６ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－２バリアント２
配列番号３７ 抗体１Ｈ２重鎖ＨＶＲ－３
配列番号３８ 抗体１Ｈ２軽鎖ＨＶＲ－１
配列番号３９ 抗体１Ｈ２軽鎖ＨＶＲ－２
配列番号４０ 抗体１Ｈ２軽鎖ＨＶＲ－３
配列番号４１ ヒトカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号４２ ヒトラムダ軽鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号４３ ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列：コーカサスアロタイプ
配列番号４４ ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列：アフロアメリカンアロタイプ
配列番号４５ ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列：ＬＡＬＡバリアント
配列番号４６ ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列：ＬＡＬＡＰＧバリアント
配列番号４７ ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号４８ ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＰＬＥバリアント
配列番号４９ ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域アミノ酸配列：ＳＰＬＥＰＧバリアント
配列番号５０ マウスカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号５１ ヒトラムダ軽鎖定常領域アミノ酸配列
配列番号５２ ＧＰＩアンカーアミノ酸配列
配列番号５３ ３’ＵＴＲプライマー
配列番号５４ ５’ＵＴＲプライマー

ＩＶ．図面の説明
図１：ＦＬＡＧタグに融合したウサギＣＤ１９の発現プラスミドでトランスフェクトされた組換えマウス細胞のＦＡＣＳ解析。ウサギＣＤ１９の発現を、ＦＩＴＣ標識抗ＦＬＡＧタグ抗体を使用した細胞表面染色によって、間接的に確認した。 Ａ：ＮＩＨ／３Ｔ３、リポフェクタミンを使用した通常のトランスフェクション、トランスフェクションの２４時間後； Ｂ：Ｃ２Ｃ１２、リポフェクタミンを使用した通常のトランスフェクション、トランスフェクションの２４時間後； Ｃ：ＮＩＨ／３Ｔ３、リポフェクタミンを使用した逆トランスフェクション、トランスフェクションの４８時間後。 図１Ａの説明を参照。 図１Ａの説明を参照。 図２：ウサギＣＤ１９に結合するハイブリドーマ上清を同定するためのウサギＰＢＭＣのＦＡＣＳ解析。ウサギＰＢＭＣを、ＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＭ抗体およびハイブリドーマ上清で二重染色した。個々のハイブリドーマ上清の非標識マウス抗体を、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体によって発色させた。 Ａ：ｒｂＩｇＭ陽性Ｂ細胞上のウサギＣＤ１９に結合する陽性ハイブリドーマ上清； Ｂ：例示的に、ウサギＩｇＭ陽性Ｂ細胞への結合を示さない陰性ハイブリドーマ上清。 図２Ａの説明を参照。 図３：精製され、かつＡｌｅｘａ６４７標識された抗ウサギＣＤ１９抗体を使用したＢ細胞マーカーとしてのウサギＣＤ１９の使用。単一Ｂ細胞選別中に使用したゲートのＦＡＣＳプロットとインデックス・ソート・アプローチによって生成されたプロットとの比較により、抗原特異的およびＩｇＧ分泌Ｂ細胞が、高度にウサギＣＤ１９陽性であることが明らかになった。 Ａ：単一細胞選別のために使用したウサギＩｇＧ－ＦＩＴＣ標識Ｂ細胞（ゲートＰ８）のＦＡＣＳプロット。ウサギＢ細胞のウサギＩｇＭ－ＰＥ標識を、対比染色として使用した； Ｂ：選別されたＢ細胞の特徴付けのための抗ウサギＣＤ１９抗体に基づく標識（ゲートＰ５）の使用； Ｃ：ウサギＩｇＧゲートを示す、ウサギＩｇＧおよび抗原特異的ＥＬＩＳＡのデータを含むインデックス・ソート・アプローチによって生成されたＦＡＣＳプロット； Ｄ：ウサギＣＤ１９ゲートを示す、ウサギＩｇＧおよび抗原特異的ＥＬＩＳＡのデータを含むインデックス・ソート・アプローチによって生成されたＦＡＣＳプロット。 図３Ａの説明を参照。 図３Ａの説明を参照。 図３Ａの説明を参照。 図４：Ｂ細胞培養の７日後のＢ細胞およびフィーダー細胞のＦＡＣＳ解析。 Ａ：細胞サイズ（ＦＳＣ、前方散乱）および細胞複雑性（ＳＳＣ、側方散乱）を介して、分布したすべての細胞を示すＦＡＣＳプロット； Ｂ：ウサギＣＤ１９染色（Ａｌｅｘａ６４７）および死細胞（ヨウ化プロピジウム）を介して、分布したすべての細胞を示すＦＡＣＳプロット； Ｃ：Ｂ細胞をほとんど含有しないウェルのＢ細胞の正確な数。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図５：Ｂ細胞培養の７日後のＢ細胞およびフィーダー細胞のＦＡＣＳ解析。 Ａ：細胞サイズ（ＦＳＣ）および細胞複雑性（ＳＳＣ）を介して、分布したすべての細胞を示すＦＡＣＳプロット； Ｂ：ウサギＣＤ１９染色（Ａｌｅｘａ６４７）および死細胞（ヨウ化プロピジウム）を介して、分布したすべての細胞を示すＦＡＣＳプロット； Ｃ：多数のＢ細胞を含有するウェルのＢ細胞の正確な数。 図５Ａの説明を参照。 図５Ａの説明を参照。 図６：Ａ：細胞サイズ（ＦＳＣ）および細胞複雑性（ＳＳＣ）を示す、ウサギ由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のＦＡＣＳプロット。 Ｂ：ＦＩＴＣチャネルにおける細胞サイズ（ＦＳＣ）およびウサギＩｇＧ染色細胞集団（＝ゲートＰ５）を示す、ウサギ由来のＰＢＬのＦＡＣＳプロット。 図７：Ａ：磁気ビーズによる抗原濃縮後のＢ細胞の生存率を示すＦＡＣＳプロット。 Ｂ：ＣＤ１９＋Ｂ細胞濃縮後のＢ細胞の生存率を示すＦＡＣＳプロット。 図７Ａの説明を参照。

Ｖ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供される一般的な記載を考慮すると、様々な他の実施形態が実施されてもよいことが理解される。

上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明および例によって、ある程度詳細に説明してきたが、その記載および例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書で引用されるすべての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

実施例１
マウス抗ウサギＣＤ１９抗体（ハイブリドーマ）の免疫化および生成
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から入手したＮＭＲＩマウスを、免疫化に使用した。動物は、付録Ａ「動物の施設と飼育に関するガイドライン」に従って、ＡＡＡＬＡＣｉ認定の動物施設に収容された。すべての動物免疫化プロトコルおよび実験は、上部バイエルン州政府（許可番号ＡＺ ５５．２－１－５４－２５３１－８３－１３）によって承認され、ドイツ動物福祉法および欧州議会および理事会の指令２０１０／６３に従って実施された。

６～８週齢のＮＭＲＩマウス（ｎ＝５）に、３ヶ月間にわたってプラスミドＤＮＡに基づく免疫化を行った。この目的のために、ウサギＣＤ１９を一本鎖分子としてコードするプラスミドＤＮＡを使用した。ハイブリドーマ融合のための脾臓採取の前に、ウサギＣＤ１９の発現のために同じベクターで一過性トランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）によりブーストした。

第１の免疫化のために、動物をイソフルラン麻酔し、動物の尾部近位の剃毛した背中の一箇所に、滅菌Ｈ_２Ｏ中１００μｇのプラスミドＤＮＡで、皮内（ｉ．ｄ．）に免疫化した。ｉ．ｄ．適用後、ＥＣＭ８３０エレクトロポレーションシステム（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）上で、以下のパラメータを使用してスポットをエレクトロポレートした：それぞれ、１２５ｍｓの間隔をあけ、１０００Ｖ／ｃｍ、０．１ｍｓ間を２回、続いて、また１２５ｍｓの間隔をあけ、２８７．５Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓ間を４回。同様の様式で、１４、２８、４９、６３、および７７日目に、ブースター免疫化を行った。最終免疫化の６週間後、ウサギＣＤ１９の発現のために一過性トランスフェクトされ、滅菌ＰＢＳに溶解された０．９×１０Ｅ６ ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、静脈内（ｉ．ｖ．）および腹腔内（ｉ．ｐ．）のそれぞれをマウスに注射した。７２時間後、脾臓を無菌的に採取し、ハイブリドーマ生成のために調製した。

免疫化マウスからの脾臓細胞の融合を、標準プロトコルに従って行った：骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８６５３を、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび８－アザグアニンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、３×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度まで培養した。次いで、細胞を採取し（１，０００ｒｐｍ、１０分、３７℃）、５０ｍＬのＲＰＭＩ（３７℃）で洗浄した。同じ条件下での２回目の遠心分離工程の後、細胞を５０ｍＬのＲＰＭＩ（３７℃）に再懸濁し、その後氷上で保存した。免疫化マウスから摘出した無菌の脾臓を、セルストレーナー（７０μｍ）を通して、単一細胞をふるい分けした。単一細胞培養物を１５ｍＬチューブに移し、氷上で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液上清を５０ｍＬチューブに移し、採取し（２５０ｘｇ、１０分、４℃）、１５ｍＬのＲＰＭＩ培地に再懸濁した。

細胞密度の検出後、脾臓細胞および骨髄腫細胞を５：１の比で混合し、遠心分離した（２５０ｘｇ、１０分、３７℃）。脾臓細胞１０^８個あたり１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を穏やかに振盪しながら添加し、試料を３７℃および６％ＣＯ_２の雰囲気で少なくとも３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２５０×ｇ（３７℃）で１０分間採取し、２０ｍＬのＲＰＭＩ培地に再懸濁した。最終的に、全融合試料をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ、２００μｌ／ウェル）に移し、インキュベートし（３７℃、６％ＣＯ_２）、さらなる解析のために使用した。

実施例２
抗ＣＤ１９抗体のハイブリドーマスクリーニングおよび細胞生物学的機能評価
ウサギＣＤ１９に対する抗体をスクリーニングするためのハイスループットＦＡＣＳ解析
ハイブリドーマ上清を、マウスＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって特徴付けした。ＩｇＧ含有培養上清の一次スクリーニングを、標準プロトコルを使用してＥＬＩＳＡによって行った：ストレプトアビジンをコートした３８４ウェルＭＴＰを、ビオチン化ポリクローナル抗マウスＦｃｇ領域抗体（ｐＡＫ＜ＭＦｃｇ＞Ｓ－ＩｇＨ－（ＩＳ）－Ｂｉ（ＸＯＳｕ））とインキュベートした。５０μｌ／ウェルの上清（１：６００に希釈）を利用し、室温で６０分間インキュベートした。その後、試料を、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％（ｖ／ｖ）ＢｒｏｎｉｄｏｘＬで、３回洗浄した。ＩｇＧの検出のために、試料を、ペルオキシダーゼをコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２断片（１：１５，０００希釈、５０μｌ／ウェル）とインキュベートし、室温で６０分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、ＡＢＴＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、５０μｌ／ウェル）を添加し、さらに２０分間インキュベートした。Ｘ Ｒｅａｄ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で、４０５／４９２ｎｍの波長で読み出しを行った。ＩｇＧ陽性ハイブリドーマ上清のみを、抗原特異的ハイスループットＦＡＣＳ解析に供した。

ＦＡＣＳ解析をハイブリドーマのスクリーニングに適用し、ウサギＣＤ１９に対する抗体を分泌するハイブリドーマを同定した。Ｂ細胞同定のために、ウサギＩｇＭ結合抗体で二重染色したウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＦＡＣＳ解析によって、すべてのＩｇＧ産生ハイブリドーマをスクリーニングした。

新たに単離したウサギ（ＰＢＭＣ）を、氷上でＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＭ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＩｇＧ陽性ハイブリドーマ上清とインキュベートした。４５分間のインキュベーション後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、ハイブリドーマ上清のマウスＩｇＧに結合するＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。氷上でさらに４５分間インキュベーショントした後、細胞を氷冷ＰＢＳで再度一回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁し、直ちにＦＡＣＳ解析に供した。２μｇ／ｍｌの濃度のＤＡＰＩ－ＨＣｌ（Ｃａｙｍａｎ）をＦＡＣＳ解析の前に添加して、死細胞と生細胞とを識別した。コンピュータを備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩデバイスおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を解析に使用した。

ウサギＩｇＭ陽性Ｂ細胞に結合するハイブリドーマ上清を同定した後、ｒｂＣＤ１９発現プラスミドでトランスフェクトされた、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ解析によって、ウサギＣＤ１９特異性を確認した。ウサギＣＤ１９でトランスフェクトされた細胞を陽性細胞として使用し、トランスフェクトされていないＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞を陰性対照細胞として使用した。実施例７に記載のように、ウサギＣＤ１９の染色を行った。

実施例３
ＣＤ１９結合抗体の発現
抗体可変ドメインをコードする配列は、遺伝子合成によって生成される。

すべての配列を、配列決定によって検証する。すべての配列を、大腸菌（例えば、ベクターｐＵＣ１８からの複製起点、アンピシリン耐性のためのβ－ラクタマーゼ）における選択および増殖を可能にするベクターにクローニングする。これらのベクターは、哺乳動物細胞（例えば、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）の複製起点（ｏｒｉＰ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、ならびにポリアデニル化配列）における発現を可能にするカセットを追加で含有する。

抗体の軽鎖および重鎖をコードするすべての遺伝子セグメントには、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列

が先行する。タンパク質は、懸濁液中の一過性トランスフェクションヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞によって発現される。これらの細胞を、３７℃および８％ＣＯ_２で培養する。トランスフェクションの当日に、細胞を、１～２×１０^６生存細胞／ｍＬの密度で、新鮮な培地に播種する。等モル量の重鎖および軽鎖プラスミドＤＮＡの両方を、同時にトランスフェクトする。細胞培養上清をトランスフェクションの７日後に採取し、遠心分離し（４℃で４５分間１４，０００×ｇ）、続いて０．２２μｍフィルタにかけて濾過する。これらの上清を凍結し、精製前に－２０℃で保存することができた。

実施例４
ＣＤ１９結合抗体の精製
無細胞ハイブリドーマ上清を、５分間の接触時間で、事前に平衡化した（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）プロテインＡアフィニティーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^（商標）ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、８×１００ｍｍ）にロードする。洗浄（ＰＢＳ、５カラム体積）後、抗体を、２５ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ（ｐＨ３．０）で溶出する。溶出液を、１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨ５．５に調整し、４℃で一晩インキュベートする。その後、最終濾過（０．４５μｍ）を行う。

実施例５
ＣＤ１９ ＥＣＤ発現細胞の提供およびそれに対する抗体の結合
細胞外提示のために、ヒトＰＳＣＡ ＧＰＩアンカー配列

に融合したウサギＣＤ１９（配列番号０１）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするプラスミドで、細胞をトランスフェクトした。免疫化のためのＮＩＨ／３Ｔ３細胞のトランスフェクションのために、１×１０Ｅ７細胞を、３つのＴ１７５フラスコに播種した。続いて、リポフェクタミンを使用して、細胞を溶液中で逆トランスフェクトした。トランスフェクションの効率を、ＦＩＴＣ抗ＦＬＡＧ抗体（ａｂｃａｍ）およびＦＡＣＳを使用して、４８時間後に４０％陽性細胞になるように決定した（図１Ｃ）。ＦＡＣＳ解析によってＣＤ１９特異性を確認するために、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞を、ｒｂＣＤ１９でトランスフェクトした。３×１０Ｅ５ ＨＥＫ２９３および１×１０Ｅ５ ＣＨＯ細胞を、リポフェクタミンを使用して、トランスフェクトした。４８時間後、ＦＩＴＣ抗ＦＬＡＧ抗体（ａｂｃａｍ）を用いたＦＡＣＳにより、発現を確認した。

実施例６
抗ウサギＣＤ１９抗体を検出可能な標識にコンジュゲート
リン酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の抗ウサギＣＤ１９抗体を、約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整した。Ｄ－ビオチノイル－アミノカプロン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドをＤＭＳＯに溶解し、１：５のモル比で抗体溶液に添加した。６０分後、Ｌ－リジンを添加することによって反応を停止させ、標識試薬の余剰分を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含む５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液に対する透析によって除去した。

実施例７
インデックス・ソート・アプローチを含む、標識抗ウサギＣＤ１９抗体によるＢ細胞の標識化
Ｂ細胞を、暗所（４℃）で３０分間、正常マウス血清（１：２０、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充したＤＰＢＳ中の抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（１：２００、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ＩｇＭ ＰＥ（１：２００ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および抗ＣＤ１９ Ａ６４７（１：２００、Ｒｏｃｈｅ）抗体で染色した。続いて、細胞を洗浄し、氷冷ＤＰＢＳに再懸濁した。コンピュータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａ上での単一細胞選別の少し前に、０．５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加することによって、生／死識別を達成した。単一のＩｇＧ＋およびＩｇＧ＋ＩｇＭ＋細胞を、９６ウェルプレートに選別した。ＦＡＣＳＡｒｉａのインデックス・ソート・ツールを適用して、選別された各細胞のＣＤ１９発現を保存した。実施例９に記載のように、細胞を培養した。培養の７日後、上清を使用して、ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＧ産生および抗原特異的クローンの数を決定した。ＥＬＩＳＡデータとＦＡＣＳインデックス・ソート・データを組み合わせたプラグインを、ＦｌｏｗＪｏで開発した。このプラグインは、ＥＬＩＳＡからのＩｇＧ陽性および抗原特異的ウェルを、抗ウサギＩｇＧ、抗ウサギＩｇＭ、および抗ウサギＣＤ１９染色からの蛍光データに追加し、したがって、ＩｇＧ産生および抗原特異的クローンを、ＦｌｏｗＪｏで視覚化することができる。結果は、すべてのＩｇＧ産生およびすべての抗原特異的クローンが、ＩｇＧおよびＣＤ１９二重陽性であることを示す。さらに、選別された二重陽性細胞の割合を確認することにより、選別効率（より特異的に選別された細胞）を約１４～２０％向上させることができる。

実施例８
Ｂ細胞培養前の免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）および抗ｈｕＣｋ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を、単一細胞選別のために使用した。表面染色のために、枯渇および濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ ＦＩＴＣおよび抗ｈｕＣｋ ＰＥ抗体と、４℃の暗所で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷したＰＢＳに再懸濁し、直ちにＦＡＣＳ解析に供した。死細胞と生細胞とを識別するためのＦＡＣＳ解析の前に、０．５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加した。コンピュータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａを、単一細胞選別のために使用した。

実施例９
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Ｓｅｅｂｅｒら（２０１４）に記載の方法により行った。簡潔には、単一細胞選別ウサギＢ細胞を、この表に記載のように、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および合成サイトカイン混合物を含有する２００μｌ／ウェルのＥＬ－４ Ｂ５培地を含む９６ウェルプレート中でインキュベートした：

さらに、０．３５ｎｇ／μｌのホルボールミリステートアセテートおよびガンマ線照射（４Ｇｙ）されたマウスＥＬ－４ Ｂ５胸腺腫細胞（２×１０Ｅ５細胞／ウェル）を使用し、細胞をインキュベータ中で３７℃で７日間培養した。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞を、直ちに１００μｌのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に溶解し、－８０℃で凍結した。

実施例１０
血液および脾臓中のＣＤ１９陽性Ｂ細胞の測定
血液を、ＰＢＭＣの単離のために、密度勾配遠心分離に供した。脾臓をすり潰し、製造業者の指示に従って、通常の赤血球溶解緩衝液で赤血球を溶解する前に遠心分離した。血液または脾臓からの細胞を、滅菌６ウェルプレート上の１ｍｌ培地中に、最大６×１０^６ＰＢＭＣ／ウェルの濃度で播種した。マクロファージの枯渇は、インキュベータ内で３７℃での１時間のインキュベーション中に、細胞培養プレートへの非特異的接着によって起こる。実施例７に記載のように、単離されたＰＢＭＣを、染色し、洗浄した。コンピュータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ上での細胞集団の分析の少し前に、０．１μｇ／ｍｌの濃度のＤＡＰＩ（Ｂｉｏｍｏｌ）によって生／死識別を達成した。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７を用いて、血液および脾臓中のＣＤ１９陽性Ｂ細胞の解析を行った。

実施例１１
共培養後のＢ細胞の計数
Ｂ細胞を選別し、実施例７および実施例９に記載のように、フィーダー細胞と共培養した。７日間の培養後、９６ウェル培養プレートを３００ｘｇで５分間遠心分離し、培地を除去し、ペレットを、暗所（４℃）で３０分間インキュベーションするために、抗ＣＤ１９ Ａ６４７抗体（１：４００、Ｒｏｃｈｅ）を含有し、正常マウス血清（１：２０、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充した氷冷ＤＰＢＳに再懸濁した。続いて、細胞を洗浄し、規定量の氷冷ＤＰＢＳに再懸濁した。コンピュータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ上での細胞集団の分析の少し前に、０．１μｇ／ｍｌの濃度でＤＡＰＩ（Ｂｉｏｍｏｌ）を添加することによって、生／死識別を達成した。１ウェルあたりの総Ｂ細胞数の正確な計算のために、ＦＡＣＳＣａｎｔｏで、規定の解析体積を設定し、総試料体積を考慮することが重要である。ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．０．７を用いて解析を行い、総試料体積を考慮して、ＣＤ１９＋細胞の数を用いて、Ｂ細胞の細胞数を計算した。この方法では、例えば細胞表面ＩｇＧが培養中に減少するため、インハウスのＢ細胞クローニングアプローチ後に、Ｂ細胞クローン内のＢ細胞の計数が初めて可能になる。

実施例１２
本発明による抗体を使用した、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の濃縮
免疫化ウサギからのＰＢＭＣを、実施例１０に記載のように、血液から単離し、実施例８および実施例９に記載のように、染色および培養した。細胞の半分を以下のように処理した：ビオチン化抗ウサギＣＤ１９を、ＰＢＭＣと共に、４℃で１：５００希釈で１５分間インキュベートした。ＰＢＭＣを、冷ＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で洗浄し、次いで、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジンＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）とインキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、続いて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを製造業者の指示に従って使用して精製した。精製した細胞を、蛍光標識抗原および抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、４℃で１５分間インキュベートし、続いて洗浄した。細胞の残りの半分を、最初にビオチン化抗原（１：１００００）と、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジンＭＡＣＳビーズとインキュベートした。細胞を洗浄し、ＬＳカラムに供した。続いて、細胞を、蛍光標識抗ウサギＣＤ１９および抗ウサギＩｇＧ抗体とインキュベートした。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁し、直ちにＢＤ Ａｒｉａ ＩＩＩで選別した。７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、製造業者の指示に従って添加して、死細胞と生細胞とを識別した。細胞の前半は、サイズ、抗原陽性、およびＩｇＧ陽性でゲーティングした。細胞の後半は、サイズ、ＣＤ１９陽性、およびＩｇＧ陽性でゲーティングした。細胞を単一細胞で選別し、実施例９に記載のように培養した。１週間のインキュベーション後、ＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧ陽性クローン、特異的クローン、および交差反応性クローンの数を決定した。抗ウサギＣＤ１９による濃縮は、細胞の生存率の増加（図７）、ＩｇＧ産生クローンの数の増加、および抗原特異的クローンの数の増加をもたらした。さらに、交差反応性クローンの数が減少した。

Claims (16)

1. ウサギＣＤ１９に結合する抗体であって、
   （ａ）配列番号３２または３３または３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、
   （ｂ）配列番号３５または３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、
   （ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、
   （ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、
   （ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および
   （ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３
   を含む、抗体。
2. モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
3. キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
4. 配列番号３０の重鎖可変ドメインと配列番号２６の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１または２に記載の抗体。
5. 全長抗体、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ断片、およびダイアボディからなる群より選択される抗体断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。
6. 検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
7. 前記検出可能な標識が、蛍光色素である、請求項６に記載の抗体。
8. ウサギＢ細胞を選択するための方法であって、
   ａ）多数のウサギ細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体とインキュベートする工程、および
   ｂ）請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体が結合している１つまたは複数のＢ細胞を選択し、それによって、ウサギＢ細胞を選択する工程
   を含む、方法。
9. 工程ｂ）の後かつ工程ｃ）の前における、前記ウサギＢ細胞を共培養培地中で３７℃で１時間インキュベートする工程、および／または
   ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体が結合している１つもしくは複数のウサギＢ細胞を単一細胞として置く工程、および／または
   ｄ）前記単一細胞として置かれたウサギＢ細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、および／または
   ｅ）工程ｄ）で増殖しているウサギＢ細胞を選択し、それによって、ウサギＢ細胞を選択する工程
   のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項８に記載の方法。
10. ウサギ細胞の培養物からウサギ非Ｂ細胞を除去するための方法であって、
    ａ）単一細胞または細胞のプールのいずれかとして置かれたウサギＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
    ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの前記細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体とインキュベートする工程、および
    ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体が結合している１つまたは複数のウサギＢ細胞を選択し、それによって、ウサギ非Ｂ細胞を除去する工程
    を含む、方法。
11. 単一細胞として置かれたウサギＢ細胞とフィーダー細胞との共培養物中のウサギＢ細胞の数を決定するための方法であって、
    ａ）単一細胞として置かれたウサギＢ細胞を、フィーダー細胞と共培養する工程、
    ｂ）工程ａ）で得られた共培養物からの前記細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体とインキュベートする工程、および
    ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体が結合している細胞の数を数えることによって、前記培養物中のウサギＢ細胞の数を決定する工程
    を含む、方法。
12. １つまたは複数のウサギＢ細胞を共培養するための方法であって、
    － 多数のウサギＢ細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体とインキュベートする工程、または多数のウサギＢ細胞の個々のウサギＢ細胞を、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体で標識する工程、
    － 請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体がその表面に結合している、または個々のウサギＢ細胞（単一細胞として置かれたウサギＢ細胞）またはウサギＢ細胞のプールのいずれかとして標識されている、１つまたは複数のウサギＢ細胞を選択するまたは置く工程、および
    － 前記単一細胞として置かれたウサギＢ細胞または前記ウサギＢ細胞のプールを、フィーダー細胞と共培養する工程
    を含む、方法。
13. 前記共培養が、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ならびにＩＬ－２１、ＳＡＣ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－６から選択される１種または複数種を含む合成フィーダー混合物の存在下で行われる、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ａ）ウサギの血液からＢ細胞を得る工程、
    ｂ）前記Ｂ細胞を、ビーズに結合している請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体とインキュベートする工程、
    ｃ）結合していないＢ細胞を除去する工程、および
    ｄ）結合したＢ細胞を前記ビーズから回収し、それによって、１つまたは複数のＢ細胞を選択する工程
    を含む、Ｂ細胞を選択するための方法。
15. ｅ）１つまたは複数の回収されたＢ細胞を、個々の容器に置く工程、
    ｆ）前記置かれた細胞を、共培養培地中でフィーダー細胞と共培養する工程、および
    ｇ）工程ｆ）で増殖しているＢ細胞を選択し、それによって、Ｂ細胞を選択する工程
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 工程ｅ）の前に、前記回収されたＢ細胞を、共培養培地中で３７℃で１時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

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