JP7672196B2 - 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本願は、その内容が参照により本明細書中に組み込まれる２０１７年３月１４日提出の米国仮出願第６２／４７１，３４７号明細書に対する優先権を主張する。

グリコシル化は、例えばタンパク質折り畳み、クオリティーコントロール、分子輸送及び局在化及び細胞表面受容体相互作用を含む複数の細胞機能に関与するので、最も一般的で、また重要な翻訳後修飾の１つである。グリコシル化は、治療用糖タンパク質の、生理活性、薬物動態、免疫原性、溶解度及びインビボクリアランスに影響を与えるので、組み換えタンパク質薬の治療効果に影響を及ぼす。Ｆｃグリコフォームプロファイルは、特に、抗体の臨床効果及び薬物動態に直接影響を及ぼすので、組み換え抗体に対して重要な製品品質特性である。

高マンノース（ＨＭ）グリコフォーム含量は、ある種の治療用抗体の薬物動態特性に影響を及ぼすことが分かった（非特許文献１）（非特許文献２）。ＨＭグリコフォームは、抗体の血清クリアランス速度に影響を与えるだけでなく、このようなグリコフォームは、非フコシル化（非フコ）グリコフォームに加えて、抗体エフェクター機能又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）としても知られる抗体介在性の標的細胞死滅にも影響し得る。

多くの要因がグリカン構造、したがってタンパク質の最終的なグリコシル化形態（グリコフォーム）に影響を与える。例えば、抗体を発現する細胞株、細胞培養培地、フィード培地組成及び細胞培養中の添加のタイミングは、タンパク質のグリコフォームの産生に影響を与え得る。

研究グループにより、抗体の特定のグリコフォームのレベルに影響を与えるための多くの方法が示唆されている一方で、治療用抗体の組み換え産生中に総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームのレベルを操作し、調節するための単純かつ効率的な方法が生物医薬産業において依然として必要とされている。

Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１，９４９－５９ Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＭＡｂｓ ４，４７５－８７

初期細胞培養期間（例えば接種後最初の２、３、４、５又は６日間）中に所望の初期ｐＨ（例えば初期設定ｐＨ値）を維持することは、組み換え産生されるグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを調整するために重要であり、一方で、初期細胞培養期間後の細胞培養ｐＨがＴＡＦグリコフォームレベルに対してあまり大きく影響しないことを明らかにするデータの記載はこれが初めてである。後期段階のｐＨではなく、初期ｐＨがＴＡＦレベルに影響を及ぼすという発見は予想外であった。特定の理論に縛られるものではないが、初期細胞培養期間（例えば接種後最初の２、３、４、５又は６日間）中に初期ｐＨ（例えば初期設定ｐＨ値）を調節することにより、グリコシル化タンパク質の組み換え産生が所望の、又は所定の、又は予め選択されたＴＡＦグリコフォームレベルを有することが可能になる。したがって、本発明は、所望の、又は所定の、又は予め選択されたＴＡＦグリコフォームレベルを有する組み換えグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）を産生させる方法に関する。

本発明は、細胞培養においてグリコシル化適格細胞により産生される組み換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルを調整する方法を提供する。代表的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間にわたり、初期ｐＨ、例えば初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。

代表的な態様において、初期細胞培養期間は、接種後、約４日～約６日間、例えば、約４日間、約５日間、約６日間、又は接種後、約２日間～約６日間、例えば接種後、約２日間、約３日間又は約４８時間～約１４４時間、又は接種後、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、３７時間、３８時間、３９時間、４０時間、４１時間、４２時間、４３時間、４４時間、４５時間、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、７１時間、７２時間、７３時間、７４時間、７５時間、７６時間、７７時間、７８時間、７９時間、８０時間、８１時間、８２時間、８３時間、８４時間、８５時間、８６時間、８７時間、８８時間、８９時間、９０時間、９１時間、９２時間、９３時間、９４時間、９５時間、９６時間、９７時間、９８時間、９９時間、１００時間、１０１時間、１０２時間、１０３時間、１０４時間、１０５時間、１０６時間、１０７時間、１０８時間、１０９時間、１１０時間、１１１時間、１１２時間、１１３時間、１１４時間、１１５時間、１１６時間、１１７時間、１１８時間、１１９時間、１２０時間、１２１時間、１２２時間、１２３時間、１２４時間、１２５時間、１２６時間、１２７時間、１２８時間、１２９時間、１３０時間、１３１時間、１３２時間、１３３時間、１３４時間、１３５時間、１３６時間、１３７時間、１３８時間、１３９時間、１４０時間、１４１時間、１４２時間、１４３時間、１４４時間、１４５時間、１４６時間、１４７時間、１４８時間、１５０時間、１５１時間、１５２時間、１５３時間、１５４時間、１５５時間、１５６時間、１５７時間、１５８時間、１５９時間、１６０時間、１６１時間、１６２時間、１６３時間、１６４時間、１６５時間、１６６時間、１６６時間又はその刻みで増加した時間数である。

代表的な態様において、初期細胞培養期間は、細胞培養の特定の生存可能細胞密度（ＶＣＤ）による。代表的な態様において、初期細胞培養期間は、細胞培養のＶＣＤが約６．５ｘ１０^６個細胞／ｍＬ以下である接種後の時間である。代表的な態様において、本方法は、細胞培養のＶＣＤが約６．５ｘ１０^６個細胞／ｍＬに到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養のＶＣＤが約６．９ｘ１０^６～約８．２ｘ１０^６に到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養のＶＣＤが約８．２ｘ１０^６～約１．９４ｘ１０^７に到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養のＶＣＤが約１．２１ｘ１０^７～約３．４６ｘ１０^７に到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。

代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．５未満であるｐＨから選択される。

本発明は、グリコシル化タンパク質及びそのＴＡＦグリコフォームを含む組成物にも関する。

図１は、３種類のＮ－グリカン及びこのような糖類に対して一般的に使用される印の説明である。 図２は、代表的なグリカン構造の表である。 図３は、初期ｐＨ又は時間の関数としてＴＡＦ（％）、ＨＭ（％）又はＡＦ（％）を相互に関連付けるグラフのセットである。 図４は、様々なｐＨ設定値に対する時間の関数としての、細胞培養中に存在する％ＴＡＦのグラフである。 図５は、細胞培養の平均の初期ｐＨの関数としての、（指定の時間中）細胞培養に存在する％ＴＡＦを示すグラフのセットである。（Ａ）は％ＴＡＦのグラフであり；（Ｂ）は、第０日～第６日の％ＴＡＦのグラフであり；（Ｃ）は、第６日～第９日の％ＴＡＦのグラフであり、（Ｄ）は、第９日～第１２日の％ＴＡＦのグラフである。 図６は、第６日～第１２日の細胞培養のｐＨの関数としての％ＴＡＦのグラフである。 図７は、時間の関数としてのｐＨ又は％ＴＡＦのグラフのペアである。 図８は、ＨＭ、非フコ又はＴＡＦ（％）対ｐＨ又はシフト後温度を相互に関連付けるグラフのセットである。

多くの分泌タンパク質が翻訳後グリコシル化され、この過程により、糖部分（例えばグリカン、糖類）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合される。真核細胞において、２種類のグリコシル化反応：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（「Ｘ」はプロリンを除く何らかのアミノ酸である）のアスパラギンに連結されるＮ結合型グリコシル化、（２）グリカンがセリン又はスレオニンに連結されるＯ結合型グリコシル化、が起こる。グリコシル化のタイプ（Ｎ結合型又はＯ結合型）にかかわらず、各部位と連結されるグリカン構造は広範囲にわたるため、タンパク質グリコフォームには微小な不均一性がある（Ｏ又はＮ）。

全てのＮ－グリカンが、共通するコア糖配列：Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ）を有し、３つのタイプのうち１つ：（Ａ）２個のＮ－アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び多数（例えば５、６、７、８又は９個）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる高マンノース（ＨＭ）又はオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）２個を超えるＧｌｃＮＡｃ部分及びあらゆる数の他の糖タイプを含む複合型又は（Ｃ）分枝の一方にＭａｎ残基を、複合枝の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型、に分類される。図１（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２^ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９より）はＮ－グリカンの３つのタイプを示す。

Ｎ結合型グリカンは、一般的には、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、グルコース（ＧＬｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＣｌｃＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ０アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコシルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２－ケト－３－ドキシノノン酸（ｄｏｘｙｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｋｄｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、グルクロン酸（ＧＬｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、マヌロン酸（ＭａｎＡ）のうち１つ以上の単糖類を含む。このような糖類に対して一般的に使用される印を図１で示す。代表的なグリカン及びそれらの個々の特性は図２で示す。

Ｎ結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）において開始され、複雑な一連の反応の結果、基本的に２個のＧｌｃＮＡｃ残基及び３個のＭａｎ残基から作られるコアグリカン構造の連結が起こる。ＥＲにおいて形成されるグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用により修飾される。糖類が酵素に比較的接近しにくい場合、これは、一般的には元来のＨＭ形態にとどまる。酵素が糖類に接近し得る場合、Ｍａｎ残基の多くが切り離され、糖類がさらに修飾され、その結果、複合型のＮ－グリカン構造が生じる。例えばｃｉｓ－ゴルジに位置するマンノシダーゼ－１は、ＨＭグリカンを切断又は加水分解し得、一方でメディアル－ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ－８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。

したがって、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機序、その機序の酵素のグリカン構造への到達性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機序から放出される段階に依存して変動する。

本明細書中で提供される発明は、グリコシル化適格細胞による組み換え産生中にタンパク質の様々なグリコシル化形態（グリコフォーム）のレベルを調整する方法に関する。特定の理論に縛られるものではないが、本発明の方法は、特定の量のある一定の組み換えタンパク質の特定のグリコフォームを含むテーラーメイドの組成物に対する手段を提供すると考えられる。

代表的な実施形態において、総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームのレベルが調整される。本明細書中で使用される場合、「総非フコシル化グリコフォーム」又は「ＴＡＦグリコフォーム」又は「ＴＡＦ」又は「最終ＴＡＦ」は、高マンノースグリコフォーム及び非フコシル化グリコフォームの合計量を指す。本明細書中で使用される場合、「高マンノース」又は「ＨＭ」又は「最終ＨＭ」という用語は、それぞれＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８及びＭａｎ９と略称される、５、６、７、８又は９個のマンノース残基を含むグリコフォームを包含する。本明細書中で使用される場合、「非フコシル化グリコフォーム」又は「非フコグリコフォーム」又は「非フコシル化グリカン」又は「非フコ」又は「ＡＦ」又は「非フコシル化」という用語は、コアフコース、例えばＮ－グリコシル化部位のＡｓｎとともにアミド結合において含まれるＧｌｃＮＡｃ残基上のα１，６－結合型フコースを欠くグリコフォームを指す。非フコシル化グリコフォームとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが限定されない。さらなる非フコシル化グリカンとしては、例えば、Ａ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、ＦＯ－Ｎ［Ｈ３Ｎ３］が挙げられる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１２）：１３２５－１３３４（２０１５）を参照のこと。代表的な態様において、本明細書中、実施例１でさらに記載されるように、ＴＡＦのレベル、ＨＭグリコフォーム及び非フコシル化グリコフォームの量はＨＩＬＩＣを介して決定される。Ｎ－グリカンの酵素切断の後、いくつかのピークがあり、その各ピークが様々なグリコフォームの平均分布（量）に相当するクロマトグラムを得るために、ＨＩＬＩＣを行う。これらの目的に対して、％ピーク面積＝ピーク面積／総ピーク面積ｘ１００％及び％総ピーク面積＝試料総面積／標準の総面積ｘ１００％である。％ＴＡＦを決定する目的のために使用する計算は次のとおり行い得る：
％非フコシル化グリコフォーム＝％Ａ１Ｇ０＋％Ａ２Ｇ０＋％Ａ２Ｇ１ａ＋％Ａ２Ｇ１ｂ＋％Ａ２Ｇ２＋％Ａ１Ｇ１Ｍ５。
％高マンノースグリコフォーム＝％Ｍａｎ５（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ６（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ７（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ８（検出可能な場合）＋％Ｍａｎ９（検出可能な場合）である。

本発明は、組み換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを調整する方法を提供する。代表的な態様において、本組み換えグリコシル化タンパク質は、細胞培養においてグリコシル化適格細胞により産生される。代表的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。本明細書中で使用される場合、「維持する」という用語は、設定ｐＨ値を初期設定ｐＨ値に設定し、指定の時間中にその設定ｐＨ値を変化させないことを意味する。本明細書中で使用される場合、「設定ｐＨ値」という用語は、ｐＨ調節系又は機器上で使用者により設定されるような所望又は標的ｐＨ値を指す。本明細書中で使用される場合、「初期設定ｐＨ値」という用語は、細胞培養物の接種中又は接種直後の使用者により設定される設定ｐＨ値を指す。当業者が認めるように、設定ｐＨ値は、特定のｐＨ調節系の較正限界に依存して、細胞培養の実際のｐＨとは異なり得る。一般的には、細胞培養の実際のｐＨは、設定ｐＨ値の±０．０５であり、一部の態様において、細胞培養の実際のｐＨは設定ｐＨ値の±０．０３又は±０．０２となる。代表的な態様において、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することは、初期細胞培養期間中、細胞培養のｐＨが初期設定ｐＨ値から０．０５を超えてシフトしないことを意味する。代表的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含み、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、７．５未満である。例えば、初期設定ｐＨ値は、６．５０、６．５２、６．５４、６．５６、６．５８、６．６０、６．６２、６．６４、６．６６、６．６８、６．７０、６．７２、６．７４、６．７６、６．７８、６．８０、６．８２、６．８４、６．８６、６．８８、６．９０、７．１０、７．１２、７．１４、７．１６、７．１８、７．２０、７．２２、７．２４、７．２６、７．２８、７．３０、７．３２、７．３４、７．３６、７．３８、７．４０、７．４２、７．４４、７．４６、７．４８、７．５０以上である。例えば、初期設定ｐＨ値は、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．０、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．４０、７．４５、７．５０である。さらに初期設定値は７．５以下である。例えば、初期設定ｐＨ値は、７．４８、７．４６、７．４４、７．４２、７．４０、７．３８、７．３６、７．３４、７．３２、７．３０、７．２８、７．２６、７．２４、７．２２、７．２０、７．１８、７．１６、７．１４、７．１２、７．１０、７．０８、７．０６、７．０４、７．０２、７．００、６．９８、６．９６、６．９４、６．９２、６．９０、６．８８、６．８６、６．８４、６．８２、６．８０、６．７８、６．７６、６．７４、６．７２、６．７０、６．６８、６．６６、６．６４、６．６２、６．６０、６．５８、６．５６、６．５４、６．５２、６．５０以下である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は約６．５５より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は約６．６０より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は約６．６５より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．７より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．７５より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．８０より高く、約７．５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．４５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．４未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．３５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．３未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．２５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．２未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．１５未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約６．５より高く、約７．１未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は約６．８５より高く、７．２未満である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は、約７．０～７．１である。初期設定ｐＨ値は、代表的な態様において、約６．８５以上～約６．９５以下である。代表的な態様において、初期設定ｐＨ値は約６．９５～７．１５である。

代表的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。本明細書中で使用される場合、「初期細胞培養期間」という句は、組み換えタンパク質産生のために細胞を培養する目的でグリコシル化適格細胞が細胞培養培地に添加された場合、接種後の時間又はその後の時間を指す。代表的な態様において、初期細胞培養期間は、約４日～約６日間（例えば約４日間、５日間又は約６日間）であるか、又は約９６時間～約１４４時間又はその刻みでの増加数である。代表的な態様において、初期細胞培養期間は、約４日間～約５日間である。代表的な態様において、初期細胞培養期間は約４日間である。代表的な実施形態において、初期細胞培養期間は、細胞培養の特定の生存可能細胞密度（ＶＣＤ）に対して定められる。代表的な態様において、初期細胞培養期間は、細胞培養のＶＣＤが約６．５ｘ１０^６個細胞／ｍＬ以下である間の接種後の時間である。代表的な態様において、本方法は、細胞培養が約６．５ｘ１０^６個細胞／ｍＬのＶＣＤを達成するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養が約８．２ｘ１０^６～約１．９４ｘ１０^７のＶＣＤに到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養が約１．２１ｘ１０^７～約３．４６ｘ１０^７のＶＣＤに到達するまで初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含む。

代表的な態様において、初期ｐＨは、対照細胞培養の対照ｐＨよりも高い。特定の理論に縛られるものではないが、（対照ｐＨと比較して）より高いｐＨを維持することは、対照細胞培養と比較した場合のＴＡＦグリコフォームの増加につながる。したがって、代表的な実施形態において、本発明の方法は、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを高くすることに関する。代表的な態様において、対照細胞培養と比較して、組み換えグリコシル化タンパク質のＨＭグリコフォームのレベルが上昇する。代表的な態様において、対照細胞培養と比較して、組み換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８及び／又はＭａｎ９のうち１つ以上のレベルが上昇する。代表的な態様において、対照細胞培養と比較して、組み換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルが上昇する。代表的な態様において、対照細胞培養と比較して、組み換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ以上のレベルが上昇する。代表的な態様において、対照細胞培養と比較して、組み換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］及びＦＯ－Ｎ［Ｈ３Ｎ３］のうち１つ以上のレベルが上昇する。

本明細書中で使用される場合、「上昇する」という用語及びそれから派生する語は、１００％又は完全な上昇でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益を有すると認める上昇度は様々である。この点において、本発明の方法は、対照細胞培養と比較して、何らかの程度又はレベルまでＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームレベルを上昇させ得る。代表的な実施形態において、本発明の方法により提供される上昇は、対照細胞培養と比較して、少なくとも又は約１０％上昇（例えば、少なくとも又は約２０％上昇、少なくとも又は約３０％上昇、少なくとも又は約４０％上昇、少なくとも又は約５０％上昇、少なくとも又は約６０％上昇、少なくとも又は約７０％上昇、少なくとも又は約８０％上昇、少なくとも又は約９０％上昇、少なくとも又は約９５％上昇、少なくとも又は約９８％上昇、）である。代表的な実施形態において、本発明の方法により提供される上昇は、対照細胞培養と比較して、１００％超、例えば、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又はさらに１０００％である。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約１．５倍上昇する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約２倍上昇する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約３倍上昇する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して、少なくとも約４倍又は５倍上昇する。

代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームの上昇レベルは、接種後第１日という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、接種後第２日という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、接種後第３日という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、接種後第４日という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、接種後第５日という早期に、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、細胞培養からタンパク質が回収されるときに、観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。

代表的な態様において、細胞培養の第４日、第５日もしくは第６日よりも長く、又は初期細胞培養期間を超えて、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇が観察される。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル上昇は、細胞培養の（接種後）７、８、９、１０、１１又は１２日間にわたり、又はより長く（例えば、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年）観察される。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルの上昇は、細胞培養からタンパク質が回収されるときに観察される。

代表的な態様において、初期ｐＨは、対照細胞培養に対照ｐＨよりも低い。特定の理論に縛られるものではないが、（対照ｐＨと比較して）より低いｐＨを維持することは、対照細胞培養と比較した場合のＴＡＦグリコフォームの減少につながる。したがって、代表的な実施形態において、本発明の方法は、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを低下させることに関する。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質のＨＭグリコフォームのレベルが、対照細胞培養と比較して低下する。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及び／又はＭａｎ９のうち１つ以上のレベルが対照細胞培養と比較して低下する。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルが対照細胞培養と比較して低下する。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ以上のレベルが対照細胞培養と比較して低下する。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］及びＦＯ－Ｎ［Ｈ３Ｎ３］のうち１つ以上のレベルが対照細胞培養と比較して低下する。

本明細書中で使用される場合、「低下する」という用語及びそこから派生する語は、１００％又は完全な低下でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益を有すると認める低下度は様々である。この点において、本発明の方法は、対照細胞培養と比較して何らかの程度又はレベルまで、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームレベルを低下させ得る。代表的な実施形態において、本発明の方法により提供される低下は、対照細胞培養と比較して、少なくとも又は約１０％低下（例えば、少なくとも又は約２０％低下、少なくとも又は約３０％低下、少なくとも又は約４０％低下、少なくとも又は約５０％低下、少なくとも又は約６０％低下、少なくとも又は約７０％低下、少なくとも又は約８０％低下、少なくとも又は約９０％低下、少なくとも又は約９５％低下、少なくとも又は約９８％低下）である。代表的な実施形態において、本発明の方法により提供される低下は、対照細胞培養と比較して、１００％超、例えば、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又はさらに１０００％である。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約１．５倍低下する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約２倍低下する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約３倍低下する。代表的な実施形態において、タンパク質の、ＴＡＦ、ＨＭ又は非フコグリコフォームのレベルは、対照細胞培養と比較して少なくとも約４倍又は５倍低下する。

代表的な態様において、接種後第１日という早期に、タンパク質の、ＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、接種後第２日という早期に、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、接種後第３日という早期に、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、接種後第４日という早期に、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、接種後およそ第５日の後に、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。代表的な態様において、タンパク質が細胞培養から回収される時間に、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察されるか又は観察可能であるか又は検出されるか又は検出可能である。

代表的な態様において、細胞培養の第４日、第５日又は第６日よりも長く、又は初期細胞培養期間を超えて、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察される。代表的な態様において、細胞培養（接種後）の７、８、９、１０、１１又は１２日間にわたり、又はより長く（例えば、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年）、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下が観察される。代表的な態様において、タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベル低下は、タンパク質が細胞培養から回収されるときに観察される。

本発明の方法に関して、このような方法により影響を受ける調整、上昇又は低下は、「対照」又は「対照細胞培養」に対するものである。これらの用語は本明細書中で交換可能に使用される。代表的な態様において、対照は、本発明の方法の段階が行われないときのタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルである。代表的な態様において、対照は、組み換え産生の公知の方法が行われるときのタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルである。代表的な態様において、対照は、既知の操作ｐＨが組み換え産生中に維持されるときのＴＡＦグリコフォームのレベルである。本明細書中で使用される場合、「対照細胞培養」という用語は、初期細胞培養期間中のｐＨを除き、本発明の方法の段階が行われる細胞培養と同じように維持される細胞培養を意味する（例えば本発明の方法の細胞培養）。代表的な態様において、対照細胞培養は、対照ｐＨを含む、既知の操作又は標準パラメーターで維持される細胞培養である。本明細書中で使用される場合、「対照ｐＨ」という用語は、既知の操作ｐＨ、例えば第１の時点又は本発明の方法を行う前の時点で維持される細胞培養のｐＨを指し得る。代表的な態様において、対照ｐＨは、ＴＡＦレベルが既知であるか又は決定される細胞培養のｐＨである。

組成物を含有する糖タンパク質中に存在するグリコフォームを評価するため、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイルを決定するために、様々な方法が当技術分野で知られている。適切な方法としては、陽イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ－ＨＰＬＣ）、エキソグリコシダーゼ消化、Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び一次元ｎ．ｍ．ｒ．分光法及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、Ｍａｔｔｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７３：２２６０－２２７２（１９９８）；Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９９（Ｐｔ １）：２６１－２７５（１９９４）；Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２（３）：３２０－３３４（２０１０）Ｗｕｈｒｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ ２，１２４－１３３頁；Ｒｕｈａａｋ Ｌ．Ｒ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７－３４８１及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，Ｖｏｌ．２４０，２１０－２２６頁を参照。また、本明細書中で示す例は、糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォームを評価するための適切な方法を記載する。

温度及び他の細胞培養パラメーター
代表的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間中、及び任意選択により初期細胞培養期間に続く第２の細胞培養期間中、初期温度で細胞培養を維持することをさらに含み、この初期温度は３０℃～４０℃である。代表的な実施形態において、初期温度は約３２℃～約３８℃又は約３５℃～約３８℃である。代表的な態様において、初期温度で細胞培養を維持することは、初期細胞培養期間中、細胞培養を初期温度の±１℃以内に維持することを指す。代表的な態様において、初期細胞培養期間にわたり初期温度で細胞培養を維持することは、初期細胞培養期間中、初期温度から細胞培養の温度が１℃を超えてシフトしないことを意味する。

本発明に関して、細胞培養は、組み換えタンパク質産生に適切な何らかの一連の条件に従い維持され得る。例えば、細胞培養は、特定の細胞密度、培養体積、溶解酸素レベル、圧力、浸透圧などで維持され得る。代表的な態様において、ＣＯ_２インキュベーター中、標準的な加湿条件下にて５％ＣＯ_２で接種前の細胞培養物を振盪する（例えば７０ｒｐｍ）。代表的な態様において、１．５Ｌ培地中１０^６個細胞／ｍＬの播種密度で細胞培養物を接種する。代表的な態様において、本方法は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ又は約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約２２５ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０％～約６０％酸素飽和度で細胞培養の溶解酸素（ＤＯ）レベルを維持することを含む。代表的な例において、本方法は、初期細胞培養期間中、約３０％～約５０％（例えば約３５％～約４５％）の酸素飽和度に細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。代表的な例において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％又は約６０％酸素飽和度で細胞培養のＤＯレベルを維持することを含む。

細胞培養は、何らかの１つ以上の培養培地中で維持され得る。代表的な態様において、細胞培養は、細胞増殖に適切な培地中で維持され得、及び／又は何らかの適切な供給計画に従う１つ以上のフィーディング培地（ｆｅｅｄｉｎｇ ｍｅｄｉａ）中で提供され得る。代表的な態様において、本方法は、グルコース、乳酸塩、アンモニア、グルタミン及び／又はグルタメートを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約１μＭ未満の濃度のマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、約０．２５μＭ～約１μＭマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、無視できる量のマンガンを含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約５０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約４０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約３０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、約２０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、培地は、約５ｐｐｂ以上又は約１０ｐｐｂ以上の濃度の銅を含む。

代表的な実施形態において、細胞培養のタイプは、流加培養法又は連続灌流培養法である。しかし、本発明の方法は、有利に、何れの特定のタイプの細胞培養にも限定されない。

初期細胞培養期間後
代表的な実施形態において、組み換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルを調整する本発明の方法は、初期細胞培養期間にわたり、初期ｐＨで細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後、初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを停止することをさらに含む。本明細書中での目的に対して、「初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを停止する」という概念は、初期設定ｐＨ値で細胞培養を調節するために必要とされる行動をやめることを指す。例えば、初期設定ｐＨ値の維持を効果的に停止するためにｐＨ対照系に対する１つ以上の設定を変化させ得る。代表的な態様において、「初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを停止する」は、ｐＨシフト又は変化を容認することを指し得る。例えば「初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを停止する」は、例えばｐＨ調節系において設定ｐＨ値を変化させることによって、ｐＨをシフトさせる能動的段階を指し得るか、又はｐＨをシフトさせること又は特定のｐＨ又はｐＨ範囲の調節又は維持の停止を許容する非能動的段階を指し得る。代表的な態様において、細胞培養ｐＨの維持又は調整は、細胞培養の最初の４～６日後に停止する。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞により産生される組み換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルを調整する方法は、初期細胞培養期間にわたり初期ｐＨで細胞培養を維持し、初期細胞培養期間後に初期ｐＨでの細胞培養の維持を停止し、例えば０．０５を超えて細胞培養のｐＨをシフトさせることを容認する。本明細書中での目的に対して、「ｐＨのシフトを容認する」の概念は、例えばｐＨ調節系において設定ｐＨ値を変化させることによりｐＨをシフトさせる能動的段階を指し得るか、又はｐＨのシフトを許容するか又は特定のｐＨもしくはｐＨ範囲を調節又は維持することを停止する非能動的段階を指し得る。代表的な態様において、初期細胞培養期間後に細胞培養のｐＨを約０．０５～約２．０シフトさせることが容認される。例えば、細胞培養の初期期間後、ｐＨを約０．１～約１．５又は約０．５～約１．０シフトさせることが容認される。ある一定の代表的な態様において、ｐＨは、細胞培養の細胞による抗体産生に適切であるｐＨ範囲外になることは容認されない。例えばｐＨは９以上又は４以下になることは容認されない。

代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後のｐＨシフトを含む。代表的な態様において、本方法は、初期設定ｐＨ値から異なる設定ｐＨ値にｐＨ調節系において設定ｐＨ値を変化させることを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後（任意選択により第２の細胞培養期間にわたり）、（初期設定ｐＨ値に対して）約０．０５を超えてｐＨ（例えば設定ｐＨ値）をシフトさせることを含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後、（初期設定ｐＨ値に対して）約０．０５～約２．０、ｐＨ（例えば設定ｐＨ値）をシフトさせることを含む。代表的な態様において、ｐＨシフトは（例えば初期設定ｐＨ値に対する）ｐＨの上昇である。ある一定の態様において、本方法は、ｐＨ（例えば設定ｐＨ値）を約０．１～約１．５又は約０．１５～約１．０上昇させることを含む。代表的な態様において、シフトは（例えば初期設定ｐＨ値に対する）ｐＨの低下である。ある一定の態様において、本方法は、ｐＨ（例えば設定ｐＨ値）を約０．１～約１．５又は約０．１５～約１．０低下させることを含む。

細胞培養のｐＨを調節又は維持する、ならびにｐＨ監視系を含む機器を完全に搭載したハイスループットバイオリアクターを用いてそれを行う方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｓｅｕｎｇ Ｊｏｏｎ Ｌｅｅの論文”Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ ａｎｄ ｐＨ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ｕｓｉｎｇ ａ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｅｎｓｏｒ”，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６，Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ａｄａｍｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐＨ Ｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ”Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｖｏｌ １６２ Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｎｏｔｅｓ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６，４８１－４８５頁（２０１３）；米国特許第７，４２９，４９１号明細書、Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２２：２９３－３０６（２００６）；Ｗｅｕｓｔｅｒ－Ｂｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．Ｅｎｇ．２８（２）：１０９－１１９（２００５）；Ｍａｈａｒｂｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５（４）：３７６－３８１（２００４）；Ｚａｎｚｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７（２）：２４３－２５４（２００５）；Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８１：１７８－１８６（２００２）；欧州特許第３１２８３１９号明細書；米国特許出願公開第２０１５／０３７６６４７号明細書を参照のこと。ｐＨモニターは市販されており、例えばＥａｓｙｆｅｒｍ Ｐｌｕｓ ＡＲＣ ２２５（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）を含む。また、細胞培養ｐＨを維持する方法は本明細書中で実施例において記載されている。

代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームレベルを調整する本発明の方法は、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で細胞培養を維持することを含み、初期細胞培養期間中、及び任意選択により初期細胞培養期間後の第２の細胞培養期間中、初期温度で細胞培養を維持することをさらに含み、初期温度は３０℃～４０℃である。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間中、及び初期細胞培養期間後に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間又はそれ以上にわたり、初期細胞温度を維持することをさらに含む。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後、初期温度を維持することを停止することをさらに含む。代表的な態様において、本方法は、初期温度で細胞培養を維持することを停止すること、及び初期細胞培養期間後に約２℃以上温度をシフトさせることを容認することを含む。代表的な態様において、初期細胞培養期間後、約２℃を超えて温度をシフトさせることが容認される。代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後、約２℃を超えて温度をシフトさせることを含む。本明細書中の実施形態の何れかにおいて、第２の細胞培養期間は、初期細胞培養期間後、さらに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間以上であり得る。

代表的な態様において、初期細胞培養期間後、細胞培養温度をシフトさせることが容認される。代表的な態様において、初期細胞培養期間後、温度はもはや選択される初期温度の±１℃で維持されない。代表的な態様において、初期細胞培養期間後、温度を約１℃～約６℃シフトさせることが容認される。例えば、細胞培養の初期期間後、温度を約１℃～約５℃又は約１℃～約４℃又は約２℃又は約３℃シフトさせることが容認される。ある一定の代表的な態様において、温度は細胞培養の細胞による抗体産生に適切である温度範囲の範囲外になることは容認されない。例えば温度は、４０℃より高くなるか又は３０℃より低くなることは容認されない。

代表的な態様において、本方法は、初期細胞培養期間後の温度シフトを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養の最初の３～５日後に約１℃～約６℃、温度をシフトさせることを含む。代表的な態様において、シフトは温度の上昇である。代表的な態様において、シフトは℃５℃又は約１℃～約４℃又は約２℃又は約３℃、温度を上昇又は低下させることを含む。代表的な態様において、本方法は、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、約３日間～約６日間、約４日～約６日間又は約４日間～約５日間である初期細胞培養期間にわたり、初期ｐＨ、例えば初期設定ｐＨ値で、細胞培養を維持することを含む。代表的な態様において、本方法は、少なくとも約７２時間、約７６時間、約８０時間、約８４時間、約８８時間、約９２時間、約９６時間、約１００時間、約１０４時間、約１０８時間、約１１２時間、約１１６時間、約１２０時間、約１２４時間、約１２８、約１３２時間、約１３６時間、約１４０時間又は約１４４時間である初期細胞培養期間にわたり、初期ｐＨ、例えば初期設定ｐＨ値で、細胞培養を維持することを含む。

代替的な実施形態において、本方法は、初期細胞培養期間後に温度シフトを含まない。代表例において、細胞培養の温度は、細胞培養期間の全期間にわたり初期温度の±１℃内である温度で維持される。代表例において、細胞培養の温度は、細胞培養期間の全体にわたり初期温度の±１℃内である温度で維持され、本方法は、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日又は少なくとも約６日である初期細胞培養期間にわたり細胞培養を初期ｐＨ、例えば初期設定ｐＨ値で維持することを含む。代表的な態様において、細胞培養の温度は、初期温度の±１℃以内の温度で全細胞培養期間中、維持され、本方法は、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間、約７６時間、約８０時間、約８４時間、約８８時間、約９２時間、約９６時間、約１００時間、約１０４時間、約１０８時間、約１１２時間、約１１６時間、約１２０時間、約１２４時間、約１２８、約１３２時間、約１３６時間、約１４０時間又は約１４４時間である初期細胞培養期間にわたり、細胞培養を初期ｐＨ、例えば初期設定ｐＨ値に維持することを含む。

組み換えタンパク質
代表的な実施形態において、本組み換えタンパク質は、式：
Ａｓｎ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２
（式中、Ｘａａ_１はＰｒｏを除く何れかのアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＳｅｒ又はＴｈｒである）である、１つ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列を含むアミノ酸配列を含む。

代表的な実施形態において、本組み換えタンパク質は、断片結晶化可能（Ｆｃ）ポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドのネイティブ及びムテイン形態を含む。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの短縮型も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（及びそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡ又はタンパク質Ｇカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の長所をもたらす。代表的な実施形態において、本組み換えタンパク質は、ＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧのＦｃを含む。代表的な態様において、本組み換えタンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃを含む。代表的な態様において、本組み換えタンパク質は、抗体、ペプチボディ又はＦｃ－融合タンパク質である。

代表的な態様において、本組み換えグリコシル化タンパク質は抗体である。本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、重及び軽鎖を含む、及び可変及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン形式を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるＩｇＧであり得、各ペアは、１本の「軽」（一般的には分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（一般的には分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。抗体は可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ形式で、可変領域は一般に約１００～１１０以上のアミノ酸であり、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗原認識に主に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に変動する。定常領域は、抗体に免疫系の細胞及び分子を動員させる。可変領域は各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域から構成され、一方で定常領域は重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分から構成される。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。

抗体のＣＤＲの一般的な構造及び特性は当技術分野で記載されている。簡潔に述べると、抗体骨格において、ＣＤＲは、重及び軽鎖可変領域におけるフレームワーク内に埋め込まれ、それらは抗原結合及び認識に大きく関与する領域を構成する。可変領域は、フレームワーク領域内（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によりフレームワーク領域１－４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれる；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７も参照）に、少なくとも３個の重鎖又は軽鎖ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照）を含む。

ヒト軽鎖はカッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定める。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むが限定されないサブクラスを有する。本発明の実施形態は、抗体の全てのこのようなクラス又はアイソタイプを含む。軽鎖定常領域は、例えばカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えばアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ又はミュー型重鎖定常領域、例えばヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ又はミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、代表的な実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の何れか１つを含む、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。

本抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態において、本抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどにより産生される天然抗体と実質的に同様である配列を含む。この点において、本抗体は、哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとみなされ得る。ある一定の態様において、本組み換えタンパク質はヒト抗体である。ある一定の態様において、本組み換えタンパク質はキメラ抗体又はヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、本明細書中で、ある１つの種由来の定常ドメイン及び第２の種類由来の可変ドメインを含有する、又はより一般には少なくとも２種由来のアミノ酸配列のストレッチを含有する抗体を指すために使用される。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、元の起源の抗体よりも真のヒト抗体と類似している構造及び免疫学的機能を有するように操作されている非ヒト起源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体など由来のＣＤＲをヒト抗体に移植することを含み得る。ヒト化は、非ヒト配列をよりヒト配列に見えるようにするためのアミノ酸置換の選択も含み得る。

例えばパパイン及びペプシンなどの酵素によって、抗体が断片に切断され得る。パパインは、抗体を切断して２個のＦａｂ断片及び１個のＦｃ断片を生成させる。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）_２断片及びｐＦｃ’断片を生成させる。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質は、少なくとも１個のグリコシル化部位を保持する抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）_２又はｐＦｃ’である。

少なくとも１２～１５０ｋＤａの分子量範囲及び単量体（ｎ＝１）、二量体（ｎ＝２）及び三量体（ｎ＝３）から四量体（ｎ＝４）及びより高い可能性がある結合価（ｎ）範囲に広がる代替的な抗体形式の範囲拡大を生じさせるために抗体の構造が利用されており；このような代替的な抗体形式は、本明細書中で「抗体タンパク質生成物」と呼ばれる。

抗体タンパク質生成物としては、完全な抗原結合能を保持する、抗体断片に基づくもの、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨが挙げられる。その完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合断片はＦｖ断片であり、これは完全に可変（Ｖ）領域からなる。分子の安定性のためにｓｃＦｖ（１本鎖断片可変）断片にＶ領域を連結するために、可溶性の柔軟性のあるアミノ酸ペプチドリンカーを使用するか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に付加してＦａｂ断片を生成させる。ｓｃＦｖ及びＦａｂの両方は、原核宿主において容易に作製され得る広く使用される断片である。他の抗体タンパク質生成物としては、オリゴマー化ドメインに連結されるｓｃＦｖからなる異なる形式を含むジア、トリア及びテトラボディ又はミニボディ（ミニＡｂｓ）のようなジスルフィド結合で安定化されるｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、１本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）ならびに二量体及び多量体抗体形式が挙げられる。最小断片は、ラクダ科動物重鎖Ａｂならびに単ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規抗体形式を作製するために最も頻繁に使用される基本単位は１本鎖可変（Ｖ）ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）であり、これは、～１５アミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結される重及び軽鎖由来のＶドメイン（ＶＨ及びＶＬドメイン）を含む。ペプチボディ又はペプチド－Ｆｃ融合は、また別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメイン上に移植された生物学的に活性のあるペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野で詳細に記載されている。例えばＳｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照。

他の抗体タンパク質生成物としては、１本鎖抗体（ＳＣＡ）；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体などが挙げられる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートに分けられ得る。例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照。

代表的な態様において、組み換えタンパク質は、これらの抗体タンパク質生成物の何れか１つを含む。代表的な態様において、組み換えグリコシル化タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えばダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニＡｂ、ラクダ科動物の重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートの何れか１つである。

組み換えタンパク質は、単量体形態又は多量体、オリゴマー又は多量体形態の抗体タンパク質生成物であり得る。抗体が２つ以上の個別の抗原結合領域断片を含むある一定の実施形態において、抗体は、抗体により認識され、結合される個別のエピトープの数に依存して、二重特異性、三重特異性もしくは多重特異性又は二価、三価もしくは多価とみなされる。

本発明の方法に関して、抗体タンパク質生成物は、抗体の一定の部分を欠き得る。しかし、一般に、断片は、真核細胞において翻訳後修飾によりグリコシル化される抗体のＦｃ領域の少なくとも一部を含む。

有利に、本方法は、抗体の抗原特異性に限定されない。したがって、抗体は、実質的にあらゆる抗原に対する何らかの結合特異性を有する。代表的な態様において、抗体は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、細胞表面受容体又は何らかのそのリガンドに結合する。代表的な態様において、抗体は、免疫細胞の細胞表面上で発現されるタンパク質に結合する。代表的な態様において、抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１４、ＣＤ １１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６及びＣＤ１８２からなる群から選択される表面抗原分類分子に結合する。

代表的な態様において、抗体は、米国特許第７９４７８０９号明細書及び米国特許出願公開第２００９００４１７８４号明細書（グルカゴン受容体）、米国特許第７９３９０７０号明細書、米国特許第７８３３５２７号明細書、米国特許第７７６７２０６号明細書及び米国特許第７７８６２８４号明細書（ＩＬ－１７受容体Ａ）、米国特許第７８７２１０６号明細書及び米国特許第７５９２４２９号明細書（スクレロスチン）、米国特許第７８７１６１１号明細書、米国特許第７８１５９０７号明細書、米国特許第７０３７４９８号明細書、米国特許第７７００７４２号明細書及び米国特許出願公開第２０１００２５５５３８号明細書（ＩＧＦ－１受容体）、米国特許第７８６８１４０号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７８０７１５９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００９１４５５号明細書（ミオスタチン）、米国特許第７７３６６４４号明細書、米国特許第７６２８９８６号明細書、米国特許第７５２４４９６号明細書及び米国特許出願公開第２０１００１１１９７９号明細書（上皮増殖因子受容体の欠失突然変異体）、米国特許第７７２８１１０号明細書（ＳＡＲＳコロナウイルス）、米国特許第７７１８７７６号明細書及び米国特許出願公開第２０１００２０９４３５号明細書（ＯＰＧＬ）、米国特許第７６５８９２４号明細書及び米国特許第７５２１０５３号明細書（アンジオポエチン－２）、米国特許第７６０１８１８号明細書、米国特許第７７９５４１３号明細書、米国特許出願公開第２００９０１５５２７４号明細書、米国特許出願公開第２０１１００４００７６号明細書（ＮＧＦ）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＴＧＦ－βＩＩ型受容体）、米国特許第７５４１４３８号明細書（結合組織増殖因子）、米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１－Ｒ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（プロパージン）、米国特許第７４１１０５７号明細書、米国特許第７８２４６７９号明細書、米国特許第７１０９００３号明細書、米国特許第６６８２７３６号明細書、米国特許第７１３２２８１号明細書及び米国特許第７８０７７９７号明細書（ＣＴＬＡ－４）、米国特許第７０８４２５７号明細書、米国特許第７７９０８５９号明細書、米国特許第７３３５７４３号明細書、米国特許第７０８４２５７号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００４５５３７号明細書（インターフェロン－ガンマ）、米国特許第７９３２３７２号明細書（ＭＡｄＣＡＭ）、米国特許第７９０６６２５号明細書、米国特許出願公開第２００８０２９２６３９号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００４４９８６号明細書（アミロイド）、米国特許第７８１５９０７号明細書及び米国特許第７７００７４２号明細書（インスリン様増殖因子Ｉ）、米国特許第７５６６７７２号明細書及び米国特許第７９６４１９３号明細書（インターロイキン－１β）、米国特許第７５６３４４２号明細書、米国特許第７２８８２５１号明細書、米国特許第７３３８６６０号明細書、米国特許第７６２６０１２号明細書、米国特許第７６１８６３３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００９８６９４号明細書（ＣＤ４０）、米国特許第７４９８４２０号明細書（ｃ－Ｍｅｔ）、米国特許第７３２６４１４号明細書、米国特許第７５９２４３０号明細書及び米国特許第７７２８１１３号明細書（Ｍ－ＣＳＦ）、米国特許第６９２４３６０号明細書、米国特許第７０６７１３１号明細書及び米国特許第７０９０８４４号明細書（ＭＵＣ１８）、米国特許第６２３５８８３号明細書、米国特許第７８０７７９８号明細書及び米国特許出願公開第２０１００３０５３０７号明細書（上皮増殖因子受容体）、米国特許第６７１６５８７号明細書、米国特許第７８７２１１３号明細書、米国特許第７４６５４５０号明細書、米国特許第７１８６８０９号明細書、米国特許第７３１７０９０号明細書及び米国特許第７６３８６０６号明細書（インターロイキン－４受容体）、米国特許出願公開第２０１１０１３５６５７号明細書（ベータ－ＫＬＯＴＨＯ）、米国特許第７８８７７９９号明細書及び米国特許第７８７９３２３号明細書（繊維芽細胞増殖因子様ポリペプチド）、米国特許第７８６７４９４号明細書（ＩｇＥ）、米国特許出願公開第２０１００２５４９７５号明細書（アルファ－４ベータ－７）、米国特許出願公開第２０１００１９７００５号明細書及び米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ１）、米国特許第７５８５５００号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４７２５３号明細書（ＩＬ－１３）、米国特許出願公開第２００９０２６３３８３号明細書及び米国特許第７４４９５５５号明細書（ＣＤ１４８）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６号明細書（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２２６４４７号明細書（アンジオポエチン－１及びアンジオポエチン－２）、米国特許出願公開第２００９０１９１２１２号明細書（アンジオポエチン－２）、米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号明細書（Ｃ－ＦＭＳ）、米国特許第７５３７７６２号明細書（アクチビン受容体様キナーゼ－１）、米国特許第７３７１３８１号明細書（ガラニン）、米国特許出願公開第２００７０１９６３７６号明細書（インスリン様増殖因子）、米国特許第７２６７９６０号明細書及び米国特許第７７４１１１５号明細書（ＬＤＣＡＭ）、米国特許第７２６５２１２号明細書（ＣＤ４５ＲＢ）、米国特許第７７０９６１１号明細書、米国特許出願公開第２００６０１２７３９３号明細書及び米国特許出願公開第２０１０００４０６１９号明細書（ＤＫＫ１）、米国特許第７８０７７９５号明細書、米国特許出願公開第２００３０１０３９７８号明細書及び米国特許第７９２３００８号明細書（オステオプロテジェリン）、米国特許出願公開第２００９０２０８４８９号明細書（ＯＶ０６４）、米国特許出願公開第２００８０２８６２８４号明細書（ＰＳＭＡ）、米国特許第７８８８４８２号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１６５１７１号明細書及び米国特許出願公開第２０１１００５９０６３号明細書（ＰＡＲ２）、米国特許出願公開第２０１１０１５０８８８号明細書（ヘプシジン）、米国特許第７９３９６４０号明細書（Ｂ７Ｌ－１）、米国特許第７９１５３９１号明細書（ｃ－Ｋｉｔ）、米国特許第７８０７７９６号明細書、米国特許第７１９３０５８号明細書及び米国特許第７４２７６６９号明細書（ＵＬＢＰ）、米国特許第７７８６２７１号明細書、米国特許第７３０４１４４号明細書及び米国特許出願公開第２００９０２３８８２３号明細書（ＴＳＬＰ）、米国特許第７７６７７９３号明細書（ＳＩＧＩＲＲ）、米国特許第７７０５１３０号明細書（ＨＥＲ－３）、米国特許第７７０４５０１号明細書（アタキシン－１様ポリペプチド）、米国特許第７６９５９４８号明細書及び米国特許第７１９９２２４号明細書（ＴＮＦ－α変換酵素）、米国特許出願公開第２００９０２３４１０６号（アクチビンＡ）、米国特許出願公開第２００９０２１４５５９号明細書及び米国特許第７４３８９１０号明細書（ＩＬ１－Ｒ１）、米国特許第７５７９１８６号明細書（ＴＧＦ－βＩＩ型受容体）、米国特許第７５６９３８７号明細書（ＴＮＦ受容体様分子）、米国特許第７５４１４３８号明細書（結合組織増殖因子）、米国特許第７５２１０４８号明細書（ＴＲＡＩＬ受容体－２）、米国特許第６３１９４９９号明細書、米国特許第７０８１５２３号明細書及び米国特許出願公開第２００８０１８２９７６号（エリスロポエチン受容体）、米国特許出願公開第２００８０１６６３５２号明細書及び米国特許第７４３５７９６号明細書（Ｂ７ＲＰ１）、米国特許第７４２３１２８号明細書（プロパージン）、米国特許第７４２２７４２号明細書及び米国特許第７１４１６５３号明細書（インターロイキン－５）、米国特許第６７４０５２２号明細書及び米国特許第７４１１０５０号明細書（ＲＡＮＫＬ）、米国特許第７３７８０９１号明細書（炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ ＩＸ）腫瘍抗原）、米国特許第７３１８９２５号明細書及び米国特許第７２８８２５３号明細書（副甲状腺ホルモン）、米国特許第７２８５２６９号明細書（ＴＮＦ）、米国特許第６６９２７４０号明細書及び米国特許第７２７０８１７号明細書（ＡＣＰＬ）、米国特許第７２０２３４３号明細書（単球走化性因子タンパク質－１）、米国特許第７１４４７３１号明細書（ＳＣＦ）、米国特許第６３５５７７９号明細書及び米国特許第７１３８５００号明細書（４－１ＢＢ）、米国特許第７１３５１７４号明細書（ＰＤＧＦＤ）、米国特許第６６３０１４３号明細書及び米国特許第７０４５１２８号明細書（Ｆｌｔ－３リガンド）、米国特許第６８４９４５０号明細書（メタロプロテイナーゼ阻害剤）、米国特許第６５９６８５２号明細書（ＬＥＲＫ－５）、米国特許第６２３２４４７号明細書（ＬＥＲＫ－６）、米国特許第６５００４２９号明細書（脳由来神経栄養因子）、米国特許第６１８４３５９号明細書（上皮由来Ｔ細胞因子）、米国特許第６１４３８７４号明細書（神経栄養因子ＮＮＴ－１）、米国特許出願公開第２０１１００２７２８７号明細書（プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン９型（ＰＣＳＫ９））、米国特許出願公開第２０１１００１４２０１号明細書（ＩＬ－１８受容体）及び米国特許出願公開第２００９０１５５１６４号（Ｃ－ＦＭＳ）に記載のもののうち１つである。上記の特許及び公開特許出願は、可変ドメインポリペプチド、可変ドメインをコードする核酸、宿主細胞、ベクター、前記の可変ドメインをコードするポリペプチドを作製する方法、医薬組成物及び可変ドメイン含有抗原結合タンパク質又は抗体の個々の標的に付随する疾患を処置する方法のそれらの開示の目的のために、それらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。

代表的な実施形態において、抗体は、ムロモナブ－ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ Ｏｋｔ３（登録商標）で市販される製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販される製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販される製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販される製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販される製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販される製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販される製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販される製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標）で市販される製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販される製品）、トシツモマブ－Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販される製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販される製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販される製品）、イブリツモマブ・チウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販される製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販される製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販される製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販される製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販される製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販される製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販される製品）、セルトリズマブ・ペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販される製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販される製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販される製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販される製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販される製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販される製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販される製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販される製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販される製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販される製品）及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販される製品）のうち１つである。代表的な実施形態において、本抗体は、抗ＴＮＦアルファ抗体、例えばアダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ及びセルトリズマブ・ペゴルなど；抗ＩＬ１．ベータ抗体、例えばカナキヌマブなど；抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体、例えばウステキヌマブ及びブリアキヌマブなど；及び抗ＩＬ２Ｒ抗体、例えばダクリズマブなどのうち１つである。適切な抗癌抗体の例としては、抗ＢＡＦＦ抗体、例えばベリムマブなど；抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブなど；抗ＣＤ２２抗体、例えばエプラツズマブなど；抗ＣＤ２５抗体、例えばダクリズマブなど；抗ＣＤ３０抗体、例えばイラツムマブなど、抗ＣＤ３３抗体、例えばゲムツズマブなど、抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブなど；抗ＣＤ１５２抗体、例えばイピリムマブなど；抗ＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブなど；抗ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ及びペルツズマブなど；抗ＩＬ６抗体、例えばシルツキシマブなど；及び抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブなど；抗ＩＬ６受容体抗体、例えばトシリズマブなどが挙げられるが限定されない。

細胞
本発明は、グリコシル化適格細胞による産生中にタンパク質の異なるグリコシル化形態のレベルを調整する方法に関する。代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は、酵母細胞、糸状菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含むが限定されない真核細胞である。このような宿主細胞は、当技術分野で記載されている。例えばＦｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照。代表的な態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。代表的な態様において、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えばＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えばＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えばＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。

代表的な態様において、グリコシル化適格細胞は真核細胞である。代表的な態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。代表的な態様において、非ヒト哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ誘導体（例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えばＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えばＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、マウス胚繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞ＨｅｐＧ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞からなる群から選択される。グリコシル化に適格ではない細胞も、例えばグリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに遺伝子移入することによって、グリコシル化適格細胞に形質転換し得る。代表的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシデアーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅａｓｅ）ＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが限定されない。

組成物を調製する方法
本発明はまた、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームを含む組成物を調製する方法も提供する。代表的な実施形態において、本方法は、（ｉ）本明細書中に記載のように初期細胞培養期間にわたり初期ｐＨで細胞培養を維持すること及び任意選択により（ｉｉ）細胞培養を拡大すること及び（ｉｉｉ）細胞により産生されるタンパク質を含む細胞培養の上清を回収することを含む。代表的な態様において、本方法は、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルを調整する（上昇させるか又は低下させる）本発明の方法に関して本明細書中に記載の段階の何れか１つを含み得る。

本方法は、細胞培養又はその上清からタンパク質を精製する、及び好ましくは精製タンパク質を回収するための１つ以上の段階を含み得る。代表的な態様において、本方法は、１つ以上のクロマトグラフィー段階、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。代表的な態様において、本方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂を用いてタンパク質を精製することを含む。

代表的な実施形態において、本方法は、精製タンパク質などを処方し、それにより精製タンパク質を含む処方物を得るための段階をさらに含む。このような段階は、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ），２０１０に記載されている。

本方法は、細胞培養段階前に１つ以上の上流段階も含み得る。代表的な実施形態において、本方法は、本タンパク質を発現する宿主細胞を作製するための段階を含む。例えば、本方法は、一部の例において、本タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。

組成物
タンパク質のＴＡＦグリコフォームを含む組成物が本明細書中で提供される。代表的な実施形態において、本組成物は、本明細書中に記載の、細胞培養において細胞により産生されるタンパク質のＴＡＦグリコフォームを含む組成物を調製する本発明の方法により調製される。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約１０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約２０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約３０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約４０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約５０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約６０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約７０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約８０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の少なくとも約９０％がＴＡＦグリコフォームである。代表的な態様において、本組成物中のタンパク質の約９０％超又は約９５％超がＴＡＦグリコフォームである。

代表的な態様において、本発明の組成物は、約１０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約２０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約３０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約４０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約５０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約６０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約７０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約８０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約９０％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。代表的な態様において、本発明の組成物は、約９５％以上のＴＡＦグリコフォームであるグリコフォームプロファイルを有する。

本発明の組成物は、代表的な態様において医薬組成物である。代表的な態様において、本医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション及び様々なタイプの湿潤剤の何れかを含む。この用語は、米国連邦政府の規制当局により承認されるか又はヒトを含む動物での使用に対する米国薬局方で列挙される薬剤の何れかも包含する。

本医薬組成物は、例えば酸性化剤、添加物、吸着剤、エアロゾル噴霧剤、エア・ディスプレースメント剤（ａｉｒ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）、アルカリ化剤、凝固阻止剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、消毒薬、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、皮膚軟化剤、乳化剤、エマルション安定化剤、注入剤、フィルム形成剤、調味料、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、トローチ基剤、顔料、可塑剤、光沢剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味料、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘性増加剤、水分吸収剤、水混和共溶媒、軟水化剤又は湿潤剤を含む、何らかの薬学的に許容可能な成分を含み得る。例えば、その全体において参照により組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照。その全体において参照により組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）を参照。

代表的な態様において、本医薬組成物は、使用される投与量及び濃度で受容者にとって無毒性の処方物質を含む。具体的な実施形態において、医薬組成物は、治療的有効量のタンパク質のＴＡＦグリコフォーム及び１つ以上の薬学的に許容可能な塩；ポリオール；界面活性剤；浸透圧バランス剤；等張化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；充填剤；凍結乾燥保護剤；消泡剤；キレート剤；保存剤；着色剤；鎮痛剤；又はさらなる医薬品を含む。代表的な態様において、本医薬組成物は、任意選択により、薬学的に許容可能な塩；浸透圧バランス剤（等張化剤）；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；充填剤；凍結乾燥保護剤；消泡剤；キレート剤；保存剤；着色剤；及び鎮痛剤を含むが限定されない１つ以上の賦形剤に加えて、１つ以上のポリオール及び／又は１つ以上の界面活性剤を含む。

ある一定の実施形態において、本医薬組成物は、例えば本組成物の、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透性を変化させる、維持する、又は保つために処方材料を含有し得る。このような実施形態において、適切な処方材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又は他の有機酸など）；充填剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；注入剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（ビクンザルコニウムクロリド（ｂｃｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルバトク（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｃ）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定化促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物など、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照。

本医薬組成物は、生理学的に適合するｐＨを達成するために処方され得る。いくつかの実施形態において、本医薬組成物のｐＨは、例えば約４又は約５～約８．０又は約４．５～約７．５又は約５．０～約７．５であり得る。代表的な実施形態において、本医薬組成物のｐＨは５．５～７．５である。

次の実施例は本発明を単に例示するために与えるものであり、その範囲を制限するものではない。

実施例１
この実施例は、初期細胞培養ｐＨが細胞培養において細胞により産生される組み換えグリコシル化タンパク質の特定のグリコフォームのレベルを調整すること、及び初期細胞培養期間後になされるｐＨの変化は何れもグリコフォームレベルに対して殆ど影響がないことを明らかにする。

材料及び方法
細胞株、細胞培養及び培地
アイソタイプＩｇＧ１の組み換え抗体を発現するＣＨＯ細胞株の細胞を１Ｌの作業体積で３Ｌエーレンマイヤー振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）中で維持した。３６℃及び５％ＣＯ_２の標準的な加湿条件下で細胞を培養し、自動ＣＯ_２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で７０ｒｐｍで振盪した。３日おきに、様々な濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有する培養培地中で全細胞を継代培養し、移し、接種し、４日間、培養培地中で培養し、その後バイオリアクターに接種した。この試験での対照培地として細胞培養産生培地を使用した。細胞培養培地の成分には、増殖因子、アミノ酸、緩衝液、栄養素、微量元素、ビタミン、界面活性剤、塩、ヌクレオチド、ホルモン、脂質及び他の有機化合物が含まれる。

バイオリアクター灌流工程
バッチ工程又は灌流工程により、標準な温度及び溶解酸素条件で培養を行う。

細胞増殖、代謝産物及び抗体タイター分析
Ｎｏｖａ ＣＤＶ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して生存可能細胞密度及び生存能を決定した。バイオリアクター試料に対して、グルコース、乳酸、アンモニア、グルタミン、グルタメートを含む代謝産物は、Ｎｏｖａ Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。

親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）グリカンマップ
ＨＩＬＩＣを使用して、酵素的に放出されるＮ結合型グリカンのグリカンマップを決定した。簡潔に述べると、～３７℃で～２時間、ＰＮＧａｓｅ Ｆ及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を含む溶液とともにグリカンを温置した。次に、２－アミノ安息香酸（２－ＡＡ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む標識溶液をＰＮＧａｓｅ Ｆで処理したグリカンに添加し、～８０℃で約７５分間、混合物を温置した。温置後、沈殿タンパク質のペレットを得るために、混合物を遠心分離した。上清を回収し、バイアルに入れた。

蛍光検出器に基づきＨＩＬＩＣによりグリカンを分離した：グリカンを注入し、高有機条件でカラムに結合させ（移動相Ａ及び移動相Ｂはそれぞれギ酸アンモニウム及びアセトニトリルであった）、次いで水性ギ酸アンモニウム緩衝液の勾配を漸増させて溶出させた。１．７μｍ小粒子カラム方式及び１５０ｍｍカラム長を使用して、高分解能が達成された。カラム再平衡化を含む総運転時間は１５５分間であった。

実験の設計
３種類の初期設定ｐＨ値：６．８５、６．９５又は７．１のうち１つでＩｇＧ１抗体を産生するＣＨＯ細胞の群を培養した。接種後最初の６日間、ｐＨを維持した（第０日で接種を行った）。細胞の少なくとも２群に対して、第６日前後にｐＨをシフトさせた。細胞の１つの群のｐＨを６．８５から６．９５にシフトさせ、少なくとも１つの他の群のｐＨを７．１から６．９５にシフトさせた。細胞の少なくとも３つの群に対して、ｐＨをシフトさせず、ｐＨを６．８５、６．９５又は７．１０に維持した。

全部で１２日間、細胞を培養した。１２日間の培養期間を通じて生存可能細胞密度（ＶＣＤ）を測定したが、その結果を表１で示す。

細胞培養第４日から数日後、ＴＡＦレベル、高マンノース（ＨＭ）グリカンレベル及び非フコシル化（ＡＦ）グリカンレベルを測定したが、観察した結果及び予想されるモデル結果を表２で示す。

予想外に、初期ｐＨはＴＡＦレベルと正の関連があった（図３）。ｐＨが上昇するにつれて、ＴＡＦレベルも上昇した。図４で示されるように、７．１のｐＨで維持するか又は７．１で維持し、次いで第６日前後に６．９５にシフトさせた細胞培養のＴＡＦレベルは、より低いｐＨ、６．９５又は６．８５で維持した他の群のＴＡＦレベルよりも高かった。およそ２倍以上の上昇が観察された。また、図４で示されるように、６．８５のｐＨで維持するか、又は６．８５のｐＨで維持し、次いで６．９５にシフトさせた細胞培養のＴＡＦレベルは、より高いｐＨ６．９５及び７．１で維持した他の群のＴＡＦレベルよりも低かった。

これらの結果の統計学的分析を行った。図５は、細胞培養期間、第０～６日、第６～９日、第９～１２日及び第１２日中のＴＡＦに対する初期設定ｐＨ値の様々な相関を示す。各期間でのＴＡＦに対する初期ｐＨの相関は強かった。図６で示されるように、ＴＡＦ（初期細胞培養期間後のＴＡＦレベル）に対する最終ｐＨ（初期細胞培養期間後のｐＨ）の相関は弱い。

最終ｐＨ（初期細胞培養期間後のｐＨ）の効果を評価した。細胞の２群を１２日間培養した。両群に対して、細胞培養の最初の５日間、６．９５のｐＨで細胞を培養した。続く数日間、群１をこのｐＨで維持した一方で、群２のｐＨを第５日～第９日にわたり、６．８５にシフトさせ、次いで第９日～第１２日に７．１にシフトさせた。図７で示されるように、両群は非常に類似したＴＡＦレベルを示した。これらの結果から、第５日の後のｐＨの調整はＴＡＦレベルに影響しないことが示唆される。

この実施例は、ＴＡＦのレベルに対する、初期細胞培養期間中のｐＨの影響を示す。

実施例２
この実施例は、初期細胞培養期間中の細胞培養ｐＨがＴＡＦのレベルにどのように影響するかということの別の例を提供する。

組み換えＩｇＧ４抗体を細胞が発現したことを除いて、基本的に実施例１に記載のように、灌流工程によるバイオリアクター中での細胞培養を行った。培養の作業体積は１．５Ｌであり、培養の持続時間は１５日間であった。初期温度は３６℃又は３７℃の何れかであり、初期ｐＨは６．６５～６．９の範囲であった。第５日の後（第５日～第８日）に３４から３６℃の温度に温度をシフトさせた。表３は、この試験の様々な実験条件を概説する。

実施例１に記載のように、ＨＭ及び非フコシル化グリコフォームのレベルを測定した。２つのレベルの合計を計算し、総非フコシル化グリコフォームとして標識した。ＨＭの範囲は１．４～２．６％であり、非フコシル化グリコフォームは０．７～１．６であった。ＴＡＦレベルの範囲は２．１～３．９であった。図８で示されるように、ｐＨ及び最終温度の両方がＴＡＦに影響を与えた。ｐＨは正の相関を示し、最終温度は負の相関を示した。

実施例３
この実施例は、初期細胞培養期間の初期ｐＨの効果がＴＡＦレベルに対してあり、初期細胞培養期間後のｐＨシフトの効果がＴＡＦレベルに対してあることを示す。

基本的に実施例１に記載のとおり、灌流工程後、バイオリアクター中でＩｇＧ１抗体を発現する細胞を培養した。全部で１２日間、細胞を培養し、約３６℃の温度で維持した。３種類の初期設定ｐＨ値（６．８５、６．９５又は７．０５）のうち１つで細胞を培養し、初期細胞培養期間中（第１日）、又は初期細胞培養期間後（第５日）に、ｐＨをシフト（上昇又は低下の何れか）させた。群Ａの細胞は７．０５の初期設定ｐＨ値で培養し、群Ｂの細胞は６．８５の初期設定ｐＨ値で培養し、一方、群Ｃの細胞は６．９５の初期設定ｐＨ値で培養した。群Ａの細胞を２つのサブグループ：サブグループＡ１及びサブグループＡ２に分けた。サブグループＡ１の細胞は、７．０５の初期設定ｐＨ値で培養し、初期細胞培養期間中（第１日）にｐＨを６．９５にシフトさせ、一方でサブグループＡ２の細胞は、７．０５の初期設定ｐＨ値で培養し、初期細胞培養期間後（第５日）にｐＨを６．９５にシフトさせた。群Ｂの細胞に対しては初期細胞培養期間後（第５日）に６．９５にｐＨを上昇させ、群Ｃの細胞に対しては、初期細胞培養期間後（第５日）にｐＨを６．８５に低下させた。一連の対照培養において、ｐＨを６．９５に設定して、培養期間の全期間にわたり維持した（すなわちｐＨシフトなし）。

１２日間の培養期間後、ＨＩＬＩＣを介して、基本的に実施例１に記載のように、群のそれぞれにより産生されるＩｇＧ１抗体のＴＡＦグリコフォームを測定した。対照培養により産生される抗体の％ＴＡＦは約３．１％～約４．１４％の範囲であった。対照培養により産生される抗体と比較して、群Ａにより産生される抗体の平均％ＴＡＦはより高く、一方で群Ｂにより産生される抗体の平均％ＴＡＦはより低かった。より高い初期ｐＨはより高い％ＴＡＦと相関し、より低い初期ｐＨはより低い％ＴＡＦと相関した。

興味深いことに、サブグループＡ２の細胞により産生されるＩｇＧ１抗体の％ＴＡＦはサブグループＡ２により産生される抗体のＴＡＦと非常に類似しており、このことから、初期細胞培養期間後のｐＨシフトがＴＡＦレベルに影響を与えなかったことが示唆される。この観察は、群Ｃの細胞により産生される抗体のＴＡＦレベルが対照細胞培養のＴＡＦレベルと非常に類似していたという観察によってさらに裏付けられた。群Ｃの細胞が下向きのｐＨシフトに供されたにもかかわらず、ＴＡＦは対照培養とほぼ同じであったが、それは、シフトが初期細胞培養期間後（第５日）に行われたからである。

この実施例は、初期細胞培養期間後に起こるｐＨシフトは、ＴＡＦレベルに顕著に影響を与えず、より高い設定ｐＨ値がより高いＴＡＦレベルに傾き、一方でより低い設定ｐＨ値はより低いＴＡＦレベルに傾くことを明らかにした。

本明細書中で引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む参考文献は全て、各参考文献が、参照により組み込まれ、本明細書中でその全体において示された場合と同程度まで、参照により本明細書によって組み込まれる。

「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語の使用及び本開示を記載する内容における類似の言及（特に、次の特許請求の範囲の内容において）は、本明細書中で別段の断りがない限り、又は内容と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されたい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の記載がない限り、制約のない用語として解釈されたい（すなわち「含むが限定されない」を意味する）。

本明細書中の値の範囲の引用は、単に、本明細書中で別段の断りがない限り、範囲及び各エンドポイント内に入る各個別の値を個々に指す省略法となるものであり、各個別の値及びエンドポイントは、それが個々に本明細書中で引用されるかのように、本明細書中に組み込まれる。

本明細書中に記載の方法は全て、本明細書中で別段の指示がない限り、又は内容と明らかに矛盾しない限り、何らかの適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供されるあらゆる例又は代表的な語（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示を単により詳細に明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲における制限を提起しない。本願の言語のうち、本開示の実施に必須なものとして何らかの非主張要素を示すものとして解釈されるべきものはない。

本開示の好ましい実施形態は、本開示を実施するための発明者らにとって公知の最良の形態を含め、本明細書中に記載される。前述の記載を読めば、これらの好ましい実施形態の変種が当業者に明らかになり得る。発明者らは、当業者が、必要に応じてこのような変種を使用することを予期し、発明者らは、本開示が、具体的に本明細書中に記載のもの以外にまた実施されるはずであることを意図する。したがって、この開示は、適用可能な法律により許容される場合、本明細書に添付される特許請求の範囲で示される主題の全ての変更物及び同等物を含む。さらに、本明細書中で別段の指示がない限り、又は内容と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形物の上記の要素の何らかの組み合わせが本開示により包含される。

Claims (34)

1. 細胞培養においてグリコシル化適格細胞により産生される組換えグリコシル化タンパク質の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームのレベルを調整する方法であって、（ｉ）初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で前記細胞培養を維持すること、及び（ｉｉ）前記初期細胞培養期間後に、前記細胞培養のｐＨが前記初期設定ｐＨ値から０．０５から０．１５シフトすることを許容することを含み、
   前記初期設定ｐＨ値が６．５０より高く、７．５未満であるｐＨから選択され、（ａ）対照細胞培養の対照ｐＨよりも高いと、対照細胞培養と比較してＴＡＦグリコフォームの増加につながり、又は（ｂ）対照細胞培養の対照ｐＨよりも低いと、対照細胞培養と比較してＴＡＦグリコフォームの減少につながり、及び
   前記初期細胞培養期間が４日～６日間であり、
   前記組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の抗体であり、
   前記グリコシル化適格細胞は、ＣＨＯであり、
   前記細胞培養は、灌流法によって行われ、
   前記初期細胞培養期間における前記細胞培養の温度は、３６～３７℃である、方法。
2. 細胞培養においてグリコシル化適格細胞により産生される組換えグリコシル化タンパク質の総非フコシル化（ＴＡＦ）グリコフォームのレベルを調整する方法であって、（ｉ）前記細胞培養が８．２ｘ１０^６～１．９４ｘ１０^７、又は１．２１ｘ１０^７～３．４６ｘ１０^７の生存可能細胞密度（ＶＣＤ）に到達するまで、初期細胞培養期間にわたり初期設定ｐＨ値で前記細胞培養を維持すること、及び（ｉｉ）前記初期細胞培養期間後に、前記細胞培養のｐＨが前記初期設定ｐＨ値から０．０５～０．１５シフトすることを許容することを含み、
   前記初期設定ｐＨ値が６．５０より高く、７．５未満であり、（ａ）対照細胞培養の対照ｐＨよりも高いと、対照細胞培養と比較してＴＡＦグリコフォームの増加につながり、又は（ｂ）対照細胞培養の対照ｐＨよりも低いと、対照細胞培養と比較してＴＡＦグリコフォームの減少につながり、
   前記組換えグリコシル化タンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の抗体であり、
   前記グリコシル化適格細胞は、ＣＨＯであり、
   前記細胞培養は、灌流法によって行われ、
   前記初期細胞培養期間における前記細胞培養の温度は、３６～３７℃である、方法。
3. 前記初期細胞培養期間が４日～６日間である、請求項２に記載の方法。
4. ４日間又は５日間にわたり前記初期設定ｐＨ値で前記細胞培養を維持することを含む、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記初期設定ｐＨ値が６．５５より高く、７．２未満である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記初期設定ｐＨ値が、６．６０より高くかつ７．２未満である、請求項５に記載の方法。
7. 前記初期設定ｐＨ値が、６．６０より高く、７．２未満である、請求項６に記載の方法。
8. 前記初期設定ｐＨ値が、６．６５より高く、かつ７．２未満である、請求項７に記載の方法。
9. 前記初期設定ｐＨ値が、
   （ａ）６．７０より高く、７．２未満である、
   （ｂ）６．７５より高く、７．２未満である、
   （ｃ）６．８０より高く、７．２未満である、
   （ｄ）６．８５より高く、７．２未満である、
   （ｅ）７．０～７．１である、又は
   （ｆ）６．８５以上であり、６．９５未満である、
   請求項８に記載の方法。
10. 前記初期細胞培養期間中、初期温度で前記細胞培養を維持することをさらに含み、前記初期温度が３０℃～４０℃又は３２℃～３８℃の温度から選択される、請求項１～９の何れか１項に記載の方法。
11. 初期温度で前記細胞培養を維持することが、前記初期細胞培養期間中に前記初期温度の±１℃以内で前記細胞培養を維持することを含むか、又は前記細胞培養の温度が、前記初期細胞培養期間中、前記初期温度から１℃を超えてシフトしない、請求項１０に記載の方法。
12. 前記初期設定ｐＨ値が、対照細胞培養の対照ｐＨより高く、前記対照細胞培養と比較して、前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルが上昇する、請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質の高マンノース（ＨＭ）グリコフォームのレベルが、前記対照細胞培養と比較して上昇する、
    請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
14. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８及び／又はＭａｎ９のうち１つ以上のレベルが、前記対照細胞培養と比較して上昇する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルが、前記対照細胞培養と比較して上昇する、
    請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ以上のレベルが、前記対照細胞培養と比較して上昇する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記初期設定ｐＨ値が、対照細胞培養の対照ｐＨよりも低く、前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＴＡＦグリコフォームのレベルが、前記対照細胞培養と比較して低下する、請求項１～１６の何れか１項に記載の方法。
18. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質の高マンノース（ＨＭ）グリコフォームのレベルが、前記対照細胞培養と比較して低下する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８及び／又はＭａｎ９のうち１つ以上のレベルが、前記対照細胞培養と比較して低下し、及び／又は（ｂ）前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質の非フコシル化グリコフォームのレベルが、前記対照細胞培養と比較して低下する、請求項１８に記載の方法。
20. 前記初期細胞培養期間後の前記組換えグリコシル化タンパク質のＡ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５のうち１つ以上のレベルが、前記対照細胞培養と比較して低下する、
    請求項１９に記載の方法。
21. 前記初期細胞培養期間後に、前記細胞培養のｐＨが０．０５シフトすることを許容することを含む、請求項１～２０の何れか１項に記載の方法。
22. 前記ｐＨがより低いｐＨへ、またはより高いｐＨにシフトすることが許容される、請求項１～２１の何れか１項に記載の方法。
23. （ａ）前記初期細胞培養期間後に、前記温度が２℃を超えてシフトすることを許容すること及び／又は（ｃ）前記初期細胞培養期間後に、２℃を超えて温度をシフトさせることを含む、請求項１～２２の何れか１項に記載の方法。
24. 温度のシフトが、温度の低下又は温度の上昇を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 温度を２℃～４℃低下させる、又は温度を２℃～４℃上昇させる、請求項２４に記載の方法。
26. 前記初期細胞培養期間中に１μＭ未満の濃度のマンガン及び／又は前記初期細胞培養期間中に３０ｐｐｂ以下の濃度の銅を含む培地中で前記細胞培養を維持することを含む、請求項１～２５の何れか１項に記載の方法。
27. 前記培地が、５ｐｐｂ以上の濃度の銅を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 初期細胞培養期間中、５０ｍｍＨｇ～１００ｍｍＨｇの範囲内に前記細胞培養の溶解酸素（ＤＯ）レベルを維持することを含む、
    請求項１～２７の何れか１項に記載の方法。
29. 前記組換えグリコシル化タンパク質が、式：
    Ａｓｎ－Ｘａａ_１－Ｘａａ_２
    （式中、Ｘａａ_１は、Ｐｒｏ以外の何れかのアミノ酸であり、Ｘａａ_２はＳｅｒ又はＴｈｒである）の１つ以上のＮ－グリコシル化コンセンサス配列を含む、請求項１～２８の何れか１項に記載の方法。
30. 前記組換えグリコシル化タンパク質が、Ｎ結合型グリコシル化部位を保持する断片結晶化可能（Ｆｃ）領域の一部を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧのＦｃ領域である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記組換えグリコシル化タンパク質が、抗体、ペプチボディ又はＦｃ融合タンパク質である、請求項２９又は３０に記載の方法。
33. 前記組換えグリコシル化タンパク質を含む前記細胞培養の上清を回収することをさらに含み、ここで、細胞培養期間の合計は少なくとも１０日間である、請求項１～３２の何れか１項に記載の方法。
34. 前記上清から前記組換えグリコシル化タンパク質を精製することを含み、前記組換えグリコシル化タンパク質がＦｃを含み、前記組換えグリコシル化タンパク質の精製が、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂の使用を含んでもよい、請求項３３に記載の方法。

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