JP7678005B2 - Ｈｅｒ２を標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子 - Google Patents

Ｈｅｒ２を標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とするＨｅｒ２標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、それらを製造するための方法、これらの分子を含有する医薬組成物、並びに疾患、特にがんの治療における免疫調節剤及び／又は共刺激剤としてのその使用に関する。
背景
がん免疫療法は、黒色腫、非小細胞肺がん及び腎細胞癌腫等のがん型において劇的で持続的な応答をもたらすことができる、ますます有効な治療選択肢になりつつある。これは主に、抗ＰＤ－１（例えば、Ｍｅｒｃｋのキイトルーダ；ＢＭＳのオプジーボ）、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、ＢＭＳのヤーボイ）及び抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｒｏｃｈｅのテセントリク）を含むいくつかの免疫チェックポイント遮断の成功によって推進される。これらの薬剤は、多くのがん型の標準治療として、又は併用療法の骨格として役立つ可能性が高いが、患者のごく一部（２５％未満）がそのような治療法から利益を得るにすぎない。さらに、様々ながん（前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肉腫、非トリプルネガティブ乳がん等）は、これらの免疫調節物質に対する免疫選択（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示す。いくつかの報告は、既存の抗腫瘍Ｔ細胞がないことが一部の患者の応答がないこと又は不十分であることに寄与することを示している。要約すると、既存の免疫療法の印象的な抗がん効果にもかかわらず、大きながん患者集団に対処すること、並びに新規な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘導及び増強することを目的とする治療法を開発することに対する明確な医学的必要性が存在する。
ＣＤ２８は、重要なシグナル伝達モチーフを含む単一の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに結合したペア型Ｖセット免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ：ｐａｉｒｅｄ Ｖ－ｓｅｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）ドメインを特徴とする共刺激分子のサブファミリーの確立メンバーである（Ｃａｒｒｅｎｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，２００２）。サブファミリーの他のメンバーとしては、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＧＩＴ及びＢＴＬＡ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，２０１３）が挙げられる。ＣＤ２８発現はＴ細胞に限定され、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４を発現するものを含む、全てのナイーブ及び抗原経験サブセットの大部分で一般的である。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４は高度に相同であり、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び腫瘍細胞上に発現される同じＢ７分子ＣＤ８０及びＣＤ８６への結合について競合する（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。リガンドのＢ７ファミリーに対するＣＴＬＡ－４のより高い親和性は、ＣＴＬＡ－４がリガンド結合についてＣＤ２８を打ち負かすこと、及びエフェクターＴ細胞応答を抑制することを可能にする（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。対照的に、ＰＤ－１は、ＣＤ２８の細胞質ドメインを部分的に脱リン酸化することによってＣＤ２８シグナル伝達を阻害することが示された（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。プロフェッショナル抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６によるＣＤ２８のライゲーションは、ナイーブＴ細胞の機能的デノボプライミング、その後のクローン増殖、サイトカイン産生、標的細胞溶解、及び長期記憶の形成に厳密に必要とされる。ＣＤ２８リガンドの結合はまた、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢ等の誘導性共刺激受容体の発現を促進する（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３で概説）。ＣＤ２８のライゲーション時に、ジスルフィド結合ホモ二量体、膜近位ＹＭＮＭモチーフ及び遠位ＰＹＡＰモチーフは、いくつかのキナーゼ及びアダプタータンパク質と複合体を形成することが示されている（Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０）。これらのモチーフは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１及びＮＦκＢファミリー転写因子のＣＤ２８依存的活性化によって媒介されるＩＬ２転写の誘導に重要である（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。しかしながら、リン酸化及びユビキチン化のための更なる十分に特徴づけられていない部位が、ＣＤ２８の細胞質ドメイン内に見られる。（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）によって概説されるように、ＣＤ２８によって開始される経路は、従来のＴ細胞の増殖及びエフェクター機能の促進において重要な役割を有する。ＣＤ２８ライゲーションはまた、制御性Ｔ細胞の抗炎症機能を促進する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞受容体からのシグナルを部分的に増強することによってＴ細胞を共刺激するが、固有のシグナル伝達事象を媒介することも示された（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３；Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０；Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＣＤ２８によって特異的に引き起こされるシグナルは、下流タンパク質のリン酸化及び他の翻訳後修飾（例えば、ＰＩ３Ｋ媒介性リン酸化）、転写変化（例えば、Ｂｃｌ－ｘＬ発現）、エピジェネティック変化（例えばＩＬ－２プロモーター）、細胞骨格リモデリング（例えば、微小管形成中心の配向）及び解糖速度の変化（例えば、解糖流量）を含む、Ｔ細胞機能の多くの重要な側面を制御する。ＣＤ２８欠損マウスは、感染性病原体、同種移植片抗原、移植片対宿主病、接触過敏症及び喘息に対する応答が低下している（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３）。ＣＤ２８媒介性共刺激の欠如は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖の減少、胚中心形成及び免疫グロブリンアイソタイプクラスの切り替えの重度の阻害、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞分化の減少並びにＴｈ２型サイトカインの発現をもたらす。ＣＤ４依存性細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も影響を受ける。重要なことに、ＣＤ２８欠損ナイーブＴ細胞は、特により低い抗原濃度で増殖応答の低下を示した。Ｔ細胞上でＣＤ２８を連結させることが抗腫瘍能を有するという考えが、文献により相次いで支持されている。最近の証拠は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤の抗がん効果がＣＤ２８に依存することを実証している（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１遮断の治療効果を調査する臨床研究は、進行した黒色腫及び他のがんを有する患者において非常に有望な結果を示している。これに加え、細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚ）及び細胞内共刺激ドメイン（ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢドメイン）に融合した細胞外抗原認識ドメインを含む人工キメラＴ細胞受容体を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の注入は、Ｂ細胞がん及び他のがんにおける高い応答率及び応答の持続性を示した。
ＣＤ２８アゴニスト抗体は、２つのカテゴリー：（ｉ）ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体及び（ｉｉ）ＣＤ２８従来のアゴニスト抗体に分けることができる。通常、ナイーブＴ細胞の活性化には、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ、シグナル１）の連結とＣＤ２８による共刺激シグナル伝達（シグナル２）の両方が必要である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）は、明白なＴ細胞受容体関与なしにＴ細胞を自律的に活性化することができるＣＤ２８特異的モノクローナル抗体である（Ｈｕｅｎｉｇ，２０１２）。齧歯類では、ＣＤ２８ＳＡは、従来の制御性Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ２８ＳＡ抗体は、自己免疫、炎症及び移植の複数のモデルにおいて治療有効である。しかしながら、ヒトＣＤ２８ＳＡ抗体ＴＧＮ１４１２の第Ｉ相研究は、２００６年に生命を脅かすサイトカインストームをもたらした。追跡調査は、ヒトＴ細胞及び前臨床動物モデルのＴ細胞のＣＤ２８応答性の違いによる投薬過誤によって毒性が引き起こされたことを示唆している。ＴＧＮ１４１２は現在、ＲＡ患者及び転移性又は切除不能な進行性固形悪性腫瘍を有する患者における非盲検多施設用量漸増試験で再評価されている。ＣＤ２８の従来のアゴニスト抗体、例えばクローン９．３は、ＣＤ２８天然リガンドを模倣し、Ｔ細胞受容体シグナルの存在下でのみＴ細胞活性化を増強することができる（シグナル１）。公開された見識は、抗体の結合エピトープが、アゴニスト抗体がスーパーアゴニストであるか従来のアゴニストであるかに大きな影響を及ぼすことを示している（Ｂｅｙｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の側方モチーフに結合するが、従来のアゴニスト分子９．３はリガンド結合エピトープの近くに結合する。異なる結合エピトープの結果として、スーパーアゴニスト抗体及び従来のアゴニスト抗体は、Ｔ細胞の表面上にＣＤ２８分子の線形複合体を形成する能力が異なる。正確には、ＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の線形アレイを効率的に形成することができ、これはおそらくＴ細胞活性化の閾値を超えるのに十分な凝集したシグナル伝達成分をもたらす。一方、従来のアゴニスト９．３は、構造が直鎖状ではない複合体をもたらす。９．３クローンに基づく従来のアゴニスト結合因子を変換する試みは、メラノーマ関連プロテオグリカン及びＣＤ２８に対する組換え二重特異性一本鎖抗体を使用して以前に発表されている（Ｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００９）。報告された二重特異性一本鎖抗体は、多量体コンストラクトを形成する二重特異性一本鎖抗体の固有の傾向に基づいて、従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子９．３の使用にもかかわらず、「超アゴニスト」活性を発揮することが報告された。
ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２；ＥｒｂＢ２）は、受容体チロシンキナーゼであり、膜貫通受容体の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。Ｈｅｒ２は、様々な腫瘍型で過剰発現され、疾患の開始及び進行に関与している。Ｈｅｒ２は予後不良に関連する。例えば、Ｈｅｒ２の過剰発現は、ヒト乳がんのおよそ３０％に観察され、これらの腫瘍に関連する侵攻性の成長及び臨床転帰不良に関連付けられている（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７－１８２）。
ヒト化抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＣＡＳ １８０２８８－６９－１、ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８、ｒｈｕＭＡｂ Ｈｅｒ２、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、Ｈｅｒ２（米国特許第５６７７１７１号；米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６１６５４６４号；米国特許第６３３９１４２号；米国特許第６４０７２１３号；米国特許第６６３９０５５号；米国特許第６７１９９７１号；米国特許第６８００７３８号；米国特許第７０７４４０４号；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１ １３２－９；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７－１２；Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２）の細胞外ドメインを標的とする。トラスツズマブは、Ｈｅｒ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害し、抗体依存性細胞傷害性メディエータ、ＡＤＣＣであることが示されている（Ｈｕｄｚｉａｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９：１ １６５－７２；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ；３７：２５５－６３；Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２８２５－２８３１；Ｈｏｔａｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９６）［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；３７：４７１；Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ，ｅｔ ａｌ（１９９７）［ａｂｓｔｒａｃｔ］．Ｐｒｏｃ Ａｍ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；３８：６０２；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６（４），Ｓｕｐｐｌ １２：６０－７０；Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．ａｎｄ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｍａｇａｚｉｎｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｖｏｌ．２：１２７－１３７）。
ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）は、Ｈｅｒ２過剰発現転移性乳がん患者（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７－７４４）の治療に対して１９９８年に承認された。２００６年に、ＦＤＡは、Ｈｅｒ２陽性のリンパ節陽性乳がんを有する患者のアジュバント治療のために、ドキソルビシン、シクロホスファミド、及びパクリタキセルを含有する治療レジメンの一部として、ハーセプチン（登録商標）を承認した。ペルツズマブ（組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４、パージェタ（ＰＥＲＪＥＴＡ）（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏとしてもまた既知）は、Ｈｅｒ２を標的とする別の抗体治療である。ペルツズマブは、Ｈｅｒ二量化阻害剤（ＨＤＩ）であり、他のＨｅｒ受容体との活性ヘテロ二量体又はホモ二量体（ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、及びＨｅｒ４等）を形成するＨｅｒ２の能力を阻害するように機能する。例えば、Ｈａｒａｒｉ ａｎｄ Ｙａｒｄｅｎ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：６１０２－１４（２０００）；Ｙａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：１２７－３７（２００１）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １０：１５８－９（２００３）；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６－６０（２００３）；及びＭａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４４：１７６－７（２００３）；米国特許第７５６０１１１号を参照されたい。パージェタ（登録商標）は、進行期又は後期（転移性）のＨｅｒ２陽性乳がんを有する患者の治療に対して、トラスツズマブ及びドセタキセルと組み合わせて２０１２年に最初に承認された。一方、トラスツズマブとペルツズマブとを用いた併用療法は、ｆ Ｈｅｒ２陽性、局所進行性、炎症性又は早期の乳がんのネオアジュバント（術前）治療、及び再発リスクの高いＨｅｒ２陽性早期乳がん（ＥＢＣ）のアジュバント（術後）治療にも承認されている。パージェタ及びハーセプチンの作用機序は、両方ともＨｅｒ２受容体に結合するが異なる場所に結合するので、互いに補完すると考えられている。パージェタとハーセプチンとの組み合わせは、ＨＥＲシグナル伝達経路のより包括的な二重遮断を提供し、したがって腫瘍細胞の成長及び生存を妨げると考えられている。ヒトＥｒｂＢ２のドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対する二重特異性二価ＨＥＲ２抗体は、国際公開第２０１２／１４３５２３号に開示されている。ハーセプターグ（Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇ）と呼ばれる、抗体ｒｈｕＭａｂ ２Ｃ４及びｈｕ４Ｄ５の最適化されたバリアントを含む二重特異性ＨＥＲ－２抗体は、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されている。
乳癌腫におけるトラスツズマブの治療有効性は十分に実証されているが、耐性のためにトラスツズマブから利益を得ない患者が多く存在する。低レベルのＨｅｒ２を発現する特定のがんにおける有効な抗Ｈｅｒ２療法の欠如、現在の療法に対する耐性、及びＨｅｒ２発現がんの有病率を考慮すると、そのようながんを治療するために新たな治療法が必要である。
限界量の抗ＣＤ３二重特異性抗体、すなわちＨｅｒ２標的化ＣＤ３抗体等のＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）を作動性抗ＣＤ２８分子と組み合わせると、より良好なＴ細胞活性化が達成されることが分かった。ＣＤ２８が様々な腫瘍適応症（Ｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）においてＴ細胞上のベースラインで発現され、ＣＤ２８シグナル伝達の活性化がＴ細胞受容体シグナルを増強することを考えると、ＴＣＢ分子とＨｅｒ２標的化ＣＤ２８抗原結合分子との組み合わせは相乗的に作用して強力で長期持続性の抗腫瘍応答を誘導すると予想される。したがって、本発明者らは、本明細書において、ＴＣＢとの相乗効果を示し、ＴＣＢシグナルの存在下での厳密なＨｅｒ２標的依存性のためにＣＤ２８結合一価を必要とする新規な腫瘍標的化アゴニストＣＤ２８分子を記載する。
概要
本発明は、多量体を形成することを必要とせずに腫瘍依存性Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を達成するＨｅｒ２標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を記載する。本発明の二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とし、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインを含む。さらに、ＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを持つ。それにより、Ｆｃ受容体媒介性架橋が抑止され、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインの結合による架橋によって腫瘍特異的活性化が達成される。
したがって、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
特に、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉｉ）配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｖ）配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉｉｉ）配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｖ）配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。
一態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更なる態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更に別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更には、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。
別の特定の態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。更なる態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
別の態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
更に別の態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
別の態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
更なる態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメイン及び／又はＨｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片と、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能なクロスＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なクロスＦａｂ断片と、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能なＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ断片である。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、第１のサブユニット及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、Ｆｃドメインが安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成される、本明細書に開示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、（ｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。
本発明の別の態様によれば、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、本発明の１つ以上の単離ポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター、特に、１つ以上の発現ベクター、及び本発明の１つ以上の単離ポリヌクレオチド又は１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、宿主細胞は原核細胞である。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、を含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の製造方法が提供される。任意に、この方法はまた、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収することを含む。本発明は、本発明の方法により作製した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子もまた包含する。
本発明は更に、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、疾患、特にがんの治療における使用のためのものである。一態様では、医薬組成物は、Ｈｅｒ２陽性がんの治療に使用するためのものである。
二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を使用する方法も本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物を提供する。一態様では、（ａ）細胞活性化の増強又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、疾患の治療に使用するための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物が提供される。特定の態様では、疾患はがん、特にＨｅｒ２陽性がんである。別の態様では、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物は、がんの治療における使用のためのものであり、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである。更なる態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はがんの治療において使用するための医薬組成物が提供され、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である。更に別の態様では、がんの治療における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は記載の医薬組成物が提供され、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである。
疾患を治療するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物の使用、並びに個体における疾患を治療する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を投与することを含む、方法も提供される。特定の態様では、疾患はがんである。一態様では、個体における（ａ）Ｔ細胞活性化を増強するか又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能を増強する方法であって、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を当該個体に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、疾患を治療するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用であって、治療が化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法に使用するための他の薬剤との同時投与を含む、使用が提供される。更なる態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と同時投与することを含む、方法が提供される。更なる態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を同時投与することを含む方法が提供される。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である。別の態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体を同時投与することを含む方法が提供される。個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容され得る形態で含む組成物を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む方法も提供される。上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
図１Ａ～図１Ｄには、本明細書に記載される分子の概略図が示される。図１Ａは、一価ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプ（「Ｆｃサイレント」）としてのＣＤ２８アゴニスト抗体バリアントの概略図を示す。図１Ｂは、１＋１フォーマットの二重特異性Ｈｅｒ２－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、ＣＤ２８抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに交換され（ＶＨ／ＶＬクロスｆａｂ）、Ｈｅｒ２抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの特定のアミノ酸が交換され（荷電バリアント）、軽鎖とのより良好な対合を可能とする。Ｆｃドメインはｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡバージョンである。図１Ｃは、Ｎ２９７Ｇ変異を含む両重鎖を有する１＋１フォーマットの二重特異性Ｈｅｒ２－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、両Ｆａｂ分子は異なる細胞株で発現され、精製され、インタクト二重特異性に集合される。図１Ｄは、１＋１フォーマットの二重特異性Ｈｅｒ２－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、Ｈｅｒ２抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに交換され（ＶＨ／ＶＬクロスｆａｂ）、ＣＤ２８抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの特定のアミノ酸が交換され（荷電バリアント）、軽鎖とのより良好な対合を可能とする。 ＣＤ２８（ＳＡ）の可変ドメイン及びそのバリアントのアラインメントを図２Ａ～２Ｄに示す。システイン５０を除去し、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を様々な程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＨドメイン及びそのバリアントのアラインメントを図２Ａに示す。注目すべきことに、ＶＨバリアントｉ及びｊでは、ＣＤ２８（ＳＡ）のＣＤＲをＩＧＨＶ１－２フレームワークからＩＧＨＶ３－２３フレームワークにグラフトした（図２Ｂ）。図２Ｃには、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を異なる程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬドメイン及びそのバリアントのアラインメントを示す。バリアントでは、ＣＤＲをトラスツズマブ（ハーセプチン）ＶＬ配列のフレームワーク配列にグラフトした（図２Ｄ）。 図３Ａ～３Ｃでは、細胞上のヒトＣＤ２８に対する上清からの単一特異性の一価ＩｇＧフォーマットにおける親和性低下ＣＤ２８アゴニスト抗体バリアントの結合を示す。陰性対照（抗ＤＰ４７）及び元のＣＤ２８抗体ＣＤ２８（ＳＡ）と比較した、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）への結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。バリアント１～１０の結合曲線を図３Ａに示し、バリアント１１～２２の結合曲線を図３Ｂに示し、バリアント２３～３１の結合曲線を図３Ｃに示す。ＳＤを伴う技術的複製を示す。 図４Ａは、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ－４によって細胞表面上に発現されたＨｅｒ２へのＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の結合を示す。Ｈｅｒ２－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ６７４１）又は対照分子（ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体）を、Ｘ軸に示すように異なる濃度でＨｅｒ２発現細胞株ＫＰＬ－４とインキュベートした。その後、過剰な分子及び結合していない分子を洗浄し、結合した分子を二次結合Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的で検出した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定し、試験した分子の親和性を用量依存的に示す。示されている値は、技術的複製＋／－ＳＥＭの平均である。図４Ｂは、ＣＨＯｋ１－ｈｕＣＤ２８細胞株の細胞表面上に発現されたＣＤ２８へのＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の結合を示す。Ｈｅｒ２－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ６７４１）又は対照分子（ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体）を、Ｘ軸に示すように異なる濃度でＣＨＯｋ１－ｈｕＣＤ２８細胞株とインキュベートした。その後、過剰な分子及び結合していない分子を洗浄し、結合した分子を二次結合Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的で検出した。蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定し、試験した分子の親和性を用量依存的に示す。示されている値は、技術的複製＋／－ＳＥＭの平均である。 図５は、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子が、ＫＰＬ－４細胞の存在下でのＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧクローンＯＫＴ３（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＨｅｒ２－ＣＤ２８（Ｐ１ＡＦ６７４１）、又は対照分子（ＤＰ４７）の存在下でのＫＰＬ－４細胞との６時間の共インキュベーション後の発光読み出しによって測定されたＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。点線は抗ＣＤ３のみを示す。示されている値は、技術的複製＋／－ＳＥＭの平均である。 図６Ａは、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ－４の細胞表面上に発現されたＨｅｒ２へのＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子Ｂ、Ｄ及びＡの結合を示す。陰性対照（生殖細胞系対照ＤＰ４７ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＰＧＬＡＬＡ）を含む全ての分子を、５倍希釈で０．０１～５００ｎＭの濃度範囲でインキュベートした。その後、過剰な分子及び未結合分子を洗浄し、Ｆｃγ断片特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体で結合分子を検出した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定し、試験した分子の親和性を用量依存的に示した。全ての値を、技術的三連＋／－ＳＥＭの平均として示す。図６Ｂは、ＣＨＯｋ１－ｈｕＣＤ２８の細胞表面上に発現されたＣＤ２８へのＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子Ｂ、Ｄ及びＡの結合を示す。陰性対照（ＤＰ４７ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＰＧＬＡＬＡ）を含む全ての分子を、５倍希釈で０．０１～５００ｎＭの濃度範囲でインキュベートした。その後、過剰な分子及び未結合分子を洗浄し、Ｆｃγ断片特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２二次抗体で結合分子を検出した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーによって測定し、試験した分子の親和性を用量依存的に示した。全ての値を、技術的三連＋／－ＳＥＭの平均として示す。 図７Ａ及び図７Ｂは、ＫＰＬ４腫瘍標的細胞の存在下（図７Ａ）又は非存在下（図７Ｂ）でのトラスツズマブＣＬＣ－ＣＤ２８（分子Ｄ）とペルツズマブＣＬＣ－ＣＤ２８（分子Ａ及びＢ）の交差バリアント間の比較を示す。ＤＰ４７ ＩｇＧ１ Ｆｃ ＰＧＬＡＬＡを非結合対照として含めた。レポーター細胞及び標的細胞を５：１のＥ：Ｔ比で播種した。抗ＣＤ３を１０ｎＭの濃度に添加した後、分子を０．００２ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度で４倍の希釈係数でインキュベートした。６時間のインキュベーション後、基質緩衝液を添加し、発光を測定した。全ての値を、技術的複製＋／－ＳＥＭの平均として示す。 図８Ａは、高Ｈｅｒ２発現細胞株ＫＰＬ４と共に培養したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導活性化に対する、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子２Ｃ４／ＣＤ２８（分子Ｆ）及び４Ｄ５／ＣＤ２８（分子Ｇ）、並びに５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＣＤ２８抗体の効果を示すグラフである。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９及びＣＤ２５の二重発現により測定した。図８Ｂは、高Ｈｅｒ２発現細胞株ＫＰＬ４と共に培養したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導活性化に対する、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子２Ｃ４／ＣＤ２８及び４Ｄ５／ＣＤ２８、並びに５００ｎｇ／ｍＬの濃度のＣＤ２８抗体の効果を示すグラフである。Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ６９及びＣＤ２５の二重発現により測定した。図８Ｃは、ＫＰＬ－４腫瘍細胞のＨＥＲ２ ＴＤＢ媒介標的細胞殺傷に対するＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子２Ｃ４／ＣＤ２８及び４Ｄ５／ＣＤ２８、並びにＣＤ２８抗体の効果を示すグラフである。 図９Ａ～９Ｇは、治療の２４時間後にＴ細胞活性化アッセイから採取した上清試料で測定したＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導サイトカイン放出に対するＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子２Ｃ４／ＣＤ２８及び４Ｄ５／ＣＤ２８、並びにＣＤ２８抗体の効果を示す。可溶性サイトカインＧＭ－ＣＳＦ（図９Ａ）、ＩＦＮ－γ（図９Ｂ）、ＩＬ－１０（図９Ｃ）、ＩＬ－６（図９Ｄ）、ＴＮＦ－アルファ（図９Ｅ）、ＩＬ－２（図９Ｆ）及びＩＬ－１ｂ（図９Ｇ）の量を示す。 図１０Ａ～１０Ｄは、ＨＥＲ２－ＴＤＢによる治療の１５日後までの様々な時点における免疫細胞の数に対する、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子２Ｃ４／ＣＤ２８及び４Ｄ５／ＣＤ２８並びにＣＤ２８抗体による共刺激の効果を示す。全免疫細胞数を図１０Ａに示し、一方、図１０ＢはＣＤ４＋細胞数を示す。図１０ＣはＣＤ８＋細胞数を示し、ＮＫ細胞数を図１０Ｄに示す。
発明の詳細な説明
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な部分」という用語は、腫瘍関連抗原Ｈｅｒ２に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２を介したシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが付着している実体（例えば、ＣＤ２８抗体）をＨｅｒ２発現細胞、例えば特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができる。Ｈｅｒ２に特異的への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。これに加え、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
抗原結合分子、すなわち抗体又はその断片に関して、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む分子の一部を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であってもよい。本明細書で使用される場合、抗原結合ドメイン等に関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が１つより多く存在するときに区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体を除き、そのようなバリアントは、一般的に、少量存在する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。しかしながら、二重特異性抗原結合分子は、更なる抗原決定基に結合する更なる抗原結合部位も含み得る。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞又は同じ細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。したがって、本発明による「二重特異性」という用語は、三重特異性分子、例えばＣＤ２８抗体及び２つの異なる標的細胞抗原に向けられた２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子も含み得る。
本出願の中で用いられる「－価」という用語は、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の特定の態様では、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができる（当該抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する）か、又は特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができる（このことは当該抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する）。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」又は「野生型」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクトな抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」又は「Ｆａｂ分子」という用語は、軽鎖（ＣＬ）の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインの１つ以上のシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン治療により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。「従来のＦａｂ断片」は、ＶＬ－ＣＬ軽鎖及びＶＨ－ＣＨ１重鎖で構成される。
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。当該単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。これに加え、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性ベータ－シート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及びＥＰ １６４１８１８Ａ１号を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのアルファらせんとベータ－ターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のアルファらせん及びベータ－ターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号Ａ１を参照されたい。一本鎖ドメイン抗体は、一本の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。ベータ－サンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが対象となる治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。特に指定されない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、この用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。
「Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な」という用語は、抗原結合分子がＨｅｒ２を標的化する際の診断剤及び／又は治療剤として有用であるような、十分な親和性でＨｅｒ２に結合することができる抗原結合分子を指す。抗原結合分子としては、限定されるものではないが、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、一本鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が挙げられる。一態様では、無関係な非Ｈｅｒ２タンパク質への抗Ｈｅｒ２抗原結合分子の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、Ｈｅｒ２への抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特に、ＨＥＲ２への特異的結合が可能な抗原結合分子は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下又は０．００１ｎＭ以下（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の態様では、抗Ｈｅｒ２抗原結合分子は、異なる種に由来するＨｅｒ２に結合する。特に、抗Ｈｅｒ２抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルＨｅｒ２に結合する。
「エピトープ」との用語は、抗体が結合する相手である、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。エピトープは、隣接するアミノ酸ストレッチ（線状エピトープ）から形成すること、又は非隣接アミノ酸（立体構造エピトープ）、例えば、抗原の折り畳みにより、すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって空間的に近位になる非隣接アミノ酸を含むことができる。線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されているが、コンフォメーションエピトープは、典型的には、変性剤を用いた治療により破壊される。エピトープは、独特の空間的構造で、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は８～１０個アミノ酸を含む。
「エピトープ４Ｄ５」又は「４Ｄ５エピトープ」又は「４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接し、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるもの等のルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。或いは、エピトープマッピングを行い、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（ヒトＨＥＲ２（配列番号５４）を含む、約５５０残基～約６１０残基に由来する領域内の任意の１つ以上の残基）に結合するかどうかを評価することができる。
「エピトープ２Ｃ４」又は「２Ｃ４エピトープ」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるもの等のルーチンクロスブロッキングアッセイを行うことができる。或いは、エピトープマッピングを行い、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４抗体及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７－３２８（２００４））。
「特異的結合」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡは、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を指す。特定の態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。特定の一態様では、ＴＡＡはＨｅｒ２である。
「Ｈｅｒ２」という用語は、「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」又は「ｃ－Ｅｒｂ－Ｂ２」としても知られ、細胞内でのＨＥＲ２前駆体タンパク質のプロセシングから生じる任意の天然の成熟ＨＥＲ２を指す。この用語には、別途指示されない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来のＨＥＲ２が含まれる。この用語はまた、ＨＥＲ２の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０３に示す。
「ＣＤ２８」（分化クラスター２８、Ｔｐ４４）は、特に指定されない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＣＤ２８タンパク質を指す。ＣＤ２８はＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８によるＴ細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生のための強力なシグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、ナイーブＴ細胞上に構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ１０７４７（配列番号１）に示されている。
「アゴニスト抗体」とは、所与の受容体に対するアゴニスト機能を備える抗体を指す。一般に、アゴニストリガンド（因子）が受容体に結合すると、受容体タンパク質の三次構造が変化し、受容体が活性化される（受容体が膜タンパク質である場合、細胞増殖シグナル等が、通常、形質導入される（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄ））。受容体が二量体形成型である場合、アゴニスト抗体は受容体を適切な距離及び角度で二量体化することができ、したがってリガンドと同様に作用する。適切な抗受容体抗体は、リガンドによって行われる受容体の二量体化を模倣することができ、したがって、アゴニスト抗体になり得る。
「ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子」又は「ＣＤ２８従来のアゴニスト抗原結合分子」は、Ｔ細胞受容体シグナル（「シグナル２」）の存在下でＴ細胞活性化を増強する役割においてＣＤ２８天然リガンド（ＣＤ８０又はＣＤ８６）を模倣する抗原結合分子である。Ｔ細胞は、完全に活性化されるために２つのシグナルを必要とする。生理学的条件下では、「シグナル１」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子と抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチド／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）複合体との相互作用から生じ、「シグナル２」は共刺激受容体、例えばＣＤ２８の連結によって提供される。ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、Ｔ細胞を共刺激することができる（シグナル２）。それはまた、ＴＣＲ複合体に対する特異性を有する分子と組み合わせてＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができるが、ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、ＴＣＲの更なる刺激なしにＴ細胞を完全に活性化することができない。しかしながら、ＣＤ２８特異的抗原結合分子のサブクラス、いわゆるＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子が存在する。「ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子」は、ＴＣＲを更に刺激することなくＴ細胞を完全に活性化することができるＣＤ２８抗原結合分子である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子は、事前のＴ細胞活性化なしにＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができる（シグナル１）。
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」 は、Ｔリンパ球，特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象にＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象にＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療薬の例には、ＣＤ３等の活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＥＡ又は葉酸受容体等の標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球，特に細胞傷害性 Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し，抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
特に指定されない限り、「ＣＤ３」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＣＤ３を指す。この用語は「完全長」の未処理のＣＤ３と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のＣＤ３とを包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号１８８も参照されたい。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９５ＬＩ５に示されている。配列番号１８９も参照されたい。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗原結合可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを指す。一般的に、抗原結合ドメインは、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に指定されない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に受け入れられた命名法に従い決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，’’Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ’’（１９８３）に記載されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに関する言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。
本明細書で使用される場合、抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子よりも高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ以上のＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。
「ＣＨ１ドメイン」という用語は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ １ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号１０４）のアミノ酸配列を有する。通常、ＥＰＫＳＣ（配列番号１０７）のアミノ酸配列を有するセグメントは、続いてＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結する。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの一部（例えば、ＫａｂａｔのＥＵナンバーシステムにより、約２１６の位置から約２３０の位置まで、又は約２２６の位置から約２３０の位置まで）を表す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、関連する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメイン（例えば、Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）４０８３を参照されたい）の３つのドメインに細分することができる。
一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１０８）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１０９）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＣＰＸＣＰ（配列番号１１０）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと、を含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約ＥＵ位置２３１のアミノ酸残基から約ＥＵ位置３４０のアミノ酸残基（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）まで延在する。一態様では、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号１０５）のアミノ酸配列を有するＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点で特有である。むしろ、インタクトネイティブＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ－ｌｉｎｋｅｄ分岐炭水化物鎖が介在している。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１－２０６。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側の残基のストレッチを含み、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧ（配列番号１０６）のアミノ酸配列を有する。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「隆起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照されたい）。そのようなバリアントＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。隆起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーを更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアント及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失され得る。そのようなバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照されたい）。
「野生型Ｆｃドメイン」という用語は、自然界で見出されるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトＦｃドメインとしては、天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及び天然ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びにその天然起源のバリアントが挙げられる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号１１１（ＩｇＧ１、白人型アロタイプ）、配列番号１１２（ＩｇＧ１、アフロアメリカン型アロタイプ）、配列番号１１３（ＩｇＧ２）、配列番号１１４（ＩｇＧ３）、及び配列番号１１５（ＩｇＧ４）に示される。
「バリアント（ヒト）Ｆｃドメイン」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」によって「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、バリアントＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば約１～約１０個のアミノ酸変異、一態様では天然Ｆｃ領域中に約１～約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（バリアント）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生物活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能を、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介することができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４を参照されたい）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を引き起こす。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである：
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブタイプ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、殺傷に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、殺傷プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、また例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化を抑制することを補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度～低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上に高度に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。
「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害性」という用語は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「減少したＡＤＣＣ」という用語は、上記で定義されたＡＤＣＣの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び／又はＡＤＣＣの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存の方法（当業者に知られている）を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないＡＤＣＣと比較している。例えば、そのＦｃドメインに、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号を参照されたい）。例えば、ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１）。
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に伸長する膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ，（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１～５、典型的には２～４、特に２の数字であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１１７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１１９）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：１２０）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１２１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１２２）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１２３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１２５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１２６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１２７）、ＧＧＳＧ（配列番号１２８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１２９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１３０）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１３１）もまた含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１１７）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１８）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１２２）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１２３）である。
本出願において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
「融合した」又は「接続した」とは、構成要素（例えば、上記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）がペプチド結合によって直接又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ等のコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で達成され得る。ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、又は配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸Ｂに対し、配列Ｂと、又は配列Ｂに対向し、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する若しくは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂのアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
特定の実施形態では、本明細書で提供する、ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントが想到される。例えば、ＣＤ２８抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終コンストラクトに到達させるために作ることができる。置換変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、対象となる分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られた１つ又は複数のバリアントは、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてよい。変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入の例としては、ＣＤ２８抗原結合分子の血清半減期を増加させる、Ｎ又はＣ末端の、ポリペプチドへの融合を伴うＣＤ２８抗原結合分子が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＤ２８抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を変更することにより、分子のグリコシル化バリアントを便利に入手し得る。アゴニストＣＤ２８抗原結合分子がＦｃドメインを含む場合、Ｆｃドメインに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有するバリアントを作製するために行われてもよい。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）接続するフコースを欠いた炭水化物構造を有するアゴニストＣＤ２８結合分子のバリアントが提供される。このようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明のＣＤ２８抗原結合分子の更なるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このようなバリアントは、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
一定の実施形態では、本発明のＣＤ２８抗原結合分子のシステイン操作バリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いて抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作製することができる。特定の実施形態では、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。
特定の態様では、本明細書中に提供されるＣＤ２８抗原結合分子は、当該分野で公知であり、容易に入手可能である更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが付着する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書で提供するＣＤ２８抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、これにより、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ以上の連続した群として散在してもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば医薬組成物の「治療有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「医薬組成物」という用語は、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、かつ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容され得る賦形剤」は、医薬組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、バッファー、安定剤又は防腐剤が挙げられる。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患進行率を低下させること、症状の寛解又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
本明細書で述べる「併用治療」又は「同時投与」という用語は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）及び別個の投与を包含し、その場合、本明細書で報告する抗体の投与は、１つ以上の追加の治療剤、好ましくは１つ以上の抗体の投与の前、同時に及び／又は後に起こり得る。
「がん」という用語は、制御されていない細胞成長／増殖を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的症状を指すか、又は説明する。そのため、本明細書で使用される場合、がんという用語は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病等の増殖性疾患を指す。特に、がんという用語は、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺細気管支肺胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部のがん、皮膚若しくは眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形膠芽細胞腫、星細胞種、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫（上述のがんのいずれかの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組み合わせを含む。一態様では、がんは固形腫瘍である。別の態様では、がんは血液がん、特に白血病、最も詳しくは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
「Ｈｅｒ２陽性」がんは、正常レベルよりも高いＨｅｒ２を有するがん細胞を含む。Ｈｅｒ２陽性がんの例としては、Ｈｅｒ２陽性乳がん及びＨｅｒ２陽性胃がんが挙げられる。任意に、Ｈｅｒ２陽性がんは、２＋若しくは３＋の免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）スコア、及び／又は＞２．０のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅率を有する。
「早期ステージ乳がん（ＥＢＣ）」又は「早期乳がん」という用語は、本明細書では、乳房又は腋窩リンパ節を越えて広がっていない乳がんを指すために使用される。これには、非浸潤性乳管癌腫並びにＩ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期及びＩＩＩＡ期の乳がんが含まれる。
「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」としての腫瘍又はがん、及びこの分類内の様々なサブステージへの言及は、当該技術分野で公知の全ステージ分類又はローマ数字病期分類法を使用した腫瘍又はがんの分類を示す。がんの実際の病期はがんの種類に依存するが、一般に、０期がんは非浸潤性（ｉｎ ｓｉｔｕ）病変であり、Ｉ期がんは小さな限局性腫瘍であり、ＩＩ期及びＩＩＩ期がんは局所リンパ節の関与を示す局所進行性腫瘍であり、ＩＶ期がんは転移性がんを表す。腫瘍のそれぞれの種類について特異的な病期は、熟練臨床医には既知である。
「転移性乳がん」という用語は、がん細胞が元の部位から体内の他の場所の１つ以上の部位に血管又はリンパ管によって伝達されて、乳房以外の１つ以上の器官に１つ以上の二次腫瘍を形成する乳がんの状態を意味する。
「進行」がんとは、元の部位又は器官の外に、局所浸潤又は転移のいずれかによって広がったがんである。したがって、「進行した」がんという用語は、局所進行性疾患及び転移性疾患の両方を含む。
「再発」がんは、手術等の初期療法への応答後に、初期部位又は遠位部位のいずれかにおいて再成長したものである。「局所的再発」がんは、治療後に以前に治療されたがんと同じ場所で再発するがんである。「手術可能な」又は「切除可能な」がんは、原発器官に限定され、手術（切除）に適したがんである。「切除不能な（ｎｏｎ－ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」又は「切除不能な（ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ）」がんは、手術によって除去（切除）されることができない。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性等の、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能（Ｆｃサイレント）を低下させ、したがってＦｃ受容体を介した非特異的架橋が回避される、１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。代わりに、それらは、腫瘍部位で架橋を引き起こすＨｅｒ２への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。したがって、腫瘍特異的Ｔ細胞活性化が達成される。
ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉｉ）配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｖ）配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書で提供される。
ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書で提供される。
別の態様では、本発明は、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み、
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な当該第２の抗原結合ドメインが、
（ｉｉｉ）配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｖ）配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させる若しくは消失させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、第１のサブユニットが配列番号７０（ＦｃホールＰＧＬＡＬＡ）のアミノ酸配列を含み、第２へのサブユニットが配列番号７１（ＦｃノブＰＧＬＡＬＡ）のアミノ酸配列を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更なる態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更に別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
更には、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む抗原結合ドメインと比較して、低いアフィニティーでＣＤ２８に結合する、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。親和性は、ＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞への結合としてフローサイトメトリーによって測定される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む抗原結合ドメインと比較して、低下したアフィニティーでＣＤ２８に結合し、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。一態様では、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む抗原結合ドメインと比較して、低い親和性でＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
Ｈｅｒ２標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書において提供される。
一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
別の態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。
本明細書では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、並びに（ｉｖ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子も開示される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。特に、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬｈｅｒ２）を含む（ペルツズマブ、２Ｃ４）。
さらに、本明細書では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、並びに（ｉｖ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子も開示される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。特に、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む（トラスツズマブ、４Ｄ５）。
これに加え、本明細書では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、並びに（ｉｖ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子も開示される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む。特に、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む（７Ｃ２）。
ＣＤ２８への結合については一価であり、Ｈｅｒ２への結合については一価である二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメイン及び／又はＨｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片である、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインとＨｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインの両方がＦａｂ断片である。
一態様では、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なクロスＦａｂ断片と、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な従来のＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な従来のＦａｂ断片と、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能なクロスＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられたＦａｂ断片（クロスＦａｂ断片）である、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ断片であり、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ断片である。
特定の一態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ａ）が提供される。更なる態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｂ）が提供される。別の特定の態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｄ）が提供される。
別の態様では、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｆ）が提供される。別態様では、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｇ）が提供される。
一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられたＦａｂ断片（クロスＦａｂ断片）である、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ断片であり、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ断片である。
特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｃ）が提供される。特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｅ）が提供される。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。一方では、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。
したがって、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の一態様では、本発明は、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、Ｆｃ領域が１つ以上のアミノ酸置換を含み、かつ抗体によって誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣの０～２０％に減少する、抗体を提供する。
一態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能等のその特性を決定するための方法も記載している国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１（Ａ１）号に記載される。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ以上が置換されたものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下と、エフェクター機能の低下を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
これに加えて、又はこれに代えて、１つ以上の置換変異は、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能も低下させる非グリコシル化部位変異（例えば、アミノ酸残基Ｎ２９７（ＥＵナンバリング）における非グリコシル化部位変異、例えば、Ｎ２９７Ｇ又はＮ２９７Ａ（ＥＵナンバリング）の非グリコシル化部位変異を含む。特定の態様では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｎ２９７Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。或いは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。或いは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．カリフォルニア州マウンテンビュー）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）等に開示されるもの等の動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの態様では、相補性構成要素、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低減される。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクター機能を有するように操作されるいくつかの態様では、当該低減されたエフェクター機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
特定の一態様では、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。より詳しくは、それは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインであり、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換はＮ２９７にある。特定の態様では、Ｆｃドメインは、ＥＵナンバリングでアミノ酸置換Ｎ２９７Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進させる改変を含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、上記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変と、を含む。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、ノブからホールへの方法に従ってＦｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置換え可能である。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、ダイマーを更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、荷電アミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
本明細書に報告される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端Ｐである。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端ＰＧである。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
Ｆａｂドメイン内の改変
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかがＣｒｏｓｓｍａｂ技術に従って交換される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（クロスＭａｂＶＨ－ＶＬ又はクロスＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載される。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１抗原に対する軽鎖と、第２抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であり、ＶＬドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
別の態様では、正しい対合を更に改善するために、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、種々の荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの改変は、クロスしているか、又はクロスしていないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵナンバリング）、及び位置２１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片のＣＬドメインでは、１２３位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）で置換されており、１２４位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片のＣＨ１ドメインでは、１４７位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び２１３位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現すると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、例えば、固体ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、配列決定され得る。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、（存在する場合には）コード領域の一部と考えられる。但し、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ以上のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメイン等の特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、１つ又は複数の制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
適切なプロモーター及び他の転写調節領域は本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス等）が挙げられる。他の転写調節領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写調節領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる）が挙げられる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）等の染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に結合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にするために、又は二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の標識化を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
本発明の更なる態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。そのような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切な画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で公知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収すること、を含む、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供される。
特定の態様では、抗原結合分子の一部を形成するＨｅｒ２（例えば、Ｆａｂ断片）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、少なくとも抗原への結合が可能な免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成し得、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，’’Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ’’，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）。
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）に更に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得て、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。
特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って、結合親和性が増強されるように操作される。本発明の抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施形態では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）’’Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，’’ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者に明瞭であろう。親和性クロマトグラフィー精製のために、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗原結合分子を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡ又はＧ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用され得る。ＣＤ２８抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現するＣＤ２８抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切に集合したことが示された。
アッセイ
本明細書提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
１．親和性アッセイ
対応する標的に対する本明細書で提供される抗原結合分子の親和性は、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）等の標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るもの等の受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原に対する抗原結合分子の親和性はまた、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）等の標準的な機器を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができ、受容体又は標的タンパク質等は組換え発現によって得ることができる。一態様によれば、ＫＤは、Ｐｒｏｔｅｏｎ（登録商標）機（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を発現するＣＨＯ細胞を結合アッセイに使用する。
更なる態様では、Ｈｅｒ２（例えば、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ－４、Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）を発現するがん細胞株を使用して、標的細胞抗原への二重特異性抗原結合分子の結合を実証した。
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有するＣＤ２８抗原結合分子を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、実施例３に記載の方法で測定されるＴ細胞活性化及びサイトカイン分泌又は腫瘍細胞殺傷が含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有する抗原結合分子も提供される。
医薬組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び少なくとも１種の薬学的に許容され得る賦形剤を含む。別の態様では、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、例えば後述する少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤に溶解又は分散した、治療有効量の１つ以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容され得る」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒト等の動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１種の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び任意に追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水緩衝液中で配合されてもよい。溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有することができる。或いは、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。薬学的に許容され得る適切な賦形剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。本発明の例示的な薬学的に許容され得る賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを含む。上述した組成物に加えて、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容され得る塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容され得る塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。本発明の組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。そのような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを、単独で又は組み合わせて、治療方法にて使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。更なる態様では、がんの治療における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書では、がんを有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、方法が、有効量のスーパーアゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｈｅｒ２発現がん細胞の増殖を阻害するのに使用するためのものである。したがって、特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｈｅｒ２陽性がんの治療における使用のためのものである。Ｈｅｒ２陽性がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。一態様では、Ｈｅｒ２陽性がんは、Ｈｅｒ２＋陽性乳がん、例えば初期又は局所進行Ｈｅｒ２＋陽性乳がんである。したがって、これらのがんの治療において使用するための、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者又は「個体」は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
特定の態様では、治療の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書では、がんを有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、方法が、有効量のスーパーアゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、ＨＥＲ２陽性がん、特に乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺、子宮内膜がん、膵臓がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する個体を治療する方法において使用するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用のために提供される。一実施形態では、医薬は、がん、特にＨｅｒ２陽性がんの治療のためのものである。更なる態様では、医薬は、がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。そのような一態様では、本方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。別の態様では、医薬は、Ｈｅｒ２陽性がんの治療のためのものである。更なる態様では、医薬は、がん、特にＨｅｒ２陽性がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。更なる態様では、がん、特にＨｅｒ２陽性がんを治療する方法が本明細書で提供される。一態様では、本方法は、がんを有する個体に有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を投与する工程を含む。そのような一態様では、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体へ投与することを更に含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
更なる態様では、例えば上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書に報告する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む医薬製剤を本明細書に提供する。一態様では、医薬製剤は、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む。別の態様では、医薬製剤は、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれか、及び少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、本明細書に記載されるような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。したがって、がん免疫療法における使用のための本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の実施形態では、がん免疫療法の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
上述のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本明細書に報告される抗体の投与は、追加の１つ以上の治療剤合の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行われ得る。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の投与、及び追加の治療剤の投与は互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
本明細書に報告される抗原結合分子（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈で考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に公知である他の要因が挙げられる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、必ずしもではないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために同時に使用する１つ以上の薬剤と共に、製剤化される。有効量のそのような他の薬剤は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の適切な投薬量は（単独で又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療対象の疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴、抗体への反応、並びに主治医の裁量によって決定されることになる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、一度に、又は一連の治療にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回以上の個別投与、又は連続点滴にかかわらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となり得る。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるものとする。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
他の薬剤及び治療
前述のように、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、がんの治療おける使用のための本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそれらを含む医薬組成物が提供され、二重特異性抗原結合分子は、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される。
そのような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のそのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に、起こり得る。
更なる態様では、がん、特にＨｅｒ２陽性がんの治療における使用のための上述した本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、別の免疫調節薬と組み合わせて投与される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、がんの治療のための抗腫瘍剤として使用され得る。一態様では、免疫調節剤としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）、ＯＸ－４０抗体、４－１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が挙げられる。上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗原結合分子の投与は、更なる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。
Ｔ細胞二重特異性抗体との組み合わせ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた投与に適している。一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。特定の態様では、Ｈｅｒ２に結合する第２の結合ドメインは、４－１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子とは異なるＨｅｒ２上のエピトープに結合する。
一態様では、本発明で使用される抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４８のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１４９のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１５０のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１５１のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１５２のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１５３のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体４Ｄ５と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン（トラスツズマブとして知られるそのヒト化バージョン）を含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体２Ｃ４と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメイン（ペルツズマブとして知られるそのヒト化バージョン）を含む。更に別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体７Ｃ２（米国特許第９，５１８，１１８号）と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１４０のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１４１のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１４２のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１４３のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１４４のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１４５のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｂ）配列番号１３２のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１３３のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１３４のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１３５のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１３６のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１３７のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｃ）配列番号１５６のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１５７のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１５８のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１５９のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１６０のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１６１のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、を含む。
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１４６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１４７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第１重鎖及び／又は配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む第２重鎖及び／又は配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＨＥＲ２ ＴＤＢ）とを含む。
別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）、及び／又は配列番号１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
更なる態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものであり、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と同時、前又は後に投与される。
更なる態様では、がんを治療するための医薬を製造するための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用であって、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するための使用が提供される。特定の態様では、治療される疾患はＨｅｒ２陽性がんである。Ｈｅｒ２陽性がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。特定の態様では、治療されるがんは、Ｈｅｒ２陽性乳がん、特にＨｅｒ２陽性転移性乳がんである。
更なる態様では、本発明は、個体においてがんを治療するための方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び有効量のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に上で定義される抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体を投与することを含む方法を提供する。特定の態様では、本方法は、Ｈｅｒ２陽性がんを治療するためのものである。Ｈｅｒ２陽性がんの例としては、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる。一態様では、本方法は、Ｈｅｒ２陽性転移性乳がんを治療するためのものである。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、を含む組み合わせ製品が提供される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤との組み合わせ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与され得る。
一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られている「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ－Ｌ１」）を指す。完全ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１６４）に示されている。「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーのうちのいずれか１つ以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、遮断する、阻害する、消失させる、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、並びにＰＤ－Ｌ１と、ＰＤ－１、Ｂ７－１等のその結合パートナーの１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、機能不全のＴ細胞を機能不全にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ－Ｌ１を介するシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激性シグナルを低減する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ－１１０５からなる群より選択される。具体的な一態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ－１１０５である。更に別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。なお更なる態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。より詳しくは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１６５の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１６６の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１６７の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１６８の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ－１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＰＤ－Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１５１１６（配列番号１６９１）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ－１を指す。「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－１抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体」、又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群より、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１７０の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号１７１の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１７２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号１７３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と、を含む組み合わせ製品が提供される。
上述のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、治療剤の投与は、追加の１つ以上の薬剤の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行うことができる。一実施形態では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。
製造物品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）製造物品中に含有され、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造物品中に含有され、更なる細胞傷害性の又は別の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造物品は、組成物が特定の症状を治療するために使用できることを示す添付文書を更に備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含め、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下のナンバリングされた項は、本発明の態様を記載する。
１．ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含み
Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
（ｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２．前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
４．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
５．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
６．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、項１～３又は５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
７．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
８．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲを含む、項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
９．前記Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む、項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１０．前記Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１１．前記Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）のＣＤＲとを含む、項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１２．前記Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）とを含む、項１～８又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１３．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメイン及び／又はＨｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１４．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１５．Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１６．Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である、項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１７．
（ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１８．Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
１９．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、従来のＦａｂ分子である、項１～１３又は１８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２０．ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である、項１～１３又は１８又は１９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２１．
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、項１～１３又は１８～２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２２．前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、前記Ｆｃドメインが、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成され、（ｉ）前記第１の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合され、かつ前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットのＮ末端に融合され、かつ前記第１の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットのＮ末端に融合される、項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
２３．前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む、項１～２２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２４．Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
２５．項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする、１つ以上の単離されたポリヌクレオチド。
２６．項２５に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ以上のベクター、特に発現ベクター。
２７．項２５に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド又は項２６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
２８．二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を製造する方法であって、ａ）項２７に記載の宿主細胞を、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）任意に、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収する工程を含む、方法。
２９．項２８に記載の方法によって製造される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
３０．項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
３１．医薬として使用するための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３２．（ａ）Ｔ細胞活性化又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３３．疾患の治療における使用のための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３４．前記疾患ががんである、項３３に記載の使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は医薬組成物。
３５．前記使用が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３６．前記使用が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３７．前記使用が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物。
３８．疾患の治療、特にがんの治療のための医薬の製造における、項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は項３０に記載の医薬組成物の使用。
３９．個体における疾患、特にがんを治療する方法であって、有効量の項１～２４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は項３０に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
４０．化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤、特にＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくは抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与することを更に含む、項３９に記載の方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記の一般的な説明を前提として、他の様々な実施形態を実施できることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２．
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ国レーゲンスブルク）又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（米国ニュージャージー州）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
タンパク質精製
標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、－２０℃又は－８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特徴付けのために提供された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準とした。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ置き換え（ＶＨ／ＶＬクロスＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなクロスＭａｂ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したクロスＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＶＨ／ＶＬクロスＭａｂを、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＶＨ／ＶＬクロスＭａｂを用い、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合を、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐｈ７．４）、２５℃（又は代替的に３７℃）中で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒～３分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３～１０分間洗浄して解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及び親和性データの計算に使用する。
実施例１
ＣＤ２８及びヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）を標的とする二重特異性抗原結合分子の作製及び産生
１．１ ＣＤ２８及びヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
抗原のクローニング：
ヒトＣＤ２８（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７）の細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸１～１３４）をコードするＤＮＡ断片を、溶解性タグ及び精製タグとしてはたらくｈｕｍ ＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードする断片の下流にある２つの異なる哺乳動物のレシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの１つはＦｃ領域に「ホール」変異を含み、もう１つは「ノブ」変異、並びにＢｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号８８）を含んでいた。また、両Ｆｃ断片はＰＧ－ＬＡＬＡ変異を含んでいた。Ｆｃノブ鎖のＣ末端に一価ビオチン化ａｖｉタグを有する二量体ＣＤ２８－Ｆｃコンストラクトを得るために、両方のベクターをＢｉｒＡビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトした。
ホットスポットを欠き、親和性が低下したＣＤ２８（ＳＡ）バリアントの作製及び特性評価
配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬを有するＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体（ＳＡ）は、国際公開第２００６／０５０９４９号に記載されている。
不対システイン残基、トリプトファン残基、脱アミド部位の除去及び親和性低下ＣＤ２８（ＳＡ）バリアントの生成
本発明者らの詳細な結合因子の特性評価の一部として、ＣＤ２８（ＳＡ）可変ドメイン配列の計算分析を行った。この分析により、ＶＨのＣＤＲ２領域の不対システイン（５０位、Ｋａｂａｔナンバリング）、ＶＨのＣＤＲ３のトリプトファン残基（１００ａ位、Ｋａｂａｔナンバリング）及びＶＬのＣＤＲ１（３２位、Ｋａｂａｔナンバリング）、並びにＶＨのＣＤＲ２の潜在的なアスパラギン脱アミド部位（５６位、Ｋａｂａｔナンバリング）が明らかになった。トリプトファンの酸化はかなり遅いプロセスであり、還元化合物を添加することによって防止することができるが、抗体可変ドメイン中の不対システインの存在は重要となり得る。遊離システインは反応性であり、他のタンパク質又は細胞若しくは培地の成分の他の不対システインと安定な結合を形成することができる。結果として、これは、潜在的に免疫原性であり、したがって患者にリスクをもたらし得る未知の修飾を有する不均一で不安定な生成物をもたらす可能性がある。これに加え、アスパラギンの脱アミド化並びに結果として生じるイソアスパラギン酸及びスクシンイミドの形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性及びｉｎ ｖｉｖｏ生物学的機能の両方に影響を及ぼし得る。親マウス結合因子５．１１Ａの結晶構造分析により、Ｃ５０はヒトＣＤ２８への結合に関与せず、したがってＣＤ２８に対する親和性に影響を与えることなくセリン等の類似のアミノ酸で置換できることが明らかになった。しかしながら、５０位のトリプトファン残基及びアスパラギンの両方は、結合界面に近いか又はそれに関与し、したがって、類似のアミノ酸による置換は、結合親和性の低下をもたらし得る。この実施例では、本発明者らは、以下の理由のために、ヒトＣＤ２８に対するＣＤ２８（ＳＡ）の親和性を低下させることを特に目的とした：ＣＤ２８（ＳＡ）の親和性は１～２ｎＭの範囲内であり、結合半減期は約３２分である。この強い親和性は、患者に静脈内注射した場合、血液及びリンパ組織等の大量のＣＤ２８発現細胞を含有する組織においてシンク効果（ｓｉｎｋ ｅｆｆｅｃｔ）をもたらし得る。結果として、標的化成分を介した化合物の部位特異的標的化が低下し得、コンストラクトの有効性が低下し得る。そのような効果を最小限に抑えるために、いくつかのＶＨ及びＶＬバリアントを生成して、親和性を種々の程度に低下させた（図２Ａ及び２Ｃ）。潜在的な安定性ホットスポットを表す前述の位置に加えて、ヒトＣＤ２８への結合に直接的又は間接的に関与する更なる残基は、元のマウス生殖系列アミノ酸又は類似のアミノ酸のいずれかによって置き換えられた。これに加え、ＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬ及びＶＨの両方のＣＤＲも、トラスツズマブのそれぞれのフレームワーク配列にグラフトした（図２Ｂ及び２Ｄ）。次いで、ＶＨ及びＶＬバリアントのいくつかの組み合わせを一価の１アーム抗ＣＤ２８ ＩｇＧ様コンストラクトとして発現させ、結合をＳＰＲによって特性評価した。
ＳＰＲによる還元型１アーム抗ＣＤ２８バリアントの解離速度定数（ｋｏｆｆ）の分析
第１の工程で抗ＣＤ２８結合因子バリアントを特徴付けるために、全ての結合因子を一価の１アームＩｇＧ様コンストラクトとして発現させた（図１Ａ）。このフォーマットを、１：１モデルにおいてＣＤ２８への結合を特性評価するために選択した。ＨＥＫ細胞へのトランスフェクションの５日後、上清を回収し、発現したコンストラクトの力価を決定した。
抗ＣＤ２８結合因子バリアントの解離速度を、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原を用いて２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化のため、ｈｕＣＤ２８－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０からなるＴｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分で注入した。これにより、垂直方向で１０００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。
ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更した。産生された上清の力価に基づいて、一価の１アームＩｇＧをＰＢＳＴで希釈して、１００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲の２倍希釈系列を得た。注入は、１２０秒の結合時間及び３００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に行った。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。結合相互作用は、精製及び生化学的特性評価をせずに上清からの一価の１アームＩｇＧを用いて測定したため、タンパク質：タンパク質相互作用のオフレートのみを更なる結論に使用した。解離センサーグラムを適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１対１ラングミュア結合モデルを使用して、解離速度を計算した。全てのクローンの解離速度定数（ｋｏｆｆ）値を表１に要約する。産生されたバリアントの比較により、ｋｏｆｆ値が親配列と比較して最大３０倍減少することが明らかになった。
ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に２．５×１０５／ｍｌで再懸濁した。５×１０４個の細胞を、漸増濃度のＣＤ２８結合因子（１ｐＭ～１００ｎＭ）とともに４℃で２時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベートした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＥコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に６０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。構築物と細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ６を用いて結合曲線を得た。図３Ａ～３Ｃから分かるように、一価の１アームＩｇＧ様ＣＤ２８バリアントコンストラクトは、結合の違いを示した。
ＣＤ２８及びＨｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のため、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」変異（Ｔ３６６Ｗ変異、ナンバリングはＥＵインデックスに従う、任意にＳ３５４Ｃ変異も含む、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、又は「ホール」変異（ＥＵインデックスに従うＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異、また任意にＥＵインデックスに従うＹ３４９Ｃ変異）のいずれかを含有した。いくつかの場合、ノブ抗体及びホール抗体を別々の細胞で発現させ、精製し、前述のようにインタクトな二重特異性抗体に集合した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（クロスＦａｂ技術）。国際特許出願の国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
Ｈｅｒ２抗体ペルツズマブＣＬＣ及びトラスツズマブＣＬＣの作製及び調製は、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図１Ｂ、図１Ｃ又は図１Ｄに示す：
分子Ａ：Ｈｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ＿ＷＴ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１フォーマット、配列番号９１及び９６の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び９７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ６７４１）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＨｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ＿ＷＴ）Ｆａｂ断片（ホール）（但し、図１Ｂは、Ｆｃノブ鎖のみがＰＧ－ＬＡＬＡ変異を含む）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１野生型／ＰＧ－ＬＡＬＡキメラクロスＦａｂ分子。
分子Ｂ：Ｈｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１フォーマット、配列番号９１及び９８の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び９７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ８３０５）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＨｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｃ：Ｈｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号７４及び９９の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び１００の軽鎖アミノ酸配列とを含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＨｅｒ２（ペルツズマブＣＬＣ）－Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（図１Ｄ）。
分子Ｄ：Ｈｅｒ２（トラスツマブＣＬＣ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号９１及び１０１の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び９７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ８３３８）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＨｅｒ２（トラスツズマブＣＬＣ）－Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｅ：Ｈｅｒ２（トラツズマブＣＬＣ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号７４及び１０２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び１００の軽鎖アミノ酸配列とを含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＨｅｒ２（トラツズマブＣＬＣ）－Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡクロスＦａｂ分子（図１Ｄ）。
分子Ｆ：Ｈｅｒ２（４Ｄ５）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号１７８及び１８０の重鎖アミノ酸配列と、配列番号１７９及び１８１の軽鎖アミノ酸配列とを含む、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ（図１Ｃ）。
分子Ｇ：Ｈｅｒ２（２Ｃ４）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号１７８及び１８２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号１７９及び１８３の軽鎖アミノ酸配列とを含む、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇ（図１Ｃ）。
１．２ ＣＤ２８及びＨｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合分子の産生
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって駆動される。これに加え、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞、又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合して、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充物（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加した（Ｗ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ．Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充物（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を添加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
或いは、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、（元は、ＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した）懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を用い、Ｅｖｉｔｒｉａにより、本明細書で記載される抗体及び二重特異性抗体を調製した。生成のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
１．３ ＣＤ２８及びＨｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
タンパク質を、標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）によって細胞培養上清から精製した。溶出はｐＨ３．０で達成され、その直後に試料をｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（物品番号：ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１．４ ＣＤ２８及びＨｅｒ２を標的とする二重特異性抗体の分析データ
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳによりタンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集物含有量の決定を、ランニング緩衝液（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表２に示す。
実施例２
Ｈｅｒ２及びＣＤ２８発現細胞へのＨｅｒ２を標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子の結合
Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子のＨｅｒ２への結合を、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ－４（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）を用いて試験し、ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。
結合を評価するため、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、２ Ｍｉｏ細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁した２×１０５細胞を丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ－番号６５０１８５号）中で４℃で６０分間、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８コンストラクト又は対照分子（配列番号１８６の重鎖及び配列番号１８７の軽鎖を含むＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）の濃度を増加させながらインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、二次結合Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃で更に３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離し、１５０μｌのＰＢＳ＋Ｄａｐｉ（４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩、ＰＢＳで１：１００００希釈、１０２３６２７６００１ Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁した。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて結合曲線を得た。
図４Ａ及び４Ｂ、並びに図６Ａ及び６Ｂに示されるように、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子は、ＫＰＬ－４細胞上のＨｅｒ２への結合、及びヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ－ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）細胞上のＣＤ２８への結合を示す。
実施例３
Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価
３．１ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＨｅｒ２を標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価－ＣＤ３－ＩｇＧによる刺激
Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子が抗ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化を支持する能力を評価するため、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子をＩＬ－２レポーター細胞アッセイで試験した。ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＫＰＬ－４細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体を非結合対照として含めた。１００００個の腫瘍標的細胞を、１０ｎＭの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６－００３７－８５）単独の存在下、又は漸増濃度のＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗体（２．４４ｐＭ～１０ｎＭ）と組み合わせた存在下、５００００個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、３７℃で６時間、白色の平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５０８３）内でインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、１００μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
図５及び図７Ａに示されるように、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子は、濃度依存的様式で最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、Ｔ細胞活性化を増強することができた。ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体について、又はＨｅｒ２発現ＫＰＬ４腫瘍細胞の非存在下では、Ｔ細胞活性化は観察することができなかった（図７Ｂ）。
３．２末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用したＨｅｒ２を標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子によるＴ細胞活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導Ｔ細胞活性化に対するＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の効果を、単一特異性又は二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗体の存在下又は非存在下で、健常ドナーＰＢＭＣ及びＨｅｒ２増幅ＫＰＬ－４乳がん細胞をＨＥＲ２ ＴＤＢで治療することによって試験した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の活性化をフローサイトメトリーによって測定した。
ヒトＰＢＭＣ及び腫瘍標的細胞（ＫＰＬ－４）（１０：１の比）を、ＨＥＲ２ ＴＤＢ（配列番号１７４の重鎖ＨＣ１、配列番号１７５の軽鎖ＬＣ１、配列番号１７６の第２重鎖ＨＣ２及び配列番号１７７の第２軽鎖を含むＨｅｒ２－ＣＤ３二重特異性抗体）の存在下、平底９６ウェルプレート（ＢＤ）内で２４時間、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子Ｈｅｒ２（４Ｄ５）／ＣＤ２８若しくはＨｅｒ２（２Ｃ４）／ＣＤ２８（５００ｎｇ／ｍｌ）、又は単一特異性抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８二価、５００ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を新しいＶ底９６ウェルプレートに移した。細胞をＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ６９－ＰＥ、及びＣＤ２５－ＡＰＣで染色した。ＣＤ６９及びＣＤ２５の表面発現を、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞上で検出した。ＣＤ４＋ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋及びＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ４＋（図８Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（図８Ｂ）として報告した。
予想されるように、ＨＥＲ２ ＴＤＢによる単剤治療は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞の両方の堅固な活性化をもたらした。ＨＥＲ２ ＴＤＢと３つのＣＤ２８アゴニストのいずれかとの併用治療は、画分活性化Ｔ細胞及びＴ細胞活性化の効力の両方を更に増加させた。Ｈｅｒ２標的化二重特異性抗原結合分子は、非標的化二価ＣＤ２８抗体と比較して、Ｔ細胞活性化をより強力に増強した。
３．３ Ｈｅｒ２ ＴＤＢの存在下でＨｅｒ２を標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子による腫瘍細胞殺傷のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
実施例３．２と同じ実験設定を使用して、ＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導腫瘍細胞殺傷に対するＣＤ２８共刺激の効果を分析した。腫瘍細胞生存率の喪失を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏｗ発光細胞生存能アッセイによって検出した。二重特異性Ｈｅｒ２－ＣＤ２８抗原結合分子が腫瘍細胞殺傷を達成するか、又はＴＤＢ媒介性腫瘍細胞殺傷を支持する能力を評価するため、Ｈｅｒ２発現ＫＰＬ－４細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。標的細胞ＫＰＬ－４を、黒色の透明底の９６ウェルプレートにウェルあたり１０，０００細胞の密度で播種した。ヒトＰＢＭＣを１０：１のＥ：Ｔ比でウェルに添加した。指示される濃度のＨＥＲ２ ＴＤＢを、Ｈｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子Ｈｅｒ２（４Ｄ５）／ＣＤ２８又はＨｅｒ２（２Ｃ４）／ＣＤ２８（５００ｎｇ／ｍｌ）と共にウェルに添加した。４８時間後、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬの Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏｗ発光細胞生存能試薬（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７０）を添加し、取扱説明書に記載のとおりに、照度計上でプレートを読み取った。
３つのＣＤ２８アゴニストのいずれかとの併用治療は、ＫＰＬ－４細胞の死滅を媒介することにおけるＨＥＲ２ ＴＤＢの効力を増加させた（図８Ｃ）。Ｔ細胞活性化と同様に、ＨＥＲ２標的化二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子の効果は、非標的化二価ＣＤ２８抗体と比較してより強かった。抗ＨＥＲ２クローン２Ｃ４を使用するＨｅｒ２標的化は、おそらく４Ｄ５標的化ＨＥＲ２ ＴＤＢとの非競合的結合に起因して、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の両方において、抗ＨＥＲ２クローン４Ｄ５を使用するＨｅｒ２標的化と比較して増強された応答をもたらした。
３．４ Ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン放出アッセイ
可溶性サイトカインの分析のための治療の２４時間後に、Ｔ細胞活性化アッセイから上清を回収した。ｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞活性化アッセイ（実施例３．２に記載）から収集した上清試料を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｐｒｏヒトサイトカインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ；カリフォルニア州ハーキュリーズ）を製造者の説明書に従って使用して試験した。
二価ＣＤ２８抗体の添加は、ＨＥＲ２ ＴＤＢ誘導サイトカイン放出にわずかな効果しか及ぼさなかったが、いずれかのＨＥＲ２標的化ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の添加は、測定された全てのサイトカインの実質的な増加をもたらした。図９Ａ～図９Ｇでは、ＧＭ－ＣＳＦ（図９Ａ）、ＩＦＮ－γ（図９Ｂ）、ＩＬ－１０（図９Ｃ）、ＩＬ－６（図９Ｄ）、ＴＮＦ－アルファ（図９Ｅ）、ＩＬ－２（図９Ｆ）及びＩＬ－１ｂ（図９Ｇ）のサイトカイン放出が示される。
３．５ Ｉｎ ｖｉｔｒｏロＴ細胞及びＮＫ細胞数のカウント
免疫細胞数に対するＣＤ２８共刺激の効果を、ＨＥＲ２－ＴＤＢによる治療の数週間後までの様々な時点でフローサイトメトリーによって測定した。製造者の指示に従って、ヒトＰＢＭＣをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した。ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ及び標的細胞（ＫＰＬ－４）（１０：１の比）を、平底９６ウェルプレート（ＢＤ）中、５０ｎｇのＨＥＲ２ ＴＤＢ、及び５００ｎｇ／ｍｌのＨｅｒ２－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子Ｈｅｒ２（４Ｄ５）／ＣＤ２８又はＨｅｒ２（２Ｃ４）／ＣＤ２８の存在下又は非存在下で３、７、１０又は１４日間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞をＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－パシフィックブルー、ＣＤ５６－ＡＰＣについて染色し、フローサイトメトリーによりカウントビーズを使用して細胞数をカウントした。
３種のＣＤ２８アゴニスト分子のいずれかによる同時治療は、ＨＥＲ２ ＴＤＢのみで処理した試料と比較して、７～１４日目にＣＤ４＋細胞数の増加をもたらした（図１０Ｂ）。全てのＣＤ２８アゴニスト分子はまた、１４日目にＣＤ８＋細胞数を明らかに増加させたが、ＮＫ細胞数は、２つのＨｅｒ２標的化二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子によってわずかに増加しただけであった（図１０Ｄ）。Ｔ細胞活性化、腫瘍細胞殺傷及びサイトカイン放出と同様に、ＨＥＲ２標的化二重特異性抗原結合分子による同時治療は、二価ＣＤ２８抗体と比較して免疫細胞数のより堅固な増加をもたらした。
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Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ，Ａ．Ｏ．，Ｗｉｅｌａｎｄ，Ａ．，Ｎａｓｔｉ，Ｔ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｂａｒｂｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｂ．Ｔ．，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｚ．，Ｋｏｅｎｉｇ，Ｌ．，Ｙｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＰＤ－１－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｓ ＣＤ２８－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５，１４２３－１４２７．
Ｌａｖｉｎ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ｌｅａｄｅｒ，Ａ．，Ａｍｉｒ，Ｅ．Ｄ．，Ｅｌｅｆａｎｔ，Ｎ．，Ｂｉｇｅｎｗａｌｄ，Ｃ．，Ｒｅｍａｒｋ，Ｒ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｒ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｃ．Ｄ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ Ｐａｉｒｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｃｅｌｌ １６９，７５０－７６５ ｅ７１７．
Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９９０）．Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ２８ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ７／ＢＢ－１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７，５０３１－５０３５．
Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｅ．，Ｇａｖｉｌｅ Ｃ．Ｍ．，Ｎａｉｒ Ｊ．Ｒ．，Ｋｏｏｒｅｌｌａ Ｃ．，Ｃａｒｌｓｏｎ Ｌ．Ｍ．，Ｂｕａｃ Ｄ．，Ｕｔｌｅｙ Ａ．，Ｃｈｅｓｉ Ｍ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ Ｐ．Ｌ．，Ｂｏｉｓｅ Ｌ．Ｈ．，Ｌｅｅ Ｋ．Ｐ．（２０１４）．ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １２３（２４），３７７０－３７７９．
Ｒｏｅｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｅｒｒ，Ｓ．，Ａｖｏｔａ，Ｅ．，Ｎａ，Ｓ．Ｙ．，Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ．，ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ，Ｉ．，Ｅｉｎｓｅｌｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｈｕｎｉｇ，Ｔ．（２０１１）．Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＰＢＭＣｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ １１８，６７７２－６７８２．
Ｔａｉ，Ｘ．，Ｖａｎ Ｌａｅｔｈｅｍ，Ｆ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．（２００７）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＣＴＬＡ－４－／－ｍｉｃｅ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２８ ｍｏｔｉｆ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，１３７５６－１３７６１．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｉｎｄｓｔｅｎ，Ｔ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｓ．Ｌ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．Ａ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．（１９８９）．ＣＤ２８ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ／ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６，１３３３－１３３７．
Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｙｏｏ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｕｏ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｇｕｏ，Ｘ．，Ｋａｎｇ，Ｂ．，Ｈｕ，Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １６９，１３４２－１３５６ ｅ１３１６．

Claims (36)

  1. ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
    （ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
    （ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、Ｆｃドメインと
    を含み、
    Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
    （ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
    （ｉｉｉ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）；又は
    （ｉｖ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）と、配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
    を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  2. ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメイン及び／又はＨｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  3. ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  4. Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  5. Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  6. （ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  7. （ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  8. Ｈｅｒ２への特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ分子である、請求項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  9. ＣＤ２８への特異的結合が可能な前記第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項１、２又は８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  10. （ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１、２、８又は９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  11. 前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする、１つ以上の単離されたポリヌクレオチド。
  13. 請求項１２に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ以上のベクター。
  14. ベクターが発現ベクターである、請求項１３に記載の１つ以上のベクター。
  15. 請求項１２に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド又は請求項１３又は１４に記載の１つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
  16. 二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を製造する方法であって、ａ）請求項１５に記載の宿主細胞を、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）任意に、前記二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収する工程を含む、方法。
  17. 請求項１６に記載の方法によって製造される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  18. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
  19. 医薬として使用するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  20. （ａ）Ｔ細胞活性化又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  21. がんの治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  22. がんの治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、前記使用が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  23. がんの治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、前記使用が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  24. 前記Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である、請求項２３に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  25. がんの治療における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、前記使用が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  26. 医薬として使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
  27. （ａ）Ｔ細胞活性化又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物。
  28. がんの治療における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物。
  29. がんの治療における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記使用が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、医薬組成物。
  30. がんの治療における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記使用が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである、医薬組成物。
  31. 前記Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. がんの治療における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記使用が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである、医薬組成物。
  33. がんの治療のための医薬の製造における、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項１８に記載の医薬組成物の使用。
  34. 個体におけるがんを治療するための医薬であって、有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は請求項１８に記載の医薬組成物を含む、医薬。
  35. 化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、請求項３４に記載の医薬。
  36. がん免疫療法において使用するための他の薬剤が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくは抗ＰＤ－１抗体である、請求項３５に記載の医薬。
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