JP7687632B2 - ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン - Google Patents

ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン Download PDF

Info

Publication number
JP7687632B2
JP7687632B2 JP2022565330A JP2022565330A JP7687632B2 JP 7687632 B2 JP7687632 B2 JP 7687632B2 JP 2022565330 A JP2022565330 A JP 2022565330A JP 2022565330 A JP2022565330 A JP 2022565330A JP 7687632 B2 JP7687632 B2 JP 7687632B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
polyrotaxane
represented
cyclodextrin
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022565330A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2022113944A1 (ja
Inventor
瑠璃子 青山（関谷）
慶紀 有坂
伸彦 由井
隆紀 岩田
哲也 依田
雅弘 秤屋
洋輝 益田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denka Co Ltd
Tokyo Institute of Technology NUC
Institute of Science Tokyo
Original Assignee
Denka Co Ltd
Tokyo Institute of Technology NUC
Denki Kagaku Kogyo KK
Institute of Science Tokyo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denka Co Ltd, Tokyo Institute of Technology NUC, Denki Kagaku Kogyo KK, Institute of Science Tokyo filed Critical Denka Co Ltd
Publication of JPWO2022113944A1 publication Critical patent/JPWO2022113944A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7687632B2 publication Critical patent/JP7687632B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/007—Polyrotaxanes; Polycatenanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D187/00—Coating compositions based on unspecified macromolecular compounds, obtained otherwise than by polymerisation reactions only involving unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

本発明は、ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサンに関する。
細胞培養技術は、医薬品及び化粧品分野、再生医療研究において広く利用されており、重要な技術である。細胞培養の環境としては、適切な培養環境、培養液、培養基材が必要となる。中でも、培養基材は、細胞が接着する足場としての役割を有しており、細胞の培養に適した表面であるか加工できる、細胞毒性がない、滅菌処理ができるか滅菌状態が維持できること、培養条件下において変質しない、顕微鏡における観察を妨げない等の特性が求められる。
従来、培養基材としては、ガラス製品が多用されていたが、現在ではポリスチレン製品が汎用されている。しかし、ポリスチレン樹脂を成形した培養基材は、表面が疎水性であり、細胞との親和性も低いため、一般的に表面処理が施されている。表面処理としては、プラズマ処理、コロナ放電処理、酸化剤処理、親水性物質によるコーティングが挙げられる。コーティング剤としては、細胞接着を促進するものが多く、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、マトリゲル、ハイドロキシアパタイト等が知られている。また、水溶性エラスチンでコーティングすると、血管平滑筋細胞又はエラスチン反応性細胞の分化誘導を促進することも知られている。
間葉系幹細胞は自己複製能と骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、靭帯細胞などの間葉系組織への多分化能を有する中胚葉由来の体性幹細胞である。成体組織では真皮、骨格筋、脂肪組織などの結合組織や主に骨髄間質に存在し、結合組織の修復や恒常性の維持、造血幹細胞の増殖や分化の制御に機能している。間葉系幹細胞の分化は、生物学的因子や物理学的因子により、複雑に制御されている。例えば、間葉系幹細胞の培地に、デキサメタゾン、β－グリセロリン酸、アスコルビン酸を加えると骨芽細胞へ、デキサメタゾン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、インスリン、インドメタシンを添加すると脂肪細胞へ分化誘導できることが知られている。
近年、培養基材の特性（例えば、硬さ等のバルク特性、コーティングの表面特性）が培養細胞の機能に影響を与えることが注目されており、所望の機能を有する細胞を増殖させる研究が報告されている（非特許文献１～３）。
Cell,2006, 126, 677-689. Nature Reviews Materials, 2020, 5, 686-705. Adv. Healthcare Mater. 2015, 4, 215-222.
しかしながら、所望の機能を有する細胞を得るために、細胞培養基材のバルク特性（硬さ等）を微調整することは、いまだ困難である。間葉系幹細胞を所望の細胞系統に分化させるために、適切な物理学的因子を選択することは有用であると考えられる。そこで、本発明の目的は、間葉系幹細胞の分化誘導を促進できるコーティング剤及び培養基材を提供することである。
本発明は、以下の［１］～［１０］を提供する。
［１］ 間葉系幹細胞の骨芽分化及び／又は脂肪分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティング剤。
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
は、少なくとも１つの水酸基が、－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
［２］ 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、［１］に記載のコーティング剤。
［３］ 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２２０個である、［１］又は［２］に記載のコーティング剤。
［４］ 間葉系幹細胞の骨芽分化及び／又は脂肪分化を促進させるための細胞培養方法であって、
式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板の表面上で、間葉系幹細胞を培養することを含む、方法。
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
［５］ 基板の表面上に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングすることを含む、［４］に記載の方法。
［６］ 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］ 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２２０個である、［４］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板を含む培養基材。
［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
［９］ 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、［８］に記載の培養基材。
［１０］ 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２００個である、［８］又は［９］に記載の培養基材。
本発明によれば、間葉系幹細胞の骨芽分化及び／又は脂肪分化を促進できるコーティング剤を提供することができる。また、本発明によれば、当該コーティング剤でコーティングした基板（培養基材）を提供することもできる。
参考例１、実施例１～２及び比較例１～２の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを比較した図である。 参考例１、実施例１、比較例２のＴＯＦ－ＳＩＭＳ測定により得られた質量スペクトルである。 比較例１、実施例２、ＴＣＰＳのＴＯＦ－ＳＩＭＳ測定により得られた質量スペクトルである。 参考例１、実施例１～２及び比較例１～２のフィブロネクチン吸着量を示すグラフである。 参考例１、実施例１～２及び比較例１～２の細胞密度を示すグラフである。 参考例１、実施例１～２及び比較例１～２を用いて、骨芽分化を誘導した細胞を撮影した顕微鏡写真である（スケールバーは１００μｍである。）。 （Ａ）は、参考例１、実施例１～２及び比較例１～２を用いて、骨芽分化を誘導した細胞をアリザリンレッドＳで染色した写真（スケールバーは２００μｍである。）であり、（Ｂ）は、染色面積を比較したグラフである。 参考例１、実施例１～２及び比較例１～２の脂肪分化を誘導した細胞を撮影した顕微鏡写真である（スケールバーは１００μｍである。）。 （Ａ）は、参考例１、実施例１～２及び比較例１～２を用いて、脂肪分化を誘導した細胞をオイルレッドＯで染色した写真（スケールバーは１００μｍである。）であり、（Ｂ）は、染色面積を比較したグラフである。
＜第一実施形態＞
本発明の第一実施形態は、間葉系幹細胞の骨芽分化及び／又は脂肪分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティング剤である。
式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
は、少なくとも１つの水酸基が、－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基（－ＯＨ）又はスルホ基（－ＳＯ３Ｈ）である。ポリロタキサン１分子中に、少なくとも１つの当該シクロデキストリンが含まれる。
式（１）で表されるポリロタキサンは、軸分子（線状高分子）と修飾されたシクロデキストリン（ＣＤ、環状分子）からなり、軸分子が少なくとも１つの修飾されたシクロデキストリンを貫通しており、その両端でキャップされている。
軸分子は、以下の式（２）で表され、ポリエチレングリコール構造を分子中央に有し、末端にフェニルジチオエステル基でキャップされたポリ（メタ）アクリレート構造を有する。式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基である。ポリエチレングリコール構造部分にシクロデキストリンが貫通される。各Ｒ１は互いに同一であっても異なっていてもよい。Ｒ１としては、メチル基が好ましい。
ポリエチレングリコール構造は、モノマー単位としてエチレングリコールを含み、少なくとも１つのシクロデキストリンを貫通できる分子長を備えていればよい。ポリエチレングリコール構造を形成するエチレングリコール単位の数は、２０～１０００であってよく、８５～８００が好ましく、１００～７００がより好ましい。式中、ｎは１０～５００であってよく、４３～４００が好ましく、５０～３５０がより好ましい。
ポリ（メタ）アクリレート構造は、モノマー単位としてベンジル（メタ）アクリレートを含む。本明細書中、「（メタ）アクリレート」という語は、「アクリレート」及び「メタクリレート」の両方を意味する。発明者らは、ポリ（メタ）アクリレート構造は、ポリスチレン等の基板への密着性を高める作用を有しているため、シクロデキストリンを貫通したポリエチレングリコール部分がループ状に基板から離れた状態になっていると考えている。ポリ（メタ）アクリレート構造を形成するベンジル（メタ）アクリレート単位の数ｍは、トリブロック共重合体の片末端のポリベンジル（メタ）アクリレートあたり、１～２０００であってよく、２０～１０００が好ましく、３０～５００がより好ましい。各ｍは互いに同一であっても異なっていてもよい。
本実施形態で使用される修飾されたシクロデキストリンは、以下の式（３）で表され、構成するグルコースの水酸基の少なくとも１つが－Ｘ－Ｙで修飾されている。シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン及びこれらの組合せのいずれであってもよい。好ましいシクロデキストリンは、α－シクロデキストリンである。下記は、－Ｘ－Ｙで修飾されたシクロデキストリンを模式的に表した図である。図中の「－Ｏ－Ｘ－Ｙ」は、シクロデキストリンを構成するグルコース中の水酸基が－Ｘ－Ｙで修飾されたことを示す。図中、「－Ｏ－Ｘ－Ｙ」は１つのみ示しているが、１つの水酸基のみが－Ｘ－Ｙで修飾されていると限定的に解釈されるべきではない。
ポリロタキサンでは、少なくとも１つの修飾されたシクロデキストリンが、軸分子によって貫通されている。ポリロタキサン１分子あたりのシクロデキストリンの数は、独立に定めることができ、ポリエチレングリコール構造の分子長によって、一義的に定める必要はない。また、化学量論的には、シクロデキストリンはポリエチレングリコールの繰り返し単位であるエチレングリコールの２ユニットを包接可能であることから、環状分子の数には、使用する線状高分子の分子量によって上限がある。例えば、数平均分子量２００００のポリエチレングリコール１分子あたりのシクロデキストリンの数は、３～２２０であってもよく、５～１５０が好ましく、５～１２０がより好ましく、５～１００が特に好ましい。但し、シクロデキストリンの軸分子の主鎖方向の長さ（ポリロタキサンが複数のシクロデキストリンを有する場合は、その長さの合計）が、ポリエチレングリコールの分子長を超えることはない。
シクロデキストリン中の－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数は、１つのシクロデキストリンに対して、１～１８個であってよく、１～１０個が好ましく、２～８個がより好ましい。－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数が上記範囲であると、間葉系幹細胞の脂肪分化及び／又は骨芽分化を促進させる効果がより優れる。－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数は１０個以下であると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒に対する溶解性により優れる。また、－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数は２個以上であると、分子可動性の変化量、表面の化学組成、表面の物理化学的特性（例えば、接触角、ゼータ電位）の変化量が大きくなる。－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数によりポリロタキサンの分子可動性、表面の化学組成、表面の物理化学的特性（例えば、接触角、ゼータ電位）が調節できるため、間葉系幹細胞の脂肪分化及び／又は骨芽分化促進に適した分子可動性のポリロタキサン表面が作製できる。
Ｘは、２価の有機基であり、特に制限されない。有機基としては、例えば、炭素原子数１～１０のアルキレン基、炭素原子数１～２０のアルケニレン基、炭素原子数１～２０のアルキニレン基が挙げられ、任意の位置にオキソ基を有していてもよく、オキシ基、イミノ基を介していてもよく、これらの組合せであってもよい。例えば、オキソ基を有する炭素原子とオキシ基を組み合わせるとエステル結合を成し、オキソ基を有する炭素原子とイミノ基を組み合わせるとアミド結合を成す。また、複数のオキシ基を有するアルキレン基は、オキシアルキレン基とも呼ばれ、例えば、炭素原子数１～１０のポリオキシエチレン基、炭素原子数１～１０のポリオキシプロピレン基が含まれる。有機基の具体例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基、へプチレン基、オクチレン基、ノナニレン基、デシレン基等のアルキレン基；プロピニレン基、ブテニレン基、ペンテニレン基、ヘキセニレン基、ヘプテニレン基、オクテニレン基、ノネニレン基、デセニレン基等のアルケニレン基；プロパルギル基、ブチニレン基、ペンチニレン基、ヘキシニレン基、ヘプチニレン基、オクチニレン基、ノニレン基、デシニレン基等のアルキニレン基が挙げられる。オキソ基、オキシ基、又はイミノ基を有する有機基としては、シクロデキストリンの水酸基由来の酸素原子とともにエステル結合、炭酸エステル結合、又はウレタン結合を形成していることが好ましい。オキソ基、オキシ基、又はイミノ基を有する有機基としては、例えば、カルボニルメチレン基（－Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２－）等のカルボニルアルキレン基；メチレンカルボニル基（－ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－）等のアルキレンカルボニル基；カルボニルアミノメチレン基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２－）等のカルボニルアミノアルキレン基；メチレンカルボニルアミノ基（－ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－）等のアルキレンカルボニルアミノ基；カルボニルアミノエチレン基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２－）等のカルボニルアミノアルキレン基、カルボニルアミノエチレンオキシエチレン基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２－）等のカルボニルアミノアルキレンオキシアルキレン基；オキシプロピレン基（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）等のオキシアルキレン基が挙げられる。
修飾されたシクロデキストリンは、好ましくは式（４）で表される。式中、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－Ｘａ－は、式（３）中のＸに対応し、Ｘがオキソ基とイミノ基を有する態様の１つに相当する。Ｘａは、炭素原子数１～９の有機基であり、好ましくは炭素原子数２～９のアルキレン基であり、より好ましくは炭素原子数２～８のポリオキシエチレン基である。
ポリロタキサンは、軸分子が少なくとも１個のシクロデキストリンを貫通した構造を備えている。各シクロデキストリンは、軸分子の主鎖方向に沿って移動することができ、軸分子の主鎖を中心に回転することができる。このような構造特性は、分子可動性と呼ばれる。分子可動性は、例えば、シクロデキストリンの数、構成するシクロデキストリンを構成するグルコースに修飾された置換基の数にしたがって変動し得る。
分子可動性は、培養基材の表面上にコーティングを施した後、コーティング表面の静的接触角を、接触角計を用いて測定し、液滴法及びキャプティブバブル法を用いて評価できる。分子可動性の評価は、例えば、Soft Matter, 2012, 8, 5477-5485(Ji-Hun Seo et al.）、Adv. Healthcare Mater. 2015, 4, 215-222等に記載の方法を参照してもよい。具体的には、コーティング表面の接触角ヒステリシス値を、液滴法で測定した水の接触角（大気中での水の接触角）とキャプティブバブル法で測定した気泡の接触角から求めた水の接触角（水中での水の接触角）の差から計算できる。対照として、ＤＭＳＯでコーティングした培養基材に対する効果と比較してもよい。
分子可動性は、シクロデキストリンの貫通数及び／又はシクロデキストリン中の－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数を変更することにより、調整することができる。例えば、シクロデキストリンの貫通数が３～１２０であると、間葉系幹細胞の脂肪分化及び／又は骨芽分化の促進により好適となり得る。シクロデキストリンの貫通数が多いと、再沈殿により精製しやすくなる。
ポリロタキサンの含有量は、コーティング剤の質量を基準として、０．０００５～５質量％であってもよく、０．０１～１質量％が好ましく、０．０２～０．５質量％がより好ましい。
本実施形態にかかるコーティング剤は、上述のポリロタキサンに加えて、溶剤、任意の添加剤を含有してもよい。溶剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メタノール、２－プロパノール、クロロホルム、塩化メチレンが挙げられる。また、このような添加剤としては、酸化防止剤等が挙げられる。
本実施形態に係るコーティング剤は、培養基材として使用できる基板の表面にコーティングするために使用される。培養基材として使用できる基板は、当業者に周知なものであってよい。基板の材質としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、アクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
本実施形態にかかるコーティング剤によれば、シクロデキストリンを構成するグルコースにおいて、－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数を調整することにより、基板自体のバルク特性に依存することなく、間葉系幹細胞の脂肪分化及び／又は骨芽分化の促進を調整することが可能となる。より具体的には、脂肪分化が進むにつれて、細胞内の脂肪滴蓄積量が増加する。細胞内に蓄積した脂肪滴をオイルレッドＯ色素により染色し、細胞内の脂肪滴蓄積の程度を評価することができる。間葉系幹細胞の脂肪分化は、脂肪分化を示す指標である分化マーカー遺伝子（例えば、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ａＰ２）の発現量によって判断してもよい。骨芽分化においては、分化が進むにつれて骨結節が形成される（石灰化とも呼ばれる。）。また、骨結節をアリザリンレッドＳ色素により染色し、石灰化の程度を評価することができる。間葉系幹細胞の骨芽分化は、骨芽分化を示す指標である分化マーカー遺伝子（例えば、ＲＵＮＸ２、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク、Ｉ型コラーゲン）の発現量により判断してもよい。
ポリロタキサンは、実施例を参考にして製造することができ、以下のように製造してもよい。所望の長さのポリエチレングリコールの両末端にある水酸基を脱離基に変換し（例えば、ハロゲン化、メタンスルホニル化、トルエンスルホニル化）、フェニルアラニノールとエーテル化して、ジアミンを得る。得られたジアミンを、シクロデキストリンと混合することにより、擬ロタキサンを得る。このとき、ジアミン１分子に対するシクロデキストリンの量を調整することにより、シクロデキストリンの貫通数を調整することができる。続いて、ＣＰＡＤＢ及びＤＭＴ－ＭＭと反応させてシクロデキストリンが軸分子から抜けないようにキャップした後、可逆的付加開裂連鎖移動重合反応（ＲＡＦＴ重合反応）により、アンカリングセグメントとして両末端にベンジルメタクリレート（（メタ）アクリレート構造に相当する。）を導入する。
＜第二実施形態＞
本発明の第二実施形態は、間葉系幹細胞の脂肪分化を促進させるための細胞培養方法であって、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板の表面上で、間葉系幹細胞を培養することを含む、方法である。
本実施形態において、「式（１）で表されるポリロタキサン」は、第一実施形態で説明したものを参照でき、「式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物」は、第一実施形態で説明したコーティング剤を利用できる。
本実施形態にかかる細胞培養方法では、培養基材として、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングした基板を使用する。細胞の培養は、上記コーティングされた基板の表面に細胞を接着させて実施する。
培養基材は、基板に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティングを施したものである。基板は、当業者に周知なものであってよい。基板の材質としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、アクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。基板は、市販のガラス製基板又はプラスチック製基板であってもよい。
本実施形態にかかる細胞培養方法では、基板上に施されたコーティング表面上に、細胞が浸るように培地を投入し、培養対象の細胞を播種し、培養する。培地は、必要に応じて新しい培地に交換してもよい。また、細胞を分化させる前に増殖用培地を投入して、播種した細胞を増殖させる工程を設けてもよい。この場合、充分な細胞数が得られるまで増殖した後、増殖用培地を分化用培地に置き換える。増殖用培地及び分化用培地は、当業者に周知な培地を利用できる。
間葉系幹細胞の脂肪分化用培地としては、例えば、PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)社のMesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium2(C-28016)が使用できる。
細胞培養環境は当業者に周知な条件で、任意に設定することができる。
間葉系幹細胞の脂肪分化とは、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を意味する。脂肪分化が進むにつれて、細胞内の脂肪滴蓄積量が増加する。間葉系幹細胞の脂肪分化促進効果は、オイルレッドＯによる細胞染色（細胞内の脂肪滴を染色）により評価できる。分化マーカーの発現量の変化を測定することにより、判断してもよい。例えば、脂肪分化の分化マーカーとしては、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ａＰ２が挙げられる。未修飾ポリロタキサン（例えば、後述するＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ）を基板（ガラス製又はポリスチレン製）にコーティングした培養基材を用いた場合と比較して、統計学的有意に分化が促進されていれば、間葉系幹細胞の脂肪分化促進効果を有すると判断できる。
本実施形態に係る細胞培養方法は、上記基板の表面上に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングすることを含んでいてもよい。
式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物は、基板にコーティングすることができる。コーティングの方法は特に制限されず、例えば、キャスティング、スピンコーティング、グラビアコーティング、ダイコーティング、ナイフコーティング、バーコーティング、ブレードコーティング、ロールコーティング等が挙げられる。好ましいコーティングの方法は、キャスティングである。
＜第三実施形態＞
本発明の第三実施形態は、間葉系幹細胞の骨芽分化を促進させるための細胞培養方法であって、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板の表面上で、間葉系幹細胞を培養することを含む、方法である。
本実施形態において、「式（１）で表されるポリロタキサン」は、第一実施形態で説明したものを参照でき、「式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物」は、第一実施形態で説明したコーティング剤を利用できる。
本実施形態にかかる細胞培養方法では、培養基材として、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングした基板を使用する。細胞の培養は、上記コーティングされた基板の表面に細胞を接着させて実施する。
培養基材は、基板に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティングを施したものである。基板は、当業者に周知なものであってよい。基板の材質としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、アクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。基板は、市販のガラス製基板又はプラスチック製基板であってもよい。
本実施形態にかかる細胞培養方法では、基板上に施されたコーティング表面上に、細胞が浸るように培地を投入し、培養対象の細胞を播種し、培養する。培地は、必要に応じて新しい培地に交換してもよい。また、細胞を分化させる前に増殖用培地を投入して、播種した細胞を増殖させる工程を設けてもよい。この場合、充分な細胞数が得られるまで増殖した後、増殖用培地を分化用培地に置き換える。増殖用培地及び分化用培地は、当業者に周知な培地を利用できる。
間葉系幹細胞の骨芽分化用培地としては、例えば、PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)社のMesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium (C-28013)を使用できる。
細胞培養環境は当業者に周知な条件で、任意に設定することができる。
間葉系幹細胞の骨芽分化とは、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を意味する。骨芽分化が進むにつれて骨結節が形成される（石灰化とも呼ばれる）。間葉系幹細胞の骨芽分化促進効果は、アリザリンレッドＳによる細胞染色（骨結節が染色される。）によって評価できる。分化マーカーの発現量の変化を測定することにより、判断してもよい。例えば、骨芽分化の分化マーカーとしては、ＲＵＮＸ２、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク、Ｉ型コラーゲンが挙げられる。未修飾ポリロタキサン（例えば、後述するＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ）を基板（ガラス製又はポリスチレン製）にコーティングした培養基材を用いた場合と比較して、統計学的有意に分化が促進されていれば、間葉系幹細胞の骨芽分化促進効果を有すると判断できる。
本実施形態に係る細胞培養方法は、上記基板の表面上に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングすることを含んでいてもよい。
式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物は、基板にコーティングすることができる。コーティングの方法は特に制限されず、例えば、キャスティング、スピンコーティング、グラビアコーティング、ダイコーティング、ナイフコーティング、バーコーティング、ブレードコーティング、ロールコーティング等が挙げられる。好ましいコーティングの方法は、キャスティングである。
＜第四実施形態＞
本発明の第四実施形態は、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板を含む培養基材である。
本実施形態において、「式（１）で表されるポリロタキサン」は、第一実施形態で説明したものを参照でき、「式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物」は、第一実施形態で説明したコーティング剤を利用できる。また、コーティング方法は、第二又は第三実施形態で説明した方法を参照できる。
本実施形態に係るコーティングされた基板（培養基材）は、間葉系幹細胞の脂肪分化及び／又は骨芽分化を促進させるための培養基材として特に好適である。
本実施形態に係る培養基材によれば、シクロデキストリンを構成するグルコースにおいて、－Ｘ－Ｙで修飾された水酸基の数を調整することにより、基板自体のバルク特性に依存することなく、間葉系幹細胞の分化（脂肪分化及び／又は骨芽分化の促進）、間葉系幹細胞の増殖（促進又は抑制）を調整することが可能となる。
以下、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されることはない。また、実施例において使用される略語は当業者に周知の慣用的な略語であり、いくつかの略語の意味を以下に示す。
αＣＤ：α－シクロデキストリン
ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール
ＣＰＡＤＢ：４－シアノペンタノイックアシッド ジチオベンゾエート
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＭＴ－ＭＭ：４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム クロリド
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＩＢＭＸ：３－イソブチル－１－メチルキサンチン
α－ＭＥＭ：α－最小必須培地
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭｓＣｌ：メタンスルホン酸クロリド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＴＣＰＳ：細胞培養用ポリスチレン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
１Ｈ－ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴スペクトルメトリー
１．ポリロタキサンの合成
（実施例１）
ポリロタキサンの合成方法を、以下に示す。
工程１：α，ω－ビスメシルポリエチレングリコールの合成
数平均分子量２００００のポリエチレングリコール（２５．０ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（５．３ｍＬ、３７．５ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１３０ｍＬ）に溶解させ、ＭｓＣｌ（２．０ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）を滴下して、２３℃にて撹拌した。５時間後、反応液をろ過し、そのろ液をジエチルエーテルで沈殿させて、沈殿物を固体として回収した。得られた沈殿物を減圧下乾燥し、α，ω－ビスメシルポリエチレングリコール（２１．１ｇ、収率：８４％）を得た。
工程２：ビス（２－アミノ－３－フェニルプロピル）ポリエチレングリコールの合成
Ｌ－フェニルアラニノール（１．４９ｇ、９．８５ｍｍｏｌ）と水素化ナトリウム（０．９７１ｇ、６０％鉱油）を窒素雰囲気下、無水ＤＭＦ（８６ｍＬ）に溶解した。この混合液にα，ω－ビスメシルポリエチレングリコール（２０．０ｇ、０．９９２ｍｍｏｌ）を加えて、２３℃で撹拌した。２４時間後、反応液をろ過し、そのろ液をジエチルエーテルで沈殿させて、沈殿物を固体として回収した。得られた沈殿物を減圧下乾燥し、ビス（２－アミノ－３－フェニルプロピル）ポリエチレングリコール（１１．８ｇ、収率：５９％）を得た。
工程３：擬ポリロタキサンの合成
ビス（２－アミノ－３－フェニルプロピル）ポリエチレングリコール（１０．１ｇ、０．４９９ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解させ、αＣＤ（５５．２ｇ、５６．６ｍｍｏｌ）の飽和水溶液（３８０ｍＬ）を加えて、２３℃で撹拌した。１９時間後、反応液を遠心分離することにより沈殿物を回収し、凍結乾燥を９日間行うことで、粗精製物として擬ポリロタキサンを得た。
工程４：ポリロタキサンＰＲＸ－ＣＰＡＤＢの合成
ＣＰＡＤＢ（５．５０ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）及びＤＭＴ－ＭＭ（５．５０ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）をメタノール（５００ｍＬ）に溶解させ、上記で得られた擬ポリロタキサンを２３℃で反応液に加えて、撹拌した。１日後、粗精製物をメタノールで洗浄し、含水ＤＭＳＯで再沈殿させ、遠心分離を行い、９日間凍結乾燥することにより、ポリロタキサンＰＲＸ－ＣＰＡＤＢ（１１．９ｇ、２工程収率：１８％）を粉末として得た。ポリロタキサンＰＲＸ－ＣＰＡＤＢの構造は、１Ｈ－ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって確認した。また、αＣＤの貫通数は、１Ｈ－ＮＭＲ（溶媒：Ｄ２Ｏ）によって決定した。
1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 3.12-3.91 (m, PEG backbone and H2, H3, H4, H5,and H6 protons of αCD), 4.43 (m, OH6 of αCD), 4.80 (m, H1 of αCD), 5.49 (m, OH3 of αCD), 5.65 (m, OH2 of αCD), 7.17 (t, aromatics of phenylalanyl group), 7.25(t, aromatics of phenylalanyl group), 7.52 (t, aromatics of CPADB group), 7.70(t, aromatics of CPADB), and 7.91 (t, aromatics of CPADB).
工程５：参考例１のポリロタキサン（ＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ）の合成
ポリロタキサンＰＲＸ－ＣＰＡＤＢ（１．５０ｇ、１３．９μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１２ｍＬ）に溶解させ、この混合液にベンジルメタクリレート（１．７１ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）及び４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（１．５５ｍｇ、５．５４μｍｏｌ）を加えた。ＦＰＴサイクル（Freeze-Pump-Thawサイクル）によって脱気した後、７０℃で撹拌した。１日後、粗精製物をジエチルエーテルで沈殿させ、減圧下乾燥して、ポリロタキサンＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ（３．１３ｇ、収率：９８％）を得た。ポリベンジルメタクリレート構造を形成するベンジルメタクリレート単位の数ｍは、１Ｈ－ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって決定した。
1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6) δ 0.40-0.95 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA),1.43-2,10 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA), 3.17-4.02 (m, PEG backbone andH2, H3, H4, H5, and H6 protons of αCD), 4.44 (m, OH6 of αCD), 4.80 (m, H1 ofαCD), 4.86 (m, -CH2-Ph of PBzMA), 5.49 (m, OH3 of αCD), 5.66 (m, OH2 ofαCD), and 7.26 (m, aromatics of PBzMA).
工程６ａ：比較例１のポリロタキサン（ＮＨ２－ＰＲＸ）の合成
ポリロタキサンＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ（２００ｍｇ，０．８９５μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解し、次いでＣＤＩ（１０４ｍｇ，０．６４３ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。２３℃で１日間撹拌した後、この溶液にエチレンジアミン（０．４３ｍＬ，６．４３ｍｍｏｌ）を加え、さらに２３℃で１日間撹拌した。次いで、反応液を４日間の透析によって精製した。生成物を７日間凍結乾燥して、粉末としてＮＨ２－ＰＲＸ（１７６ｍｇ、収率７３％）を得た。アミノ基の数は、１Ｈ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって決定した。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ = 0.38-0.92 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA),1.47-2.02 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA), 3.00 (m, -O-CO-NH-CH2-CH2-NH2), 3.15-4.55 (m, PEG backbone, H2, H3, H4, H5, and H6 protons of α-CD, andOH6 of α-CD), 4.86 (m, -CH2-Ph of PBzMA, H1 of α-CD), and 7.26 (m,aromatics of PBzMA).
工程６ｂ：比較例２のポリロタキサン（ＣＨ３－ＰＲＸ）の合成
ポリロタキサンＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ（０．１５ｇ、０．６７１μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１．３１ｍＬ）に溶解させ、水酸化ナトリウム（２８．７ｍｇ、０．７１６ｍｍｏｌ）及びヨードメタン（１５μＬ、０．２３９ｍｍｏｌ）を加えて、２３℃で撹拌した。１時間後、メタノールを加えて反応を停止し、３日間透析することで、比較例１のポリロタキサン（１１５ｍｇ、収率：７５％）を得た。メチル基の数は、１Ｈ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって決定した。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 0.40-0.95(m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA), 1.43-2.10 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA),3.17-4.02 (m, PEG backbone, H2, H3, H4, H5, and H6 protons of αCD, and -OCH3 ofαCD), 4.44 (m, OH6 of αCD), 4.57-5.10 (m, H1 of αCD and -CH2-Ph ofPBzMA), 5.49 (m, OH3 ofαCD), 5.64 (m, OH2 ofαCD), and 7.26 (m, aromatics ofPBzMA).
工程６ｃ：実施例１のポリロタキサン（ＯＨ－ＰＲＸ）の合成
ポリロタキサンＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ（２００ｍｇ、０．８９５μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解し、ＣＤＩ（１３０ｍｇ、０．８０４ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。２３℃で１日間撹拌した後、２－（２－アミノエトキシ）エタノール（０．８０ｍＬ、８．０４ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、２３℃でさらに１日間撹拌した。次いで、反応液を４日間の透析によって精製した。生成物を７日間凍結乾燥し、粉末としてＯＨ－ＰＲＸ（１９４ｍｇ、収率７４％）を得た。ＯＨ基の数は、１Ｈ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって決定した。
1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ 0.42-0.95 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA), 1.45-2.02(m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA), 3.14 (m, -O-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH),3.17-4.70 (m, PEG backbone, H2, H3, H4, H5, and H6 protons of α-CD, OH6 ofα-CD, and -O-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH), 4.86 (m, -CH2-Phof PBzMA, H1 of α-CD), and 7.26 (m, aromatics of PBzMAH).
工程６ｄ：実施例２のポリロタキサン（ＳＯ３Ｈ－ＰＲＸ）の合成
ポリロタキサンＰＲＸ－ＰＢｚＭＡ（１５０ｍｇ、０．６７１μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（３．０ｍＬ）に溶解し、その後、ＮａＯＨ粉末（６５．１ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）および１，３－プロパンスルトン（６６．３ｍｇ、０．５４３ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。２３℃で１日間撹拌した後、５日間透析精製した。生成物を７日間凍結乾燥し、粉末としてＳＯ３Ｈ－ＰＲＸ（１５５ｍｇ、収率６８％）を得た。スルホ基（－ＳＯ３Ｈ）の数は、１Ｈ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）によって決定した。
1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ = 0.33-0.95 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA),1.41-2.12 (m, -CH(-CH3)-CH2- of PBzMA and -O-CH2-CH2-CH2-SO3Na),2.92-4.23 (m, PEG backbone, H2, H3, H4, H5, and H6 protons of α-CD, and -O-CH2-CH2-CH2-SO3Na),4.86 (m, -CH2-Ph of PBzMA, H1 of α-CD), 7.26 (m, aromatics of PBzMA).
得られたポリロタキサンのデータを表１に示す。図１は、参考例１、実施例１～２、比較例１～２のポリロタキサンの各１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを比較した図である。各スペクトルにおける特徴的なピークをグレーで示した。括弧内の数字は、１個のシクロデキストリンあたりの官能基修飾数を示す。
得られたポリロタキサンをＤＭＳＯに溶解し、コーティング剤を製造した。得られたコーティング剤をＴＣＰＳにキャスティングした。
２．表面化学組成の分析
（１）表面の元素組成
ポリロタキサン表面の化学組成を３０ｋｅＶのＢｉ３＋＋一次イオンを用いたＴＯＦ－ＳＩＭＳ（ＰＨＩ ＮａｎｏＴＯＦ ＩＩ、ＵＬＶＡＣ－ＰＨＩ）により分析した。分析視野は１００×１００μｍである。表面の元素組成は、１４８６．６ｅＶのエネルギーを有する単色化されたＸ線放射を用いたＸ線光電子分光（Ａｌ－Ｋα、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、イーストグリンステッド）によって決定した。分析領域の直径は４００μｍであり、元素組成は各表面の３点の平均から計算した。
ＴＯＦ－ＳＩＭＳ測定により得られた質量スペクトルを図２～３に示す。ＴＣＰＳ以外の表面ではｍ／ｚ＝８５の特性ピークが観測された。このピークはメタクリレート基（Ｃ４Ｈ５Ｏ２ －）の存在を示唆し、ＴＣＰＳ表面がＰＢｚＭＡ構造を含むトリブロック共重合体でコーティングされていると推察された。また、比較例１と実施例１の表面に対して、Ｎ含有基（ＣＮＯ－）の存在を示唆するｍ／ｚ＝４２での特徴的なピークを検出した。表２に示すＸＰＳ分析の結果から、窒素および酸素の元素組成は、ＮＨ２－ＰＲＸ表面（比較例１）およびＯＨ－ＰＲＸ（実施例１）上で他の表面上よりも顕著に高かった。
（２）接触角及びゼータ電位の測定
細胞培養用ポリスチレン（ＴＣＰＳ）の表面に、実施例１～２及び比較例１～２のポリロタキサンを含有するコーティングを施した。接触角計（商品名：ＤＭ－５０１、協和界面科学株式会社製）とソフトウェアを用いて、コーティング表面の静的接触角を液滴法とキャプティブバブル法の両方で測定した。各表面の接触角ヒステリシス値は、液滴法で測定した水の接触角（大気中での水の接触角）とキャプティブバブル法で測定した気泡の接触角から求めた水の接触角（水中での水の接触角）の差から算出した。すべての測定値は４つの異なる表面で得たものであり、各表面の３つの異なるポイントの平均値を記録した。接触角ヒステリシスの差は、表面間の分子可動性の差を示すことが知られている。
参考例１、実施例１～２及び比較例１～２のポリロタキサン表面の接触角及び接触角ヒステリシスを表３に示す。ポリロタキサン表面の大気中での水の接触角は８０～１００°の範囲であり、ポリロタキサンコーティングによりＴＣＰＳ表面（接触角は７４°）表面とは濡れ性が変化したことが確認された。実施例１～２及び比較例１～２のポリロタキサン表面の大気中の水の接触角は、参考例１のポリロタキサン表面の接触角よりわずかに小さく、ポリロタキサン表面間に有意差はなかった。一方、水中でキャプティブバブル法を用いて測定した水中での水の接触角は異なる傾向を示し、ポリロタキサン表面間で有意差が見られた。
ポリロタキサン表面は、αＣＤとポリエチレングリコール鎖間のインターロック構造に由来した分子可動性を有し、水和状態で独特の挙動を示す。例えば、ポリロタキサン表面の水和時の分子可動性を、（１）散逸を伴う水晶マイクロバランスを用いて水中で測定した散逸エネルギー損失（ＱＣＭ－Ｄ）から求めた結果と、及び（２）空気中の水の接触角と水中の気泡の接触角から求めた水の接触角の差で測定した接触角ヒステリシスの結果に関連性があることが知られている。実施例１～２及び比較例１～２を用いた各コーティング表面において、表面官能基の種類により接触角ヒステリシスの値が変化したことから、シクロデキストリンの水酸基の官能基修飾は、分子可動性を調整するために有用であると考えられる。
また、ポリロタキサン表面のゼータ電位を、電気泳動光散乱分光計（ＥＬＳＺ－２、大塚電子）を用いて、平板試料用の石英フローセルを用いて測定した。表面上の電気浸透の移動度を、１０ｍＭ ＰＢＳ中のモニタリング粒子（大塚電子）を用いて分析し表面上のゼータ電位を算出した。すべての測定は３つの異なる表面で行った。
参考例１、実施例１～２及び比較例１～２のポリロタキサン表面のゼータ電位を、表３に示す。比較例１のポリロタキサン表面は最も負電荷が小さく、実施例２は全表面の中で最も負に帯電していた。アミノ基はｐＨ７．４で正に帯電するはずであるが、比較例１のポリロタキサン表面は負に帯電していた。これはコーティングの下地の基板（ＴＣＰＳ）の負電荷と、非修飾ＰＲＸ表面の負電荷によると考えられる。
（３）ポリロタキサン表面へのフィブロネクチン吸着（マイクロＢＣＡアッセイ）
ポリロタキサン表面へのフィブロネクチン吸着を調べるために、参考例１、実施例１～２及び比較例１～２の各表面でヒトフィブロネクチンのＰＢＳ溶液（１００μｇ／ｍＬ）を３７℃で３時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄して、非吸着フィブロネクチンを除去した。J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2017, 28, 986-999.又はACSBiomater. Sci. Eng., 2018, 4, 1591-1597.に記載の方法に従って、５％ＳＤＳおよび０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、吸着されたフィブロネクチンを抽出した。フィブロネクチン濃度は、製造業者の指示に従って、ヒトフィブロネクチン標準と共にタンパク質アッセイキット（Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標）、Thermo Scientific製）を用いて測定した。
結果を図４に示す。比較例１の表面でフィブロネクチンが最も多く吸着した。フィブロネクチンは負に帯電しており、正に帯電したアミノ基との静電的相互作用により、フィブロネクチンが多く吸着したと考えられた。実施例１～２及び比較例２のポリロタキサン表面のフィブロネクチン吸着量には、参考例１に対して有意差はなかった。
２．ポリロタキサン表面における細胞応答
（１）ポリロタキサン表面上のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）接着および増殖
各ポリロタキサン表面上のｈＭＳＣの初期接着および増殖を評価するために、細胞を６．０×１０３細胞／ｃｍ２の濃度で各表面上に播種し、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃にて３日間、ｈＭＳＣ増殖用培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いて培養した。細胞の形態は、位相差顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、キーエンス）を用いて観察し、接着した細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いた処理により基板から剥がし、各表面に接着したｈＭＳＣの数を１日間隔で血球計算盤を用いて測定した。
結果を図５に示す。播種後１日目には、各ポリロタキサン表面間で細胞密度に有意差は認められなかった。播種３日目において、比較例１の表面上の細胞密度は最も低かった。
（２）ポリロタキサン表面上のｈＭＳＣの骨芽分化
骨芽分化（骨形成分化）を誘導するために、各ポリロタキサン表面にｈＭＳＣを２．４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ｈＭＳＣ増殖用培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いて、細胞の密度が過剰コンフルエントになるまで、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で３７℃にて５日間培養した。増殖用培地を骨芽分化用培地に交換し、細胞を１４日間インキュベートした。培地を３～４日ごとに新鮮な培地と交換した。骨芽分化用培地として、PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)社のMesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium (C-28013)を使用した。
分化誘導の１４日後に、細胞をアリザリンレッドＳで染色して、ｈＭＳＣの石灰化の程度を評価した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて、２３℃で１０分間処理することによって固定した。細胞をＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、アリザリンレッドＳ溶液を用いて、２３℃で１０分間染色した。染色液を除去した後、細胞をＭｉｌｌｉＱ水で４回洗浄し、顕微鏡で観察した。染色面積はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて算出した。すべての測定値は３つの異なる表面で得たものであり、各表面の４つの異なる点の平均値を各表面の平均値とした。
結果を図６に示す。骨形成分化の誘導後、細胞形態は、細長い形状から正方形の形状に変化し、細胞密度は、特に実施例２の表面上で増加した。各表面上で培養したｈＭＳＣの骨結節形成を評価するために、骨芽分化誘導後１４日目にアリザリンレッドＳを用いてカルシウム結節を染色した。図７は、（Ａ）アリザリンレッドＳによる染色写真と（Ｂ）各ポリロタキサン表面における染色面積を比較したグラフである。染色面積に有意差が認められ、最も負に帯電した表面（実施例２）で最も大きく、最も負に帯電していない表面（比較例１）で最も小さく、他の表面（参考例１、実施例１、比較例２）では中程度であった。
（３）ポリロタキサン表面上のｈＭＳＣの脂肪分化
脂肪分化を誘導するために、各ポリロタキサン表面にｈＭＳＣを１．０×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ｈＭＳＣ増殖用培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを用いて、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で５日間培養した。増殖用培地を脂肪分化用培地に交換し、細胞を１５日間培養した。培地を３～４日ごとに新鮮な培地と交換した。脂肪分化用培地として、PromoCell GmbH (Heidelberg, Germany)社のMesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium2(C-28016)を使用した。
分化誘導の１５日後、細胞をオイルレッドＯで染色し、細胞内の脂肪滴蓄積を評価した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて、２３℃で１０分間処理することによって固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、６０％２－プロパノールで１回洗浄した。細胞を２３℃で２０分間オイルレッドＯ溶液を用いて染色し、６０％２－プロパノールで１回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、顕微鏡を用いてＰＢＳ中で観察した。染色面積はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて算出した。すべての測定値は３つの異なる表面で得たものであり、各表面の３つの異なる点の平均値を各表面の平均値とした。
結果を図８に示す。脂肪分化に伴う細胞内の脂肪滴形成が全ての表面に観察され、培養期間に従って脂肪滴の増加が見られた。図９は、（Ａ）オイルレッドＯによる染色写真と（Ｂ）各ポリロタキサン表面における染色面積を比較したグラフである。比較例１及び実施例１～２の表面上の染色面積は、参考例１及び比較例２の表面上の染色面積より大きかった。オイルレッドＯによる染色面積は、接触角ヒステリシスの増加と共に増加する傾向が見られた。接触角ヒステリシスの差は、表面の分子可動性の差を示すので、特に比較例１及び実施例１～２のポリロタキサン表面の分子可動性は、脂肪分化の促進により適していると考えられる。

Claims (13)

  1. 間葉系幹細胞の増殖及び骨芽分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティング剤。
    Figure 0007687632000020
    ［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000021
    は、少なくとも１つの水酸基が、－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙはスルホ基である。］
  2. 間葉系幹細胞の脂肪分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有するコーティング剤。
    Figure 0007687632000022
    ［式中、Ｒ １ は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000023
    は、少なくとも１つの水酸基が、－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
  3. 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、請求項１又は２に記載のコーティング剤。
  4. 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２２０個である、請求項１～３のいずれか一項に記載のコーティング剤。
  5. 間葉系幹細胞の増殖及び骨芽分化を促進させるための細胞培養方法であって、
    式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板の表面上で、間葉系幹細胞を培養することを含む、方法。
    Figure 0007687632000024
    ［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000025
    は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙはスルホ基である。］
  6. 間葉系幹細胞の脂肪分化を促進させるための細胞培養方法であって、
    式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板の表面上で、間葉系幹細胞を培養することを含む、方法。
    Figure 0007687632000026
    ［式中、Ｒ １ は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000027
    は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
  7. 基板の表面上に、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物をコーティングすることを含む、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２２０個である、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 間葉系幹細胞の増殖及び骨芽分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板を含む培養基材。
    Figure 0007687632000028
    ［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000029
    は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙはスルホ基である。］
  11. 間葉系幹細胞の脂肪分化を促進させるための、式（１）で表されるポリロタキサンを含有する組成物でコーティングされた基板を含む培養基材。
    Figure 0007687632000030
    ［式中、Ｒ １ は水素原子又はメチル基であり、ｍは１～２０００であり、ｎは１０～５００であり、
    Figure 0007687632000031
    は、少なくとも１つの水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンであり、Ｘは２価の有機基であり、Ｙは水酸基又はスルホ基である。］
  12. 前記ポリロタキサンが、１～１８個の水酸基が－Ｘ－Ｙで表される基で修飾されたシクロデキストリンを含む、請求項１０又は１１に記載の培養基材。
  13. 前記ポリロタキサンにおいて、シクロデキストリンの貫通数が３～２００個である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の培養基材。
JP2022565330A 2020-11-26 2021-11-22 ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン Active JP7687632B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020196323 2020-11-26
JP2020196323 2020-11-26
PCT/JP2021/042832 WO2022113944A1 (ja) 2020-11-26 2021-11-22 ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2022113944A1 JPWO2022113944A1 (ja) 2022-06-02
JP7687632B2 true JP7687632B2 (ja) 2025-06-03

Family

ID=81754563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022565330A Active JP7687632B2 (ja) 2020-11-26 2021-11-22 ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230416682A1 (ja)
EP (1) EP4253535B1 (ja)
JP (1) JP7687632B2 (ja)
KR (1) KR20230091943A (ja)
CN (1) CN116648501A (ja)
AU (1) AU2021389338A1 (ja)
CA (1) CA3203150A1 (ja)
TW (1) TW202227539A (ja)
WO (1) WO2022113944A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023124226A (ja) * 2022-02-25 2023-09-06 横浜ゴム株式会社 ロタキサン及びその製造方法、並びに、架橋ポリマー、高分子微粒子及び高分子樹脂部材
CN120966238B (zh) * 2025-10-20 2026-01-06 浙江美亚特精密机械有限公司 一种耐腐蚀复合材料、制备方法及其在齿轮中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60235472D1 (de) * 2001-07-30 2010-04-08 Japan Tissue Eng Co Ltd Implantationsmaterial zur geweberegeneration
KR101718803B1 (ko) * 2015-09-03 2017-03-22 경희대학교 산학협력단 거대분자 기반 하이드로겔 조성물 및 이의 용도
WO2017191827A1 (ja) * 2016-05-02 2017-11-09 国立大学法人 東京医科歯科大学 内部分解型ポリロタキサンおよびその合成方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS BIOMATERIALS SCIENCE & ENGINEERING，2019年02月28日，Vol. 5, No. 11，pp. 5652-5659
ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS，2015年，Vol. 4，pp. 215-222
JOURNAL OF BIOMATERIALS SCIENCE, POLYMER EDITION，2017年，Vol. 28, Nos. 10-12，pp. 974-985
POLYMER CHEMISTRY，2014年，Vol. 5，pp. 4511-4520

Also Published As

Publication number Publication date
EP4253535A1 (en) 2023-10-04
EP4253535A4 (en) 2024-05-15
JPWO2022113944A1 (ja) 2022-06-02
EP4253535B1 (en) 2025-11-12
WO2022113944A1 (ja) 2022-06-02
AU2021389338A1 (en) 2023-06-29
TW202227539A (zh) 2022-07-16
CN116648501A (zh) 2023-08-25
KR20230091943A (ko) 2023-06-23
EP4253535C0 (en) 2025-11-12
US20230416682A1 (en) 2023-12-28
CA3203150A1 (en) 2022-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3495400B1 (en) Block copolymer and surface treatment agent using same
Hsu et al. Biocompatibility of poly (ε-caprolactone)/poly (ethylene glycol) diblock copolymers with nanophase separation
Dworak et al. Poly (2-substituted-2-oxazoline) surfaces for dermal fibroblasts adhesion and detachment
Amiri et al. Osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells on modified PES-PEG electrospun fibrous composites loaded with Zn2SiO4 bioceramic nanoparticles
Yuan et al. Copolymer coatings consisting of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and 3-methacryloxypropyl trimethoxysilane via ATRP to improve cellulose biocompatibility
JP7687632B2 (ja) ヒドロキシ基又はスルホ基を有するポリロタキサン
Singh et al. Directing chondrogenesis of stem cells with specific blends of cellulose and silk
JP6497677B2 (ja) ブロック共重合体、表面処理剤、その膜、およびそれを被覆した細胞培養基材
US20240052097A1 (en) Synthesis of peg-based thiol-norbornene hydrogels with tunable hydroylitic degradation properties
Zhou et al. The effect of matrix stiffness on the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells
JP6756201B2 (ja) 刺激応答性ポリマー
Liu et al. Nondegradable magnetic poly (carbonate urethane) microspheres with good shape memory as a proposed material for vascular embolization
JP7689672B2 (ja) アミノ基を有するポリロタキサン
EP3584318A1 (en) Polymer bead
Du et al. Mediating the migration of mesenchymal stem cells by dynamically changing the density of cell-selective peptides immobilized on β-cyclodextrin-modified cell-resisting polymer brushes
JP2018201463A (ja) 幹細胞を調製するための方法およびキット
JP3311074B2 (ja) 細胞培養基材
WO2022102663A1 (ja) コーティング剤、培養基材、及び細胞培養方法
JP2007049918A (ja) 細胞培養支持体及びその細胞培養法、細胞回収法と細胞
Tamaño-Machiavello et al. Maintenance of pluripotency and osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells on acrylate-based substrates exhibiting gelatin or heparin grafting
Sempere et al. María Noel Tamaño-Machiavello1, Juan Carlos Marín Payá1, Silvia Flores1, Lourdes Cordón2, 3
Nelson et al. Glycosaminoglycan-Inspired Polymer Brushes Promote Human Mesenchymal Stem Cell Proliferation While Retaining Trilineage Differentiation Potential
JP2023036217A (ja) 共重合体、表面改質剤、組成物、医療用デバイス、シリコーン基材、及び細胞培養容器

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230502

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230725

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240611

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240806

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712

Effective date: 20241009

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241010

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20241010

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241021

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250328

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20250507

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250514

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7687632

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150