JP7699112B2 - Method for improving separation performance of stationary phase for column chromatography - Google Patents
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Description
本開示は、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法に関する。 The present disclosure relates to a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography.
多くの化学物質、特に有機化合物には物理的性質又は化学的性質（例えば、沸点、融点、溶解度等）が完全に同一であるが、生体に及ぼす影響、すなわち生理活性の異なる化合物が存在する。その代表例として光学異性体がある。生理活性の相違において、特に医薬品分野においては、この光学異性体間での薬効や毒性、代謝、分布の差異が顕著にみられる場合が往々にしてある。そのため、医薬品の安全性を確保すべく、厚生省では１９８５年度版の医薬品製造指針において光学異性体は生体内では全く別種の化合物として考えるべき、との考えを打ち出している。これを受け、医薬品分野では、光学異性体を分離・分析する必要性が強く求められていた。
しかしながら、上述したように、物理的性質又は化学的性質が全く同一である場合には、化合物のこれら物性差に基づき、化合物を認識又は分離するための古典的な手法、例えば、沸点差を利用する蒸留、溶解度差を利用する再結晶、分配係数差を利用する液液抽出、固液抽出等の手法では、光学異性体分離を行うことは不可能である。
Many chemical substances, especially organic compounds, have completely identical physical or chemical properties (e.g., boiling point, melting point, solubility, etc.), but there are compounds that have different effects on living organisms, i.e., different physiological activities. A typical example is optical isomers. In terms of differences in physiological activities, especially in the pharmaceutical field, there are often significant differences in efficacy, toxicity, metabolism, and distribution between optical isomers. Therefore, in order to ensure the safety of pharmaceuticals, the Ministry of Health, Labor and Welfare put forward the idea in the 1985 edition of the Pharmaceutical Manufacturing Guidelines that optical isomers should be considered as completely different compounds in the body. In response to this, there was a strong need in the pharmaceutical field to separate and analyze optical isomers.
However, as described above, when the physical or chemical properties of the compounds are completely identical, it is impossible to separate optical isomers by classical methods for identifying or separating compounds based on the differences in their physical properties, such as distillation utilizing the difference in boiling point, recrystallization utilizing the difference in solubility, and liquid-liquid extraction and solid-liquid extraction utilizing the difference in distribution coefficient.
そこで、分離が極めて困難な光学異性体の分離達成のため、分離対象とは異なる光学活性体をキラルセレクター（不斉識別剤）として光学異性体に作用させ、光学活性体と光学異性体との相互作用の差によって各異性体を認識及び分離する方法が開発されてきた（特許文献１、非特許文献１）。
そのために、数多くのキラルセレクターが検討されてきた。現在、世界で最も広く使用され、最も高い分離成功率を達成できるキラルセレクターは、高分子材料である多糖誘導体とされている（特許文献２～５、非特許文献２）。近年、この不斉識別剤を充填した分析用カラムを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）モード、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）法クロマトグラフィーモード等で、光学異性体分離を実施する手法が分析分野において多用されている。また、分析用カラムを大型化した分取用カラムによって実際の医薬品が製造されている。
Therefore, in order to achieve separation of optical isomers, which are extremely difficult to separate, a method has been developed in which an optically active substance different from the separation target is allowed to act on the optical isomer as a chiral selector (asymmetry discrimination agent), and each isomer is recognized and separated based on the difference in the interaction between the optically active substance and the optical isomer (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
For this purpose, many chiral selectors have been investigated. Currently, the chiral selector that is most widely used in the world and can achieve the highest separation success rate is a polysaccharide derivative, which is a polymeric material (
分析用カラムは、光学異性体の光学純度、すなわち、分析試料に含まれる各光学異性体の比率及び組成を特定することを目的とするものである。分析カラムは、数多く（通例、数百～数千）のサンプルを分析するうちに性能が劣化するところ、従来は、一定の性能の低下又は変化が生じた時点で寿命として破棄されることが一般的であった。カラムの寿命は、使用条件によっても変動し、想定よりも早く寿命が尽きる場合も多い。そのため、カラムの寿命を延ばす方法の開発が望まれている。 The purpose of analytical columns is to determine the optical purity of optical isomers, that is, the ratio and composition of each optical isomer contained in an analytical sample. The performance of analytical columns deteriorates as a large number of samples (usually hundreds to thousands) are analyzed, and traditionally, columns have generally been discarded when a certain level of performance degradation or change occurs. The column's lifespan varies depending on the conditions of use, and it often reaches the end of its life sooner than expected. For this reason, there is a need to develop a method to extend the column's lifespan.
最近では、性能が劣化したカラムに特定の溶剤を通液することで、カラム性能を改善させる手法も試みられている。しかしながら、分離性能を改善させることのできる溶剤と不斉識別剤との選定は容易ではない。例えば、構造が酷似する複数種の不斉識別剤において、一の分離性能を改善し得る溶剤が、他の分離性能の改善には有効でないケースも多い。さらには、溶剤の流速、通液量によって、分離性能の改善効果に影響を与える場合もある。そのため、不斉識別剤と、それに適した分離性能改善の条件との関係については、未だ明らかとなっていない。Recently, attempts have been made to improve column performance by passing a specific solvent through a column with degraded performance. However, it is not easy to select a solvent and asymmetry discriminator that can improve separation performance. For example, when there are multiple types of asymmetry discriminators with similar structures, a solvent that can improve the separation performance of one is often not effective in improving the separation performance of the others. Furthermore, the flow rate and amount of solvent passed through may affect the effect of improving separation performance. Therefore, the relationship between asymmetry discriminators and the conditions suitable for improving separation performance has not yet been clarified.
本開示は、不斉識別剤として特定の多糖類誘導体を有するカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法を提供することを課題とする。The objective of the present disclosure is to provide a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography having a specific polysaccharide derivative as an asymmetric discrimination agent.
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討を重ねた。その結果、不斉識別剤としてセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物を用いた固定相においては、固定相とセルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤とを接触させることで、固定相の分離性能が改善し、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本開示の要旨は、以下に示す通りである。In order to solve the above problems, the inventors have conducted extensive research. As a result, they have found that in a stationary phase using a cross-linked product of cellulose (4-methylbenzoate) as an asymmetric discrimination agent, the separation performance of the stationary phase is improved by contacting the stationary phase with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate), thereby solving the above problems. In other words, the gist of the present disclosure is as follows.
［１］
カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法であって、
前記固定相が、担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる固定相であり、
前記固定相と、セルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含む、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［２］
前記有機溶剤が、炭素数１～４のハロゲン化炭化水素及びアミドの少なくとも一方である、［１］に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［３］
前記ハロゲン化炭化水素が、ジクロロメタン及びクロロホルムの少なくとも一方であり、
前記アミドが、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドである、［２］に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［４］
前記分離性能改善工程の後に、前記固定相と、炭素数１～３のアルコールとを接触させる後処理工程をさらに含む、［１］～［３］のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［５］
前記分離性能改善工程の前に、前記固定相と、炭素数１～３のアルコールとを接触させる前処理工程をさらに含む、［１］～［４］のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［６］
前記後処理工程における前記固定相と前記アルコールとの接触が、前記固定相が充填されたカラムに前記アルコールを通液させることにより行われる、［４］に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［７］
前記前処理工程における前記固定相と前記アルコールとの接触が、前記固定相が充填されたカラムに前記アルコールを通液させることにより行われる、［５］に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［８］
前記通液における、前記アルコールの流速（線速度）が、０．０１ｍｍ／ｓｅｃ以上１０ｍｍ／ｓｅｃ以下である、［６］又は［７］に記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［９］
前記アルコールが、メタノール、エタノール及び２－プロパノールからなる群から選択される１種以上のアルコールである、［４］～［８］のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［１０］
前記分離性能改善工程における前記固定相と前記有機溶剤との接触が、前記固定相が充填されたカラムに前記有機溶剤を通液させることにより行われる、［１］～［９］のいずれかに記載のカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。
［１１］
カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法であって、
担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる被処理固定相と、セルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含み、
下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方を満たす、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法。
（Ａ）前記固定相の分離係数（α値）が、前記被処理固定相の分離係数よりも高い。
（Ｂ）前記固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、前記被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。
[1]
A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The stationary phase is a stationary phase in which a cross-linked product of cellulose (4-methylbenzoate) is supported on a carrier,
The method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography comprises a separation performance improving step of contacting the stationary phase with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate).
[2]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [1], wherein the organic solvent is at least one of a halogenated hydrocarbon having 1 to 4 carbon atoms and an amide.
[3]
the halogenated hydrocarbon is at least one of dichloromethane and chloroform;
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [2], wherein the amide is N,N-dimethylformamide.
[4]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [1] to [3], further comprising a post-treatment step of contacting the stationary phase with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms after the separation performance improvement step.
[5]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [1] to [4], further comprising a pretreatment step of contacting the stationary phase with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms prior to the separation performance improvement step.
[6]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [4], wherein the contact between the stationary phase and the alcohol in the post-treatment step is carried out by passing the alcohol through a column packed with the stationary phase.
[7]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [5], wherein the contact between the stationary phase and the alcohol in the pretreatment step is carried out by passing the alcohol through a column packed with the stationary phase.
[8]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to [6] or [7], wherein a flow rate (linear velocity) of the alcohol during the passing is 0.01 mm/sec or more and 10 mm/sec or less.
[9]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [4] to [8], wherein the alcohol is one or more alcohols selected from the group consisting of methanol, ethanol, and 2-propanol.
[10]
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of [1] to [9], wherein the contact between the stationary phase and the organic solvent in the separation performance improving step is carried out by passing the organic solvent through a column packed with the stationary phase.
[11]
A method for producing a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The method includes a separation performance improving step of contacting a stationary phase to be treated, which is a carrier carrying a crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate), with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate),
A method for producing a stationary phase for column chromatography, which satisfies at least one of the following (A) and (B):
(A) The separation factor (α value) of the stationary phase is higher than the separation factor of the stationary phase to be treated.
(B) The number of theoretical columns (N) of the stationary phase is higher than the number of theoretical columns of the stationary phase to be treated.
本開示によれば、不斉識別剤として特定の多糖類誘導体を有するカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能を改善する方法を提供することができる。
そして本開示の課題及び効果は、具体的に上記に記載したものに限らず、明細書全体より当業者に明らかにされるものを含む。
According to the present disclosure, it is possible to provide a method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography having a specific polysaccharide derivative as an asymmetric discrimination agent.
The problems and advantages of the present disclosure are not limited to those specifically described above, but include those that will become apparent to a person skilled in the art from the entire specification.
以下に、本開示について具体的な実施態様を挙げて説明するが、各実施態様における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施態様によって限定されるものではない。
また、本明細書に開示される各々の態様は、本明細書に開示される他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
なお、本明細書において、「Ａ及びＢの少なくとも一方」とは、「Ａ」、「Ｂ」、又は「Ａ及びＢの両方」を指すものとする。
The present disclosure will be described below with reference to specific embodiments, but each configuration and their combinations in each embodiment are merely examples, and addition, omission, substitution, and other modifications of the configurations are possible as appropriate within the scope of the gist of the present disclosure. The present disclosure is not limited by the embodiments.
Additionally, each feature disclosed herein may be combined with any other feature disclosed herein.
In this specification, "at least one of A and B" refers to "A", "B", or "both A and B".
1 カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法
本開示の一実施態様であるカラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法は、担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる固定相と、セルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含む。
本実施態様において、分離性能を改善する固定相は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）等の各種カラムクロマトグラフィーに用いられるものである。
1. Method for Improving Separation Performance of Stationary Phase for Column Chromatography A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, which is one embodiment of the present disclosure, includes a separation performance improving step of contacting a stationary phase comprising a carrier carrying a crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate).
In this embodiment, the stationary phase that improves separation performance is one that is used in various column chromatography such as high performance liquid chromatography (HPLC), supercritical fluid chromatography (SFC), and ion exchange chromatography (IEC).
1.1 分離性能改善工程
1.1.1 固定相
本実施態様における固定相は、不斉識別剤としてセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物を有し、当該不斉識別剤が担体に担持されてなるものである。
担体としては、多孔質有機担体、多孔質無機担体、多孔質有機無機複合担体、表面多孔質有機担体、表面多孔質無機担体、表面多孔質有機無機ハイブリッド担体が挙げられる。これらのうち、担体は、多孔質無機担体又は表面多孔質無機担体であることが好ましい。なお、多孔質担体とは、担体全体にわたって細孔が形成されている担体を意味し、表面多孔質担体とは、無孔質の核が多孔質層に覆われた構造を有する所謂コアシェル担体を意味する。
1.1 Separation performance improvement process
1.1.1 Stationary Phase The stationary phase in this embodiment has a crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) as an asymmetric recognition agent, and the asymmetric recognition agent is supported on a carrier.
Examples of the carrier include a porous organic carrier, a porous inorganic carrier, a porous organic-inorganic composite carrier, a surface-porous organic carrier, a surface-porous inorganic carrier, and a surface-porous organic-inorganic hybrid carrier. Of these, the carrier is preferably a porous inorganic carrier or a surface-porous inorganic carrier. The porous carrier means a carrier in which pores are formed throughout the carrier, and the surface-porous carrier means a so-called core-shell carrier having a structure in which a non-porous core is covered with a porous layer.
多孔質有機担体としては、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。また、多孔質無機担体としては、シリカ、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ケイ酸塩、ヒドロキシアパタイト等が挙げられ、好ましくはシリカゲルである。多孔質有機無機複合担体としては、アルコキシシランとアルキル置換又はアレキレン置換アルコキシシラン化合物とのゾルゲル反応によって形成される有機無機複合担体が挙げられる。Examples of porous organic carriers include polystyrene, poly(meth)acrylamide, and poly(meth)acrylic acid esters. Examples of porous inorganic carriers include silica, alumina, magnesia, glass, kaolin, titanium oxide, zirconium oxide, silicates, and hydroxyapatite, with silica gel being preferred. Examples of porous organic-inorganic composite carriers include organic-inorganic composite carriers formed by the sol-gel reaction of alkoxysilanes and alkyl- or alkoxysilane-substituted compounds.
不斉識別剤であるセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物とは、少なくともセルロース（４－メチルベンゾエート）同士が架橋により高分子化及び不溶化したものである。当該架橋は、架橋剤、架橋触媒又はこれら両方による架橋であってよい。セルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物は、担体を被覆するように形成されている。また、セルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物は、担体表面の官能基又は表面処理により担体表面に導入された官能基を介して担体に連結されていてもよい。また、当該連結は、例えば架橋剤を介して行われたものであってもよい。
なお、不斉識別剤の架橋前の化合物であるセルロース（４－メチルベンゾエート）は、セルロース部の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノース環の平均数）は５以上、好ましくは１０以上であり、特に上限はないが、取り扱い性の観点から、好ましくは１０００以下である。また、セルロース（４－メチルベンゾエート）は、セルロースの水酸基の一部又は全部が、４－メチルベンゾイル基により修飾された化合物であって、水酸基の一部に架橋性基が導入されていてもよい。
The crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) which is an asymmetric recognition agent is one in which at least cellulose (4-methylbenzoate) is crosslinked with itself to be polymerized and insolubilized. The crosslinking may be by a crosslinking agent, a crosslinking catalyst, or both. The crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) is formed so as to cover the carrier. The crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) may be linked to the carrier via a functional group on the carrier surface or a functional group introduced to the carrier surface by surface treatment. The linking may be carried out, for example, via a crosslinking agent.
The cellulose (4-methylbenzoate) which is a compound of the asymmetric recognition agent before crosslinking has a number average degree of polymerization (average number of pyranose rings contained in one molecule) of the cellulose moiety of 5 or more, preferably 10 or more, and although there is no particular upper limit, from the viewpoint of handleability, it is preferably 1000 or less. Also, cellulose (4-methylbenzoate) is a compound in which some or all of the hydroxyl groups of cellulose have been modified with 4-methylbenzoyl groups, and a crosslinkable group may be introduced into some of the hydroxyl groups.
1.1.2 有機溶剤
固定相と接触させる有機溶剤は、セルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する溶剤（以下、単に「有機溶剤」と称することがある。）である。セルロース（４－メチルベンゾエート）（すなわち、不斉識別剤であるセルロース（４－メチルベンゾエート）架橋物の架橋前の化合物）を膨潤又溶解する有機溶剤により、固定相の分離性能が改善する原理について、本発明者等は、次のように推測している。
1.1.2 Organic solvent The organic solvent that is brought into contact with the stationary phase is a solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate) (hereinafter, may be simply referred to as "organic solvent"). The inventors speculate as follows about the principle by which the separation performance of the stationary phase is improved by an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate) (i.e., the compound before crosslinking of the cellulose (4-methylbenzoate) crosslinked product, which is an asymmetric discrimination agent).
セルロース（４－メチルベンゾエート）のようなセルロース誘導体は、一方向巻きのらせん構造を有する光学活性ポリマーである。セルロース誘導体の不斉識別能に寄与する要素としては、セルロースの側鎖構造（本実施態様においては４-メチルベンゾイル基）だけでなく、セミロース誘導体のらせん構造も挙げられる。したがって、固定相の分離性能が低下する原因として、固定相を充填したカラムへの分析試料の導入及び各種移動相の通液を繰り返すうちに、らせん径の変化、らせん角の変化等により、セルロース誘導体のらせん構造が光学分割に適した状態を維持できなくなることが考えられる。本実施態様においては、固定相にセルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤を接触させることにより、セルロース（４－メチルベンゾエート）のらせん構造の自由度が増し、光学分割に適した状態へと戻るものと推測される。なお、本実施態様においては、不斉識別剤としてセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物を採用しているため、固定相にセルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤を接触させても、不斉識別剤が担体から脱落することなく、セルロース（４－メチルベンゾエート）のらせん構造を制御することができる。Cellulose derivatives such as cellulose (4-methylbenzoate) are optically active polymers with a unidirectional helical structure. Factors that contribute to the asymmetric discrimination ability of cellulose derivatives include not only the side chain structure of cellulose (4-methylbenzoyl group in this embodiment) but also the helical structure of the semirose derivative. Therefore, the cause of the decrease in separation performance of the stationary phase is considered to be that the helical structure of the cellulose derivative cannot maintain a state suitable for optical resolution due to changes in the helical diameter and helical angle as the introduction of the analytical sample into a column packed with the stationary phase and the passage of various mobile phases are repeated. In this embodiment, it is presumed that the degree of freedom of the helical structure of cellulose (4-methylbenzoate) is increased and it returns to a state suitable for optical resolution by contacting the stationary phase with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate). In this embodiment, since a crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) is used as the chiral recognition agent, even if the stationary phase is brought into contact with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate), the chiral recognition agent does not fall off from the carrier, and the helical structure of cellulose (4-methylbenzoate) can be controlled.
有機溶剤としては、分離性能改善工程が行われる条件下において液体として存在する炭素数１～４のハロゲン化炭化水素、アミド、炭素数４～８のエーテル、炭素数３～８のケトン、炭素数３～８のエステル、スルホキシド等が挙げられる。これらのうち、有機溶剤は、分離性能改善効果に優れる点で、炭素数１～４のハロゲン化炭化水素及びアミドの一方又は両方であることが好ましく、炭素数１～４のハロゲン化炭化水素であることがより好ましい。以下、これらの溶剤についてより詳細に説明する。 Examples of organic solvents include halogenated hydrocarbons having 1 to 4 carbon atoms, amides, ethers having 4 to 8 carbon atoms, ketones having 3 to 8 carbon atoms, esters having 3 to 8 carbon atoms, and sulfoxides that exist as liquids under the conditions in which the separation performance improvement process is carried out. Of these, the organic solvent is preferably one or both of halogenated hydrocarbons having 1 to 4 carbon atoms and amides, and more preferably halogenated hydrocarbons having 1 to 4 carbon atoms, in that they have an excellent effect of improving separation performance. These solvents are described in more detail below.
炭素数１～４のハロゲン化炭化水素は、炭素数１～４の炭化水素の炭素原子に結合した水素原子がハロゲン原子に置換された化合物である。ハロゲン化炭化水素の炭化水素としては、直鎖状、分岐状又は環状のアルカン又はアルケンが挙げられる。炭化水素は、直鎖状又は分岐状のアルカンであることが好ましく、直鎖状のアルカンであることがより好ましい。炭化水素の炭素数は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、さらに好ましくは１である。また、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、塩素原子であることが好ましい。
具体的な炭素数１～４のハロゲン化炭化水素としては、ジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、ジクロロプロパン、ジブロモメタン、ブロモホルム、ジヨードメタン等が挙げられる。これらのうち、ハロゲン化炭化水素は、ジクロロメタン又はクロロホルムであることが好ましく、ジクロロメタンであることがより好ましい。
A halogenated hydrocarbon having 1 to 4 carbon atoms is a compound in which a hydrogen atom bonded to a carbon atom of a hydrocarbon having 1 to 4 carbon atoms is substituted with a halogen atom. Examples of the hydrocarbon of the halogenated hydrocarbon include linear, branched, or cyclic alkanes or alkenes. The hydrocarbon is preferably a linear or branched alkane, and more preferably a linear alkane. The number of carbon atoms in the hydrocarbon is preferably 3 or less, more preferably 2 or less, and even more preferably 1. Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, and a chlorine atom is preferable.
Specific examples of halogenated hydrocarbons having 1 to 4 carbon atoms include difluoromethane, trichlorofluoromethane, dichloromethane, chloroform, dichloroethane, dichloropropane, dibromomethane, bromoform, diiodomethane, etc. Among these, the halogenated hydrocarbon is preferably dichloromethane or chloroform, and more preferably dichloromethane.
アミドとしては、ホルムアミド、Ｎ－アルキルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミド、Ｎ－アルキルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアセトアミド等が挙げられる。Ｎ－アルキルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミド、Ｎ－アルキルアセトアミド又はＮ，Ｎ－ジアルキルアセトアミドのアルキルの炭素数は、通常１以上３以下であり、好ましくは１又は２であり、より好ましくは１である。
Ｎ－アルキルホルムアミドとしては、Ｎ－メチルホルムアミド、Ｎ－エチルホルムアミド、Ｎ－プロピルホルムアミド等が挙げられ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルホルムアミドとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルホルムアミド等が挙げられる。また、Ｎ－アルキルアセトアミドとしては、Ｎ－エチルアセトアミド等が挙げられ、Ｎ，Ｎ－ジアルキルアセトアミドとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド等が挙げられる。
これらのうち、アミドはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドであることが好ましい。
Examples of the amide include formamide, N-alkylformamide, N,N-dialkylformamide, N-alkylacetamide, N,N-dialkylacetamide, etc. The number of carbon atoms in the alkyl of N-alkylformamide, N,N-dialkylformamide, N-alkylacetamide, or N,N-dialkylacetamide is usually 1 or more and 3 or less, preferably 1 or 2, and more preferably 1.
Examples of N-alkylformamides include N-methylformamide, N-ethylformamide, N-propylformamide, etc., and examples of N,N-dialkylformamides include N,N-dimethylformamide, N,N-diethylformamide, etc. In addition, examples of N-alkylacetamides include N-ethylacetamide, etc., and examples of N,N-dialkylacetamides include N,N-dimethylacetamide, N,N-diethylacetamide, etc.
Of these, the amide is preferably N,N-dimethylformamide.
また、炭素数４～８のエーテルとしては、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル等が挙げられる。
炭素数３～８のケトンとしては、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等が挙げられる。
炭素数３～８のエステルとしては、酢酸メチル、酢酸エチル、安息香酸メチル等が挙げられる。
スルホキシドとしては、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
Examples of ethers having 4 to 8 carbon atoms include tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, diethyl ether, diisopropyl ether, and tert-butyl methyl ether.
Examples of the ketones having 3 to 8 carbon atoms include acetone, diethyl ketone, methyl ethyl ketone, and methyl isobutyl ketone.
Examples of the ester having 3 to 8 carbon atoms include methyl acetate, ethyl acetate, and methyl benzoate.
The sulfoxide includes dimethyl sulfoxide and the like.
なお、炭素数１～４のハロゲン化炭化水素、アミド、炭素数４～８のエーテル、炭素数３～８のケトン、炭素数３～８のエステル、スルホキシド等の有機溶剤は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。In addition, organic solvents such as halogenated hydrocarbons having 1 to 4 carbon atoms, amides, ethers having 4 to 8 carbon atoms, ketones having 3 to 8 carbon atoms, esters having 3 to 8 carbon atoms, and sulfoxides may be used alone or in combination of two or more types.
1.1.3 接触条件
固定相と有機溶剤とを接触させる方法は、特に限定されず、例えば固定相が充填されたカラムに有機溶剤を通液させる方法を好適に採用し得る。以下、カラムに有機溶剤を通液させる方法について説明する。
1.1.3 Contact Conditions The method for contacting the stationary phase with the organic solvent is not particularly limited, and for example, a method for passing the organic solvent through a column packed with the stationary phase can be suitably adopted. The method for passing the organic solvent through the column is described below.
本方法において、有機溶剤の通液は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよいが、連続的に行うことが好ましい。有機溶剤の断続的な通液とは、有機溶剤の通液において、通液を一時的に停止することによりカラム内で固定相を有機溶剤に浸漬させ、この浸漬状態を一定時間保持した後に通液を再開する操作が１回以上行われるものを意味する。In this method, the organic solvent may be passed continuously or intermittently, but is preferably passed continuously. Intermittent passing of the organic solvent means that the passing of the organic solvent is temporarily stopped to immerse the stationary phase in the organic solvent in the column, and this immersion state is maintained for a certain period of time, after which the passing of the organic solvent is resumed, and this operation is carried out at least once.
有機溶剤の流速（線速度）は、カラム圧力を、試料の分析において許容されるカラム圧力範囲と同等の範囲内に維持することができる限り特に制限されない。例えば、試料分析の際に、カラムが許容される圧力が５０ＭＰａ（５００ｋｇ／ｃｍ２）以下の場合は、カラム圧力が５０ＭＰａ以下となるように流速の上限を調整すればよい。カラム内の圧力は、固定相の粒子サイズ、有機溶剤の粘度等に左右されるため、これらの要素を考慮しながら有機溶剤の流速の上限を適宜決定すればよい。一方、有機溶剤の流速の下限は特に限定されず、通常０ｍｍ／ｓｅｃ超である。
また、有機溶剤の通液量は、カラム容積に対して、通常１．０倍以上であり、十分な分離性能改善効果を得る観点から、好ましくは２．０倍以上、５．０倍以上又は１０倍以上である。また、有機溶剤の通液量に上限はないが、実用上の観点から、カラム容積に対して好ましくは１０００倍以下、より好ましくは５００倍以下、１００倍又は５０倍以下である。
有機溶剤の通液時間は、有機溶剤の流速及び通液量に応じて適宜選択すればよい。ただし、カラムに有機溶剤を断続的に通液する場合は、分離性能改善効果を確保する観点から、有機溶剤の通液時間を１時間以上とすることが好ましい。
また、有機溶剤の温度は、有機溶剤が液体として存在する温度である限り特に制限されず、好ましくは０℃以上、より好ましくは室温である。なお、本明細書において、室温とは、２０℃以上３５℃以下の温度範囲を意味する。また、カラムオーブンを具備するカラムクロマトグラフ装置においては、カラムオーブンの設定温度を有機溶剤の温度とする。
The flow rate (linear velocity) of the organic solvent is not particularly limited as long as the column pressure can be maintained within the same range as the column pressure range allowed in the analysis of the sample. For example, when the pressure allowed in the column during the sample analysis is 50 MPa (500 kg/cm 2 ) or less, the upper limit of the flow rate may be adjusted so that the column pressure is 50 MPa or less. The pressure in the column depends on the particle size of the stationary phase, the viscosity of the organic solvent, etc., so the upper limit of the flow rate of the organic solvent may be appropriately determined while taking these factors into consideration. On the other hand, the lower limit of the flow rate of the organic solvent is not particularly limited and is usually more than 0 mm/sec.
The amount of the organic solvent passed through the column is usually 1.0 times or more, and from the viewpoint of obtaining a sufficient effect of improving separation performance, it is preferably 2.0 times or more, 5.0 times or more, or 10 times or more. Although there is no upper limit to the amount of the organic solvent passed through the column, from the viewpoint of practical use, it is preferably 1000 times or less, more preferably 500 times or less, 100 times or less, or 50 times or less, relative to the column volume.
The time for passing the organic solvent may be appropriately selected depending on the flow rate and amount of the organic solvent. However, when the organic solvent is passed through the column intermittently, the time for passing the organic solvent is preferably 1 hour or more from the viewpoint of ensuring the effect of improving the separation performance.
The temperature of the organic solvent is not particularly limited as long as it is a temperature at which the organic solvent exists as a liquid, and is preferably 0° C. or higher, and more preferably room temperature. In this specification, room temperature means a temperature range of 20° C. or higher and 35° C. or lower. In a column chromatograph equipped with a column oven, the set temperature of the column oven is the temperature of the organic solvent.
1.1.4 分離性能の評価方法
固定相の分離性能を評価するための指標としては、保持係数（ｋ’）、分離係数（α値）、カラム理論段数（Ｎ）及びピーク対称性（Ｐｓ）を用いることができる。各指標は、以下のように定義される。
・保持係数ｋ１’＝（ｔ１－ｔ０）／ｔ０
・保持係数ｋ２’＝（ｔ２－ｔ０）／ｔ０
ｔ０、デッドタイム（固定相と相互作用しない物質をカラムに導入してから溶出されるまでの時間である。便宜上、トリ－ｔｅｒｔ－ブチルベンゼンの溶出時間をデッドタイムとする。）
ｔ１：より弱く保持される成分の溶出時間
ｔ２：より強く保持される成分の溶出時間
・分離係数α＝ｋ２’／ｋ１’（すなわち、（より強く保持される成分の保持係数）／（より弱く保持される成分の保持係数））
・理論段数Ｎ＝５．５４×（ｔｒ／Ｗ０．５）２
ｔｒ＝保持時間
Ｗ＝ピーク高さ１／２となる位置でのピーク幅（半値幅）
・ピーク対称性（Ｐｓ）＝Ｗ（５％）／２ａ
Ｗ（５％）：ピーク高さの５％の高さにおけるピーク幅（図１参照）
ａ：ピークトップから垂線をおろしてピークを二分したときの、ピーク高さの５％の高さにけるピークの立ち上がり側の幅（図１参照）
1.1.4 Evaluation method of separation performance The retention factor (k'), separation factor (α value), number of theoretical columns (N), and peak symmetry (Ps) can be used as indices to evaluate the separation performance of the stationary phase. Each indices is defined as follows:
Retention coefficient k1'=(t1-t0)/t0
Retention coefficient k2'=(t2-t0)/t0
t0, dead time (the time from when a substance that does not interact with the stationary phase is introduced into the column until it is eluted. For convenience, the elution time of tri-tert-butylbenzene is taken as the dead time.)
t1: elution time of the more weakly retained component t2: elution time of the more strongly retained component Separation factor α=k2'/k1' (i.e., (retention factor of the more strongly retained component)/(retention factor of the more weakly retained component))
Theoretical plate number N = 5.54 × (tr / W0.5) 2
tr = retention time W = peak width at half the peak height (half width)
Peak symmetry (Ps) = W (5%) / 2a
W(5%): Peak width at 5% of the peak height (see FIG. 1)
a: The width of the rising side of the peak at a height of 5% of the peak height when a perpendicular line is dropped from the peak top to divide the peak in half (see FIG. 1)
本実施態様において、分離性能が改善したと評価するためには、保持係数、分離係数、カラム理論段数及びピーク対称性のうち、少なくとも１つが改善してればよいが、保持係数、分離係数及びカラム理論段数の少なくとも１つが改善していることが好ましく、分離係数及びカラム理論段数の一方又は両方が改善していることがより好ましく、分離係数及びカラム理論段数の両方が改善していることがさらに好ましく、全てが改善していることが特に好ましい。In this embodiment, in order to evaluate that the separation performance has been improved, it is sufficient that at least one of the retention factor, separation factor, column theoretical plate number, and peak symmetry has been improved; however, it is preferable that at least one of the retention factor, separation factor, and column theoretical plate number has been improved, it is more preferable that one or both of the separation factor and column theoretical plate number have been improved, it is even more preferable that both the separation factor and column theoretical plate number have been improved, and it is particularly preferable that all of them have been improved.
1.2 後処理工程
本実施態様に係る分離性能改善方法においては、分離性能改善工程の後に、固定相と、炭素数１～３のアルコール（以下、単に「アルコール」と称することがある。）とを接触させる後処理工程を行うことが好ましい。かかる後処理工程を行うことにより、分離性能をより改善することが可能となる。本発明者等は、その理由を、分離性能改善工程において制御されたセルロース（４－メチルベンゾエート）のらせん構造が、貧溶剤であるがセルロース（４－メチルベンゾエート）と親和性の良い炭素数１～３のアルコールとの接触により徐々に固定化されるためであると推測している。
1.2 Post-treatment step In the separation performance improving method according to this embodiment, it is preferable to carry out a post-treatment step in which the stationary phase is contacted with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as "alcohol") after the separation performance improving step. By carrying out such a post-treatment step, it becomes possible to further improve the separation performance. The inventors speculate that the reason for this is that the helical structure of cellulose (4-methylbenzoate) controlled in the separation performance improving step is gradually fixed by contact with the alcohol having 1 to 3 carbon atoms, which is a poor solvent but has good affinity for cellulose (4-methylbenzoate).
1.2.1 アルコール
炭素数１～３のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール等が挙げられる。これらのうち、アルコールは、メタノール、エタノール又は２－プロパノールであることが好ましく、エタノールであることがより好ましい。炭素数１～３のアルコールは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
1.2.1 Alcohol Examples of alcohols having 1 to 3 carbon atoms include methanol, ethanol, n-propanol, and 2-propanol. Of these, the alcohol is preferably methanol, ethanol, or 2-propanol, and more preferably ethanol. The alcohols having 1 to 3 carbon atoms may be used alone or in combination of two or more.
1.2.2 接触条件
固定相と炭素数１～３のアルコールとを接触させる方法は、特に限定されず、例えば固定相が充填されたカラムに有機溶剤を通液させる方法を好適に採用し得る。アルコールの通液は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよいが、連続的に行うことが好ましい。なお、アルコールの断続的な通液とは、有機溶剤の断続的な通液と同様の意味である。
アルコールの流速（線速度）は、通常０．０１ｍｍ／ｓｅｃ以上、好ましくは０．０５ｍｍ／ｓｅｃ以上、より好ましくは０．１ｍｍ／ｓｅｃ以上、さらに好ましくは０．３ｍｍ／ｓｅｃ以上、また、通常１０ｍｍ／ｓｅｃ以下、好ましくは５ｍｍ／ｓｅｃ以下、より好ましくは１ｍｍ／ｓｅｃ、さらに好ましくは０．５ｍｍ／ｓｅｃ以下である。
1.2.2 Contact Conditions The method for contacting the stationary phase with the alcohol having 1 to 3 carbon atoms is not particularly limited, and for example, a method of passing an organic solvent through a column packed with the stationary phase can be suitably adopted. The passing of the alcohol may be carried out continuously or intermittently, but is preferably carried out continuously. The intermittent passing of the alcohol has the same meaning as the intermittent passing of the organic solvent.
The flow velocity (linear velocity) of the alcohol is usually 0.01 mm/sec or more, preferably 0.05 mm/sec or more, more preferably 0.1 mm/sec or more, even more preferably 0.3 mm/sec or more, and usually 10 mm/sec or less, preferably 5 mm/sec or less, more preferably 1 mm/sec or less, even more preferably 0.5 mm/sec or less.
アルコールの通液量は、カラム容積に対して、通常１．０倍以上であり、分離性能改善効果をより高める観点から、好ましくは２．０倍以上又は３．０倍以上である。また、アルコールの通液量に上限はないが、実用上の観点から、カラム容積に対して好ましくは１０００倍以下、より好ましくは５００倍以下、１００倍又は１０倍以下である。
アルコールの通液時間は、アルコールの流速及び通液量に応じて適宜選択すればよい。ただし、カラムにアルコールを断続的に通液する場合は、アルコールの通液時間を１時間以上とすることが好ましい。
アルコール通液の際のアルコールの温度としては、分離性能改善工程の際の有機溶剤と同様の温度を採用することができる。
The amount of alcohol passed through the column is usually 1.0 times or more, and from the viewpoint of further enhancing the effect of improving separation performance, it is preferably 2.0 times or more or 3.0 times or more. Although there is no upper limit to the amount of alcohol passed through the column, from the viewpoint of practical use, it is preferably 1000 times or less, more preferably 500 times or less, 100 times or less, or 10 times or less.
The time for passing the alcohol may be appropriately selected depending on the flow rate and amount of the alcohol passed through the column, but when the alcohol is passed through the column intermittently, the time for passing the alcohol through the column is preferably 1 hour or more.
The temperature of the alcohol when passing it through can be the same as that of the organic solvent in the separation performance improving step.
1.3 前処理工程
本実施態様に係る分離性能改善方法においては、分離性能改善工程の前に、固定相と、炭素数１～３のアルコール（以下、単に「アルコール」と称することがある。）とを接触させる前処理工程を行うことが好ましい。これは、分離性能改善工程において、カラム内の溶剤（移動相）との相溶性の低い有機溶剤を用いる場合は、移動相及び有機溶剤が互いに分離して分離性能改善効果を十分に得られない虞があるところ、分離性能改善工程に先立って移動相及び有機溶剤の双方と相溶可能なアルコールをカラムに通液することで、このような事態を回避し得るからであると考えられる。また、分離性能改善工程において、分離性能改善効果を十分に発揮するためには、固定相に残存する分析試料、不純物等を取り除いておくことが好ましく、したがって、分離性能改善工程に先立って炭素数１～３のアルコールにより固定相を洗浄しておくことが望ましいからであると考えられる。
1.3 Pretreatment Step In the separation performance improvement method according to this embodiment, it is preferable to carry out a pretreatment step of contacting the stationary phase with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms (hereinafter, sometimes simply referred to as "alcohol") before the separation performance improvement step. This is because, when an organic solvent having low compatibility with the solvent (mobile phase) in the column is used in the separation performance improvement step, the mobile phase and the organic solvent may separate from each other and the separation performance improvement effect may not be sufficiently obtained, and it is considered that such a situation can be avoided by passing an alcohol compatible with both the mobile phase and the organic solvent through the column prior to the separation performance improvement step. In addition, in order to fully exert the separation performance improvement effect in the separation performance improvement step, it is preferable to remove the analysis sample, impurities, etc. remaining in the stationary phase, and therefore it is considered that it is desirable to wash the stationary phase with an alcohol having 1 to 3 carbon atoms prior to the separation performance improvement step.
1.3.1 アルコール
前処理工程に用いられる炭素数１～３のアルコールとしては、後処理工程に用いられる炭素数１～３のアルコールとして挙げた化合物と同様のものが挙げられ、好ましい態様も同様である。また、前処理工程及び後処理工程の両方を行う場合、前処理工程に用いるアルコールと後処理工程に用いるアルコールとは、同一であってもよく、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。すなわち、前処理工程及び後処理工程の両方において、カラムにエタノールを通液させることが特に好ましい。
1.3.1 Alcohol Examples of the alcohol having 1 to 3 carbon atoms used in the pretreatment step include the same compounds as those listed as the alcohol having 1 to 3 carbon atoms used in the posttreatment step, and the preferred embodiments are also the same. When both the pretreatment step and the posttreatment step are performed, the alcohol used in the pretreatment step and the alcohol used in the posttreatment step may be the same or different, but are preferably the same. That is, it is particularly preferable to pass ethanol through the column in both the pretreatment step and the posttreatment step.
1.3.2 接触条件
固定相と炭素数１～３のアルコールとを接触させる方法の説明としては、後処理工程の「接触条件」の項目における説明を援用する。
また、アルコールの流速（線速度）は、カラム圧力を、試料の分析において許容されるカラム圧力範囲と同等の範囲内に維持することができる限り特に限定されず、例えば後処理工程におけるアルコールの流速を採用することができる。
1.3.2 Contact Conditions The explanation of the method for contacting the stationary phase with the alcohol having 1 to 3 carbon atoms is given in the section "Contact Conditions" in the post-treatment step.
In addition, the flow rate (linear velocity) of the alcohol is not particularly limited as long as the column pressure can be maintained within a range equivalent to the column pressure range acceptable for sample analysis, and for example, the flow rate of the alcohol in the post-treatment step can be adopted.
本実施態様に係る分離性能改善方法によれば、カラムクロマトグラフィー用固定相の、使用に伴い低下した分離性能を、使用前（出荷時）と同程度の分離性能に回復させることができる。このように、本実施態様に係る分離性能改善方法により、従来は廃棄対象となっていた固定相であっても、高い分離性能を有する固定相に再生することができるため、固定相の寿命を延ばすことができる。
加えて、製造直後のカラムクロマトグラフィー用固定相であって、分離性能が基準値未満である固定相に対して本実施態様に係る分離性能改善方法を使用すれば、当該固定相を、製品として必要な水準の分離性能を有する固定相に変換することができる。したがって、本実施態様に係る分離性能改善方法は、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造において、歩留まりを向上させるためにも有効である。
According to the method for improving separation performance of the present embodiment, the separation performance of a stationary phase for column chromatography, which has decreased with use, can be restored to the same level as that before use (at the time of shipment). Thus, according to the method for improving separation performance of the present embodiment, even a stationary phase that has conventionally been discarded can be regenerated into a stationary phase having high separation performance, and the life of the stationary phase can be extended.
In addition, if the method for improving separation performance according to the present embodiment is applied to a stationary phase for column chromatography immediately after production, the stationary phase having a separation performance below a reference value, the stationary phase can be converted into a stationary phase having a required level of separation performance as a product. Therefore, the method for improving separation performance according to the present embodiment is also effective in improving the yield in the production of a stationary phase for column chromatography.
2 カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法
本開示の別の実施態様は、上述の分離性能改善方法により、当該分離性能改善方法を実施する前よりも分離性能が改善されたカラムクロマトグラフィー用固定相を製造する方法である。換言すると、本開示の別の実施態様は、担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる被処理固定相と、セルロース（４－メチルベンゾエート）を膨潤又溶解する有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含む、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法である（以下、分離性能改善工程を行う前の固定相を単に「被処理固定相」、分離性能改善工程を行った後の固定相を「製造された固定相」と称することがある。）。すなわち、本実施態様における分離性能改善工程は、上述の分離性能改善方法における分離性能改善工程と同義である。
本実施態様において、被処理固定相とは、分離性能が低く、分離性能改善の対象となる固定相である。具体的には、試料分析の繰り返しにより分離性能が低下した固定相、製造プロセス中の不具合により製造された時点で十分な分離性能が得られなかった固定相等を被処理固定相として採用し得る。
2. Method for Producing a Stationary Phase for Column Chromatography Another embodiment of the present disclosure is a method for producing a stationary phase for column chromatography having improved separation performance compared to before the separation performance improvement method is carried out by the above-mentioned separation performance improvement method. In other words, another embodiment of the present disclosure is a method for producing a stationary phase for column chromatography, including a separation performance improvement step of contacting a treated stationary phase formed by supporting a crosslinked product of cellulose (4-methylbenzoate) on a carrier with an organic solvent that swells or dissolves cellulose (4-methylbenzoate) (hereinafter, the stationary phase before the separation performance improvement step may be simply referred to as the "treated stationary phase", and the stationary phase after the separation performance improvement step may be referred to as the "produced stationary phase"). In other words, the separation performance improvement step in this embodiment is synonymous with the separation performance improvement step in the above-mentioned separation performance improvement method.
In this embodiment, the stationary phase to be treated is a stationary phase that has low separation performance and is a target for improving the separation performance. Specifically, a stationary phase whose separation performance has been reduced by repeated sample analysis, a stationary phase whose separation performance is insufficient at the time of manufacture due to a defect in the manufacturing process, etc. can be used as the stationary phase to be treated.
本実施態様においては、分離係数（α値）及びカラム理論段数（Ｎ）の少なくとも一方、好ましくは両方が改善されたことを以って分離性能が改善されたと判断するものとする。より詳細には、本実施態様に係る製造方法は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方、好ましくは下記（Ａ）、より好ましくは（Ａ）及び（Ｂ）の両方を満たす。In this embodiment, the separation performance is determined to be improved when at least one of the separation factor (α value) and the number of theoretical columns (N), preferably both, is improved. More specifically, the production method according to this embodiment satisfies at least one of the following (A) and (B), preferably the following (A), and more preferably both (A) and (B).
（Ａ）製造された固定相の分離係数（α値）が、被処理固定相の分離係数よりも高い。
（Ｂ）製造された固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。
(A) The separation factor (α value) of the produced stationary phase is higher than that of the stationary phase to be treated.
(B) The number of theoretical column plates (N) of the produced stationary phase is higher than the number of theoretical column plates of the treated stationary phase.
また、本実施態様に係る製造方法においても、分離性能改善工程の前後それぞれに、上述の分離性能改善方法と同様の前処理工程及び後処理工程を含んでいてもよい。 In addition, the manufacturing method of this embodiment may also include pre-treatment and post-treatment steps similar to those of the above-mentioned separation performance improvement method before and after the separation performance improvement step.
以下、本開示を実施例によりさらに具体的に説明するが、本開示はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。 The present disclosure will be explained in more detail below with reference to examples, but the present disclosure is not limited to the examples below as long as they do not deviate from the gist of the disclosure.
シリカゲルにセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる固定相が充填されたカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＪカラム（０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ、株式会社ダイセル製品）を用い、固定相の初期（出荷時）分離性能；劣化試験により経時劣化した状態を模擬的に再現した固定相の分離性能；及び分離性能改善方法を実施した後の固定相の分離性能；をそれぞれ評価した。A CHIRALPAK (registered trademark) IJ column (0.46 cm diameter x 25 cm, product of Daicel Corporation) was used as a column packed with a stationary phase consisting of silica gel supported with cross-linked cellulose (4-methylbenzoate). The initial (shipped) separation performance of the stationary phase, the separation performance of the stationary phase simulating a state of deterioration over time through a deterioration test, and the separation performance of the stationary phase after implementing a separation performance improvement method were evaluated.
［初期分離性能の評価］
出荷状態のＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＪカラムを液体クロマトグラフ装置（島津製作所製Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（登録商標））に接続した。この液体クロマトグラフ装置記分析条件でラセミ体のｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドの光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α値）、保持係数（ｋ’）及びカラム理論段数（Ｎ）を表１に、クロマトグラムを図２に示す。
[Evaluation of initial separation performance]
The CHIRALPAK IJ column as shipped was connected to a liquid chromatograph (Prominence (registered trademark) manufactured by Shimadzu Corporation). Racemic trans-stilbene oxide was optically resolved using this liquid chromatograph under the analysis conditions described above, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation coefficient (α value), retention coefficient (k') and number of theoretical columns (N) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in Figure 2.
（分析条件）
移動相：ヘキサン／２－プロパノール＝９０／１０（ｖ／ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
コンディショニング時間：６０分
(Analysis conditions)
Mobile phase: hexane/2-propanol = 90/10 (v/v)
Flow rate: 1.0mL/min
Temperature: 25℃
Detection: UV 254 nm
Conditioning time: 60 minutes
［劣化試験後の分離性能の評価］
初期分離性能評価後、下記条件で劣化試験を行い、固定相を模擬的に劣化させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でラセミ体のｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドの光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α値）、保持係数（ｋ’）及びカラム理論段数（Ｎ）を表１に、クロマトグラムを図３に示す。
[Evaluation of separation performance after deterioration test]
After the initial separation performance evaluation, a deterioration test was carried out under the following conditions to simulate deterioration of the stationary phase.
Thereafter, racemic trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α value), retention factor (k') and theoretical number of columns (N) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in Figure 3.
（劣化試験条件）
移動相：ＤＭＳＯ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：６０分
(Deterioration test conditions)
Mobile phase: DMSO
Flow rate: 0.5mL/min
Temperature: 25℃
Liquid passing time: 60 minutes
［分離性能改善後の分離性能の評価］
劣化試験後の分離性能の評価後、下記条件で前処理工程、分離性能改善工程及び後処理工程に供し、固定相の分離性能を改善させた。
その後、初期分離性能の評価と同様の分析条件でラセミ体のｔｒａｎｓ－スチルベンオキシドの光学分割を行い、固定相の分離性能を評価した。固定相の分離係数（α値）、保持係数（ｋ’）及びカラム理論段数（Ｎ）を表１に、クロマトグラムを図４に示す。
[Evaluation of separation performance after improvement of separation performance]
After evaluating the separation performance after the deterioration test, the separation performance of the stationary phase was improved by subjecting the column to a pretreatment process, a separation performance improvement process, and a posttreatment process under the following conditions.
Thereafter, racemic trans-stilbene oxide was optically resolved under the same analytical conditions as those for evaluating the initial separation performance, and the separation performance of the stationary phase was evaluated. The separation factor (α value), retention factor (k') and theoretical number of columns (N) of the stationary phase are shown in Table 1, and the chromatogram is shown in Figure 4.
（前処理工程の条件）
移動相：エタノール
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：３０分
（分離性能改善工程の条件）
移動相：ジクロロメタン
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：１８０分
（後処理工程の条件）
移動相：エタノール
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
温度：２５℃
通液時間：５０分
(Conditions for pretreatment process)
Mobile phase: ethanol Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25℃
Liquid passing time: 30 minutes (conditions for the separation performance improvement process)
Mobile phase: dichloromethane Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25℃
Liquid passing time: 180 minutes (conditions for post-treatment process)
Mobile phase: ethanol Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25℃
Liquid passing time: 50 minutes
表１より、カラムにジクロロメタンを通液することで、固定相の保持係数、分離係数及び理論段数の全てが改善しており、特に保持係数及び分離係数は、カラムの出荷状態と同レベルまで改善することが示された。
以上より、本開示に係る方法によれば、使用により分離性能が劣化した固定相の分離性能を、使用前と同程度まで改善することができる。したがって、固定相の分離性能が経時的に劣化した場合であっても、本開示に係る方法を用いることで、固定相の分離性能が改善するため、固定相の寿命を延ばすことができる。
As shown in Table 1, by passing dichloromethane through the column, the retention factor, separation factor, and theoretical plate number of the stationary phase were all improved, and in particular, the retention factor and separation factor were improved to the same levels as those of the column in its shipping state.
As described above, according to the method of the present disclosure, the separation performance of a stationary phase whose separation performance has deteriorated due to use can be improved to the same level as before use. Therefore, even if the separation performance of the stationary phase deteriorates over time, the method of the present disclosure can improve the separation performance of the stationary phase, thereby extending the life of the stationary phase.
Claims (9)
前記固定相が、担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる固定相であり、
前記固定相と、有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含み、
前記有機溶剤が、ジクロロメタン及びクロロホルムの少なくとも一方である、カラムクロマトグラフィー用固定相の分離性能改善方法。 A method for improving the separation performance of a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The stationary phase is a stationary phase in which a cross-linked product of cellulose (4-methylbenzoate) is supported on a carrier,
A separation performance improving step of contacting the stationary phase with an organic solvent ,
The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography , wherein the organic solvent is at least one of dichloromethane and chloroform .
トグラフィー用固定相の分離性能改善方法。 The method for improving separation performance of a stationary phase for column chromatography according to any one of claims 2 to 6 , wherein the alcohol is one or more alcohols selected from the group consisting of methanol, ethanol and 2-propanol.
担体にセルロース（４－メチルベンゾエート）の架橋物が担持されてなる被処理固定相と、有機溶剤とを接触させる分離性能改善工程を含み、
前記有機溶剤が、ジクロロメタン及びクロロホルムの少なくとも一方であり、
下記（Ａ）及び（Ｂ）の少なくとも一方を満たす、カラムクロマトグラフィー用固定相の製造方法。
（Ａ）前記固定相の分離係数（α値）が、前記被処理固定相の分離係数よりも高い。
（Ｂ）前記固定相のカラム理論段数（Ｎ）が、前記被処理固定相のカラム理論段数よりも高い。 A method for producing a stationary phase for column chromatography, comprising the steps of:
The method includes a separation performance improving step of contacting a stationary phase to be treated , which is a carrier carrying a cross-linked product of cellulose (4-methylbenzoate), with an organic solvent,
the organic solvent is at least one of dichloromethane and chloroform,
A method for producing a stationary phase for column chromatography, which satisfies at least one of the following (A) and (B):
(A) The separation factor (α value) of the stationary phase is higher than the separation factor of the stationary phase to be treated.
(B) The number of theoretical columns (N) of the stationary phase is higher than the number of theoretical columns of the stationary phase to be treated.
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