JP7701879B2 - 単球前駆細胞を生成するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本出願は、単球前駆細胞の生成ならびにそれらのマクロファージおよびミクログリアへの分化のための方法、ならびに単球前駆細胞を産生するための大規模細胞培養物に関する。

背景
単球およびマクロファージは、炎症プロセスにおいて重要な役割を果たすものであり、それらの活性化および機能性は、健康および疾患において極めて重要である（Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｓｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１３）。マクロファージの関与が確認されている疾患には、代謝性疾患、アレルギー障害、自己免疫性、がん、神経変性疾患、ならびに細菌、ウイルス、寄生虫、および真菌の感染症が包含される。疾患の状況における急性免疫防御の媒介の他に、組織全体に広く分布しているマクロファージは、周囲組織の修復およびホメオスタシスに必須である。したがって、マクロファージの機能性の損傷、およびそれに続くホメオスタシスの喪失は、変性疾患の発生機序と密接に関連している。

ホメオスタシスおよび疾患防御における重要なマクロファージ機能としては、食作用（病原体、デブリ、および死細胞）、遊走（損傷側への）、ならびにさらなる炎症応答をトリガーするかまたは周囲組織に栄養支持を与えるためのサイトカイン放出が挙げられる。（Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｍａｎｔｏｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｓｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１３）。この理由のため、単球／マクロファージ機能のモジュレーションは、多くの疾患を解決する可能性のある治療的戦略を表す。マクロファージが関与する広範な疾患領域およびマクロファージの機能特性により、可能性のある標的は非常に多様である（Ｔｉｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．２００８）。これにより、薬物の開発およびスクリーニングのために単球およびマクロファージに高い需要が生じる。

これまで、マクロファージの研究は、関連する細胞の生成に関する制限によって、複雑で時間のかかるものであった。過去に主に使用されていたマクロファージを得る１つの手段は、献血から濃縮したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から単球を単離することである（図１）。しかしながら、ドナー当たりの細胞数が限られていること、ドナーごとの変動、および遺伝子操作の可能性の制限により、これらの初代細胞の使用は制限される。

最近の研究では、ｉＰＳ細胞から単球前駆細胞およびマクロファージを誘導することに成功している（Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｓｅｎｊｕ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１４、ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）。このアプローチは、初代単球の単離と比較していくつかの利点を有する（図１）。これは、疾患関連の遺伝子バックグラウンドを有する細胞の使用、遺伝子操作（すなわち、多能性状態における疾患の素因となる突然変異の補正）を可能にし、必要な場合にはドナーの変動性を制限する。ｉＰＳ技術により、一定のジェノタイプおよび機能の単球／マクロファージの実質的に無制限の供給がもたらされる。

ミクログリアは、組織定住マクロファージの特別なサブタイプである。胚発生中に、卵黄嚢の血島において、２つのマクロファージの波が生じる。これらの卵黄嚢に由来するマクロファージは、Ｍｙｂ非依存性であるが、増殖に関してＰＵ．１およびＩＲＦ８依存性であり（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６）、組織定住マクロファージを発生させる。多くの組織において、この初期マクロファージ集団は、骨髄由来のマクロファージによって部分的または完全に置き換えられるが、脳定住マクロファージ集団、すなわちミクログリアは、依然としてその起源単独のものである。

ミクログリアは、ミスフォールディングされたタンパク質および死細胞のクリアランス、シナプスの刈り込み、および神経栄養因子の放出など、重要なホメオスタシス機能を有する。さらに、炎症性刺激の際には、それらが活性化され、有害となる可能性のあるサイトカインを放出し、活性酸素種を産生し得る。慢性炎症性活性化、および神経変性疾患のいくつかの遺伝的危険因子（例えば、ＬＲＲＫ２、ＴＲＥＭ２、ＡＳＹＮ、およびＣＤ３３）の高いレベルの発現により、神経変性疾患および神経炎症におけるミクログリアの役割に対して高い関心が生じている。

これまで、ヒト初代ミクログリアおよび関連するヒト細胞モデルの入手可能性が低いことに起因して、ミクログリアの研究は、初代げっ歯類細胞に限定されていた。ｉＰＳ細胞から単球およびマクロファージを生成する最近のプロトコール（Ａｂｕｄ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｂｒｏｗｎｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｄｏｕｖａｒａｓ ｅｔ ａｌ．２０１７、Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７ａ、Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７ｂ、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８、Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｍｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．２０１６、Ｓｅｎｊｕ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１４、ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）は、正しい個体発生マーカーを示しており、神経細胞共培養物におけるその前駆体からのミクログリア様細胞の生成が、最近説明されている（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７ａ）。

しかしながら、参考文献によって提供されるプロトコールは、細胞培養物のスループットおよび安定性が限定され、したがって、例えば、創薬および開発において、ハイスループットのアッセイに必要とされる量の細胞を、定性的にも定量的にも提供することができない。

したがって、ハイスループット様式で、ｉＰＳ細胞から多量の単球前駆細胞を生成するための改善されたプロトコールの必要性が残っている。

単球前駆細胞を産生するための方法であって、
ａ）ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体に、多能性培地中の多能性幹細胞を播種する工程と、
ｂ）多能性幹細胞を採取し、多能性幹細胞を懸濁培養物中の中胚葉誘導培地と接触させる工程と、
ｃ）細胞を、細胞の付着に好適な細胞培養支持体に播種する工程と、
ｄ）細胞培養上清から単球前駆細胞を採取する工程と
を含む、方法が、提供される。

一実施形態において、工程ａ）におけるラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－５を含み、具体的には、工程ａ）におけるラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－２、およびガンマ－１を含む。

一実施形態において、細胞を、工程ｂ）において、ＢＭＰ４を含む規定培地と接触させる。

一実施形態において、細胞を、工程ｂ）において、ＶＥＧＦを含む規定培地と接触させる。

一実施形態において、細胞を、工程ｂ）において、ＳＣＦを含む規定培地と接触させる。

一実施形態において、工程ｂ）における細胞は、胚葉体（ＥＢ）を形成する。

一実施形態において、工程ｃ）における細胞培養支持体は、基底膜生体材料でコーティングされている。

一実施形態において、工程ｃ）における細胞を、骨髄系成熟培地と接触させる。

一実施形態において、骨髄系成熟培地は、Ｍ－ＣＳＦを含む。

一実施形態において、骨髄系成熟培地は、ＩＬ－３を含む。

一実施形態において、本方法は、ｅ）採取した単球前駆細胞をマクロファージに分化させる工程をさらに含む。

一実施形態において、工程ｅ）における細胞を、コーティングされていない組織培養支持体に播種する。

一実施形態において、本方法は、ｅ）採取した単球前駆細胞をミクログリアに分化させる工程をさらに含む。

単球前駆細胞を産生するための接着性大規模細胞培養物であって、接着性細胞培養物が、１週間につき、細胞培養面積１ｃｍ^２当たり少なくとも約１００，０００個の単球前駆細胞を産生することができる、接着性大規模細胞培養物が、さらに提供される。
[本発明１００１]
単球前駆細胞を産生するための方法であって、
ａ）ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体に、多能性培地中の多能性幹細胞を播種する工程と、
ｂ）多能性幹細胞を採取し、多能性幹細胞を懸濁培養物中の中胚葉誘導培地と接触させる工程と、
ｃ）細胞を、細胞の付着に好適な細胞培養支持体に播種する工程と、
ｄ）細胞培養上清から単球前駆細胞を採取する工程と
を含む、方法。
[本発明１００２]
工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５を含み、特に、工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－２、およびガンマ－１を含む、本発明１００１の方法。
[本発明１００３]
工程ｂ）において、細胞を、ＢＭＰ４を含む規定培地と接触させる、本発明１００１または１００２の方法。
[本発明１００４]
工程ｂ）において、細胞を、ＶＥＧＦを含む規定培地と接触させる、本発明１００１から１００３のいずれかの方法。
[本発明１００５]
工程ｂ）において、細胞を、ＳＣＦを含む規定培地と接触させる、本発明１００１から１００４のいずれかの方法。
[本発明１００６]
工程ｂ）における細胞が、胚葉体（ＥＢ）を形成する、本発明１００１から１００５のいずれかの方法。
[本発明１００７]
工程ｃ）における細胞培養支持体が、基底膜生体材料でコーティングされている、本発明１００１から１００６のいずれかの方法。
[本発明１００８]
工程ｃ）における細胞を骨髄系成熟培地と接触させる、本発明１００１から１００７のいずれかの方法。
[本発明１００９]
骨髄系成熟培地が、Ｍ－ＣＳＦを含む、本発明１００１から１００８のいずれかの方法。
[本発明１０１０]
骨髄系成熟培地が、ＩＬ－３を含む、本発明１００１から１００９のいずれかの方法。
[本発明１０１１]
ｅ）採取した単球前駆細胞をマクロファージに分化させる工程
をさらに含む、本発明１００１から１０１０のいずれかの方法。
[本発明１０１２]
工程ｅ）における細胞を、コーティングされていない組織培養支持体に播種する、本発明１０１１の方法。
[本発明１０１３]
ｅ）採取した単球前駆細胞をミクログリアに分化させる工程
をさらに含む、本発明１００１から１０１０のいずれかの方法。
[本発明１０１４]
単球前駆細胞を産生するための接着性大規模細胞培養物であって、接着性細胞培養物が、１週間につき、細胞培養面積１ｃｍ ^２ 当たり少なくとも約１００，０００個の単球前駆細胞を産生することができる、接着性大規模細胞培養物。
[本発明１０１５]
本発明１００１から１０１３のいずれかの方法の工程ａ）からｃ）によって産生される、本発明１０１４の接着性大規模細胞培養物。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から単球前駆体およびマクロファージを誘導するための方法の概略図である。成体ドナー細胞は、ｉＰＳＣを生成するように再プログラミングすることができる。分化キュー（サイトカイン、モルフォゲン、増殖因子、および小分子）の正しい組合せを使用して、細胞系統発生を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導し、所望される細胞型（すなわち、マクロファージ）を生成するために使用することができる。この手法は、単一のドナーからの細胞の無制限な供給を提供し、疾患特異的な遺伝子バックグラウンドを有するドナーに由来する細胞の使用を可能にする。さらに、ｉＰＳＣは、自己複製する多能性状態で、遺伝子的に改変し、クローン的に選択することができる。この技法は、同系ｉＰＳＣ株の生成を可能にし、その細胞誘導体（例えば、マクロファージ）を、それぞれの健常であるかまたは罹患した親ｉＰＳＣクローンと直接的に比較することができる。単球およびマクロファージを得るための代替的な手段は、ヒト献血からの単離である。この手段で得られた細胞は、ドナー当たりのその個数が限定され、それらの有糸分裂後状態に起因して、遺伝子改変されたクローン株の生成は、実現可能ではない。献血以前の感染など、様々なドナー状態（生理学的状態）により、さらなる変動が生じ得る。 ｉＰＳＣ由来のマクロファージの生成プロセスにおける逐次的分化工程の概略図である。ｉＰＳＣを培養し、多能性状態で維持する（工程１）。維持培養物を継代するときに、２～１０００万個のｉＰＳＣを使用して、胚葉体（ＥＢ）形成を開始する（工程２）。４日間のＥＢ形成後に、事前分化させたＥＢを、細胞培養皿に播種し、その後の期間で造血工場を形成する（工程３）。造血工場は、分化の開始後１４日ほどの早さで、第１の単球前駆体の産生および放出を開始する。これらの前駆体は、最大で１００日間を上回って、１週間に２回、上清から採取することができる。単球前駆体は、７日間でマクロファージへとさらに分化し（工程４）、実験の必要条件に応じて、これらのマクロファージは、サイトカインの添加によって、特定の炎症性または制御性のサブタイプを発生させるようにさらに分極化することができる（工程５）。 分化の時系列の概略図である。５つの逐次的分化工程（工程１～５）において使用されるサイトカイン、増殖因子、モルフォゲン、培地、およびコーティングは、示される通りである。 新規な培養条件と、これまでに公開されているＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、増殖因子を低減させたマトリゲルまたはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、分化の２１日目に比較した。 ラミニン－５２１において培養したｉＰＳＣに由来する造血工場（接着性細胞）が、分化の２１日目時点ですでに単球前駆体を産生することを示す。 分化の２１日目時点における、ラミニン－５２１において培養したｉＰＳＣに由来する造血工場の上清中の単球前駆体（非接着性細胞）である。 マトリゲルにおいて培養したｉＰＳＣに由来する造血工場（接着性細胞）は、分化の２１日目時点で単球を産生しないことを示す。 分化の２１日目時点における、マトリゲルにおいて培養したｉＰＳＣに由来する造血工場の上清中に単球前駆体（非接着性細胞）がほとんどないことを示す。 新規な培養条件と、これまでに公開されているＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、マトリゲルまたはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、分化の２１日目に比較した。ラミニン－５２１において培養したｉＰＳＣに由来する単球前駆体を、骨髄系マーカーＣＤ１４およびＣＤ１１ｂについて、フローサイトメーターによって分析した。 ラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１１ｂ表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。複数のピークは、不均一なＣＤ１１ｂ陽性細胞集団を示す。 ラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１４表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。複数のピークは、不均一なＣＤ１４陽性細胞集団を示す。 新規な培養条件と、これまでに公開されているＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、マトリゲルまたはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、単球前駆体を、上清から採取し、分化の３４日目に比較した。ラミニン－５２１またはマトリゲルのいずれかで培養したｉＰＳＣに由来する単球前駆体を、フローサイトメーターによって、骨髄系マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、および増殖マーカーＫｉ６７について分析した。Ｂ１０培養皿からの平均収率は、ラミニン－５２１由来の培養物については、３６．５×１０^６個の生細胞であり、マトリゲル由来培養物については、１．２×１０^６個の生細胞であった。 ３４日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１１ｂ表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１１ｂ陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１４表面染色のフローサイトメータードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１４陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ６８染色のフローサイトメータードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ６８陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＫｉ６７増殖マーカーのフローサイトメトリードットプロット分析である。アイソタイプ対照の強度における単一のピークは、細胞集団における低い増殖活性を示す。 ３４日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１１ｂ表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１１ｂ陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１４表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１４陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ６８染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ６８陽性細胞集団を示す。 ３４日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＫｉ６７増殖マーカーのフローサイトメトリードットプロット分析である。アイソタイプ対照の強度における単一のピークは、細胞集団における低い増殖活性を示す。 新規な培養条件と、これまでに公開されているＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、マトリゲルまたはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、単球前駆体を、上清から回収し、分化の４１日目に比較した。ラミニン－５２１またはマトリゲルのいずれかで培養したｉＰＳＣに由来する単球前駆体を、ＦＡＣＳ分析によって、骨髄系マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、および増殖マーカーＫｉ６７について分析した。Ｂ１０培養皿からの平均収率は、ラミニン－５２１由来の培養物については、３０×１０^６個の生細胞であり、マトリゲル由来培養物については、８．５×１０^６個の生細胞であった。 ４１日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１１ｂ表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１１ｂ陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１４表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１４陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ６８染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ６８陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるラミニン－５２１由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＫｉ６７増殖マーカーのフローサイトメトリードットプロット分析である。アイソタイプ対照の強度における単一のピークは、細胞集団における低い増殖活性を示す。 ４１日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１１ｂ表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１１ｂ陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ１４表面染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ１４陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＣＤ６８染色のフローサイトメトリードットプロット分析である。単一のピークは、均一なＣＤ６８陽性細胞集団を示す。 ４１日目におけるマトリゲル由来の培養物およびアイソタイプ対照から採取した単球前駆体のＫｉ６７増殖マーカーのフローサイトメトリードットプロット分析である。アイソタイプ対照の強度における単一のピークは、細胞集団における低い増殖活性を示す。 新規な培養条件と、これまでに公開されているｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、マトリゲル（ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）またはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、単球前駆体を、上清から回収し、分化の２１日目、３５日目、４１日目に比較した。異なる採取日の単球収率およびマーカー発現を、要約する。ラミニン－５２１において成長させたｉＰＳＣに由来する造血工場は、成熟し、単球前駆体を産生し、上清中に放出するのがより高速かつより高収率であった。 新規な培養条件と、これまでに公開されているＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。ｉＰＳＣを、マトリゲル（ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）またはラミニン－５２１のいずれかにおいて培養し、造血工場を、図２および３に示されるように分化させ、単球前駆体を、上清から回収し、分化の２７日目に開始して、最大で分化の１１１日目まで、７日ごとに比較した。ラミニン－５２１（９Ａ）またはマトリゲル（９Ｂ）のいずれかで培養したｉＰＳＣに由来する単球前駆体を、ＦＡＣＳ分析によって、骨髄系マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、および増殖マーカーＫｉ６７について分析した。 ｉＰＳＣに由来する単球と、ＰＢＭＣから単離したＣＤ１４＋単球との比較である。両方の源から得られた単球を、ＦＡＣＳ分析によって、骨髄系マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、および増殖マーカーＫｉ６７について分析した。いずれの源に由来する細胞型も、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８を発現し、Ｋｉ６７は陰性である。マーカーの強度は、２つの源から得られた細胞間で異なり、それぞれ、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ６８の量におけるわずかな差を示す。 ｉＰＳＣに由来するマクロファージと、ＰＢＭＣに由来するマクロファージから単離したＣＤ１４＋単球との比較である。両方の源から得られた単球を、材料および方法に記載されるように分化させ、マクロファージ分化の７日目に、ＦＡＣＳ分析によって、骨髄系マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、および増殖マーカーＫｉ６７について分析した。いずれの源に由来する細胞型も、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８を発現し、Ｋｉ６７は陰性である。マーカーの強度は、２つの源から得られた細胞間で異なり、それぞれ、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ６８の量におけるわずかな差を示す。 新規な培養条件と、これまでに公開されているｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。３つの異なるｉＰＳＣ株、ＳＦＣ８４０（図１２ＡおよびＤ）、Ｇｉｂｃｏエピソーム（図１２ＢおよびＥ）、ならびにＳＡ００１（図１２ＣおよびＦ）から生成した胚葉体を、コーティングされていない細胞培養皿（１２Ａ～Ｃ）または増殖因子を低減させた（ＧＦＲ）マトリゲルでコーティングされた培養皿（１２Ｄ～Ｆ）のいずれかに播種した。胚葉体の接着および細胞増殖は、試験した３つすべての細胞株について、ＧＦＲマトリゲルの方が良好であり、より強い培養物の発達が確保された。細胞の層は、単球前駆体が組織培養皿の表面に接着するのを防止し、上清中の単球前駆体の数をさらに増加させる。 新規な培養条件と、これまでに公開されているｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）の方法との比較である。３つの異なるｉＰＳＣ株、ＳＦＣ８４０（図１３ＡおよびＤ）、Ｇｉｂｃｏエピソーム（図１３ＢおよびＥ）、ならびにＳＡ００１（図１３ＣおよびＦ）から生成した胚葉体を、コーティングされていない細胞培養皿（１３Ａ～Ｃ）または増殖因子を低減させた（ＧＦＲ）マトリゲルでコーティングされた培養皿（１３Ｄ～Ｆ）のいずれかに播種した。分化の２１日目の時点ですでに、ＧＦＲマトリゲルにおいて増殖させた胚葉体によって生成された造血工場によって、コーティングされていない皿と比較してより多くの単球前駆体が、上清中に放出されている。 ３つの異なる細胞株（ＳＦＣ８４０－０３－０１、ＳＡ００１、およびＧｉｂｃｏエピソーム）を起源とする単球前駆体を、材料および方法に記載されるように、７日間、マクロファージに分化させた。Ａｌｅｘａ４８８で標識したザイモサン粒子を、３つの異なるｉＰＳＣ由来のマクロファージ株に供給することによって、食作用アッセイを行った。１時間の食作用の後、細胞を剥離し、Ａｌｅｘａ４８８陽性細胞を、フローサイトメーターによって測定した。すべての源を起源とするマクロファージが、強力な食作用能力を呈し、１時間後で５０％～７０％の陽性細胞の範囲に及んだ。 ニューロン－ミクログリア共培養物において、ミクログリア様細胞を得るための分化レジメンの図を示す。ｉＰＳＣ由来のニューロンを、２１日間事前分化させ、この分化段階で、凍結保存することができる。共培養を開始するために、ニューロンを、単球前駆体を播種する少なくとも１週間前に、解凍した。ミクログリアの発達、移動、および形態特性をより良好に可視化するために、ＧＦＰ陽性ｉＰＳ細胞を、造血工場および単球前駆体の生成に使用した。ミクログリア様分化のために、ＧＦＰ陽性単球前駆体を、事前分化させたニューロン培養物の上に播種し、２週間成熟させた。 共培養物におけるミクログリアの分布および形態学を、ミクログリア様細胞によって発現されるＧＦＰ（図１６Ａ）および抗ベータＩＩＩ－チューブリン（Ｔｕｊ）抗体で標識したニューロン（図１６Ｂ）について、蛍光顕微鏡によって観察した。１週間の分化の後に、単球ミクログリア様細胞は、共培養物中に均一に拡がり、分岐した形態学を呈する。 ＬＰＳ刺激の際のマクロファージおよびミクログリアのサイトカイン放出を示す。マクロファージおよびミクログリアの１つの機能特性は、炎症性刺激、例えば、ＬＰＳに応答して、サイトカインを放出する能力である。マクロファージ、ミクログリア、ならびにベースラインの間の差を試験するために、神経系共培養物のベースラインサイトカインレベル、未刺激細胞および１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した細胞のＩＬ１ｂ（図１７Ａ）、ＩＬ６（図１７Ｂ）、ＭＣＰ１（図１７Ｃ）、ＩＬ １０（図１７Ｄ）、ＩＬ８（図１７Ｅ）、ＩＬ１２ｐ４０（図１７Ｆ）、ＭＩＰ１ａ（図１７Ｇ）、およびＴＮＦａ（図１７Ｈ）のサイトカインレベルを、ＣＢＡによって測定した。ミクログリアは、マクロファージと比較して、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、Ｉｌ１０、ＴＮＦａ、ＩＬ１２ｐ４０、およびＭＩＰ１ａのより多くの放出、ならびにＩＬ８のより少ない放出を示す。神経系単一培養物は、ＴＮＦａ、ＭＣＰ１、ＭＩＰ１ａ、およびＩＬ８の放出を示し、共培養物における炎症性応答に対する星状細胞の寄与を示した。 食作用は、骨髄起源の細胞の重要な機能特性である。異なる培養条件、例えば、マクロファージまたはミクログリアにおいて、このプロセスをモニタリングするために、ｐＨ感受性色素ｐＨｒｏｄｏで標識した異なる基質（例えば、ザイモサン、Ａｂｅｔａでコーティングされたビーツ、またはアポトーシス細胞）を、使用することができる。これらの基質は、骨髄細胞によって認識され、エンドソームに飲み込まれ、リソソーム成熟中にｐＨが低下すると蛍光性となる。ミクログリア（図１８ＡおよびＢ）またはマクロファージ（図１８ＣおよびＤ）のいずれかによって取り込まれたｐＨｒｏｄｏで標識したザイモサンの代表的な画像である。 食作用活性は、ｐＨｒｏｄｏ技術を用いた薬物スクリーニングおよび画像に基づく読み取りに使用され得る。細胞骨格の機能性に干渉することにより、食作用活性の減少が引き起こされ得（図１９Ａ）、一方で、血清（ＦＣＳ）との共インキュベーションまたは事前処置により、ザイモサン取り込み活性に濃度依存的増加が生じ得る（図１９Ｂ）。 単球前駆体の中期保管および大型バッチの生成のために、造血工場から採取した単球は、懸濁培養（「スピナー」）において培養することができる。保管した単球前駆体からマクロファージへの分化は、任意の時点で開始することができる（図２０Ａ）。懸濁培養（「スピナー」）で培養した単球前駆体は、少なくとも６週間、生存したままであり（図２０Ｂ）、それらのマーカープロファイルを保持する（図２０Ｃ）。懸濁培養（「スピナー」）で保持されている単球前駆体から分化したマクロファージは、採取後に直接分化させたマクロファージと比較して、類似のマーカー発現を有する（図２０Ｄ）。 懸濁培養物中の単球前駆体から分化させたマクロファージ（「スピナー」）は、採取後に直接的に細胞から分化させたマクロファージ（「採取物」）と区別できない機能特性を呈し、それらは、類似の食作用能力（図２１Ａ）および遊走能力（図２１Ｂ）を有する。

引用参考文献

詳細な説明
本明細書において使用されるとき、「規定培地」または「化学的規定培地」という用語は、すべての個々の構成要素およびそれらのそれぞれの濃度が既知である細胞培養培地を指す。規定培地は、組換えおよび化学的に定義される構成要素を含有し得る。

本明細書において使用されるとき、「分化すること」、「分化」、および「分化する」という用語は、分化度の低い細胞を体細胞に変換する、例えば、多能性幹細胞を単球に変換するか、または単球をマクロファージに変換する、１つまたは複数の工程を指す。分化は、当該技術分野において公知であり本明細書においても記載される方法によって達成される。

本明細書において使用されるとき、「単球前駆細胞」は、特異的表面マーカーＣＤ１４（分化クラスター１４、骨髄系細胞特異的ロイシンリッチ糖タンパク質としても知られている、公式の符号ＣＤ１４）、ＣＤ１１ｂ（分化クラスター１１Ｂ、インテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）、マクロファージ－１抗原（Ｍａｃ－１）、および補体受容体３（ＣＲ３／ＣＲ３Ａ）としても知られている、公式の符号ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ６８（分化クラスター６８、ＧＰ１１０、マクロシアリン、スカベンジャー受容体クラスＤメンバー１（ＳＣＡＲＤ１）、およびＬＡＭＰ４としても知られている、公式の符号ＣＤ６８）を発現し、懸濁液中にあり、接着性マクロファージおよびミクログリアを生じる能力を有する、細胞である。

本明細書において使用されるとき、「マクロファージ」は、特異的マーカーＣＤ１４（分化クラスター１４、骨髄系細胞特異的ロイシンリッチ糖タンパク質としても知られている、公式の符号ＣＤ１４）、ＣＤ１１ｂ（分化クラスター１１Ｂ、インテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）、マクロファージ－１抗原（Ｍａｃ－１）、および補体受容体３（ＣＲ３／ＣＲ３Ａ）としても知られている、公式の符号ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ６８（分化クラスター６８、ＧＰ１１０、マクロシアリン、スカベンジャー受容体クラスＤメンバー１（ＳＣＡＲＤ１）、およびＬＡＭＰ４としても知られている、公式の符号ＣＤ６８）を発現し、接着性であり、異なる基質を貪食することができ、様々な炎症性刺激に応答し、固有のサイトカイン（例えば、ＩＬ－４およびＩＮＦｇ）の存在によって分極化され得る、細胞である。

本明細書において使用されるとき、「ミクログリア」は、特異的マーカーＣＤ１４（分化クラスター１４、骨髄系細胞特異的ロイシンリッチ糖タンパク質としても知られている、公式の符号ＣＤ１４）、ＣＤ１１ｂ（分化クラスター１１Ｂ、インテグリンアルファＭ（ＩＴＧＡＭ）、マクロファージ－１抗原（Ｍａｃ－１）、および補体受容体３（ＣＲ３／ＣＲ３Ａ）としても知られている、公式の符号ＩＴＧＡＭ）、ＣＤ６８（分化クラスター６８、ＧＰ１１０、マクロシアリン、スカベンジャー受容体クラスＤメンバー１（ＳＣＡＲＤ１）、およびＬＡＭＰ４としても知られている、公式の符号ＣＤ６８）、ＩＢＡ １（イオン化カルシウム結合アダプター分子１、同種移植片炎症性因子１ＡＩＦ１としても知られている、公式の符号ＡＩＦ１）を発現し、分岐した形態を有し、異なる基質を貪食することができ、様々な炎症性刺激に応答し、少なくとも１つのさらなるマーカータンパク質、例えば、ＴＭＥＭ１１９（膜貫通タンパク質１１９、破骨細胞誘導因子（ＯＢＩＦ）としても知られている、公式の符号ＴＭＥＭ１１９）、Ｐ２ＲＹ１２（Ｐ２Ｙプリン受容体１２、ＡＤＰ－グルコース受容体としても知られている、公式の符号Ｐ２ＲＹ１２）、またはＰＲＯＳ１（プロテインＳ、ＰＳＡ、ＰＲＯＳ、ＰＳ２１、ＰＳ２２、ＰＳ２３、ＰＳ２４、ＰＳ２５、ＴＨＰＨ５、ＴＨＰＨ６としても知られている、公式の符号ＰＲＯＳ１）を発現し、かつ／または分岐した形態のものである、細胞である。

「中胚葉誘導培地」は、本明細書において使用されるとき、多能性幹細胞における中胚葉の誘導に有用な任意の培地、好ましくは、化学的規定培地を指す。そのような培地の１つの例は、ヒト組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を補充した、規定培地、例えば、ＭＴｅＳＲ１培地である。中胚葉の誘導を判定するのに好適なマーカーは、ＭＩＸＬ、ＥＯＭＥＳ、およびＴ－ブラキウリである。

「骨髄系成熟培地」は、本明細書において使用されるとき、骨髄系統に沿った細胞の成熟に有用な培地、好ましくは、化学的規定培地を指す。そのような培地の１つの例は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＳＣＦ）およびインターロイキン３（ＩＬ－３）を補充した、規定培地、例えば、ＸＶＩＶＯ１５培地である。骨髄系統に沿った成熟を判定するのに好適なマーカーは、ＣＤ１４、ＩＴＧＡＭ、および／またはＣＤ６８である。

「マクロファージ分化培地」は、本明細書において使用されるとき、単球前駆細胞からマクロファージへの分化に有用な任意の培地、好ましくは、化学的規定培地を指す。そのような培地の１つの例は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を補充した、規定培地、例えば、ＸＶＩＶＯ１５培地である。マクロファージを特定するのに好適なマクロファージマーカーは、ＣＤ１４、ＩＴＧＡＭ、および／またはＣＤ６８、ならびに細胞培養基質への接着、食作用、様々な炎症性刺激に対する応答、および例えば、ＩＬ－４および／もしくはＩＮＦｇで処置した際の分極化である。

本明細書において使用されるとき、「増殖因子」という用語は、細胞増殖を引き起こす生物学的に活性なポリペプチドまたは小分子化合物を意味し、これには、増殖因子およびそれらのアナログの両方が含まれる。

「ハイスループットスクリーニング」は、本明細書において使用されるとき、多数の異なる疾患モデル条件および／または化学的化合物を並行して分析および比較することを意味することを理解されたい。典型的に、そのようなハイスループットスクリーニング（アッセイ）は、マルチウェルマイクロタイタープレートにおいて、例えば、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレート、または１５３６もしくは３４５６個のウェルを有するプレートにおいて行われる。

「大規模細胞培養物」は、本明細書において使用されるとき、多量の細胞が、細胞の生存率を維持するための条件（例えば、培地供給、ガス交換、利用可能な表面積）下に拘束されており、その細胞の量が、ハイスループットスクリーニング（アッセイ）に好適である、細胞培養物（系）を指す。特定の実施形態において、大規模細胞培養物格納容器（例えば、容器、コンテナ、フラスコ）は、１０^６個を上回る、１０^７個を上回る、１０^８個を上回る、１０^９個を上回る、１０^１０個を上回る、１０^１１個を上回る、１０^１２個を上回る細胞を含む。一実施形態において、大規模細胞培養物は、１つの単一細胞培養物格納容器を含む。別の実施形態において、大規模細胞培養物は、複数の細胞培養物格納容器のアセンブリを含む。さらなる実施形態において、大規模細胞培養物（格納容器）は、少なくとも１００ｃｍ^２、５００ｃｍ^２、１，０００ｃｍ^２、２，０００ｃｍ^２、５，０００ｃｍ^２、１０，０００ｃｍ^２の細胞培養面積を含む。一実施形態において、大規模細胞培養物（系）には、１日目における少なくとも１０^５個、１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個の出発細胞数に対応して、１ｃｍ^２当たり少なくとも１、２、３、４、５個の胚葉体が接種される。一実施形態において、１つの胚葉体（約１３，０００個の細胞に対応する）が、細胞培養面積１ｃｍ^２につき播種される。

「単一層の細胞」は、本明細書において使用されるとき、細胞が、コンフルエントではない単一細胞とは対照的に、また複数の細胞が接着性基質に付着しているかまたは付着していない（複数の）三次元の層状または非層状の形式（例えば、胚葉体）を形成するのとは対照的に、実質的に１つの単一細胞層として、接着性基質（例えば、細胞培養支持体）に付着していることを意味する。

「多能性培地」は、本明細書において使用されるとき、多能性幹細胞がそれらの多能性を維持しながら、単一細胞として単一層で付着するのに有用な任意の化学的規定培地を指す。有用な多能性培地は、当該技術分野において周知であり、本明細書にも記載されている。本明細書に記載される特定の実施形態において、多能性培地は、以下の増殖因子：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、線維芽細胞増殖因子２、ＦＧＦ２とも表記される）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のうちの少なくとも１つを含有する。

本明細書において使用されるとき、「再プログラミング」という用語は、体細胞を、分化度の低い細胞に変換するため、例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、ケラチノサイト、または白血球を多能性幹細胞に変換するために必要とされる１つまたは複数の工程を指す。「再プログラミングされた」細胞は、本明細書に記載されるように体細胞を再プログラミングすることによって導出された細胞を指す。

「小分子」、または「小化合物」、または「小分子化合物」という用語は、本明細書において使用されるとき、一般に、１モル当たり１０，０００グラム未満、必要に応じて１モル当たり５，０００グラム未満、および必要に応じて１モル当たり２，０００グラム未満の分子量を有する、合成であるかまたは天然に見出されるかのいずれかの有機または無機分子を指す。

「体細胞」という用語は、本明細書において使用されるとき、生殖系列の細胞（例えば、それらが作られる細胞（生殖母細胞）である精子および卵子）および未分化の幹細胞ではない、生物体の身体を形成する任意の細胞を指す。

「幹細胞」という用語は、本明細書において使用されるとき、自己複製の能力を有する細胞を指す。「未分化幹細胞」は、本明細書において使用されるとき、多様な細胞型に分化する能力を有する幹細胞を指す。本明細書において使用されるとき、「多能性幹細胞」は、複数の細胞型の細胞を生じることができる幹細胞を指す。多能性幹細胞（ＰＳＣ）には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が含まれる。ヒト人工多能性幹細胞は、再プログラミングされた体細胞から、例えば、当該技術分野において公知であり、本明細書にさらに記載されている方法による４つの所定の因子（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）の形質導入によって、誘導することができる。このヒト体細胞は、健常な個体または患者から得ることができる。これらのドナー細胞は、任意の好適な源から得ることができる。ヒト身体への侵襲的手技を用いることなくドナー細胞の単離を可能にする源、例えば、ヒト皮膚細胞、血液細胞、または尿試料から得ることができる細胞が、本明細書では好ましい。

「懸濁培養物」という用語は、本明細書において使用されるとき、細胞（単一細胞または細胞凝集物、例えば、胚葉体）が、細胞をインキュベートするために使用される細胞培養物格納容器の表面に実質的に付着してないか、最小限にしか付着していない、細胞培養系を指す。懸濁培養物において、細胞または細胞凝集物は、細胞培養物格納容器の表面（例えば、フラスコの組織培養支持体）との接触が最小限であるかまたは接触することなく、浮遊している。懸濁培養物の最小限に付着した細胞または細胞凝集物は、弱いかまたは中等度の物理的な力の使用によって、例えば、細胞培養物の軽い振盪、タッピング、または水平方向の移動によって、容易に剥離することができる。

「接着性細胞培養物」という用語は、本明細書において使用されるとき、懸濁培養物とは対照的に、細胞が、細胞をインキュベートするために使用される細胞培養物格納容器の表面に付着している、細胞培養系を指す。本明細書に記載される弱いかまたは中等度の物理的な力の使用によって容易に剥離することができる、懸濁培養物の最小限に付着した細胞または細胞凝集物は、接着性細胞培養物とは見なされない。

ヒト細胞が好ましいが、本明細書に記載される方法はまた、非ヒト細胞、例えば、霊長類、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ウサギ）、およびイヌ細胞にも適用可能である。

単球前駆細胞を産生するための方法が、本明細書において提供される。本発明よりも以前は、いくつかの技術的な問題により、創薬における単球およびマクロファージの使用は限定されていた。プロジェクトが納期に間に合うのを保証するために、細胞数、拡張性、再現性、および表現型関連性など因子は、必須である。本発明者らは、公開されているプロトコール（ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）を修正し、分化時間を減少させながら、収率および再現性を増加させることができた。好ましい実施形態において、胚葉体（ＥＢ）は、ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体に播種した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。これらのＥＢは、初期の胚形成に類似し、３つの生殖系列の層（原始線条）の形成を開始する。ＥＢは、次いで、細胞を、ＢＭＰ４を含む規定培地と接触させることによって事前分化され、細胞の運命決定を中胚葉系統へと誘導する。形成され事前分化された後、ＥＢは、播種され、骨髄系統に沿ってさらに分化して、造血工場を形成し、これが、単球前駆体を産生し上清中に放出する（図２）。造血工場は、１００日間を上回って維持することができ、単球前駆体を、培養上清から採取することができる（最大で１週間に２回）。採取した後、これらの前駆体は、１週間以内に非分極化マクロファージに分化し得るか、または炎症促進性もしくは抗炎症性のいずれかのサブタイプを促進する特定のサイトカインの添加によってさらに分極化されてもよい。造血工場の拡張性を、１０から１０００ｃｍ^２の培養面積に増加させることによって、本発明は、創薬および開発プロジェクトに関連する作業ならびに中規模サイズの薬物スクリーニングプログラムの必要性に合った細胞採取および取り扱い時間を達成している。別の態様において、ミクログリア様細胞の生成のための新規な共培養設定を、確立した。

単球前駆細胞の生成
多能性幹細胞は、自己複製の特徴を有し、成体哺乳動物身体のすべての主要な細胞型に分化することができる。多能性幹細胞は、標準化された細胞培養条件下において、多量に産生することができる。したがって、好ましい実施形態において、単球前駆細胞は、多能性幹細胞から生成される、すなわち、分化する。一実施形態において、単球前駆細胞は、胚性幹細胞から生成される、すなわち、分化する。好ましい実施形態において、単球前駆細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成、すなわち、分化する。一実施形態において、ｉＰＳＣは、再プログラミングされた体細胞から生成される。体細胞のｉＰＳＣへの再プログラミングは、ｉＰＳＣ特性の維持に関与する特定の遺伝子を導入することによって達成することができる。体細胞のｉＰＳＣへの再プログラミングに好適な遺伝子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＣ－Ｍｙｃ、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、再プログラミングのための遺伝子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＣ－Ｍｙｃである。

内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織は、すべて、体細胞から作製されている。ｉＰＳＣを生成するために使用される体細胞としては、線維芽細胞、脂肪細胞、およびケラチノサイトが挙げられるがこれらに限定されず、皮膚生検から得ることができる。他の好適な体細胞は、白血球、血液試料もしくは上皮細胞から得られる赤芽球、または血液もしくは尿試料から得られる他の細胞であり、当該技術分野において公知であり本明細書に記載される方法によって、ｉＰＳＣに再プログラミングされる。体細胞は、健常な個体から、または罹患した個体から得ることができる。一実施形態において、体細胞は、疾患を患う対象（例えば、ヒト対象）に由来する。一実施形態において、疾患は、慢性炎症（例えば、炎症性腸疾患）、原発性もしくは後天性免疫不全（例えば、裸リンパ球症候群）、または神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、もしくはパーキンソン病）のいずれかと関連している。本明細書に記載される再プログラミングのための遺伝子は、当該技術分野において公知の方法、再プログラミングベクターを介した細胞への送達または小分子を介した前記遺伝子の活性化のいずれかによって、体細胞に導入される。再プログラミングのための方法は、とりわけ、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミドおよびトランスポゾン、マイクロＲＮＡ、小分子、改変されたＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ならびに組換えタンパク質を含む。一実施形態において、レンチウイルスが、本明細書に記載される遺伝子の送達に使用される。別の実施形態において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＣ－Ｍｙｃは、センダイウイルス粒子を使用して体細胞に送達される。加えて、体細胞を、少なくとも１つの小分子の存在下において培養してもよい。一実施形態において、この小分子は、プロテインキナーゼのＲｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（ＲＯＣＫ）ファミリーの阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例は、ファスジル（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、チアゾビビン（Ｎ－ベンジル－２－（ピリミジン－４－イルアミノ）チアゾール－４－カルボキサミド）、およびＹ－２７６３２（（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロ－ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド）を含む。

多能性幹細胞の所定の単一層を提供することが、得られる培養物の再現性および効率性に好ましい。本発明者らは、驚くべきことに、幹細胞維持培養においてラミニンでコーティングされた基質を使用することによる置換が、造血工場の分化時間を減少させ、細胞培養物のスループットを増加させたことを見出した。一実施形態において、多能性幹細胞の単一層は、細胞を、単一細胞に酵素的に解離させ、それらを接着性基質、例えば、ラミニン基質でコーティングされた細胞培養物格納容器（例えば、フラスコ）に播種することによって、産生され得る。好ましい実施形態において、接着性基質（コーティング）は、ラミニンである。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－４を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－５を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットベータ－１を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットベータ－２を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットガンマ－１を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－４、ベータ－１、およびガンマ－１（ラミニン－４１１）を含む。一実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－１、およびガンマ－１（ラミニン－５１１）を含む。好ましい実施形態において、ラミニンは、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－２、およびガンマ－１（ラミニン－５２１、例えば、ＢｉｏＬａｍｉｎａ ｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１）を含む。

単一細胞への解離に好適な酵素の例としては、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。一実施形態において、１ｃｍ^２当たり２０，０００～６０，０００個の細胞が、接着性基質に播種される。本明細書において使用される培地は、多能性幹細胞が単一細胞として単一層で付着および増殖するのを促進する、多能性培地である。一実施形態において、多能性培地は、プロテインキナーゼのＲｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ（ＲＯＣＫ）ファミリーの小分子阻害剤（本明細書においてＲＯＣＫキナーゼ阻害剤と称される）を補充した、無血清培地である。

したがって、一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ラミニン基質に、多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供することを含み、ここで、この多能性培地は、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤を補充した無血清培地である。

多能性幹細胞の基質への付着に好適な無血清培地の例としては、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのｍＴｅＳＲ１もしくはＴｅＳＲ２、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬからのＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地、ＭｉｌｉｐｏｒｅからのＰｌｕｒｉＳＴＥＭ、Ｍｉｌｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ、ＬｏｎｚａからのＸ－ＶＩＶＯがある。本明細書において有用なＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の例は、ファスジル（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、チアゾビビン（Ｎ－ベンジル－２－（ピリジン－４－イルアミノ）チアゾール－４－カルボキサミド）、およびＹ２７６３２（（＋）－（Ｒ）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロ－ヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、例えば、Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのカタログ番号：１２５４）がある。一実施形態において、多能性培地は、約２～２０μＭのＹ２７６３２、好ましくは約５～１０μＭのＹ２７６３２を補充した無血清培地である。別の実施形態において、多能性培地は、約２～２０μＭのファスジルを補充した無血清培地である。別の実施形態において、多能性培地は、約０．２～１０μＭのチアゾビビンを補充した無血清培地である。

一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ラミニン基質に多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供すること、およびこの単一層を多能性培地において、少なくとも１日間（２４時間）増殖させることを含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供すること、およびこの単一層を多能性培地において、１８時間～３０時間、好ましくは２３～２５時間増殖させることを含む。さらなる実施形態において、本明細書に記載される方法は、ラミニン基質に多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供すること、およびこの単一層を多能性培地において、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または１０日間を上回って増殖させることを含む。

別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ラミニン基質に、ｍＴｅｓＲ１培地である多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供すること、およびこの単一層を多能性培地において、少なくとも１日間（２４時間）増殖させることを含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、ラミニン基質に、ｍＴｅｓＲ１である多能性培地中の多能性幹細胞の単一層を提供すること、およびこの単一層を多能性培地において、１８時間～３０時間、好ましくは２３～２５時間増殖させることを含む。

次の工程ｂ）において、多能性幹細胞は、採取され、懸濁培養物に移される。一実施形態において、多能性幹細胞を、中胚葉誘導培地と接触させる。一実施形態において、中胚葉誘導培地は、組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）を含む。一実施形態において、中胚葉誘導培地は、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（例えば、ｈＢＭＰ４）、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を補充した無血清培地である。

さらなる実施形態において、中胚葉誘導培地は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をさらに含む。一実施形態において、中胚葉誘導培地は、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（例えば、ｈＶＥＧＦ）、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを補充した無血清培地である。

さらなる実施形態において、中胚葉誘導培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）をさらに含む。一実施形態において、中胚葉誘導培地は、約５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（例えば、ｈＳＣＦ）、好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを補充した無血清培地である。

好ましい実施形態において、中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびＳＣＦ、具体的には、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および約５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む。好ましい実施形態において、中胚葉誘導培地は、約５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、約５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および約２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む。

一実施形態において、多能性幹細胞を、少なくとも約１日間（２４時間）、中胚葉誘導培地と接触させる。さらなる実施形態において、多能性幹細胞を、約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または約１０日間を上回って、中胚葉誘導培地と接触させる。一実施形態において、多能性幹細胞を、約２４時間～約７２時間、好ましくは、約３６～約６０時間、中胚葉誘導培地と接触させる。

一実施形態において、細胞は、工程ｃ）において、中胚葉誘導後の細胞の付着に好適な細胞培養支持体に播種される。好ましい実施形態において、細胞は、基底膜生体材料、例えば、マトリゲル、Ｃｕｌｔｒｅｘ ＢＭＥ、Ｇｅｌｔｒｅｘ Ｍａｔｒｉｘなどでコーティングされた細胞培養支持体に播種される。一実施形態において、基底膜生体材料は、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ナイドジェン－１，２を含む。好ましい実施形態において、細胞は、マトリゲルでコーティングされた細胞培養支持体に播種される。

一実施形態において、細胞は、工程ｃ）において、大規模細胞培養容器に播種される。特定の実施形態において、１０^６個を上回る、１０^７個を上回る、１０^８個を上回る、１０^９個を上回る、１０^１０個を上回る、１０^１１個を上回る、１０^１２個を上回る細胞が、個々の大規模細胞培養物格納容器に播種される。一実施形態において、大規模細胞培養物は、１つの単一細胞培養物格納容器を含む。別の実施形態において、大規模細胞培養物は、複数の細胞培養物格納容器のアセンブリを含む。さらなる実施形態において、大規模細胞培養物（格納容器）は、少なくとも１００ｃｍ^２、５００ｃｍ^２、１，０００ｃｍ^２、２，０００ｃｍ^２、５，０００ｃｍ^２、１０，０００ｃｍ^２の細胞培養面積を含む。一実施形態において、大規模細胞培養物（系）には、少なくとも１０^６個、１０^７個、１０^８個、１０^９個、１０^１０個、１０^１１個、１０^１２個の細胞が接種される。

次の工程において、大規模細胞培養物中の細胞を、骨髄系統に沿ってさらに分化させる。一実施形態において、播種した細胞を、工程ｃ）において、骨髄系成熟培地と接触させる。好適な骨髄系成熟培地は、当該技術分野において公知であり、本明細書にも記載されている。一実施形態において、骨髄系成熟培地は、インターロイキン３（ＩＬ－３）を含む。一実施形態において、骨髄系成熟培地は、約１～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３（例えば、ｈＩＬ－３）、好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３を補充した無血清培地である。一実施形態において、細胞を、約４日間（約９６時間）、骨髄系成熟培地と接触させる。さらなる実施形態において、細胞を、約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または約１０日間を上回って、骨髄系成熟培地と接触させる。一実施形態において、細胞を、約７２時間～約１２０時間、好ましくは、約８４～約１０８時間、骨髄系成熟培地と接触させる。骨髄系成熟の工程中に、大規模細胞培養物は、単球前駆細胞の産生を開始する。単球前駆細胞は、骨髄系成熟後に、細胞培養物の上清を回収することによって、接着性細胞培養物から採取することができる。一実施形態において、本発明による工程ｃ）の大規模細胞培養物は、約１０日間を上回って、１５日間を上回って、２０日間を上回って、２５日間を上回って、３０日間を上回って、４０日間を上回って、５０日間を上回って、６０日間を上回って、７０日間を上回って、８０日間を上回って、９０日間を上回って、または１００日間を上回って、単球前駆細胞を産生することができる。一実施形態において、工程ｃ）の大規模培養物は、１週間につき、細胞培養面積１ｃｍ^２当たり、少なくとも約１００，０００個の単球前駆細胞を産生することができる。

単球前駆細胞からマクロファージへの分化
単球前駆細胞は、当該技術分野において公知であり本明細書にも記載される方法によって、マクロファージに分化させることができる。一実施形態において、単球前駆細胞を、マクロファージ分化培地と接触させる。一実施形態において、細胞を、約１～１０日間、４～８日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または約１０日間を上回って、マクロファージ分化培地と接触させる。一実施形態において、マクロファージ分化培地は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含む。一実施形態において、マクロファージ分化培地は、１０～２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ（例えば、ｈＭ－ＣＳＦ）、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを補充した無血清培地である。好ましい実施形態において、細胞を、約６日間、マクロファージ分化培地と接触させる。一実施形態において、細胞をマクロファージ分化培地と接触させる前またはそれと同時に、細胞を、コーティングされていない組織培養支持体に播種する。一実施形態において、マクロファージを、コーティングされていない組織培養支持体に再播種する。一実施形態において、マクロファージを、ハイスループットプレート形式で再播種する。一実施形態において、マクロファージを、２４ウェルプレート形式、９６ウェルプレート形式、または３８４ウェルプレート形式で再播種する。

単球前駆細胞からミクログリアへの分化
単球前駆細胞は、当該技術分野において公知であり本明細書にも記載される方法によって、ミクログリアに分化させることができる。一実施形態において、単球前駆細胞を、ニューロンと接触させる。一実施形態において、ニューロンは、国際公開第２０１７０８１２５０号に記載される方法を使用して生成される。いくつかの実施形態において、ニューロンを、（少なくとも）約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、分化させる。好ましい実施形態において、ニューロンを、約２～５週間分化させる。いくつかの実施形態において、細胞を、約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または約１０日間を上回って、ニューロンと接触させる。いくつかの実施形態において、細胞を、約５～２０日間または約１０～１８日間、ニューロンと接触させる。一実施形態において、細胞を、共培養分化培地において、ニューロンと共培養する。一実施形態において、共培養分化培地は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および／またはインターロイキン３４（ＩＬ－３４）を含む。一実施形態において、共培養分化培地は、１０～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ（例えば、ｈＧＭ－ＣＳＦ）、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを補充した無血清培地である。一実施形態において、共培養分化培地は、１～５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４（例えば、ｈＩＬ－３４）、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４を補充した無血清培地である。好ましい実施形態において、細胞を、１０～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ（例えば、ｈＧＭ－ＣＳＦ）および１～５００ｎｇのＩＬ－３４、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦおよび１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４を補充した無血清培地において、約１４日間、ニューロンおよび共培養分化培地と接触させる。

例示的な実施形態：
１． 単球前駆細胞を産生するための方法であって、
ａ）ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体に、多能性培地中の多能性幹細胞を播種する工程と、
ｂ）多能性幹細胞を採取し、多能性幹細胞を懸濁培養物中の中胚葉誘導培地と接触させる工程と、
ｃ）細胞を、細胞の付着に好適な細胞培養支持体に播種する工程と、
ｄ）懸濁液から単球前駆細胞を採取する工程と
を含む、方法。
２． 工程ａ）における細胞を、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間、具体的には、少なくとも約１日間、ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体上で培養する、実施形態１に記載の方法。
３． 工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５を含む、特に、工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－２、およびガンマ１を含む、実施形態１または２に記載の方法。
４． 中胚葉誘導培地が、組換え骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）を含む化学的規定培地である、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。
５． 培地が、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む、実施形態４に記載の方法。
６． 中胚葉誘導培地が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をさらに含む、実施形態４または５に記載の方法。
７． 中胚葉誘導培地が、約１０～１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む、実施形態６に記載の方法。
８． 中胚葉誘導培地が、幹細胞因子（ＳＣＦ）をさらに含む、実施形態４から７のいずれか１つに記載の方法。
９． 中胚葉誘導培地が、約５～５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含む、実施形態８に記載の方法。
１０． 細胞を、約１～１０日間、２～６日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、中胚葉誘導培地と接触させる、実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法。
１１． 細胞を、約４日間、中胚葉誘導培地と接触させる、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
１２． 工程ｂ）における細胞が、胚葉体（ＥＢ）を形成する、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の方法。
１３． 工程ｃ）における細胞培養支持体が、基底膜生体材料でコーティングされている、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法。
１４． 基底膜生体材料が、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ナイドジェン－１，２を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５． 工程ｃ）における細胞を、骨髄系成熟培地と接触させる、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法。
１６． 骨髄系成熟培地が、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含む、実施形態１から１５のいずれか１つに記載の方法。
１７． 骨髄系成熟培地が、約２０～２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを含む、実施形態１６に記載の方法。
１８． 骨髄系成熟培地が、ＩＬ－３をさらに含む、実施形態１５から１７のいずれか１つに記載の方法。
１９． 培地が、約１～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３、好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３を含む、実施形態１８に記載の方法。
２０． 細胞を、約１～１０日間、２～６日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、骨髄系成熟培地と接触させる、実施形態１５から１９のいずれか１つに記載の方法。
２１． 細胞を、約４日間、骨髄系成熟培地と接触させる、実施形態１５から２０のいずれか１つに記載の方法。
２２． 工程ｄ）において、単球前駆細胞を、細胞培養物の上清を回収することによって、採取する、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
２３． 工程ｄ）において、単球前駆細胞を、細胞培養物の上清を回収することによって、バッチで採取する、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の方法。
２４． 単球前駆細胞を規則的な間隔で、具体的には、毎日、１日おきに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、または６日ごとに、バッチで採取する、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
２５． 単球前駆細胞を継続的に採取する、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
２６． 工程ｄ）において、単球前駆細胞を、細胞培養物から上清を除去し、必要に応じて、除去した上清を新しい培地と置き換えることによって、継続的に採取する、実施形態１から２５のいずれか１つに記載の方法。
２７． ｅ）採取した単球前駆細胞をマクロファージに分化させる工程をさらに含む、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法。
２８． 工程ｅ）における細胞を、マクロファージ分化培地と接触させる、実施形態２７に記載の方法。
２９． マクロファージ分化培地が、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を含む、実施形態２７に記載の方法。
３０． マクロファージ分化培地が、約１０～２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを含む、実施形態２８または２９に記載の方法。
３１． 細胞を、約１～１０日間、４～８日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、マクロファージ分化培地と接触させる、実施形態２８から３０のいずれか１つに記載の方法。
３２． 細胞を、約６日間、マクロファージ分化培地と接触させる、実施形態２８から３１のいずれか１つに記載の方法。
３３． 工程ｅ）における細胞を、コーティングされていない組織培養物支持体に播種する、実施形態２８から３２のいずれか１つに記載の方法。
３４． マクロファージを、コーティングされていない組織培養物支持体に再播種する、実施形態２８から３３のいずれか１つに記載の方法。
３５． マクロファージを、２４ウェルプレート形式、９６ウェルプレート形式、または３８４ウェルプレート形式で再播種する、実施形態２８から３４のいずれか１つに記載の方法。
３６． ｅ）単球前駆細胞をミクログリアに分化させる工程をさらに含む、実施形態１から２６のいずれか１つに記載の方法。
３６． 工程ｅ）における単球前駆体を神経細胞と共培養する、実施形態３５に記載の方法。
３７． 工程ｅ）における細胞を共培養分化培地と接触させる、実施形態３５または３６に記載の方法。
３８． 共培養分化培地が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および／またはインターロイキン３４（ＩＬ－３４）を含む、実施形態３７に記載の方法。
３９． 共培養分化培地が、約１０～２００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含む、実施形態３８に記載の方法。
４０． 共培養分化培地培地が、約１～５００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４（例えば、ｈＩＬ－３４）、好ましくは、約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３４を含む、実施形態３８または３９に記載の方法。
４１． 細胞を、約１～２８日間、７～２１日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、共培養分化培地と接触させる、実施形態３８から４０のいずれか１つに記載の方法。
４２． 細胞を、約１４日間、共培養分化培地と接触させる、実施形態３８から４１のいずれか１つに記載の方法。
４３． 神経細胞が、多能性幹細胞に由来する、実施形態３６から４２のいずれか１つに記載の方法。
４４． 神経細胞が、国際公開第２０１７／０８１２５０号に記載される均一に分配された分化したＮＣの標準化細胞培養物を産生するための方法に従って産生される、実施形態３６から４３のいずれか１つに記載の方法。
４５． 多能性幹細胞が、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞である、実施形態１から４４のいずれか１つに記載の方法。
４６． 多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の方法。
４７． 多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、実施形態１から４５のいずれか１つに記載の方法。
４８． 単球前駆細胞を産生するための接着性大規模細胞培養物であって、１週間につき、細胞培養面積１ｃｍ^２当たり少なくとも約１００，０００個の単球前駆細胞を産生することができる、接着性大規模細胞培養物。
４９． 請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法の工程ａ）からｃ）によって産生される、実施形態４８に記載の接着性大規模細胞培養物。
４９． 本明細書に記載される発明。

以下は、本発明の組成物および方法の非限定的な例である。上記に提供されている一般的な説明を踏まえ、様々な他の実施形態を実施することができることが理解される。

材料および方法
ヒト人工多能性幹細胞からマクロファージを生成するために、本発明者らは、公開されているプロトコール（ｖａｎ Ｗｉｌｇｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）を採用した。これは、図３に示される複数工程のプロトコールをもたらした。このプロトコールは、５つの工程で構成されている：ｉＰＳＣ維持（工程１）、ＥＢ形成（工程２）、ＥＢの播種（工程３）、マクロファージ分化（工程４）、およびマクロファージ分極化（工程５）。

フィーダーフリー条件でのｉＰＳＣ維持
培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、使用前に少なくとも２時間、カルシウムおよびマグネシウムを含有するＰＢＳ中１２．５ｕｇ／ｍｌのｒｈラミニン－５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした。ｈｉＰＳ細胞を、５％ ＣＯ^２で３７℃において、ｍＴｅｓＲ１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に播種し、培養し、培地を毎日交換した。細胞を、９０％の培養密度で継代させた。そうして、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、３７℃で２～５分間、アキュターゼで剥離した。遠心分離によってアキュターゼを除去した後、細胞を、維持または分化の開始のいずれかに使用した。

ＥＢの形成および中胚葉の誘導
均質なＥＢを得るために、ｉＰＳ細胞を、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ ８００（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プレートに播種した。そうして、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２、Ｃａｌｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充し、４×１０^６個のｉＰＳ単一細胞を含有する、２ｍｌのｍＴｅｓＲ１を、それぞれのＡｇｇｒｅｗｅｌｌに添加し、１００ｇで３分間遠心分離して、ｉＰＳ細胞がａｇｇｒｅｗｅｌｌのマイクロウェルに均一かつ高速で分配されるのを確実にした。翌日、ｍＴｅＳＲ１培地の７５％（それぞれのウェルにおいて、２ｍｌのうちの１ｍｌを２回交換する）を、５０ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ、および２０ｎｇ／ｍｌのｈＳＣＦを補充した新しいｍＴｅＳＲ１培地と交換することによって、中胚葉誘導を開始した。さらなる分化のために、これを、続いて２日間繰り返した。

ＥＢの播種および骨髄系統に沿った成熟の継続
分化の４日目に、ａｇｇｒｅｗｅｌｌをＰＢＳですすぐことにより、ＥＢを緩徐に取り除くことによって、ＥＢを採取した。ＥＢを、４０μｍのストレーナーで回収し、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｕｇ／ｍｌのメルカプトエタノール、Ｍ－ＣＳＦ（２０～２００ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ３（１～５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）からなる工場培地に移した。ＥＢを、室温において１時間、低温ＤＭＥＭ Ｆ１２ １：１ １×Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｇｉｂｃｏ ３１３３１－０２８）中に希釈した増殖因子を低減させたマトリゲル（３５４２３０ Ｃｏｒｎｉｎｇ）で事前コーティングされた所望される表面積（２～２０００ｃｍ^２）の細胞培養容器に、０．８～１．５個のＥＢ／ｃｍ^２の密度で播種した。ＥＢの接着を可能にするために、ＥＢを、緩やかな動作によって均一に分配させ、培養容器を、即座に３７℃で５％ ＣＯ^２におき、分化の最初の１週間はいずれのさらなる干渉は行わなかった。次の２週間の分化では、開始体積の５０％の新しい工場培地を、１週間に１回添加した。分化の３週間目から、上清中の（ＣＤ１４＋）単球前駆体の産生および放出が検出可能となるまで、培地の半分の交換を行った。この時点以降、新しい工場培地との完全な培地交換を、１週間に２回行った。

単球の採取
単球を、遠心分離（４分間、３００ｇ）によって、上清から回収し、細胞を、再懸濁させ、計数し、フローサイトメトリーによるマーカー発現の品質コントロール（ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ１１ｂ、およびＣＤ１４）を、１週間に１回行った。単球前駆体を、分化培地に移し、マクロファージに分化させたか、またはニューロンとの共培養においてミクログリアに分化させた。

マクロファージの分化
適用要件によると、マクロファージは、必要とされるプレート形式で直接分化させたか、またはｕｐｃｅｌｌ（商標）プレートで６日間、事前分化させ、次いで、製造業者のプロトコールに従って、アッセイ開始の１日前に、最終的なプレート形式に再播種したかのいずれかであった。分化のために、細胞を、ＸＶＩＶＯ １５（２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ、および１０～２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦを補充）またはＲＰＭＩ１６４０（１％のＰｅｎｓｔｒｅｐおよび１０～２００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦもしくは１～１０％のウシ胎児血清を補充）のいずれかにおいて培養した。培地を、播種の３日後に交換し、細胞を、７日間分化させた。

マクロファージの分極化
マクロファージの炎症促進性（Ｍ１）または制御性表現型（Ｍ２）への分極化のために、細胞を、それぞれ、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ、５～１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、および１～１００ｎｇ／ｍｌのＩＮＦｙを補充した（Ｍ１）、または２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のＰｅｎｓｔｒｅｐ、５～１００ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ、および１～１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を補充した（Ｍ２）、ＸＩＶＩＶＯ１５培地において、所望される分極化期間、培養した。

ニューロン共培養物におけるミクログリア様細胞の生成
単球からミクログリア様細胞への分化のために、単球を、事前分化させたニューロンに播種し、分析の前に２週間共培養した。

ニューロンの生成
ニューロンを、国際公開第２０１７０８１２５０号に記載されるように分化させ、多量の原液を、２１日目に凍結させた。共培養の開始の２週間前に、ニューロンを解凍し、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、および１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２、Ｃａｌｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有するＮ２／Ｂ２７培地において、１ｃｍ^２当たり５０～２０００００個の細胞の密度で、５ｕｇ／ｍｌの組換えヒトラミニン－５２１（ＢＮｉｏＬａｍｉｎａ）で事前コーティングされた細胞培養容器に播種した。培地を、３日ごとに交換した（ニューロン成熟のさらなる過程についてはＲＯＣＫ阻害剤なし）。

共培養
新しく採取した単球前駆体を、Ｎ２培地（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ Ｆ－１２、Ｎ２補充物質、Ｇｌｕｔａｍａｘ、５０μＭのメルカプトエタノール、１％のＰ／Ｓ、および１～１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ、ならびに１～５００ｎｇのＩＬ－３４からなる）において、成熟ニューロンの上に播種した。ミクログリア細胞を、１４日間、１週間に２回の培地交換で、共培養物中で成熟させた。

単球の回収および懸濁培養物における中間体の保管
新しく採取した単球前駆体を、回収し、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｕｇ／ｍｌのメルカプトエタノール、Ｍ－ＣＳＦ（２０～２００ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ３（１～５０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＸＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）において、数週間にわたって、「スピナー」と称される懸濁培養において培養した。細胞数を５０～２００万個／ｍｌに調節し、培地交換を１週間に２回行い、細胞を再懸濁させ、計数し、品質コントロールを行った（ＣＤ６８、Ｋｉ６７）。

実施例１
改変された幹細胞の維持により、造血工場の分化が促進され、単球の収率が増加する
人工多能性幹細胞を、上述のように、フィーダーフリー条件下において培養し、造血工場に分化させた。幹細胞維持培養物におけるラミニン－５２１コーティング基質によるマトリゲルの置換は、造血工場の分化時間を減少させた。ラミニン－５２１で培養したｉＰＳＣに由来する造血工場は、分化の２１日目に単球前駆体の産生を開始したが、一方で、分化の３４日目まで、マトリゲルで培養したｉＰＳＣに由来する造血工場によって上清中に放出される単球前駆体はなかった（図４）。マクロファージの早期放出と一致して、単球のマーカー遺伝子発現もまた、分化プロセスの早期に増加し、週ごとの採取収率は、ラミニン－５２１で培養したｉＰＳＣに由来する造血工場において、有意に高かった（図５～９）。この観察により、効率的な分化プロセスのためには、ｉＰＳＣ維持条件が高度に関連することが指摘される。

実施例２
ｉＰＳＣに由来する単球前駆体は、培養した初代ヒトマクロファージと同等のマーカーパターンを有するマクロファージに分化する。
ｉＰＳＣに由来するマクロファージを、初代マクロファージと比較するために、ｉＰＳ細胞に由来する単球前駆体、およびＬＯＮＺＡから入手したＣＤ１４陽性血中単球を、上述のようにマクロファージに分化させた。開始集団（単球／図１０）およびマクロファージ（図１１）におけるマーカー遺伝子の発現を、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、およびＫｉ６７について、フローサイトメーターによって評価した。ｉＰＳ細胞に由来する単球は、より高いレベルのＣＤ１４およびより低いＣＤ１１ｂ発現を有したが、全体的に同等のマーカー発現パターンを有した（図１０）。両方の源から分化したマクロファージは、同様に類似のマーカーパターンを呈し（図１１）、ｉＰＳＣに由来する単球前駆体およびマクロファージが、骨髄生物学のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの有効な代替源であることが示された。

実施例３
造血工場の培養条件の強化により、ＥＢの接着および造血工場の安定性が向上する
異なるドナーに由来する３つのｉＰＳＣ株由来のＥＢを、上述のように生成し、増殖因子を低減したマトリゲルで事前コーティングされた培養容器または未処置の培養容器のいずれかに播種し、接着性および培養安定性を、分化期間にわたって視覚的にモニタリングした（図１２および１３）。すべてのドナーに由来するＥＢは、増殖因子を低減したマトリゲルでコーティングされたプレートに、より良好に接着し、より多くのＥＢからの細胞増殖物が、コーティングプレート上で観察された。このプロトコールの変更により、培養物の安定性が増加し、それによって、長期培養成功率が増加する。

実施例４
新しい培養プロトコールにより、異なるｉＰＳ細胞株からの機能性マクロファージの生成が可能となる。
単球前駆体およびマクロファージを、上述のように、３つの異なるｉＰＳ細胞株から導出した。マクロファージの機能性を評価するために、これらのマクロファージの食作用能力を、これらをｐＨｒｏｄｏ緑色標識ザイモサンとともに１２０分間インキュベートし、続いてフローサイトメトリー分析によって緑色の細胞を検出することによって、試験した（図１４）。１２０分間のインキュベーション後、細胞のうちの約６０％が、緑色の蛍光によって測定されるように、ザイモサン粒子を取り込んでいた。３つの異なるｉＰＳＣドナー間で観察された違いは、わずかしかなく（図１４）、これにより、分化プロトコールの堅牢性が強調される。

実施例５
ニューロンとの共培養物におけるミクログリアの分化
上述のようにｉＰＳ細胞株から導出した単球前駆体は、それらをミクログリア様細胞に分化させるために、ヒトｉＰＳＣに由来するニューロンと共培養することができる（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７ａ）（概要、図１５）。本明細書では、本発明者らは、公開されているプロトコールを短縮し、単球前駆体をニューロンに播種する際、分化の３週間目で再解凍した（国際公開第２０１７０８１２５０号）。この凍結されたニューロン原液の使用により、実験的共培養設計において、高い柔軟性およびスループットが可能となる。安定したＧＦＰの発現を有するｉＰＳ細胞を使用することによって、ＧＦＰ陽性単球前駆体およびミクログリア様細胞を生成することができ、これにより、生細胞のイメージングおよび共培養物中のミクログリアの検出が容易となる（図１５および１６）。興味深いことに、ＬＰＳ刺激を受けると、共培養物中のミクログリアは、単一培養のマクロファージおよびニューロン単一培養物（図１７）と比較して、サイトカイン放出パターンの違いを示し、神経炎症モデルとしての使用の可能性を示した。サイトカイン放出における変化とは対照的に、ハイコンテントイメージング設定において、ｐＨｒｏｄｏ赤色ザイモサンをＧＦＰ陽性マクロファージおよびミクログリアと組み合わせて使用することによる食作用測定は、マクロファージおよびミクログリアによるザイモサン粒子の同様の取り込みを示した（図１８）。ハイコンテントイメージングを利用し、アッセイを３８４ウェルに小型化することにより、この設定を、マクロファージおよびミクログリアにおける食作用のモジュレーターをスクリーニングするために使用することができ（図１９）、これは、本明細書において、サイトカラシンＤによる食作用の用量依存的阻害、および血清インキュベーションによる用量依存性の刺激により示される。

実施例６
大規模スクリーニングキャンペーンのための懸濁培養物中の単球前駆体の回収
単球前駆体を、造血工場から採取し、懸濁培養物中に数週間回収した（図２０Ａ）。単球前駆体の生存率、ならびにマーカー発現は、懸濁培養物中で少なくとも６週間、一定なままであった（図２０ＢおよびＣ）。単球を、異なる時点で懸濁培養物から取り出し、マクロファージに分化させると、得られたマクロファージのマーカー発現は、採取後に直接導出された細胞と比較して、懸濁培養物から導出された細胞間で違いを示さなかった（図２０Ｄ）。単球前駆体の大規模な均一集団の生成が可能であることは、スクリーニング用途に非常に好適であり、したがって、そのような懸濁培養物で保管されている細胞は、直接的に分化させたマクロファージと同等の機能特徴を有するマクロファージを発生させるはずである。マクロファージの機能性を評価するために、懸濁培養物に由来するマクロファージ（「スピナー」）および新しい採取物に由来するマクロファージ（「採取物」）の食作用能力を、これらをｐＨｒｏｄｏ赤色標識ザイモサンとともに１２０分間インキュベートして、続いてハイコンテントに基づく分析によって食作用性細胞を検出することによって、試験した（図２１Ａ）。２つの条件の間で違いは観察されなかった（図２１Ａ）。マクロファージの第２の機能特性は、走化性物質に向かって遊走する能力であり、本発明者らは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ｔｒａｎｓｗｅｌｌアッセイ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および走化性物質Ｃ５ａを使用することによって、２つのマクロファージ集団について、これを評価した。この設定においても、懸濁培養物に由来する細胞（「スピナー」）は、新しく採取した単球前駆体から分化させた細胞（「採取物」）と比較して、それらの遊走挙動に有意な差を示さなかった（図２１Ｂ）。同等の機能特性およびマーカー発現により、大規模機能性および表現型アッセイに関して、懸濁培養物に由来する細胞の表現型および有用性が確認された。

前述の発明は、理解の明確性のために、例示および実施例を用いていくらか詳細に記載されているが、説明および実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。本明細書において引用されるすべての特許および科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

Claims (12)

1. 単球前駆細胞を産生するための方法であって、
   ａ）ラミニンでコーティングされた細胞培養支持体に、多能性培地中の多能性幹細胞を播種する工程と、
   ｂ）多能性幹細胞を採取し、多能性幹細胞を懸濁培養物中の中胚葉誘導培地と接触させる工程であって、該細胞が胚葉体（ＥＢ）を形成する、前記工程と、
   ｃ）該ＥＢを、基底膜生体材料でコーティングされている、ＥＢの付着に好適な細胞培養支持体に播種する工程と、
   ｄ）細胞培養上清から単球前駆細胞を採取する工程と
   を含む、方法。
2. 工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５を含む、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）におけるラミニンが、ラミニンサブユニットアルファ－５、ベータ－２、およびガンマ－１を含む、請求項１に記載の方法。
4. 工程ｂ）において、細胞を、ＢＭＰ４を含む規定培地と接触させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 工程ｂ）において、細胞を、ＶＥＧＦを含む規定培地と接触させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程ｂ）において、細胞を、ＳＣＦを含む規定培地と接触させる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程ｃ）におけるＥＢを骨髄系成熟培地と接触させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 骨髄系成熟培地が、Ｍ－ＣＳＦを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 骨髄系成熟培地が、ＩＬ－３を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. ｅ）採取した単球前駆細胞をマクロファージに分化させる工程
    をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 工程ｅ）における細胞を、コーティングされていない組織培養支持体に播種する、請求項１０に記載の方法。
12. ｅ）採取した単球前駆細胞をミクログリアに分化させる工程
    をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

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