JP7711045B2 - 腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫療法 - Google Patents

腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫療法

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Description

本開示は、癌治療に使用することができる、転位因子（ＴＥ）エキソン融合転写物、核酸、ワクチン、抗体、および免疫細胞によってコードされるネオアンチゲンペプチドを提供する。
免疫系を利用して腫瘍に対する効果的な応答を生み出すことは、癌免疫療法の中心的な目標である。効果的な免疫応答の一部は、腫瘍抗原に特異的なＴリンパ球が関与する。Ｔ細胞の活性化には、主要組織適合分子（ＭＨＣ）および共刺激シグナルとの関連で提示されるＴＣＲ－コグネイトペプチドを発現する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、通例樹状細胞（ＤＣ）との相互作用が必要である。続いて、活性化Ｔ細胞は、悪性細胞を含むすべての細胞タイプによって提示されるペプチド－ＭＨＣ複合体を認識することができる。新生物はしばしば、腫瘍細胞と反応する浸潤性Ｔリンパ球を含有する。
しかしながら、腫瘍に対する免疫応答の効率は、腫瘍によって開発された様々な免疫抑制戦略によって著しく鈍化される。例えば、腫瘍細胞は、浸潤Ｔ細胞に阻害シグナルを提供する受容体を発現するか、または阻害サイトカインを分泌する。チェックポイント遮断療法の開発は、これらのメカニズムのいくつかをバイパスする手段を提供し、癌細胞のより効率的な殺傷をもたらす。このアプローチにより得られた有望な結果は、Ｔ細胞ベースの免疫療法の開発に新たな道を開くものであった。しかしながら、チェックポイント阻害剤は、少数の患者に有効であり、限られたタイプの癌にのみ有効である。
免疫療法における主な目標は、応答する患者の割合を増加させ、癌の適応症を拡大することである。ワクチン接種、抗腫瘍抗体の投与、または腫瘍抗原に特異的な免疫細胞の投与はすべて、抗腫瘍免疫応答を増加させるために提案されており、単独で、化学療法または放射線などの他の療法と共に、またはチェックポイントブロッカーとの併用療法として投与することができる。健康な組織を標的化することなく抗腫瘍免疫をトリガすることができる抗原の選択は、長年にわたる課題であった。
腫瘍ネオアンチゲンの検索は、主に、癌細胞に見られるような変異配列に焦点を当ててきた。これらの抗原は、患者それぞれに固有である。しかしながら、腫瘍抗原（腫瘍細胞で優先的に発現するもの）は、ワクチン接種の標的が乏しい（おそらくは中枢性トレランスのため）ことを表す自己抗原である。共有された真のネオアンチゲン（組織には存在しない）の同定は、当該分野にとって大きな課題である。
腫瘍における転位因子（ＴＥ）に関するいくつかの過去の報告には、以下が挙げられる。（Ｈｅｌｍａｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．）（Ｓｃｈｉａｖｅｔｔｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）。（Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｃｅｌｌ，Ｒｏｕｌｏｉｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｃｅｌｌ）。しかしながら、腫瘍細胞によって提示される抗原ランドスケープとＴＥとの関係は、詳細に研究されていない。
新しい腫瘍ネオアンチゲンが関心の対象となり、特にワクチン接種および養子細胞療法の場合、癌療法のコストを改善または削減し得る。
本開示は、少なくとも８アミノ酸を含む腫瘍ネオアンチゲンペプチドを提供し、該ネオアンチゲンペプチドは、転位因子（ＴＥ）配列およびエキソン配列を含む融合転写物配列からのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部によってコードされる。
典型的には、該ＯＲＦは、
－ ＴＥとエキソン配列との間の接合部と重複し、
－ 純粋なＴＥであり、および／または
－ 非標準であり得る。
本開示はまた、
－ 対象の癌細胞からのｍＲＮＡ配列のうち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、転位因子（ＴＥ）配列とエキソン配列とを含む融合転写物配列を同定する工程と、
－ 融合転写物配列の該ＯＲＦの一部によってコードされる、少なくとも８アミノ酸の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する工程と、を含む腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する方法を提供し、
該ＯＲＦが、ＴＥとエキソン配列との間の接合部と重複し、純粋なＴＥであり、および／または非標準であり、
該腫瘍ネオアンチゲンペプチドが、該対象の少なくとも一つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合する。
一実施形態では、腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、８または９アミノ酸長、特に８～１１アミノ酸長であり、少なくとも一つのＭＨＣクラスＩ分子に結合する。
別の実施形態では、腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、１３～２５アミノ酸長であり、該対象の少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。
本開示によれば、「ネオアンチゲンペプチド特性」には、以下が含まれる：
－ ＴＥ配列は、融合転写物配列の５’末端に位置してもよく、エキソン配列は、融合転写物配列の３’末端に位置してもよく、ネオアンチゲンペプチドをコードする該融合転写物配列のＯＲＦの部分は、接合部と重複してもよい；
－ ＴＥ配列は、融合転写物配列の５’末端に位置してもよく、エキソン配列は、融合転写物配列の３’末端に位置してもよく、該腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分は、オープンリーディングフレームが非標準であるように、接合部の下流に存在してもよい；
－ ＴＥ配列は、融合転写物配列の３’末端に位置してもよく、エキソン配列は、融合転写物配列の５’末端に位置してもよく、腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする該融合転写物配列のＯＲＦの部分は、接合部と重複してもよい；または
－ ＴＥ配列が、融合転写物配列の３’末端に位置し、エキソン配列が、キメラ転写物配列の５’末端に位置し、腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、エキソン配列とＴＥ配列との間の接合部の下流に存在し、任意選択的に、純粋なＴＥ配列によってコードされるペプチド配列は非標準である。
ＴＥ配列は、ＴＥクラスＩ：内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）および短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）、ならびにＭａＬＲ配列、またはクラスＩＩのＤＮＡトランスポゾンから選択することができる。
本開示はまた、本明細書に開示される方法によって取得可能なペプチドを包含する。
本開示はまた、少なくとも８アミノ酸を含み、配列番号１１８－１７４９２のいずれかの融合転写物のいずれか一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるネオアンチゲンペプチド、好ましくは、上述のネオアンチゲンペプチド特性のうちの一つまたは複数を有するペプチドを提供する。より具体的には、配列番号１～１１７のいずれかの少なくとも８アミノ酸を含むネオアンチゲンペプチドが本明細書に提供される。
該ネオアンチゲンペプチドは、典型的には、正常と比較して、腫瘍試料においてより高いレベルまたはより高い頻度で発現され、任意選択的に、該ネオアンチゲンペプチドは、正常な組織試料（すなわち、正常で健康な細胞）では発現されないか、または正常な健康な試料では検出可能に発現されない。
いくつかの実施形態では、該ネオアンチゲンペプチドは、癌を患う対象集団、特に肺癌、より具体的には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、さらにより具体的には、肺腺癌（ＬＵＡＤ）などの癌を患う対象集団の、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または少なくとも３０％の対象で発現される。
典型的には、ネオアンチゲンペプチドは、約１０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、または１０－９Ｍ（低い数ほど高い結合親和性を示す）未満の結合親和性ＫｄでＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに結合する。
典型的には、ネオアンチゲンペプチドは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０によって予測される２％未満のパーセンタイルランクスコアの結合親和性でＭＨＣクラスＩに結合する。
典型的には、ネオアンチゲンペプチドは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎＩＩ ３．２によって予測される１０％未満のパーセンタイルランクスコアの結合親和性でＭＨＣクラスＩＩに結合する。
本開示はまた、以下を包含する：
－ 本明細書に定義される一つまたは複数のペプチドでパルスされた、または本明細書に記述される一つまたは複数のペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた、自己樹状細胞または抗原提示細胞の集団と、
－ ワクチンまたは免疫原性組成物、特に滅菌ワクチンまたは免疫原性組成物であって、
ａ．本明細書に定義される一つまたは複数のネオアンチゲンペプチド、
ｂ．本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドであって、任意選択的に一つまたは複数のポリヌクレオチドが異種調節制御ヌクレオチド配列に連結されている、一つまたは複数のポリヌクレオチド、または
ｃ．本明細書に定義される一つまたは複数のペプチドでパルスまたはロードされた、自己樹状細胞または抗原提示細胞（特に人工ＡＰＣ）の集団を含む特異的なＴ細胞応答を、
任意選択的に、生理学的または薬理学的に許容可能な緩衝剤、担体、賦形剤、免疫刺激剤、および／またはアジュバントと組み合わせて上昇させることができる、ワクチンまたは免疫原性組成物と、
－ 本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドに対するその結合親和性について選択された抗体、またはその抗原結合断片、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはかかる抗体、その抗原結合断片、ＴＣＲもしくはＣＡＲを含む組成物と、
－ 典型的には、異種調節制御ヌクレオチド配列に動作可能に連結された、本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチド、抗体、ＣＡＲ、またはＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドをコードするベクター、またはかかるポリヌクレオチドもしくはベクターを含むワクチンもしくは免疫原性組成物と、
－ 本明細書に定義される一つまたは複数のネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫細胞、または免疫細胞集団であって、免疫細胞集団が、好ましくは、本明細書に開示される複数の異なる腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするか、または任意選択的に生理学的または薬理学的に許容可能な緩衝剤、担体、賦形剤、免疫刺激剤、および／またはアジュバントと組み合わせた、このような免疫細胞もしくは免疫細胞集団を含む組成物を標的とする、免疫細胞、または免疫細胞集団と、を包含する。
典型的には、抗体またはその抗原結合断片、ＴＣＲまたはＣＡＲは、任意選択的に、ＭＨＣ分子と関連して、約１０－６Ｍ以下のＫｄ親和性でネオアンチゲンペプチドに結合する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体を可溶性にし、Ｔ細胞抗原に向けられた抗体断片に融合させることができ、任意選択的に、標的抗原はＣＤ３またはＣＤ１６である。
いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも免疫細胞抗原をさらに標的とする多重特異性抗体であってもよく、任意選択的に、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞であり、任意選択的に、標的抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３０、またはＴＣＲである。抗体に関する実施形態のいずれにおいても、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒトであってもよく、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４であってもよい。
免疫細胞は、典型的には、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞、ＴＩＬ／腫瘍由来ＣＤ８ Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＭＡＩＴ、またはΥδＴ細胞であり得る。細胞はまた、自己由来または同種異系である場合もある。
Ｔ細胞は、本明細書に定義されるＴ細胞受容体およびキメラ抗原受容体から選択される組換え抗原受容体を含むことができ、抗原は、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲン受容体である。
本開示はまた、本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する抗体、ＴＣＲまたはＣＡＲを産生し、任意選択的に、ＭＨＣまたはＨＬＡ分子と関連して、任意選択的に、約１０－６Ｍ以下のＫｄ結合親和性で、本開示の腫瘍ネオアンチゲンペプチドに結合する抗体、ＴＣＲまたはＣＡＲを選択する工程を含む、方法を包含する。該方法によって選択される抗体、ＴＣＲ、およびＣＡＲも本出願の一部であり、したがって、本明細書の抗体、ＴＣＲ、またはＣＡＲに対する任意の言及も、該方法によって選択された抗体、ＴＣＲ、またはＣＡＲを意味する。
任意選択的に、異種調節制御配列に連結された、本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に定義される抗体、ＣＡＲ、またはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドも、本出願の一部である。
本開示によると、ネオアンチゲンペプチド、樹状細胞集団、ワクチンまたは免疫原性組成物、ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはベクターは、対象の癌ワクチン接種療法において、または癌に罹患しているもしくは癌のリスクがある対象において癌を治療するために使用することができ、または癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。典型的には、ペプチドは、該対象の少なくとも一つのＭＨＣ分子に結合する。
本開示によれば、本明細書に定義される抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗体、ＴＣＲ、ＣＡＲ、かかる抗体、ＴＣＲもしくはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはベクターは、それを必要とする対象、癌に罹患している、もしくは癌のリスクがある対象において癌を治療するために使用することができ、または癌細胞の増殖を阻害するために使用することができる。さらに本開示によると、本明細書に定義される免疫細胞集団は、癌に罹患している、または癌のリスクがある対象の細胞療法に使用され得るか、または癌細胞の増殖を阻害するために使用され得る。
特に、ネオアンチゲンペプチド、樹状細胞集団、ワクチンまたは免疫原性組成物、ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、抗体またはその抗原結合断片、多重特異性抗体、ＴＣＲ、ＣＡＲ、かかる抗体、ＴＣＲもしくはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、または免疫細胞集団（本明細書では「癌治療薬」と総称する）は、ＮＳＣＬＣに罹患している、またはＮＳＣＬＣに罹患するリスクがある対象の治療、および／またはＮＳＣＬＣの治療に使用される。
前述のいずれかを含み、任意選択的に、滅菌の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、および／または緩衝剤を含む医薬組成物も、それらを使用する方法と同様に企図される。
本明細書に記載されるいずれかの実施形態では、上記に定義される癌治療薬は、少なくとも一つのさらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。こうしたさらなる治療剤は、典型的には、化学療法剤、または免疫療法剤であり得る。
例えば、本開示によると、癌治療薬のいずれかは、抗免疫抑制／免疫賦活剤と組み合わせて投与することができる。例えば、対象は、典型的にはＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、Ｌａｇ－３阻害剤、Ｔｉｍ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）阻害剤、およびＣＴＬＡ－４阻害剤、またはＩＤＯ阻害剤から選択される一つまたは複数のチェックポイント阻害剤をさらに投与される。
本方法の様々な実施形態、ネオアンチゲンペプチド、および癌治療薬を、以下に詳述する。明確に言及された代替案を除いて、こうした実施形態の組み合わせは、本出願に包含される。
正常な組織における転位因子（ＴＥ）の発現は、胚発生の初期に確立されたＤＮＡメチル化によってサイレンシングされる。ヒストン修飾によって、追加の阻害層が提供される。ＴＥは、腫瘍細胞内で再活性化され得る。
発明者らは、ＴＥ配列の一部とエキソン配列の一部とを含む融合転写物配列によってコードされる腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する方法を開発した。
本開示による方法によって同定されたネオアンチゲン腫瘍特異的ペプチドは、免疫原性が高い。実際に、それらは、正常な細胞に存在しない融合転写物（転位因子、ＴＥ、およびエキソン配列からなる）に由来するため、本開示のペプチドは、非常に低い免疫寛容を呈することが期待される。
本開示はまた、患者集団間で共有腫瘍ネオエピトープを有するペプチドを選択することを可能にする。このような共有腫瘍ペプチドは、多数の患者の免疫療法に使用され得るため、治療的関心が高い。
定義
本開示によれば、用語「疾患」は、癌疾患、特に本明細書に記載される癌疾患の形態を含む、任意の病理学的状態を指す。
用語「正常」は、健康な状態または健康な対象もしくは組織における状態、すなわち、非病理学的状態を指し、ここで「健康な」は、非癌性を意味することが好ましい。
癌（医学用語：悪性新生物）は、細胞群が制御不能な増殖（正常範囲を超えた分裂）、浸潤（隣接組織への侵入および破壊）、ならびに時には転移（リンパまたは血液を介して体内の他の場所に広がる）を示す疾患の一種である。これら三つの悪性特性の癌は、自己限定的であり、浸潤または転移しない良性腫瘍と区別する。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、白血病のような一部の癌は形成しない。
悪性腫瘍は本質的に癌と同義である。悪性腫瘍（Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、悪性新生物、および悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）は、本質的に癌と同義である。
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」または「腫瘍疾患」は、細胞（新生細胞、発癌性細胞、または腫瘍細胞と呼ばれる）が異常増殖し、好ましくは腫れまたは病変を形成することを指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御不能な細胞増殖によって成長し、新しい成長を開始した刺激が止まった後も成長し続ける異常な細胞を意味する。腫瘍は、正常な組織との構造的構成および機能的連携の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性、または悪性のいずれかであり得る別個の組織の塊を形成する。
良性腫瘍は、癌の悪性特性の三つ全てを欠く腫瘍である。したがって、定義により、良性腫瘍は、無制限に侵襲的に増殖せず、周囲の組織に浸潤せず、隣接していない組織に広がらない（転移）。
新生物は、新生組織形成の結果としての異常な組織の塊である。新生組織形成（ギリシャ語で新たな成長）は、細胞の異常な増殖である。細胞の増殖が上回り、その周囲の正常組織の成長と協調していない。刺激の停止後も、同じように過剰な増殖が持続する。通常はしこりまたは腫瘍の原因となる。新生物は、良性、前悪性または悪性であり得る。
本開示による「腫瘍の成長」または「腫瘍成長」は、腫瘍がその大きさを増加させる傾向、および／または腫瘍細胞が増殖する傾向に関する。
本開示の目的のために、用語「癌」および「癌疾患」は、用語「腫瘍」および「腫瘍疾患」と互換的に使用される。
癌は、腫瘍に似ている細胞の種類、したがって、腫瘍の起源であると推定される組織によって分類される。これらはそれぞれ、組織型および部位である。
本出願によれば、癌は、以下の組織または器官のいずれか一つに影響を及ぼす可能性がある：乳房；肝臓；腎臓；心臓、縦隔、胸膜；口底；口唇；唾液腺；舌；歯茎；口腔；口蓋；扁桃腺；喉頭；気管；気管支、肺；咽頭、下咽頭、中咽頭、上咽頭；食道；胃、肝内胆管、胆道、膵臓、小腸、結腸などの消化器；直腸；膀胱、胆嚢、尿管などの泌尿器；直腸Ｓ状結腸移行部； 肛門、肛門管；皮膚；骨；関節、 手足の関節軟骨；眼および付属器；脳；末梢神経、自律神経系；脊髄、脳神経、髄膜；および中枢神経系の様々な部分；結合組織、皮下組織およびその他の軟組織；後腹膜、腹膜； 副腎；甲状腺；内分泌腺および関連構造；卵巣、子宮、子宮頸部などの女性生殖器；子宮体部、膣、外陰部；陰茎、精巣および前立腺などの男性生殖器；造血系および網内系；血液；リンパ節；胸腺。
したがって、本開示による用語「癌」は、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸の癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌、ならびにそれらの転移物を含む。その例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、または上述の癌種もしくは腫瘍の転移である。本開示による癌という用語は、癌転移および癌の再発も含む。
肺癌の主な種類は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。非小細胞肺癌には、扁平上皮細胞肺癌、肺腺癌（ＬＵＡＤ）、および大細胞肺癌の三つの主な亜型がある。腺癌は肺癌の約１０％を占める。この癌は通常、肺の末梢に見られ、小細胞肺癌および扁平上皮肺癌がどちらも中心に位置する傾向があるのとは対照的である。
「転移」とは、体の元の部位から別の部位への癌細胞の広がりを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外基質の浸潤、内皮基底膜を貫通して体腔および血管への侵入、次いで血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍、すなわち二次性腫瘍または転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移は、原発腫瘍の除去後も、腫瘍細胞または構成要素が残存し、転移能を発達させる可能性があるため、しばしば発生する。一実施形態では、本開示による用語「転移」は、原発腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
二次性または転移性腫瘍の細胞は、元の腫瘍の細胞と似ている。これは、例えば、卵巣癌が肝臓に転移する場合、二次腫瘍は、異常な肝細胞ではなく、異常な卵巣細胞から構成されることを意味する。次いで、肝臓の腫瘍は、肝臓癌ではなく、転移性卵巣癌と呼ばれる。
再発または再燃は、患者が過去に罹患した状態に再び罹患した時に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患し、当該疾患の治療に成功し、当該疾患を再び発症した場合、当該新たに発症した疾患は、再発または再燃とみなされ得る。しかしながら、本開示によると、腫瘍疾患の再発または再燃は、元の腫瘍疾患の部位で発生する場合があるが、必ずしも発生するとは限らない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍に罹患し、治療が成功した場合、再発または再燃は、卵巣腫瘍の発生、または卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生である可能性がある。腫瘍の再発または再燃はまた、腫瘍が、元の腫瘍の部位だけでなく、元の腫瘍の部位とは異なる部位で発生する状況も含む。好ましくは、患者が治療を受けている元の腫瘍は原発腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は二次性または転移性腫瘍である。
「治療」とは、対象の腫瘍のサイズまたは腫瘍の数を減少させること；対象の疾患を停止または遅延させること；対象の新たな疾患の発症を阻害または遅延させること；現在疾患を有するか、または以前に疾患を有していた対象の症状および／または再燃の頻度または重症度を低減させること；および／または延長すること、すなわち、対象の寿命を延ばすことを含む、疾患を予防または除去するために、本明細書に記載される化合物または組成物を対象に投与することを意味する。特に、「疾患の治療」という用語は、疾患またはその症状の治癒、期間の短縮、改善、予防、進行もしくは悪化の遅延もしくは阻害、または発症の予防もしくは遅延を含む。
「リスクがある」とは、一般集団と比較して、疾患、特に癌を発症する可能性が通常よりも高いと識別される対象、すなわち患者を意味する。さらに、疾患、特に癌に罹患したことがある、または現在罹患している対象は、疾患を発症するリスクが高い対象であり、そのような対象は疾患を発症し続ける場合がある。癌に罹患している、または罹患したことがある対象は、癌転移のリスクが高くなる。
本明細書に記載される治療活性剤、ワクチン、および組成物は、注射または注入を含む任意の従来的経路を介して投与され得る。
本明細書に記載される薬剤は、有効量で投与される。「有効量」は、所望の反応または所望の効果を、単独で、またはさらなる用量と共に、またはさらなる治療剤と共に達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断または逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、該疾患または該状態の発症の遅延または発症の予防であってもよい。
本明細書に記載の薬剤の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、身長および体重、治療期間、付随する療法の種類（存在する場合）、特定の投与経路および類似の因子を含む、患者の個々のパラメータに依存する。したがって、本明細書に記載の薬剤の投与量は、こうした様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的に高い用量）が使用されてもよい。
本明細書に記載される医薬組成物は、好ましくは滅菌され、有効量の治療活性物質を含有して、所望の反応または所望の効果を生成する。
本明細書に記載される医薬組成物は、概して、薬学的に適合性のある量で、かつ薬学的に適合性のある調製物で投与される。用語「薬学的に適合性のある」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質を指す。この種の調製物は、通常、塩、緩衝物質、保存剤、担体、アジュバントなどの免疫強化物質を補足するもの、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＲＮＡ、ならびに適切な場合には他の治療活性化合物を含有し得る。医薬で使用される場合、塩は薬学的に適合性があるべきである。
本出願では、用語「融合転写物」または「キメラ転写物」は、同義語として無差別に使用される。本開示による「融合またはキメラ」「転写物または配列」は、部分的にエキソン配列と、部分的に転位因子（ＴＥ）配列と整列し、正規化された読み取り数が２．１０－６より大きい転写物として定義される。正規化された読み取り数は、融合をカバーする読み取り数を試料のライブラリサイズで割ったものとして定義される。
本明細書で使用される場合、具体的に記載または文脈から明白でない限り、用語「約」は、当技術分野の正常な許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内であると理解されるべきである。約は、記載値の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解され得る。文脈から明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語によって修正される。
「転位因子」は、クラスＩ（ＬＴＲ、ＬＩＮＥ、およびＳＩＮＥを含有するものを含むレトロトランスポゾン）と、クラスＩＩ（ＤＮＡトランスポゾン）の両方が、内在的にゲノムの一部である（すなわち、感染によるものではない）と理解されるべきである。これには、両方のクラスの自律要素と非自律要素の両方が含まれる。本開示によると、ＴＥ配列は、例えば、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）、長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）および短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）、および哺乳類末端反復配列トランスポゾン（ＭａＬＲ）を含むレトロトランスポゾンなどのクラスＩのＴＥ、ならびに内在的にゲノムの一部であるＤＮＡトランスポゾンなどのクラスＩＩのＴＥから選択され得る。
リーディングフレームは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子内のヌクレオチドの配列を、連続した重複しない三連セットに分割する方法である。
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ペプチドに翻訳される能力を有するリーディングフレームの一部である。ＯＲＦは、転写開始部位（ＴＳＳ）の開始コドン（例えば、ＡＵＧ）と終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）を含有する連続したコドンである。ＯＲＦ内のＡＴＧコドン（必ずしも最初ではない）は、翻訳がどこで始まるかを示し得る。転写終結部位は、ＯＲＦの後、翻訳終止コドンを超えて位置する。複数のエキソンを有する真核生物遺伝子では、ＯＲＦはイントロン／エキソン領域にまたがり、ＯＲＦの転写後に一緒にスプライシングされて、タンパク質翻訳のための最終的なｍＲＮＡを産生し得る。
本明細書に意図されるように、「標準ＯＲＦ」は、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノム／トランスクリプトーム／プロテオームデータベースコレクション（典型的にはＨＧ１９）などのデータベースに記載または注釈されているｍＲＮＡ配列内の特定のリーディングフレームを有するタンパク質コード配列である。典型的には、標準ＯＲＦは、正常で健康な細胞のエキソンの一つと同じである。
本明細書に意図されるように、「非標準ＯＲＦ」は、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノム／トランスクリプトーム／プロテオームデータベースなどのゲノムデータベースに記載されていない（すなわち注釈されていない）ｍＲＮＡ配列内の特定のリーディングフレームを有するタンパク質コード配列である。典型的には、非標準ＯＲＦは、したがって、正常で健康な細胞におけるエキソンの通常のリーディングフレームと比較して、リーディングフレームがシフトしていることを意味する。しかしながら、いくつかの実施形態では、非標準をゲノムデータベース（例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース）に記載することができるが、ｍＲＮＡ配列は、正常細胞においてマイナーな種を表す。マイナーな種は、典型的には、正常細胞中５％未満、特に２％未満、または優先的に１％未満の種を意図する。
エキソンは、ＲＮＡスプライシングによってイントロンが除去された後、その遺伝子によって産生される最終的な成熟ＲＮＡの一部をコードする遺伝子の任意の部分である。エキソンという用語は、遺伝子内のＤＮＡ配列と、ＲＮＡ転写物の対応する配列の両方を指す。ＲＮＡスプライシングでは、成熟メッセンジャーＲＮＡを生成する一部分として、イントロンが除去され、エキソンが互いに共有結合される。本出願人によるエキソン配列は、一つまたは複数のエキソンの少なくとも一部を含む。典型的には、エキソン配列は、一つまたは２つのエキソンの少なくとも一部を含む。
したがって、スプライシング後の成熟ＲＮＡ中に存在する３’末端および５’末端（３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲ）の非翻訳配列は、エキソン配列であるが、これらの配列は、翻訳（５’ＵＴＲ）の開始コドンの上流または翻訳（３’ＵＴＲ）を終了する終止コドンの下流に位置するため、非コード配列である。
用語「ペプチドまたはポリペプチド」は、本明細書中の「ネオアンチゲンペプチドまたはポリペプチド」と互換的に使用され、典型的には、隣接するアミノ酸のα－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基、典型的にはＬ－アミノ酸を示す。ポリペプチドまたはペプチドは、その中性（非荷電）形態、または塩の形態のいずれかで、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含有しないか、またはこれらの修飾を含有するかのいずれかで、様々な長さであってもよいが、修飾は、本明細書に記載されるポリペプチドの生物学的活性を破壊しないことを条件とする。
「参照ゲノム」、または「代表ゲノム」は、遺伝子の種セットの代表例として科学者によって組み立てられた、デジタル核酸配列データベースである。参照ゲノムは、多数のドナーからのＤＮＡの配列決定から組み立てられることが多いため、任意の単一の個体（動物またはヒト）の遺伝子のセットを正確には表さない。代わりに、参照は、各ドナーからの異なるＤＮＡ配列の半数体モザイクを提供する。
腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する方法
本開示による腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する方法は、
－ 対象の癌細胞試料由来のｍＲＮＡ配列の中から、転位因子（ＴＥ）配列およびエキソン配列を含み、かつオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、融合転写物配列を特定する工程と、
－ 融合転写物配列の該ＯＲＦの一部によってコードされる、少なくとも８アミノ酸の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する工程と、を含み、
該ＯＲＦが、ＴＥとエキソン配列との間の接合部と重複し、純粋なＴＥであり、および／または非標準であり、
該腫瘍ネオアンチゲンペプチドが、該対象の少なくとも一つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合する。
典型的には、エキソン配列の非標準ＯＲＦの一部から翻訳されたペプチドは、免疫系によって非自己として認識される。
いくつかの実施形態では、エキソン配列は、発癌遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子、ならびにそれらの変異バリアント由来である。
概念上、癌は連続的な体細胞変異の蓄積の結果である。多くの研究は、発癌遺伝子における機能獲得と腫瘍抑制因子遺伝子における機能喪失の両方が、正常細胞からの癌の発生に必要であることを示している。二倍体生物の場合、機能獲得変異は、多くの場合、優性または半優性であるのに対し、機能喪失変異は通常劣性である。発癌の２ヒット仮説は、腫瘍抑制因子遺伝子の両方の対立遺伝子の喪失によって癌の発生が開始することを示唆する。
発癌遺伝子（癌遺伝子とも呼ばれる）は、その作用が細胞増殖または成長を積極的に促進する遺伝子である。正常な非変異型は、癌原遺伝子として知られている。変異型は、過剰にまたは不適切に活性化され、腫瘍成長をもたらす。発癌遺伝子は、癌遺伝子マーカーデータベース（ＣＧＭＤ） （Ｐｒａｄｅｅｐｋｉｒａｎ，Ｊ．，Ｓａｉｎａｔｈ，Ｓ．，Ｋｒａｍｔｈｉ Ｋｕｍａｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．ＣＧＭＤ：。Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１２０３５ （２０１５） “Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒ”）で特定できる。発癌遺伝子（ＯＮＣ）はまた、癌遺伝子ネットワークデータベース（ＮＣＧ ５．０）（Ａｎ Ｏ、Ｄａｌｌ’Ｏｌｉｏ ＧＭ、Ｍｏｕｒｉｋｉｓ ＴＰ、Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ ＦＤ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊａｎ ４； ４４（Ｄ１）：Ｄ９９２－９； “ＮＣＧ ５．０：ｕｐｄａｔｅｓ ｏｆ ａ ｍａｎｕａｌｌｙ ｃｕｌａｔｅｄ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓ ”）からダウンロードできる。発癌遺伝子の非限定的な例には、以下が含まれる：Ｌ－ＭＹＣ、ＬＹＬ－１、ＬＹＴ－１０、ＬＹＴ－１０／Ｃα１、ＭＡＳ、ＭＤＭ－２、ＭＬＬ、ＭＯＳ、ＭＴＧ８／ＡＭＬ１、ＭＹＢ、ＭＹＨ１１／ＣＢＦＢ、ＮＥＵ、Ｎ－ＭＹＣ、ＯＳＴ、ＰＡＸ－５、ＰＢＸ１／Ｅ２Ａ、ＰＩＭ－１、ＰＲＡＤ－１、ＲＡＦ、ＲＡＲ／ＰＭＬ、ＲＡＳ－Ｈ、ＲＡＳ－Ｋ、ＲＡＳ－Ｎ、ＲＥＬ／ＮＲＧ、ＲＥＴ、ＲＨＯＭ１、ＲＨＯＭ２、ＲＯＳ、ＳＫＩ、ＳＩＳ、ＳＥＴ／ＣＡＮ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＡＮ－１、ＴＩＡＭ１、ＴＳＣ２、およびＴＲＫ。
腫瘍抑制遺伝子（抗発癌遺伝子とも呼ばれる）は、細胞増殖制御の反対を表し、通常、細胞増殖および腫瘍発生を阻害するように作用する。したがって、腫瘍抑制遺伝子は、通常、細胞分裂または増殖を抑制する遺伝子である。ＴＳＧ機能の喪失は、制御不能な細胞分裂および腫瘍成長を促進する。Ｒｂは、転写調節タンパク質をコードする網膜芽細胞腫の遺伝子解析によって識別された腫瘍抑制遺伝子であり、多くの異なるヒトの癌の発生に寄与する追加の腫瘍抑制遺伝子の同定のためのプロトタイプとして機能した。腫瘍抑制遺伝子は、特に、“Ｃｏｏｐｅｒ ＧＭ．Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ．２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ （ＭＡ）：Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； ２０００．Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｇｅｎｅｓ”に記載される。腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）は、腫瘍抑制遺伝子データベース（ＴＳＧｅｎｅ ２．０）からダウンロードすることもできる（Ｚｈａｏ Ｍ、Ｋｉｍ Ｐ、Ｍｉｔｒａ Ｒ、Ｚｈａｏ Ｊ、Ｚｈａｏ Ｚ； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊａｎ ４； ４４（Ｄ１）：Ｄ１０２３－３１； “ＴＳＧｅｎｅ ２．０：ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｐａｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ”を参照されたい）。この文脈において、腫瘍抑制遺伝子の非限定的な例としては以下が挙げられる：ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＤＰＣ４、ＩＮＫ４、ＭＡＤＲ２、ＮＦ１、ＮＦ２、ｐ５３、ＰＴＣ、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＢＵＢ１、ＢＵＢＲ１、ＴＧＦ－βＲＩＩ、Ａｘｉｎ、ＤＰＣ４、ｐ３００、ＰＰＡＲγ、ｐ１６、ＤＰＣ４、ＰＴＥＮ、およびｈＳＮＦ５。
発癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または「二重スパイ」遺伝子（発癌性および腫瘍抑制機能の両方を有する）は、データベース検索およびテキストマイニングを介して体系的に特定することができる。実際に、発癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に関する情報は、典型的には、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース中に見出すことができる（しかしまた、Ｓｈｅｎ Ｌ，Ｓｈｉ Ｑ，Ｗａｎｇ Ｗ．Ｄｏｕｂｌｅ ａｇｅｎｔｓ：ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｂｏｔｈ ｏｎ ｃｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ．２０１８；７（３）：２５．２０１８年３月１３日公開も参照のこと）。二重スパイ遺伝子は、上述の二つのデータベース間で重複した遺伝子として特定され得る（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ２０１８を参照されたい）。
本発明者らは、いかなる理論にも縛られることなく、エキソン配列が発癌遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子に由来する融合の選択が、以下の理由により関連性が高いと考えている。
発癌遺伝子へのＴＥ挿入は、それらの発癌活性を変化させることができる。したがって、発癌遺伝子の活性ドメインへのＴＥ配列の挿入は、ドライバー変異と同様に、発癌遺伝子の構成的な活性をもたらす可能性がある。したがって、キメラ発癌遺伝子を与えるこれらの融合は、発癌性タンパク質の新しいファミリーを表すことができる。この場合、これらの新しい「融合発癌遺伝子」の活性を小分子拮抗薬を用いて標的化することは、これらのキメラ発癌遺伝子が発現する癌に対する潜在的な治療アプローチを表すことができる。
腫瘍抑制因子におけるＴＥ挿入は、その抑制機能を不活化し、典型的には機能喪失（例えば、終止コドンの導入、ＯＲＦの変化、または破壊的アミノ酸の伸長を通して）をもたらし、それにより発癌過程に寄与する可能性がある。
癌ドライバー遺伝子に関与する融合は、養子細胞療法、抗体、ＡＤＣ、Ｔ細胞エンゲイジャーなどの優れた標的となるであろう。それらが発癌に関与する場合、融合発癌遺伝子は、癌細胞に対してより特異的であり、したがって、（標的の発癌活性のため）耐性の発生を減少させることが予期される。
一実施形態では、接合部に対して、ＴＥ配列は、融合転写物配列の５’末端に位置し（ＴＥ配列はドナー配列であるとも言われている）、エキソン配列は、融合転写物配列の３’末端に位置する（エキソン配列は、したがって、アクセプター配列と呼ばれる）。表現「融合転写物配列の５’末端に位置する」は、要素が融合転写物配列の接合部の上流に位置することを意味する。表現「融合転写物配列の３’末端に位置する」は、要素が融合転写物配列の接合部の下流に位置することを意味する。
特定の実施形態では、ＴＥ配列は、融合転写物配列の５’末端に位置し、エキソン配列は、融合転写物配列の３’末端に位置し、ネオアンチゲンペプチドをコードする該融合転写物配列のＯＲＦの部分は、接合部と重複する。この場合、ＯＲＦは、標準または非標準であり得る。ＯＲＦは接合部を含んでもよいが、ネオアンチゲンペプチドは接合部を含む必要がないことが理解される。いくつかの実施形態では、ネオアンチゲンペプチドが接合部を含む場合、得られたペプチドは、ＴＥ配列およびエキソン配列の両方によってコードされる。
表現「ＯＲＦの部分が、ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部と重複しているまたは重複する」は、該接合部が、該ネオアンチゲンペプチドをコードする融合転写物配列のＯＲＦの部分に含有されていることを意味する。
（ｉ）ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部と重複し、かつ（ｉｉ）ＴＥ配列およびエキソン配列が、融合転写物配列の５’末端および３’末端にそれぞれある実施形態では、ＯＲＦの該部分が、典型的には、ＴＥ配列から少なくとも１～６アミノ酸、特に２～６アミノ酸、およびエキソン配列から少なくとも１～６アミノ酸、特に２～６アミノ酸を含む、少なくとも８アミノ酸のネオアンチゲンペプチドをコードする。
ＴＥ配列が、融合転写物配列の５’末端に位置し、エキソン配列が、融合転写物配列の３’末端に位置する別の実施形態では、該ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分は、接合部の下流にあり、ＯＲＦはしたがって非標準である。
表現「ＯＲＦの部分は、接合部の下流にある」は、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、接合部と重複していないことを意味するが、それは接合部に対して、該融合転写物配列の３’末端部分に含有されている。この実施形態では、接合部に対する３’末端部分がエキソン配列であるため、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分は、ゆえにエキソン配列中に含有される。したがって、ＯＲＦの部分はエキソン配列にのみに位置するため、得られたペプチドは、非標準ＯＲＦのエキソン配列によってコードされる。したがって、エキソン配列が、接合部に対して、融合転写物配列の３’末端に位置し、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、非標準リーディングフレームを有する接合部の下流にある特定の実施形態では、融合転写物配列のＯＲＦの部分は、ＴＥ配列からの０アミノ酸、およびエキソン配列からの少なくとも８アミノ酸を含むネオアンチゲンペプチドをコードする。
別の実施形態では、接合部に対して、ＴＥ配列は融合転写物配列の３’末端に位置し、エキソン配列は融合転写物配列の５’末端に位置する。
いくつかの実施形態では、ＴＥ配列は、融合転写物配列の３’末端に位置し、エキソン配列は、融合転写物配列の５’末端に位置し、ネオアンチゲンペプチドをコードする該融合転写物配列のＯＲＦの部分は、ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部と重複している。この場合、ＯＲＦはまた、標準または非標準であってもよい。得られたペプチドは、ＴＥ配列およびエキソン配列の両方によってコードされる。
ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、エキソン配列とＴＥ配列との間の接合部と重複し、かつエキソン配列およびＴＥ配列が、融合転写物配列の５’末端および３’末端にそれぞれある特定の実施形態では、ＯＲＦの該部分が、ＴＥ配列から少なくとも１～６アミノ酸、特に２～６アミノ酸、およびエキソン配列から少なくとも１～６アミノ酸、特に２～６アミノ酸を含む、少なくとも８アミノ酸のネオアンチゲンペプチドをコードする。
さらに別の実施形態では、ＴＥ配列は、融合転写物配列の３’末端に位置し、エキソン配列は、融合転写物配列の５’末端に位置し、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分は、エキソン配列とＴＥ配列との間の接合部の下流にある。任意で、純粋なＴＥ配列によってこのようにコードされるペプチド配列は、非標準である。
この実施形態では、接合部に対する３’末端部分がＴＥ配列であるため、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分は、ゆえにＴＥ配列によってコードされる。したがって、ＯＲＦの部分は、エキソン配列からのアミノ酸を含まず、ＴＥ配列からの少なくとも８アミノ酸を含むネオアンチゲンペプチドをコードする。ＴＥ配列が、接合部に対して、融合転写物配列の３’末端に位置し、ネオアンチゲンペプチドをコードするＯＲＦの部分が、接合部の下流にある特定の実施形態では、融合転写物配列のＯＲＦの部分は、エキソン配列からの０アミノ酸、およびＴＥ配列からの少なくとも８アミノ酸を含むネオアンチゲンペプチドをコードする。
腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、体細胞の変化（古典的にはＤＮＡ配列の変異）から生じ、自己とは異なるものとして認識され、樹状細胞（ＤＣ）および腫瘍細胞自体などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示されるペプチドである。ＡＰＣは、外因性抗原をファゴソームからサイトゾルに移動させ、プロテアソームによる主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）エピトープへのタンパク質分解切断を行うことができるため、交差提示は重要な役割を果たしている。
本開示では、変化は、転位因子（ＴＥ）配列およびエキソン配列を含む融合ｍＲＮＡ配列の転写に対応する。これは、体細胞（すなわち、具体的には、腫瘍クローン内）転位から生じる場合がある。また、デノボ転位からではなく、ＴＥおよび近くの遺伝子が共転写されるような腫瘍特異的な転写脱抑制から生じ得る。
本開示によるネオアンチゲンペプチドは、正常な健康試料（すなわち、正常な健康試料では発現されない）に完全に存在せず、ゆえに腫瘍試料に特異的であり得る。あるいは、正常細胞において低レベルで発現されてもよく、および／または正常（健康な）試料と比較して、腫瘍試料上に偏って発現されてもよい。
また、癌が発生した細胞系統によって選択的に発現され得る。
本開示による癌または腫瘍試料は、以前に定義された組織または器官のいずれかの任意の固形腫瘍または非固形腫瘍、例えば、乳癌、肺癌、および／または黒色腫などから単離され得る。いくつかの実施形態では、癌試料は、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳管癌、乳腺小葉癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、腎臓色素嫌性癌、腎臓明細胞癌、腎臓乳頭細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、傍神経節腫および褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞癌、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌またはブドウ膜黒色腫試料由来である。特定の実施形態では、癌試料は、肺癌試料、特にＬＵＡＤ試料由来のものである。
典型的には、本開示によると、該融合転写物配列を特定する工程は、参照ゲノムに対して癌試料からのｍＲＮＡ配列をマッピングし、その後、正常接合部と異常接合部を区別することによって実施される。
本開示によると、正常な接合部は、同じ鎖上にあり、離れすぎていない（例えば、異なる染色体上にない）接合部ドナーおよび受容体に対応する。
本開示によると、異常な接合部は、異なる染色体上の、またはシスではあるが異なる鎖上の（順序および５’－３’のセンスに関係なく）ドナー配列とアクセプター配列との間の接合部に対応する。
一実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、例えば、以下のような適応されたソフトウェアで、対応する参照ゲノムに対してマッピングされ得る：Ｓｐｌｉｃｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （すなわち：ＳＴＡＲ － Ｄｏｂｉｎ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．“ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．” Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ） ｖｏｌ．２９，１ （２０１３）：１５－２１を参照）、ＴｏｐＨａｔ２ （Ｋｉｍ，Ｄａｅｈｗａｎ ｅｔ ａｌ．“ＴｏｐＨａｔ２：ａｃｃｕｒａｔｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ，ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．” Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１４，４ Ｒ３６．２５ Ａｐｒ．２０１３，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｇｂ－２０１３－１４－４－ｒ３６） または ＨＩＳＡＴ （Ｋｉｍ，Ｄａｅｈｗａｎ ｅｔ ａｌ．“ＨＩＳＡＴ：ａ ｆａｓｔ ｓｐｌｉｃｅｄ ａｌｉｇｎｅｒ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．” Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ．１２，４ （２０１５）：３５７－６０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３３１７）。ＳＴＡＲは、逐次最大マッピング可能なシード検索、続いてシードクラスタリングおよびステッチングを使用して、ＲＮＡ－ｓｅｑリードを整列させるスタンドアロンソフトウェアである。標準接合部、非標準スプライス、および融合／キメラ転写物を検出することができる。
特定の実施形態では、正常および異常な接合部は、例えば、ＥｎｓｅｍｂｌおよびＲｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒデータベースなどの専用データベースを使用してインシリコで決定され、ＴＥとエキソン配列との間に接合部を有する融合転写物は、インシリコで抽出される。
本開示によると、ｍＲＮＡ配列は、全てのタイプの癌細胞または腫瘍細胞試料に由来することができる。腫瘍は、固形腫瘍または非固形腫瘍であってもよい。特に、ｍＲＮＡ配列は、以前に定義された癌または腫瘍、例えば、乳癌、肺癌、および／または黒色腫などによって影響を受ける任意の組織または器官に由来する。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、ＬＵＡＤ試料由来である。
典型的には、本開示によると、融合転写物配列は、１％超、特に５％超、１０％超、１５％超、２０％超、またはさらには２５％超の癌試料で共有される。言い換えれば、本開示による融合転写物配列は、１％超、特に５％超、１０％超、１５％超、２０％超、またはさらには２５％超の癌に罹患している対象の癌試料で共有される。したがって、融合転写物配列は、いくつかの癌間で共有される癌種に特異的であり得る。
本開示によると、融合転写物配列は、正常で健康な細胞と比較して、腫瘍細胞において高いレベルで発現される。いくつかの実施形態では、融合転写物配列は、癌細胞で発現し、健康な細胞では発現せず、特に胸腺の健康な細胞では発現しない。かかる融合転写物は、本開示による腫瘍特異的融合と呼ばれ得る。正常細胞と比較して腫瘍細胞においてより高いレベルで発現する融合転写物、典型的には上記に定義されるように、正常細胞と比較して癌細胞において不均衡に発現する融合転写物は、本開示による腫瘍関連融合転写物（ＴＡＦ）と呼ばれ得る。腫瘍関連融合転写物は、腫瘍試料の１０％超および正常試料の２０％未満で存在する場合、本出願に従って選択され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、任意選択的にインシリコで、またはインビトロ技術（特に例示の実施例を参照）を使用して、癌に罹患している該対象の少なくとも一つのＭＨＣ分子と腫瘍ネオアンチゲンペプチドの結合親和性を決定する工程をさらに含む。
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、身体のほとんどの有核細胞に機能的な受容体を形成する。ＨＬＡには３つの主働ＭＨＣクラスＩ遺伝子：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃと、三つの微働遺伝子ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇがある。β２－ミクログロブリンは、主働および微働遺伝子サブユニットと結合して、ヘテロ二量体を産生する。クラスＩのＭＨＣ分子は、重鎖および軽鎖からなり、約８～１１アミノ酸、通常は８または９アミノ酸のペプチドを結合することができ、このペプチドが適切な結合モチーフを有する場合、それを細胞傷害性Ｔ－リンパ球に提示することができる。ペプチドの結合は、ペプチド主鎖の原子と、すべてのＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝にある不変部位との間の接触によって、その両端で安定化される。ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に結合する溝の両端に不変部位がある。ペプチドの長の変化は、多くの場合、必要とされる柔軟性を可能にするプロリン残基またはグリシン残基でのペプチド骨格のねじれによって調整される。クラスＩのＭＨＣ分子によって結合されるペプチドは、通常、内因性タンパク質抗原に由来する。一例として、クラスＩのＭＨＣ分子の重鎖は、ヒトにおいて、典型的には、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃモノマーであり、軽鎖は、 β－２－ミクログロブリンである。
ＨＬＡによってコードされる３つの主要ＭＨＣクラスＩＩタンパク質と２つの微量ＭＨＣクラスＩＩタンパク質がある。クラスＩＩの遺伝子は結合して、典型的には抗原提示細胞の表面に発現するヘテロ二量体（αβ）タンパク質受容体を形成する。クラスＩＩのＭＨＣ分子によって結合されるペプチドは、通常、細胞外または外因性タンパク質抗原に由来する。一例として、α－鎖およびβ－鎖は、ヒトでは、特にＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＰモノマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、約８～２０アミノ酸のペプチド、特に１０～２５、またはこのペプチドが適切な結合モチーフを有する場合、１３～２５アミノ酸を結合し、それをＴ－ヘルパー細胞に提示することができる。これらのペプチドは、（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝とは異なり）両端が開いているＭＨＣ ＩＩペプチド結合溝に沿って拡張された構造にある。ペプチドは、主鎖原子が主にペプチド結合溝に並ぶ保存された残基と接触することにより、定位置に保持される。
本方法がヒト試料で実施されるとき、本方法は、患者のクラスＩまたはクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ、別名ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子）を決定する工程を含み得る。実験用マウスのＭＨＣ対立遺伝子は一般的に知られているため、この工程が特定の状況において必要ない場合があることに留意されたい。本出願では、「ＭＨＣ分子」は、少なくとも一つのＭＨＣクラスＩ分子または少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。
ＭＨＣ対立遺伝子データベースは、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩの公知の配列を分析し、各ドメインの対立遺伝子の変異性を決定することによって実施される。これは、典型的には、当該分野で周知の適切なソフトウェアアルゴリズムを使用してインシリコで決定することができる。ＯｐｔｉＴｙｐｅ、Ｐｏｌｙｓｏｌｖｅｒ、ＰＨＬＡＴ、ＨＬＡｒｅｐｏｒｔｅｒ、ＨＬＡｆｏｒｅｓｔ、ＨＬＡｍｉｎｅｒ、およびｓｅｑ２ＨＬＡ（Ｋｉｙｏｔａｎｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｗａｉｍｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｅｏ ａｎｔｉｇｅｎｓ； Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８；１０９：５４２－５４９を参照）など、ゲノムワイド配列決定データ（全エキソーム、全ゲノム、およびＲＮＡ配列決定データ）からＨＬＡ対立遺伝子情報を取得するためのいくつかのツールが開発されている。例えば、本明細書に開示されるような本方法を実施するために良好に設計されたｓｅｑ２ｈｌａツール（Ｂｏｅｇｅｌ Ｓ，Ｌｏｗｅｒ Ｍ，Ｓｃｈａｆｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＨＬＡ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．２０１２；４：１０２を参照）は、ｐｙｔｈｏｎおよびＲで記述されたインシリコ法であり、ｆａｓｔｑ形式の標準的なＲＮＡ－Ｓｅｑ配列読み取りを入力として受け取り、すべてのＨＬＡ対立遺伝子を含むボウタイインデックス（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２００９，１０：Ｒ２５－１０．１１８６／ｇｂ－２００９－１０－３－ｒ２５）を使用して、最も可能性の高いＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子型（４桁の解像度）、各呼び出しのｐ値、および各クラスの発現を出力する。
典型的には、ＴＥとエキソン配列との間の接合部を有する配列は、インシリコで抽出される。患者（またはマウス）からの各ＭＨＣ対立遺伝子に対する、各配列によってコードされる全ての可能なペプチドの親和性は、例えば、ＨＬＡ分子へのペプチド結合親和性を予測するための計算方法を使用してインシリコで決定され得る。実際に、正確な予測アプローチは、予測されたＩＣ５０を用いた人工ニューラルネットワークに基づく。例えば、リガンドが報告されていない対立遺伝子に結合するペプチドを予測するためにＮｅｔＭＨＣから改変されたＮｅｔＭＨＣｐａｎソフトウェアは、本明細書に開示される方法を実施するのに十分適切である（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＮｅｔＭＨＣ－３．０：ａｃｃｕｒａｔｅ ｗｅｂ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｍｏｎｋｅｙ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｌｅｎｇｔｈ ８－１１； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８；３６：Ｗ５０９－Ｗ５１２； Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．ＮｅｔＭＨＣｐａｎ，ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｎｙ ＨＬＡ－Ａ ａｎｄ －Ｂ ｌｏｃｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００７；２：ｅ７９６、しかしＫｉｙｏｔａｎｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ； Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８； １０９：５４２－５４９ ａｎｄ Ｙａｒｃｈｏａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｒｅｖ．ｃａｎｃｅｒ ２０１７； １７（４）：２０９－２２２も参照のこと）。ＮｅｔＭＨＣｐａｎソフトウェアは、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）を使用して、公知の配列の任意のＭＨＣ分子へのペプチドの結合を予測する。本方法は、１８０，０００を超える定量的結合データと、ＭＳ由来ＭＨＣ溶出リガンドの組み合わせに向けられている。結合親和性データは、ヒト（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）、マウス（Ｈ－２）、ウシ（ＢｏＬＡ）、霊長類（Ｐａｔｒ、Ｍａｍｕ、ＧＯＧＯ）およびブタ（ＳＬＡ）からの１７２のＭＨＣ分子を対象としている。ＭＳ溶出リガンドデータは、５５のＨＬＡおよびマウス対立遺伝子を対象としている。
例示的な実施形態では、上述の融合転写物によってコードされるネオアンチゲンペプチド、およびＭＨＣ対立遺伝子に対する予測ペプチドのＫｄ親和性が、１０－４、１０－５、１０－６、１０－７Ｍ未満、または５００ｎＭ未満、特に５０ｎＭ未満のものが、腫瘍ネオアンチゲンペプチドとして選択される。
上述のように、ＭＨＣ対立遺伝子に対する選択されたペプチドの親和性は、ｎｅｔＭＨＣｐａｎなどの適切なソフトウェアを使用してインシリコで決定することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ネオアンチゲンペプチドは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ４．０によって予測される２％未満のパーセンタイルランクスコアの結合親和性でＭＨＣクラスＩに結合する。他の実施形態では、ネオアンチゲンペプチドは、ＮｅｔＭＨＣｐａｎＩＩ ３．２によって予測される１０％未満のパーセンタイルランクスコアの結合親和性でＭＨＣクラスＩＩに結合する。
親和性はまた、（代替的にまたは追加的に）インビトロで、例えば、その中に含まれる結果に記載されているようなＭＨＣ四量体形成アッセイを使用して推定することができる（実施例２、ポイント２．１および２．２．２を参照）。例えばＩｍｍｕｎＡｗａｒｅ（登録商標）からの市販のアッセイは、典型的には、当業者によって使用され得る（ＥａｓＹｍｅｒｓ（登録商標）キットは、ＩｍｍｕｎＡｗａｒｅ（登録商標）からのもので、それらのトレーニングガイドに従って特に使用される）。典型的には、結合親和性は、陽性対照への結合の割合として決定される。概して、陽性対照の少なくとも３０％、特に少なくとも４０％、またはさらに少なくとも５０％の結合の割合を示すペプチドが選択される。典型的には、本開示による、および典型的には本方法によって取得可能なネオアンチゲンペプチドは、ペプチドが抗原として細胞の表面上に提示されるのに充分な親和性で少なくとも一つのＨＬＡ／ＭＨＣ分子に結合する。概して、ネオアンチゲンペプチドは、少なくとも一つのＨＬＡ／ＭＨＣ分子、典型的には、癌に罹患している該対象の分子に対して、１０－４未満、または１０－５未満、または１０－６未満、または１０－７未満、または５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満（小さい数字ほど大きな結合親和性を示す）のＩＣ５０親和性を有する。
したがって、本方法によるさらなる任意の工程は、独立して、
－ 健康な細胞上で高レベルまたは高頻度で発現する融合転写物または予測ペプチドを排除する工程であって、健康な細胞のＲＮＡｓｅｑデータに対する融合転写物配列のアライメントは、典型的には、健康な細胞中に存在する融合転写物配列の相対量を決定することを可能にし、一実施形態では、健康な細胞上に発現する融合転写物または予測ペプチドは廃棄される、工程と、
－ 腫瘍ネオアンチゲンペプチドが対象の健康な細胞で発現されていないことを確認する工程であって、この工程は、典型的には、基本的なローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）を使用して、健康な細胞のプロテオームに対するネオアンチゲンペプチドの配列のアラインメントを実施することができ、好ましくは、（例えば、ＢＬＡＳＴを使用して）正常で健康な細胞のプロテオームに対して整列するペプチドは廃棄される工程と、
－ 融合転写物または予測ペプチドが、対象の癌細胞で発現されることを確認する工程であって、癌細胞における選択された融合転写物配列の存在は、癌細胞試料から抽出されたｍＲＮＡ中のＲＴ－ＰＣＲによって典型的にはチェックされ得る工程と、を含む。
ネオアンチゲンペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクター
本開示はまた、転位因子（ＴＥ）配列およびエキソン配列を含むヒトｍＲＮＡ配列である融合転写物由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部分によってコードされる、少なくとも８、９、１０、１１、または１２アミノ酸を含む単離された腫瘍ネオアンチゲンペプチドに関する。ペプチドは、８～９、８～１０、８～１１、１２～２５、１３～２５、１２～２０、または１３～２０アミノ酸長であってもよい。ＯＲＦは、ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部と重複するが、腫瘍ネオアンチゲンペプチド自体は接合部を含まない場合があることが理解される。
本開示はまた、より具体的には、癌細胞由来のヒト融合ｍＲＮＡ配列の一部によってコードされる単離された腫瘍ネオアンチゲンペプチドを包含し、該融合ｍＲＮＡは、ＴＥ配列およびエキソン配列を含む。例示的な実施形態では、少なくとも８、９、１０、１１、または１２アミノ酸を含むネオアンチゲンペプチドは、配列番号１１８～９１０のいずれか一つの融合転写物配列のいずれかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部によってコードされ、好ましくは、上述のネオアンチゲンペプチド特性のうちの一つまたは複数を有するペプチドである。
ペプチドは、８～９、８～１０、８～１１、１２～２５、１３～２５、１２～２０、または１３～２０アミノ酸長であってもよく、上述のネオアンチゲンペプチド特性のうちの一つまたは複数を満たす。少なくとも８アミノ酸のペプチドのＮ末端は、ヌクレオチド位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、およびそれ以上のいずれかで始まるトリプレットコドンによってコードされてもよい（本開示は、１と８０００の間のすべての数を列挙することなく、１と８０００の間の整数のいずれかである開始位置を企図することが理解される）。
上述のペプチドは、典型的には、本開示の方法に従って取得可能であり、それゆえ、前述の特徴のうちの一つまたは複数を包含する。特に、本開示によるネオアンチゲンペプチドは、以下のさらなる特徴のうちの一つまたは組み合わせを呈し得る：
－ これは、対象のＭＨＣクラスＩを結合するか、または特異的に結合し、８～１１アミノ酸、特に８、９、１０、または１１アミノ酸である。典型的には、ネオアンチゲンペプチドは、８または９アミノ酸長であり、対象の少なくとも一つのＭＨＣクラスＩ分子に結合し、または代替的に、該対象の少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、１２～２５アミノ酸を含有し、特に１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長である。
－ これは、抗原として細胞の表面上に提示されるペプチドに充分な親和性を有する癌に罹患している該対象の少なくとも一つのＨＬＡ／ＭＨＣ分子に結合する。典型的には、ネオアンチゲンペプチドは、１０－４未満、または１０－５未満、または１０－６未満、または１０－７未満、または５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満（小さい数字ほど大きな結合親和性を示す）のＩＣ５０を有する。
－ これは、対象に投与されたとき、有意な自己免疫反応を誘発せず、および／または免疫寛容を引き起こすものではない。
－ これは、正常で健康な試料と比較して、腫瘍試料において高いレベルで発現される。典型的には、本開示によると、融合転写物は、腫瘍試料の１０％超および正常試料の２０％未満に存在する場合に選択され得る。いくつかの実施形態では、ネオアンチゲンは、より具体的には、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり、すなわち、正常な試料では発現されず、癌試料でのみ発現されるか、または正常な試料では比較的低いレベルで発現される（例えば、発現されたｍＲＮＡ配列は、正常な試料からの正常な細胞において、マイナーな種を表す）。
－ これは、ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部を含み、言い換えれば、これは、ＴＥ配列の一部とエキソン配列の一部によってコードされ、ＯＲＦは、標準または非標準のいずれかであり、または
－ これは、エキソン配列の非標準ＯＲＦによってコードされ、または
－ これは、ＴＥ配列によってコードされ、任意選択的に非標準ＯＲＦでコードされる。
腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、最初に、対象からの腫瘍細胞における融合転写物配列のＲＴ転写解析によって検証されてもよい。典型的には、本開示による腫瘍ネオアンチゲンペプチドを用いた免疫化はまた、Ｔ細胞応答を誘発する。
特定の実施形態では、本開示は、配列番号１～１１７のいずれか一つの少なくとも８アミノ酸を含む、ＮＳＣＬＣネオアンチゲンペプチドを包含する。典型的には、配列番号１～１１７の該ネオアンチゲンペプチドは、抗原として細胞の表面上に提示されるペプチドに充分な親和性を有するＨＬＡ－Ａ０２に結合する。ＭＨＣ対立遺伝子に対する親和性は、当該分野の公知の技術、特に上記に例示したように、インシリコまたはインビトロにより決定することができる。
特定の実施形態では、本開示による腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、対象の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれ以上に存在するＭＨＣ分子に結合する。特に、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、癌に罹患している対象集団からの対象の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％で発現される。
より具体的には、本開示の腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、癌に罹患している対象集団の対象の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％に存在する腫瘍に対する免疫応答を誘発することができる。
以前に定義したように、癌は、以下の組織または器官のいずれか一つに影響を及ぼす可能性がある：乳房；肝臓；腎臓；心臓、縦隔、胸膜；口底；口唇；唾液腺；舌；歯茎；口腔；口蓋；扁桃腺；喉頭；気管；気管支、肺；咽頭、下咽頭、中咽頭、上咽頭；食道；胃、肝内胆管、胆道、膵臓、小腸、結腸などの消化器；直腸；膀胱、胆嚢、尿管などの泌尿器；直腸Ｓ状結腸移行部； 肛門、肛門管；皮膚；骨；関節、 手足の関節軟骨；眼および付属器；脳；末梢神経、自律神経系；脊髄、脳神経、髄膜；および中枢神経系の様々な部分；結合組織、皮下組織およびその他の軟組織；後腹膜、腹膜； 副腎；甲状腺；内分泌腺および関連構造；卵巣、子宮、子宮頸部などの女性生殖器；子宮体部、膣、外陰部；陰茎、精巣および前立腺などの男性生殖器；造血系および網内系；血液；リンパ節；胸腺。例えば、本出願による腫瘍または癌は、白血病、セミノーマ、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頸癌、腸の癌、肝癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、消化器癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌、ならびにそれらの転移物を含む。その例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、または上述の癌種もしくは腫瘍の転移である。本開示による癌という用語は、癌転移および癌の再発も含む。
典型的には、本開示によるネオアンチゲンペプチドは、対象に投与されたとき、有意な自己免疫応答を誘発せず、および／または免疫寛容を引き起こすものではない。寛容のメカニズムには、高親和性自己反応性Ｔ細胞の数の減少を伴う、宿主におけるクローン除去、無知、アネルギー、または抑制が含まれる。
ネオアンチゲンペプチドはまた、化合物のアミノ酸配列を伸長または減少させることによって、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって修飾することができる。ペプチドはまた、特定の残基の順序または組成を改変することによっても修飾することができ、生物学的活性に必要不可欠な特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位または保存された残基は、生物学的活性に対する悪影響なしには概して改変され得ないことが容易に理解される。重要でないアミノ酸は、Ｌ－α－アミノ酸、またはそのＤ－異性体などのタンパク質に天然に存在するものに限定する必要はなく、β－γ－δ－アミノ酸などの非天然アミノ酸、およびＬ－α－アミノ酸の多くの誘導体を含む場合がある。
典型的には、単一のアミノ酸置換を有する一連のペプチドを使用して、静電荷、疎水性などの結合に対する影響を決定する。例えば、一連の正荷電（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負荷電（例えば、Ｇｌｕ）を持つアミノ酸置換が、ペプチドの長さに沿って行われ、様々なＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体に対する感受性の異なるパターンを明らかにする。さらに、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基などの小さな比較的中性部分を使用した複数の置換が採用されてもよい。置換は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであってもよい。置換または付加される残基の数および種類は、必須接触点間に必要な間隔と、求められる特定の機能的特性（例えば、疎水性対親水性）に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する結合親和性の増加はまた、親ペプチドの親和性と比較して、このような置換によって達成されてもよい。いずれにしても、こうした置換は、例えば、結合を妨害し得る立体障害および電荷干渉を避けるために選択されたアミノ酸残基または他の分子断片を用いるべきである。
アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものである。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終的なペプチドに到達してもよい。置換バリアントは、ペプチドの少なくとも一つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。こうした置換は、ペプチドの特性を細かく調節することが所望されるとき、概して以下の表１に従って行われる。
機能の実質的な変化（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞受容体に対する親和性）は、上記表のものよりも保存的でない置換を選択することによって行われる。すなわち、（ａ）シートまたはらせん状構造などの置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大部分の維持に対する効果において、より顕著な差異がある残基を選択することによって行われる。一般的に、ペプチド特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル（またはそれによって）に置換される；（ｂ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチル（またはそれによって）に置換される； または（ｃ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しないもの、例えば、グリシン（またはそれによって）に置換される。
ペプチドおよびポリペプチドはまた、ネオアンチゲンペプチドまたはポリペペプチド中に二つ以上の残基のアイソスターを含んでもよい。本明細書で定義されるアイソスターは、第一の配列の立体配座が、第二の配列に特異的な結合部位と適合するため、第二の配列に置換され得る二つ以上の残基の配列である。この用語は、具体的には、当業者に周知のペプチド骨格修飾を含む。かかる修飾には、アミド窒素、α－炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失、または骨格の架橋が含まれる。概して、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＶＩＩ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｄ．，１９８３）を参照されたい。
さらに、ネオアンチゲンペプチドは、担体タンパク質、リガンド、または抗体にコンジュゲートされてもよい。ペプチドの半減期は、ＰＥＧ化、グリコシル化、ポリシアル化、ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ模倣物、Ｆｃ融合、アルブミン融合、ナノ粒子付着、ナノ粒子カプセル化、コレステロール融合、鉄融合、またはアシル化によって改善され得る。
様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸を用いたペプチドおよびポリペプチドの修飾は、インビボでペプチドおよびポリペプチドの安定性を高めるのに特に有用である。安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼおよびヒト血漿および血清などの様々な生物学的媒体を使用して、安定性を試験した。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１－３０２（１９８６）を参照のこと。本開示のペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して簡便に決定される。プロトコルは概して以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、非熱不活性化）は、使用前に遠心分離により脱脂される。次いで、血清をＲＰＭＩ組織培養培地で２５％に希釈し、ペプチド安定性を試験するために使用される。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を除去し、６％の水性トリクロロ酢酸またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却し（４℃）、次いで遠心分離して沈殿した血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を使用して逆相ＨＰＬＣにより決定する。
ペプチドおよびポリペプチドは、改善された血清半減期以外の所望の属性を提供するように修飾されてもよい。例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる、少なくとも一つのエピトープを含有する配列に連結することによって強化され得る。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結される。スペーサーは、典型的には、生理学的条件下では実質的に帯電していない、アミノ酸またはアミノ酸模倣物などの比較的小さな中性分子から構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸のその他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基からなる必要はないため、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであってもよいことが理解されよう。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも１または２残基、より一般的には３～６残基である。あるいは、ペプチドは、スペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結されてもよい。
ネオアンチゲンペプチドは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的にまたはスペーサーを介して、Ｔヘルパーペプチドに連結されてもよい。ネオアンチゲンペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化されてもよい。例示的なＴヘルパーペプチドとしては、破傷風トキソイド８３０～８４３、インフルエンザ３０７～３１９、マラリアスポロゾイト周囲３８２～３９８および３７８～３８９が挙げられる。
本明細書に記載される複数のネオアンチゲンペプチドも、任意選択的にスペーサーによって一緒に連結することができる。
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を通したタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの発現、天然起源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列は、以前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースで見出すことができる。そのようなデータベースの一つは、国立衛生研究所のウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を使用して、または当業者に公知であるように、増幅および／または発現され得る。あるいは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの様々な市販の調製物は、当業者に公知である。
さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドをコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、またはネイティブもしくは安定化形態のポリヌクレオチド、例えば、ホスホロチオチエート骨格を有するポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択されてもよく、ペプチドをコードする限り、イントロンを含有してもよく、または含有しなくてもよい。天然に存在するペプチド結合によって結合された天然に存在するアミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってコード可能である。
本開示のさらにさらなる態様は、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドを発現することができる発現ベクターを提供する。異なる細胞型に対する発現ベクターは、当技術分野で周知であり、過度の実験をすることなく選択することができる。概して、ＤＮＡは、プラスミドなどの発現ベクター内に、発現のための適切な方向および正しいリーディングフレームで挿入される。発現ベクターは、所望の宿主によって認識される適切な異種転写および／または翻訳調節制御ヌクレオチド配列を含む。腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このような異種調節制御ヌクレオチド配列に連結されていてもよく、またはそのような異種調節制御ヌクレオチド配列に隣接していなくても動作可能に連結されていてもよい。ベクターはその後、標準的な技術を通して宿主に導入される。指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に見出すことができる。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本開示はまた、前述の方法において予め定義される、および／または取得可能な一つまたは複数のペプチドでパルス化された抗原提示細胞の集団を包含する。抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であることが好ましい（Ｎｅａｌ，Ｌｉｌｌｉａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ．” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２，１ （２０１７）：６８－７９）を参照されたい）。樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞を刺激し、病原体に対する一次免疫応答を開始する並外れた能力を有する、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。実際に、成熟したＤＣの主な役割は、抗原を感知し、他の免疫細胞、特にＴ細胞を活性化するメディエーターを産生することである。ＤＣは、Ｔ細胞上のＴＣＲ（シグナル１）および共刺激分子（シグナル２）をトリガするＭＨＣ分子を発現するため、リンパ球活性化のための強力な刺激因子である。さらに、ＤＣは、Ｔ細胞増殖を支持するサイトカインも分泌する。Ｔ細胞は、外来病原体または腫瘍を認識するために、プロセシングされたペプチドの形態で提示された抗原を必要とする。病原体／腫瘍タンパク質に由来するペプチドエピトープの提示は、ＭＨＣ分子を介して達成される。ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）分子およびＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ－ＩＩ）分子は、それぞれ、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞に対してプロセシングされたペプチドを提示する。重要なことは、ＤＣが、豊富なＴ細胞集団を含む炎症部位に存在し、免疫応答を促進することである。したがってＤＣは、適応免疫応答の活性化と密接に関与しているため、任意の免疫療法アプローチの重要な要素となり得る。ワクチンとの関連で、ＤＣ療法は、健康なボランティアまたは感染性疾患もしくは癌を有する患者において、所望の標的に対するＴ細胞免疫応答を強化することができる。一実施形態では、ＡＰＣＳは人工ＡＰＣであり、これは、所望のＴ細胞共刺激分子、ヒトＨＬＡ対立遺伝子、および／またはサイトカインを発現するように遺伝子改変される。かかる人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｔ細胞の適切な関与、共刺激、ならびに制御されたＴ細胞増殖を可能にするサイトカインの持続放出という要件を提供することができる。これらの細胞は、時間の制約および入手の制限を受けることなく、異なるドナーからのＴ細胞株を作製する際に使用するために少量ずつ保存できるため、免疫療法用途のための既製の試薬となる。これらのａＡＰＣ上の強力な共刺激シグナルの発現は、このシステムに、養子免疫療法の有効性を高めるためのより高い効率をもたらす。さらに、ａＡＰＣを操作して、特定のサイトカインの放出を指示する遺伝子を発現させ、例えば、長寿命メモリーＴ細胞などの養子移植のための望ましいＴ細胞サブセットの優先的な増殖を促進することができる（Ｈａｓａｎ ＡＨ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ：Ａｎ Ｏｆｆ ｔｈｅ Ｓｈｅｌｆ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｓｉｒａｂｌｅ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｂｒｏａｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ； Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ．２０１５； ４（３）：１３０， Ｋｉｍ ＪＶ，Ｌａｔｏｕｃｈｅ ＪＢ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉ，Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ．Ｔｈｅ ＡＢＣｓ ｏｆ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２：４０３－４１０ ｏｒ Ｗａｎｇ Ｃ，Ｓｕｎ Ｗ，Ｙｅ Ｙ，Ｂｏｍｂａ ＨＮ，Ｇｕ Ｚ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎｓ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１７； ７（１４）：３５０４－３５１６を参照されたい）。
典型的には、樹状細胞は、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドでパルスされる自己樹状細胞である。ペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせる任意の適切なペプチドであってもよい。抗原提示細胞（または刺激細胞）は、典型的には、その表面上にＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を有し、一実施形態では、選択された抗原をＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子にロードすることは実質的に不可能である。ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子は、選択された抗原をインビトロで容易にロードすることができる。
代替として、抗原提示細胞は、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする発現構築物を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、以前に定義された任意の適切なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入することができ、それゆえペプチドの提示および免疫の誘導をもたらすことができることが好ましい。
したがって、本開示は、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドでパルスまたはロードすることができるか、本明細書に開示される少なくとも一つのネオアンチゲンペプチドを発現するように（ＤＮＡまたはＲＮＡ転移を介して）遺伝子改変されるか、または本開示の腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする発現構築物を含む、ＡＰＣの集団を包含する。典型的には、ＡＰＣの集団は、パルスまたはロードされ、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０の異なるネオアンチゲンペプチドまたはそれをコードする発現構築物を発現するように改変されるか、またはそれを含む。
本開示はまた、本明細書に開示されるＡＰＣを含む組成物を包含する。ＡＰＣは、細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養培地などの任意の公知の生理学的に互換性のある薬学的担体中に懸濁されて、生理学的に許容可能な水性医薬組成物を形成することができる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸リンゲルが含まれる。所望に応じて、抗菌剤など他の物質を加えることができる。本明細書で使用される場合、「担体」は、ＡＰＣを好適なインビトロまたはインビボの作用部位に送達するためのビヒクルとして好適な任意の物質を指す。したがって、担体は、ＡＰＣを含有する治療試薬または実験試薬の製剤化のための賦形剤として機能し得る。好ましい担体は、Ｔ細胞と相互作用することができる形態のＡＰＣを維持することができる。こうした担体の例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンク溶液、およびその他の生理学的にバランスのとれた水溶液または細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。水性担体はまた、例えば、化学的安定性および等張性の強化など、レシピエントの生理学的条件に近似するために必要な適切な補助物質を含有してもよい。適切な補助物質としては、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ならびにリン酸緩衝液、トリス緩衝液、および重炭酸塩緩衝液を生成するために使用される他の物質が挙げられる。
ワクチン組成物
本開示は、特異的なＴ細胞応答を起こすことができるワクチンまたは免疫原性組成物をさらに包含するものであり、
－ 本明細書に定義される一つまたは複数のネオアンチゲンペプチドと、
－ 本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドと、
－ 上述の抗原提示細胞（自己樹状細胞または人工ＡＰＣなど）の集団と、を含む。
好ましくは、以前に定義された腫瘍特異的融合によりコードされるネオアンチゲンペプチドは、本開示によるワクチン組成物で使用される。該ネオアンチゲンペプチドは、腫瘍特異的ペプチドとも命名され得る。腫瘍特異的ペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本開示に従って使用されることが好ましい。
好適なワクチンまたは免疫原性組成物は、１～２０のネオアンチゲンペプチド、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の異なるネオアンチゲンペプチド、さらに好ましくは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の異なるネオアンチゲンペプチド、および最も好ましくは１２、１３または１４の異なるネオアンチゲンペプチドを含有することが好ましい。
ネオアンチゲンペプチドは、担体タンパク質に連結されてもよい。組成物が二つ以上のネオアンチゲンペプチドを含有する場合、二つ以上（例えば、２～２５）のペプチドは、上述のスペーサー分子、例えば、２～６の非極性または中性アミノ酸を含むスペーサーによって直線的に連結されてもよい。
本開示の一実施形態では、ポリヌクレオチド、ベクター、またはＡＰＣをコードする異なるネオアンチゲンペプチドは、一つのワクチンまたは免疫原性組成物が、異なるＭＨＣクラスＩ分子などの異なるＭＨＣ分子と会合することができるネオアンチゲンペプチドを含むように選択される。好ましくは、こうしたネオアンチゲンペプチドは、最も頻繁に発生するＭＨＣクラスＩ分子と会合することができ、例えば、少なくとも２つの好ましい、より好ましくは少なくとも３つの好ましい、さらにより好ましくは少なくとも４つの好ましいＭＨＣクラスＩ分子と会合することができる異なる断片である。いくつかの実施形態では、組成物は、一つまたは複数のＭＨＣクラスＩＩ分子と会合することができるポリヌクレオチド、ベクター、またはＡＰＣをコードするペプチドを含む。ＭＨＣは、任意選択で、ＨＬＡ －Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＰ、－ＤＱ、または－ＤＲである。
ワクチンまたは免疫原性組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答および／または特異的なヘルパーＴ細胞応答を起こすことができる。
したがって特定の実施形態では、本開示はまた、上述のネオアンチゲンペプチドに関し、ネオアンチゲンペプチドは腫瘍特異的ネオエピトープを有し、ワクチンまたは免疫原性組成物に含まれる。ワクチン組成物は、疾患の予防および／または治療のための免疫を生成するための組成物を意味すると理解されるべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含むか、または抗原を生成する薬剤であり、ワクチン接種によって特定の防御物質および保護物質を生成するために、ヒトまたは動物に使用されることが意図される。「免疫原性組成物」は、抗原を含むか、または抗原を生成し、抗原特異的液性または細胞性免疫応答、例えば、Ｔ細胞応答を誘発することができる組成物を意味すると理解されるべきである。
好ましい実施形態では、本開示によるネオアンチゲンペプチドは、８もしくは９残基長、または１３～２５残基長である。ペプチドが２０残基未満である場合、インビボ免疫化により適したペプチドを有するために、該ネオアンチゲンペプチドは、任意選択的に追加のアミノ酸に隣接して、より多くの、通常は２０超のアミノ酸の免疫化ペプチドを得る。
本明細書に記載されるペプチドを含む医薬組成物（すなわち、ワクチンまたは免疫原性組成物）は、既に癌に罹患している個体に投与されてもよい。治療用途では、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発し、症状および／または合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、治療される疾患の段階および重症度、患者の体重および全般的な健康状態、および処方する医師の判断によるが、一般に、初期免疫（つまり、治療的または予防的投与）の範囲は、体重７０ｋｇの患者に対してペプチドを約１．０μｇ～約５０，０００μｇ、その後、患者の血液中の特定のＣＴＬ活性の測定により、患者の反応および状態に応じて、数週間から数か月にわたる追加レジメンに従ってペプチドを約１．０μｇ～約１０，０００μｇ追加投与される。本発明のペプチドおよび組成物は、概して重篤な疾患状態、すなわち、生命を脅かす状態、または生命を脅かす可能性のある状態、特に癌が転移した場合、採用され得ることに留意されたい。このような場合、異物の最小化およびペプチドの比較的毒性のない性質を考慮すると、これらのペプチド組成物の実質的な過剰投与は可能であり、治療担当医は望ましいと感じるかもしれない。
治療的使用については、腫瘍の検出または外科的除去から投与を開始すべきである。この後に、少なくとも症状が実質的に軽減するまで、およびその後一定期間、用量を追加する。
治療のためのワクチンまたは免疫原性組成物は、非経口、局所、経鼻、経口、または局所投与を意図する。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与される。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘発するために外科的切除の部位に投与されてもよい。
ワクチンまたは免疫原性組成物は、薬学的に許容可能なアジュバント、免疫賦活剤、安定剤、担体、希釈剤、賦形剤、および／または当業者に周知の任意の他の材料を追加的に含む医薬組成物であってもよい。かかる材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体は水性担体であることが好ましいが、担体または他の材料の正確な性質は投与経路に依存する。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用してもよい。これらの組成物は、従来的な周知の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥してもよいが、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、生理学的条件を近似するために必要な薬学的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどをさらに含有してもよい。癌ワクチンについての考察は、例えば、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，ＢＭＪ．２０１５ ２２；３５０を参照のこと。
抗原性化合物に対する宿主の免疫反応を増大または拡大させるアジュバントの例としては、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウムなどの水性アジュバント、キトサン系アジュバント、サポニン、油、アンフィゲン、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、ＣｐＧ配列、合成オリゴヌクレオチド、サイトカインおよびそれらの組み合わせが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ラウリン酸およびオレイン酸のカリウム塩、ナトリウム塩およびアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホン酸塩、臭化セチルトレチルアンモラム（ｃｅｔｙｌｔｒｈｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｌｕｍ）、グリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステルおよびエーテル、およびソルビタン脂肪酸エステルおよびそれらのポリオキシエチレン、アカシア、ゼラチン、レシチンおよび／またはコレステロールが挙げられる。オイル成分を含むアジュバントは、鉱油、植物油、または動物油を含む。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）が挙げられる。追加の免疫賦活剤として有用なサイトカインとしては、インターフェロンアルファ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、および顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
ワクチンまたは免疫原性製剤中の本明細書に記載のペプチドの濃度は、大きく変動する可能性があり、すなわち、下は約０．１重量％未満、通常または少なくとも約２重量％から、上は２０重量％～５０重量％以上までであり、選択された特定の投与様式に従って、主に流体量、粘度などによって選択される。
本明細書に記載されるペプチドはまた、リンパ球組織などの特定の細胞組織にペプチドを標的化するリポソームを介して投与されてもよい。リポソームはまた、ペプチドの半減期を増加させるのに有用である。リポソームには、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層などが含まれる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、リポソームの一部として、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ系細胞に広く見られる受容体に結合する分子、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物と共に組み込まれる。したがって、本発明の所望のペプチドで充填されたリポソームは、リンパ系細胞の部位に向けられ、ここでリポソームは次に選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達することができる。本発明における使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは概して中性および負に帯電したリン脂質、ならびにコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームのサイズ、酸の不安定性、および血流中のリポソームの安定性を考慮することによって導かれる。リポソームの調製に利用可能な様々な方法は、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０）、米国米国特許第４，２３５，８７１号、４５０１７２８号、米国第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号に記載されている。
免疫細胞への標的化のために、リポソームに組み込まれるリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片を含み得る。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、特に、投与方法、送達されるペプチド、および治療される疾患の段階に応じて変化する用量で、静脈内、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などに、投与され得る。
固体組成物については、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む、従来のまたはナノ粒子の非毒性固体担体が使用され得る。経口投与については、薬学的に許容可能な非毒性組成物は、以前に列挙された担体などの通常使用される賦形剤のいずれか、および概して１０～９５％の活性成分、すなわち本発明の一つまたは複数のペプチド、より好ましくは２５％～７５％の濃度で組み込むことによって形成される。
エアロゾル投与については、免疫原性ペプチドは、界面活性剤および噴霧剤と共に微細に分割された形態で供給されることが好ましい。ペプチドの典型的な割合は、０．０１重量％～２０％、好ましくは１％～１０％である。界面活性剤は、もちろん、非毒性であり、かつ好ましくは噴霧剤に可溶性でなければならない。そのような薬剤を代表するものとしては、６～２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステル酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびオレイン酸の脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルが挙げられる。混合エステル、例えば混合または天然グリセリドを使用してもよい。界面活性剤は、組成物の０．１％～２０重量％、好ましくは０．２５～５重量％を構成してもよい。組成物の残りは、通常、噴射剤である。担体は所望により、例えば、経鼻送達ではレシチンも含むことが可能である。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、インタクトな外来抗原自体ではなく、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態で抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の三量体複合体が存在する場合にのみ可能である。同様に、ＣＴＬの活性化にペプチドを使用するだけでなく、それぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣをさらに追加する場合、免疫応答を増強し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示によるワクチンまたは免疫原性組成物は、代替的にまたは追加的に、少なくとも一つの抗原提示細胞、好ましくはＡＰＣの集団を含有する。
したがって、ワクチンまたは免疫原性組成物は、例えば樹状細胞ワクチンとして、抗原提示細胞などの細胞の形態で送達されてもよい。樹状細胞などの抗原提示細胞は、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドでパルスまたはロードしてもよく、本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドをコードする発現構築物を含んでもよく、または本明細書に開示されるネオアンチゲンペプチドのうちの一つ、二つ以上、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のネオアンチゲンペプチドを発現するように（ＤＮＡまたはＲＮＡ転移を介して）遺伝子改変されてもよい。
適切なワクチンまたは免疫原性組成物はまた、本明細書に記載されるネオアンチゲンペプチドに関連するＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよい。例えば、一つまたは複数のネオアンチゲンペプチドまたはそこから誘導されるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、ワクチンとして、例えば、対象に直接注射することによって使用してもよい。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のネオアンチゲンペプチドまたはそれらから誘導されたタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ。
患者に核酸を送達するために、多くの方法が便利に使用されている。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達されてもよい。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５－１４６８ （１９９０）、および米国米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような弾道送達を使用して投与することができる。ＤＮＡのみからなる粒子を投与することができる。あるいは、ＤＮＡを、金粒子などの粒子に付着させることができる。
核酸はまた、カチオン性脂質などのカチオン性化合物に複合体化されて送達されてもよい。脂質を介した遺伝子送達方法は、例えば、９６１８３７２ＷＯＡＷＯ ９６／１８３７２； ９３２４６４０ＷＯＡＷＯ ９３／２４６４０； Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）、５２７９８３３ＵＳＡＲｏｓｅ米国特許第５，２７９，８３３号、９１０６３０９ＷＯＡＷＯ ９１／０６３０９、およびＦｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１４ （１９８７ ）に記載されている。
送達システムは任意に、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子カプセル化、ウイルス様粒子、リポソーム、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。細胞透過性ペプチドには、ＴＡＴペプチド、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、トランスポータン、Ａｎｔｐが含まれる。リポソームは、送達システムとして使用され得る。リステリアワクチンまたはエレクトロポレーションも使用され得る。
一つまたは複数のネオアンチゲンペプチドはまた、一つまたは複数のネオアンチゲンペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含有する細菌またはウイルスベクターを介して送達されてもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、ベクター自体として、または弱毒化された細菌ウイルス、またはワクシニアまたは鶏痘などの弱毒化された生ウイルス内に送達されてもよい。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を伴う。急性または慢性感染宿主または非感染宿主に導入されると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主のＣＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６－４６０（１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な幅広い他のベクター、例えば、チフス菌ベクターなどは、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。
本明細書に記載されるペプチドをコードする核酸を投与する適切な手段は、複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物の使用を伴う。ヒト細胞における発現のために選択されたＣＴＬエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳する。ヒトコドン使用表を使用して、各アミノ酸のコドン選択を誘導する。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は直接隣接し、連続ポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をミニ遺伝子設計に組み込むことができる。逆翻訳され、ミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体保持シグナルが挙げられる。さらに、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、ＣＴＬエピトープに隣接する合成（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖とマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換される。重複オリゴヌクレオチド（３０～１００塩基長）は、周知の技術を使用して適切な条件下で合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合される。次いでＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を、所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
当業者に周知の標準的な調節配列がベクターに含まれ、標的細胞での発現を確実にする。したがって、ネオアンチゲンペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、典型的には、以下のうちの一つまたは複数に動作可能に連結されてもよい：
－ 核酸分子発現を駆動するために使用することができるプロモーター。ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして機能することができ、追加のプロモーター要素の必要性を排除するのに有利である。ユビキタス発現については、以下のプロモーターを使用できる：ＣＭＶ（特にヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ｈＣＭＶ－ＩＥ））、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、フェリチン重鎖または軽鎖など。脳発現については、以下のプロモーターを使用できる：すべてのニューロンにはシナプシン、興奮性ニューロンにはＣａＭＫＩＩａｌｐｈａ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにはＧＡＤ６７またはＧＡＤ６５またはＶＧＡＴなど。ＲＮＡ合成を駆動するために使用されるプロモーターには、以下が含まれ得る：Ｕ６またはＨＩなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターおよびイントロンカセットを使用して、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現させることができる。典型的には、プロモーターは、ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を含む。適切なプロモーター配列の例については、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号を参照のこと。
－ 転写活性を高めることができる転写トランス活性因子または他のエンハンサー要素、例えば、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）の５’末端反復配列（ＬＴＲ）からの調節Ｒ領域（ＣＭＶプロモーターと組み合わせた場合、より高い細胞免疫応答を誘発することが示されている）。
－ 翻訳最適化配列、例えば、ｍＲＮＡ内のＡＵＧ開始コドン（ＡＣＣＡＵＧＧ）に隣接するコザック配列、およびコドン最適化。
ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために、さらなるベクター改変が望まれ得る。いくつかの事例では、効率的な遺伝子発現にはイントロンが必要であり、一つまたは複数の合成または天然に存在するイントロンをミニ遺伝子の転写領域に組み込むことができる。ミニ遺伝子の発現を増加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列を含めることも検討することができる。最近、ＤＮＡ’ワクチンの免疫原性に免疫賦活配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）が関与することが提唱されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが見出された場合、ミニ遺伝子コード配列の外側でベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子にコードされたエピトープおよび免疫原性を増強または減少させるために含まれる第二のタンパク質の産生を可能にするためのバイシストロン性発現ベクターを使用することができる。
本明細書に記載されるＤＮＡワクチンまたは免疫原性組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮγなどの細胞媒介免疫応答を促進するサイトカインを共送達することによって強化され得る。ＩＬ－８などのＣＸＣケモカイン、およびマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、およびＲＡＮＴＥＳなどのＣＣケモカインは、免疫反応の効力を増加させる場合がある。ＤＮＡワクチン免疫原性はまた、プラスミドにコードされたサイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子および接着分子、例えば、Ｂ７－１（ＣＤ８０）および／またはＢ７－２（ＣＤ８６）を共送達することによっても強化され得る。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的シグナルに結合され、ＣＴＬエピトープとは別に発現され得る。これにより、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けが可能となる。必要に応じて、これは、ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な進入を促進し、それによってＣＴＬ誘導を改善することができる。ＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ－β）の共発現による免疫反応の特異的低下は、特定の疾患において有益であり得る。
発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子はプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは適切な大腸菌株に形質転換され、ＤＮＡは標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の配向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる他のすべての要素は、制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列解析を使用して確認される。正しいプラスミドを保有する細菌性細胞は、マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクとして保存することができる。
精製されたプラスミドＤＮＡは、様々な製剤を使用して注射用に調製することができる。これらの中で最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。様々な方法が説明されており、新しい技術が利用可能となり得る。上述のように、核酸は、カチオン性脂質で簡便に製剤化される。さらに、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチドおよび防御相互作用非縮合（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ，ｎｏｎ－ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）と総称される化合物を、精製されたプラスミドＤＮＡと複合体化して、安定性、筋肉内分散、または特定の器官もしくは細胞型への輸送などの変数に影響を与えることができる。
ペプチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物は、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンまたは免疫原性組成物と組み合わせて投与されてもよい。例えば、ペプチドワクチンおよびＤＮＡワクチンの投与は、プライムブーストプロトコルで代替されてもよい。例えば、ペプチド免疫原性組成物を用いてプライミングすること、およびＤＮＡ免疫原性組成物を用いてブーストすること、ならびにＤＮＡ免疫原性組成物を用いてプライミングすること、およびペプチド免疫原性組成物を用いてブーストすることが企図される。
本開示はまた、
ａ） 任意で、前述の方法に従って、少なくとも一つのネオアンチゲンペプチドを同定する工程と、
ｂ） 本明細書に記載される該少なくとも一つのネオアンチゲンペプチド、ネオアンチゲンペプチドをコードする少なくとも一つのポリペプチド、または該ポリペプチドを含むベ少なくとも一つのベクターを産生する工程と、
ｃ） 任意で、生理学的に許容可能な緩衝剤、賦形剤、および／またはアジュバントを添加し、該少なくとも一つのネオアンチゲンペプチド、ポリペプチド、またはベクターを用いてワクチンを産生する工程と、を含む、ワクチン組成物を産生する方法を包含する。
本開示の別の態様は、ＤＣワクチンを産生する方法であり、該ＤＣは、本明細書に開示される少なくとも一つのネオアンチゲンペプチドを提示する。
抗体ＴＣＲ、ＣＡＲおよびその誘導体
本開示はまた、本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
いくつかの実施形態では、ネオアンチゲンペプチドは、ＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と会合している。
典型的には、該抗体またはその抗原結合断片は、単独で、または任意でＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と関連して、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、または１０－１１Ｍ以下のＫｄ結合親和性で、本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドに結合する。
リンパ球Ｔ（ＬＴ）による腫瘍細胞の浸潤および認識を促進するために、別の戦略は、複数の抗原標的を同時に、より具体的には二つの抗原標的を同時に認識することができる抗体を使用することからなる。二重特異性抗体には多くのフォーマットがある。ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー）は、最初に開発されたものである。これらは、結合ペプチドによって連結された二つの抗体からの二つのｓｃＦｖ（重鎖ＶＨ可変ドメインおよび軽鎖ＶＬ可変ドメイン）からなる融合タンパク質であり、一方はＬＴマーカー（ＣＤ３＋）を認識し、他方は腫瘍抗原を認識する。目標は、腫瘍と接触しているＬＴの動員および活性化を促進し、それゆえ細胞溶解腫瘍をもたらすことである（Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．Ｂａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｃａｒｓｔｅｎ Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ； Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９； ６９：（１２）．Ｊｕｎｅ １５，２００９； ａｎｄ Ｇａｌａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅｓ ｅｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｅ，ｖｏｌ．３－ｎ°３－７，ｍａｉ－ａｏｕｔ ２０１７を参照されたい）。
特定の実施形態では、該抗体は、本明細書に定義される腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とし、任意選択的にＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と関連して、さらに少なくとも免疫細胞抗原を標的にする、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャーである。典型的には、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である。この文脈において、標的免疫細胞抗原は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３０、またはＴＣＲであってもよい。
本明細書の用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み、インタクトな抗体および機能的（抗原結合）抗体断片を含み、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、 Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒｌｇＧ）断片、抗原に特異的に結合できる可変重鎖（ＶＨ）領域、単鎖抗体断片を含み、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む。この用語は、例えば、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば、二重特異性、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖなどの免疫グロブリンの遺伝子操作された、および／または別の方法でバリアント修飾された形態を包含する。別段の記載がない限り、用語「抗体」は、機能性抗体およびその断片を包含するものとして理解されるべきである。用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトまたは完全長の抗体を包含する。いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含み、例えば、ｓｃＦｖ形式である。
抗体は、抗体がその特異的結合機能を保持するかまたは実質的に保持することを条件に、天然アミノ酸配列内に一つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するバリアントポリペプチド種を含む。アミノ酸の保存的置換は周知であり、上述されている。
本開示はさらに、約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、または１０－１１Ｍ以下のＫｄ結合親和性を有する、任意選択的にＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と会合して、本明細書に定義される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに結合する抗体を選択する工程を含む、抗体またはその抗原結合断片を作製する方法を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体配列のライブラリーから選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、任意選択的にＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と会合したネオアンチゲンペプチドを含むポリペプチドで動物を免疫化し、その後の選択工程によって生成される。
キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含む抗体は、上述のようにさらに親和性成熟させ、選択することができる。ヒト化抗体は、げっ歯類配列由来のＣＤＲ領域を含有し、典型的には、げっ歯類ＣＤＲはヒトフレームワークに移植され、ヒトフレームワーク残基の一部は、親和性を保持するために元のげっ歯類フレームワーク残基に突然変異する場合があり、および／またはＣＤＲ残基のうちの一つもしくはいくつかを変異させて、親和性を高める場合がある。完全ヒト抗体は、マウス配列を有しておらず、典型的には、ヒト抗体ライブラリーのファージディスプレイ技術、または天然の免疫グロビン座位がヒト免疫グロブリン座位のセグメントで置換されているトランスジェニックマウスの免疫化によって産生される。
該方法によって産生される抗体、ならびにそのような抗体またはその断片を発現する免疫細胞も、本開示によって包含される。
本開示はまた、本明細書に開示された一つまたは複数の抗体を、単独で、または安定化化合物などの少なくとも一つの他の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物を包含し、安定化化合物は、任意の滅菌の生体適合性医薬担体で投与されてもよく、滅菌の薬学的に許容可能な緩衝液、希釈剤、および／または賦形剤を配合して任意に製剤化されてもよい。薬学的に許容可能な担体は、典型的には組成物を増強または安定化し、および／または組成物の調製を容易にするために使用することができる。薬学的に許容可能な担体には、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれ、これらは生理学的に適合性があり、いくつかの実施形態では薬学的に不活性である。
本明細書に開示される抗体を含む医薬組成物の投与は、経口的にまたは非経口的に達成され得る。非経口送達の方法には、局所、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、脊椎、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。
したがって、活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用することができる調製物にプロセシングすることを容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な薬学的に許容可能な担体を含有してもよい。製剤化および投与の技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に見出すことができる。
投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性分子、および多重特異性分子は材料でコーティングして、化合物を不活化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護することができる。
組成物は、典型的には滅菌され、好ましくは流体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることによってもたらされ得る。
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体を使用して製剤化することができる。こうした担体は、患者が摂取するために、医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。
経口使用のための医薬品は、活性化合物と固体賦形剤とを組み合わせ、得られた混合物を任意に粉砕し、所望に応じて適切な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの炭水化物またはタンパク質充填剤；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチル、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；ならびにアラビアおよびトラガカントを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が添加されてもよい。
糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物も含有し得る、濃縮糖溶液などの好適なコーティングが施されている。染料または顔料は、製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。
経口的に使用することができる医薬品には、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、ならびにゼラチンで作られ、グリセロールまたはソルビトールなどでコーティングされた軟質の密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と混合された活性成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、安定剤の有無に関わらず、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁され得る。
非経口投与のための医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射の場合、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理的に緩衝された生理食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝液中に製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。任意選択で、懸濁液はまた、化合物の溶解度を増加させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含有してもよい。
局所投与または鼻腔投与については、浸透させる特定のバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。こうした浸透剤は、当該技術分野で一般的に公知である。
本開示の医薬組成物は、当技術分野で周知で、日常的に実践されている方法に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０ｔｈ ｅｄ．，２０００； ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。
本開示はまた、ＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子に関連して本明細書に定義されるネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を包含する。
本開示は、ＴＣＲまたはその抗原結合断片を産生する方法をさらに含み、本明細書に定義される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに、任意選択的にＭＨＣ分子またはＨＬＡ分子と会合して、約１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、または１０－１１Ｍの以下のＫｄ結合親和性で結合するＴＣＲを選択する工程を含む。
ＴＣＲをコードする核酸は、天然に存在するＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、続いて抗体可変領域の発現、続いて上述の選択工程など、様々なソースから取得することができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、患者から単離されたＴ細胞、または培養Ｔ細胞ハイブリドーマから取得される。いくつかの実施形態では、標的抗原のＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１６９－１８０ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５７９９－５８０８を参照のこと。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを使用して、標的抗原に対してＴＣＲを単離する（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｎａｔ Ｍｅｄ．１４：１３９０－１３９５ ａｎｄ Ｌｉ （２００５） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９－３５４を参照のこと。
「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲａおよびＴＣＲｂとしても知られる）、または可変γ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲｇおよびＴＣＲｄとしても知られる）を含有し、ＭＨＣ受容体に結合される抗原ペプチドに特異的に結合する能力を有する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αβ形態である。典型的には、αβおよびγδ形態で存在するＴＣＲは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するＴ細胞は、異なる解剖学的位置または機能を有し得る。ＴＣＲは、細胞の表面上または可溶性形態で見出すことができる。概して、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見出され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合された抗原を認識するのに一般的に関与している。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質尾部を含有してもよい（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｈ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，３ ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、Ｃ末端に、一つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、一つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、および短い細胞質尾部を有し得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質と関連している。別段の記載がない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲ断片を包含するものとして理解されるべきである。この用語はまた、αβ形態またはγδ 形態のＴＣＲを含む、インタクトまたは全長のＴＣＲを包含する。
したがって、本明細書の目的のために、ＴＣＲへの言及は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチド、すなわちＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分などの任意のＴＣＲまたは機能的断片を含む。ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合断片」は、互換的に使用することができ、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含有するが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子を指す。いくつかの事例では、抗原結合部分は、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖などの、ＴＣＲの可変ドメインを含有し、一般に各鎖が三つの相補性決定領域を含有するなど、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する結合部位を形成するのに十分である。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖の可変ドメインが結合してループ、または免疫グロブリンに類似した相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、これはＴＣＲ分子の結合部位を形成することによって抗原認識を与え、ペプチドの特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される｛例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｗｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９１３８，１９９０； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７：３７４５，１９８８； ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５，２００３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、処理された抗原の認識に関する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は抗原ペプチドのＮ末端部分と、ベータ鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用することも示されている。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられる。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含有し得る。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外部分｛例えば、α－鎖、β－鎖）は、二つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端の可変ドメイン｛例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的には、カバト番号付けに基づくアミノ酸１～１１６ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈ ｅｄ．）、および細胞膜に隣接する一つの定常ドメイン｛例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣａ、典型的には、カバトに基づくアミノ酸１１７～２５９、β－鎖定常ドメインまたはＣｐ、典型的には、カバトに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含むことができる。例えば、いくつかの事例では、二つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、二つの膜近位定常ドメインと、ＣＤＲを含有する二つの膜遠位可変ドメインを含有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含有し、二つの鎖間のリンクを形成する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメイン中に二つのジスルフィド結合を含有するように、α鎖およびβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有してもよい。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は膜貫通ドメインを含有してもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、正に荷電される。いくつかの事例では、ＴＣＲ鎖は細胞質尾部を含有する。いくつかの事例では、この構造は、ＴＣＲがＣＤ３などの他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、タンパク質を細胞膜内に固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと会合させることができる。
概して、ＣＤ３は、哺乳類の三つの異なる鎖（γ、δ、およびε）と、ζ－鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、複合体は、ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３５鎖、二つのＣＤ３ｓ鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を含有し得る。ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３５鎖、およびＣＤ３ｓ鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３ｙ、ＣＤ３５、およびＣＤ３ｓ鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖が正に荷電したＴ細胞受容体鎖と会合することを可能にする特徴である。ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３５鎖、およびＣＤ３ｓ鎖の細胞内尾部は各々、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られる単一の保存モチーフを含有し、各ＣＤ３ζ鎖には三つある。一般的に、ＩＴＡＭはＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらのアクセサリ分子は、負に荷電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲからの信号を細胞内に伝播させる役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ－鎖は、ＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを形成する。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、二つの鎖αおよびβ（または任意に、γおよびδ）のヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、一つまたは複数のジスルフィド結合などによって連結された二つの異なる鎖（α鎖およびβ鎖またはγ鎖およびδ鎖）を含有するヘテロ二量体である。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は膜貫通型タンパク質であり、可溶性形態で天然に存在するものではないが、抗体は膜結合だけでなく分泌されてもよい。重要な点として、ＴＣＲは、ＭＨＣ分子との関連で提示された場合、原則的に、細胞内および細胞外の両方で、すべての分解された細胞タンパク質から生成されたペプチドを認識できるという抗体に対する利点を有する。したがって、ＴＣＲは重要な治療の可能性を有する。
本開示はまた、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに対して向けられた抗原認識部分を含有する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）に関する（特に、Ｗａｌｓｅｎｇ Ｅ，Ｗａｌｃｈｌｉ Ｓ，Ｆａｌｌａｎｇ Ｌ－Ｅ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｖｅｆｆｅｒｓｔａｄ Ａ，Ａｒｅｆｆａｒｄ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１１９５５９を参照のこと）。特定の実施形態では、可溶性ＴＣＲは、Ｔ細胞抗原に向けられた抗体断片に融合されてもよく、任意選択的に、標的抗原はＣＤ３またはＣＤ１６である（例えば、Ｂｏｕｄｏｕｓｑｕｉｅ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．“Ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ＩｍｍＴＡＣ （ＩＭＣｇｐ１００）ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ＣＤ８＋ ａｎｄ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５２，３（２０１７）：４２５－４３８．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｍ．１２７７９を参照のこと）。
本開示はまた、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに向けられるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を包含する。ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメインに連結された、典型的には抗体に由来する抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。ＣＡＲは、選択された適切な抗原結合ドメインと共に以前に定義されたように、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞を、腫瘍ネオアンチゲンペプチドに対して方向付けるために使用され得る。
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、典型的には、抗体に由来するｓｃＦｖ（単鎖可変断片）に基づく。Ｎ末端の細胞外抗体結合ドメインに加えて、ＣＡＲは、典型的には、それが発現する免疫エフェクター細胞の細胞膜から離れて抗原結合ドメインを伸ばすためのスペーサーとして機能するヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ複合体のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ）のゼータ鎖からのシグナル伝達ドメイン、または同等のもの）、および任意選択的に、ＣＡＲを発現する細胞のシグナル伝達または機能性を補助し得る、一つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、および４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）添加されて、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生存率を高め、増殖を増やすことができる。潜在的な共刺激ドメインとしては、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、およびＤＡＰ１０が挙げられる。
したがって、ＣＡＲは以下を含み得る：
（１） その細胞外部分では、一つまたは複数の抗原結合断片、ドメイン、もしくは抗体の一部などの一つまたは複数の抗原結合分子、または一つまたは複数の抗体可変ドメイン、および／または抗体分子。
（２） その膜貫通部分では、ヒトＴ細胞受容体－アルファまたは－ベータ鎖、ＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３－エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、またはＧＩＴＲ由来の膜貫通ドメイン。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８、またはＣＤ３－ゼータに由来する。
（３） ヒトＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ－１、ＣＤ２７、ＯＸ ４０（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、およびＧＩＴＲ（ＡＩＴＲ）に由来する共刺激ドメインなどの一つまたは複数の共刺激ドメイン。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８および４－１ＢＢの両方の共刺激ドメインを含む。
（４） その細胞内シグナル伝達ドメインでは、一つまたは複数のＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、または一つもしくは二つのＩＴＡＭを欠くそのバリアント（例えば、ＩＴＡＭ３およびＩＴＡＭ２）、または細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩγに由来する。
ＣＡＲは、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを単独で、またはＨＬＡもしくはＭＨＣ分子と会合して認識するように設計され得る。
ＣＡＲおよび組換えＴＣＲを含む例示的な抗原受容体、ならびに受容体の操作方法および細胞内への導入方法については、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０００１４２５７、 ＷＯ２０１３１２６７２６、 ＷＯ２０１２／１２９５１４、 ＷＯ２０１４０３１６８７、 ＷＯ２０１３／１６６３２１、 ＷＯ２０１３／０７１１５４、ＷＯ２０１３／１２３０６１、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３１９６０、 ＵＳ２０１３２８７７４８、ＵＳ２０１３０１４９３３７、米国特許番号：６，４５１，９９５、７，４４６，１９０、８，２５２，５９２、８，３３９，６４５、８，３９８，２８２、７，４４６，１７９、６，４１０，３１９、７，０７０，９９５、７，２６５，２０９、７，３５４，７６２、７，４４６，１９１、８，３２４，３５３、および８，４７９，１１８、欧州特許出願番号ＥＰ２５３７４１６に記載されているもの、および／またはＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３ Ａｐｒｉｌ； ３（４）：３８８－３９８； Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８； Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ； ２４（５）：６３３－３９； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２ Ｍａｒｃｈ １８（２）：１６０－７５に記載されているものを含む。いくつかの態様では、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されるＣＡＲ、および国際特許出願公開第 ＷＯ／２０１４０５５６６８ Ａｌ号に記載されるものを含む。
本開示はまた、抗体、その抗原結合断片または誘導体をコードするポリヌクレオチド、前述のＴＣＲおよびＣＡＲ、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。
免疫細胞
本開示は、前述の一つまたは複数の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫細胞をさらに包含する。
本明細書で使用される場合、用語「免疫細胞」は、造血起源であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄細胞が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに対して向けられたＴＣＲを有する細胞を含む。本開示によるＴ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、粘膜関連不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）、Υδ Ｔ細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、またはタイプ１および２ヘルパーＴ細胞の両方ならびにＴｈ１７ヘルパーＴ細胞を含む、ヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されてもよい。別の実施形態では、該細胞は、ＣＤ４＋Ｔ－リンパ球およびＣＤ８＋Ｔ－リンパ球からなる群に由来することができる。該免疫細胞は、健康なドナーまたは癌に罹患している対象に由来してもよい。
免疫細胞は、血液から抽出されてもよく、または幹細胞から誘導されてもよい。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から取得することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液の単位から取得することができる。一実施形態では、対象の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって取得される。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、全血の密度勾配遠心分離、例えば、ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）勾配、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配、またはＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって得られたバフィーコートから単離され得る。Ｔ細胞は、例えばＣＤ１４ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を使用して、単球を枯渇させることによってＰＢＭＣから単離することができる。いくつかの実施形態では、赤血球は、密度勾配遠心分離の前に溶解されてもよい。
別の実施形態では、該細胞は、健康なドナー、癌と診断された対象に由来することができる。細胞は、自己または同種であり得る。
同種免疫細胞療法では、免疫細胞は患者ではなく健康なドナーから採取される。典型的には、これらは、移植片対宿主病の可能性を減少させるためにＨＬＡ一致である。あるいは、ＨＬＡ一致を必要としない可能性のある一般的な「既製」製品は、ＴＣＲαβ受容体の破壊または除去など、移植片対宿主病を減少させるように設計された改変を含む。レビューについては、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ．２０１８ Ｏｃｔ； ７（１０）：１５５を参照のこと。ベータ鎖をコードする二つの遺伝子ではなく、単一の遺伝子がアルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードするため、ＴＲＡＣ遺伝子座は、ＴＣＲαβ受容体発現を除去または破壊するための典型的な標的である。あるいは、ＴＣＲαβシグナル伝達の阻害剤が発現されてもよく、例えば、ＣＤ３ζの切断型は、ＴＣＲ阻害分子として作用し得る。ＨＬＡクラスＩ分子の破壊または除去も採用されている。例えば、Ｔｏｒｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２：１３４１－１３４９は、ＺＦＮを使用してＨＬＡ－Ａ座位をノックアウトし、一方でＲｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７；２３：２２５５－２２６６は、ＨＬＡクラスＩ発現に必要なベータ－２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をノックアウトした。Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．は、ＴＣＲαβ、Ｂ２Ｍ、および免疫チェックポイントＰＤ１を同時にノックアウトした。概して、免疫細胞は養子細胞療法で利用されるように活性化され、増殖される。本明細書に開示される免疫細胞は、インビボまたはエクスビボで増殖され得る。免疫細胞、特にＴ細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して概して活性化および増殖することができる。概して、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが付着した表面と接触することによって増殖する。
本開示の一実施形態では、免疫細胞は、以前に定義される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに向けられるように改変され得る。特定の実施形態では、該免疫細胞は、該ネオアンチゲンペプチドに向けられた組換え抗原受容体をその細胞表面に発現してもよい。「組換え」とは、その生来の状態で細胞によってコードされない、すなわち異種で、非内因性である抗原受容体を意味する。したがって、組換え抗原受容体の発現は、免疫細胞に新たな抗原特異性を導入し、細胞に前述のペプチドを認識させ、結合させると見ることができる。抗原受容体は、任意の有用な供給源から単離されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、一つまたは複数の抗原受容体をコードする遺伝子工学を介して導入された一つまたは複数の核酸を含み、抗原は、本開示による少なくとも一つの腫瘍ネオアンチゲンペプチドを含む。
本開示による抗原受容体の中には、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその構成要素、ならびに前述したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの機能的非ＴＣＲ抗原受容体がある。
免疫細胞が遺伝子改変されて組換え抗原受容体を発現することができる方法は、当技術分野で周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、例えば、ベクター、または任意の他の適切な核酸構築物の形態で細胞内に導入されてもよい。ベクター、およびその必須成分は、当技術分野で周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ＰＣＲを使用した分子クローニングを使用して作製することができる。抗原受容体配列は、部位特異的変異誘発など、一般的に使用される方法を用いて改変することができる。
本開示はまた、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞集団を提供する方法に関する。
Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を含んでもよい。
本開示に従って産生されるＴ細胞集団は、本開示の腫瘍ネオアンチゲンペプチドに特異的な、すなわち標的であるＴ細胞で濃縮されてもよい。すなわち、本開示に従って産生されるＴ細胞集団は、一つまたは複数の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の数が増加することになる。例えば、本開示のＴ細胞集団は、対象から単離された試料中のＴ細胞と比較して、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の数が増加する。すなわち、Ｔ細胞集団の組成は、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の割合または比率が増加するという点で、「天然」Ｔ細胞集団（すなわち、本明細書で論じた識別および増殖工程を経ていない集団）の組成とは異なる。
本開示に従って産生されるＴ細胞集団は、腫瘍ネオアンチゲンペプチドに特異的な、すなわち標的であるＴ細胞で濃縮されてもよい。すなわち、本開示に従って産生されるＴ細胞集団は、本開示の一つまたは複数の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の数が増加することになる。例えば、本開示のＴ細胞集団は、対象から単離された試料中のＴ細胞と比較して、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の数が増加する。すなわち、Ｔ細胞集団の組成は、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とするＴ細胞の割合または比率が増加するという点で、「天然」Ｔ細胞集団（すなわち、本明細書で論じた識別および増殖工程を経ていない集団）の組成とは異なる。
本開示によるＴ細胞集団は、本明細書に開示される腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％のＴ細胞を有し得る。例えば、Ｔ細胞集団は、本開示の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする約０．２％～５％、５％～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～７０％、または７０～１００％のＴ細胞を有し得る。
腫瘍ネオアンチゲンペプチド－反応性Ｔ細胞の増殖集団は、例えば、腫瘍ネオアンチゲンペプチドを使用して、増殖しないＴ細胞の集団よりも高い活性を有し得る。「活性」への言及は、腫瘍ネオアンチゲンペプチド、例えば、増殖に使用されるペプチドに対応するペプチド、または腫瘍ネオアンチゲンペプチドの混合物による再刺激に対するＴ細胞集団の応答を表し得る。応答をアッセイするための適切な方法は、当技術分野で公知である。例えば、サイトカイン産生を測定することができる（例えば、ＩＬ２またはＩＦＮｙ産生を測定することができる）。「より高い活性」への言及は、例えば、活性の１～５倍、５～１０倍、１０～２０倍、２０～５０倍、５０～１００倍、１００～５００倍、５００～１０００倍の増加を含む。一態様では、活性は１０００倍超高い場合がある。
好ましい実施形態では、本開示は、複数または集団、すなわち二つ以上のＴ細胞を提供し、複数のＴ細胞は、クローン性腫瘍ネオアンチゲンペプチドを認識するＴ細胞と、異なるクローン性腫瘍ネオアンチゲンペプチドを認識するＴ細胞とを含む。したがって、本開示は、異なるクローン性腫瘍ネオアンチゲンペプチドを認識する複数のＴ細胞を提供する。複数のまたは集団中の異なるＴ細胞は、代替的に、同じ腫瘍ネオアンチゲンペプチドを認識する異なるＴＣＲを有し得る。
好ましい実施形態では、複数のＴ細胞によって認識されるクローン性腫瘍ネオアンチゲンペプチドの数は、２～１０００である。例えば、認識されるクローン性ネオアンチゲンの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００、好ましくは２～１００とすることができる。異なるＴＣＲを有するが、同じクローン性ネオアンチゲンを認識する複数のＴ細胞が存在する場合がある。
Ｔ細胞集団は、すべてもしくは主にＣＤ８＋ Ｔ細胞で構成されてもよく、またはすべてもしくは主にＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の混合物で構成されてもよく、またはすべてもしくは主にＣＤ４＋ Ｔ細胞で構成されてもよい。
特定の実施形態では、Ｔ細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離されたＴ細胞から生成される。例えば、Ｔ細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離された試料中のＴ細胞から生成されてもよい。試料は、腫瘍試料、末梢血試料、または対象の他の組織からの試料であってもよい。
特定の実施形態では、Ｔ細胞集団は、腫瘍ネオアンチゲンペプチドが同定される腫瘍からの試料から生成される。言い換えれば、Ｔ細胞集団は、治療される患者の腫瘍に由来する試料から単離される。かかるＴ細胞は、本明細書では、「腫瘍浸潤リンパ球」（ＴＩＬ）と呼ばれる。
Ｔ細胞は、当該技術分野で周知の方法を使用して単離されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８の発現に基づいて試料から生成された単一細胞懸濁液から精製されてもよい。Ｔ細胞は、フィコールパック勾配を通過させることにより、試料から濃縮することができる。
癌治療方法
いずれかの実施形態では、本明細書に記載の癌治療薬は、癌細胞の増殖を阻害するための方法に使用されてもよい。本明細書に記載される癌治療薬はまた、癌に罹患している患者における癌の治療、または癌のリスクを有する患者における癌の予防的治療に使用され得る。
本明細書に記載される療法を使用して治療され得る癌は、以前に定義された任意の固形腫瘍または非固形腫瘍を含む。本開示によれば、特に興味深いのは、乳癌、黒色腫、および肺癌である。本開示の特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。
癌にはまた、他の化学療法剤を用いた治療に抵抗性のある癌も含まれる。本明細書において使用される場合、用語「難治性」は、別の化学療法剤を用いた治療後に、抗増殖反応を示さないか、または弱い反応のみ（例えば、腫瘍成長の阻害がないか、または弱い阻害のみ）を示す癌（および／またはその転移）を指す。これらは、他の化学療法剤では満足に治療することができない癌である。難治性癌は、（ｉ）一つまたは複数の化学療法剤が患者の治療中にすでに失敗している癌だけでなく、（ｉｉ）化学療法剤の存在下で、生検および培養などの他の手段によって難治性であることが示され得る癌も包含する。
本明細書に記載される療法は、以前に治療されていないそれを必要とする患者の治療にも適用可能である。
本開示による対象は、典型的には、癌と診断されたか、または癌を発症するリスクがある、それを必要とする患者である。対象は、典型的には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または腫瘍特異的免疫反応が望まれる任意の動物である。
本開示はまた、ネオアンチゲンペプチド、ＡＰＣの集団、ワクチンまたは免疫原性組成物、対象の癌ワクチン接種療法における使用のために以前に定義されたネオアンチゲンペプチドまたはベクターをコードするポリヌクレオチド、または対象の癌を治療するためのポリヌクレオチドにも関連し、ペプチドは、該対象の少なくとも一つのＭＨＣ分子に結合する。
本開示はまた、対象を治療するための治療有効量で該対象に本明細書に記載されるワクチンまたは免疫原性組成物を投与することを含む、対象において癌を治療するための方法を提供する。方法は、癌を有する対象を特定するステップを追加的に含んでもよい。
本開示はまた、本明細書に記載される方法によって抗体またはその抗原結合断片を産生すること、および該抗体またはその抗原結合断片を、癌を有する、または該抗体もしくはその抗原結合断片を発現する免疫細胞有する対象に、該対象を治療するために治療有効量で投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
本開示はまた、対象の癌治療における使用のために、任意選択的にＭＨＣまたはＨＬＡ分子と関連して、本明細書に記載される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに対して向けられる抗体（そのバリアントおよび誘導体を含む）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（そのバリアントおよびその誘導体を含む）、またはＣＡＲ（バリアントおよびその誘導体を含む）に関し、腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、該対象の少なくとも一つのＭＨＣ分子に結合する。
本開示はまた、対象の養子細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞治療における使用のために、任意選択的にＭＨＣもしくはＨＬＡ分子、または以前に定義されたネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫細胞と関連して、本明細書に記載される腫瘍ネオアンチゲンペプチドに対して向けられる抗体（そのバリアントおよび誘導体を含む）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（そのバリアントおよびその誘導体を含む）、またはＣＡＲ（バリアントおよびその誘導体を含む）に関し、腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、該対象の少なくとも一つのＭＨＣ分子に結合する。
典型的には、当業者は、癌細胞療法で使用する免疫細胞をリダイレクトするために以前に定義されたような腫瘍ネオアンチゲンペプチドを結合して認識する適切な抗原受容体を選択することができる。特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための免疫細胞は、リダイレクトされたＴ細胞、例えば、リダイレクトされたＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、上述の癌治療、ワクチン接種療法、および／または養子細胞癌療法は、追加の癌療法と組み合わせて投与される。特に、本開示によるＴ細胞組成物は、チェックポイント遮断療法、共刺激抗体、化学療法および／または放射線療法、標的療法、またはモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与されてもよい。
チェックポイント阻害剤には、限定されるものではないが、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、Ｌａｇ－３阻害剤、Ｔｉｍ－３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）阻害剤およびＣＴＬＡ－４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤などが含まれる。共刺激抗体は、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７ ＯＸ－４０、およびＧＩＴＲを含むがこれに限定されない免疫調節性受容体を介して陽性シグナルを送達する。好ましい実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。
本明細書で使用される化学療法実体は、細胞に対して破壊的である実体、すなわち細胞の生存率を低下させる実体を指す。化学療法実体は、細胞障害性薬物であってもよい。企図される化学療法剤には、限定されるものではないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、アルキルスルホン酸塩、アルキル化剤、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン、Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；生物学的応答修飾物質、例えばＩＦＮａ、ＩＬ－２、Ｇ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦ；シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン、アントラセンジオン、置換尿素、例えばヒドロキシウレア、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタンなどの副腎皮質抑制剤（ο，ρ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；プレドニゾンおよび等価物などの副腎皮質ステロイド拮抗薬を含むホルモンおよび拮抗薬、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミド；プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロンカプロエート、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含むアンドロゲン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体およびロイプロリド；および非ステロイド性抗アンドロゲン剤、例えばフルタミドなどが挙げられる。
「組み合わせて」は、本開示によるＴ細胞組成物の投与の前、投与時、または投与後の追加的療法の投与を指す場合がある。
チェックポイント遮断との組み合わせに加えて、またはその代替として、本開示のＴ細胞組成物は、ＴＡＬＥＮおよびＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓを含むがこれらに限定されない遺伝子編集技術を使用して、免疫チェックポイントに対して耐性となるように遺伝子改変されてもよい。かかる方法は当該技術分野で公知であり、例えば、ＵＳ２０１４０１２０６２２を参照のこと。遺伝子編集技術は、限定されるものではないが、ＰＤ－１、Ｌａｇ－３、Ｔｉｍ－３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ ＣＴＬＡ－４、およびこれらの組み合わせを含む、Ｔ細胞によって発現される免疫チェックポイントの発現を防止するために使用され得る。本明細書で論じるＴ細胞は、これらの方法のいずれかによって改変されてもよい。
本開示によるＴ細胞はまた、腫瘍へのホーミングを増加させる分子を発現するように、および／またはサイトカイン、可溶性免疫調節受容体および／またはリガンドを含むがこれらに限定されない腫瘍微小環境内に炎症性メディエーターを送達するように、遺伝子改変されてもよい。
特定の実施形態では、該腫瘍ネオアンチゲンペプチドは、免疫チェックポイント療法などの別の免疫療法と組み合わせて、より具体的には抗－ＰＤ１抗体、抗－ＰＤＬ１抗体、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗－ＴＩＭ－３抗体、抗－ＬＡＧ３抗体、抗－ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて、癌ワクチン接種療法で使用される。
図１：腫瘍マウス系統Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞（Ａ）およびＭＣＡ１０１－ＯＶＡ細胞（Ｂ）において開示に従ってインシリコ法によって同定され、二つの系統（Ｃ）の両方で同定された、５００ｎＭ未満のＭＨＣ対立遺伝子に対する予測親和性を有する腫瘍ネオアンチゲンペプチド（またはＴＥ由来エピトープ）。 図２：（Ａ）腫瘍マウス系統Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡおよびＭＣＡ１０１－ＯＶＡのｃＤＮＡ中のネオアンチゲンペプチドＮ２５をコードする融合転写物配列の増幅のＲＴ－ＰＣＲゲル。（Ｂ）腫瘍マウス系統Ｂ１６Ｆ１０、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ、およびＭＣＡ１０１－ＯＶＡのｃＤＮＡ中のネオアンチゲンペプチドＮ２６をコードする融合転写物配列の増幅のＲＴ－ＰＣＲゲル。 図３：（Ａ）ＤＭＳＯ（陰性対照）、ＯＶＡ（オバルブミン）（陽性対照）、ペプチドＮ２５またはペプチドＮ２６で免疫した動物の鼠径リンパ節における、ＥＬＩＳＰＯＴによるペプチド反応性ＩＦＮｇ分泌細胞の検出。（Ｂ）ＤＭＳＯ（陰性対照）、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（陽性対照）、Ｎ２５またはＮ２６ペプチドで免疫した動物の１０＾５細胞に対するＩＦＮｇスポット。 図４：（Ａ）該免疫されたマウスへの腫瘍細胞Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡの注射の数日後、ＤＭＳＯ、ＯＶＡまたはＮ２５Ｌペプチドで事前に免疫されたマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３）の推移。（Ｂ）該免疫されたマウスへの腫瘍細胞Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡの注射の数日後、ＤＭＳＯ、ＯＶＡまたはＮ２６Ｌペプチドで事前に免疫されたマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３）の推移。 図５：７８４管腔、１００ＨＥＲ２＋、１９７ＴＮＢＣ、１１２正常乳房組織、５１６原発性肺腺癌（原発性腫瘍）、および５９正常肺組織（正常固形組織）のＴＣＧＡデータセットを、記載される腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする融合転写物配列の同定方法によって分析した。（Ａ）乳癌の異なるサブタイプ（ＨＥＲ２＋、ＴＮＢＣ、正常な乳房組織および管腔）における融合転写物配列（ＴＥ－エキソン融合）の数。（Ｂ）肺癌の異なるサブタイプ（原発性肺腺癌、正常な肺組織）における融合転写物配列（ＴＥ－エキソン融合）の数。 図６：各試料由来のＴＥ遺伝子融合産物から予測された８～９アミノ酸長ペプチドを、同じ試料中で発現した予測されたＨＬＡ対立遺伝子への結合について、インシリコで試験した。各試料からの少なくとも一つのＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、または－Ｃ対立遺伝子に対して５００ｎＭ未満の親和性が予測されるペプチドを示す。（Ａ）乳癌の異なるサブタイプ（ＨＥＲ２＋、ＴＮＢＣ、正常な乳房組織および管腔）の試料。（Ｂ）肺癌の異なるサブタイプ（非小細胞肺癌、正常な肺組織）の試料。 図７：乳房腫瘍サブタイプ全体での患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布。（Ａ）乳癌患者のサブタイプ当たりの腫瘍特異的ＨＬＡ結合ペプチドの数を示す。 （Ｂ）管腔サブタイプ試料間で共有される予測される腫瘍ネオアンチゲンペプチドの数（ｎ＝７８４）（横座標）。 （Ｃ）ＨＥＲ２＋サブタイプ試料間で共有される予測される腫瘍ネオアンチゲンペプチドの数（ｎ＝１００）（横座標）。 同上。 （Ｄ）ＴＮＢＣサブタイプ試料間で共有される予測される腫瘍ネオアンチゲンペプチドの数（ｎ＝１９７）（横座標）。 図８：（Ａ）原発性肺腺癌（ＬＵＡＤ）試料（肺癌）当たりの腫瘍特異的ＨＬＡ結合ペプチドの数。 （Ｂ）肺腺癌全体での患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布。原発腫瘍サブタイプ試料間で共有される予測される腫瘍ネオアンチゲンペプチドの数（ｎ＝５１６）（横座標）。 図９：ドナーがエキソン（Ａ）である場合、およびドナーがＴＥ（Ｂ）である場合の融合ヌクレオチド配列の再構成。 図１０：ＨＬＡ－Ａ２へのキメラ転写物由来ペプチドの結合。最も頻度の高いキメラ融合物からの予測されるペプチドのＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子への結合を、四量体形成アッセイを使用したフローサイトメトリーにより検証した。結果は、陽性対照に対する結合の割合として示されている。点線は、この対立遺伝子への結合を確認するために考慮された閾値を示す。 図１１．融合転写物由来ペプチドの免疫原性および反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生成。（Ａ）分析された６人の健康なドナーに対する免疫原性アッセイにおいて、自己ｍｏＤＣによって誘導された示された融合転写物由来ペプチドに対する四量体陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。（Ｂ）異なる濃度の特異的ペプチドで刺激した後のＣＴＬ－クローンのサイトカイン分泌。右側には、生成されたＣＴＬ－クローンとそのペプチド特異性がリストされている。（Ｃ）抗ＭＨＣ－Ｉ抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせた２つの異なるペプチド濃度でロードした標的細胞（左パネル）、または異なる比率でロードされていない標的細胞（右パネル）との共培養におけるＣＴＬ－クローン９の殺傷アッセイ。（Ｄ）抗ＭＨＣＩ－Ｉ抗体またはアイソタイプ対照と組み合わせてペプチドをアンロードした標的細胞と共培養した場合のＣＴＬ－クローン９、８０および６４に対する殺傷アッセイ。エフェクター：標的比は、各個々のプロットに示される。Ｈ１６５０を、この図の各プロットの標的細胞として使用した。 図１２．融合由来ペプチドを認識するＴＣＲの発現。標的細胞のみと共培養された、または２つの異なるペプチド濃度でロードされた、ＣＴＬ－クローン９に由来するＴＣＲ配列を有する形質導入されたジャーカットレポーター細胞。プロットは、Ｈ１６５０細胞株を標的細胞として（上のプロット）、またはＨ１３９５細胞株を標的細胞として（下のプロット）、フローサイトメトリーによって評価した３つのレポーター遺伝子に対する陽性ジャーカット細胞の割合を示す。陰性対照：非形質導入ジャーカット細胞。ペプチドなし：ペプチドをアンロードした標的細胞と共培養した、形質導入されたジャーカット細胞。陽性対照：ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激された形質導入されたジャーカット細胞。 図１３．融合転写物由来ペプチドを認識する腫瘍浸潤リンパ球。融合転写物由来ペプチドの混合＋ＩＬ２（Ａ）またはＩＬ－２のみ（Ｂ）の存在下で増殖した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中に見られる、示された融合転写物由来ペプチドに対する四量体陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。 図１４．ＬＵＡＤ患者由来の試料中の融合転写物由来ペプチドを認識するＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型。ＬＵＡＤ患者２（Ａ、上部パネル）および患者３（Ｂ、上部パネル）に由来する腫瘍、近傍腫瘍、リンパ節および血液試料に存在する融合転写物由来ペプチドを認識する四量体陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の割合。図（Ａ）および図（Ｂ）の下部パネルには、四量体陽性親細胞集団のナイーブ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５＋）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＣＲ７－ＣＤ４５－）およびターミナルエフェクター（ＴＥ、ＣＣＲ７－ＣＤ４５＋）細胞の割合が示されている。 図１５．肺腫瘍試料の免疫ペプチドミクス解析。融合転写物由来ペプチド配列を、公開のＭＨＣ－Ｉ免疫ペプチドームデータセットで検索した。各列は、異なる試料を表す。各行は、異なるペプチド配列を表す（右側に指定）。色のついた四角は、各融合転写物由来ペプチドがどの試料で発見されたかを示す。各試料データセットを説明する出版物は、上部に注釈付けされている。
１．実施例１：腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする融合転写物配列の特定
１．１ マウスにおける概念実証
融合転写物配列から発せられた個々の共有腫瘍ネオアンチゲンペプチドを検出するために、バイオインフォマティクスパイプラインが開発されている。このパイプラインは、ＴＥ配列の一部およびエキソン配列の一部で構成された腫瘍特異的ｍＲＮＡ配列を特定するよう設計される。このパイプラインは、ＭＨＣ対立遺伝子を決定することを意味する。各ヒト試料について、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ対立遺伝子は、ｓｅｑ２ｈｌａ（ｖ２．２）ツール（ｂｉｔｂｕｃｋｅｔ．ｏｒｇ／ｓｅｂａｓｔｉａｎ＿ｂｏｅｇｅｌ／ｓｅｑ２ｈｌａ）を使用して決定することができる。マウスモデルの場合、マウスＨ－２対立遺伝子は一般に知られている。バイオインフォマティクス法は、参照ゲノムに対するＲＮＡ配列決定からの転写物のマッピングを含む。ここで説明した概念実証分析については、マウスにｍｍ１０、ヒトにｈｇ１９を使用した。組み立てられたゲノムの異なるバージョンを、例えば、ｈｇ１９、ｈｇ３８、ｍｍ９、またはｍｍ１０などに用いることができる。このマッピングは、ＳＴＡＲ（ｖ２．５．３ａ）（ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｌｅｘｄｏｂｉｎ／ＳＴＡＲ）を用いて以下の設定で実行される：
－ 遺伝子座の最大数を設定するパラメータｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘのマルチヒットマッピングを可能にするために、リードがマッピングできるようにし、１０００に設定し、
－ 異常な接合部（融合）を検出するために、融合セグメントの最小長さを設定するパラメータｃｈｉｍＳｅｇｍｅｎｔＭｉｎを１０に設定し、融合接合部の最小オーバーハングを設定するパラメータｃｈｉｍＪｕｎｃｔｉｏｎＯｖｅｒｈａｎｇＭｉｎを１０に設定する。
正常（ＳＪ．ｏｕｔ．ｔａｂ出力ファイルから）および異常（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ．ｏｕｔ．ｊｕｎｃｔｉｏｎ出力ファイルから）の接合部は、Ｅｎｓｅｍｂｌおよびｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒデータベースを使用して注釈付けされる。正常な接合部は、マッピングに使用されるパラメータ（最大イントロン長さ＜＝１,０００,０００ｂｐ（－－ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘにより設定）、同じ染色体およびウェル配向）に合致する全ての接合部を定義し、異常な接合部は、前の基準の少なくとも一つと合致しない接合部である。これは、ＴＥ／エキソン接合部は両方の接合部型であってもよいが、エキソン／エキソン接合部は標準ファイル（ＳＪ．ｏｕｔ．ｔａｂ）でなければならないことを意味する。ＴＥ配列とエキソン配列との間の接合部を含む転写物配列は、インシリコで抽出される。転写物配列のうち接合部と重複する領域、またはフレームから外れた場合は接合部の下流（リーディングフレーム非標準）から、ソフトウェアは、全てのリーディングフレームにおいて、８または９ｍｅｒの全ての可能性のあるペプチドを予測する。次いで、一致した試料に対して以前に定義されたＭＨＣ対立遺伝子に対するこれら全ての可能性のあるペプチドの結合親和性を、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ（ｖ３．４）（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）で決定した。現在、ペプチドの結合親和性を予測するための十数種類の様々な予測アルゴリズムが存在しており、ＮｅｔＭＨＣはネオアンチゲン予測パイプラインに最も広く使用され、検証されたアルゴリズムである。
５００ｎＭ未満またはパーセンタイルランク２％未満のペプチドは、潜在的なネオアンチゲンとみなされる。各スプライス部位（ドナーまたはアクセプター）は、ＴＥまたはエキソンとして一意に注釈付けされる。５’末端の一部は、「ドナー」に認定されており、３’末端の一部は、「アクセプター」に認定されている。
癌と正常組織の間で共有される予測されるＨＬＡ結合ペプチドは、さらなる解析から除外される。
この方法は、７つのよく特徴付けられたマウス腫瘍細胞株（Ｂ１６Ｆ１０、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ、ＭＣＡ１０１、ＭＣＡ１０１－ＯＶＡ、ＭＣ３８、ＭＣ３８－ＧＦＰ、ＭＣ３８－ＧＦＰ－ＯＶＡ）から得られたＲＮＡｓｅｑデータに適用されている。伸長－ＯＶＡを有する細胞株は、同じモデルに対応するが、オバルブミンをさらに発現する。この研究では、この系統は類似のモデルとみなされ、例えば、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡからの細胞株上で実施されたアッセイは、Ｂ１６Ｆ１０からの細胞株上で実施されたアッセイの繰り返しとみなされる。
これらのパラメータ（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）を用いて候補ペプチドのリストを取得しており、いくつかは特定の細胞株に特異的であり（図１Ａおよび１Ｂ）、いくつかは二つの腫瘍細胞株間で共有されていた（図１Ｃ）。
検証のために、我々は、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡまたはＭＣＡ１０１－ＯＶＡのいずれかで発現され、予測親和性が５００ｎＭ未満であるペプチドの範囲を選択した。ペプチドは、読み取り数とＭＨＣ－Ｉに対する予測される親和性との間の比を最適化しようと選択された。
四つの予測される腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択し、ＴＥおよびエキソン配列を特定することによって特徴付けた（表３）。
１．２ 融合転写物配列のＲＴ－ＰＣＲによる検証
第一に、通常のＲＴ－ＰＣＲによる検証が、ＴＥ配列の一方のプライマーとエキソン配列の他方のプライマーとのプライマー対を使用して実施されてきた。
ＲＮＡ抽出および逆転写のために、３～５．１０６の細胞を５００μＬのトリゾール中で溶解し、遠心分離前に１００μＬのフェノール－クロロホルムを可溶化液に添加した。水性相を収集し、１００％ＥｔＯＨと１：１の比率で混合し、ＲＮＡｅａｓｙ ｍｉｎｉｋｉｔカラムに移した。その後、製造業者の指示に従ってＲＮＡを回収した（カラムＤＮＡｓｅ処理を含む）。ＲＮＡ溶出後、製造業者の指示に従って、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理することにより、ＤＮＡ汚染物をさらに除去した）。ＲＮＡ濃度をナノドロップを使用して測定し、１μｇのＲＮＡを逆転写に使用した。製造業者の指示に従って、プライマーとしてｏｌｉｇｏｄＴ（１５）を使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、第一鎖合成を実施した。プライマーをＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから注文した。Ｔａｑポリメラーゼを使用してＰＣＲ反応を実施した。各反応の最適条件を特定した後、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、ＧＡＴＣ ｌｉｇｈｔｒｕｎを使用して配列決定を行った。配列アライメントをＡＰＥソフトウェアで確認した。
このアプローチを使用して、Ｎ２５、Ｎ２６、Ｎ９０、およびＮ９４の予測サイズに合致するバンドが、表１で識別された細胞株でそれぞれ検出された（Ｎ２５については図２Ａを参照）。興味深いことに、Ｎ２６は、パイプラインで前述したようにＲＮＡｓｅｑによってインシリコでＭＣＡおよびＭＣ３８細胞でのみ検出されたが、ＲＴ－ＰＣＲを使用して、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞中のＮ２６に対応するバンドを検出し（図２Ｂ）、この配列が三つの独立した腫瘍細胞株（ＭＣＡ、ＭＣ３８およびＢ１６Ｆ１０）間で共有されていることを示した。ＲＮＡｓｅｑデータを再分析することによって、Ｎ２６接合部がＢ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞に存在するが、アルゴリズムの検出閾値未満であることを発見した。さらに、ＲＴ－ＰＣＲ産物の配列決定は、アルゴリズムによって予測される配列と完全一致を示した。
１．３ マウスのインビボ免疫
これらの候補をインビボで検証するために、ＭＨＣクラスＩ配列に結合するネオアンチゲンペプチドに対応する短い（９－ｍｅｒ）ペプチドを合成した。インビボアッセイでは、９ｍｅｒの予測されるＭＨＣ結合の短いペプチドの隣接領域を含む長い（２７－ｍｅｒ）ペプチドを合成した。これは、この長さがインビボ免疫により適しているためである。Ｂ１６Ｆ１０ ＯＶＡおよびＭＣＡ１０１－ＯＶＡは、ＲＰＭＩ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン中で維持され、ＴｒｙｐＬＥを使用して継代された。細胞を、最大一か月間培養物中で保持し、各インビボ実験について新しいバイアルを解凍した。Ｃ５７ＢＬ６Ｊレシピエントマウスを、１００μｇのロングペプチド（Ｎ２５ＬまたはＮ２６Ｌ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ショートＯＶＡペプチド）、ＯＶＡ（シグマ）またはＤＭＳＯで、それぞれ５０μｇのポリＩ：Ｃと共に、脇腹に皮下注射することによって免疫した。一次免疫の７日後、免疫が繰り返された。３日後（一次免疫の１０日後）、動物を犠牲にし、鼠径リンパ節中のペプチド特異的ＩＦＮｇ分泌ＣＤ８ Ｔ細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴによって検出した（図３Ａ）。ショートペプチド（Ｎ２５、Ｎ２６、またはＳＩＩＮＦＥＫＬ）またはＤＭＳＯを１０μｇ．ｍＬ－１で使用して、Ｔ細胞を再刺激した。あるいは、二次免疫の７日後、動物に、ＰＢＳ中、２．５．１０５のＢ１６Ｆ１０－ＯＶＡまたは５．１０５のＭＣＡ－ＯＶＡ細胞を皮下注射した。我々は、Ｎ２５、およびより少ない程度でＮ２６が免疫反応を誘導できることを発見した（図３Ｂ）。
１．４ 腫瘍を有するマウスのインビボ治療
これらのペプチドが腫瘍細胞に対して保護的かどうかを検証するために、Ｃ５７ＢＬ６マウスを、１００ｍｇのペプチドＮ２５ＬもしくはＮ２６Ｌ、またはＯＶＡ（対照ペプチド）、およびＰＢＳ中の５０μｇのポリＩ：Ｃで、ｄ０およびｄ７に免疫し、ｄ１４に、ＯＶＡ、Ｎ２５Ｌ、およびＮ２６Ｌで免疫されたマウスに２．５．１０５のＢ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞を注射した。Ｂ１６Ｆ１０ ＯＶＡおよびＭＣＡ１０１－ＯＶＡは、ＲＰＭＩ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン中で維持され、ＴｒｙｐＬＥを使用して継代された。細胞を、最大一か月間培養物中で保持し、各インビボ実験について新しいバイアルを解凍した。Ｃ５７ＢＬ６Ｊレシピエントマウスを、１００μｇのロングペプチド（Ｎ２５ＬまたはＮ２６Ｌ）、ＯＶＡ（シグマ）またはＤＭＳＯで、それぞれ５０μｇのポリＩ：Ｃと共に、脇腹に皮下注射することによって免疫した。免疫を一次免疫の７日後に繰り返した。
ショートペプチド（Ｎ２５、Ｎ２６、またはＳＩＩＮＦＥＫＬ）またはＤＭＳＯを１０μｇ．ｍＬ－１で使用して、Ｔ細胞を再刺激した。あるいは、二次免疫の７日後、動物に、ＰＢＳ中、２．５．１０５のＢ１６Ｆ１０－ＯＶＡまたは５．１０５のＭＣＡ－ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍サイズは、手動キャリパーを使用して週に二回測定され、実験期間を通して動物の健康状態をモニターした（図４Ａおよび４Ｂ）。腫瘍体積が１ｍｍ３に達したときに、動物を犠牲にした。驚くべきことに、Ｎ２５Ｌは、ＯＶＡよりも効率的な方法で、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍の形成を有意に遅延させることが観察された。さらに、Ｎ２６Ｌ免疫でも同様の結果を得た。
実施例２：ＴＥ要素とエキソン配列から構成される融合転写物に由来するヒト肺腺癌（ＬＵＡＤ）ネオアンチゲンペプチドの特定
２．１ 材料および方法
ＲＮＡ抽出。腫瘍試料および近傍腫瘍試料を、＃１ｍｍ３の断片に切断し、１％のβ－メルカプトエタノールを補充した７００μｌのＲＴＬ溶解緩衝液（Ｑｕｉａｇｅｎ）に再懸濁し、Ｐｅｒｅｃｅｌｌｙｓ ２４ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）を使用してホモジナイズした。製造業者の指示に従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡ単離を行った。腫瘍細胞株からの総ＲＮＡを、同じ手順を用いて５．１０６の腫瘍細胞株から抽出した。
ＰＣＲおよび配列決定。プライマーは、ＡＰＥソフトウェアを使用して設計した。各試料について、提供者が指示するように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ反応を、ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。すべてのプライマーを、０．５μｍの濃度で使用した。反応をＶｅｒｉｔｉ（商標）９６－ウェルサーマルサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実施した。ＰＣＲ産物をＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）にロードし、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ソフトウェア（ｖ４．２）により分析した。
予想されるサイズの増幅産物を含むこれらの試料について、ＰＣＲ反応を繰り返した。次いで、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルＳＹＢＲ Ｆｒｅｅ Ｄｙｅ（１／１００００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動した。特定のバンドを切断し、製造業者の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡ産物を精製した。最後に、これらの産物をＥｕｒｏＦｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより配列決定した。得られた配列を、Ｓｅｒｉａｌ Ｃｌｏｎｅｒソフトウェアを使用して予想されたものと比較した。
四量体形成。ＨＬＡ－Ａ２モノマーをＩｍｍｕｎＡｗａｒｅ（登録商標）から購入し、四量体の形成を、合成ＥＲ由来ペプチドを用いて製造業者の指示に従って評価した。簡潔に述べると、合成ＨＬＡ－Ａ２モノマーを、４８時間、１８℃で合成ペプチドとインキュベートした。四量体形成は、ビオチン化セファロースでモノマーをさらにインキュベーションすることによって行われた。最後に、四量体形成を、ＰＥコンジュゲート抗－β２ミクログロブリン抗体を使用してフローサイトメトリーにより測定した。陽性対照として、製造業者から提供されたＣＭＶ由来のペプチドを使用した。
特定のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を評価するための実験では、モノマーを蛍光ストレプトアビジンの異なる組み合わせ（ＰＥ、ＡＰＣ、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰＥ－ＣＦ５９４、ＢＶ４２１、ＢＶ７１１およびＦＩＴＣ）でインキュベートすることによって、四量体化工程を実施した。
ナイーブＣＴＬのプライミング。ＰＢＭＣは、ＨＬＡ－Ａ２＋健康な血液ドナーからのＦｉｃｏｌｌ勾配分離によって得られた。ＣＤ１４＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋細胞を、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してポジティブ選択により精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を実験日まで凍結保存したが、ＣＤ１４＋画分を、ＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で１０６細胞／ｍＬで５日間培養し、ｍｏＤＣを得た。この期間の後、ｍｏＤＣをＬＰＳで成熟させ、最終濃度１μｇ／ｍＬで２時間、合成ＥＲ由来ペプチドと共にインキュベートした。最後に、ＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１００ｎｇ／ｍｌ）で補充された培養培地中で、自己ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞とペプチドをロードしたｍｏＤＣを共培養した。特定のＣＤ８＋ＣＴＬ集団のＥＲ由来ペプチド刺激を、各ペプチドに二色四量体の組み合わせを使用したフローサイトメトリーによるＭＨＣ－Ｉ四量体染色により評価した。
四量体染色。細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ－４０５ｎｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で２０分間、４℃で染色し、一回洗浄した。その後、細胞をＳＡ共役四量体の混合物を含有するＰＢＳ－１％ＢＳＡに再懸濁し、暗所で、室温で２０分間インキュベートした。さらなる洗浄を行うことなく、表面抗体をＰＢＳ－１％ＢＳＡに添加し、細胞を暗所で４℃で２０分間インキュベートした。表面抗体は、必要に応じて、抗－ＣＤ３－ＢＶ６５０＋抗－ＣＤ８－ＰＥＣｙ７と、抗－ＣＣＲ７－ＡＦ７００＋抗－ＣＤ４５ＲＡ－ＢＵＶ３９５との組合せであった。最後に、細胞を二回洗浄し、フローサイトメトリー分析のためにＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
ＣＴＬ－クローン生成。四量体陽性細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートで単一細胞ＦＡＣＳソーティング（ＡＲＩＡソーター、ＢＤ）した。ソーティングされた細胞を、１５０．０００個のフィーダー細胞を含有する、１００μＬのＲＰＭＩ １０％ヒト血清ＡＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に収集した。最後に、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍｌ）および抗－ＣＤ３（１００μｇ／ｍｌ、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＯＫＴ３クローン）を含有する１００μＬのＡＩＭ培地を添加し、細胞を最大１５～２０日間培養した。明らかな細胞増殖がウェルで観察された場合、二回目の増殖を新しいフィーダーの細胞を用いて、さらに最長１５日間行う。細胞は、この期間中に必要に応じて、同じ培養培地（ＡＩＭ－ＲＰＭＩ ５０／５０ ＋ ５％ヒト血清）だがＩＬ－２を５００ ＩＵ／ｍｌで含有する培地で、供給および分割された。最後に、増殖クローンの特異性についてＦＡＣ－四量体染色でチェックし、四量体陽性クローンのうち８５％を超えるクローンのみをさらに分析するために使用した。
殺傷アッセイ。殺傷アッセイを実施するために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓ１６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した。Ｈ１６５０細胞株を、予めコーティングされた１６ウェルプレート中に０，５×１０６細胞／ｍｌで播種した。一日後、細胞は、異なる濃度の対応する合成ペプチドと共に１時間インキュベートされたか、されなかったかであった。その後、細胞を培地で二回洗浄し、同濃度の抗ＭＨＣ－Ｉ抗体（クローンＷ６／３２、５０μｇ／ウェル）またはアイソタイプ対照と共にさらに３０分間インキュベートしたか、しなかったかであった。追加の洗浄なしに、ＣＴＬ－クローンを、対応する比率で添加した。完全なアッセイを、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムに接続した最終容量２００の無血清培地で３７℃で行った。インピーダンス変動（細胞指数）を、４０時間中リアルタイムで測定した。各条件は、重複して実施した。
サイトカイン分泌とジャーカット細胞の活性化。５０．０００個のＨ１６５０細胞を、５％のウシ胎児血清を補充した培地の９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を異なる最終濃度の合成ペプチドで１～２時間培養した。その後、細胞を二回洗浄し、ＣＴＬクローンを１：１の比率で添加し、ペプチドをロードした標的細胞と１８時間共培養した。培養上清を収集し、製造業者の指示に従ってサイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりサイトカイン濃度を分析した。
同じ実験を、ＣＴＬ－クローンおよび二つの異なるタイプの標的細胞：Ｈ１６５０およびＨ１３９５細胞株の代わりに形質導入されたジャーカット細胞を使用して実施した。このアッセイでは、ペプチドをロードした標的細胞と共培養した後、ジャーカット細胞を、レポーターマーカーの発現を分析するフローサイトメトリーによって評価した。ＰＭＡ／イオノマイシンを陽性対照ルとして使用して、ジャーカット細胞を活性化した。
組織および血液試料。肺腫瘍、近傍腫瘍、およびリンパ節試料を小片に切断し、コラゲナーゼ－Ｉ（２ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（２ｍｇ／ｍｌ）、およびＤＮａｓａ（２５μｇ／ｍｌ）の混合物を使用して、最終容積の２ｍｌの培地（ＣＯ２独立培地＋５）中で、４０分間、３７℃で消化した。消化後、単一細胞懸濁液を、細胞ストレーナーを介して収集し、洗浄した。腫瘍および近傍腫瘍懸濁液は、フィコール勾配によってリンパ球画分で濃縮された。その後、細胞は、前述したようにＦＡＣによる四量体分析のために染色された。
血液試料を、フィコール勾配上に播種し、ＰＢＭＣを単離した。その後、ＥａｓｙＳｔｅｐヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＢＭＣをＣＤ８＋ Ｔ細胞用に濃縮した。最後に、濃縮細胞を、前述したように四量体分析のために染色した。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）培養。腫瘍組織を小片に切断した（１～３ｍｍ３のサイズ、最大６～１２個）。各腫瘍断片を、２４ウェルプレートから個々のウェルに移し、２ｍｌのＲＰＭＩ １０％ヒト血清＋ＩＬ－２ ６０００ ＩＵ／ｍｌの最終容積で培養した。細胞は、必要に応じて１５～２０日間にわたって供給／分割され、四量体染色用に凍結保存または分析された。
ＴＣＲクローニング。全ＲＮＡをＣＴＬ－クローンから抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１９に記載されるように、ＴＣＲαおよびβをＰＣＲにより増幅した。ＤＮＡ産物を２％アガロースゲルで泳動し、ゲルバンド抽出（Ｑｉａｇｅｎ）後に配列決定した。ＴＣＲ Ｖ領域（αおよびβ）を、マウスＴＣＲ定常鎖と連結し、ＰＥＷ－ｐＥＦ１Ａ－ｉｎａｃｔＥＧＦＰベクターにクローニングし、形質転換細菌で増幅した。
ジャーカット形質導入。レンチウイルス粒子は、エンベロープ（ｐＶＳＶＧ）プラスミドおよびパッケージング（ｐｓＰＡＸ２）プラスミドと共に、ＴＣＲ発現プラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３ＦＴ細胞株によって産生された。６４時間後、上清を収集し、レンチウイルス粒子を、１００ｋＤａ遠心フィルター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して濃縮した。レンチウイルス懸濁液を、レポーター遺伝子（ＮＦＡＴ－ＧＰＦ、ＮＦ－ＫＢ－ＣＦＰ、およびＡＰ－１－ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現するＴＣＲ陰性ジャーカット細胞に、スピノキュレーションによって移した。５日後、遺伝子導入効率を、抗マウスＴＣＲ－β抗体（クローンＨ５７－５９７）を使用してＦＡＣＳによって評価した。このジャーカット細胞は、Ｒｏｓｓｋｏｐｆ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１８に記載されている。
質量分析データ解析。ＭＨＣ溶出ペプチドに由来する公開免疫ペプチドミクスの生データを、ＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、以下のパラメータで分析した：酵素なし、ペプチド長８～１５ａａ、前駆体質量公差２０ｐｐｍ、および断片質量公差０．０２Ｄａ。変数変更としてメチオニンを有効にし、１％の偽発見率（ＦＤＲ）を適用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、肺ＴＣＧＡプロジェクトからの全ての融合転写物由来タンパク質のリストと連結されたＵｎｉｐｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（更新０６．０３．２０２０）からのヒトプロテオームに対して検索した。最後に、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースと合致するペプチド、または肺正常試料中に存在する翻訳融合転写物と合致するペプチドを廃棄した。
２．２ 結果：ヒト対象における腫瘍ネオアンチゲンペプチドをコードする融合転写物配列の特定
２．２．１ ネオアンチゲンの特徴付け
まず、ＴＣＧＡ公開データベースからの通常の試料において、ＴＥ－エキソン融合転写物ランドスケープを特徴付けた。１９の異なる組織（胆管、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、膵臓、ＰＣＰＧ、前立腺、直腸、肉腫、皮膚、胸腺、甲状腺、子宮）からの６７９の正常試料において、合計８８７６の固有の融合物が特定された。各組織型への特異的融合は、汎組織融合転写物のごく一部で見出された。これらの結果は、専用の組織特異的調節機構がこれらの融合転写物と関連していることを示唆する。
次いで、ＴＣＧＡからの５１４のＬＵＡＤ試料で特定された融合の数を、ＴＣＧＡに存在する５９の正常な関連肺試料と比較した。健康な肺試料の２００と比較して、ＮＳＣＬＣ試料では平均で２３５の融合が同定された（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｐｖａｌｕｅ＝９×１０．－１０）。合計８２６９の固有融合がＮＳＣＬＣ腫瘍で同定された。
ＴＳＦ（腫瘍特異的融合）と呼ばれる第一のカテゴリーは、腫瘍試料の少なくとも１％で見られ、正常試料ではまったく見られない融合として得た。したがって、２１０の融合をＴＳＦとして定義した。
腫瘍では高頻度、正常細胞では低頻度の融合転写物もまた、ネオアンチゲンの良好な候補であり得る。したがって、ＴＡＦ（腫瘍関連融合）と呼ばれる第二のカテゴリーは、正常組織の４％未満、特に２％未満、および１０％超の腫瘍に存在し、正常な組織試料と比較して腫瘍で過剰発現される融合として、特に定義された。
表３および４（以下を参照）は、エキソンまたはＴＥのどちらがドナーであるかによる融合を記述する。最初の列は、ＮＳＣＬＣコホートにおける融合の頻度を示す。ドナーとアクセプターの列は、各要素の種類を紹介する。「ドナー」で始まるすべての列（それぞれ「アクセプター」）は、ドナー（それぞれアクセプター）に関する情報である。融合の配列は、以下のように取り出すことができる：
－ ドナー配列：鎖「ドナー＿鎖＿Ｘ」の「ドナー＿スタート＿Ｘ」から「ドナー＿ブレークポイント＿Ｘ」の染色体「ドナー＿染色体＿Ｘ」上
－ アクセプター配列：鎖「ドナー＿鎖＿Ｘ」の「アクセプター＿エンド＿Ｘ」から「アクセプター＿ブレークポイント＿Ｘ」の染色体「アクセプター＿染色体＿Ｘ」上
融合がマイナス鎖上に存在する場合、配列の逆相補体を取るように注意すべきである。
融合配列：
－ 融合ヌクレオチド配列を再構築するために、鎖「ドナー＿鎖＿Ｘ」の「ドナー＿スタート＿Ｘ」から「ドナー＿ブレークポイント＿Ｘ」の染色体「ドナー＿染色体＿Ｘ」上のドナーの配列と、鎖「アクセプター＿鎖＿Ｘ」の「アクセプター＿ブレークポイント＿Ｘ」から「アクセプター＿エンド＿Ｘ」の染色体「アクセプター＿染色体＿Ｘ」上のアクセプター配列とを、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＨＧ１９ヒトアセンブリデータベースから抽出した。Ｅｎｓｅｍｂｌ ＨＧ１９ヒトデータベースの使用は制限的ではなく、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）などの他の適合データベースも使用され得ることに留意されたい。
－ 融合がマイナス鎖上に存在する場合、配列の逆相補体を取るように注意すべきである。
－ 「融合配列」は、ドナー配列に続いてアクセプター配列からなる。
融合転写物のヌクレオチド配列：
エキソンが関与する公知の標準転写物に基づいて、全ての「融合転写物」を再構築した。
ドナーがエキソンの場合（図９Ａを参照）
・ それはドナーエキソンへの標準転写物の開始から始まり、完全な標準エキソン配列を融合配列に置換する。この場合、融合転写物は、アクセプターのＴＥ配列の後に停止する。
ドナーがＴＥの場合（図９Ｂ）
・ 配列は転写物中のアクセプターエキソンの標準位置で始まり、上流のすべてのエキソンを忘れる。アクセプターエキソンの標準配列を融合配列で置換し、転写物を最後まで再構成した。
次いで、融合転写物のサイズｋ（すなわち、２４～７５ヌクレオチド）の各ヌクレオチド配列（第一のｋ－ｍｅｒの翻訳は、融合転写物の第一のヌクレオチドで始まり、第二のｋ－ｍｅｒの翻訳は、融合転写物の第二のヌクレオチドで始まる、など）をペプチド配列に翻訳した。
次いで、得られたペプチドを、ＭＨＣ結合予測のためにＮｅｔＭＨＣｐａｎを用いてさらに分析する。したがって、公知のヒト対立遺伝子の少なくとも一つに結合する親和性が、配列中に存在する各ｋ－ｍｅｒについて予測された（さらなる説明については実施例１も参照されたい）。
表３．ドナーがエキソンである融合配列の座標。列名は以下のとおりである。
１．ＬＵＡＤコホートにおける頻度
２．ドナー染色体エキソン
３．ドナースタートエキソン
４．ドナーブレークポイントエキソン
５．ドナー鎖エキソン
６．ドナー転写物（すなわち、ドナー＿ｔｘ＿ネーム＿エキソン）
７．アクセプター染色体ＴＥ
８．アクセプターブレークポイントＴＥ
９．アクセプターエンドＴＥ
１０．アクセプター鎖ＴＥ
１１．融合の種類
表３の融合転写物配列は、同一の順序で配列番号１１８～４３１に対応する（典型的には、１行目は配列番号１１８であり、２行目は配列番号１１９であり、３行目は配列番号１２０および１２１に対応する。これは、２つのドナー転写物（第６列目に示されるように、それぞれＥＮＳＴ０００００２９６４７４およびＥＮＳＴ０００００３４４２０６）などのためである）。
表４．ドナーがＴＥである融合配列の座標。列名は以下のとおりである。
１．ＬＵＡＤコホートにおける頻度
２．ドナー染色体ＴＥ
３．ドナースタートＴＥ
４．ドナーブレークポイントＴＥ
５．ドナー鎖ＴＥ
６．アクセプター染色体エキソン
７．アクセプターブレークポイントエキソン
８．アクセプターエンドエキソン
９．アクセプター鎖エキソン
１０．アクセプター転写物
１１．融合の種類
表４の融合転写物配列は、同一の順序で配列番号：４３２～９１０（上記表３と同じ理由付けで）に対応する。
次いで、ペプチドを、参照プロテオームに対して、典型的には、ヒト対象の場合はＵｎｉｐｒｏｔに存在する全ての配列（ヒトエキソームにコードされる全ての配列を表す）に対して、さらにスクリーニングした。ペプチドは、同じアミノ酸配列を有する場合、または最初もしくは最後の位置でアミノ酸のみが異なる場合、Ｕｎｉｐｒｏｔのペプチドと同等であるとみなされた。次いで、これらの等しい配列はすべて候補リストから破棄した。したがって、ＨＬＡ－Ａ２に結合すると予測されるこれら２３０の融合転写物に由来する１１７のペプチド配列：０１（以下の表５を参照）。
２．２．２ ＨＬＡ－Ａ２関連ペプチドの検証
ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子が白人集団のほぼ５０％で発現されていることを考えると、異なる技術ツールの存在と共に、検証はＨＬＡ－Ａ２－関連ペプチドに焦点を当てた。
以下の段落では、ＴＥ－エキソン由来転写物は「融合転写物」と互換的に使用され、「ＴＥ由来ペプチド」という用語は「融合転写物由来ペプチド」と互換的に使用される。
肺腺癌試料におけるＴＥ－エキソン由来転写物の発現
予測されるＴＥ－エキソン転写物を実験的に検証するために、ＬＵＡＤ腫瘍試料および腫瘍細胞株におけるＰＣＲによる発現を最初に検証した。したがって、各キメラ融合に対する特定のプライマーを、それらのうちの一方を融合のＴＥ部分に結合させ、他方を融合のエキソン部分に結合させるように設計した。結果を、ＰＣＲ産物の配列決定によってさらに確認した。
特に、特定のプライマーを、フォワードプライマーが再構成された融合配列の「ドナー」配列で結合し、リバースプライマーが再構成された融合配列の「アクセプター」配列で結合するように設計した。ＰＣＲ反応を、肺腫瘍試料およびヒト腫瘍細胞株に由来するＲＮＡで実行した。増幅産物をアガロースゲル上に播種し、予想されるサイズで発見されたバンドを切断し、配列決定した。最後に、配列決定されたＰＣＲ産物を、再構成された融合配列と比較した。
このアプローチを使用して、ＬＵＡＤ腫瘍試料および腫瘍細胞株の両方において、予測される融合転写物の存在を確認することができた。以下の表６は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子に高親和性で結合すると予測されるペプチドを有するキメラ融合のうち、最も頻度の高いの８つについて得られた結果をまとめたものである。
表６：最も頻度の高い融合転写物の検証。最も頻度の高い融合ペプチドは、１５のＬＵＡＤ腫瘍試料および６のＬＵＡＤ腫瘍細胞株においてＰＣＲにより検証された。以下の表のステータス「有」または「無」は、予想されるサイズでのＰＣＲ産物の有無を示す。ＰＣＲ産物が配列決定によってさらに検証された場合、「有」と示される。
ＨＬＡ－Ａ２分子へのＥＲ由来ペプチドの結合
キメラ転写物の発現が確認されたら、誘導ペプチドを合成し、ＨＬＡ－Ａ２へのそれらの結合を確認した。モノマーの安定化および四量体形成は、高親和性結合ペプチドの存在下でのみ可能であるため、ＨＬＡ－Ａ２四量体の形成は、合成ペプチドの存在下でフローサイトメトリーにより推定された。予測されたすべてのペプチドは、陽性対照と比較して５０％を超える蛍光の割合を示し、四量体形成を安定化させることができた。陽性対照として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のＨＬＡ－Ａ２に対する公知の高親和性結合ペプチドを使用した。この結果は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子への予測される高親和性結合を確認した。図１０は、最も頻度の高い融合ペプチドに由来する１０個のペプチドの結果を示す。
ＥＲ由来ペプチドの免疫原性
ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子への結合検証後の次の工程は、予測されるペプチドの免疫原性を試験することであった。したがってプライミングアッセイを実施して、特定の細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させる同定されたペプチドの能力を検証した。ＨＬＡ－Ａ２＋の健康なドナーからのＰＢＭＣを使用して、単球由来－ＤＣ（ｍｏＤＣ）を生成した。合成ペプチドの混合物をｍｏＤＣにロードした後、自己共培養をＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞で行った。最後に、特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を、二色の四量体染色を使用したフローサイトメトリーにより分析した。特異的増殖の対照として、ペプチドの非存在下で共培養を行った。このアプローチを一人のドナーに使用することで、最も頻度の高いキメラ融合由来ペプチドの６種類を認識する特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞を同定し、増殖することが可能となった（ＲＬＬＨＬＥＳＦＬ、ＬＬＧＥＴＫＶＹＶ、ＡＩＬＰＫＡＮＴＶ、ＲＬＡＤＨＬＳＦＣ、ＦＬＩＶＡＥＩＬＩ、ＹＬＷＴＦＦＰＬ）。この結果は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の対照試験と比較して、四量体陽性細胞の割合が少なくとも一桁増加することによって示される。
追加の５人のドナーにおける応答を評価するために、同じ実験を実施した。図１１Ａは、分析した合計６人のドナーについて得られた結果をまとめたもので、最も頻度の高い融合転写物由来ペプチドのうち２１種類に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ増殖が見られた（ＹＬＷＴＴＦＦＰＬ、ＦＬＧＴＲＶＴＲＶ、ＲＬＡＤＨＬＳＦＣ、ＬＬＧＥＴＫＶＹＶ、ＭＬＶＴＷＥＬＡＬ、ＭＬＭＫＴＶＷＱＡ、ＳＬＭＱＳＧＳＰＶ、ＡＩＬＰＫＡＮＴＶ、ＡＭＤＧＫＥＬＳＬ、ＬＬＤＲＦＧＹＨＶ、ＧＬＬＮＩＳＨＴＡ、ＩＬＴＡＳＩＴＳＩ、ＩＬＳＧＹＧＰＣＶ、ＲＱＡＰＧＦＨＨＡ、ＧＬＰＳＨＶＥＬＡ、ＩＬＨＳＬＶＴＧＶ、ＬＬＨＬＥＳＦＬＶ、ＶＬＬＴＮＴＩＷＬ、ＬＬＴＳＷＨＬＹＬ）。これらの実験は、これらのペプチドが免疫反応を誘導できることを示し、ＥＲ由来ペプチドの免疫原性を確認する。
ＥＲ由来ペプチドを認識する細胞傷害性Ｔリンパ球クローンの生成
免疫原性アッセイからの増殖ＣＤ８＋四量体陽性Ｔ細胞（図１１Ａ）を、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンを生成するために単一細胞ＦＡＣＳソーティングした。５種類の異なるＥＲ由来ペプチドを認識する１０個のクローンを作製した：ＹＬＷＴＴＦＦＰＬ、ＬＬＧＥＴＫＶＹＶ、ＭＬＶＴＷＥＬＡＬ、ＭＬＭＫＴＶＷＱＡ、ＲＬＡＤＨＬＳＦ。これらのペプチドは、それぞれ、ペプチド９、８６、５３、８０および６４として表５に列挙される。これらの数字を参照して、生成された各ＣＴＬ－クローンの特異性を示す。例として、ＣＴＬ－クローン９は、ＥＲ由来ペプチド９を認識する。
生成されたＣＴＬ－クローンの細胞傷害能力を評価するために、Ｈ１６５０細胞株を標的細胞として使用して、二つの異なる機能的アッセイを実施した。これは、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子を発現するＬＵＡＤ由来腫瘍細胞株である。
第一に、ＥＲ由来ペプチドへの曝露後にサイトカインを分泌するＣＴＬ－クローンの能力を測定する。ＣＴＬ－クローンを特定のＥＲ由来ペプチドをロードした標的細胞と１８時間共培養した後、培養上清中のＩＮＦ－γ、ＴＮＦ、およびグランザイム－Ｂ（Ｇｒ－Ｂ）の分泌を測定した。すべてのＣＴＬ－クローンは、特定のＥＲ由来ペプチドに曝露された後に活性化され、用量依存的にサイトカインを分泌した（図１１Ｂ）。
実験の第二のセットでは、ＣＴＬクローンの死滅能力を評価した。ＣＴＬ－クローンは、ＥＲ由来ペプチドをロードした、またはロードしていない標的細胞と、異なる条件下で共培養した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して、標的細胞の単層におけるリアルタイムインピーダンス変動を測定する。これらのアッセイでは、細胞指数の減少は、細胞生存率を反映する単層中の細胞数の減少に関連する。
ＣＴＬ－クローン９を、ＥＲ由来ペプチド９をロードした標的細胞と１：１の比率で共培養した場合、対照細胞（標的細胞のみ）と比較して、経時的に細胞指数の減少が見られた。ブロッキング抗ＭＨＣ－Ｉ抗体（＋抗ＭＨＣ－Ｉ）の存在下で共培養を実施すると、細胞指数のこの減少は抑制された。同濃度のアイソタイプ対照（＋アイソタイプ）を使用して共培養を行っても、細胞指数の減少は抑制されなかった。さらに、標的細胞に高濃度のペプチド（１ｕＭと比較して１ｐＭ）をロードすると、これらの減少は増加する（図１１Ｃ、左パネル）。この結果は、本明細書に開示される方法、ＣＴＬクローン９によって識別されるペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞が、標的腫瘍細胞を殺傷していることを示す。
ＥＲ由来ペプチドが標的細胞によって自然に発現および提示される場合、ペプチドを外部から添加することなくＣＴＬ－クローンと共培養することによって、それらを殺すことができるはずであると推論した。この目的のために、ＣＴＬ－クローン９とＨ１６５０標的細胞の共培養を異なる比率で行って、エフェクターが標的細胞を殺すのに十分な比率を見つけた。図１１Ｃの右のパネルでは、ＣＴＬ－９は、対照細胞（標的細胞のみ）と比較して、エフェクター対標的の比率が４：１で標的細胞を殺すことができることがわかった。さらに、殺傷力は、比率を大きくすると（８：１）高まる。標的細胞の死滅は、これより低い比率（２：１）では認められなかった。
最後に、同様の実験を、ＣＴＬ－クローン９、ＣＴＬ－クローン６４、およびＣＴＬ－クローン８０を用いて実施したところ、標的細胞の特異的殺傷が見られたが、抗ＭＣＨ－Ｉ抗体の存在下で共培養を実施すると、これも抑制され得ることがわかった（図１１Ｄ）。
これらの結果をまとめると、本明細書に開示される方法によって同定されたいくつかの異なるペプチドを認識する細胞傷害性Ｔ細胞が、特定の融合転写物由来ペプチドを発現する腫瘍細胞を認識して殺傷することができ、この効果が、ＭＨＣ－Ｉ分子の文脈におけるペプチドの特異的認識によるものであることが確認された。さらに、ＣＴＬ－クローンが外部ペプチドを添加することなく標的細胞を殺傷することができるという事実は、融合転写物由来ペプチド９、６４および８０がＨ１６５０ ＬＵＡＤ腫瘍細胞株によって自然に発現および提示されることを示す。
融合由来ペプチドを認識する操作されたＴ細胞の生成
ＣＴＬ－９ ＴＣＲ配列をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたジャーカット細胞を、二つの異なる標的細胞、Ｈ１６５０およびＨ１３９５と共培養した。両方とも、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子を発現するＬＵＡＤ由来細胞株である。ＴＣＲを介するジャーカット細胞の活性化は、レポーター遺伝子（ＮＦＡＴ－ＧＰＦ、ＮＦ－ＫＢ－ＣＦＰ、およびＡＰ－１－ｍＣｈｅｒｒｙ）の蛍光の増加を分析するフローサイトメトリーによって評価した。予備的な結果は、陰性対照（非形質導入ジャーカット細胞）と比較して、両方の標的細胞と共培養した場合、ジャーカット細胞が活性化されることを示している。さらに、この活性化は、特定のペプチドをロードした標的細胞と共培養を実施した場合、用量依存的に増加した。ＰＭＡ／イオノマイシンを陽性対照として使用した（図１２）。これらの結果は、図１１ＣおよびＤに示す結果と一致しており、ＬＵＡＤ由来腫瘍細胞がＴＥ由来ペプチドを発現することを示唆している。さらに、操作されたＴ細胞の発生におけるＣＴＬ－クローンＴＣＲ配列の潜在的な使用を示した。
ＬＵＡＤ患者における融合由来ペプチドを認識するＣＤ８＋細胞の存在
ＬＵＡＤ腫瘍試料中の融合由来ペプチドを認識するＣＴＬ細胞の存在を特定することを目的とした。
最初の一連の実験では、ＴＥ由来ペプチドとＩｌ－２との混合、またはＩｌ－２のみで増殖した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、四量体染色によって分析した。図１３ＡおよびＢに示されるように、ＬＵＡＤ患者に由来するＴＩＬにおいて融合由来ペプチドを認識するＣＤ８＋ Ｔ細胞が見出された。
次いで、新鮮な腫瘍試料に由来する非増殖ＣＤ８＋ Ｔ細胞において、四量体陽性細胞およびその表現型が検出されるかどうかを分析した。この戦略を使用して、ＬＵＡＤ患者試料に由来する腫瘍、近傍－腫瘍、浸潤リンパ節、および血液に存在するＣＤ８＋ Ｔ細胞を分析した。表現型は、表面マーカーであるＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＡの発現を考慮して、ナイーブ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５＋）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＣＲ７－ＣＤ４５－）、およびターミナルエフェクター（ＴＥ、ＣＣＲ７－ＣＤ４５＋）として決定した。興味深いことに、腫瘍組織に存在する四量体陽性細胞は、メモリー表現型を優先的に共有し、ナイーブ細胞（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５＋）は、主にリンパ節に由来する細胞に見られる（図１４ＡおよびＢ）。患者２と３は図１３と図１４で同じである。
検査したすべての試料は、ＨＬＡ－Ａ２＋患者に由来する。
腫瘍組織におけるメモリー表現型を有する四量体陽性細胞の存在は、ＴＩＬにおける四量体陽性細胞の存在と共に、これらの患者においてＴＥ由来ペプチドに対して生じた免疫反応と一致する。さらに、リンパ節におけるナイーブ四量体陽性細胞の存在は、これらの特にＴＥ由来ペプチドに対する免疫反応を生成する能力の可能性を示唆する。
ＬＵＡＤ生検における質量分析によるペプチドの同定。
細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるには、ＥＲ由来ペプチドには、腫瘍細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子による提示が必要である。予測されるペプチドがＭＨＣクラスＩ分子上に発現していることを確認するために、３つのＬＵＡＤ生検に由来するＭＨＣ Ｉ免疫ペプチドームからの公開データ（Ｌａｕｍｏｎｔ ＣＭ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１８ １０（４７０））を使用した。ＯｐｅｎＭＳソフトウェアを使用して、３つのＬＵＡＤ腫瘍（ＰＸＤ００９７５２、ＰＸＤ００９７５４およびＰＸＤ００９７５５）のＭＨＣ－Ｉ免疫精製からＰＲＩＤＥデータベースにアップロードされた生データを分析した。プロテオミクスにおけるデータ依存的な取得は、標的データベース（概してヒトプロテオーム全体）に含まれるそれらの配列の同定のみを可能にすることに留意されたい。本出願によるペプチドは、非コード配列に由来するため、以前は同定されていなかった。本明細書に予測されたペプチドの配列を標的データベースに組み込んだＭＳ／ＭＳ同定を再分析した。３つの試料生検の中で五つのペプチド（ペプチドＩＤ：３３０４、２６９、７５７、１８１０、３９５３）が見出された。この分析を実施するために、任意のＭＨＣ Ｉ対立遺伝子に結合する、ＴＣＧＡ中の少なくとも５つの試料中に存在する、キメラ融合に由来する全ての予測ペプチドを検討した。この結果は、ＬＵＡＤ腫瘍におけるＭＨＣクラスＩ分子上のキメラ融合由来ペプチドの発現を確認する。
その後、新たな肺免疫ペプチドミクスのデータセットに分析を拡張した（Ｂｕｌｉｋ－Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃ ２０１８，Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．２０２０ ａｎｄ Ｊａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９）。注目すべきことに、すべてのデータベースは、ＬＵＡＤ腫瘍細胞株を含有するＪａｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１９を除いて、新鮮な肺腫瘍試料で生成された。この第二の分析では、ＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＥＲ由来ペプチドを同定した。４つのデータセットを考慮すると、２３の固有のＥＲ由来ペプチドが、合計１９の免疫ペプチドミック試料のうちの少なくとも一つに存在した。図１５では、各ＭＨＣ試料（列）で同定されたＥＲ由来ペプチド（行）は、灰色の正方形で示されている。右側には、見つかったペプチド配列が示されている。興味深いことに、それらのいくつかは、複数のＭＨＣ試料で観察され、試料間で共有されていることを示す。これらの結果から、融合転写物由来ペプチドが、腫瘍細胞表面上のＨＬＡ－Ｉ分子によって処理され、提示されることを確認する。
融合の遺伝子部分が腫瘍抑制遺伝子である融合転写物に由来するペプチドＲＬＡＤＨＬＳＦＣ（融合ＩＤ：ｃｈｒ２２：２９１１７５０６：－＞ｃｈｒ２２：２９１１５４７３：－／関与遺伝子：ＣＨＥＫ２）、および遺伝子部分が発癌遺伝子である融合転写物に由来するペプチドＧＬＰＳＨＶＥＬＡ（融合ＩＤ：ｃｈｒ６：１１７７６３５９７：－＞ｃｈｒ６：１１７７３９６６９：－／関与遺伝子：ＲＯＳ１）。興味深いことに、両方のペプチドが免疫原性であることが判明し（図１１Ａ）、特にペプチドＲＬＡＤＨＬＳＦＣの場合、図１１Ｄに示す結果が、Ｈ１６５０細胞株によって発現され得ることを示す。さらに、ペプチドＧＬＰＳＨＶＥＬＡを認識するＴＩＬを見出し（図１２Ａ）、これは、この融合転写物由来ペプチドがＬＵＡＤ腫瘍試料中で発現し得ることを示す。
実施例３：様々な癌試料からのＴＥ要素およびエキソン配列から構成される融合転写物に由来するネオアンチゲンペプチドの同定。
３２の異なる癌の種類からの９１８４の試料（急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱尿路上皮癌、乳管癌、乳腺小葉癌、子宮頸癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、腎臓色素嫌性癌、腎臓明細胞癌、腎臓乳頭細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、傍神経節腫および褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞癌、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体部内膜癌およびブドウ膜黒色腫）が、前述の方法に従って分析された。
配列番号９１１－１７４９２の融合転写物が同定された。
以下の表では、列は以下のように参照される：
１．コホートにおける頻度
２．ドナー染色体エキソン／２’ドナー染色体エキソン
３．ドナースタートエキソン／３’ドナースタートＴＥ
４．ドナーブレークポイントエキソン／４’ドナーブレークポイントＴＥ
５．ドナー鎖エキソン／５’ドナー鎖ＴＥ
６．ドナー転写物（すなわちドナー＿ｔｘ＿ネーム＿Ｅｘｏｎ）／６’アクセプター染色体エキソン
７．アクセプター染色体ＴＥ／７’アクセプターブレークポイントエキソン
８．アクセプターブレークポイントＴＥ／８’アクセプターエンドエキソン
９．アクセプターエンドＴＥ／９’アクセプター鎖エキソン
１０．アクセプター鎖ＴＥ／１０’アクセプター転写物（すなわちアクセプター＿ｔｘ＿ネーム＿エキソン）
１１．融合の種類／１１’融合の種類

Claims (4)

  1. 腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択するための方法であって、
    － 対象の癌細胞由来のｍＲＮＡ配列の中から、転位因子（ＴＥ）配列およびエキソン配列を含み、かつオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、融合転写物配列を特定する工程と、
    － 前記融合転写物配列の前記ＯＲＦの一部によってコードされる、少なくとも８アミノ酸の腫瘍ネオアンチゲンペプチドを選択する工程と、を含み、
    前記ＯＲＦが、前記ＴＥと前記エキソン配列との間の接合部と重複し、純粋なＴＥであり、および／または非標準であり、
    前記腫瘍ネオアンチゲンペプチドが、前記対象の少なくとも一つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合する、方法。
  2. 前記腫瘍ネオアンチゲンペプチドが、８～１１アミノ酸長であり、前記対象の少なくとも一つのＭＨＣクラスＩ分子に結合するか、または前記腫瘍ネオアンチゲンペプチドが、１３～２５アミノ酸長であり、前記対象の少なくとも一つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ネオアンチゲンペプチドが、
    － 正常で健康な細胞と比較して、腫瘍細胞においてより高いレベルで発現され；
    － 癌を患う対象の集団からの対象の少なくとも１％で発現され；および／または
    － ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩに、約１０ －５ Ｍ未満のＫｄ結合親和性で結合する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記癌が、ＮＳＣＬである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
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