JP7712877B2 - 校正されたガス充填微小胞を調製するための凍結乾燥組成物 - Google Patents

Description

本発明は概して、超音波造影剤（ＵＳＣＡ）の分野に関する。特に、両親媒性材料と、凍結乾燥保護成分の混合物とを含む凍結乾燥組成物に関し、それは、診断または治療的適用に有用な校正されたサイズを有するガス充填微小胞の懸濁液を調製するために再構成され得る。さらに、そのような凍結乾燥組成物を調製する方法に関する。

校正されたサイズの微小胞（ＣＭＶ）は、市販される多分散性微小気泡の超音波造影剤（ＵＳＣＡ）と比較して、狭い、校正および制御されたサイズ分布（平均サイズ３～８μｍ）を有する新世代のガス状微小気泡である。これらの校正されたサイズの微小気泡は、イメージング感度を高め、薬物および遺伝子を特異的な臓器へ送達する効率が改善されるように設計されている。校正された微小胞は、様々な技術：デカンテーション、機械的濾過、遠心分離、バブルソートおよびフローフォーカシングを用いて生産することができる。特に、フローフォーカシング技術は、校正された微小胞（典型的に１．０５～１．０８の幾何標準偏差（ＧＳＤ）値を有する）を、非常に再現性のある方法で合理的な生産率（１分あたり約６０００万の気泡）で、その後の使用に許容できる濃度の懸濁された微小胞（例えば３×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ～４×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ）を製造することを可能にする。

参考文献１［ＷＯ２０１８／０４１９０６ Ａ１－ＢＲＡＣＣＯ ＳＵＩＳＳＥ ＳＡ］および参考文献２［ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５３２５］は両方とも本願出願人によるものであり、特にマイクロ流体技術を用いることによる、ガス充填微小気泡のようなＣＭＶを調製する方法を説明している。

校正された微小胞の水性懸濁液は、室温で数週間、非常に安定であるにもかかわらず、この安定性は、より長い貯蔵寿命が一般に望ましい医薬製品の開発についてはいくつかの制約を課す場合がある。したがって、長期の保管手順を開発する必要性がある。凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）としても知られ、複雑かつチャレンジングな工程であり、医薬製品を乾燥形態で数ヶ月にわたり保存することが有利である調剤産業において広く用いられている。実際に、凍結乾燥産物は、より良好な保管安定性を示し、より簡単に出荷することができる。凍結乾燥は、凍結乾燥剤形を調製するためのガス充填微小胞の分野においても用いられ、それをガスの存在下で水性溶媒を用いて再構成して、ガス充填微小胞の懸濁液が形成される。

参考文献３［ＵＳ２０１７／０８０１１３ Ａ１－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］は、調整されたサイズを有する微小気泡の懸濁液の調製、および、そのスクロース溶液を用いたその後の凍結乾燥を説明している。

参考文献４［ＷＯ９７／２９７８２ Ａ１－ＮＩＣＯＭＥＤ ＩＭＡＧＩＮＧ Ａ／Ｓ］は、室温（ＲＴ）で安定のＵＳＣＡ前駆体を、凍結乾燥安定化剤、好ましくはスクロースの存在下で、Ｃ_３Ｆ_８微小気泡の凍結乾燥によって調製することができることを教示している。

これまでに、本出願人の知識によれば、そのような技術が、校正された微小胞の懸濁液から凍結乾燥組成物を調製するために適用されたことはまだない。

本出願人が観察したように、校正された微小胞の凍結乾燥組成物の調製における最もチャレンジングな問題の１つは、校正された微小胞の最初の懸濁液の特性、例えば濃度、単分散性または幾何標準偏差（ＧＳＤ）および／または最終平均径の実質的な改変を避ける必要性に関する。

本出願人はここで、そのような最初の特性が、凍結乾燥保護成分の適切な混合物を用いることによって、凍結乾燥工程後に、許容できる程度まで維持され得ることを見いだした。

第１の態様において、本発明は、生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液を用いて再構成した際に、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を提供する、両親媒性材料と凍結乾燥保護成分とを含む凍結乾燥組成物に関し、上記凍結乾燥保護成分は、少なくとも２つの凍結乾燥保護成分の混合物であり、校正されたガス充填微小胞の上記再構成された懸濁液は、１．２未満の幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有する。

本発明の好ましい一実施態様では、凍結乾燥保護成分の混合物は、ポリマー、好ましくは親水性ポリマー、より好ましくはポリグリコール、および、ポリオールまたは糖類を含む。

さらにより好ましい実施態様では、上記混合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびソルビトールまたはＰＥＧおよびスクロースを含む。

好ましい一実施態様では、校正された微小胞の上記再構成された懸濁液は、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１５、例えば１．１までのＧＳＤによって特徴付けられる。

本発明の一実施態様では、校正された微小胞の上記再構成された懸濁液は、少なくとも２．０×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ、好ましくは２．２５×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ、より好ましくは２．５×１０８個のＣＭＶ／ｍＬの濃度、５．５×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬまでの濃度によって特徴付けられる。

さらなる一態様によれば、本発明は、校正されたガス充填微小胞の再構成された懸濁液の調製のための凍結乾燥組成物を調製する方法に関し、以下のステップ：
ａ．凍結乾燥保護成分の混合物を含む校正されたガス充填微小胞の懸濁液を調製するステップ；
ｂ．校正された微小胞懸濁液を凍結乾燥するステップ、を含む。

本発明のさらなる一態様は、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を調製するための凍結乾燥組成物に関し、上記凍結乾燥組成物は、以下のステップ：
ａ．ガスが充填された校正された微小胞の第１の懸濁液をフローフォーカシング工程によって調製するステップ（上記懸濁液は、凍結乾燥保護成分の混合物をさらに含む）：
および
ｂ．上記懸濁液を凍結乾燥するステップ、を含む工程によって得ることができる。

本発明のさらなる一態様は、ガス充填微小胞の懸濁液を含んでいる注入可能な造影剤を調製する方法に関し、上記方法は、上記に定義される凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液を用いて再構成するステップを含む。

典型的な粒子サイズ分布表示。 マイクロ流体フローフォーカシングデバイスのコア部分の略図。 本発明の技術の工程に有用なデバイスの例示的な略図。

「ガス充填微小胞」という表現は一般に、ガスと液体の界面に置かれた安定化両親媒性材料（典型的にリン脂質）を含む非常に薄いエンベロープ（フィルム）によってガス／液体界面において境界が作られているガスの気泡を指す。上記校正されたガス充填微小胞は、超音波イメージング技術において（造影増強超音波（ＣＥＵＳ）イメージングとして知られる）、または、例えば超音波が介在する薬物輸送と組み合わせた治療的適用において、造影剤として適切である。

これらの安定化された気泡（適切な生理学的溶液中に分散される）は一般に、当該分野において、典型的にはその調製に用いられる安定化材料によって様々な専門用語で呼ばれ；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含み、ここでは包括的に「ガス充填微小胞」（または短縮して「微小胞」）と呼ぶ。

「校正された（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）」という用語は（ガス充填微小胞を指す場合）、特に、３～８μｍの異なるサイズを有しており、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１、例えば１．０５までの幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有するサイズ分布によって特徴付けられる、高度に校正された微小胞（ＣＭＶ）を有する微小胞懸濁液を指す。

本明細書および特許請求の範囲において、「校正された」という用語は、「サイズが制御された」、「単分散性の」または「単一サイズ（の）」微小胞と相互交換可能に用いられる。

本発明では、校正されたガス充填微小胞は、好ましくはマイクロ流体フローフォーカシング技術を用いて生産され、フローフォーカシングデバイス内でガススレッド（ｇａｓ ｔｈｒｅａｄ）が２つの液体流の間で収束して（ｆｏｃｕｓｅｄ）、リン脂質によって安定化された校正された微小胞が形成されて、出口チャネル内に集められる。この手法を用いて、校正された微小胞が、非常に再現性のある方法で合理的な生産率（１分あたり約６０００万の気泡）で製造される（図２および図３）。

製造工程およびデバイスのパラメーターに応じて、およそ任意の所望の平均径、例えば３～８μｍ、好ましくは約４μｍの相対的に狭いサイズ分布で、校正された微小胞が取得され得る。

上記校正された微小胞のサイズ分布は、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１、例えば１．０５までの幾何標準偏差（ＧＳＤ）値によって典型的に特徴付けられる。

校正された微小胞濃度は（特に、マイクロ流体フローフォーカシングを用いて生産された際）、典型的に３×１０^８～４×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬの間に含まれ、好ましくは４×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬに近く、３×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬよりも低くない。

「幾何標準偏差」（ＧＳＤ）は一般に、粒子（特定の場合においてはガス充填微小胞）の集団におけるサイズ分布のブレス（ｂｒｅａｔｈ）を特徴付けるための適切な値を提供する。広範なサイズを有する粒子の集団はしたがって、粒子サイズが平均値付近に狭く分布しているものよりも大きなＧＳＤ値を有する（すなわち相対的にサイズがより小さい）。

図１は、市販の測定デバイス（例えば、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ソフトウェアを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３）を用いて、そのチャネルのそれぞれに関するガスの体積を決定することによって得ることのできる（それぞれのチャネルは、微小胞の所定の直径（例えば０．１ミクロン単位）に対応する）、ガス充填微小胞の集団のサイズ分布グラフ（体積による）の例を示す。懸濁液中の校正されたガス充填微小胞の数、選択されたサイズ範囲（例えば、４．５μｍ ＣＭＶ平均径については３μｍ～６μｍ）におけるそれらのそれぞれの直径および体積分布を決定することにより、ＣＭＶ分布のＧＳＤを、以下の等式１を用いることによって計算することが可能である：
ここで：
ｎ_ｉ＝ｉ^ｔｈチャネルについて計算された、微小胞内にトラップされたガスの体積のパーセンテージ（合計に対する）
ｘ_ｉ＝ｉｔｈチャネル内の微小胞の体積
であり、
ここで、
（ｄ_ｉ＝ｉ_ｔｈチャネル中央（ｃｈａｎｎｅｌ ｃｅｎｔｅｒ）内の微小胞の直径）
ｘ（エックスバー）＝選択された範囲内の微小胞の体積の幾何平均
であり、
ここで：

様々な市販される測定デバイスのうち、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３ソフトウェアを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３は、上記に定義されるようにＧＳＤ値を計算および提供することが可能である。

例えば、１．２というＧＳＤ値は、ＣＭＶの約５０％が、４μｍの平均径について２．５～５μｍに校正されていることを示し；１．０５～１．０８（＜１．１）というＧＳＤは、ＣＭＶの約９０～９５％が２．５～５μｍの間に含まれるサイズを有することを示す。

本明細書において用いられる「微小胞濃度」という表現は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ器具を用いて決定される体積単位内のＣＭＶの数、すなわち、ＣＭＶの数／ｍＬを指す。

出願人が観察したように、マイクロ流体フローフォーカシングによって得られる上記校正された微小胞は、室温で数週間、それらの主な特性に対して実質的な影響なく保管することができるが、上記保管期間後に、上記微小胞の特性（例えば濃度およびサイズ分布）は維持され得ず、次第に悪化し得る。

そのようなガス充填微小胞の懸濁液の貯蔵寿命はしたがって、医薬製品については相対的に短く、ＣＭＶの最初の特性、例えば濃度、ＧＳＤおよび最終直径を、例えば何ヶ月か、または何年かのより長い時間、維持することが可能な長期の保管手順を開発する必要がある。

凍結乾燥工程は、校正された微小胞の乾燥形態を、長期にわたり高い安定性で最初の特性を維持して取得するための適切な手法である。

驚くべきことに、ＣＭＶの最初の特性、例えば濃度、ＧＳＤおよび最終直径は、同一の凍結乾燥保護成分を単一の添加剤として用いる凍結乾燥工程と比較して、凍結乾燥保護成分の適切な組み合わせを用いることによる凍結乾燥工程後に実質的に維持され得ることが見いだされた。

第１の態様では、本発明は、両親媒性材料と、凍結乾燥保護成分の混合物とを含む凍結乾燥組成物を提供し、それは、生体適合性ガスの存在下で適切な水溶液を用いて再構成した際に、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を提供し、上記微小胞は、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１５、例えば１．１までのＧＳＤ値を有する。

本明細書および特許請求の範囲において、用語「凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）」および「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」は、用語「凍結乾燥された（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）」および「凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」と同様に、相互交換可能に用いられる。

凍結乾燥組成物
本明細書において用いられる「凍結乾燥組成物」という表現は、凍結乾燥工程によって得られるガス充填微小胞製剤の長期保管のための任意の乾燥剤形を示す。上記凍結乾燥組成物は、１つまたは複数の活性成分と、少なくとも２つの凍結乾燥保護成分の混合物とを含むことができる。

本明細書において用いられる「活性成分」という表現は、微小胞安定化材料、例えば両親媒性材料を示し、それは、凍結乾燥保護成分とともに凍結乾燥組成物内に含まれる。

凍結乾燥保護成分の混合物
本明細書において用いられる「凍結乾燥保護成分の混合物」という表現は、凍結乾燥に適切な少なくとも２つの成分の組み合わせを指し、その凍結乾燥工程前に微小胞懸濁液内に含まれるものである。

「凍結乾燥保護成分」という用語は、凍結乾燥工程の任意の段階の間に活性成分を保護するために添加される任意の化合物を指す。適切な凍結乾燥保護成分の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオール、糖類、界面活性剤、バッファー、アミノ酸、キレート錯体、および無機塩類である。

本発明の一実施態様によれば、上記凍結乾燥保護成分の混合物は、凍結乾燥に適切な少なくとも２つの異なる化合物の組み合わせであり、ポリマー、ポリオールおよび糖類の群の中から選択される。好ましくは、上記混合物は、ポリオールまたは糖類とポリマーの組み合わせを含む。

本発明の好ましい一実施態様では、凍結乾燥保護成分の混合物の成分の１つは、ポリマー、好ましくは親水性ポリマー、より好ましくはポリグリコールである。

さらにより好ましい一実施態様では、上記ポリグリコール（ｐｏｌｙｇｌｉｃｏｌ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その標準的な化学的意味を有する。ＰＥＧの化学式はＨＯＣＨ_２（ＣＨ_２ＯＣＨ_２）_ｍＣＨ_２ＯＨであり、ここで、ｍはオキシエチレン基の平均数を表わす。典型的なポリエチレングリコールは、１９０～２１０ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ２００；ｍ＝４．２）から始まり、７０００～９０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ８０００；ｍ＝１８１．４）までの、広い範囲の平均分子量で利用可能である。

本明細書によれば、「分子量」という表現は、ＰＥＧポリマー鎖の平均長を示し、示された分子量に対して±１０％の変動を有する。

本発明の一実施態様によれば、凍結乾燥保護成分の混合物は、２０００～１００００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは４０００～８０００ｇ／ｍｏｌの間に含まれる分子量を有するＰＥＧを好ましくは含む。

一実施態様によれば、凍結乾燥保護成分は、８０００ｇ／ｍｏｌ（±１０％）の分子量を有するＰＥＧである。別の実施態様によれば、凍結乾燥保護成分は、４０００ｇ／ｍｏｌ（±１０％）に近い分子量を有するＰＥＧである。

本発明の一実施態様では、凍結乾燥保護成分の混合物は、１００ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１２０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの間に含まれる、より好ましくは２００ｍｇ／ｍＬに近い濃度を有する溶液としてＣＭＶの懸濁液に添加される。

本出願人が観察したように、１５０ｍｇ／ｍＬ以上（例えば２００ｍｇ／ｍＬ）の濃度を有するポリマー（特にポリグリコール、例えばＰＥＧ）懸濁液は、それらの相対的に高い粘度に起因して、工業プロセス中に取り扱うことが困難であり得る。したがって、１５０ｍｇ／ｍＬよりも低い濃度を有するポリマー懸濁液を使用し続けることが好ましい。

凍結乾燥工程後に再構成されるＣＭＶ懸濁液の最初の特性の維持を改善するために、出願人は、第２の凍結乾燥保護成分と組み合わせたＰＥＧの適切な混合物を１５０ｍｇ／ｍＬよりも低い濃度（例えば１００ｍｇ／ｍＬ）で用いることが好ましいことを見いだした。

本発明の好ましい一実施態様では、凍結乾燥組成物は、ポリオールと、ポリマー、好ましくはポリグリコールの組み合わせである凍結乾燥保護成分の混合物を含む。

本明細書および特許請求の範囲において、「ポリオール」という用語は、その従来の化学的意味を有し；２つよりも多いヒドロキシル官能基を有する任意の有機化合物を示し、一般式ＨＯＣＨ_２（ＣＨＯＨ）_ｎＣＨ_２ＯＨによって特徴付けられ、ここでｎは、１～６、好ましくは２～４の整数である。ポリオールは、鎖長が異なり、すなわち、４個、５個または６個の炭素鎖である。それらは、それぞれの炭素に付着した１つのヒドロキシル基を有する。ポリオールは、これらのヒドロキシル基の相対的配位（立体化学）によってさらに区別することができる。適切なポリオールは、エリトリトール、キシリトール、ソルビトール、ラクチトールおよびマンニトールを含む。

本発明では、上記ポリオールは好ましくは、４個～６個の炭素原子の炭素鎖長を有するポリオールの群より選択される。

さらにより好ましい一実施態様では、上記ポリオールは、ソルビトールまたはキシリトールである。

「ソルビトール」という用語は、化学分野におけるその従来の意味を有する。ソルビトール、または（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－ヘキサン－１，２，３，４，５，６－ヘキソールは、直鎖炭素を含む多価アルコールであり、６個の炭素原子を有しており、それぞれがヒドロキシル官能基によって置換されている。それは１８２．１７２ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ソルビトールは天然に発生し、また、グルコースから合成的にも生産される。それは、マンニトールと異性体である。

「キシリトール」という用語は、化学分野におけるその従来の意味を有する。キシリトール、または（２Ｓ，４Ｒ）－ペンタン－１，２，３，４，５－ペントールは、５個の炭素の糖アルコールであり、ここで、分子の全ての５個の炭素原子はヒドロキシル基に結合している。その分子量は１５２．１４６ｇ／ｍｏｌである。

さらなる一実施態様では、凍結乾燥組成物は、糖類とポリマーの混合物を含む。

「糖類」という用語は、化学分野におけるその標準的な意味を有する。糖類は、炭水化物とも呼ばれ、３つの元素：炭素、水素および酸素だけから作られる分子化合物である。最も単純な糖類は単糖類と呼ばれ、二糖類、三糖類および多糖類のようなより大きな糖類のためのビルディング単位である。

好ましくは、上記糖類は、二糖類、三糖類および多糖類、より好ましくは二糖類または三糖類の群から選択される。

単糖類は、一般分子式（ＣＨ_２Ｏ）_ｎを有し、ここでｎは３、５または６であってよい。単糖類は、ＯＨ基とカルボニル基の反応によって環状構造を形成することができる。これらの環状分子は続いて、別のアルコールと反応することができる。単糖類の適切な例は、グルコース、フルクトースおよびガラクトースを含む。

二糖類（Ｃ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１）は、グリコシド結合によって結合された２つの単糖類単位からなる糖類である。この後者は、第２の単糖類のＯＨ基と１つの環状単糖類のアノマー炭素の反応によって形成される共有結合である。二糖類は、単糖類成分およびそれらを連結する特定のタイプのグリコシド結合が互いに異なっている。二糖類の例は、マルトース、ラクトース、およびスクロースを含む。二糖類の中でも特に好ましいものはスクロースである。

三糖類は、３つの単糖類からなる糖類であり、それらを連結する２つのグリコシド結合を有する。二糖類と同様に、それぞれのグリコシド結合は、構成要素の単糖類上の任意のヒドロキシル基の間に形成され得る。３つの構成要素の糖類が全て同一であるとしても（例えば、グルコース）、異なる結合の組み合わせ（位置化学）および立体化学（α－またはβ－）によって、異なる化学的および物理的特性を有するジアステレオ異性体である三糖類がもたらされる。三糖類の例は、マルトトリオース、メレチトース、マルトトリオース（ｍａｌｔｏｔｒｉｕｌｏｓｅ）およびラフィノースである。三糖類の中で特に好ましいものはラフィノースである。

多糖類は、グリコシド結合によって一緒に結合された単糖類単位の長い鎖からなる高分子糖類分子である。それらは、構造が線形から高度の分岐まで及ぶ。多糖類の例は：デンプン、セルロース、デキストランおよびキチンである。多糖類の中でも特に好ましいものはデキストランである。

本発明の好ましい一実施態様では、上記糖類は二糖類であり、より好ましくはスクロースである。

本発明において、「スクロース」という用語は、その標準的な意味である。スクロースは、グルコースのヘミアセタールからフルクトースのヘミケタールへのアセタール酸素架橋によって連結されたグルコース単位とフルクトース単位によって形成された二糖類である。スクロースは、実験式Ｃ_１２Ｈ_２２Ｏ_１１および３４２．３０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。

最初のＣＭＶ特性は、凍結乾燥保護成分の混合物を用いる場合に特に維持され、上記凍結乾燥保護成分の混合物が、１００ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１２０ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍＬの間に含まれる合計濃度を有しており、より好ましくは、ＰＥＧおよびポリオールまたはＰＥＧおよび糖類の合計濃度が２００ｍｇ／ｍＬである点を特徴とする。

好ましい一実施態様では、凍結乾燥保護成分の混合物は、ＰＥＧおよびポリオールまたはＰＥＧおよび糖類を、２：１～２：３、好ましくは３：２～４：５、より好ましくは１：１の比で含む。

凍結乾燥保護成分の上記混合物は、校正された微小胞懸濁液の凍結乾燥工程において使用した場合に有利な結果を示し、凍結乾燥組成物を調製して、それから再構成して、濃度およびサイズ分布の観点から許容できる特性を有する校正された微小胞の懸濁液を得ることができる。

両親媒性材料
ガス充填微小胞の安定化層を形成するのに適切な材料（すなわち微小胞安定化材料）は、当技術分野で知られているものである。これらは、好ましくは両親媒性材料を含む。

本明細書において用いられる「両親媒性材料」という用語は、水性媒体と相互作用することのできる親水性極性頭部（例えば、極性またはイオン基）、および、例えば有機溶媒と相互作用することのできる疎水性有機尾部（例えば、炭化水素鎖）を有する分子を有している化合物を含む。これらの化合物はしたがって、一般に、「表面活性剤」として作用し、すなわち、他の方法では一般に非混和性材料である混合物、例えば、２つの非混和性の液体（例えば、水と油）の混合物、ガスと液体の混合物（例えば、水中のガス微小気泡）、または不溶性粒子と液体の混合物（例えば、水中の金属ナノ粒子）を安定化することのできる化合物として作用する。

適切な両親媒性材料は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸類、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸；ポリマーを保有する脂質、例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、「ペグ化脂質」とも呼ばれる；スルホン化モノ－ジ－、オリゴ－または多糖類を保有する脂質；コレステロール、コレステロール硫酸またはヘミこはく酸コレステロール；ヘミこはく酸トコフェロール；エーテルを含む脂質またはエステル結合脂肪酸；重合脂質；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；セラミド類；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪族アルコール類、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテル類、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化大豆ステロール類、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロック共重合体；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７－デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコン酸、ラノステロールグルコン酸、またはエルゴステロールグルコン酸を含む、糖酸類のステロールエステル類；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、アルコール類および糖酸類のエステル；スクロースラウリン酸、フルクトースラウリン酸、スクロースパルミチン酸、スクロースステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、脂肪酸類と糖類のエステル類；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン類；グリセロールまたは脂肪酸とのグリセロールモノエステル類（グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノミリステートまたはグリセロールモノラウレートを含む）；ｎ－デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ－オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール類；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド；ジガラクトシル－ジグリセリド；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシ－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド；６－（５－コレステン－３β－イルオキシ）ヘキシル－６－アミノ－６－デオキシル－１－チオ－β－Ｄ－マンノピラノシド；１２－（（（７’－ジエチルアミノクマリン－３－イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ－［１２－（（（７’－ジエチルアミノクマリン－３－イル）カルボニル）メチルアミノ）－オクタデカノイル］－２－アミノパルミチン酸；Ｎ－スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロール；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－３－スクシニルグリセロール；１，３－ジパルミトイル－２－スクシニルグリセロール；１－ヘキサデシル－２－パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；アルキルアミン類またはアルキルアンモニウム塩類、以下を含む、少なくとも１つの（Ｃ_１０－Ｃ_２０）、好ましくは（Ｃ_１４－Ｃ_１８）、アルキル鎖、例えば、Ｎ－ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジステアリルアミン、Ｎ－ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジヘキサデシルアミン、Ｎ－ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’－ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ－ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’－ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；第３級または第４級アンモニウム塩類、以下を含む、１つまたは好ましくは２つの（Ｃ_１０－Ｃ_２０）、好ましくは（Ｃ_１４－Ｃ_１８）、アシル鎖（（Ｃ_３－Ｃ_６）アルキレン橋を通してＮ原子に連結される）、例えば、１，２－ジステアロイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２－オレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＳＤＡＰ）；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。

本発明によれば、両親媒性材料は、好ましくはリン脂質である。

「リン脂質」という用語は、任意の両親媒性のリン脂質性（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｉｃ）化合物を包含することを意図し、その分子は、最終微小気泡懸濁液中で、ガスと水の境界界面において材料の安定化フィルムを（典型的に単分子層の形態で）形成することが可能である。したがって、これらの材料は、当該分野において「フィルム形成リン脂質」とも呼ばれる。

適切なリン脂質の例は、１つまたは好ましくは２つの（等しい、または異なる）脂肪酸残基およびリン酸とグリセロールのエステルを含み、ここで、リン酸残基は次いで、例えば、コリン（ホスファチジルコリン－ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン－ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール－ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）などの親水性基に結合される。ただ１つの脂肪酸残基とリン脂質のエステルは、一般に、当該分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質内に存在する脂肪酸残基は一般に、典型的に１２～２４個の炭素原子、好ましくは１４～２２個を含む長鎖脂肪酸類であり；脂肪族鎖は、１つまたは複数の不飽和を含んでよく、または、好ましくは完全に飽和である。リン脂質に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が例示される。

リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸類、すなわち、脂肪酸とグリセロール－リン酸のジエステル類；スフィンゴミエリン類のようなスフィンゴ脂質類、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン類、すなわち、脂肪酸と１，３－ジホスファチジルグリセロールのエステル類；糖脂質類、例えば、ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシド類；糖脂質；スルファチド類およびグリコスフィンゴリピド類である。

本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独または混合物としてのいずれかで用いられ得る、天然起源、半合成または合成のいずれかで調製された産物を含む。

天然起源のリン脂質の例は、天然レシチン類（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）、例えば、典型的に、大豆または卵黄レシチン類である。

半合成リン脂質の例は、天然起源レシチン類の部分的または完全に水素化された誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。

好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル－ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル－ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル－ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（エチル－ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイル－ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル－ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジアラキドイルホスファチジル－グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル－ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル－ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。

適切なリン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーが、それに結合することによって改変されたリン脂質をさらに含む。好ましいポリマー改変リン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン類（短縮して「ＰＥ－ＰＥＧ」）、すなわち、親水性エタノールアミン部分が可変分子量（例えば３００～２００００ダルトン、好ましくは５００～５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合されたホスファチジルエタノールアミン類、例えば、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ（またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＡＰＥ－ＰＥＧまたはＤＯＰＥ－ＰＥＧ）である。例えば、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００は、約２０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーがそれに付着したＤＰＰＥを指す。

特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル－ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。

リン脂質の混合物、例えば、ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル－ＤＳＰＣおよび／またはエチル－ＤＰＰＣと、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣの混合物も用いられ得る。

例えば、リン脂質の混合物は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジン酸誘導体およびペグ化ホスファチジルエタノールアミン、例えばＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧを含んでよい。

本発明によれば、リン脂質は、任意の上記に挙げた両親媒性化合物との混合で好適に用いられ得る。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはパルミチン酸アスコルビルのような脂質類、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体のような脂肪酸、またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物は、前述のリン脂質の１つまたは複数に、例えば、好ましくは０～５０重量％の範囲、より好ましくは２５％までの比率で、任意に添加されてもよい。例えば、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ－ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ／ステアリン酸またはＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ／ステアリン酸を含む、リン脂質および脂肪酸を含む両親媒性材料の混合物が有利に用いられ得る。

本発明によって調製される微小胞は、標的化リガンドを任意に含んでもよい。

「標的化リガンド」という用語は、生体内の任意の生物学的または病理学的部位に向かう、本発明の組成物の微小胞の標的化活性（例えば選択的結合を含む）を有する、またはそれを促進することが可能な、任意の化合物、部分または残基をその意味の中に含む。標的化リガンドが関連し得る標的は、組織、例えば、心筋組織（心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を含む）、膜質組織（内皮および上皮を含む）、薄膜、結合組織（間質組織を含む）または腫瘍；血塊；および受容体、例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片、および免疫グロブリンに関する細胞表面受容体、および、ステロイドホルモンに関する細胞質受容体を含む。

標的化リガンドは、合成、半合成、または天然起源であってよい。標的化リガンドとして作用し得る材料または物質は、例えば、限定されないが、抗体、抗体フラグメント、受容体分子、受容体結合分子、糖タンパク質およびレクチンを含む、タンパク質；オリゴペプチドおよびポリペプチドを含むペプチド；ペプチド模倣薬；単糖類および多糖類を含む、糖類；ビタミン類；ステロイド類、ステロイドアナログ類、ホルモン類、補助因子、生物活性剤、ならびに、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および、ポリヌクレオチドを含む遺伝物質を含む。

標的化リガンドは、それ自体が両親媒性化合物であってよく（微小胞の他の構成要素と混合される）、または、微小胞の形成に用いられる両親媒性分子（例えばリン脂質）に結合された化合物であってよい。

ガス
適切なガスは、生体適合性フッ素化ガス、好ましくはパーフルオロ化ガスを含む。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子を含む材料、例えば、フッ素化炭化水素（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含んでいる有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはパーフルオロ化ケトン類、例えば、パーフルオロアセトン；およびフッ素化、好ましくはパーフルオロ化エーテル類、例えばパーフルオロジエチルエーテルを含む。好ましい化合物は、パーフルオロ化ガス、例えば、ＳＦ_６またはパーフルオロカーボン（パーフルオロ化炭化水素）、すなわち全ての水素原子がフッ素原子によって置換されている炭化水素であり、特に安定したガス充填微小胞懸濁液を形成することが知られている。

「パーフルオロカーボン」という用語は、飽和、不飽和、および環状パーフルオロカーボン類を含む。生体適合性の、生理的に許容できるパーフルオロカーボン類の例は：パーフルオロアルカン類、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン類、パーフルオロブタン類（例えばパーフルオロ－ｎ－ブタン、パーフルオロ－イソブタンのような他の異性体との混合であってもよい）、パーフルオロペンタン類、パーフルオロヘキサン類またはパーフルオロヘプタン類；パーフルオロアルケン類、例えばパーフルオロプロペン、パーフルオロブテン類（例えばパーフルオロブト－２エン）またはパーフルオロブタジエン；パーフルオロアルキン類（例えばパーフルオロブト－２－イン）；およびパーフルオロシクロアルカン類（例えばパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン類、パーフルオロトリメチルシクロブタン類、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン類、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンおよびパーフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和パーフルオロカーボン類は、例えば、ＣＦ_４、Ｃ_２Ｆ_６、Ｃ_３Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_８、Ｃ_４Ｆ_１０、Ｃ_５Ｆ_１２およびＣ_６Ｆ_１４を含む。特に好ましいガスは、室温でガス状形態であるものであり、ＳＦ_６、Ｃ_３Ｆ_８、およびＣ_４Ｆ_１０を含む。

本発明の一態様はしたがって、校正されたガス充填微小胞の長期保管のための凍結乾燥組成物を調製する方法に関し、以下のステップ：
ａ．凍結乾燥保護成分の混合物を含む校正されたガス充填微小胞の懸濁液を調製するステップ；
ｂ．校正された微小胞懸濁液を凍結乾燥するステップ、を含む。

好ましくは、ステップａ）の調製方法は、参考文献１［ＷＯ２０１８／０４１９０６ Ａ１－ＢＲＡＣＣＯ ＳＵＩＳＳＥ ＳＡ］および参考文献２［ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５３２５］において説明されるマイクロ流体フローフォーカシング技術である。

図２は、本発明の工程において有用なフローフォーカシングデバイス（「マイクロ流体チップ」）のコア部分２００の略図を示す。チップは、ガス流（ｇａｓｅｏｕｓ ｆｌｏｗ）２０１’を供給するための第１の供給チャネル２０１と、両親媒性材料を含む液体流を供給するための２つのさらなるオルトゴナル供給チャネル２０２ａおよび２０２ｂとを備える。

ガス流（ｇａｓ ｆｌｏｗ）および２つの液体流は、接触ゾーン２０３へ向かい、それから、図１において点線として示される校正されたオリフィス２０４を通る。校正されたオリフィスは、好ましくはオリフィスと同一の横断面を有する校正されたチャネル２０４’に接続されて、次いで、出口チャネル２０６の最初の部分２０５に接続される。代替の実施態様（図示せず）では、校正されたオリフィス２０４は、出口チャネル２０６の最初の部分２０５に直接的に接続された、すなわち校正されたチャネルが間にない、ノズルであってよい。微小胞２０３’は、校正されたオリフィス内で形成され、校正されたチャネル２０４’を通って、出口チャネル２０６の最初の部分２０５へ向けられる。出口チャネルの水力直径は一般に、校正されたオリフィスの水力直径よりも大きく、典型的に、校正されたオリフィスの最初の直径から出口チャネル２０６の最終の直径へと増大していて、フローフォーカシングデバイスを微小胞の懸濁液を回収するためのコンテナー、例えば密封されたバイアルに接続する、回収チューブ（図示せず）の水力直径に実質的に対応する。

デバイスの出口チャネルの最初の部分２０５において、および好ましくは接触ゾーン２０３においても、および校正されたオリフィス２０４において、微小胞の温度は、参考文献１［ＷＯ２０１８／０４１９０６ Ａ１－ＢＲＡＣＣＯ ＳＵＩＳＳＥ ＳＡ］および参考文献２［ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５３２５］に説明されるように制御されている。

液体流
本発明の方法による校正されたガス充填微小胞を調製するための水性液体流は、水性担体中に分散された、例えば５．０～２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５～１５ｍｇ／ｍＬの濃度の両親媒性材料（上記に定義）を含む。

好ましくは生理的に許容できる適切な水性担体は、水（好ましくは滅菌水）、食塩水のような水溶液（注入のための最終産物が低張でないように有利に緩衝されてよい）、または、１つまたは複数の浸透圧調節物質の溶液を含む。浸透圧調節物質は、塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコール類など）、キトサン誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはゲル化化合物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルデンプンまたはデキストランを含む。

代替の実施態様では、さらなる油相が、治療的疎水性物質を微小胞中に取り込むために添加されてよい。この目的を達成するために、２つのさらなる導管が、例えば参考文献１［ＷＯ２０１８／０４１９０６ Ａ１－ＢＲＡＣＣＯ ＳＵＩＳＳＥ ＳＡ］および参考文献２［ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５３２５］において説明されるように、所望の油相を供給するためにデバイス内に提供されてよい。形成されたガス充填微小胞はしたがって、ガスおよび両親媒性材料の安定化層の間の界面に配置された油のフィルムを有しており、所望の治療的薬剤を担持させることができる。適切な油類は、室温で液体である任意の生体適合性の油を含んでよく、例えば、飽和または不飽和（Ｃ_２－Ｃ_１８）アルキル鎖とグリセロールのモノ－、ジ－またはトリ－エステル（ホモ－またはヘテロ－アルキルエステル類（ａｌｌｋｙｌｅｓｔｅｒｓ）を含む）、例えば、グリセロールモノブチリン、モノリノール酸グリセロール、１，２－ジヘキサノイルグリセロール、１，２ジオクタノイルグリセロール、１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロール、トリアセチン、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリン、トリカプリン、およびそれらの混合物；または天然油類、例えば、大豆油、オリーブ油、ベニバナ種子油、ヒマワリ種子油、落花生油およびそれらの混合物を含む。

混合ガス流
形成されたばかりの微小胞は、前に示したものの中から選択されるガスを含む。好ましくは、ガスは、参考文献２［ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５３２５］において予期されるように、水中に非常に可溶性であるガス（「ＨＳガス」）および水中に難溶解性であるガス（「ＬＳガス」）の混合物である。

安定化の段階中に、非常に可溶性であるガスの大部分が水中に急速に溶解するが、可溶性が低いものは、両親媒性化合物の密集層中にトラップされたままであり、典型的に、ＨＳ溶解度ガスの一部の残量はその中に分散されている。

ＨＳガスの例は、窒素、空気、および二酸化炭素を含み、この後者は水中の溶解度がより高いので特に好ましい。

適切なＬＳガスは、フッ素化ガス、好ましくはパーフルオロ化ガスである。本明細書において前に説明したフッ素化ガス。

本発明の好ましい一実施態様では、８０／２０～９０／１０、例えば８５／１５の体積比でＣＯ_２／Ｃ_４Ｆ_１０を含むガス充填微小胞が、図３に模式的に示されるものと同様のガス混合デバイスによって調製され得る。

図３は、校正された微小胞の生産のために用いられるマイクロ流体フローフォーカシングデバイスの例を示す。ガス流３０２（例えばＣ_４Ｆ_１０およびＣＯ_２の混合物を含む）および液体流３０１（両親媒性材料、例えば、リン脂質、脂肪酸またはそれらの混合物を含む）は、マイクロ流体チップ３０３に供給されて、オリフィス３０４を通して微小胞が生産される。微小胞懸濁液は、好ましくは雰囲気圧でガス（例えばＣ_４Ｆ_１０）が予め充填されているバイアル３０５内に回収される。ガス抜き（ｖｅｎｔｉｎｇ）デバイス（例えばニードル３０６）は、好ましくは、バイアルの液体充填によって生じた過剰圧力を一様にするために用いられる。微小胞懸濁液の回収の最後に、ガス抜きデバイスを好ましくは取り外し、外部雰囲気とのさらなるガス交換を避けるために好ましくはコンテナーを密封する。

本発明の好ましい一実施態様によれば、回収段階の後に、マイクロ流体フローフォーカシング方法によって得られた校正された微小胞を、アセンブルされなかった（ｎｏｔ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）両親媒性材料およびあり得る残渣化合物を除去するために適切な洗浄技術を用いて処理する。

本明細書において、「洗浄する（ｗａｓｈｉｎｇ）」という用語は、調製されたばかりの微小胞懸濁液に対して行われ、アセンブルされなかった両親媒性材料および残渣化合物を除去（または実質的にその量を減少させる）ように完了される任意の操作を示す。

本明細書によれば、適切な洗浄技術は、遠心分離、濾過、バブルソートおよびデカンテーションを含む。

本明細書において、「アセンブルされなかった（ｎｏｔ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）両親媒性材料」という表現は、調製工程の最後に校正された微小胞懸濁液中に存在するが、ガス充填微小胞の安定化層を形成していない両親媒性分子を指す。

本明細書において、「残渣化合物」は、微小胞の調製中に両親媒性材料溶液へ添加される任意のあり得る添加物質、例えば前に説明した浸透圧調節剤を示す。

本発明の好ましい一実施態様では、洗浄操作後に、凍結乾燥保護成分の混合物を、校正された微小胞懸濁液へ添加する。

あるいは、凍結乾燥保護成分の混合物を、マイクロ流体技術による微小胞の調製中に、上述の両親媒性化合物を含んでいる液体流へ添加することができる。

最初のＣＭＶの特性は、凍結乾燥保護成分の混合物を用いた場合に特に維持され、上記凍結乾燥保護成分の混合物が１００ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１２０ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍＬの間に含まれる合計濃度を有し、より好ましくはＰＥＧおよびポリオールまたはＰＥＧおよび糖類の合計濃度が２００ｍｇ／ｍＬであるという点を特徴とする。

本発明の好ましい一実施態様では、凍結乾燥工程の前に、ＣＭＶ懸濁液は、１０～２５％、好ましくは１４～２４％、さらにより好ましくは１８～２２％（ｗ／ｖ％）の濃度の凍結乾燥保護成分の混合物を含む。

凍結乾燥保護成分の混合物は、最終的な凍結乾燥製剤の多い方の量を示し、それは典型的に、少なくとも９０％、好ましくは９４％～９９．７％、より好ましくは９９．５％を示し、９９．９％（ｗ／ｗ）までである。

上記凍結乾燥保護成分の混合物は、本明細書において上記に説明したものである。上記混合物は、校正された微小胞懸濁液の凍結乾燥工程において使用した場合に有利な結果を示し、凍結乾燥組成物を調製して、それから再構成して、最初の懸濁液（凍結乾燥前）と比べて濃度およびサイズ分布の観点から許容できる特性を有する校正された微小胞の懸濁液を得ることができる。

例えば、凍結乾燥保護成分の混合物を使用することは、凍結乾燥工程後のＧＳＤ値を実質的に維持するための最善のストラテジーをもたらす。一実施態様によれば、１．１６～１．１８の間に含まれるＧＳＤ値は、より高いＧＳＤ値によって特徴付けられる校正された微小胞を与える単一の添加剤の使用と比べて、凍結乾燥保護成分の混合物を用いた場合に得ることができる。

好ましい一実施態様では、凍結乾燥保護成分の混合物の使用は、単一の凍結乾燥保護成分の使用と比べた場合、凍結乾燥後に校正された微小胞の収率を３８％の増大で有意に改善することが可能である。

本明細書および特許請求の範囲において、凍結乾燥という用語は、調剤技術分野におけるその標準的な意味を有する。凍結乾燥工程は、低圧または真空および低温での、予め凍結された（ｐｒｅ－ｆｒｏｚｅｎ）液体産物の乾燥からなる。主な目的は、長期保管に適切な凍結乾燥産物を提供するために産物から液体を除去することである。

本出願人が観察したように、凍結乾燥パラメーターは、微小胞の再構成された懸濁液の特性（例えば収率、サイズ、ＧＳＤ）をさらに最適化するために選択されてよい。

本発明の好ましい一実施態様では、校正されたガス充填微小胞の長期保管のための上記方法の凍結温度は、－３０℃～－７０℃、好ましくは－３０℃～－６０℃の範囲であり、さらにより好ましくは－４０℃である。

さらに好ましい一実施態様では、凍結乾燥の圧力は、好ましくは０．５ｍｂａｒ以下、好ましくは０．２以下、例えば０．１ｍｂａｒ付近である。

本発明のさらなる一態様は、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を調製するための凍結乾燥組成物に関し、上記凍結乾燥組成物は、以下のステップ：
ａ．以下のステップを含むフローフォーカシング工程によって、ガスが充填された校正された微小胞の第１の懸濁液を調製するステップ、
ここで上記懸濁液は、凍結乾燥保護成分の混合物をさらに含む；および
ｂ．上記懸濁液を凍結乾燥するステップ、を含む工程によって得ることができる。

本発明のさらなる一態様は、ガス充填微小胞の懸濁液を含んでいる注入可能な造影剤を調製する方法に関し、ここで上記方法は、両親媒性材料と、凍結乾燥保護成分の混合物とを含む、上述のとおりに得られる凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液によって再構成するステップを含む。

それから、凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で適切な薬学的に許容できる（水性）溶液によって再構成することができ、したがって、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を提供し、ここで上記微小胞は、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１５、例えば１．１までのＧＳＤを有する。

本発明において、薬学的に許容できる（水性）溶液は、水、典型的に滅菌された、発熱物質フリーの水（最終の再構成された産物における汚染の可能性をできるだけ防止するため）、食塩水のような水溶液（注入のための最終産物が低張でないように有利に緩衝してよい）、または、塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料などの１つまたは複数の浸透圧調節物質の水溶液である。

凍結乾燥組成物は典型的に、凍結乾燥工程を受ける懸濁液の体積と同様の体積の水溶液を用いて再構成される。したがって、再構成された懸濁液中の凍結乾燥保護成分の濃度は、最初の懸濁液中のものと実質的に同一である。この理由により、過剰な量のポリマー（典型的にポリグリコール、例えばＰＥＧ）、例えば１５０ｍｇ／ｍＬよりも多い量（例えば２００ｍｇ／ｍＬ）は、投与される懸濁液の過剰な粘度を避けるために好ましくは回避すべきである。

驚くべきことに、校正された微小胞の再構成された懸濁液は、凍結乾燥工程の前に特徴付けられる、校正された微小胞の最初の特性を実質的に維持することが見いだされ、その後の製剤用途に適切なものとなった。

校正された微小胞の上記再構成された懸濁液は、少なくとも１．２以下、好ましくは少なくとも１．１５、例えば１．１までのＧＳＤを有する校正された微小胞によって特徴付けられる。

本発明の一実施態様では、校正された微小胞の上記再構成された懸濁液は、少なくとも２．０×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ、好ましくは２．２５×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬ、より好ましくは２．５×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬの濃度、５．５０×１０^８個のＣＭＶ／ｍＬまでの濃度によって特徴付けられる。

上述のとおり、「微小胞濃度」という表現は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ器具を用いて決定される体積単位内の微小胞の数、すなわちＭＢの数／ｍＬを指す。

典型的に、適切な水溶液を用いて本発明の凍結乾燥組成物を再構成した後に測定される校正された微小胞の濃度（％）は、凍結乾燥工程前に測定された微小胞濃度と比較した、上記再構成後の微小気泡の収率を決定することを可能にする。

本発明において、本発明の凍結乾燥組成物の再構成後の校正された微小胞の収率は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも６５％、例えば８５％まで、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは１００％である。

「校正された微小胞の収率」という表現は、凍結乾燥前に測定された微小胞濃度と、凍結乾燥および再分散後に測定された微小胞濃度の間の比を指す（等式２を参照）：
等式２：凍結乾燥後のＣＭＶ収率（％）＝（凍結乾燥後のＣＭＶ濃度／ｍＬ）／（凍結乾燥前のＣＭＶ濃度／ｍＬ）

「ＧＳＤ比」という表現は、凍結乾燥後のＧＳＤ値に対する、凍結乾燥前のＣＭＶについて測定されたＧＳＤ値の比を示す（等式３を参照）：
等式３：ＧＳＤ比＝（凍結乾燥前のＧＳＤ）／（凍結乾燥後のＧＳＤ）

凍結乾燥工程後のＣＭＶ系の単分散性は、ＧＳＤ比の値によって監視することができる。例えば、良好な単分散性は、凍結乾燥後のＧＳＤ値が凍結乾燥前のものと同様である場合に評価され、１に近いＧＳＤ比をもたらす。一般に、ＧＳＤ比が高ければ高いほど（すなわち、１に近ければ近いほど）、凍結乾燥後のＣＭＶ分布における最初の単分散性の維持を示す。

用途
本発明の方法によって調製される微小胞は、様々な診断および／または治療的技術において用いられてよく、特に超音波および磁気共鳴を含む。

診断方法は、ガス充填微小胞の使用によって、動物（ヒトを含む）の身体の一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）または部位（ｐａｒｔ）の可視化を増強することが可能になる任意の方法を含み、前臨床および臨床研究目的のためのイメージングを含む。様々なイメージング技術が超音波適用において用いられ得て、例えば、基本およびハーモニックＢモードのイメージング、パルスまたは位相反転イメージング、ならびに、基本およびハーモニックドップラーのイメージングを含み；必要に応じて三次元イメージング技術が用いられ得る。

本発明に係る微小胞は典型的に、例えば、それぞれの組成、イメージングされる組織または臓器および／または選択されるイメージング技術に依存して、患者のｋｇあたり約０．０１～約１．０μＬのガスの濃度で投与されてよい。この一般的な濃度範囲は、特定のイメージング適用に応じて、例えば、カラー・ドップラーまたは電源パルス反転のような非常に低い用量でシグナルを観察することができる場合は、もちろん変化し得る。

一実施態様では、上記診断方法は、
（ｉ）本発明の工程によって得られる凍結乾燥産物の再構成によって得られるガス充填微小胞の懸濁液を患者へ投与するステップ；および
（ｉｉ）上記患者における関心領域からの超音波シグナルを検出するステップ、を含む。

一実施態様によれば、ガス充填微小胞の上記懸濁液は、両親媒性材料と、凍結乾燥保護成分の混合物とを含む。

凍結乾燥産物の再構成は、好ましくは、生理的に許容できるガス（例えばＳＦ_６）の存在下で、穏やかに撹拌しながら、生理的に許容できる水性担体（例えば食塩水）中にそれを分散させることによって行なわれる。

可能性のある他の診断イメージング適用は、シンチグラフィー、光イメージング、およびＸ線イメージング（Ｘ線位相コントラストイメージングを含む）を含む。

本発明の別態様は、本発明による凍結乾燥産物から再構成された微小胞の懸濁液の治療的処置の方法での使用に関する。

治療的技術は、患者の任意の治療方法（上記に定義）を含み、それは、超音波およびガス充填微小胞の併用を、それ自体として含み（例えば、超音波によって仲介される血栓溶解、高密度焦点式超音波アブレーション、血液脳関門の透過化、免疫調節、神経調節、放射線増感において）、または、治療剤と組み合わせて含み（すなわち、超音波によって仲介される送達、例えば、選択部位または組織への薬物または生体活性化合物の送達のため、例えば、腫瘍治療、遺伝子療法、感染性疾患の療法、代謝疾患の療法、慢性疾患の療法、変性疾患の療法、炎症性疾患の療法、免疫性または自己免疫性疾患の療法において、または、ワクチンとしての使用において）、したがって、ガス充填微小胞の存在は、例えば、生物学的効果をインビトロおよび／またはインビボで与えるか、または与える要因となることによって、それ自体によって、または様々な物理的方法による特定の活性化の際に（例えば超音波によって仲介される送達を含む）、治療的効果自体を提供し得て、または、適用される超音波の治療的効果を増強することができる。

本発明に係る微小胞は典型的に、例えば、それぞれの組成、治療中の対象のタイプ、治療される組織または臓器および／または用いられる治療的方法に依存して、患者のｋｇあたり約０．０１～約５．０μＬのガスの濃度で治療的目的のために投与することができる。

一実施態様では、超音波の治療的処置の上記方法は、
（ｉ）本発明の工程によって得られる凍結乾燥産物の再構成によって得られるガス充填微小胞の懸濁液を患者へ投与するステップ；
（ｉｉ）治療的処置に曝される上記患者における関心領域を同定するステップ（上記関心領域は、ガス充填微小胞の上記懸濁液を含んでいる）；および
（ｉｉｉ）上記関心領域を治療的に処置するために超音波ビームを適用するステップ；を含み、
それにより、上記超音波の治療的処置は、上記関心領域におけるガス充填微小胞の上記懸濁液の存在によって増強される。

以下の実施例は、本発明をさらに例示するのを助けるであろう。

［実施例１］
ガス充填微小胞の調製
ガス充填微小胞を、市販のチップホルダー（Ｍｉｃｒｏｎｉｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｏｎｎｅｃｔ ＰＲＯ Ｃｈｉｐ Ｈｏｌｄｅｒ（４５１５ Ｉｎｓｅｒｔｓを有する））内にマウントされた、市販のマイクロ流体フローフォーカシングデバイス（ＣＵ４５５３．００７ Ｎ３０デザイン、Ｍｉｃｒｏｎｉｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＮＬ）を用いて合成した。微小胞形成チャネルは、１９μｍの幅を有していた。チップおよびそのホルダーを、２０倍の倍率対物（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＬＭＰＬＡＮ ２０ｘ）およびＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｅｎｅｒａ，ＬＭ１５６Ｍ）を具備する倒立顕微鏡上にマウントされた光透明性の温度制御された水浴内に置いた。恒温浴の温度を５０℃に設定した。

液体流中の両親媒性材料はＤＳＰＣ：ＤＰＰＥ－ＰＥＧ５０００であり、それぞれのモル比は９：１であった。

材料を、上記モル比で２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、６０℃で攪拌しながら、両親媒性材料が完全に溶解するまで、クロロホルム／メタノール２：１（体積比）の混合物に添加した。それから、減圧下で溶媒を蒸発させて、得られたフィルムを減圧下で一晩乾燥させた。それから、乾燥した材料を、６０℃で撹拌しながら３０分間、食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中に（１５ｍｇ／ｍＬの濃度で）再分散させた。それから、チップ・ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０）を用いることによって分散物を超音波処理して、材料を均一に分散させた。それから、調製物を、ポリカーボネート・フィルター（０．４５μｍポアサイズ）を用いて濾過して、室温まで冷却して脱気した。

８５／１５の体積比でＣＯ_２／Ｃ_４Ｆ_１０を含むガス充填微小胞を、図３に模式的に示したものと同様のガス混合デバイスを用いて調製した。簡潔に説明すると、２つのガスコンテナーに、それぞれＣＯ_２およびＣ_４Ｆ_１０を充填した。それぞれのガスのガス流を、それぞれの質量流量コントローラー：（ｉ）ＥＬ－Ｆｌｏｗ：Ｆ２００ＣＶ－００２－ＲＡＤ－１１－Ｋ（ＣＯ_２用）および（ｉｉ）Ｌｏｗ－ΔＰ－Ｆｌｏｗ：Ｆ－２００ＤＶ－ＲＡＤ－１１－Ｚ（Ｃ_４Ｆ_１０用）によって調節した（ガス・コントローラーは両方とも、Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ｒｕｕｒｌｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによる）。質量流量コントローラーは、所望の混合比を設定および維持するために、パーソナルコンピューター上にインストールされたＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）に実装されている、カスタマイズされたソフトウェアプログラムによって制御した。圧力センサー（ＰＳＥ５３０－Ｍ５－Ｌ；ＳＭＣ Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、マイクロ流体チップに導く出口チャネル内のガス混合物における実際の圧力を測定し；微小胞の形成には２バールのガス圧力を用いた。液体並行流量（ｃｏ－ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は、別個の質量流量コントローラー（Ｍｉｎｉ Ｃｏｒｉ Ｆｌｏｗ：Ｍ１３Ｖ１４Ｉ－ＭＡＤ－１１－Ｋ－Ｓ；Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ｒｕｕｒｌｏ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いることによって制御した。約１５０μＬ／分の液体並行流量を用いて、ジェット・レジームにおけるフローフォーカシングデバイスを操作して、約４μｍの直径（モード）を有する微小胞を生産した。

［実施例２］
凍結乾燥組成物の調製
まず、実施例１で説明したマイクロ流体フローフォーカシング方法によって得られた３ｍＬの校正された微小胞懸濁液を、Ｐｙｒｅｘチューブ（Ｐｙｒｅｘ使い捨てチューブ１２×７５ｍｍ）内に、チューブ内にＣ_４Ｆ_１０をさらに添加せずに移した。それから、校正された微小胞懸濁液を、６４ｇで６分間、遠心分離して（Ｓｉｇｍａ３－１６遠心分離機）、針を備えたシリンジを用いて下澄液（ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）を吸引した。残っている２００μＬの洗浄した微小胞を、以下の実施例に詳述されるように、凍結乾燥保護成分を含む３ｍＬの溶液を用いて再分散させた。効果的な濃度の凍結乾燥保護成分は、残っている洗浄した微小胞の再分散後、１８８ｍｇ／ｍＬであった。

それから、凍結乾燥保護成分の溶液中に懸濁された、校正された微小胞を、ＤＩＮ８Ｒガラスバイアル中に分取して（１．５ｍＬ懸濁液／バイアル）、凍結乾燥器内に移した。

バイアルを、－３０℃～－６０℃の温度で冷却して（以下の実施例において詳述する）、およそ１時間、真空下で凍結乾燥した。手順の最後に、凍結乾燥組成物は、白い均質な乾燥固体として得られた。それから、ヘッドスペースに純粋なＣ_４Ｆ_１０を充填した。

［実施例３］
校正された微小胞の特性に対する、凍結乾燥保護成分の効果
表１は、試験した凍結乾燥保護成分を列挙する。

上記材料を、実施例２に示される凍結乾燥組成物の調製において、－６０℃の温度で、単一成分またはそれらの混合物として、様々な濃度で用いた。表２は、単一成分（Ｓ１～Ｓ１３）およびそれらの混合物（Ｍ１～Ｍ９）の様々な例を列挙する。

特性化
凍結乾燥工程後、校正された安定した微小胞懸濁液を得るために、それぞれの凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で１．５ｍＬの水溶液を用いて再構成した。凍結乾燥保護成分の混合物の濃度は、凍結乾燥の前後で１８８ｍｇ／ｍＬであった。

再構成後、再構成した校正された微小胞懸濁液を、３０μｍアパーチャ－チューブを具備するＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３を用いて特性化する前にベンチ上に５分置いて、微小胞のサイズ、幾何標準偏差（ＧＳＤ）、濃度および凍結乾燥工程後の収率を測定した。

結果
再構成した校正された微小胞懸濁液の特性化の主な結果を、表３および表４に報告する。

微小胞のＧＳＤ値および濃度を、凍結乾燥工程の前後に測定して、校正された微小胞の最初の特性を維持する凍結乾燥保護成分の有効性を評価した。

凍結乾燥後のＧＳＤ値および微小胞の収率を考慮すると、結果は、凍結乾燥保護成分の混合物を校正された微小胞懸濁液に添加することは、微小胞の特性を維持するのに、単一成分を添加するよりも効果的であることを明らかに示している。

表４に示される結果から、凍結乾燥効率が、凍結乾燥保護成分の混合物を用いて改善されたことが明らかである。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００およびＰＥＧ８０００）およびポリオール類（すなわちキシリトール、ソルビトール、およびマンニトール）の混合物中の校正された微小胞の凍結乾燥は、凍結乾燥後の微小胞の収率の改善を可能にした。例えば、混合物Ｍ１の使用は、Ｓ１Ａの使用と比較して、凍結乾燥後の微小胞の収率の１７％の増大を可能にした。さらにより有利に、Ｍ２の使用は、製剤Ｓ２Ａと比較して、ＣＭＶ収率のより高い増大（３８％）を可能にした。さらに、混合物Ｍ２中でのＣＭＶの凍結乾燥は、製剤Ｓ２ＡおよびＳ３Ａの単一凍結乾燥保護成分（それぞれ、１．２１および１．３３）を用いて得られたものよりも低い、より良好なＧＳＤ値（１．１７）を得ることを可能にした。

同様の傾向が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００およびＰＥＧ８０００）および糖類（すなわちマルトース、スクロース、ラフィノース、デキストラン６０００）の混合物中で校正された微小胞を凍結乾燥した後に観察された。例えば、混合物Ｍ５中で凍結乾燥した後のＣＭＶ収率は５１％であることが分かり、製剤Ｓ２Ａと比較すると２５％の増大であった。さらにまた、混合物Ｍ５を用いたＧＳＤ値は１．１７であることが分かり、単一凍結乾燥保護成分Ｓ２ＡおよびＳ６（それぞれ、１．２１および１．２８）よりも著しく低かった。

［実施例４］
異なる凍結温度での凍結乾燥後の、校正された微小胞の特性の特性化
凍結乾燥組成物の調製を、調製されたばかりの校正された微小胞が凍結乾燥手順の最初に冷却される異なる凍結温度を評価してさらに研究した。

製剤工程は、表５に報告したように異なる凍結温度でバイアルを冷却したことを除き、実施例２において前述したように行なった。

凍結乾燥工程の最後に、校正された安定した微小胞懸濁液を得るために、それぞれの凍結乾燥された組成物を、生体適合性ガスの存在下で１．５ｍＬの水溶液を用いて再構成した。凍結乾燥組成物はしたがって、凍結乾燥工程を受けた懸濁液の体積と同様の体積の水溶液を用いて再構成される。したがって、再構成された懸濁液中の凍結乾燥保護成分の濃度は、最初の懸濁液中の濃度と実質的に同一である。

再構成後、再構成した校正された微小胞懸濁液を、３０μｍアパーチャ－チューブを具備するＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３を用いて特性化する前にベンチ上に５分置いて、微小胞のサイズ、幾何標準偏差（ＧＳＤ）、濃度および凍結乾燥工程後の収率を測定した。

表５は、異なる温度で凍結された、異なる凍結乾燥保護成分を含んでいる、凍結乾燥された組成物の再構成後に得られたそれぞれの微小胞懸濁液に関して凍結乾燥後に測定された、ＧＳＤ値および微小胞収率を報告する。

結果
結果は、凍結乾燥成分の混合物の使用は、単一成分の使用と比較した場合、任意の試験された凍結温度において凍結乾燥性能を改善させることを確認した。例えば、表５に示されるように、混合物Ｍ２中で凍結乾燥されたＣＭＶは、任意の試験された凍結温度において最も低いＧＳＤ値によって特性化され、実施例３において以前に得られた結果が確認された。

［実施例５］
校正された微小胞の特性に対する、凍結乾燥保護成分の濃度の効果
凍結乾燥後のＧＳＤ値および微小胞収率の維持の観点から凍結乾燥効率を評価するために、凍結乾燥保護成分の混合物の濃度も試験した。

この試験のために、凍結乾燥保護成分の混合物を、対応する凍結乾燥保護成分単独と比較した。特に、以下の凍結乾燥保護成分を評価した：
ｉ） ＰＥＧ４０００単独と比較した、ＰＥＧ４０００およびソルビトール（等量で含む）。
ｉｉ） ＰＥＧ４０００単独と比較した、ＰＥＧ４０００およびキシリトール（等量で含む）。
ｉｉｉ） ＰＥＧ８０００単独と比較した、ＰＥＧ８０００およびソルビトール（等量で含む）。
ｉｖ） ＰＥＧ８０００単独と比較した、ＰＥＧ８０００およびキシリトール（等量で含む）。

５０ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の異なる溶液を、それぞれの試験した製剤について調製した。

それから、凍結乾燥保護成分の異なる溶液中に懸濁された校正された微小胞をＤＩＮ８Ｒガラスバイアル中に分取して（１．５ｍＬ懸濁液／バイアル）、凍結乾燥器内に移した。

バイアルを、－６０℃または－４０℃（ＰＥＧ８０００混合物）および－６０℃（ＰＥＧ４０００混合物）で１時間、雰囲気圧で冷却して、その後に、－２０℃および０．１ｍｂａｒで一次乾燥させた。手順の最後に、凍結乾燥組成物は、白い均質な乾燥固体として得られた。それから、ヘッドスペースに純粋なＣ_４Ｆ_１０を充填した。

結果
凍結乾燥後のＣＭＶ収率（等式２）およびＧＳＤ比（等式３）を考慮して、校正された微小胞の特性に対する凍結乾燥保護成分の濃度の効果を試験した。

ｉ）ＰＥＧ４０００単独と比較した、ＰＥＧ４０００およびソルビトール（等量で含む）。
表６は、増加する濃度で、ＦＤ保護混合物（ＰＥＧ４０００およびソルビトール）およびＰＥＧ４０００単独について、凍結乾燥後のＣＭＶ収率およびＧＳＤ比に関する比較を報告する。

ＣＭＶ収率を考慮すると、結果は、凍結乾燥効率の改善の増大が、混合物および単一成分の両方について、５０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥保護成分濃度を用いて得られることを示した。さらに、結果は、試験された凍結温度で、混合物（ＰＥＧ４０００およびソルビトール）およびＰＥＧ４０００単独について、実質的に同様のＣＭＶ収率が得られることを示した（≦２００ｍｇ／ｍｌ）。

それとは対照的に、ＧＳＤ比に関する限り、単一成分と混合物の間の違いが観察された。特に－６０℃で凍結した場合、ＧＳＤ比は、ＰＥＧ４０００単独よりも、ＰＥＧ４０００およびソルビトール混合物について、体系的に増大した値を生じた。

ｉｉ）ＰＥＧ４０００単独と比較した、ＰＥＧ４０００およびキシリトール（等量で含む）。
表７は、増加する濃度で、ＦＤ保護ＰＥＧ４０００およびキシリトール混合物およびＰＥＧ４０００単独について、凍結乾燥後のＣＭＶ収率およびＧＳＤ比に関する比較を報告する。

以前（ケースｉ）と同様に、ＧＳＤ比に関する結果は、－６０℃で凍結した場合に、ＰＥＧ４０００およびキシリトール混合物の改善された凍結乾燥効率を示し、ＰＥＧ４０００単独よりも良好なＧＳＤ比の値をもたらした。それとは異なり、ＣＭＶ収率は、低い濃度（５０～１００ｍｇ／ｍＬ）でのみ、混合物に関してより高いことが見いだされた。

ｉｉｉ）ＰＥＧ８０００単独と比較した、ＰＥＧ８０００およびソルビトール（等量で含む）
表８は、ＰＥＧ８０００およびソルビトールの混合物を含む製剤とＰＥＧ８０００単独を含む製剤を比較することにより、それぞれの試験した濃度について、凍結乾燥後のＣＭＶ収率およびＧＳＤ比に関する比較を報告する。

ＣＭＶ収率を考慮すると、結果は、凍結乾燥効率の改善の増大が、混合物および単一成分の両方について、両方の凍結温度において、５０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥保護成分の濃度を用いて得られることを示した。

しかしながら、－６０℃の凍結温度では、ＣＭＶ収率は、低い濃度（５０～１００ｍｇ／ｍＬ）で混合物についてのみ増大するが、値は、混合物および単一成分の両方について、より高い濃度（特に≧２００ｍｇ／ｍＬ）で実質的に同様であることが見いだされた。

それとは異なり、－４０℃の凍結温度では、ＰＥＧ８０００およびソルビトールの混合物は、ＰＥＧ８０００単独と比較して、ＣＭＶ収率およびＧＳＤ比の両方の値が改善した。

表８に示すように、ＰＥＧ８０００単独の代わりにＰＥＧ８０００およびソルビトールの混合物を用いる利点が、ＧＳＤ比の値によっても確認された。特に、より高いＧＳＤ値は、全ての試験された濃度および両方の凍結温度において、ＰＥＧ８０００およびソルビトールの溶液中でＣＭＶを凍結乾燥した場合に評価され、等量のＰＥＧ８０００を含むＣＭＶ懸濁液と比較して改善された単分散性が示された。

ｖ）ＰＥＧ８０００単独と比較した、ＰＥＧ８０００およびキシリトール（等量で含む）。
表９は、ＰＥＧ８０００およびキシリトールの混合物を含む製剤およびＰＥＧ８０００単独を含む製剤を比較することにより、それぞれの試験した濃度について、凍結乾燥後のＣＭＶ収率およびＧＳＤ比に関する比較を報告する。

増大するＣＭＶ収率の値によって示されるように、凍結乾燥効率の改善が、混合物および単一成分の両方について、５０ｍｇ／ｍＬ～２５０ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥保護成分の濃度を用いて得られた。結果は、－６０℃の凍結温度では、ＣＭＶ収率の値は、低い濃度（＜１００ｍｇ／ｍＬ）で、混合物について特に改善されることを示した。

ＧＳＤ比は、全ての濃度および両方の凍結温度で、混合物において改善されることが見いだされた。

ケースｉｉｉ）と同様に、－４０℃の凍結温度では、ＰＥＧ８０００およびキシリトールの混合物は、ＰＥＧ８０００単独と比較してＣＭＶ収率およびＧＳＤ比の両方の値が改善され、その改善された凍結乾燥効率が確認された。

全ての結果の分析から、ＦＤ保護成分の混合物の使用は、単一ＦＤ保護成分と比較した場合、凍結乾燥効率の改善の増大を与えることが明らかになった。

特に、Ｓ１ＡをＭ１（ＰＥＧ４０００＋ソルビトール）およびＭ９（ＰＥＧ４０００＋キシリトール）と比較すると、ＧＤＳ比の値の改善が、－６０℃で凍結した場合に、混合物に関して評価されることが観察された。

Ｓ２Ａ（ＰＥＧ８０００）と混合物Ｍ２（ＰＥＧ８０００＋ソルビトール）およびＭ３（ＰＥＧ８０００＋キシリトール（Ｘｙｉｌｉｔｏｌ））の間の比較から、混合物の凍結乾燥効率の改善の増大が、－４０℃で凍結した場合に評価され、全ての試験したパラメーター（ＣＭＶ収率、ＧＳＤ、ＧＳＤ比）の増大が観察されることが明らかになった。しかしながら、－６０℃の凍結温度では、ＣＭＶ収率は、単一ＦＤ保護成分と比較して混合物について、同様か、またはわずかにより高いことが見いだされたが、ＧＳＤ比およびＧＳＤ値は、混合物Ｍ２およびＭ３についてのみ、特に高い濃度の凍結保護物質（ｃｒｙｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（≧２００ｍｇ／ｍＬ）で改善をもたらした。

引用文献
1. WO2018/041906 A1 - BRACCO SUISSE SA
2. PCT application number PCT/EP2019/055325
3. US2017/080113 A1 - GE Healthcare
4. WO97/29782 A1 - NICOMED IMAGING A/S

Claims (8)

1. 生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液を用いて再構成した際に、校正されたガス充填微小胞の懸濁液を提供する、（ｉ）リン脂質を含む両親媒性材料と（ｉｉ）凍結乾燥保護成分とを含む凍結乾燥組成物であって、
   前記凍結乾燥保護成分は１０～２５％（ｗ／ｖ％）の濃度を有し、４０００～８０００ｇ／ｍｏｌの間に含まれる分子量を有するポリエチレングリコール、および、ソルビトールまたはキシリトールから選択されるポリオールを含む少なくとも２つの凍結乾燥保護成分の混合物であり、
   校正されたガス充填微小胞の前記再構成された懸濁液は、１．２未満の幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有する、
   凍結乾燥組成物。
2. 請求項１に記載の凍結乾燥組成物であって、
   校正された微小胞の前記再構成された懸濁液が、２．５×１０^８個の微小胞／ｍＬの濃度によって特徴付けられる、
   凍結乾燥組成物。
3. 請求項１または２に記載の凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液を用いて再構成することによって得られる、
   ガス充填微小胞の懸濁液。
4. １．２未満の幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有する校正されたガス充填微小胞の再構成された懸濁液の調製のための、請求項１または２に記載の凍結乾燥組成物を調製する方法であって、
   ａ．１．２未満の幾何標準偏差（ＧＳＤ）を有し、４０００～８０００ｇ／ｍｏｌの間に含まれる分子量を有するポリエチレングリコール、および、ソルビトールまたはキシリトールから選択されるポリオールを含む凍結乾燥保護成分の混合物を含む校正されたガス充填微小胞の懸濁液を調製するステップ；および
   ｂ．校正された微小胞懸濁液を凍結乾燥するステップ、
   を含む、
   方法。
5. 請求項４の方法であって、
   ステップａ．の調製方法が、マイクロ流体フローフォーカシング技術を含む、
   方法。
6. 請求項４の方法であって、
   前記凍結乾燥保護成分の混合物が、１２０ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍＬの間に含まれる合計濃度を有する、
   方法。
7. 請求項６の方法であって、
   前記濃度が２００ｍｇ／ｍＬである、
   方法。
8. ガス充填微小胞の懸濁液を含んでいる注入可能な造影剤を調製する方法であって、
   前記方法は、請求項１または２において定義される凍結乾燥組成物を、生体適合性ガスの存在下で薬学的に許容できる溶液を用いて再構成するステップを含む、
   方法。